GENÈTICA Introducció (1) La genètica com a ciència (1.1) Segons la definició clàssica de Bateson (1906), la genètica és la ciència que estudia l’herència i la variació en els éssers vius. Els organismes biològics contenen informació codificada que es transmet de generació a generació. La ciència de la genètica va evolucionar des de la genètica molecular, genètica de poblacions fins a arribar a la genètica quantitativa. Aplicacions de la genètica veterinària (1.2) La genètica en l’àmbit de la veterinària pot utilitzar-se per:

· Diagnosticar malalties segons les bases moleculars i investigar la resistència genètica a les malalties. Exemples:

· Les bases moleculars de la condrodisplasia hereditària ovina demostren que es produeix una mutació de l’aminoàcid Val per Glu en la posició 700 del domini tirosinquinasa del fibroblast growth factor receptor 3, lo que produeix una diferenciació anormal dels condròcits. Les bases moleculars de la resistència al scrapie oví demostren que uns determinats aminoàcids en determinades posicions del gen PrP oví poden provocar una sensibilització o resistència per l’scrapie oví. Les bases moleculars són útils també per diagnosticar malalties com la leishmaniasis canina a través de la utilització de PCR.

· Construir mapes genètics i físics, buscar el quantitative trait loci i observar els gens majors. Exemples:

· Els mapes genètics i físics, i la cerca quantitativa de caràcters s’utilitzen per comprovar la correspondència entre cromosomes de diferents espècies, com el mapa de lligament del cromosoma 4 porcí i la seva correspondència amb els cromosomes 1 i 8 dels humans. · El gen major, com el que actua en la hipertròfia muscular bovina, provoca un increment molt marcat en el desenvolupament de la musculatura glútia del ramat boví a causa d’una deleció de 11 parells de bases en el gen de la miostatina.

· Identificar individualment als animals, fer proves de paternitat i sexatge. Exemple: · La utilització de marcadors genètics altament polimòrfics permet identificar individus i assignar paternitats. Un sistema per assignar paternitats és l’anàlisi de microsatèl·lits.

· Gestionar recursos genètics en espècies salvatges. Exemples: · Mitjançant la genètica es poden obtenir les històries demogràfiques de determinades poblacions salvatges.

· Investigar sobre l’origen de les diferents races d’espècies domèstiques. Exemple: · Un anàlisis filogenètic pot trobar l’individu d’origen de diferents espècies domèstiques. · Dissenyar esquemes de selecció en espècies d’interès productiu com el color de la capa, la presència de banyes, el gen booroola de prolificitat en oví, el gen del síndrome d’estrès porcí, la hipertròfia muscular en boví i oví, la determinació del sexe en aus, l’hemofília... Exemple:

· Un esquema típic en la selecció d’oví mostra com d’una població de mascles i femelles es seleccionen 1500 individus mascle per a fer una selecció individual de cria, de la qual sorgirà una petita part (430) que aniran a parar a un centre de recollida de semen degut als bons caràcters dels que disposen; 350 d’aquests individus entraran en un rang d’elit i s’utilitzaran per inseminar a les femelles.

Unes mirades al passat (1.3) Els dofins i les vaques tenen un avantpassat comú anomenat Indohyus, l’avantpassat dels cetartiodàctils. Per la banda humana, mitjançant la seqüenciació del genoma de l’Homo sapiens i l’Homo neanderthalensis extingit fa 30.000 anys, s’ha comprovat que tenien entre ells una divergència genètica del 0’5%, i fins i tot es dubta una possible hibridació entre ells. A més, existeix una hipòtesi que manté que els primers Homo sapiens originats al sud d’Àfrica fa 130.000 anys, van anar migrant cap a Europa, Àsia, Oceania i Amèrica, conquerint tot el mon i relacionant-se (i fins i tot hibridant-se, es creu) amb altres espècies del gènere Homo. En quant als mamuts, gràcies a l’estudi genètic, s’ha pogut comprovar com unes mutacions determinades en el genoma, provocava l’expressió d’uns aminoàcids determinats en unes posicions determinades que conseqüentment provocaven en aquests animals un color negre o un color blanc en el seu pelatge. Gràcies a la genètica també s’ha pogut esbrinar l’origen de les diferents races en espècies domèstiques. L’estudi de la distribució geogràfica dels llinatges mitocondrials caprins ha demostrat que hi ha únicament dos possibles centres de domesticació de les cabres: l’Orient Pròxim i la Índia. Genètica mendeliana (2) Definicions bàsiques (2.1) Un gen s’ha definit clàssicament com una unitat hereditària que ocupa una posició específica (locus) en el genoma i que codifica per un mRNA que dona lloc a una proteïna amb una funció determinada. Tanmateix, la definició actual trenca aquest dogma, ja que es coneixen algunes molècules de RNA que també tenen funcions específiques. El conjunt de gens formen el genoma de l’individu. Un al·lel és un gen que té una o més variants degut al canvi d’una base nucleotídica. El genotip és el conjunt de dos al·lels que corresponen a una regió específica del genoma. El fenotip és una característica observable determinada pel genotip i l’ambient. Experiments de Mendel (2.2) Gregor Mendel va proposar els fonaments de la genètica, encara que durant una llarga època no es varen tenir en compte. Mendel va escollir la planta del pèsol per la realització dels seus experiments ja que existien línies altament consanguínies, tenien caràcters fàcilment observables (com el color i la textura de la llavor), eren plantes petites i de creixement ràpid, i la realització dels encreuaments és senzilla. Llei de la segregació igualitària (2.2.1) Quan els dos individus de la generació Parental són homozigots per a un únic caràcter i amb un fenotip diferent, el total de la generació Filial1 serà heterozigot per a aquest caràcter, mostrant en el fenotip l’al·lel dominant (color verd) i no el recessiu (color groc). El creuament entre individus de la F1 aporta una nova generació F2 en la qual reapareix el fenotip recessiu, demostrant que la F1 era portadora de la informació recessiva. Aquesta nova generació conté individus homozigots dominants, homozigots recessius i heterozigots, els quals genotípicament es troben en proporció 1:2:1 i fenotípicament en proporció 3:1. La llei de segregació igualitària demostra que els dos al·lels d’un gen es divideixen en les mateixes proporcions en els gamets; quan es forma el zigot, el seu genotip serà la mescla del contingut genètic dels dos gamets.

Llei de la transmissió independent i Dihibridisme (2.2.2) El creuament de dos varietats pures (homozigots) que difereixen per a dos caràcters (AArr x aaRR) generaran una generació heterozigòtica igual formada pels fenotips dominants. El creuament entre individus d’aquesta generació F1 aporta una nova generació F2 (dihíbrida) on la proporció dels diferents fenotips és 9:3:3:1. La llei de transmissió independent demostra doncs, que la segregació dels al·lels d’un gen determinat (color) és independent de la segregació dels al·lels d’un altre gens determinat (textura), sempre i quan els gens es trobin separats. El dihibridisme es produeix quan els individus que es creuen són dobles heterozigots. El quadre de Punnett permet calcular les freqüències relatives de cada genotip i fenotip. Suposant un creuament AaRr x AaRr: Polihibridisme (constants numèriques) (2.2.3) El polihibridisme és el creuament entre dos heterozigots per a més de 2 al·lels. En aquests casos en els que estudiem la combinació de més d’un tipus d’al·lel, utilitzarem unes operacions per saber el nombre de diverses aspectes: · 2n per esbrinar el nombre de fenotips diferents en dominància completa · 3n per esbrinar el nombre de genotips diferents en dominància completa · 3n per esbrinar el nombre de fenotips diferents en dominància incompleta · 2n per esbrinar el nombre de genotips homozigots diferents

· 3n - 2n per esbrinar el nombre de genotips heterozigots diferents · 2n per esbrinar el nombre de gamets diferents · 4n per esbrinar el nombre de combinacions gamètiques diferents.

Altres termes (2.3) El retrocreuament o backcross es produeix quan es creuen individus de generacions diferents (F1 x P). El creuament prova consisteix en creuar un individu indeterminat genotípicament però amb fenotip dominant (AA o Aa) amb un individu homozigot recessiu (aa) per esbrinar el genotip de l’individu indeterminat segons el fenotip de la F1 (Aa o aa). Relacions de dominància entre al·lels (3) Per conèixer les relacions de dominància entre dos al·lels, és necessari observar el fenotip de l’heterozigot. Ens podem trobar amb una gran quantitat de relacions diferents entre al·lels, encara que les més comuns són la dominància incompleta, la dominància completa i la sobredominància. Dominància completa (3.1) La dominància completa es dona quan l’individu heterozigot (CT) posseeix el mateix fenotip que l’individu homozigot dominant, per lo que el gen dominant emmascara completament el gen recessiu. Un cas de malaltia hereditària amb aquest tipus de dominància és la Citrulinemia bovina, en la qual el gen que es tradueix per la Arginina succinat sintasa que participa en el cicle de la urea, pateix una mutació en una C per una T, convertint el codó per l’arginina en un codó d’stop prematur; els individus homozigots recessius (TT) amb aquesta mutació pateixen símptomes nerviosos i la mort. Dominància incompleta (3.2) La dominància incompleta es dona quan l’individu heterozigot (+B) posseeix un fenotip intermedi entre els individus homozigots dominant i recessiu. Un cas de malaltia hereditària amb aquest tipus de dominància és la Fecundity Booroola, en la qual el gen que es tradueix per la proteïna bone morphogenetic protein-receptor-IB pateix una mutació de l’aminoàcid Glu de la posició 249 per un aminoàcid Arg; els individus homozigots dominants (++)

faran madurar un sol fol·licle ovàric normal cada cicle estral, els individus homozigots recessius (BB) faran madurar molts fol·licles ovàrics molt petits cada cicle estral, i els individus heterozigots (+B) faran madurar més d’un fol·licle ovàric de mida petita cada cicle estral. Herència intermèdia (3.3) L’herència intermèdia es dona quan l’individu heterozigot (Aa) posseeix un fenotip intermedi entre els individus homozigots dominant i recessiu, expressant els gens alhora i en la mateixa intensitat. Un cas d’herència intermèdia és el fenotip d’algunes persones, en les quals els progenitors són homozigots diferents per al color de pell (AA i aa). Codominància (3.4) La codominància es dona quan l’individu heterozigot (Aa) posseeix el mateix fenotip que els individus homozigots (dominant i recessiu) segons la zona del cos. Un cas de codominància és el fenotip roan d’algunes vaques, en les quals el gen que es tradueix pel kit ligand pateix una mutació de l’aminoàcid Ala de la posició 193 per l’aminoàcid Asp; els individus homozigots dominants (AA) tindran una coloració marró en el pèl, els homozigots recessius (aa) tindran una coloració blanca, i els heterozigots (Aa) tindran una coloració marró i blanca alhora repartida per diferents parts del cos. Sobredominància (3.5) La sobredominància es dona quan l’individu heterozigot (Aa) pateix una amplificació del fenotip homozigot dominant. Un cas de sobredominància és la producció d’un complex major d’histocompatibilitat, on la mutació recessiva d’un gen que es tradueix en un receptor de membrana, provoca un augment d’afinitat. Altres exemples (3.6) La síndrome d’intersexualitat en caprí ve determinada pel sexe i per la combinació dels possibles genotips:

PP PP’ P’P’ Femella Intesexe i sense banyes Normal i sense banyes Normal i amb banyes Mascle Alguns estèrils i sense banyes Normal i sense banyes Normal i amb banyes

L’anèmia falciforme en humà ve determinada pel gen de la hemoglobina β i provoca que els eritròcits adoptin una forma de falç i quedin atrapats en els microcapil·lars causant una varietat de símptomes:

HbA HbA HbA HbS HbS HbS Anemia (HbA > HbS) No No Si

RBC (HbA = HbS) Normals Deformes a baixes [O2] Deformes Malària (HbS = HbA) Susceptible Resistent Resistent

Veient aquests exemples podem dir que les relacions de dominància depenen dels caràcters que es considerin. Al·lelisme múltiple (3.7) L’al·lelisme múltiple es dona quan un gen pot presentar més de dues variants. Una sèrie al·lèlica és el conjunt d’al·lels d’un gen. Els isoal·lels són diferents al·lels d’un gen que tenen efectes fenotípics idèntics. Un exemple conegut d’al·lelisme múltiple en les espècies domèstiques és el dels gens que determinen el color de la capa, actuant sobre el mecanisme de síntesis de la melanina. El color de la capa es troba influenciat per un sol gen amb possibles al·lels diferents, els quals es tradueixen en diferents receptors de la melanocortina. La pigmentació final és el resultat de la interacció de diferents gens i de diferents al·lels. Interacció gènica (4) La interacció gènica és la interacció que hi ha entre diferents gens per a la determinació d’un caràcter fenotípic.

Tipus d’interacció (4.1) Definicions:

· Un gen epistàtic és aquell que té la capacitat de suprimir o emmascarar l’expressió d’un altre gen. · Un gen modificador és aquell que té la capacitat de canviar de forma quantitativa l’expressió d’un altre gen. · Un gen supressor és aquell que té la capacitat d’eliminar l’expressió fenotípica d’un altre gen.

