guía de referencia de forenseq dna signature prep 15049528

PROPIEDAD DE ILLUMINAN.º de catálogo TG-450-9001DOCN.º de material 20000923N.º de documento 15049528 v01 ESPSeptiembre de 2015

Guía de referencia de ForenSeq™DNASignature Prep

Parausoexclusivoeninvestigación,métodosforensesopruebasdepaternidad

Historial de revisiones 3Introducción 5Recomendaciones de entrada de ADN 7Recursos adicionales 8Introducción al protocolo 9Sugerencias y técnicas 10Flujo de trabajo de preparación de bibliotecas 11Amplificación y marcado de objetivos 12Enriquecimiento de objetivos 16Purificación de bibliotecas 19Normalización de bibliotecas 21Agrupación de bibliotecas 24Desnaturalización y dilución de bibliotecas 25Información adicional 27Asistencia técnica 39

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Para uso exclusivo en investigación, pruebas forenses o de paternidad; no apto parauso clínico ni terapéutico en humanos o animales. Este producto incluye ADN decontrol 2800M fabricado por Promega Corporation para su distribución por parte deIllumina, Inc.

Historialde

revisiones

Guía de referencia de ForenSeqDNASignature Prep 3

Historial de revisiones

Documento Fecha Descripción del cambio

N.º de material20000923N.º de documento15049528 v01

Septiembrede 2015

Actualización de la introducción para indicar que DPMA contienepares de cebadores para 58 STR y 94 SNP informativos deidentidad.Actualización de este documento para ofrecer el formato actual dela documentación de la preparación de bibliotecas. Revisión de lasinstrucciones para que sean más precisas.Cambio de la referencia del producto de PCR a biblioteca tras laamplificación.Eliminación de la referencia a la obsoleta tarjeta de usuarioexperimentado y adición de referencia a la nueva lista decomprobación y guía del protocolo.Eliminación de los números de referencia de tubos y cajas del kit.Eliminación de pipetas de Consumibles ya que son artículos delaboratorio estándar.Eliminación de ciclador térmico del Equipo previo a PCR.Corrección de los alelos de control 2800M en las tablas de Locuspara los siguientes alelos.• rs279844, DYS612, Y-GATA-H4, DXS10103• rs1805007, rs1294331, rs1413212, rs993934• rs1355366, rs2399332, rs1979255, rs2046361• rs251934, rs338882, rs1336071, rs214955• rs727811, rs763869, rs1463729, rs3780962• rs735155, rs2111980, rs2920816, rs1335873• rs1886510, rs354439, rs722290, rs1821380• rs1382387, rs729172, rs1024116, rs1736442• rs719366, rs1800407, rs2814778, rs3737576• rs1876482, rs3827760, rs1229984, rs3811801• rs870347, rs1871534, rs2196051, rs3814134• rs1079597, rs1572018, rs1800414, rs2593595• rs4411548, rs2042762, rs3916235, rs310644Eliminación del locus rs7520386 de la tabla de Locus de SNPinformativos de identidad.Corrección de las longitudes del amplicón para DXS8378 en latabla de Locus de los marcadores de haplotipo X.Modificación de los encabezados de la tabla de Locus de Inicio deobjetivo a Posición de inicio del amplicón y Final objetivo aPosición de fin del amplicón, así como definición de las posiciones.Incorporación de procedimientos alternativos para preparar latarjeta FTA en los procedimientos de Amplificación y marcado deobjetivos.Adición de 2800M como control de plantilla positiva para prepararla tarjeta FTA.

4 N.º de material 20000923N.º de documento 15049528 v01 ESP

Documento Fecha Descripción del cambio

N.º de referencia15049528 Rev. D

Febrero de2015

• Actualización de la introducción para indicar que la mezcla decebador de ADN A admite siete marcadores de haplotipo X.

• Eliminación de las puntas y la pipetas de 1000 µl de Consumiblesy equipos.

• En las tablas de Locus:• Desplazamiento de los SNP rs16891982 y rs12913832 delSNP informativo de fenotipo a SNP informativo deascendencia, así como indicación de que ambos se utilizanpara la predicción.

• Corrección de la longitud de amplicón mínima y máximade vWA.

N.º de referencia15049528 Rev. C

Enero de2015

• Actualización de las tablas de Locus:• Revisión de las longitudes de amplicón de STR autosómico,marcador de haplotipo Y y marcador de haplotipo X.

• Eliminación del marcador de haplotipo X DXS10148.• Cambio de encabezado de columna derecha de SNPinformativo de identidad, de fenotipo y de ascendencia aalelos de control 2800M.

• Adición del número de reacciones admitidas en el Contenido delkit.

• Cambio de los números de catálogos para la tarjeta de usuarioexperimentado, de la guía y del kit.

• Cambio del número de catálogo y del nombre del MiSeq FGxReagent Kit.

N.º de referencia15049528 Rev. B

Septiembrede 2014

• Modificación de los volúmenes de reactivos en las tablas demezclas maestras de Amplificación y marcado de objetivos yPreparación de la tarjeta de FTA a volúmenes de reactivos realessin promedio.

• Corrección de los alelos de control 2800M del locus D5S818 a12,12.

• Actualización de Recursos adicionales para eliminar la direcciónURL de la página de asistencia y eliminación de las instruccionesde navegación web e indicación de direcciones URL.

• Separación de sellado y agitación como subpasosindependientes.

• Actualización del enlace de las hojas de datos de seguridad(SDS) a support.illumina.com/sds.html.

N.º de referencia15049528 Rev. A

Agosto de2014

Publicación inicial.

Introducción


Introducción

Este protocolo explica cómo preparar bibliotecas de ADN con los reactivosproporcionados en el ForenSeq™ DNA Signature Prep Kit de Illumina® en bases de datosde genotipos o muestras de referencia de casos prácticos en un solo experimento desecuenciación.Se mezcla una mezcla de cebador que contiene un par de oligonucleótidos marcadospara cada secuencia objetivo con la muestra de ADN. En los ciclos de PCR se vinculanlos marcadores con las copias de cada objetivo para formar plantillas de ADN quecontienen las regiones de interés flanqueadas por secuencias de cebadores universales.Los marcadores se utilizan para conectar adaptadores indexados, que se amplificanmediante PCR, se purifican, se agrupan un solo tubo y, posteriormente, se secuencian.Las secuencias de índice permiten que el sistema de secuenciación se separe y aísle losdatos generados de cada muestra.

Figura 1 Descripción general de ForenSeq DNA Signature Prep

Las mezclas de cebadores selectivos permiten el análisis de objetivos de repeticionescortas en tándem (STR) de cromosoma Y y X autosómicos, SNP informativos deidentidad, con la opción de incluir SNP informativos de ascendencia y de fenotipos enfunción de la mezcla de cebador que se utilice. El ForenSeq DNA Signature Prep permiteel análisis de estos marcadores en una amplia gama de muestras de ADNg, desdemuestras de origen único de alta calidad hasta muestras complejas. Este proceso serealiza dentro de una sola reacción con el indexado integrado para permitir lasecuenciación de hasta 96 muestras de base de datos o 32 muestras de casos prácticospor experimento. ForenSeq DNA Signature Prep emplea capacidades de lectura "paired-end" largas y una alta calidad de datos de sus sistemas de secuenciación de Illumina.


El ForenSeq DNA Signature Prep Kit ofrece:} Multiplexado: Amplifica los amplicones de STR y SNP en una reacción única y

secuencia hasta 96 muestras en un único experimento de secuenciación.} Dos mezclas de cebador diferentes:

} Mezcla para cebador de ADN A: Contiene pares de cebadores para 58 STR(incluidos 27 STR autosómicos, 7 marcadores de haplotipos del cromosoma X y 24del cromosoma Y) y 94 SNP informativos de identidad.

