guía para el recuento de microorganismos en alimentos

GUIA GENERAL PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS

EN ALIMENTOS

Cabeza Herrera, E.A., Ortiz Lemuz, J.F. Universidad de Pamplona, Facultad de Ciencias Básicas, Departamento de

Microbiología. Campus Universitario, Km. 1 Vía Bucaramanga.

La presente guía presenta de forma ilustrada los diferentes métodos para el recuento en placa de microorganismos en alimentos. Se trata de un resumen adaptado de la norma técnica colombiana NTC – 4092 y de las recomendaciones que se manejan en el Instituto Nacional de Salud de Colombia y avaladas por el Ministerio de la Protección Social (Antes Ministerio de Salud). Para el método de recuento de microorganismos por la técnica del número más probable consulte la NTC-4092.

RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS (ICONTEC). La presente guía de recuento de microorganismos en alimentos está basada en la Norma Técnica Colombiana NTC-4092. Esta norma establece directrices generales para realizar análisis microbiológicos de conformidad con normas internacionales (ISO 7218 de 1997). 1. CONSIDERACIONES GENERALES:

Para la correcta aplicación de esta norma la preparación de la muestra es fundamental, por lo tanto se requiere que la siembra se realice a partir de dos diluciones consecutivas y por duplicado además de inocular los volúmenes correctos (0,1 ml para superficie – bajo ciertas circunstancias se puede inocular 0,2 ml, 0,5 ml o 1 ml en superficie para muestras que se consideren con un bajo recuento y cuando el medio de cultivo empleado tenga la capacidad de embeber dicho volumen – y 1 ml para profundidad).

2. RANGOS PARA EL RECUENTO: Después del periodo especificado de incubación se cuentan las unidades formadoras de colonias UFC presentes en las cajas que contengan entre 15 UFC y 300 UFC, los análisis que aplica dicho rango son: Aerobios mesófilos; coliformes, recuento de bacterias termófilas, proteolíticas, lipolíticas, Clostridium sulfito reductores, S. aureus, B. cereus, etc. Excepto para aquellas bacterias cuya norma exige presencia o ausencia. Después del periodo especificado de incubación se cuentan las unidades formadoras de colonias UFC presentes en las cajas que contengan entre 15 UFC y 150 UFC para Mohos y levaduras, levaduras osmofílicas.

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GUIA GENERAL PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS

3. RECUENTO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS:

A). CASO GENERAL: Se calcula el número N de microorganismos presentes en la muestra, a partir del recuento de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una de las dos cajas de cada dilución esté dentro del rango, usando la siguiente fórmula:

N= dnnV

C))2*1.0(1( +

Σ , donde:

N: Número total de UFC por gramo o mililitro de muestra. ΣC: Es la Sumatoria del número de colonias contadas en cada caja examinada de

las diluciones sucesivas. V: Volumen de muestra inoculada en cada caja. n1: Número de cajas retenidas de la primera dilución. N2: Número de cajas retenidas de la segunda dilución. d: Factor de dilución correspondiente a la primera dilución retenida. 0,1= constante de corrección.

Se redondea el resultado calculado a dos cifras significativas. Para esto si la última cifra es inferior a 5 la cifra anterior no se modifica; si la última cifra es 5 o mayor, la cifra anterior se incrementa en una unidad. Se prosigue así hasta que se obtengan dos cifras significativas. Los resultados se expresan en UFC por gramo o mililitro de producto según la naturaleza del mismo, expresado como un número entre 1,0 y 9,9 (Dos cifras significativas, un entero y un decimal) multiplicado por 10X donde x es la potencia apropiada de 10.

Ejemplo: A partir de un análisis de aerobios mesófilos para una leche pasteurizada se obtuvieron los siguientes resultados: - en la primera dilución seleccionada (10-2): 168 UFC y 215 UFC. - en la segunda dilución seleccionada (10-3): 14 UFC y 25 UFC.

N= 0,01))1*1.0(2(125215168

+++

N= 57,428.190,021408

=

Al redondear la cifra como se especificó anteriormente, se obtiene como resultado 19.000, expresado con dos cifra significativas 1,9x104 UFC por mililitro.

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CABEZA HERRERA, E.A., ORTIZ LEMUZ J.F.