Podem trobar un conjunt molt diferent de tipus d’interacció: · Interacció sense epistàsia: És la interacció que hi ha entre gens que segueixen al peu de la lletra les Lleis de Mendel on els caràcters són simples. Exemple: La forma de la cresta de les gallines ve determinada per la interacció entre els al·lels A i a d’un gen i els al·lels B i b de l’altre. El creuament entre dos individus dobles heterozigots (AaBb x AaBb) fenotípicament amb una cresta en forma de nou, produirà una proporció de fenotips que segueixen les lleis de Mendel: 9:3:3:1, on A_B_ tindran la cresta en forma de nou, aaB_ tindran la cresta en forma de pèsol, A_bb tindran la cresta en forma de roseta, i aabb tindran una cresta senzilla. · Epistàsia recessiva: En la interacció amb epistàsia recessiva trobem 3 fenotips: 9:3:4. Està produïda per l’expressió d’un gen epistàtic (homozigot recessiu) que provoca la supressió d’un o més gens. Exemple: El color de les vaques ve determinada per la combinació dels al·lels E i e dels gens pel color (negre i marró respectivament), tanmateix, l’altre gen determina si hi ha color amb el seu al·lel C dominant o si no hi ha color amb el seu al·lel c recessiu. El creuament entre dos individus dobles heterozigots (EeCc x EeCc) fenotípicament negres, produirà una proporció de fenotips 9:3:4, on E_C_ tindran un color negre, eeC_ tindran un color vermell, i _ _cc seran albins. L’expressió homozigòtica del gen c recessiu impedeix la creació de la tirosinasa, per lo que no es pot sintetitzar melanina i es bloqueja l’aparició dels colors. · Epistàsia dominant: En la interacció amb epistàsia dominant trobem 3 fenotips: 12:3:1. Està produïda per l’expressió d’un gen epistàtic (heterozigot o homozigot dominant) que provoca la supressió d’un o més gens. Exemple: El color de la llana de les ovelles ve determinada per la combinació dels al·lels B i b dels gens pel color (negre i marró respectivament), tanmateix, l’altre gens determina si hi ha color amb e l seu al·lel a recessiu o si no hi ha color amb el seu al·lel A dominant. El creuament entre dos individus dobles heterozigots (AaBb x AaBb) fenotípicament amb llana blanca, produirà una proporció de fenotips 12:3:1, on A_ _ _ seran de llana blanca, aaB_ seran de llana negre, i aabb seran de llana marró. · Epistàsia doble recessiva: En la interacció amb epistàsia doble recessiva trobem 2 fenotips: 9:7. Està produïda per l’expressió de dos gens epistàtics (homozigots recessius) alhora o de manera individual que provoquen la supressió d’un o més gens. Exemple: El color del pelatge dels conills ve determinat per la combinació dels al·lels R1 i R2 de dos gens diferents, tanmateix, els altres al·lels r1 i r2 d’aquests dos gens diferents determinen un pelatge “rex” en el conill si qualsevol dels dos es troba homozigòtic. El creuament entre dos individus dobles heterozigots (R1r1R2r2 x R1r1R2r2) fenotípicament normals, produirà una proporció de fenotips 9:7, on R1_R2_ tindran un pelatge normal, i r1r1_ _ i _ _r2r2 tindran un pelatge “rex”. · Epistàsia doble dominant: En la interacció amb epistàsia doble dominant trobem 2 fenotips: 15:1. Està produïda per l’expressió de dos gens epistàtics (heterozigots o homozigots dominants) alhora o de manera individual que provoquen la supressió d’un o més gens. Exemple: La forma de la llavor de la planta Capsella ve determinada per la combinació dels al·lels a i b de dos gens diferents per la forma ovalada, tanmateix, els altres al·lels A i B d’aquests dos gens determinen una forma triangular. El creuament de dos individus dobles

heterozigots (AaBb x AaBb) fenotípicament triangulars, produirà una proporció de fenotips 15:1, on A_ _ _ i _ _B_ tindran una forma triangular, i aabb tindran una forma ovalada. · Supressió dominant d’A sobre B o interacció de gens dominants i recessius: En la supressió dominant trobem 2 fenotips: 13:3. Està produïda per l’expressió d’un gen supressor dominant i un gen supressor recessiu. Exemple: L’aparició de color en les gallines ve determinat per l’expressió de l’al·lel C dominant d’un gen, tanmateix, els al·lels c recessius homozigots d’aquest gen i l’al·lel I (regula la polimerització de la melanina) dominant d’un altre gen provoquen falta de color; per tant, l’aparició del I (dominant) i l’aparició del gen i homozigot (recessiu) tenen el mateix efecte. El creuament de dos individus dobles heterozigots (IiCc x IiCc) fenotípicament incolors, produirà una proporció de fenotips 13:3, on I_ _ _ i _ _cc seran incolors, i iiC_ tindran color. Estudis demostren que les gallines de color pateixen més picatge per part de les companyes que les blanques.

Les interaccions poden arribar a ser de molts tipus i summament complexes. Pleitropia (4.2) La pleitropia fa referència a un gen que té efectes diversos sobre múltiples caràcters fenotípics que no tenen perquè estar relacionats entre si. Exemple: Les proteïnes β-defensines tenen la funció d’activar cèl·lules que produeixin inflamacions i respostes antimicrobianes. Algunes β-defensines dels gossos es troben mutades quan el gen CBD103 pateix una deleció de 3 parells de bases, produint que aquesta proteïna perdi un residu de glicina en la posició 23; quan això es produeix, aquesta proteïna té elevada afinitat pel receptors de la melanocortina 1, que al unir-se, estimula la producció d’eumelanina (pigment negre) per part dels melanòcits en comptes de la feomelanina que hagués estat formada si s’haguessin connectat la proteïna Agoutí amb el receptors de la melanocortina 1 (com hauria sigut normal). La mutació de les β-defensines pot produir, a més, que s’uneixi al receptor de melanocortina 4, inhibint la sacietat i provocant sobrepès en l’individu. Letalitat (4.3) Els gens letals són aquell conjunt de gens que són crucials pel manteniment de la vida des de que es produeix la unió dels gamets; la seva mutació pot comprometre la viabilitat de l’individu durant la gestació i durant la vida (gens subletals), poden comportar directament la mort (gens letals) o poden reduir l’esperança de vida (detrimentals). Exemples de gens letals:

· Locus Agoutí en ratolí: En el promotor del gen Agoutí del ratolí poden aparèixer una sèrie de mutacions associades a una expressió ectòpica i mal regulada del mateix, donades per la deleció i la juxtaposició del gen a un promotor d’un altre gen o per la inserció d’un transposó que usurpa el control de la seva regulació. La mutació en els dos al·lels del gen (AYAY) provoca la mort preimplantacional del ratolí, i la mutació d’un dels dos al·lels del gen (AYA) provoca un color groc en l’animal i problemes de diabetis, obesitat i hiperfàgia. · Absència de cua en gats (fenotip manx): La mutació en els dos al·lels d’un gen determinat (MLML) provoca la mort del gat, i la mutació d’un dels dos al·lels del gen determinat (MLM) provoca que el gat no tingui cua i tingui defectes en la viabilitat.

· Overo Lethal White Syndrome: Aquesta malaltia es deu a una manca en el desenvolupament del sistema nerviós entèric (aganglionosis) i obstrucció intestinal. Els poltres afectats són completament blancs i tenen els ulls blaus, però solen morir en unes 72 hores. La mutació es produeix en el gen del receptor de la endotelina B, en la que aquesta proteïna pateix un intercanvi entre la Isoleucina de la posició 118 per una Lisina, provocant que no pugui realitzar la seva funció essencial: regular el desenvolupament de les cèl·lules de les crestes neurals que donen lloc als ganglis entèrics i als melanòcits. La mutació en els dos al·lels del gen W (ww) provoca la mort del poltre en 72 hores, i la mutació d’un dels dos al·lels del gen (Ww) provoca que l’animal portador tingui una capa overa. Durant les primeres 72 hores, el fenotip de la descendència entre Ww x Ww és 1:2:1, però després d’aquest temps sempre serà 1:2. · Citrulinemia en boví: Aquesta malaltia es deu a una mutació que introdueix un codó stop prematur en el gen de l’argininsuccinat sintasa, un enzim del cicle de la urea. · Acondroplasia en boví: És una malaltia hereditària que determina nanisme en el bestiar boví si l’individu és portador o provoca la mort si l’individu és homozigot. La mutació en els dos al·lels del gen D (D’D’) provoca la mort del vedell, el qual pateix un avortament als 6-7 mesos de gestació i una deformació corporal (vedell bulldog), i la mutació d’un dels dos al·lels (DD’) provoca el naixement d’un individu nan. · Tret letal A46: Existeixen al·lels que expressen la seva letalitat en qualsevol ambient, tanmateix, hi ha altres casos en els que la letalitat no només depèn del genotip, sinó que també depèn de les circumstàncies ambientals. La deficiència hereditària de zinc o tret letal A46 n’és un exemple, es tracta d’una malaltia causada per la mala absorció de zinc a nivell intestinal. La mutació en els dos al·lels del gen determinat provoca uns símptomes quan l’animal contacta amb la llum solar, com la paraqueratosi, una pell poc llustrosa, atrofia tímica..., tanmateix, el tractament amb dosis elevades d’òxid de zinc permet el total manteniment dels animals afectats.

Les malalties hereditàries, per sort, es troben en molt baixa freqüència, tanmateix, hi ha un nombre molt elevat de tipus, per lo que poden arribar a tenir un pes molt elevat en la medicina a causa del seu difícil diagnòstic. Efectes ambientals i genotip (5) Genotip i ambient (5.1) El fenotip està determinat pels factors genètics (genotip) i factors ambientals; els factors ambientals poden ser extrínsecs (llum, nutrició, temperatura...) o intrínsecs (sexe, edat...). Temperatura i color del pelatge (5.2) En algunes ocasions, la temperatura i la llum determinen la coloració i la densitat del pelatge. En els conills de raça Himàlaia i en els gats de raça siamesa existeixen uns al·lels del gen tirosinasa que s’expressen segons la temperatura. Temperatura i diferenciació sexual (5.3) En els rèptils i en moltes espècies de vertebrats, la sexualitat ve influenciada per la temperatura ambiental que hi ha en el moment del desenvolupament embrionari. Les altes temperatures influeixen en un enzim que regula la síntesi d’estrògens; aquest mecanisme és especialment important en cocodrils. Alguns contaminants com els bifenils i els policlorats condueixen la sexualitat dels rèptils cap a femella. Llum (5.4) La fotosensibilització hereditària en la raça ovina Southdown presenta una herència autosòmica recessiva i produeix la incapacitat d’excretar la filoeritrina (procedent de la

clorofil·la de les plantes) per via biliar, acumulant-se en els teixits i produir un compost tòxic quan reacciona amb la llum. Nutrició (5.5) El nutrients poden influir de forma directa o indirecta en l’expressió de nombrosos gens, provocant la deficiència en folat i posterior trencament de les cadenes de DNA de les cèl·lules a causa de la manca de timina afavorint a la producció de malalties tumorals; o la producció de leptines que generen gana en els individus. Efectes materns (5.6) Els efectes materns es donen en casos en els que hi ha barreja de sang entre la mare i el fetus abans de néixer: la isoeritrolisis nenonatal equina es produeix quan un individu (fetus) Aa+ fill de mare Aa- i pare Aa+ té una extravasació de sang cap a la mare i aquesta forma anticossos contra els eritròcits del fill, ocasionant que en la primera alimentació dels calostres el nounat introdueixi en el seu cos defenses formades per la mare contra els seus propis eritròcits. Fenocopia (5.7) La fenocopia es dóna quan es pot produir un fenotip a causa d’una malaltia hereditària o per causes ambientals independentment. Un exemple és la manosidosis, una malaltia produïda en boví a causa de mutacions en el gen de la manosidasa o a causa de la ingesta de llegums dels gèneres Swainsona, Astragalus i Oxytropis. Heterogeneïtat genètica (5.8) L’heterogeneïtat genètica es dóna quan diferents mutacions d’un genotip donen lloc al mateix fenotip. La hipertrofia muscular bovina és una característica d’alguns bovins que aporten molta quanitat de carn, però provoquen moltes dificultats en els parts; la hipertròfia és deguda a diverses mutacions en el gen de la miostatina, les quals individualment donen lloc al fenotip. Aquests tipus de mutacions són molt difícils de localitzar degut als múltiples genotips possibles que hi ha per un únic fenotip. Penetrància i expressivitat (5.9) La penetrància és el percentatge d’individus amb un genotip que manifesten el fenotip associat, i l’expressivitat és el grau d’extensió de l’expressió d’un genotip; aquests dos factors són variables, produint que el fenotip associat a un determinat genotip no sempre es desencadeni adequadament. La penetrància variable es produeix quan un genotip no s’expressa en fenotip. L’expressivitat variable es produeix quan un genotip s’expressa a nivells variables. Ambdós mutacions poden trobar-se alhora. Aquests factors dificulten establir un model genètic fix. En l’expressió del gen Spotting en boví trobem una expressivitat variable, produint que les taques negres del bestiar ocupin més o menys part del cos. Norma de reacció (5.10) La norma de reacció és el conjunt de fenotips que són donats per un únic i determinat genotip, però que es troben molt influenciats pels factors ambientals. Algunes plantes, presentant el mateix genotip, tenen creixements molt diferents segons a l’alçada en que es trobin. Poden arribar a ser caràcters complexos, és a dir, fenotips causats per múltiples causes ambiental i causes genètiques. En genètica són els que més s’estudien, ja que tenen una herència molt complexa. Efectes ambientals sobre malalties hereditàries (5.11) La displàsia del maluc en gossos és una malaltia hereditària pròpia de grans races canines, en la qual es pateix una degeneració progressiva del cartílag hialí de l’articulació coxofemoral quan s’expressen uns al·lels homozigots recessius per a determinat gen. Tanmateix, no tots els homozigots recessius presenten displàsia del maluc.