} Mezcla para cebador de ADN B: Contiene todos los marcadores de la mezcla paracebador de ADN A, más los pares de cebadores para 56 SNP informativos deascendencia y 22 SNP informativos de fenotipo (también se utilizan dos SNPinformativos de ascendencia para la predicción de fenotipo).

} Generación de bibliotecas: Permite la preparación simultánea de 96 muestras paragenerar bibliotecas de los productos de PCR con una sola placa. Cada biblioteca esuna recopilación de fragmentos de ADN amplificados a partir de una única muestra.

Recom

endacionesde

entradade

ADN


Recomendaciones deentradadeADN

Es importante cuantificar el ADN de entrada y evaluar la calidad del ADN antes decomenzar el protocolo ForenSeq DNA Signature Prep. Siga estas recomendaciones deentrada de ADN:} Se recomienda una entrada de 1 ng de ADN genómico humano (ADNg).} Utilice un método basado en fluorometría para la cuantificación, como la qPCR.} El ForenSeq DNA Signature Prep Kit es compatible con lisados de frotis bucales y

tinciones de tarjetas de FTA como entrada de ADN.} Si utiliza lisados crudos, son necesarios 2 µl de material de entrada para cadamuestra. Consulte Equipo en la página 29 para tampones de lisis recomendados.

} Si utiliza papel de FTA, necesitará una punción de tarjeta de FTA de 1,2 mm porcada muestra.


Recursos adicionales

La documentación siguiente está disponible para su descarga en el sitio web de Illumina.

Recurso Descripción

Guía del protocolo de ForenSeq DNA SignaturePrep (n.º de documento 1000000001629)

Proporciona solo las instrucciones delprotocolo. La guía del protocolo se haconcebido para usuarios experimentados.

Lista de comprobación de ForenSeq DNA SignaturePrep (n.º de documento 1000000001630)

Proporciona una lista de comprobación delos pasos del protocolo. La lista decomprobación se ha concebido parausuarios experimentados.

Guía de referencia del instrumento MiSeq FGx(n.º de documento 15050524)

Proporciona una descripción general de loscomponentes y el software del instrumentoMiSeq FGx™, las instrucciones para realizarexperimentos de secuenciación, y losprocedimientos para un mantenimiento yuna resolución de problemas adecuados delinstrumento.

Guía del usuario del software de análisis universalForenSeq (n.º de documento 15053876)

Proporciona una descripción general delsoftware de análisis universal (UAS)ForenSeq, que realiza análisis secundarioscomo el demultiplexado, la alineación, lallamada de variantes y la generación deinformes.

Visite la página de asistencia de ForenSeq DNA Signature Prep Kit en el sitio web deIllumina para obtener acceso a los requisitos y obtener información sobre compatibilidad,documentación adicional, preguntas frecuentes y prácticas recomendadas.

http://support.illumina.com/downloads/forenseq-dna-signature-prep-protocol-guide-1000000001629.html

http://support.illumina.com/downloads/forenseq-dna-signature-prep-protocol-guide-1000000001629.html

http://support.illumina.com/downloads/forenseq-dna-signature-prep-checklist-1000000001630.html

http://support.illumina.com/downloads/forenseq-dna-signature-prep-checklist-1000000001630.html

http://support.illumina.com/downloads/miseq-fgx-instrument-reference-guide-15050524.html


https://support.illumina.com/downloads/forenseq-universal-analysis-software-guide-15053876.html

https://support.illumina.com/downloads/forenseq-universal-analysis-software-guide-15053876.html

http://support.illumina.com/forensics-support/forensics-kits/forenseq-dna-signature-kit.html

Introducciónalprotocolo


Introducciónal protocolo

} Revise las prácticas recomendadas antes de realizar el procedimiento. ConsulteRecursos adicionales en la página 8 para obtener información sobre las prácticasrecomendadas de ForenSeq DNA Signature Prep Kit en el sitio web de Illumina.

} El procesamiento de menos de ocho muestras al mismo tiempo, incluidos loscontroles positivos y negativos, puede producir problemas en la precisión delpipeteo debido a los pequeños volúmenes utilizados al preparar la mezcla maestra.

} Cree una hoja de muestras para registrar las posiciones de cada muestra y deladaptador de índices. Para obtener más información, consulte la Guía del usuario delsoftware de análisis universal ForenSeq (n.º de documento 15053876).

NOTAPara obtener instrucciones de indexado al agrupar 16 bibliotecas o menos, consulteRecursos adicionales en la página 8 para obtener información sobre las prácticasrecomendadas de ForenSeq DNA Signature Prep Kit en el sitio web de Illumina.

} Siga el protocolo en el orden que se muestra con los parámetros de incubación y losvolúmenes especificados.

} Confirme el contenido del kit y asegúrese de que tiene los consumibles y el equipoque necesita. Para obtener información adicional, consulte Información adicional en lapágina 27.


Sugerencias y técnicas

A menos que se haya especificado un punto de parada de seguridad en el protocolo,continúe inmediatamente con el siguiente paso.

Procedimientos para evitar la contaminación cruzada} Cuando añada o transfiera muestras, cambie las puntas entre cada muestra.} Cuando añada adaptadores o cebadores, cambie las puntas entre cada fila y cada

columna.} Retire los tubos adaptadores de índices no utilizados del área de trabajo.

Sellado de la placa} Selle siempre la placa de 96 pocillos antes de llevar a cabo los siguientes pasos del

protocolo:} Agitación} Agitación vorticial} Centrifugado} Termociclado

} Aplique el sello adhesivo para cubrir la placa y séllela con un rodillo de goma.} Los sellos adhesivos Microseal "B" son eficaces con un rango de temperatura entre

-40 °C y 110 °C, además de ser aptos para placas de PCR con bordes o semibordes.Utilice los sellos Microseal "B" para la agitación, el centrifugado y el almacenamientoa largo plazo.

} La película adhesiva Microseal "A" es eficaz para el termociclado y es fácil de cortarcuando se utilizan menos de 96 pocillos.

Transferencias de placa} Cuando transfiera volúmenes entre placas, transfiera el volumen especificado desde

cada pocillo de una placa al pocillo correspondiente de la otra placa.} Si se aspiran las bolas con las puntas de las pipetas, dispénselas en la placa con el

soporte magnético y espere hasta que el líquido se vuelva transparente(aproximadamente 2 minutos).

Centrifugado} Centrifugue en cada paso del procedimiento para consolidar el líquido o las bolas en

el fondo del pocillo, además de para evitar pérdidas de la muestra.

Flujode

trabajode

preparaciónde

bibliotecas


Flujode trabajodepreparacióndebibliotecas

Figura 2 Flujo de trabajo de ForenSeq DNA Signature Prep


Amplificaciónymarcadodeobjetivos

Este proceso amplifica y marca el ADNg utilizando una mezcla de cebador deoligonucleótidos ForenSeq con regiones específicas de secuencias de ADN antes ydespués de STR y SNP.Este protocolo requiere ADN de control 2800M y un control de amplificación de PCRnegativo (agua sin nucleasas) en cada experimento. Si estos controles no se incluyen, selimita la asistencia para la solución de problemas.

NOTAEl procesamiento de menos de ocho muestras al mismo tiempo, incluidos los controlespositivos y negativos, puede afectar a la precisión del pipeteo debido a los pequeñosvolúmenes utilizados al preparar la mezcla maestra.