B). MÉTODO DE CÁLCULO PARA RECUENTOS DE MICROORGANISMOS QUE REQUIERAN CONFIRMACIÓN POSTERIOR: (Por Ejemplo S. aureus coagulasa positiva, B. cereus.) Se calcula el número N de microorganismos presentes en la muestra, a partir del recuento de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una de las dos cajas de cada dilución esté dentro del rango. En este caso es necesario confirmar de cada una de las cajas un número representativo de colonias típicas (generalmente 5). Antes de calcular el informe final es necesario aplicar un factor de corrección a cada una de las cajas retenidas mediante la siguiente fórmula:

a= CAb * , donde:

b: Número de colonias identificadas como positivas de acuerdo al criterio

microbiológico. A: Número de colonias examinadas C: Número total de colonias típicas contadas en cada una de las cajas retenidas. Para expresar el resultado final se aplica la siguiente formula:

N= dnnV

a))2*1.0(1( +

Σ , donde:

N: Número total de UFC por gramo o mililitro de muestra. Σa: Sumatoria del número de colonias típicas corregidas en cada caja examinada. V: Volumen de muestra inoculada en cada caja. n1: Número de cajas retenidas de la primera dilución. N2: Número de cajas retenidas de la segunda dilución. d: Factor de dilución de la primera dilución retenida. 0,1= constante de corrección.

Se redondea el resultado calculado a dos cifras significativas. Para esto si la última cifra es inferior a 5 la cifra anterior no se modifica; si la última cifra es 5 o mayor, la cifra anterior se incrementa en una unidad. Se prosigue así hasta que se obtengan dos cifras significativas. Los resultados se expresan en UFC por gramo o mililitro de producto según la naturaleza del mismo, expresado como un número entre 1,0 y 9,9 multiplicado por 10X donde x es la potencia apropiada de 10.

Ejemplo: A partir de un análisis de S. aureus coagulasa positiva en un queso se obtuvieron los siguientes resultados: - en la primera dilución seleccionada (10-3): 66 UFC y 80 UFC. - en la segunda dilución seleccionada (10-4): 4 UFC y 17 UFC.

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Factor de correción: Colonias contadas en c/caja (C): 66 y 80 UFC. 4 y 17 UFC. Colonias examinadas (A): 6 y 8 4 y 5 Colonias positivas (b): 4 y 5 4 y 3

66*64

=a 80*85

=a 4*44

=a 17*53

=a

a= 44 col. a= 50 col. a= 4 col. a= 28 col.

Informe:

N= dnnV

a)2*1.01( +

Σ

N= 0,001))1*1.0(2(1,0

285044+

++

N= 38,952.5800,00021

122=

Al redondear la cifra como se especificó anteriormente, se obtiene como resultado 580.000, expresado con dos cifra significativas 5,8x105 UFC por gramo. C). CASOS ESPECIALES: - CASO 1: Cuando el número de UFC se encuentran por debajo del rango

mínimo en ambas cajas de una o las dos diluciones consecutivas, se informará así:

Se descarta el recuento obtenido en la mayor dilución y se calcula la media aritmética de las colonias presentes en las dos cajas de la menor dilución multiplicándose por el inverso de la dilución y se informa el resultado como sigue:

Conteo estimado de UFC por gramo o mililitro (Teniendo en cuenta la

forma de informar el resultado final: dos cifras significativas por.....) - CASO 2: Ausencia de crecimiento, si las dos cajas correspondientes a la

primera dilución, se informa el resultado como sigue: < 1x10X UFC por gramo o mililitro según corresponda.

NOTA: cuando el conteo de colonias exceda el máximo del rango se recomienda repetir el análisis empleando diluciones mayores para obtener un resultado más confiable, o reportar como TNTC (too numerous to count = Muy numeroso para contar).

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RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS (Recomendaciones del Instituto Nacional de Salud y Ministerio de la Protección Social de Colombia).

La presente guía de recuento de microorganismos en alimentos está basada en las recomendaciones del Instituto Nacional de Salud y avaladas por el Ministerio de la Protección Social de Colombia y del instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos –INVIMA-. Esta guía establece directrices generales para realizar recuentos de análisis microbiológicos de conformidad con las normas nacionales. 1. CONSIDERACIONES GENERALES:

Para la correcta aplicación de esta norma la preparación de la muestra es fundamental, por lo tanto se requiere que la siembra se realice a partir de dos diluciones consecutivas y por duplicado además de inocular los volúmenes correctos (0,1 ml para superficie y bajo ciertas circunstancias se puede inocular 1 ml en superficie para muestras que se consideren con un bajo recuento y 1 ml para profundidad).

2. RANGOS PARA EL RECUENTO: Después del periodo especificado de incubación se cuentan las unidades formadoras de colonias UFC presentes en las cajas que contengan entre 30 UFC y 300 UFC, los análisis que aplica dicho rango1 son: Aerobios mesófilos; coliformes, recuento de bacterias termófilas, y en general para análisis de microorganismos donde no se observan reacciones enzimáticas ni de crecimiento sobre la superficie del Agar. Para el recuento de estos últimos microorganismos se emplea el rango de 20 UFC – 200 UFC, por ejemplo para: S. aureus, B. cereus, etc. Para el recuento de Mohos y Levaduras, y levaduras osmofílicas se tiene en cuenta el rango de 10 UFC – 100 UFC.