El motiu d’aquest fet és perquè pot ser que el gen tingui una penetrància variable; o que factors ambientals indueixin a la falta d’expressió. Herència quantitativa (6) Caràcters de variabilitat contínua (6.1) En les poblacions naturals, la variació de la majoria de caràcters és contínua (variació quantitativa) en comptes de discreta (variació qualitativa). La variació genètica d’un caràcter amb una distribució contínua pot deure’s a un sol gel o a l’acció de diversos. Els caràcters de variabilitat contínua són caràcters mesurables que varien de forma contínua dintre d’un rang, seguint una distribució normal. També s’inclouen els caràcters discrets i comptables amb un nombre gran de classes. Distribució normal: mitjana i variància (6.2) La mitjana i sobretot la variància (amb la seva variabilitat reflectida) són els factors més importants per un genetista. Escola biomètrica i escola mendeliana dels inicis del s.XX (6.3) La teoria de Darwin de l’evolució de les espècies mancava d’una base biològica que permetés entendre el fenomen de la selecció natural. Simplement assumia que la descendència posseeix una barreja de les característiques dels pares (herència barrejada). Al segle XX es va produir un debat sobre aquest tema enfrontant a l’escola biomètrica dirigida per Pearson i l’escola mendeliana dirigida per Bateson. L’escola biomètrica utilitza tècniques estadístiques com la correlació i la regressió per analitzar l’herència dels caràcters quantitatius; defensen l’existència d’una herència barrejada; la seva teoria permet la realització de prediccions fenotípiques precises però manca d’una base biològica; l’herència s’entén com una magnitud estadística. Per la seva banda, l’escola mendeliana rebutja la idea d’una herència barrejada, els pares transmeten a la seva descendència els gens de “forma pura”, és a dir, sense barreja (herència particulada); i mantenen que l’aproximació matemàtica és probabilística. Fisher realitza una síntesis que concilia els dos models i estableix en un article que l’herència dels caràcters continus pot atribuir-se a un gran nombre de gens (poligens) amb un efecte petit (i additiu) i demostra que sota aquesta suposició els caràcters continus haurien de tenir una distribució normal, i també calcula el valor de les correlacions entre parents sota un model mendelià que demostra que són molt similars a les calculades en un context biomètric. Experiment de Johannsen amb Phaseolus vulgaris (6.4) Va demostrar que un caràcter quantitatiu com el pes d’una mongeta de Phaseolus vulgaris estava determinat per l’ambient i el genotip. En els seus experiments partia de 19 línies pures que produïen amb el pas de generacions mongetes amb un pes variable degut a factors heretables i no heretables. Experiment de Nilsson-Ehle amb llavors de blat (6.5) Creuant dos varietats de blat amb llavors blanques o vermelles va obtenir una generació F1 amb un color intermedi, i una genera ció F2 amb trihibridisme, demostrant que els caràcters quantitatius segueixen una llei normal més extensa quantes més generacions s’han produït degut als efectes de l’ambient. Identificació de Quantitative Trait Loci (6.6) Els QTL són les diferents parts d’un genoma que contenen gens que afecten sobre un únic tipus de caràcters de tipus quantitatiu, de manera que cada QTL afecta al caràcter d’una manera diferent, amb diferents intensitats. En porcs, l’espessor del greix dorsal en l’última costella ve determinada per una gran quantitat de QTL. Teoria cromosòmica de l’herència (7) Al 1902, W. Sutton i T. Boveri varen establir la teoria cromosòmica de l’herència, varen establir el paral·lelisme entre la segregació i la distribució independent dels factors mendelians i la meiosi; concloent que els gens estan situats als cromosomes disposats linealment, i que la recombinació dels gens es correspon amb l’intercanvi de segments cromosòmics.

Cicles de vida en organismes multicel·lulars (7.1) El cicle de vida dels organismes multicel·lulars pot ser de diversos tipus:

· La gran majoria d’animals tenen un cicle diplont, en el qual gaudeixen durant tota la seva existència d’un genoma diploide; les úniques cèl·lules haploides són els gàmetes, procedents d’unes cèl·lules diploides. La diploidia ofereix als individus una més alta viabilitat, gràcies a que les mutacions perjudicials d’un sol al·lel poden veure’s · Els fongs tenen un cicle haplont, en el qual gaudeixen durant tota la seva existència d’un genoma haploide; l’única cèl·lula diploide és el zigot, procedent de la unió dels gàmetes però que molt aviat realitza una meiosi. · Les plantes i algunes algues tenen un cicle haplodiplont, en el qual s’alternen la diploidia i la haploidia, de diferents durades segons l’espècie.

Mitosis i cicle cel·lular (7.2) El cicle de la mitosis està dividit en quatre fases: G1, S, G2 i M; la fase S és la més significativa perquè durant el seu recorregut es duplica la dotació cromosòmica de la cèl·lula. El cicle està regulat en certs punts de control, però el més important és el punt que controla l’entrada a la fase S de la mitosis. La progressió per aquesta fase és dependent d’unes proteïnes anomenades Quinases dependents de Ciclines (CDK). Les CDK de moltes cèl·lules tumorals perden el control i permeten constantment la seva duplicació sense aturar-se; en el seu tractament s’utilitzen teràpies amb inhibidors de les CDK com el flavopiridol. Mitosis (7.3) La mitosis està formada per 6 fases ben diferenciades:

· Durant la interfase els cromosomes es troben descondensats i la cèl·lula en repòs; és l’estadi que hi ha entre successives divisions. · Durant la profase es produeix una condensació cromosòmica, un trencament de la membrana nuclear i l’inici de la formació del fus polar. · Durant la metafase es produeix l’alineació dels cromosomes en el fus mitòtic i els microtúbuls cinetocòrics interaccionen amb els microtúbuls polars. · Durant la anafase els microtúbuls polars arrosseguen als dos cromosomes en direccions oposades, cap als dos pols del fus. · Durant la telofase els microtúbuls cinetocòrics desapareixen, els cromosomes es condensen i es forma de nou la membrana nuclear. · Durant la citoquinesis es reconstrueix la membrana nuclear i el citoplasma es divideix.

Mitosis i càncer (7.4) La mitosis és la causa i conseqüència del càncer. Normalment, una o vàries mutacions provoquen la mort de la cèl·lula si els mecanismes no aconsegueixen solucionar-les; si no es produeix cap dels dos casos, es poden donar més mutacions a partir de la inicial, arribant-se a acumular casi sense límits. Les cèl·lules tumorals acumulen mutacions amb el pas del temps (sense que s’arribi a produir la seva mort)

i evolucionen a nivell constant, obtenint uns avantatges que permeten la seva multiplicació a uns nivells molt elevats. Són cèl·lules aneuploids, és a dir, tenen dotacions cromosòmiques molt estranyes, i a més, acumulen mutacions puntuals. Amplificació dels centrosomes (7.5) Els centrosomes són uns dels principals centres organitzadors dels microtúbuls del citoesquelet. Durant les mitosis, és l’encarregat d’iniciar el fus mitòtic, i per tant es duplica per aquest fi. En cèl·lules tumorals, sol haver-hi un fenomen anomenat amplificació dels centrosomes, una múltiple duplicació de centrosomes que produeix un repartiment de cromosomes no equitatiu, afavorint les mutacions. Els defectes dels centrosomes es classifiquen en:

· Fus tripolar: La triplicació del centrosoma original provoca la creació de cèl·lules aneuploids o la mort de les cèl·lules. · Fus multipolar: La multiplicació del centrosoma original provoca la creació de moltes cèl·lules aneuploids o la mort de les cèl·lules. · Fus pseudobipolar: La multiplicació del centrosoma original no provoca la creació de mutacions quan l’excés de centrosomes no provoca cap problema en el fus mitòtic. · Fus monopolar: El manteniment del centrosoma original en el moment de la divisió provoca la creació de cèl·lules poliploids o la mort de les cèl·lules.

En els gossos, per exemple, l’amplificació dels centrosomes és causant dels tumors més freqüents en aquesta espècie, els tumors de pell i els mamaris, els quals solen ser en un 40-50% tumors malignes. AA base de mutacions, les cèl·lules tumorals poden arribar a perdre la inhibició per contacte i poden arribar a envair teixits que no són propis, com la sang (metàstasi), la qual aprofiten per intentar conquerir altres òrgans. Control de la mitosis (7.6) A més dels centrosomes i els seus microtúbuls, hi ha altres mecanismes que participen i controlen que la mitosis es produeixi correctament (òbviament, no sempre funcionen). La maquinària de control del fus és un complex multiproteic que comprova que els cromosomes estiguin en la seva correcta posició i alineació dins del fus mitòtics; quan detecta anomalies atura la mitosis fins que aquestes es reparen. Quan el funcionament és correcte envia un senyal a una proteïna que activarà la proteïna separasa, la qual s’encarregarà de permetre la separació dels cromosomes duplicats. Mitocondris (7.7) Una de les teories diu que en els inicis, els mitocondris van ser cèl·lules procariotes que van establir una relació de simbiosi amb una cèl·lula eucariota a la qual li van transmetre part de la seva informació genètica. Els mitocondris poden dividir-se a través de la fissió mitocondrial i arribar a formar xarxes completes o reticles a través de la fusió mitocondrial; si aquests processos es veuen alterats per mutacions, els mitocondris no disposen de la total capacitat de crear energia. Meiosi (7.8) A diferència de la mitosi, la meiosi és un procés en el qual es creen variacions cromosòmiques a través de dues divisions seguides de les cèl·lules germinals. Durant la meiosi es produeix un intercanvi de fragments cromosòmics entre les cromàtides no germanes de cromosomes homòlegs en algunes zones determinades anomenades quiasmes. La profase I de la meiosi és més complexa que la profase de la mitosis i inclou un conjunt d’etapes: leptotè, zigotè, paquitè, diplotè i diacinesis. Gametogènesi (7.9) La meiosi de les espermatogònies produeix la creació de 4 espermatozoides haploides amb un repartiment de citoplasma igual. La meiosi de les oogònies produeix la creació d’un únic oòcit haploides i 2 o 3 corpuscles polars amb un repartiment de citoplasma molt desigual. Les disjuncions durant la meiosi són necessàries per separar les cromàtides germanes dels cromosomes homòlegs. Quan no es produeixen adequadament es dóna el risc de crear gàmetes diploides o gàmetes sense informació genètica, que al unir-se amb el gàmeta de l’altre sexe, pot donar lloc a individus amb trisomies o monosomies, la majoria dels quals no són compatibles amb la vida.

Morfologia cromosòmica (7.10) El tipus de morfologia dels cromosomes ve determinada per la posició del centrosoma, és a dir, la regió que uneix les dues cromàtides germanes i on s’uneixen els microtúbuls del fus mitòtics:

· Cromosoma metacèntric: El centrosoma està situat al mig de les cromàtides. · Cromosoma submetacentric: El centrosoma està situat una mica distanciat del centre de les cromàtides. · Cromosoma acrocèntric: El centrosoma està situat a prop de la perifèria de les cromàtides. · Cromosoma telocèntric: El centrosoma està situat a la perifèria de les cromàtides, unint-les pels telòmers.

Cariotips i ideograma (7.11) Els cromosomes també poden ser classificats segons un criteri més acurat, el qual utilitza els patrons de bandes observables (G-C) del cromosomes un cop realitzada una tinció. Els patrons de bandes observats al microscopi són el cariotip d’una espècie, i poden representar-se gràficament mitjançant uns dibuixos anomenats ideograma. L’ideograma permet identificar i visualitzar de manera clara els diferents parells cromosòmics. Autosomes i cromosomes sexuals (7.12) Els autosomes són el conjunt de cromosomes que no determinen directament la sexualitat de l’individu, a diferència dels cromosomes sexuals. En mamífers i en la majoria d’espècies d’aus els 2 cromosomes sexuals tenen divergència de mides. En els mamífers, el sexe homogamètic (XX) correspon a les femelles, i el sexe heterogamètic (XY) correspon als mascles; en aus, el sexe homogamètic (ZZ) correspon als mascles, i el sexe heterogamètic (ZW) correspon a les femelles. Cariotip de les espècies domèstiques (Gallus gallus) (7.13) El genoma dels pollastres és un genoma molt compacte, amb un total de 1’2 x 109 parells de bases, mentre que els mamífers solen triplicar aquesta xifra; tanmateix, la complexitat biològica no està relacionada amb el nombre o la mida dels gens. En el cariotip podem observar els 39 parells de cromosomes, 6 dels quals són considerats macrocromosomes i 33 microcromosomes degut a les diferents mides observables. En els microcromosomes hi ha més densitat gènica que en els macrocromosomes. Els mascles són homogamètics (ZZ) i les femelles són heterogamètiques (ZW). Polimorfisme en el cariotip d’algunes espècies (7.14) En moltes espècies de vertebrats, sobretot en peixos, hi pot haver polimorfisme (variabilitat) de genomes en quant al nombre de cromosomes dels quals es disposa: Arengada, Carpa, Peix Gat, Truita d’arc de Sant Martí i Tilàpia. Caràcters lligats al sexe (8) Definicions (8.1) L’herència lligada al sexe són aquells caràcters determinats per gens lligats als cromosomes sexual, encara que no necessàriament han de pertànyer a aquests cromosomes. L’herència influïda pel sexe són aquells caràcters determinats per gens autosòmics que actuen de forma diferent segons el sexe de l’individu (la calvície en humana actua de forma recessiva en el sexe femení i de forma dominant en el sexe masculí). L’herència limitada pel sexe són aquells caràcters determinats per gens autosòmics que únicament s’expressen en un dels dos sexes. Determinació del sexe en Drosophila (8.2) En la mosca Drosophila l’equilibri entre cromosomes autosòmics i cromosomes sexuals és el que determina el sexe; els cromosomes X compten, i els cromosomes Y no. Les mosques diploides amb 2 cromosomes X (XX) tenen una ràtio de 2/2 = 1, el que determina que la mosca serà una femella; amb 1 cromosoma X i 1 cromosoma Y (XY) tenen una ràtio de 1/2 = 0’5, el que determina que la mosca serà un mascle; amb 1 cromosoma X (XO) tenen una ràtio de 1/2 = 0’5, el que determina que la mosca serà un mascle estèril. Les mosques triploides amb 3 cromosomes X (XXX) tenen una ràtio de 3/3 = 1, el que determina que la mosca serà femella; amb 2 cromosomes X i un cromosoma Y (XXY) tenen una ràtio 2/3 = 0’6, el que determina que la mosca serà intersexe; amb

1 cromosoma X i 2 cromosomes Y (XYY) tenen una ràtio 1/3 = 0’3, el que determina que la mosca serà mascle. Determinació del sexe en vertebrats (8.3) En els vertebrats coexisteixen diferents models en quant a la determinació del sexe. El sexe en els mamífers ve determinat per la combinació dels cromosomes X i Y, obtenint un mascle si es produeix una unió heterozigòtica; el sexe en les aus i les serps ve determinat per la combinació dels cromosomes W i Z, obtenint una femella si es produeix una unió heterozigòtica; el sexe en els cocodrils ve determinat per la influència de la temperatura durant la incubació dels ous. En altres tipus de vertebrats, el sexe ve determinat per 2 o els 3 models alhora. Determinació del sexe en peixos (8.3.1) El desenvolupament del sexe dels peixos ve determinat per diferents models: · Gonocorisme: Els peixos tenen els sexes ben diferenciats

· Hermafrodita sincrònic: Els peixos són hermafrodites i en la fecundació realitzen les funcions d’ambdós sexes segons convingui · Protogini: Els peixos femelles poden canviar de sexe cap a mascle secundari quan falten mascles primaris · Protàndric: Els peixos mascles poden canviar de sexe cap a femelles.