Consumibles} 2800M (ADN de control 2800M)} Una de los siguientes:

} DPMA (Mezcla de cebador de ADN A)} DPMB (Mezcla de cebador de ADN B)

} FEM (Mezcla de enzimas)} PCR1 (Mezcla de reacción PCR1)} Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (2)} Placas de PCR de 96 pocillos, 0,3 ml, con bordes o semibordes} ADNg humano:

} ADN purificado (1 ng por muestra)} Lisado crudo (2 µl por muestra)} Tarjeta de FTA (punción de 1,2 mm por muestra)

} [Para tarjeta de FTA] Tampón de 1X TBE (100 µl por cada punción de tarjeta de FTA)} Película adhesiva Microseal "A"} Sello adhesivo Microseal "B"} Agua sin nucleasas} [Opcional] Tapones y gradillas de ocho tubos sin ARNasa/ADNasa

NOTAUtilice Microseal "A" cuando selle la placa antes de colocarla en el ciclador térmico. UtiliceMicroseal "B" para los demás pasos que requieran una placa sellada.

Acerca de los reactivos} Para obtener información sobre los locus detectados con DPMA y DPMB, consulte

Locus en la página 30.

Amplificación

ymarcado

deobjetivos


Preparación1 Prepare los siguientes consumibles.

Elemento Almacenamiento InstruccionesDPMA o DPMB Entre -25 °C y -15 °C Descongele a temperatura ambiente.FEM Entre -25 °C y -15 °C Descongele a temperatura ambiente.

Devuelva al almacenamiento despuésde su uso.

PCR1 Entre -25 °C y -15 °C Descongele a temperatura ambiente.Tampón de TBE 1X Entre -25 °C y -15 °C Descongele a temperatura ambiente.2800M Entre 2 °C y 8 °C Deje reposar durante 30 minutos hasta

que alcance la temperatura ambiente.

2 Cree una hoja de muestras para registrar las posiciones de cada muestra y deladaptador de índices.

3 Guarde el siguiente programa de PCR1 en el ciclador térmico en el área depostamplificación.

PRECAUCIÓNSi no utiliza el modo de rampa térmica de su ciclador térmico, puede tener un efectoadverso en los resultados. Consulte los modos de rampa para los Cicladores térmicosen la página 30.

} Seleccione la opción de tapa precalentada y establezca la temperatura a 100 °C.} 98 °C durante 3 minutos} 8 ciclos de:

} 96 °C durante 45 segundos} 80 °C durante 30 segundos} 54 °C durante 2 minutos, con el modo de rampa especificado} 68 °C durante 2 minutos, con el modo de rampa especificado

} 10 ciclos de:} 96 °C durante 30 segundos} 68 °C durante 3 minutos, con el modo de rampa especificado

} 68 °C durante 10 minutos} Mantenga la temperatura a 10 °C.

NOTAEl programa de PCR1 dura aproximadamente 3,5 horas y puede llevarse a cabo durantela noche.

4 Etiquete los tubos y las placas con un rotulador de la siguiente manera.} [Para ADN purificado o lisado crudo] Mezcla maestra: tubo de microcentrífuga de1,5 ml

} [Para tarjeta de FTA] Mezcla maestra de FTA: tubo de microcentrífuga de 1,5 ml} FSP: placa de PCR


Procedimiento1 Cuantifique el ADNg con un método basado en fluorometría.

2 Para ADN purificado o lisado crudo, realice los pasos siguientes:

a Diluya el material de entrada de la siguiente manera.} [ADN purificado] Diluya 1 ng a 0,2 ng/µl con agua sin nucleasas.} [Lisado crudo] Diluya 2 µl con 3 µl de agua sin nucleasas.

b Cree una mezcla maestra durante 8 o más reacciones en el tubo de mezclamaestra. Multiplique cada volumen de reactivo con el número de reacciones enpreparación. Realice un 10 % de reactivo adicional para contar con excedente dematerial.} PCR1 (4,7 µl)} FEM (0,3 µl)} DPMA o DPMB (5,0 µl)

c Pipetee para mezclar y, a continuación, centrifugue brevemente.d Si está procesando más de ocho muestras, distribuya la mezcla maestra de

manera uniforme en cada pocillo de una gradilla de ocho tubos y, acontinuación, utilice una pipeta multicanal para dispensar.

e Añada 10 µl de mezcla maestra a cada pocillo de muestra de la placa de FSP.f Diluya 2 µl de 2800M con agua sin nucleasas de 98 µl en un nuevo tubo de

microcentrífuga de 1,5 ml. De pequeños golpes al tubo y, a continuación,centrifugue brevemente.

g Añada 5 µl de 2800M diluido como control de plantilla positivo al pocillocorrespondiente según la hoja de muestras.

h Añada 5 µl de agua sin nucleasas como control de amplificación de PCRnegativo al pocillo correspondiente según la hoja de muestras.

i Añada muestras a los pocillos según la hoja de muestras. Pipetee paramezclarlo.} [ADN purificado] Añada 5 µl de muestras de ADN diluido (0,2 ng/µl) a

cada pocillo.} [Lisado crudo] Añada 5 µl de muestra de lisado crudo diluido a cada

pocillo.

Amplificación

ymarcado

deobjetivos


3 Para el material de entrada de la tarjeta de FTA, realice los pasos siguientes:

a Coloque una punción de tarjeta de FTA de 1,2 mm en cada pocillo de la placa deFSP de acuerdo con la hoja de muestras.

b Añada 100 µl de tampón de 1X TBE.c Coloque en una gradilla de almacenamiento de tubos para PCR.d Agite a 1800 rpm durante 2 minutos.e Centrifugue a 1000 × g durante 30 segundos.f Retire y deseche todo el sobrenadante.g Añada los siguientes componentes el tubo de mezcla maestra de FTA.

} PCR1 (4,7 µl)} FEM (0,3 µl)} DPMA o DMPB (5,0 µl)} Agua sin nucleasas (5,0 µl)

h Añada 15 µl de mezcla maestra de FTA a una punción de FTA.i Añada 15 µl de mezcla maestra de FTA a un pocillo vacío como control sin

plantilla.j Diluya 2 µl de 2800M con agua sin nucleasas de 98 µl en un nuevo tubo de

microcentrífuga de 1,5 ml. De pequeños golpes al tubo y, a continuación,centrifugue brevemente.

k Añada 5 µl de 2800M diluido como control de plantilla positivo al pocillocorrespondiente según la hoja de muestras.

4 Centrifugue a 1000 × g durante 30 segundos.

5 Transporte al área posterior a la PCR.

6 Coloque en el ciclador térmico preprogramado y lleve a cabo el programa de PCR1.

PUNTO DE PARADA DE SEGURIDADSi va a detener el proceso, selle la placa y almacénela a una temperatura comprendidaentre 2 °C y 8 °C durante un periodo de 2 días como máximo. De manera alternativa,puede dejarla en el ciclador térmico durante la noche.


Enriquecimientodeobjetivos

Este proceso amplifica el ADN y añade los adaptadores de índice 1 (i7), los adaptadoresde índice 2 (i5) y las secuencias necesarias para la amplificación de grupos.Los adaptadores de índice marcan el ADN con una combinación única de secuencias deíndice, que permiten que los datos de cada biblioteca marcada se separen en los análisisposteriores.

NOTAEste procedimiento se describe con una placa de PCR de 96 pocillos. Sin embargo,al procesar ocho bibliotecas, se puede realizar con una gradilla de ocho tubos.

Consumibles} Kit de fijación de placa de índices ForenSeq} Adaptadores de índice 1 (i7) y tapones de tubo naranjas} Adaptadores de índice 2 (i5) y tapones de tubo blancos} PCR2 (Mezcla de reacción PCR2)} Tubos para microcentrífuga de 1,7 ml (1 por tubo de adaptador de índice)} Película adhesiva Microseal "A"} Sello adhesivo Microseal "B"

NOTAUtilice Microseal "A" cuando selle la placa antes de colocarla en el ciclador térmico. UtiliceMicroseal "B" para los demás pasos que requieran una placa sellada.