3. RECUENTO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS: A). CASO GENERAL: Se calcula el promedio de colonias para cada una de las diluciones a examinar multiplicando el resultado por el factor inverso de la dilución respectiva, a partir del recuento de dos diluciones sucesivas. Dividir el resultado obtenido de la mayor dilución (Menos concentrada) por el resultado de la menor dilución (más concentrada). Si el cociente de esta división es mayor a 2, reportar el resultado obtenido en la dilución más concentrada, Pero, si el cociente es menor de 2 reportar la media aritmética de los recuentos de las dos diluciones consecutivas.

1 Excepto para aquellas bacterias cuya norma exige presencia o ausencia

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Se redondea el resultado calculado a dos cifras significativas. Para esto si la última cifra es inferior a 5 la cifra anterior no se modifica; si la última cifra es 5 o mayor, la cifra anterior se incrementa en una unidad. Se prosigue así hasta que se obtengan dos cifras significativas. Los resultados se expresan en UFC por gramo o mililitro de producto según la naturaleza del mismo, expresado como un número entre 10 y 99 (dos cifras significativas enteras) multiplicado por 10X donde x es la potencia apropiada de 10.

Ejemplo: A partir de un análisis de aerobios mesófilos para una leche pasteurizada se obtuvieron los siguientes resultados: - en la primera dilución seleccionada (10-2): 168 UFC y 215 UFC. - en la segunda dilución seleccionada (10-3): 35 UFC y 45 UFC.

10-2= 150.191002

215168=

+ x

10-3= 4000010002

4535=

+ x

087,21915040000

=

Como el cociente es mayor de dos se reporta el resultado de la menor dilución: 10-2= 19150 UFC/ml. Al redondear la cifra como se especificó anteriormente, se obtiene como resultado 19.000, expresado con dos cifra significativas 19x103 UFC/ml. B). CASOS ESPECIALES: - CASO 1: Cuando el número de UFC se encuentran por debajo del rango

mínimo en ambas cajas de una o las dos diluciones consecutivas, se informará así:

Se descarta el recuento obtenido en la mayor dilución y se calcula la media aritmética de las colonias presentes en las dos cajas de la menor dilución multiplicándose por el inverso de la dilución y se informa el resultado como sigue:

Conteo estimado de UFC por gramo o mililitro (Teniendo en cuenta la

forma de informar el resultado final: dos cifras significativas por.....)

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- CASO 2: Ausencia de crecimiento, si las dos cajas correspondientes a la primera dilución no presentan crecimiento se reportará como negativo y se informa el resultado como sigue: Conteo estimado de UFC por gramo o mililitro < 1x10X UFC por gramo o mililitro según corresponda. C.E.

- CASO 3: Crecimiento abundante, si las dos cajas correspondientes a la primera

dilución presentan crecimiento mayor de 300 colonias se divide la caja en 2, 4, 6, 8 cuadrantes, se cuenta el número de colonias presente en un cuadrante y se multiplica por el total de cuadrantes y por el inverso de la dilución. Se continua el recuento como en el caso general pero se informa el resultado como Conteo estimado de UFC por gramo o mililitro

Ejemplo: A partir de un análisis de aerobios mesófilos para una leche pasteurizada se obtuvieron los siguientes resultados: - en la primera dilución seleccionada (10-2): >300 UFC en las dos cajas. - en la segunda dilución seleccionada (10-3): >300 UFC en las dos cajas. Al dividir las cajas de 10-2 en 4 se contó en un cuadrante 180 colonias y 150 colonias respectivamente. Al dividir las cajas de 10-3 en 4 se contó en un cuadrante 100 colonias y 120 colonias respectivamente. 10-2 (caja 1) = 10( 100)4180( xx ) -2 (caja 2) = ( )100)4150( xx 10-3 (caja 1) = 10( 1000)4100( xx ) -2 (caja 2) = ( )1000)4120( xx

10-2= 660001002

600720=

+ x

10-3= 44000010002

480400=

+ x

66,666000400000

=

Como el cociente es mayor de dos se reporta el resultado de la menor dilución: 10-2= 66.000 UFC/ml. Al redondear la cifra como se especificó anteriormente, se obtiene como resultado 66.000, expresado con dos cifra significativas 66x103 UFC/ml. C.E.

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NOTA: cuando el conteo de colonias exceda de 200 en 1/8 de la caja se reportará como >1600 UFC/gr o ml multiplicadas por el inverso de la menor dilución y Conteo estimado.

Ejemplo: A partir de un análisis de aerobios mesófilos para una leche pasteurizada se obtuvieron los siguientes resultados: - en la primera dilución seleccionada (10-2): >300 UFC en las dos cajas. - en la segunda dilución seleccionada (10-3): >300 UFC en las dos cajas. Al dividir las cajas de 10-2 en 4 se contó en un cuadrante 240 colonias y 230 colonias respectivamente. Se informa como >1600x102 UFC/ml. C.E.

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