Les indústries han desenvolupat mitjans per aconseguir canviar el sexe dels peixos quan els hi és convenient. En la major part de les espècies de peixos no s’han estudiat acuradament els cromosomes, per lo que pot ser que en algunes espècies el sexe vingui determinat també per gens autosomals. Determinació del sexe en rèptils (8.3.2) En molts rèptils, com per exemple les tortugues i els cocodrils, la determinació del sexe no es deu a la segregació de cromosomes sexuals, sinó a factors ambiental. El factor més important és la temperatura d’incubació dels ous, ja que aquest factor influeix en l’activitat de l’enzim aromatasa, el qual intervé en la síntesi d’estrògens quan la temperatura és elevada, provocant la creació de femelles. Segons les espècies de rèptils (i d’aus), els cromosomes sexuals (W i Z) poden semblar-se molt o gens. Determinació del sexe en aus (8.3.3) Realment no es coneix si el gen que determina el sexe de les aus es troba en el cromosoma W o intervé l’efecte de dosis amb el nombre de cromosomes Z. El gen DMRT1 juga un paper essencial en la diferenciació sexual de nombrosos vertebrats, i en aus, s’expressa el doble en embrions ZZ respecte als embrions ZW. Aquesta expressió augmentada podria dirigir el procés de diferenciació sexual. Segons les espècies d’aus (i de rèptils), els cromosomes sexuals (W i Z) poden semblar-se molt o gens. En moltes espècies d’aus no hi ha dimorfisme sexual, sobretot quan són pollets, per lo que es realitzen diferents estratègies d’encreuaments, on la línia mare (ZW) porta un gen dominant associat al cromosoma ZA , i la línia pare porta els dos al·lels recessius per aquest gen associat al cromosoma Za . La descendència mascle d’aquest

encreuament portarà el cromosoma ZA de la mare i el cromosoma Za del pare, per lo que mostrarà el fenotip dominant d’aquest gen; en canvi, la descendència femella d’aquest encreuament portarà el cromosoma W de la mare i el cromosoma Za del pare, per lo que mostrarà el fenotip recessiu d’aquest gen. Aquests gens solen ser el del plomatge barrat, el del color del plomatge, el de l’emplomallat de les ales... Característiques del cromosoma Y en mamífers (8.4) El cromosoma Y conté un 40 gens, mentre que l’X en conté un 1100. Els gens que porta aquest cromosoma actuen bàsicament per l’expressió de factors sexuals. Es coneix que el gen X i el gen Y tenen el mateix origen, tanmateix, l’Y va anar evolucionant, diferenciant-se mentre perdia gens que el cromosoma X podia aportar; per aquest motiu, els dos cromosomes són molt divergents, exceptuant unes regions pseudoautosòmiques situades als extrems dels cromosomes (telòmers). Aparició del gen SRY (8.5) El cromosoma Y es va diferenciar principalment en la creació del gen SRY, el qual és un factor de transcripció que regula la diferenciació sexual i que té una herència estrictament paterna; la seva funció és regular l’expressió de molts altres gens que realitzen la feina de diferenciació de les gònades, com

el SOX9. El gen SRY es troba en la majoria de mamífers, concretament els que tenen una antiguitat de 180-210 milions d’anys, just després de la radiació dels monotremes (que no el tenen) i just abans de la radiació dels marsupials (primers mamífers en tenir-lo). Una hipòtesi apunta a que el gen SRY va evolucionar a partir del seu suposat predecessor SOX3, degut a que tenen un petit domini funcional comú. Extinció del cromosoma Y (8.6) L’interès per les espècies de mantenir aquest gen va implicar que el cromosoma Y es diferenciés el màxim possible per així evitar i desafavorir la homologia dels dos cromosomes i evitar així la recombinació d’aquests durant la meiosi. La pèrdua de gens del cromosoma Y es calcula que en l’espècie humana dintre de 10 x 106 d’anys donarà lloc a l’extinció del cromosoma i del seu gen SRY; alguns rosegadors ja han perdut completament el cromosoma Y (mascles són X0). És per això, que l’extinció del cromosoma Y no determina la extinció de l’espècie, ja que el gen SRY pot traslocar-se a un altre cromosoma o un altre gen pot adoptar la seva funció. Inactivació del cromosoma X (8.7) La repetició dels cromosomes X en les femelles provoca el fenomen de compensació de dosis, en el que aleatòriament s’inactiven en les cèl·lules un dels dos cromosomes X (el maternal o el parental) mitjançant l’RNA procedent de la molècula XIST que l’envolta i el marca, metilacions i la

utilització de d’histones que el condensen formant una estructura anomenada corpuscle de Barr. El típic fenomen de la coloració doble d’algunes femelles de gat està provocat per la inactivació de cromosomes X que tenen al·lels heterozigots determinants del color, conduint a que aleatòriament les cèl·lules expressin colors diferents. Malalties lligades al cromosoma X (8.8) Hi ha moltes malalties lligades al cromosoma X, en les que normalment l’al·lel mutat té una freqüència molt baixa. L’al·lel en qüestió sol estar en individus heterozigots, és el cas de malalties de gossos com l’atrofia retinal progressiva (ceguesa en progressió), immunodeficiència combinada severa, deficiència del factor de coagulació VIII (hemofília), distrofia muscuar (malaltia de Duchenne), síndrome d’Alport... Aquestes malalties actuen en el 50% dels mascles (XaY) i en el 0% de les femelles (encara que la meitat de femelles seran portadores) quan la mare és portadora (XAXa). En l’espècie humana, també hi ha moltes malalties lligades al cromosoma X, com el Síndrome de l’X fràgil, el qual provoca retard mental, problemes mentals... en els homes, mentre que les dones portadores també pateixen una simptomatologia semblant però molt més lleu. Herència mitocondrial (extranuclear) (8.9) Els únics gens de l’herència que rep la descendència és per part materna són els mitocondris. Determinades malalties o efectes estan produïts pel mal funcionament dels gens dels mitocondris que es troben en l’òvul quan es produeix la fecundació. El nombre de mitocondris defectuosos o no funcionals varia al llarg de la vida de l’òvul, el qual pateix dos processos que poden disminuir o elevar el nombre:

· En el moment de la fecundació, l’òvul elimina un nombre determinat de mitocondris. Si casualment elimina mitocondris defectuosos disminueix la gravetat de les malalties mitocondrial, però si elimina mitocondris sans, augmenta la gravetat de les malalties mitocondrials. · Al llarg de la seva vida, l’òvul elimina mitocondris també, produint els mateixos efectes esmentats anteriorment.

Depenent de la quantitat de mitocondris mutants, la simptomatologia és diferent, per lo que és molt difícil diagnosticar les malalties.

Herència citoplasmàtica (efectes materns) (8.10) Alguns dels primers caràcters que s’expressaran en l’embrió, abans i tot de l’expressió dels gens dels cromosomes dels nuclis dels gamets, provenen del mRNA, de les proteïnes i de les molècules que hi ha en el citoplasma de l’òvul. És el cas de la direcció que pren l’espiral de la closca d’algunes cargols de mar, la qual segueix l’expressió que li manen els gens que es troben en el citoplasma de l’òvul. Lligament (9) Introducció (9.1) El lligament es dóna quan dos gens es troben en un mateix cromosoma i molt propers entre ells. El desequilibri del lligament es dóna quan, degut al lligament, les proporcions de la distribució dels gens en els gamets no segueixen la llei mendeliana. L’haplotip són les combinacions d’al·lels que s’hereten conjuntament i com una sola unitat degut a la proximitat entre ells i a la impossibilitat d’haver-hi recombinació entre ells. Proporcions gamètiques en absència de quiasma (9.2) Quan no es produeixen quiasmes, els cromosomes dels 4 gamets són exactament iguals als cromosomes originals de les cèl·lules precursores de l’individu. Aquest tipus de proporció implica que els gamets són 100% gamets parentals. Proporcions gamètiques quan hi ha quiasma (9.3) Quan es produeixen quiasmes, els cromosomes de 2 dels 4 gamets són exactament iguals als cromosomes originals de les cèl·lules precursores, i els cromosomes dels altres 2 gamets han patit un intercanvi d’informació gènica. Aquest tipus de proporció implica que els gamets són 50% gamets parentals i 50% gamets recombinants. Freqüències d’entrecreuament i recombinació (9.4) La Freqüència de Recombinació és un paràmetre que indica el % de gamets recombinants que hi ha sobre un total. La Freqüència d’Entrecreuament és un paràmetre que indica el % de quiasmes que s’han produït, la qual sempre és el doble que la FR. La FR augmenta a mesura que augmenta la distància entre gens i per tant, l’espai disponible per a la formació de quiasmes. Absència de lligament entre dos gens (9.4.1) Quan es segreguen dos cromosomes diferents (1 i 2) amb 1 gen determinat cadascun (A i B) que tenen 2 al·lels diferents (A, a, B, b), s’obtenen 4 gamets diferents, els quals segueixen les proporcions mendelianes. Lligament complet entre dos gens (9.4.2) Quan es segrega 1 cromosoma (1) amb 2 gens determinats (A i B) lligats que tenen 2 al·lels diferents (A, a, B, b), s’obtenen 2 gamets diferents; amb la impossibilitat de formar gamets recombinants s’alteren les proporcions esperades pel model mendelià. Lligament incomplet entre dos gens (9.4.3) Quan es segrega 1 cromosoma (1) amb 2 gens determinats (A i B) no lligats (distanciats) que tenen 2 al·lels diferents (A, a, B, b), s’obtenen 4 gamets diferents; formant-se un nombre indeterminat de gamets recombinants s’alteren les proporcions esperades pel procés mendelià. 2 dels 4 gamets seran parentals i els altres 2 seran gamets recombinants; la proporció de gamets parentals es donarà per l’equació (1-FR)/2, i la proporció de gamets recombinants es donarà per l’equació FR/2.

Lligament i freqüència de recombinació (9.5) Quan hi ha absència de lligament, els gens es troben en diferents cromosomes o en el mateix però molt allunyats entre ells, sent la FE = 100% i la FR = 50%. Quan hi ha lligament complet, els gens estan tant pròxims que no es produeixen quiasmes i la FR = 0%; quan hi ha lligament incomplet, la FR es troba entre el 0 i el 50 %. Acoblament i repulsió (9.6) Quan un individu heterozigot es troba amb 2 al·lels dominants en el mateix cromosoma s’entén per acoblament; quan un individu heterozigot es troba amb al·lels dominants en diferents cromosomes s’entén per repulsió. Heterogeneïtat de la freqüència de recombinació en el genoma (9.7) La FR és un reflex directe de la distància entre els gens en un cromosoma, tanmateix, la FR no augmenta uniformement amb la distància, per lo que es dóna una heterogeneïtat de la freqüència de recombinació. En aquest factor influeixen els Hotspots i coldspots de recombinació. Desequilibri de lligament en gos (9.8) El desequilibri de lligament és el desequilibri produït en les proporcions de la distribució dels gens en els gamets respecte la llei mendeliana degut a l’efecte de lligament entre dos gens que provoca que hi hagi al·lels que s’heretin de manera conjunta. En el gos succeeix en gran freqüència degut a la gran domesticació que ha patit l’espècie. Mapes de lligament (9.9) La FR és una eina que permet construir uns mapes de lligament, els quals permeten investigar l’ordre dels gens i la mútua distància entre ells. Identificació de QTL (9.10) Els QTL són uns gens amb polimorfisme que expressen la variació d’un caràcter. Per trobar la posició exacte d’aquests gens, s’avaluen diferents marcadors (gens als quals possiblement pugui estar lligat el gen QTL) que permeten esbrinar a quin d’ells està lligat el gen a descobrir. Exemple: Al conèixer la posició exacte de 3 gens (H,M,N), es fan creuaments per intentar trobar la posició del gen Q. Quan l’expressió d’aquest gen sempre va lligat a l’expressió d’un dels altres tres, es conclou que es troben molt junts o lligats dintre d’un cromosoma. Cerca de mutacions causals (9.10.1) Aquesta tècnica s’utilitza per buscar mutacions causals com la del gen IGF2 que pateixen les races porcines Pietrain, les quals tenen sobremusculació. Genètica de poblacions (10) La genètica de poblacions és una branca de la genètica que s’inicia al principi del segle XX a partir de dues persones, un físic i un matemàtic, que van estudiar-la i desenvolupar-la; tanmateix, la guerra entre l’escola mendeliana i l’escola biomètrica va posar entrebancs a la seva evolució. Informació genètica (10.1) La informació genètica es troba en els cromosomes de la cèl·lula. El locus (loci en plural) és el lloc físic dels cromosomes nuclears on es troben els determinats gens amb la seva informació genètica. A les mitocondries també hi ha el DNA que va restar quan aquesta estructura era una cèl·lula procariota; el seu DNA no pateix recombinació genètica. Herència quantitativa o poligènica (10.2) La majoria dels caràcters d’interès productiu són caràcters quantitatius, és a dir, la suma de l’efecte de molts gens (herència multifactorial), obtenint-se gran varietat de fenotips. Les característiques quantitatives s’ajusten a una distribució Normal; exemples d’aquests caràcters són l’alçada a la creu, el pes corporal, la prolificitat, l’aptitud materna per a la cria, la velocitat en carrera, índex promig de guanys anuals, caràcters de comportament, puntuació morfològica general... Les freqüències gèniques o al·lèliques mostren la quantitat d’al·lels individualitzats de cada gen que hi ha a la població.