Acerca de los reactivos} Si está procesando más de ocho bibliotecas al mismo tiempo, distribuya la mezcla

PCR2 de manera uniforme en cada pocillo de una gradilla de ocho tubos y, acontinuación, utilice una pipeta multicanal para dispensar.

} Añada la mezcla PCR2 lentamente en cada pocillo para evitar la formación deburbujas de aire.


Elemento Almacenamiento InstruccionesAdaptadores deíndices (i5 e i7)

Entre -25 °C y -15 °C Retire solo los adaptadores utilizados.Descongele a temperatura ambientedurante 20 minutos.Agite en vórtex cada tubo para mezclarlo.Centrifugue brevemente con el tubo de1,7 ml Eppendorf.

PCR2 Entre -25 °C y -15 °C Descongele a temperatura ambiente.

Enriquecim

ientode

objetivos


2 Guarde el siguiente programa de PCR2 en el ciclador térmico:} Seleccione la opción de tapa precalentada y establezca la temperatura a 100 °C.} 98 °C durante 30 segundos} 15 ciclos de:

} 98 °C durante 20 segundos} 66 °C durante 30 segundos} 68 °C durante 90 segundos

} 68 °C durante 10 minutos} Mantenga la temperatura a 10 °C.

Procedimiento1 Centrifugue a 1000 × g durante 30 segundos.

2 Disponga los adaptadores de índice 1 (i7) en las columnas 1–12 del kit de fijación dela placa de índices ForenSeq.

3 Disponga los adaptadores de índice 2 (i5) en las filas A–H del kit de fijación de laplaca de índices ForenSeq.

4 Coloque la placa del kit de fijación de placa de índices ForenSeq.

Figura 3 Fijación de placa de índices ForenSeq (96 bibliotecas)

A Columnas de la 1 a la 12: Adaptadores de índice 1 (i7) (tapones naranjas)B Filas A–H: Adaptadores de índice 2 (i5) (tapones blancos)C Placa de FSP

5 Con una pipeta multicanal, añada 4 µl de cada adaptador de índice 1 (i7) a cadacolumna. Vuelva a colocar el tapón en cada tubo del adaptador i7 con un tapónnaranja nuevo.

6 Con una pipeta multicanal, añada 4 µl de cada adaptador de índice 2 (i5) a cadafila. Vuelva a colocar el tapón en cada tubo del adaptador i5 con un tapón blanconuevo.

7 Agite en un mezclador vorticial la mezcla PCR2 y, a continuación, centrifuguebrevemente.

8 Añada 27 µl de PCR2 a cada pocillo.



10 Coloque en el ciclador térmico preprogramado y lleve a cabo el programa de PCR2.

PUNTO DE PARADA DE SEGURIDADSi va a detener el proceso, selle el tubo y almacénelo a una temperatura comprendidaentre 2 °C y 8 °C durante un periodo de 7 días como máximo. De manera alternativa,puede dejarlo en el ciclador térmico durante la noche.

Purificación

debibliotecas


Purificacióndebibliotecas

Este proceso utiliza SPB (bolas de purificación de muestras) para purificar las bibliotecasamplificadas de los componentes de otras reacciones.

Consumibles} RSB (Tampón de resuspensión)} SPB (Bolas de purificación de muestras)} Placas de PCR de 96 pocillos, 0,3 ml, con bordes o semibordes} Placas MIDI de 96 pocillos (1 + 1 si procesa 16–96 bibliotecas)} Etanol al 80 % recién preparado (EtOH)} Sellos adhesivos Microseal "B"} Depósitos de reactivo sin ARNasa/ADNasa (1 + 1 si procesa más de 96 bibliotecas)

Acerca de los reactivos} Agite con un vórtex las SPB antes de cada uso.} Agite con un vórtex las SPB frecuentemente para asegurarse de que las bolas están

distribuidas de manera uniforme.} Aspire y dispense las SPB lentamente debido a la viscosidad de la solución.


Elemento Almacenamiento InstruccionesRSB Entre 2 °C y 8 °C Deje reposar durante 30 minutos hasta que alcance la

temperatura ambiente.SPB Entre 2 °C y 8 °C Deje reposar durante 30 minutos hasta que alcance la

temperatura ambiente.

2 Etiquete las placas con un rotulador de la siguiente manera.} PBP: placa MIDI} PLP: placa de PCR

Procedimiento1 Realice lo siguiente en función del número de bibliotecas que esté preparando:

Número debibliotecas

Procedimiento

< 16 Añada 50 µl de SPB × el número de bibliotecas a un tubo demicrocentrífuga de 1,7 ml.

16–96 Añada [50 µl de SPB × (el número de bibliotecas/8)] + 5 µl de SPB a cadapocillo de una columna de una nueva placa MIDI.

> 96 Añada (50 µl de SPB × el número de bibliotecas) + 200 µl de SPB a undepósito de reactivo multicanal.

2 Añada 45 µl de SPB a cada pocillo de la placa de PBP según la hoja de muestras.

3 Centrifugue la placa de FSP a 1000 × g durante 30 segundos.

4 Transfiera 45 µl al pocillo correspondiente de la placa de PBP, según la hoja demuestras.

5 Agite a 1800 rpm durante 2 minutos.


6 Incube a temperatura ambiente durante 5 minutos.

7 Coloque en la placa magnética y espere hasta que el líquido se vuelva transparente(aproximadamente 2 minutos).

8 Retire y deseche todo el sobrenadante de cada pocillo.

9 Lave dos veces como se indica a continuación.

a Añada 200 µl de EtOH al 80 % recién preparado en cada pocillo de muestra.b Incube en la placa magnética durante 30 segundos.c Retire y deseche todo el sobrenadante de cada pocillo.


11 Coloque en la placa magnética.

12 Utilice una pipeta de 20 µl para retirar el EtOH residual de cada pocillo.

13 Añada 52,5 µl de RSB a cada pocillo.

14 Agite a 1800 rpm durante 2 minutos. Si las bolas no se resuspenden, pipetee paramezclar o vuelva a agitar a 1800 rpm durante 2 minutos.



17 Transfiera 50 µl al pocillo correspondiente de la placa de PLP.


PUNTO DE PARADA DE SEGURIDADSi va a detener el proceso, selle la platina y almacénela a una temperatura comprendidaentre -25 °C y -15 °C durante un año como máximo.

Norm

alizaciónde

bibliotecas


Normalizacióndebibliotecas

Este proceso prepara bibliotecas de ADN para la generación de grupos con el objeto degarantizar que las bibliotecas de diferentes niveles de rendimiento se representan deigual manera dentro del experimento de secuenciación. Este proceso garantiza que lasmuestras con diferentes cantidades de entrada o tipos de muestran logran una densidadde grupo coherente para optimizar la resolución de las muestras individuales cuando seagrupan. Al normalizar la concentración de las bibliotecas, además de conservar elcontenido de cada biblioteca, la cuantificación posterior a la PCR y la normalización delos productos de PCR individuales no son necesarias.

Consumibles} HP3 (2N-NaOH)} LNA1 (Aditivos de normalización de bibliotecas 1)} LNB1 (Bolas de normalización de bibliotecas 1)} LNS2 (Tampón de almacenamiento 2 de normalización de bibliotecas)} LNW1 (Lavado de normalización de bibliotecas 1)} Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml} Una de los siguientes:

} Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml} Tubo cónico de 15 ml

} Placas de PCR de 96 pocillos, 0,3 ml, con bordes o semibordes} Placas MIDI de 96 pocillos} Sellos adhesivos Microseal "B"} Agua sin nucleasas} Depósito de reactivo sin ARNasa/ADNasa

ADVERTENCIAEste grupo de reactivos contiene formamida, una amida alifática que es una toxinareproductiva probable.LNA1 y LNW1 contienen ß-mercaptoetanol y una exposición prolongada puede resultartóxica para el sistema nervioso y producir daños en órganos.Lleve a cabo este procedimiento bajo una campana de extracción o en un área bienventilada, si lo desea. Evite su inhalación o ingestión, o el contacto con la piel o los ojos,pues podrían producirse lesiones. Deseche los contenedores y los contenidos no utilizadosde acuerdo con las normativas de seguridad gubernamentales de su región. Para obtenermás información, vea cómo puede acceder a las hojas de datos de seguridad (SDS) enAsistencia técnica en la página 39.El sobrenadante, el exceso de mezcla maestra LNA1/LNB1 y las puntas para pipetear lasmezclas LNA1 y LNB1 son residuos peligrosos. Deséchelos de acuerdo con la normativade seguridad gubernamental de su región.