Estudi de l’estructura gènica d’una població (10.3) L’objectiu de la genètica de poblacions és descriure i mesurar la diversitat genètica de les poblacions, a través de l’espai i del temps (estructura genètica), així com, determinar els processos evolutius pels quals ve tenir lloc aquesta estructuració. Objectius específics (10.3.1) La genètica de poblacions s’utilitza per un conjunt de projectes: · Caracteritzar genèticament la raça o població

· Estudiar els nivells de variabilitat i l’estructuració genètica de les poblacions mitjançant els estudis comparatius · Obtenir estimacions mitjanes de consanguinitat. La consanguinitat es defineix com el grau de creuaments entre parents; augmenta la proporció d’homozigots quan disminueix la proporció d’heterozigots. La depressió consanguínia és la disminució del rendiment degut a nivells alts de consanguinitat. · Identificar genèticament els individus i disposar d’una eina fiable per a la verificació de paternitats, utilitzant marcadors genètics. · Identificar possibles marcadors específics de raça · Identificar combinacions haplotípiques més favorables dels individus més heterozigots, per a la programació d’aparellaments, sobretot en poblacions en perill d’extinció o amb la finalitat de mantenir el màxim grau de diversitat dintre d’una espècie o raça. · Assignar individus incògnita a poblacions determinades per classificar animals de races o poblacions desconegudes. · Recerca dels nuclis o subpoblacions més interessants per a una possible reintroducció o reconstrucció de la raça, amb al finalitat d’incrementar la diversitat. · Quantificar el grau de divergència genètica entre poblacions: càlculs de distàncies i estudi de les relacions filogenètiques.

Diversitat (10.4) La diversitat en el seu sentit més ampli, és l’observació de les diferents formes i funcions entre les espècies. La diversitat biològica reflexa la quantitat, varietat i variabilitat dels éssers vius. La diversitat visible és la diversitat fenotípica, i la diversitat oculta és la diversitat genètica. La diversitat genètica és la variació dels gens deins de cada espècie; representa la variació heretable dins i entre poblacions d’organismes. La variació és el conjunt de diferències presents reals entre individus d’una població o entre poblacions. La variabilitat és el potencial per variar. La variació observable o polimorfisme es dóna quan un gen o un caràcter és polimòrfic, és a dir, si hi ha més d’una forma del gen o del caràcter dins de la població. Variabilitat genètica (10.5) Per mesurar la variació genètica d’una població s’ha d’estudiar una mostra d’individus i de gens, a partir dels quals s’inferirà la variabilitat genètica de les poblacions. La mostra escollida ha de ser representativa, és a dir, els individus i els gens escollits han de ser, com a mitjana, tan variables com els existents en la població i el conjunt del genoma, per lo que s’han d’escollir a l’atzar; i precisa, és a dir, la metodologia emprada ha de ser suficientment sensible per detectar els diferents estats o al·lels presents en un locus determinat.

· Metodologia molecular: La metodologia molecular que s’utilitza per analitzar la variabilitat genètica es basa en l’anàlisi de:

· Divergència proteica: La divergència proteica s’analitza a través de tècniques com l’electroforesi (midó, agarosa, poliacrilamida, bidimensional, SDS-PAGE, isoelectroenfoc...), tècniques immunològiques (fixació del complement, reacció Ag-Ac, grups sanguinis...) i la seqüenciació de proteïnes. · Divergència d’àcids nucleics: La divergència d’àcids nucleics s’analitza a través de tècniques com la hibridació del DNA i marcadors moleculars (RFLP, RAPD, VNTR de minisatèl·lits i microsatèl·lits, SNP...). · Divergència mitocondrial: Important en estudis evolutius perquè la seva herència és estrictament maternal.

Degut a un gen por arribar a tenir molts al·lels diferents, i no només 1 o 2, per quantificar tota la divergència s’utilitzen diferents tipus de taxes que mesuren la variabilitat genètica, com la taxa de polimorfisme, la taxa d’al·lelisme, l’heterozigoci... · Metodologia genealògica: La metodologia genealògica que s’utilitza per analitzar la variabilitat genètica es basa en l’anàlisi del pedigree que utilitza coeficients genealògics (com el coeficient de parentiu...). · Metodologia quantitativa: La metodologia quantitativa que s’utilitza per analitzar la variabilitat genètica es basa en la heretabilitat (h2) i la variància additiva (σ2) a través dels caràcters d’herència poligènica. L’expressió matemàtica que engloba aquests termes és: h2 (heretabilitat) = σ2

A (variabilitat additiva o variabilitat genètica) · σ2F (variabilitat fenotípica) [h2 = σ2

A · σ2F].

Amb totes les dades obtingudes es poden calcular les distàncies genètiques o al·lèliques dels locus per a un marcador (característica detectable) concret entre dos races. Quan la distància entre races és molt elevada mostra que estan allunyades genèticament, i quan les distàncies són curtes mostra que les 2 races són properes. Calculades les distàncies es poden representar en uns gràfics aclaridors que donen diferents informacions com l’inici de la divergència evolutiva... La genètica de poblacions, doncs, ens dóna la informació exacte sobre la freqüència de cadascuna de les classes en la població, la freqüència de cadascun dels gens o al·lels, i si una població es troba en equilibri genètic de Hardy-Weinberg. Exemple: En una població de 175 animals, 91 tenen el genotip AA, 28 tenen el genotip AB i 56 tenen el genotip BB.

· Les freqüències genotípiques d’aquesta població són: · fr (AA) = 91 / 175 = 0’52, per conveni l’anomenarem P · fr (AB) = 28 / 175 = 0’16, per conveni l’anomenarem H · fr (BB) = 56 / 175 = 0’32, per conveni l’anomenarem Q. · P + H + Q = 1

· Les freqüències gèniques o al·lèliques d’aquesta població es poden mesurar per dos sistemes: · A partir del recompte gènic (directe): · fr (A) = 91 · 2 + 28 / 350 = 0’6, per conveni l’anomenarem p · fr (B) = 56 · 2 + 28 / 350 = 0’4, per conveni l’anomenarem q · p + q = 1 · A partir de les freqüències genotípiques: · p = P + ½ H = 0’6 · q = Q + ½ H = 0’4 · L’equilibri genètic de Hardy-Weinberg es compleix quan una població és molt gran (la grandària disminueix els fenòmens de l’atzar), amb aparell aleatori i amb absència de migracions, mutacions i/o seleccions; amb una població d’aquestes característiques es produeixen aquests fenòmens:

· Les freqüències gèniques i genotípiques es mantenen constants d’una generació a l’altra. · Les freqüències genotípiques de la descendència depenen exclusivament de les freqüències gèniques dels pares i no de les seves freqüències genotípiques, essent igual a: p2, 2pq i q2, per lo que els genotips no s’hereten, únicament s’hereten els gens.

Seguint amb l’exemple on les freqüències genotípiques i gèniques de la generació parental (P) són 0’52, 0’16, 0’32, 0’6, 0’4, obtenim una generació filial 1 amb les següents freqüències genotípiques: fr (AA) = p2 = 0’36, per conveni l’anomenarem P’; fr (AB) = 2pq = 0’48, per conveni l’anomenarem H’; i fr (BB) = q2 = 0’16, per conveni l’anomenarem Q’.

♀ \ ♂ A (p) B (q) A (p) AA (p2) AB (pq) B (q) AB (pq) BB (q2)

Al comprovar a partir d’aquestes freqüències genètiques, la freqüència gènica s’observa que efectivament no varia de generació en generació: p’ = P’ + ½ H’ = 0’6; i q’ = Q’ + ½ H’ = 0’4. A partir d’aquest moment, en el que la freqüència genotípica també es mantindrà igual, es considerarà que la població ha assolit l’equilibri genètic de Hardy-Weinberg. Una població assoleix l’equilibri genètic en una única generació d’aparellament aleatori (per a un gen autosòmic amb freqüències gèniques iguals en les subpoblacions de mascles i femelles), on les freqüències gèniques són les mateixes que les de la generació parental, i on les freqüències genotípiques d’equilibri s’assoleixen al cap d’una generació. Si les freqüències gèniques són diferents en les subploblacions de mascles i femelles, l’equilibri s’assoleix en dues generacions d’aparellaments aleatoris, on en la primera generació s’assoleix l’equilibri de les freqüències gèniques i en la segona generació s’assoleix l’equilibri de les freqüències genotípiques.

Relacions entre freqüències gèniques i genotípiques (11) En una població en equilibri de H-W, les freqüències genotípiques, per a un sol locus amb dos al·lels, depenen de les freqüències gèniques. La freqüència d’heterozigots no pot ésser mai superior al 50%, i aquest màxim només s’assoleix quan p i q són de 0’5. Quan la freqüència gènica d’un al·lel és baixa, l’al·lel rar es presenta predominantment en els heterozigots, havent-hi molt pocs homozigots. Població en equilibri genètic de Hardy-Weinberg (11.1) Una població que es troba en equilibri genètic té unes freqüències genotípiques de p2, 2pq i q2; arribat a aquest punts, les freqüències gèniques i genotípiques es mantenen constants d’una generació a l’altra. Les condicions per a que es produeixi aquest equilibri genètic són:

· No hi ha migració, es tracta d’una població en reproducció tancada. Aquesta condició impedeix que individus d’altres poblacions es puguin reproduir amb els de la nostra població · No hi ha mutacions. Les mutacions són successos poc probables i consisteix en que un al·lel canvia espontàniament i es transforma en un altre al·lel; per exemple, en un de cada 100.000 aparellaments l’al·lel A pot transformar-se en l’al·lel a o en una nova variant. · No hi ha selecció ni natural ni artificial, és a dir, tots els individus tenen les mateixes probabilitats d’ésser reproductors. Si un genotipus deixa més descendents que un altre, es modifiquen les freqüències gèniques i, conseqüentment, les genotípiques; per exemple, si els individus AA deixen més descendents, hi ha una tendència a augmentar la freqüència dels al·lels A en la població, dient-se llavors que la població està sotmesa a selecció. · La població és molt gran, ja que si fos de mida reduïda les freqüències dels gens podrien variar degut exclusivament a l’atzar, produint-se una deriva genètica. Si la població no és infinita, la freqüència d’al·lels A i a en els espermatozous i òvuls no és exactament p i q, i per tant, P’, H’ i Q’ són diferents a P, H i Q; a aquest fenomen de mostreig, molt important en poblacions petites, se’l coneix com deriva genètica.

· Els aparellaments són aleatoris, ja que l’aparellament entre individus emparentats (consanguinitat) pot trencar l’equilibri. Si els aparellament no són a l’atzar, la probabilitat de que un al·lel A es trobi amb un al·lels a ja no és el producte de les seves probabilitats pq; Les freqüències genotípiques P, H i Q varien, encara que les gèniques p i q continuen constants. Una població que s’aparella a l’atzar es diu que està en panmixia; hi ha varis sistemes en els que l’aparellament no es produeix a l’atzar; per exemple, aparellant-se individus emparentats (aparellaments consanguinis) o bé aparellant-se individus que presenten valors similars per a un caràcter (aparellaments classificats o associatius).

Test d’equilibri Hardy-Weinberg (11.2) Per a una població concreta de 86 individus i per a un locus concret, observem 31 individus AA, 36 AB i 19 BB. Amb aquestes dades, les freqüències gèniques són: fr (A) = p = 0’57 i fr (B) = q = 0’43; amb aquestes freqüències gèniques esperaríem que el nombre d’individus per a cada genotip fos: · Nº esperats (AA) = p2 · N = 27’9 individus AA · Nº esperats (AB) = 2pq · N = 42’2 individus AB · Nº esperats (BB) = q2 · N = 15’9 individus BB. Per assegurar si aquesta població està en equilibri p2 2pq q2, s’ha d’utilitzar el Test de Chi-Quadrat (χ2) on la hipòtesi nul·la (H0) és: La mostra de 86 individus prové d’una població amb les freqüències genotípiques H-W, i en aquest cas els nombres esperats seran iguals als observats, com a promig (amb un 95% de confiança).

χ2 = ∑ (Observats – Esperats)2 / Esperats || (31-27’9)2 / 27’9 + (36-42’2)2 / 42’2 + (19-15’9)2 / 15’9 = 0’34 + 0’91 + 0’60 = 1’85.

Graus de llibertat = nombre de genotips – nombre d’al·lels || 3-2 = 1. La taula χ2 amb un 95% de confiança i 1 grau de llibertat ens indica que la χ2 esperada (3’84) és superior a la χ2 observada (1’85), per lo que ens permet acceptar la H0, hi ha equilibri H-W i les

úniques diferències estan atribuïdes a l’atzar i no són significatives.

[Quan les diferències són significatives s’interpreta amb 1 asterisc (*), quan les diferències són molt significatives s’interpreta amb 2 asterisc (**), i quan les diferències són altament significatives s’interpreta amb 3 asteriscs (*). Quan el test ens permet acceptar la hipòtesi alternativa (H1), no explica el perquè no hi ha equilibri genètic.] Extensions de la llei Hardy-Weinberg (11.3) Al·lels múltiples (11.3.1) Quan ens trobem en el cas de tenir un gen amb al·lels múltiples (A1, A2 i A3) amb freqüències gèniques fr (A1) = p, fr (A2) = q i fr (A3) = r, les freqüències genotípiques en l’equilibri per als genotips A1A1, A1A2, A1A3, A2A2, A2A3 i A3A3 són: p2

+ 2pq + 2pr + q2 + 2qr + r

2 = 1. Gens lligats al sexe (11.3.2)

Quan ens trobem amb gens lligats al cromosoma X (hologènia), les femelles contribueixen amb 2/3 dels gens en el conjunt de la població, mentre que els mascles només ho fan en 1/3; quan els gens estan lligats al cromosoma Y (holàndrica), les femelles no contribueixen. En el cas de tenir un gen lligat al cromosoma X amb dos al·lels, les freqüències genotípiques per part de les femelles són P (p2

f), H (2pfqf) i Q (q2f) per A1A1, A1A2 i A2A2 respectivament, i per part del

mascle són R (pm) i S (qm) per A1 i A2 respectivament. Per esbrinar la p total ( ) s’utilitza la següent formula: = 2/3 pf + 1/3 pm = 1/3 (2pf + pm) = 1/3 (2P +

H + R); i per esbrinar la q total ( ) s’utilitza la següent formula: = 2/3 qf + 1/3 qm = 1/3 (2qf + qm) = 1/3 (2Q + H + S). La (freqüència total de l’al·lel A1) es troba en equilibri quan la pf i la pm són iguals. Si les freqüències gèniques són les mateixes en les subpoblacions de mascles i femelles, s’arriba a l’equilibri en una única generació d’aparellament aleatori. Si les freqüències gèniques de mascles i femelles són diferents, es requereixen més de dues generacions d’aparellaments aleatoris per assolir l’equilibri. Exemple: = 2/3 pf + 1/3 pm; inicialment, en la generació 0 (G0) tenim que la pf = 1 i la pm = 0, per lo que la freqüència total de l’al·lel A1 equival a: = 2/3 · 1 + 1/3 · 0 = 2/3. En la G1 doncs, la p’f equival a la mitjana de les freqüències parentals: p’f = (pm + pf)/2 = (0+1)/2 = 0’5, mentre que la p’m serà sempre igual a la freqüència maternal: p’m = pf = 1. Així es continua generació rere generació fins que la pf sigui igual a la pm.

G2: p’’f = (p’f + p’m)/2 = (0’5 + 1)/2 = 0’75; p’’m = p’f = 0’5 G3: p’’’f = (p’’f + p’’m)/2 = (0’75 + 0’5)/2 = 0’625; p’’’m = p’’f = 0’75

... Gn: pn

f = pnm = 2/3.

Equilibri en més d’un locus (11.3.3) En situacions on tenim en compte més d’un locus, per a que la població estigui en equilibri H-W, és necessari que els seus gamets estiguin en equilibri, és a dir, que la freqüència d’un determinat gamet sigui la seva freqüència en equilibri. La població es troba en equilibri quan són haplotip per als dos locus (AABB o aabb), on els seus gamets tenen sempre la mateixa freqüència (AB = 1 o ab = 1). Quan dues poblacions en equilibri (AABB i aabb) s’ajunten, trenquen l’equilibri degut a que la seva descendència produirà gamets diferents (AB, ab, Ab o aB) amb diferents freqüències. Per a que la població resultant aconsegueixi de nou un equilibri, els gamets han d’estar de nou en equilibri (AB, ab, Ab i aB amb freqüència ¼). Exemple: Les freqüències gèniques dels gens A, a, B i b són per conveni p, q, r i s respectivament. Per tant, la freqüència dels diferents gamets (t, u, v i w per conveni) estarà en equilibri quan: fr (AB) = t = pr, fr (Ab) = u = ps, fr (aB) = v = qr, i fr (ab) = w = qs. L’equilibri s’obtindrà quan el nombre de gamets en fase d’acoblament (AB en un cromosoma i ab en l’altre) sigui igual al nombre de gamets en fase de repulsió (Ab en un cromosoma i aB en l’altre), és a dir, quan el producte d’acoblament sigui igual al producte de repulsió: t·w = u·v o pr·qs = ps·qr. El desequilibri de lligament o en fase gamètica es dóna quan la producció de gamets en estat d’acoblament i la producció de gamets en estat de repulsió són diferents. El màxim desequilibri es produeix quan t i w valen 0’5, és a dir, que els gamets produïts només són AB i ab; o quan u i v valen 0’5, quan els gamets produïts només són Ab i aB. El desequilibri de lligament és una causa de correlació temporal, mentre que la pleotropia és una causa de correlació permanent. Quan una població amb desequilibri de lligament s’aparella al atzar, la quantitat de desequilibri es va reduint progressivament en cada generació. Tanmateix, el desequilibri dependrà de la llunyania que tinguin en el cromosoma els 2 loci en qüestió, ja que les recombinacions durant la meiosi afecten en l’equilibri; aquesta distància entre els 2 loci s’expressa mitjançant el coeficient de recombinació (C), i quant més gran sigui (valor màxim de 0’5), més petit és el nombre de generacions d’aparellaments aleatoris necessaris per arribar a l’equilibri.

Forces que canvien les freqüències gèniques (12) A partir d’una població en equilibri ens podem trobar factors o forces que canvien les freqüències gèniques i trenquen l’equilibri; o viceversa, apropin una població en desequilibri a l’equilibr. Processos sistemàtics (12.1) Els processos sistemàtics canvien les freqüències gèniques de forma predictible en magnitud i direcció:

· Migració: És la introducció de gens o al·lels en una població que provenen d’una altra població. Es considera que la mida de la població es manté, per lo que es suposa que marxen la mateixa quantitat d’individus de la població receptora que els que s’han introduït de la població donadora. Exemple: Ens trobem una població receptora on la freqüència gènica de l’al·lel A1 és p0, mentre que la freqüència en la població donadora és pD; quan es produeix la introducció de la segona població, la fr (A1) depèn de la taxa de migració (m). La freqüència de p en la població al cap d’una generació (p1) serà igual a: p1 = p0 + m (pD – p0); i al cap de t generacions: pt = (1-m)

t · (p0 – pD) + pD.

· Mutació: És la transformació espontània d’un al·lel en un altre que pot ser millor, pitjor o neutre per la raça. Hi ha dos tipus de mutacions:

· La mutació puntual té poca importància perquè és fàcil de perdre-la en poques generacions. · Les mutacions recurrents apareixen regularment amb una determinada freqüència; tanmateix, aquestes mutacions poden ser:

· Les mutacions recurrents irreversibles consten d’una taxa de mutació (u) on un al·lel A1 (amb una freqüència p) es transforma en A2 (amb una freqüència q). Exemple: Una població en la que la freqüència d’A1 i A2 són p0 i q0 respectivament en la generació 0, pateix una mutació irreversible en el gen A1, fent que en la generació 1 la p1 sigui igual a: p1 = p0 – u·p0, mentre que la q1 serà igual a: q1 = q0 + u·p0. Si el nombre de generacions fos elevat (n): qn = 1 – [(1 – u)

n · (1-q0)].

· Les mutacions recurrents reversibles consten d’una taxa de mutació d’anada (u) i tornada (v), és a dir, on un al·lel A1 es transforma en A2 i viceversa segons la taxa de mutació. Exemple_ Una població en la que la freqüència d’A2 és q0 en la generació 0, pateix una mutació fent que en la generació 1 la q1 sigui: q1 = q0 + u·p0 – v·q0, és a dir, l’increment de q (∆q) és igual a u·p0 – v·q0. L’equilibri en aquesta població es troba quan ∆q = 0, és a dir, quan u· = v· i trobem les freqüències gèniques en equilibri. Al comprovar que = u / (u+v) i = v / (u+v) es conclou que els valor de i en l’equilibri són independents de les freqüències gèniques inicials (p0 i q0). Per esbrinar el nombre de generacions que es triga en passar d’una freqüència q0 a una altra qn s’utilitza la següent fórmula: n = [1/(u+v)] · ln [(q0- )/(qn- )].

· Selecció: La selecció es dóna quan no tots els genotips tenen el mateix nombre de descendència; pot ser natural o artificial. La aptitud (w) és la contribució proporcional de descendents a la següent generació per part d’un genotip (fitness o eficàcia biològica); el coeficient de selecció (s) és la reducció proporcional de la contribució genètica per part d’un genotip: w + s = 1 o w = 1 – s. La selecció es pot donar en gran varietat de situacions: · En dominància completa (A1 > A2):

· Eliminació parcial de recessius: La generació en la que es produeix l’eliminació total dels recessius A2 quan s ≠ 1 s’obté de la següent fórmula: n = 1/s · [1/qn – 1/q0

+ ln q0·(1-qn) / qn·(1-q0)]. L’increment de la freqüència de l’al·lel A2 (∆q) es troba a partir de: ∆q = -sq2·(1-q) / (1-sq2). · Eliminació total de recessius: L’eliminació total dels recessius A2 es produeix molt més ràpidament quan s = 1, sent w = 0, mentre que el coeficient de selecció (s) per l’al·lel dominant A1 és de 0, sent l’aptitud (w) 1.

Exemple: Per a eliminar completament el gen A2 d’una població serien necessàries tantes generacions com: n = 1/qn – 1/q0; degut a que per esbrinar la freqüència de l’al·lel A2 en una generació n s’utilitza la fórmula: qn = q0 / (1 + n·q0). · Selecció contra el dominant A1: Quan s’elimina completament el gen dominant A1 quan s = 1 i w = 0, ens trobem amb que l’increment de q (freqüència d’A2) equival a: ∆q = [s·q2 · (1-q)] / [1 – s · (1-q2)].

· En codominància (A1 = A2): Selecció contra A2. · En dominància parcial de A1:

· Selecció contra els homozigots (A1A1 o A2A2): Per a eliminar els homozigots quan l’s de pq és 1 i w = 0, ens trobem amb que l’increment de q (freqüència d’A2) equival a: ∆q = [pq·(s1·p – s2·q)] / (1 – s1·p

2 – s2·q). · Selecció contra els heterozigots (A1A2): Per a eliminar els heterozigots quan s = 1, es pot aplicar la mateixa fórmula que en la selecció contra els homozigots.

Exemple: En un cas de dominància completa i selecció parcial de recessius on s = 0’2, es produeix un efecte en contra els al·lels A2 en el que es rebutgen un 20%. De l’exemple es poden treure dos conclusions: La selecció és més eficaç a freqüències intermèdies, i es fa menys efectiva quan q és molt petita o molt gran. La selecció a favor o en contra d’un gen recessiu és molt ineficaç quan l’al·lel recessiu és rar i es troba encobert pels heterozigots.

S’ha de recordar el que es deia a l’inici del tema 11: En una població en equilibri de H-W, les freqüències genotípiques, per a un sol locus amb dos al·lels, depenen de les freqüències gèniques. La freqüència d’heterozigots no pot ésser mai superior al 50%, i aquest màxim només s’assoleix quan p i q són de 0’5. Quan la freqüència gènica d’un al·lel és baixa, l’al·lel rar es presenta predominantment en els heterozigots, havent-hi molt pocs homozigots. Equilibri mutació - selecció (12.1.1) En el cas d’una població natural (exemple) en el que actua un gen recessiu letal (a), sobre el genotip doble recessiu (aa) actua una intensitat de selecció s, fent que en cada generació es perdin al·lels a segons la fórmula utilitzada en l’eliminació parcial de recessius: ∆q = -sq2·(1-q) / (1-sq2). Tanmateix, si en cada generació existeix una taxa de mutació u que converteix gens A en a al mateix ritme que la taxa de mutació v converteix gens a en A, ens trobem que ∆q guanyat és igual a ∆q perdut, i per tant, u·p – v·q = sq

2·(1-q) / (1-sq

2) = u·(1-q) – v·q. Aquesta fórmula es pot simplificar

quan estem interessats en gens amb freqüències baixes d’equilibri i per tant q és tan petit que la fórmula queda de la següent manera: sq2 = u, obtenint-se la proporció de morts genètiques quan una població es troba en equilibri (llast genètic). Processos dispersius (12.2)

Els processos dispersius sorgeixen en petites poblacions, com a conseqüència del mostreig o dels aparellaments no aleatoris entre els individus. Aquesta força o agent, que pot canviar les freqüències gèniques d’una població en equilibri, difereix de les anteriorment vistes en que és aleatòria en direcció o predictible només, en quantitat. S’ha de tenir en compte que s’exclouen casos on hi hagi hagut migracions, mutacions o seleccions, degut al procés de mostreig dels gàmetes. Hi ha dues maneres diferents d’estudiar el procés dispersiu i de deduir-ne les conseqüències:

· Procés de mostreig (atzar) que es descriu en termes de la variància del mostreig (deriva genètica). · Aparellament no aleatori:

· Procés endogàmic o consanguini que es descriu en termes dels canvis genotípics resultants de l’aparellament entre parents (consanguinitat). · Aparellaments classificats o associatius

Les conseqüències del procés dispersiu són els canvis aleatoris de les freqüències entre generació i generació; la uniformitat dins de les subpoblacions en les que es redueix la variància genètica (σ2) degut a que l’aïllament reproductiu provoca l’augment de consanguinitat; la diferenciació entre les diferents subpoblacions o línies en les que augmenta la variància genètica (σ2); i l’augment de l’homozigosi degut a la mida petita de les subpoblacions on al·lels letals són recessius i a més, hi ha pèrdua de fertilitat i viabilitat. Deriva genètica (12.2.1) Una població compleix les condicions d’una població ideal quan la població base és gran i es subdivideix en vàries subpoblacions o línies, en les quals no actua cap altra força (a part del procés dispersiu) que pugui alterar l’equilibri H-W. És a dir, no hi ha migració i les línies estan aïllades reproductivament; no hi ha mutació; no hi ha selecció i tots els individus tenen les mateixes probabilitats de reproduir-se sense diferències de fertilitat ni viabilitat; les generacions són separades i no solapades; hi ha igual nombre de reproductors en cada línia i generació, i igual nombre de mascles i femelles; i els aparellaments són aleatoris dins de cada línia, incloent l’autofertilització. En el global de cada generació no hi ha canvis de les freqüències gèniques, tan sols hi ha una redistribució dels gens (genotips) en la població; tanmateix, hi ha una dispersió de les freqüències gèniques, des dels valor intermedis cap als extrems. La tendència fa que en algunes subpoblacions es tendeixi a l’augment d’un al·lel A1 i en altres línies a l’altre al·lel A2, per lo que es tendeix a l’augment de l’homozigosi i a la disminució de l’heterozigosi.