Acerca de los reactivos} Tras la agitación vorticial, mantenga los aditivos LNA1 delante de una luz y

asegúrese de que no hay cristales y de que se han disuelto todos los precipitados.} Tras la agitación vorticial, asegúrese de que las bolas de LNB1 se han resuspendido

bien y que no hay ningún pellet en el fondo del tubo.} Resulta crítico resuspender el pellet de bolas de LNB1 en el fondo del tubo. Utilice

una pipeta de 1000 µl para garantizar que las bolas queden resuspendidas demanera homogénea y que no quede masa de bolas en el fondo del tubo. Laresuspensión es esencial para lograr una densidad de grupo coherente paraoptimizar la resolución de las bibliotecas individuales al agruparlas.


} La biblioteca que permanece en la placa de PLP se puede almacenar. Selle la placade PLP y almacénela a una temperatura comprendida entre -25 °C y -15 °C duranteun periodo de 1 año como máximo.


Elemento Almacenamiento InstruccionesHP3 Entre -25 °C y -15 °C Descongele a temperatura ambiente.LNA1 Entre -25 °C y -15 °C Descongele a temperatura ambiente. Agite en un

vórtex con inversión intermitente.LNB1 Entre 2 °C y 8 °C Deje reposar durante 30 minutos hasta que alcance

la temperatura ambiente. Agite con el vórtexdurante al menos 1 minuto, invirtiendo 5 vecescada 15 segundos. Pipetee para mezclar hasta quelos pellets de bolas del fondo se resuspendan.

LNW1 Entre 2 °C y 8 °C Deje reposar durante 30 minutos hasta que alcancela temperatura ambiente.

LNS2 Entre 15 °C y 30 °C Retírelo de su almacenamiento.

2 Etiquete los tubos y las placas con un rotulador de la siguiente manera.} Mezcla maestra LNA1/LNB1: tubo de microcentrífuga de 1,5 ml o tubo cónico de15 ml

} NWP: placa MIDI} NLP: placa de PCR

3 Disponga unos contenedores de desecho de residuos peligrosos separados paralíquidos y sólidos.

Procedimiento1 Cree una mezcla maestra en el tubo de la mezcla maestra LNA1/LNB1.

} LNA1 (46,8 µl) (Ejemplo: 8 reacciones de 374 µl)} LNB1 (8,5 µl) (Ejemplo: 8 reacciones de 68 µl)

2 Agite en un vórtex e invierta el tubo varias veces para mezclar.

3 Vierta en un depósito de reactivos.

4 Transfiera 45 µl a cada pocillo de la placa de NWP que contendrá una biblioteca deacuerdo con la hoja de muestras.

5 Coloque la placa de PLP en la placa magnética y espere hasta que el líquido sevuelva transparente (aproximadamente 2 minutos).

6 Transfiera 20 µl desde cada pocillo de la placa de PLP al pocillo correspondiente dela placa de NWP.


8 Prepare 0,1 de N HP3 en un tubo para microcentrífuga de 1,5 ml nuevo.} Agua sin nucleasas (33,3 µl) (Ejemplo: 8 reacciones de 266 µl)} HP3 (1,8 µl) (Ejemplo: 8 reacciones de 14 µl)

9 Invierta el tubo varias veces para mezclar.

10 Añada 30 µl de LNS2 a cada pocillo de la placa de NLP que contendrá unabiblioteca de acuerdo con la hoja de muestras.

Norm

alizaciónde

bibliotecas


11 Coloque la placa de NWP en la placa magnética y espere hasta que el líquido sevuelva transparente (aproximadamente 2 minutos).


13 Retire de la placa magnética.

14 Añada 45 µl de LNW1 a cada pocillo.




18 Repita los pasos 14–17 para realizar dos lavados.




22 Utilice una pipeta de 20 µl para retirar el sobrenadante residual de cada pocillo.


24 Añada 32 µl de 0,1 N HP3 recién preparado a cada pocillo.

25 Agite a 1800 rpm durante 5 minutos. Si las bolas no se resuspenden, pipetee paramezclar o vuelva a agitar a 1800 rpm durante 5 minutos.


27 Transfiera 30 µl al pocillo correspondiente de la placa de NLP. Pipetee paramezclarlo.


PUNTO DE PARADA DE SEGURIDADSi va a detener el proceso, selle la placa y almacénela a una temperatura comprendidaentre -25 °C y -15 °C durante un periodo de 30 días como máximo.


Agrupacióndebibliotecas

Este proceso combina volúmenes iguales de bibliotecas normalizadas para crear ungrupo de bibliotecas que se secuencien juntas en la misma celda de flujo.

Consumibles} Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml} Sello adhesivo Microseal "B"} Tapas y gradillas de ocho tubos sin ARNasa/ADNasa

Preparación1 Determine las bibliotecas que desea agrupar para la secuenciación.

} En el caso de muestras de casos de trabajo, no agrupe más de 32 bibliotecas,incluidos los controles positivos y negativos.

} En el caso de muestras de la base de datos, no agrupe más de 96 bibliotecas.

2 Marque el tubo PNL con un rotulador.

Procedimiento1 Transfiera 5 µl de cada biblioteca a una nueva gradilla de ocho tubos.

2 Almacene la placa en el área posterior a la PCR a una temperatura entre-25 °C y -15 °C durante un periodo de 30 días como máximo.

3 Transfiera el contenido de cada pocillo de la gradilla de ocho tubos al tubo PNL.

4 Agite en un mezclador vorticial y, a continuación, centrifugue brevemente.

PUNTO DE PARADA DE SEGURIDADSi va a detener el proceso, tape el tubo y almacénelo a una temperatura comprendidaentre -25 °C y -15 °C durante un periodo de 30 días como máximo.

Desnaturalización

ydilución

debibliotecas


Desnaturalizacióny dilucióndebibliotecas

Este proceso diluye las bibliotecas en HT1 (tampón de hibridación), añade HSC (Controlde secuenciación humana) y desnaturaliza mediante calor las bibliotecas en fase depreparación para la secuenciación.

NOTARealice este procedimiento inmediatamente antes de cargar la biblioteca en el cartucho dereactivos con el fin de garantizar una carga de plantillas eficaz en la celda de flujo.

Consumibles} HP3 (2N-NaOH)} HSC (Control de secuenciación humana)} Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (2)} El MiSeq FGx Reagent Kit contiene:

} HT1 (tampón de hibridación)} Cartucho de reactivo

} Agua sin nucleasas

Acerca de los reactivos} Siga las instrucciones de preparación del cartucho de reactivo en la Guía de referencia del

instrumento MiSeq FGx (n.º de documento 15050524).


Elemento Almacenamiento InstruccionesHP3 Entre -25 °C y -15 °C Descongele a temperatura ambiente.HSC Entre -25 °C y -15 °C Descongele a temperatura ambiente.HT1 Entre -25 °C y -15 °C Descongele a temperatura ambiente.Cartucho de reactivo Entre -25 °C y -15 °C Descongele a temperatura ambiente.