Exemple de pèrdua d’al·lels en poblacions petites: Si es disposa d’un sac amb un 80% de bolques blanques i un 20% de bolques negres, i s’extreuen mostres de 10 boles, a vegades s’extrauran exactament 8 blanques i 2 negres, però freqüentment el nombre de bolques blanques i negres no es correspondrà exactament amb la proporció 80:20. A vegades s’extrauran 7 blanques i 3 negres, i inclòs en alguna ocasió s’extrauran només boles blanques o només boles negres (aquest segon cas es donarà, lògicament, amb molta menys freqüència). Quan es disposar d’una població de 10 individus que es reprodueixen a l’atzar, en la qual hi ha un 80% d’al·lels A1 i un 20% d’al·lels A2, no sempre 8 parells de gàmetes amb l’al·lel A1 i 2 amb el A2 donaran lloc a la següent generació. Si 9 parells de gàmetes amb el A1 i 1 amb el A2 són els que tenen èxit, les freqüències gèniques ha passaran a ser del 90% i del 10%. Aquesta situació erràtica continua de generació en generació fins que, casualment, només gàmetes amb l’al·lel A1 es reprodueixen, amb la qual cosa l’al·lel A2 es perdrà, i d’aquí en endavant tots els individus de la població seran A1A1. Quan es dóna aquesta situació es diu que l’al·lel A1 està fixat. També es pot donar el cas que sigui l’al·lel A2 el que es fixi, encara que això és menys probable. Pot succeir que, per atzar, l’al·lel A2 vagi augmentant la seva freqüència en la població fins a ser, per exemple, del 90%. En aquest cas és més probable que en la següent generació es fixi l’al·lel A2.

Aquest fenomen és més acusat quan la població és petita. Si les mostren que traguéssim del sac anterior fossin de 1000 boles, la proporció de boles blanques en la mostra s’aproximaria més al 80% que quan traiem mostres de 10 boles. Si la població és molt gran, la freqüència de gàmetes amb l’al·lel A serà més pròxima al 80% que quan la població era de 10 individus. A la diferència de freqüències entre una generació i la següent, deguda a aquest efecte del mostreig, se l’anomena deriva genètica.

Amb la conclusió d’aquest exemple s’obté que la variància de q en la generació t és: σ2qt = p0q0 · [1 –

(1 – 1/2N)t]; i, a més, les freqüències genotípiques en la població global són ( 2

)t = p20 + σ

2qt per al

genotip A1A1, (2 )t = 2p0q0 - 2σ2

qt per al genotip A1A2, i (2)t = q

20 + σ

2qt per al genotip A2A2.

Experiment de deriva genètica: Evolució de la freqüència d’un al·lel en un experiment de 20 generacions realitzat en 12 poblacions d’escarabats Tribolium on un al·lel (tipus silvestre) estava sotmès a selecció natural. En les subpoblacions de 10 individus es van trobar que la freqüència de l’al·lel no augmentava de forma contínua i fins i tot es perdia en alguna de les subpoblacions; en canvi, en les subpoblacions de 100 individus, l’al·lel augmentava en totes les subpoblacions seguint una corrent contínua. Exemple de Stern, 1949: Suposem que ne una regió geogràfica habita una espècie animal que en una generació determinada presenta les freqüències genotípiques 0’25 per AA, 0’5 per Aa i 0’25 per aa, i per tant, p = q = 0’5. Com a conseqüència d’un fenomen volcànic, aquesta regió es converteix en un arxipèlag format per 160 illes, en cadascuna de les quals queden com a únics supervivents un mascle i una femella. Què succeirà en les 160 illes (subpoblacions) originades a partir del continent inicial (població base)?

Composició de les illes segons els

supervivents

Probabilitat Tipus de descendència i freqüència amb que apareixerà a l’illa

AA Aa aa

Fr (A) = p Nombre d’illes

AA x AA ¼·¼ = 1/16 1 - - 1 10 AA x Aa 2·¼·½ = 4/16 0’5 0’5 - 0’75 40 AA x aa 2·¼·¼ = 2/16 - 1 - 0’5 20 Aa x Aa ½·½ = 4/16 0’25 0’5 0’25 0’5 40 Aa x aa 2·½·¼ = 4/16 - 0’5 0’5 0’25 40 aa x aa ¼·¼ = 1/16 - - 1 0 10

És a dir, que en 10 illes (subpoblacions) el gen A s’ha fixat i en altres 10 s’ha perdut. En 40 illes la freqüència del gen A ha passat a ser 0’75, i en altres 40 la freqüència és de 0’25; mentre que només en 60 illes la freqüència segueix sent la de la població original 0’5. Tanmateix, la freqüència gènica p de la població conjunta no ha canviat, la = p0 = 0’5:

= (1·10)+(0’75·40)+(0’5·20)+(0’5·40)+(0’25·40)+(0·10) / 160 = 0’5. Existeixen situacions naturals o artificials en les que es perden individus reproductors d’una població inicial, la qual cosa condueix a la modificació de les freqüències gèniques quan la mida de la població es recupera, s’anomenen colls d’ampolla. Aquests casos es donen en situacions de desastres, en els que no es produeix una selecció, sinó una eliminació aleatòria d’individus i genotips. Aquests colls d’ampolla poden canviar les freqüències gèniques de forma lleugera quan és menor, per exemple, quan es produeix una disminució de la població de 1100 a 500, o major, per exemple, quan es produeix un efecte fundador on només romanen en la mateixa localització 12 dels 1100 individus.

Consanguinitat (12.2.2) La consanguinitat és una característica dels individus que tenen aparellaments amb individus emparentats (aparellaments endogàmics), és a dir, individus que tenen un antecessor comú. Aquest procés té com a fi l’augment de l’homozigosi i la disminució de l’heterozigosi.

Exemple: Una població base (població ideal), és a dir, una població que es troba en equilibri genètic, en la generació 0 conté un coeficient de consanguinitat (F) de 0, és a dir, no hi ha relacions familiars entre els individus; en la G1, la probabilitat de que es formi un individu a partir de dos gàmetes amb gens idèntics és F1 = 1/2N; en la G2 i en les següents fins a Gt, la Ft = 1/2N + (1 – 1/2N) · Ft-1, en la que es té en compte l’endogàmia nova (1/2N) i l’endogàmia prèvia [(1 – 1/2N)·Ft-1], ja que en la població hi ha gens que són independents en el seu origen de la generació 1, però podrien ser idèntics en el seu origen de la generació 0. Per calcular el grau de consanguinitat (F) s’utilitza al màxim la informació genealògica, que és la més útil; si no, es poden utilitzar marcadors genètics neutres. El grau de consanguinitat respecte el capdamunt del pedigree conegut en una generació t es calcula utilitzant la següent fórmula: Ft

= ∆F + (1-∆F) · Ft-1, on ∆F = (Ft – Ft-1) / (1 – Ft-1). Si ens trobem que en la generació t han augmentat els heterozigots

El coeficient d’endogàmia o grau de consanguinitat (F) ens permet mesurar la probabilitat de que 2 al·lels d’un locus d’un individus siguin iguals per descendència i vinguin d’un antecessor comú degut a que indica la proporció d’ascendents comuns que tenen dos individus; i l’índex de panmixia (P) és una mesura de la quantitat relativa d’heterozigosi, per aparellament aleatori, que es perd per consanguinitat. F + P = 1, per lo que P = 1 – F.

Exemple: Partint d’una població base on F = 0 (no hi ha consanguinitat, mínima homozigosi) i P = 1 (màxima heterozigosi), i per tant, hi ha 2pq heterozigots (equilibri H-W), mesurarem la F de la generació t a partir de la fórmula: Ft = ∆F + (1-∆F) · Ft-1, i la P de la generació t serà doncs: Pt

= Pt-1 · (1-∆F). Per veure la panmixia de la generació t en relació a generacions anteriors s’utilitza la fórmula: Pt = Pt-2 · (1-∆F)2, i en relació a la generació G0 s’utilitza la següent fórmula: Pt = P0 · (1-∆F)

t; com que en la població base, la P0 = 1, el grau de consanguinitat (F) en la generació t és: Ft = 1 – (1-∆F)

t = 1 – Pt.

L’índex panmíctic (Pt) el podem expressar com la freqüència d’heterozigots (heterozigosi � H) en qualsevol moment, en relació a la seva freqüència en la població base, és a dir, en relació amb les freqüències H-W esperades si la població global s’aparellés a l’atzar: Pt = 1 – Ft = Ht / H0, que expressat segons l’índex de fixació de Wright (F) és: F = (Hesp – Hobs) / Hesp. Un valor de F = 0 en un estudi amb una mostra representativa d’animals i de gens indica un equilibri H-W, mentre que un valor de F positiu o negatiu indica un dèficit o excés respectivament, d’heterozigots en la població, respecte a les proporcions H-W. Alguns factors importants que poden donar valors de F inferiors a 0 (quan l’heterozigosi observada és superior a l’esperada � excés d’heterozigots) o superiors a 0 (quan l’heterozigosi esperada és superior a l’observada � dèficit d’heterozigots) són: · Consanguinitat (dèficit) · Aparellaments classificats (dèficit) · Efecte Wahlund: Subdivisió de poblacions (dèficit) · Locus sotmès a selecció (dèficit): Efecte d’arrossegament o autostop. · Existència d’al·lels nuls no detectables (dèficit)

· Efecte Robertson (excés): Quan les freqüències gèniques de mascles i femelles, per a un locus, són diferents. · Migració (excés) · Moment d’actuació de la selecció (excés).

La consanguinitat no canvia les freqüències gèniques d’una població, tan sols les freqüències genotípiques, doncs hi ha una nova redistribució dels gens a la població. La variància que es produeix en les freqüències gèniques d’un al·lel i l’altre són les mateixes: σ

2qt = σ

2pt = p0q0 · Ft. La

consanguinitat, com ja s’ha dit, provoca la disminució d’heterozigots i l’augment d’homozigots que poden ser d’origen independent (alozigots) o d’origen idèntic (autozigots), de la següent manera:

F Freqüència original

Canvi degut a l’endogàmia

Origen: Independent Idèntic

A1A1 p20 + p0q0F = p2

0 (1-F) + p0F A1A2 2p0q0 - 2p0q0F = 2p0q0 (1-F) A2A2 q2

0 + p0q0F = q20 (1-F) + q0F

La freqüència d’homozigots idèntics (autozigots) és per definició el Coeficient de Consanguinitat (F) i és proporcional a les freqüències gèniques inicials. Relació deriva – consanguinitat (12.2.3)

Deriva Consanguinitat

σ2p = σ2

q = p0q0 / 2N ∆F = 1/2N ; σ2q = p0q0∆F

σ2p = σ2

q = p0q0 · [1 – (1-1/2N)t] Ft = 1 – (1-∆F) ; σ2qt = p0q0Ft

fr (A1A1) = p20 + σ2

q fr (A1A2) = 2p0q0 – 2σ2

q fr (A2A2) = q2

0 + σ2q

fr (A1A1) = p20 + p0q0F

fr (A1A2) = 2p0q0 – 2p0q0F fr (A2A2) = q2

0 + p0q0F La consanguinitat té conseqüències: Augmenta la freqüència dels defectes o anomalies genètiques degudes a gens recessius, és a dir, exterioritza o destapa aquests defectes i/o anomalies. A més, produeix un fenomen anomenat depressió consanguínia, en la qual es disminueix el valor fenotípic mig d’un caràcter en la població degut a l’augment de l’homozigosi, principalment en caràcters relacionats amb la taxa reproductiva i el vigor general, i en menor mesura, en caràcters de producció. Aparellaments endogàmics (12.2.4) Els aparellaments endogàmics són aquells que es fan entre parents per incrementar la fixació de caràcters que puguin ser apropiats pel ramader. El coeficient de consanguinitat dintre d’una raça o població es calcula mitjançant els sistemes regulars de consanguinitat o llibres genealògics. Les línies o subpoblacions presenten un elevat grau d’homozigosi i determinats caràcters fixats; aquest fet pot dur a terme una depressió endogàmica que es manifesta en forma de disminució del vigor i la salut dels animals, i l’aparició d’anomalies recessives. La depressió endogàmica es pot solucionar mitjançant encreuaments interracials o intrarracials amb poblacions no emparentades (heterosi); o mitjançant programes d’endogàmia mínima tant si no es disposa d’informació genealògica (igualant el nombre de mascles i femelles o diferenciant-lo), com si es disposa (realitzant una matriu de Parentius o l’anàlisi de Cluster). La producció de línies consanguínies experimentals es pot realitzar a diferents nivells però sempre al mateix nivell, és a dir, entre germans, entre cosins, entre cosins segons...