2 Precaliente el sistema de microcalentamiento a 96 °C.

3 Prepare lo siguiente:} Retire un tubo del refrigerador de mesa de un almacenamiento entre-25 °C y -15 °C o un baño de hielo.

} Prepare un baño de agua-hielo combinando tres partes de hielo y una parte deagua sin nucleasas.

4 Etiquete los tubos con un rotulador de la siguiente manera.} Mezcla de HSC} DNL

Procedimiento1 Cree una reacción de desnaturalización de HSC en el tubo de la mezcla de HSC.

} HSC (2 µl)} HP3 (2 µl)} Agua sin nucleasas (36 µl)






4 Añada 591 µl de HT1 al tubo DNL.

5 Transfiera 7 µl del tubo PNL al tubo DNL. Pipetee para mezclarlo.

6 Tape el tubo PNL y almacénelo a una temperatura comprendida entre-25 °C y -15 °C durante un periodo de 30 días como máximo. Si se superan los 30días de almacenamiento, se producirá una reducción significativa de la densidad delgrupo.

7 Transfiera 2 µl de la mezcla de HSC al tubo DNL. Pipetee para mezclarlo. Noalmacene la mezcla de HSC durante un periodo de tiempo prolongado, ya que sereduciría significativamente la densidad del grupo.


9 Coloque en el sistema de microcalentamiento a 96 °C durante 2 minutos.

10 Invierta el tubo varias veces para mezclar.

11 Colóquelo inmediatamente en el baño de agua-hielo o en un refrigerador de mesa auna temperatura de entre -25 °C y -15 °C durante 5 minutos.

12 Cargue inmediatamente todo el contenido en el cartucho de reactivo. Para obtenermás información, consulte las instrucciones Carga de bibliotecas de muestras encartuchos en la Guía de referencia del instrumento MiSeq FGx (n.º de documento 15050524).


Información

adicional


Informaciónadicional

Los protocolos que figuran en esta guía presuponen que usted está familiarizado con elcontenido de esta sección y que cuenta con los consumibles y equipos necesarios.

Contenido del kitAsegúrese de que tiene todos los reactivos del ForenSeq DNA Signature Prep Kit (n.º decatálogo TG-450-1001) identificados en esta sección antes de empezar el protocolo. Cadakit admite 384 reacciones y contiene 3 cajas.

Caja 1 previo a PCR, especificaciones de almacenamiento

Cantidad Reactivo Descripción Temperatura dealmacenamiento

2 2800M ADN de control 2800M Entre 2 °C y 8 °C8 PCR1 Mezcla de reacción de PCR1 Entre -25 °C y -15 °C8 FEM Mezcla de enzimas Entre -25 °C y -15 °C8 DPMA Mezcla para cebador de ADN A Entre -25 °C y -15 °C8 DPMB Mezcla para cebador de ADN B Entre -25 °C y -15 °C

Caja 2 posterior a PCR, almacene entre -25 °C y -15 °C

Cantidad Reactivo Descripción4 LNA1 Aditivos 1 de normalización de bibliotecas4 LNS2 Tampón de almacenamiento 2 de normalización de bibliotecas8 LNW1 Lavado 1 de normalización de bibliotecas3 HP3 HP3 2N-NaOH8 PCR2 Mezcla de reacción de PCR21 HSC Control de secuencia humano1 A501 Adaptador de índices A5011 A502 Adaptador de índices A5021 A503 Adaptador de índices A5031 A504 Adaptador de índices A5041 A505 Adaptador de índices A5051 A506 Adaptador de índices A5061 A507 Adaptador de índices A5071 A508 Adaptador de índices A5081 R701 Adaptador de índices R7011 R702 Adaptador de índices R7021 R703 Adaptador de índices R7032 R704 Adaptador de índices R7041 R705 Adaptador de índices R7051 R706 Adaptador de índices R7061 R707 Adaptador de índices R7071 R708 Adaptador de índices R7081 R709 Adaptador de índices R7091 R710 Adaptador de índices R7101 R711 Adaptador de índices R7111 R712 Adaptador de índices R7121 — Tapones de tubo para índice i7, naranjas1 — Tapones de tubo para índice i5, blancos


Caja 3 posterior a PCR, almacene entre 2 °C y 8 °C

Cantidad Reactivo Descripción4 LNB1 Bolas 1 de normalización de bibliotecas1 RSB Tampón de resuspensión2 SPB Bolas de purificación de muestras

Consumibles y equiposAsegúrese de que cuenta con el equipo y los consumibles proporcionados por el usuarionecesarios antes de comenzar el protocolo.El protocolo se ha optimizado y validado con los artículos que se enumeran. No segarantiza un rendimiento comparable al utilizar equipos y consumibles alternativos.

Consumibles

Consumible Proveedor

Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml Proveedor de laboratorio general

Tubos de microcentrífuga de 1,7 ml Proveedor de laboratorio general

Tubo cónico de 15 ml Proveedor de laboratorio general

Puntas de pipetas de barrera de 20 µl Proveedor de laboratorio general

Puntas de pipetas de barrera de 200 µl Proveedor de laboratorio general

Placas de PCR de 96 pocillos de 0,3 ml consemibordes

Eppendorf Twin-Tec, n.º de referencia951020303 o VWR, n.º dereferencia 89136-706

Placas de almacenamiento de 96 pocillos,pocillos redondos, 0,8 ml (placa MIDI)

Fisher Scientific, n.º de referencia AB 0859

Etanol, 200 probado (absoluto) parabiología molecular (500 ml)

Sigma-Aldrich, n.º de referencia E7023

Película adhesiva Microseal "A" Bio-Rad, n.º de referencia MSA-5001

Sellos adhesivos Microseal "B" Bio-Rad, n.º de referencia MSB-1001

MiSeq FGx Reagent Kit Illumina, n.º de catálogo TG-143-1001

Agua sin nucleasas Proveedor de laboratorio general

Gradilla de almacenamiento de tubos dePCR(si utiliza una tarjeta de FTA como materialde entrada)

VWR, n.º de referencia 80086-074

Uno de los siguientes, si utiliza lisadoscrudos como material de entrada:• Solución de extracción de ADNQuickExtract

• Kit SwabSolution

•Epicentre, n.º de catálogo QE09050•Promega, n.º de catálogo DC8271

Información

adicional


Consumible Proveedor

Tapas y gradillas de ocho tubos sinARNasa/ADNasa

Proveedor de laboratorio general

Depósitos de reactivos, multicanal,desechables, sin ARNasa/ADNasa

Labcor, n.º de referencia 730-001

Equipo

Equipo Proveedor/Descripción Anteriora laPCR

Posteriora la PCR

Refrigerador de mesapara tubos de 1,5 ml

VWR, n.º de catálogo 414004-286 X

Ciclador térmico de 96pocillos (con tapacaliente)

Consulte Cicladores térmicos. X

Microcentrífuga desobremesa

Proveedor de laboratorio general X X

Fijación de la placa deíndices ForenSeq

Illumina, n.º de catálogoFC-451-1001

X

Soporte magnético para96 pocillos

Life Technologies, n.º de referenciaAM10027 o proveedor delaboratorio general

X

Centrífuga demicroplacas

Proveedor de laboratorio general X X

Sistema de calentamientode 96 pocillos de 1,5 ml

Proveedor de laboratorio general X

Uno de los siguientesmezcladores térmicos dealta velocidad:• BioShake iQ• BioShake XP

Q instruments, n.º de catálogo:

•1808-0506•1808-0505

X

Mezclador vorticial Proveedor de laboratorio general X X


Cicladores térmicos

En la siguiente tabla figuran las opciones de configuración recomendadas para elciclador térmico. Si su laboratorio tiene un ciclador térmico que no se encuentre en lalista, valídelo antes de realizar el protocolo.

Cicladortérmico

Modo detemperatura

Temperaturade la tapa

Tipo derecipiente

Modode rampa

Cicladortérmico ABI LTI9700

9600 emulation Calefactado Tubos yplacas depolipropileno

8 %

Bio-Rad Calculado Calefactado,constante a100 °C

Tubos yplacas depolipropileno

0,2 °Cpor segundo

EppendorfMastercyclerPro S

Gradiente de S,tubo simulado

Calefactado Placa 2 %

Secuencias de índiceEl kit contiene las siguientes secuencias del adaptador de índices.

Índice 1 (i7) Secuencia Índice 1 (i7) SecuenciaR701 ATCACGAT R707 CAGATCATR702 CGATGTAT R708 ACTTGAATR703 TTAGGCAT R709 GATCAGATR704 TGACCAAT R710 TAGCTTATR705 ACAGTGAT R711 GGCTACATR706 GCCAATAT R712 CTTGTAAT

Índice 2 (i5) SecuenciaA501 TGAACCTTA502 TGCTAAGTA503 TGTTCTCTA504 TAAGACACA505 CTAATCGAA506 CTAGAACAA507 TAAGTTCCA508 TAGACCTA

LocusNOTA• La longitud de amplicón no incluye 120 pb para las secuencias de adaptadores deIllumina. Las posiciones de inicio y fin de amplicón son los puntos finales de 1 base delamplicón completo, incluidos los cebadores de coincidencia de secuencias en el genomade referencia humano hg19.

• Todos los locus en la mezcla de cebador de ADN A también se incluyen en la mezcla decebador de ADN B.

Los siguientes locus se detectan con la mezcla de cebador de ADN A o la mezcla decebador de ADN B.

Información

adicional


Amelogenina: un marcador genético que confirma el sexo del donante de la muestrabiológica. Su rango de tamaño oscila entre 106–112 pb y el ADN de control esmasculino.

Locus

Longituddel

amplicón (pb)

CromosomaPosición deinicio delamplicón

Posición defin delamplicón

Alelos decontrol2800M

rs10495407 109 1 238439234 238439342 Grs1294331 85 1 233448359 233448443 GArs1413212 64 1 242806767 242806830 Grs1490413 98 1 4367256 4367353 Ars560681 90 1 160786641 160786730 AGrs891700 115 1 239881850 239881964 AGrs1109037 118 2 10085691 10085808 Grs12997453 100 2 182413195 182413294 Ars876724 119 2 114945 115063 Crs907100 115 2 239563542 239563656 CGrs993934 120 2 124109120 124109239 Crs1355366 119 3 190806041 190806159 AGrs1357617 120 3 961696 961815 ATrs2399332 157 3 110300999 110301155 ACrs4364205 98 3 32417576 32417673 Grs6444724 120 3 193207306 193207425 Trs1979255 102 4 190318007 190318108 Grs2046361 120 4 10968994 10969113 Ars279844 167 4 46329584 46329750 ATrs6811238 120 4 169663541 169663660 Grs13182883 169 5 136633252 136633420 AGrs159606 104 5 17374845 17374948 Ars251934 97 5 174778619 174778715 Trs338882 157 5 178690599 178690755 Crs717302 110 5 2879333 2879442 Grs13218440 170 6 12059928 12060097 AGrs1336071 120 6 94537182 94537301 Grs214955 120 6 152697629 152697748 Grs727811 115 6 165045254 165045368 Ars321198 165 7 137029715 137029879 Trs6955448 120 7 4310285 4310404 CTrs737681 120 7 155990742 155990861 Trs917118 109 7 4456953 4457061 Crs10092491 116 8 28411037 28411152 CTrs2056277 104 8 139399038 139399141 Crs4606077 151 8 144656710 144656860 CTrs763869 85 8 1375576 1375660 CTrs1015250 117 9 1823702 1823818 Grs10776839 103 9 137417271 137417373 Grs1360288 119 9 128967994 128968112 Crs1463729 99 9 126881396 126881494 GArs7041158 115 9 27985907 27986021 C

Tabla 1 SNP informativos de identidad


Locus

Longituddel

amplicón (pb)




rs3780962 94 10 17193284 17193377 Trs735155 170 10 3374133 3374302 Ars740598 120 10 118506839 118506958 AGrs826472 153 10 2406511 2406663 Trs964681 105 10 132698394 132698498 CTrs10488710 118 11 115207134 115207251 CGrs1498553 111 11 5708981 5709091 CTrs2076848 118 11 134667502 134667619 ATrs901398 90 11 11096173 11096262 Trs10773760 99 12 130761623 130761721 AGrs2107612 103 12 888262 888364 AGrs2111980 94 12 106328186 106328279 Grs2269355 65 12 6945881 6945945 Crs2920816 157 12 40862976 40863132 Trs1058083 76 13 100038193 100038268 AGrs1335873 109 13 20901665 20901773 Trs1886510 116 13 22374646 22374761 CTrs354439 170 13 106938320 106938489 Trs1454361 118 14 25850765 25850882 ATrs4530059 170 14 104769099 104769268 Grs722290 101 14 53216686 53216786 Grs873196 114 14 98845506 98845619 CTrs1528460 115 15 55210664 55210778 Trs1821380 118 15 39313343 39313460 Grs8037429 63 15 53616876 53616938 Trs1382387 89 16 80106318 80106406 GTrs2342747 104 16 5868645 5868748 AGrs430046 119 16 78016980 78017098 Crs729172 104 16 5606153 5606256 Crs740910 113 17 5706552 5706664 Ars8078417 143 17 80461847 80461989 CTrs938283 98 17 77468433 77468530 Trs9905977 170 17 2919324 2919493 Grs1024116 98 18 75432317 75432414 Ars1493232 75 18 1127945 1128019 Ars1736442 153 18 55225698 55225850 Grs9951171 119 18 9749789 9749907 Grs576261 76 19 39559780 39559855 ACrs719366 170 19 28463281 28463450 Trs1005533 158 20 39487066 39487223 Ars1031825 126 20 4447416 4447541 Crs1523537 117 20 51296076 51296192 Crs445251 119 20 15124865 15124983 CGrs221956 97 21 43606933 43607029 Crs2830795 114 21 28608089 28608202 Ars2831700 79 21 29679639 29679717 A

Información

adicional


Locus

Longituddel

amplicón (pb)




rs722098 101 21 16685561 16685661 AGrs914165 156 21 42415865 42416020 AGrs1028528 78 22 48362256 48362333 AGrs2040411 68 22 47836378 47836445 Ars733164 120 22 27816711 27816830 AGrs987640 120 22 33559450 33559569 AT

LocusLongitud

del amplicón mínima (pb)

Longituddel amplicón máxima

(pb)Cromosoma


D1S1656 141 189 1 12,13TPOX 85 145 2 11,11D2S441 144 180 2 10,14D2S1338 114 182 3 22,25D3S1358 138 186 3 17,18D4S2408 93 117 4 9,9FGA 150 306 22 20,23D5S818 102 150 5 12,12CSF1PO 85 129 5 12,12D6S1043 163 227 6 12,20D7S820 135 179 7 8,11D8S1179 86 138 8 14,15D9S1122 108 140 9 12,12D10S1248 128 172 10 13,15TH01 100 148 11 6,9.3vWA 132 192 12 16,19D12S391 237 281 12 18,23D13S317 138 186 13 9,11PentaE 362 467 15 7,14D16S539 132 180 16 9,13D17S1301 114 142 17 11,12D18S51 140 227 18 16,18D19S433 154 212 19 13,14D20S482 125 165 20 14,15D21S11 158 276 20 29,31.2PentaD 209 293 21 12,13D22S1045* 193 229 21 16,16

Tabla 2 STR autosómicos

* Interprete el locus D22S1045 con precaución. Pueden verse más desequilibrios en losrecuentos de lectura entre los alelos de un heterocigoto que en los observados en otroslocus. Considere un genotipo de varios locus al determinar la presencia de una mezclade ADN.


LocusLongitud



(pb)Cromosoma


DYF387S1 123 155 Y 37,38DYS19 261 345 Y 14DYS385a-b 316 354 Y 13,16DYS389I 231 275 Y 14DYS389II 255 299 Y 31DYS390 242 286 Y 24DYS391 123 167 Y 10DYS392 346 358 Y 13DYS437 178 210 Y 14DYS438 144 169 Y 9DYS439 199 239 Y 12DYS448 288 324 Y 19DYS460 356 380 Y 11DYS481 102 129 Y 22DYS505 154 194 Y 11DYS522 294 334 Y 12DYS533 198 258 Y 12DYS549 214 262 Y 13DYS570 162 214 Y 17DYS576 183 235 Y 18DYS612 215 248 Y 29DYS635 214 306 Y 21DYS643 115 115 Y 10Y-GATA-H4 151 203 Y 11

Tabla 3 Marcadores de haplotipo Y

LocusLongitud



(pb)Cromosoma


DXS10074 211 309 X 21DXS10103 161 185 X 18DXS10135 228 334 X 28DXS7132 176 208 X 13DXS7423 147 215 X 15DXS8378 430 462 X 12HPRTB 193 237 X 12

Tabla 4 Marcadores de haplotipo X

Información

adicional


Además de los SNP y los marcadores de haplotipo anteriores, los siguientes locustambién se detectan con la mezcla de cebador de ADN B. Estos no se incluyen en lamezcla de cebador de ADN A.

Locus

Longituddel

amplicón (pb)

Cromosoma Posición de iniciodel amplicón

Posición de findel amplicón


rs28777 92 5 33958916 33959007 Ars12203592 110 6 396273 396382 Crs4959270 161 6 457655 457815 ACrs683 120 9 12709246 12709365 ACrs1042602 113 11 88911659 88911771 ACrs1393350 99 11 89010977 89011075 Grs12821256 119 12 89328278 89328396 CTrs12896399 73 14 92773627 92773699 Grs2402130 120 14 92801169 92801288 Ars1800407 119 15 28230246 28230364 GN29insA 112 16 89985688 89985799 Crs1110400 213 16 89985774 89985986 Trs11547464 213 16 89985774 89985986 Grs1805005 173 16 89986044 89986216 Grs1805006 173 16 89986044 89986216 Crs1805007 213 16 89985774 89985986 Crs1805008 213 16 89985774 89985986 Crs1805009 227 16 89986484 89986710 Grs201326893_Y152OCH

213 16 89985774 89985986 C

rs2228479 173 16 89986044 89986216 Grs885479 213 16 89985774 89985986 Grs2378249 118 20 33218028 33218145 A

Tabla 5 SNP informativos de fenotipo

Locus

Longituddel

amplicón (pb)




rs2814778 120 1 159174650 159174769 Ars3737576 98 1 101709521 101709618 Ars7554936 106 1 151122413 151122518 CTrs10497191 101 2 158667153 158667253 Crs1834619 84 2 17901444 17901527 Grs1876482 120 2 17362526 17362645 Crs260690 115 2 109579681 109579795 Ars3827760 108 2 109513546 109513653 Trs6754311 98 2 136707920 136708017 CTrs798443 84 2 7968221 7968304 Ars12498138 119 3 121459545 121459663 Grs1919550 117 3 121364112 121364228 Ars1229984 120 4 100239288 100239407 Grs3811801 114 4 100244261 100244374 C

Tabla 6 SNP informativos de ascendencia


Locus

Longituddel

amplicón (pb)




rs4833103 95 4 38815462 38815556 ACrs7657799 116 4 105375396 105375511 Trs7722456 114 5 170202901 170203014 Trs870347 119 5 6844995 6845113 Trs16891982* 108 5 33951621 33951728 Grs192655 70 6 90518235 90518304 AGrs3823159 119 6 136482701 136482819 Ars917115 71 7 28172543 28172613 Trs1462906 84 8 31896545 31896628 Crs1871534 71 8 145639652 145639722 Crs2196051 120 8 122124216 122124335 Trs6990312 111 8 110602270 110602380 Grs3814134 104 9 127267664 127267767 Trs4918664 168 10 94920962 94921129 Ars1079597 167 11 113296227 113296393 Grs174570 120 11 61597179 61597298 Crs2238151 113 12 112211753 112211865 CTrs671 136 12 112241658 112241793 Grs1572018 116 13 41715225 41715340 AGrs2166624 71 13 42579949 42580019 AGrs7326934 96 13 49070482 49070577 Grs7997709 85 13 34847693 34847777 Trs9522149 119 13 111827125 111827243 Crs200354 165 14 99375246 99375410 Grs12439433 100 15 36219979 36220078 Grs1426654 92 15 48426457 48426548 Ars1800414 116 15 28196969 28197084 Ars735480 108 15 45152321 45152428 Trs12913832* 119 15 28365523 28365641 AGrs459920 78 16 89730800 89730877 Trs11652805 119 17 62987113 62987231 Trs17642714 118 17 48726060 48726177 ATrs2593595 102 17 41056210 41056311 TCrs4411548 158 17 40658440 40658597 Grs4471745 67 17 53568849 53568915 Grs2042762 83 18 35277568 35277650 Ars3916235 120 18 67578894 67579013 AGrs4891825 106 18 67867615 67867720 AGrs7226659 149 18 40488180 40488328 Grs7251928 200 19 4077044 4077243 Ars310644 89 20 62159472 62159560 Ars2024566 88 22 41697312 41697399 A

* También se utiliza para la predicción de fenotipos.

Información

adicional


Acrónimos

Acrónimo Definición

2800M ADN de control 2800M

A7XX Adaptador de índice i7

A50X Adaptador de índice i5

DNL Bibliotecas normalizadas diluidas

DPMA Mezcla para cebador de ADN A

DPMB Mezcla para cebador de ADN B

FEM Mezcla de enzimas

FSP Placa de muestras ForenSeq

HP3 NaOH 2N

HSC Control de secuenciación humana

HT1 Tampón de hibridación

LNA1 Aditivos 1 de normalización de bibliotecas

LNB1 Bolas 1 de normalización de bibliotecas

LNS2 Tampón de almacenamiento 2 de normalización de bibliotecas

LNW1 Lavado 1 de normalización de bibliotecas

NLP Placa de biblioteca normalizada

NWP Placa de trabajo de normalización

PBP Placa de bolas de purificación

PCR1 Mezcla de reacción de PCR1

PCR2 Mezcla de reacción de PCR2

PLP Placa de biblioteca purificada

PNL Bibliotecas normalizadas agrupadas

RSB Tampón de resuspensión

SPB Bolas de purificación de muestras

Asistencia

técnica

Guía de referencia de ForenSeqDNASignature Prep

Asistencia técnica

Si necesita asistencia técnica, póngase en contacto con el servicio de asistencia técnica deIllumina.

Sitio web www.illumina.com

Correo electrónico [email protected]

Tabla 7 Información de contacto general de Illumina

Zona Número de contacto Zona Número de contactoNorteamérica 1.800.809.4566 Irlanda 1.800.812949Alemania 0800.180.8994 Italia 800.874909Australia 1.800.775.688 Noruega 800.16836Austria 0800.296575 Nueva Zelanda 0800.451.650Bélgica 0800.81102 Países Bajos 0800.0223859Dinamarca 80882346 Reino Unido 0800.917.0041España 900.812168 Suecia 020790181Finlandia 0800.918363 Suiza 0800.563118Francia 0800.911850 Otros países +44.1799.534000

Tabla 8 Números del Servicio de asistencia al cliente de Illumina

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*20000923*N.º de material 20000923

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