Experiment: S’inicia l’experiment amb 20 línies consanguínies de ratolins que en la població base eren cosins germans que tenien un parentesc de 0’25 i varen donar a lloc a una descendència amb un coeficient de consanguinitat de F = 0’125. En els resultats s’observa com el nombre de supervivents va disminuint a mida que s’incrementa la consanguinitat (F) degut a la depressió endogàmica que pateixen poc a poc.

Generació nombre F (%) de les ventrades

Nombre de línies Perdudes Supervivents

Base 0 0 20 0 12’5 0 20 1 31’3 0 20 2 43’8 0 20 3 54’7 1 19 4 63’3 10 10 5 70’3 15 5 6 76’0 17 3 7 80’6 17 3 8 84’3 17 3 9 87’3 17 3

10 89’7 17 3 11 91’7 18 2 12 93’5 19 1 ... ... ... ... 20 98’8 19 1

Experiment 2: Els coeficients d’endogàmia són diferents segons els sistemes regulars de consanguinitat sota la que es trobi.

Generació Autofecundació o creuaments

repetits

Germà x germana: Coeficient

d’endogàmia

Germà x germana:

Probabilitat de fixació

Mig germans Creuaments repetits a

l’atzar d’individus individuals

0 0 0 0 0 0 1 0’5 0’25 0 0’125 0’25 2 0’75 0’375 0’063 0’219 0’375 3 0’875 0’5 0’172 0’305 0’438 4 0’938 0’594 0’293 0’381 0’469 5 0’969 0’672 0’409 0’449 0’484 6 0’984 0’734 0’512 0’509 0’492 7 0’992 0’785 0’601 0’563 0’496 8 0’996 0’826 0’675 0’611 0’498 9 0’998 0’859 0’736 0’654 0’499

10 0’999 0’886 0’785 0’691 ... 11 ... ... ... ... ...

Exercici exemple del canvi de base en una població estructurada: Es va criar una línia de ratolins durant 42 generacions, amb una mida de població de 40 individus. Després es va continuar criant durant 11 generacions més, mitjançant encreuament entre germans complets. Quin va ser al final el coeficient de consanguinitat? Des del punt A fins al punt B hi ha 42 generacions, i des del punt B fins al punt X n’hi ha 11; per tant, l’índex panmíctic entre X i A és: PXA = PXB · PBA, el qual també es pot expressar com: (HX / HA) = (HX / HB) · (HB / HA) o (1-FXA) = (1-FXB) · (1-FBA). La consanguinitat i la panmíxia des de A fins a B, on trobem una població de 40 ratolins amb 42 generacions d’aparellaments a l’atzar és: ∆F = 1/2N = 1/80 = 0’0125; Ft = 1-(1-∆F)t = 1 – (1 – 0’0125)42 = 0’41; i PBA = 1-FBA = 1 – 0’41 = 0’59. La consanguinitat i la panmíxia des de A fins a B, on trobem una població de 40 ratolins amb 11 generacions d’aparellaments entre germans complets és: FXB = 0’908 segons les Taules; i PXB = 1-FXB = 1 – 0’908 = 0’092.

Per tant, la consanguinitat i la panmíxia des de A fins a X és: PXA = PXB · PBA = 0’092 · 0’59 = 0’054, i FXA = 1-PXA = 1 – 0’054 = 0’946. El coeficient de consanguinitat al final de l’experiment va ser del 94’6%.

Índexs de fixació o F-Estadístics (12.3) Els índexs de fixació varen ser estudiats creats per Nei al 1977, Wright al 1978 i Weir & Cockerham al 1984. Es varen establir 3 F-estadístics a partir de 3 tipus d’heterozigosi:

· Mitjana d’heterozigosi observada en el conjunt de les subpoblacions (HO), mitjana d’heterozigosi esperada en el conjunt de les subpoblacions (HS), i heterozigosi esperada en el global de la població (HT). · FIS (ƒ) mesura l’excés o dèficit mig d’heterozigots en cada subpoblació: FIS = (HS – HO) / HS. · FIT (F) mesura l’excés o dèficit mig d’heterozigots en la població conjunta: FIT = (HT – HO) /

HT. · FST (θ) mesura el grau de diferenciació genètica existent entre les subpoblacions: FST = (HT –

HS) / HT. L’heterozigosi observada o individual és la freqüència relativa d’individus heterozigots observats en la mostra per a qualsevol dels loci; es calcula per comptatge directe. L’heterozigosi esperada o Diversitat genètica de Nei és la freqüència esperada d’individus heterozigots en el global de la població, sota les condicions d’equilibri genètic H-W; és la probabilitat de que dos al·lels d’un locus, agafats a l’atzar de la població, siguin diferents.

1 – FIT = (1 – FIS) · (1 – FST) Variació de l’estructura reproductiva (13) En una població ideal, la grandària de la família, és a dir, el nombre descendents d’un parell de progenitors que sobreviuen per arribar a ser individus reproductius és: σ2

k = = 2, segons la propietat de distribució de Poisson. El nombre efectiu de reproductors o grandària efectiva de la població (Ne) és el nombre d’individus que donarien lloc a la variància del mostreig (σ2

k), o a la taxa d’endogàmia apropiades a les condicions sota consideració, si dits individus es reproduïssin en la forma com es fa en la població ideal. Quan augmenta la Ne disminueix l’increment de consanguinitat (∆F); el nombre efectiu de reproductors es calcula mitjançant aquesta operació: Ne = 4N / (2 + σ

2k).

En una població ideal la σ2k = 2, la Ne = N, i l’∆F = 1/2N; tanmateix, en les poblacions reals ens

trobem amb que σ2k > 2, la Ne < N, i l’∆F és superior.

Una reproducció controlada per l’humà implicaria reduir la σ2k per sota de 2 i en el millor dels casos

fins a σ2k = 0, augmentar la Ne per sobre de N i en el millor dels casos fins a Ne = 2N, i reduir l’∆F i en

el millor dels casos fins a un ∆F mínim. Reduir la σ2k a 0 és el camí, a través del qual, podem

disminuir la consanguinitat. Reproductors a l’atzar (13.1) Quan l’elecció dels reproductors és a l’atzar, es produeixen 2 tipus de variacions de l’estructura reproductiva segons les probabilitats de contribuir a la següent generació:

· Tots els reproductors tenen les mateixes probabilitats de contribuir a la següent generació, és a dir, no hi ha diferències de fertilitat. Es mantenen les condicions de la població ideal, llevat del fet que excloem l’autofertilització i l’aparellament entre individus estretament emparentats. Tenint en compte que el nombre de mascles i femelles són el mateix, les fórmules no varien: Ne ≈ N + 2, i ∆F ≈ 1 / (2N+4). Les condicions seran sempre les mateixes llevat que el nombre de mascles sigui diferent al de femelles, canviant les fórmules en aquest cas: Ne = (4Nm·Nf) / (Nm+Nf), i ∆F = 1/(8Nm) +

1/(8Nf). En el cas d’haver-hi un nombre desigual en generacions successives, ens trobem amb que 1/Ne =

1/t · (1/N1 + 1/N2 + ... + 1/Nt). Exemple: El nombre efectiu de reproductors i l’increment de consanguinitat en una població amb 100 femelles i 5 mascles seria: Ne = (4·5·100) / (5+100) = 19; ∆F = 1 / 2Ne = 1 / 2·19 = 2’6 %. Els increments de consanguinitat (∆F) depenen sobretot del sexe menys nombrós.

· Els individus reproductors no tenen tots les mateixes probabilitat de contribuir amb gens o descendents a la següent generació, és a dir, hi ha diferències de fertilitat i supervivència dels zigots. Es suposa una població real on = 2 i σ2

k > 2. En el cas d’aparellaments monògams, en els que els mascles només es poden aparellar amb una femella i hi ha el mateix nombre d’uns i d’altres: Ne = 4N / (2 + σ

2k).

En el cas en els que els mascles es poden aparellar amb més d’una parella i no hi ha el mateix nombre d’uns i d’altres: Ne = 8N / (σ

2km + σ

2kf + 4).

Reproductors no a l’atzar (13.2) Quan els l’elecció dels reproductors no és a l’atzar, l’endogàmia mínima s’aconseguirà quan la variància de la grandària de la família sigui igual a 0 (σ2

k = 0). S’aconsegueix escollint deliberadament els individus per a que siguin els progenitors de la següent generació. En el cas en que el nombre de mascles i femelles sigui igual, s’escullen deliberadament dos membres de cada família per a que siguin els progenitors de la següent generació: σ2

k = 0, Ne = 2N, i ∆F = 1/4N. Exemples: Si utilitzem 2 mascles i 2 femelles, l’∆F = 1/4·4 = 6’25%; si utilitzem 3 mascles i 3 femelles, l’∆F = 1/4·6 = 4’17%; si utilitzem 4 mascles i 4 femelles, l’∆F = 1/4·8 = 3’13%; ...

En el cas en que el nombre de mascles i femelles sigui diferent, s’escullen com a progenitors un mascle de la descendència de cada mascle i una femella de la descendència de cada femella: σ2

k = 0, Ne =

(16Nm · Nf) / (3Nf + Nm), i ∆F = 3/(32Nm) + (1/32Nf). Exemples: Si tenim un mascle i 4 femelles, l’∆F = 3/32·1 + 1/32·4 = 10’16%; si tenim 2 mascles i 5 femelles, l’∆F = 3/32·2 + 1/32·5 = 5’31%; si tenim 3 mascles i 15 femelles, l’∆F = 3/32·3 + 1/32·15 = 3’33%; ...

Quan aconseguim que σ2k = 0, l’∆F és mínim.

Genealogia (14) La genealogia o pedigree d’un individu X, és la cronologia dels individus que tenen una part del seu patrimoni genètic en comú amb l’individu X, ja que ells en són antecessors, col·laterals o descendents. La genealogia es pot representar gràficament de diferents maneres segons convingui, depenent de l’embolic que hi hagi amb els creuaments:

Exemple: En aquest arbre genealògic trobem un individu A amb genotip AA’ i un individu B amb genotip AA’’; la seva descendència X, doncs, podrà tenir els següent genotips amb una probabilitat de 1/4 per cadascun: AA (homozigot idèntic per descendència), AA’, AA’’ o A’A’’. El coeficient de consanguinitat (Fx) de l’individu X, és la probabilitat de que els dos al·lels, presents en un locus d’aquest individu, siguin idèntics per descendència a un al·lel d’un antecessor. El Fx varia entre 0 i 1.

Fx = 1/2 · 1/2 = 1/4 El coeficient de parentiu (rAB) entre els individus A i B, és el nombre esperat de gens en un locus d’un individu (A), que són idèntics per descendència amb un gen escollit a l’atzar, en el mateix locus, de l’altre individu (B). El rAB varia entre 0 i 2.

rAB = 1 · 1/2 = 1/2 El coeficient de coascendència (ƒAB) entre els individus A i B, és la probabilitat de que dos al·lels, agafats a l’atzar del mateix locus entre els dos individus, siguin idèntics per descendència.

fAB = 1/2 · 1/2 = 1/4 Podem comprovar doncs, com: Fx = ƒAB = rAB/2 || 2Fx = 2fAB = rAB

Exemple: Càlcul del coeficient de consanguinitat del Toro Comet, el fundador de la raça Shorthorn. Observant la informació genealògica, ens trobem amb que els individus E i G es consideren població base degut a que no es coneix els seus progenitors, lo que els hi

confereix una consanguinitat nul·la (F = 0); tampoc coneixem un dels progenitors (el pare) de l’individu F. A més, segons la informació genealògica, l’individu X té 4 progenitors comuns: E, G, D i A, és a dir, individus que ofereixen la possibilitat de donar el mateix al·lel exacte a l’individu X des de la branca del pare i la branca de la mare gràcies a que tenen 2 descendents. Per obtenir la Fx (coeficient de consanguinitat del Toro Comet) s’ha de sumar la Fx de cada via mitjançant la fórmula Fx =

(1/2)n · (1+Fant), on n equival al nombre d’individus dintre del circuit genealògic (sense comptar

al propi individu X), i Fant a la F de l’antecessor comú. Via E (ACEDB): Fx = (1/2)5 · (1+FB) = (1/2)5 = 1/32 Via G (ACDFGDB): Fx = (1/2)6 · (1+FG) = (1/2)6 = 1/64 Via D (ADB): Fx = (1/2)3 · (1+FD) = (1/2)3 = 1/8; FD = 0 ja que entre els seus progenitors E i G no hi ha parentiu. Via A (AB): Fx = (1/2)2 · (1+FA); FA té dos coeficients de consanguinitat, ja que té dos antecessors comuns: E i G.

Via E (CED): FA = (1/2)3 · (1+FE) = 1/8; Via G (CFGD): FA = (1/2)4 · (1+FG) = 1/16. FA (total) = 1/8 + 1/16 = 3/16. Fx = (1/2)2 · (1+3/16) = 19/64.

Fx (total) = 1/32 + 1/64 + 1/8 + 19/64 = 0’4687, obtenint-se un coeficient de parentiu (rAB) de: rAB = 2Fx = 0’9375. Càlcul del coeficient de coascendència del Toro Comet, el fundador de la raça Shorthorn. El coeficient de coascendència (fAB) és igual a la Fx i la meitat del coeficient de parentiu (rAB): fAB = Fx (total) = 0’4687, sent rAB = 0’9375.

Matriu de parentius (14.1) La matriu de parentius és el mètode tabular que permet observar la el coeficient de parentiu entre els diferents individus d’un arbre genealògic. Per realitzar-la, només cal fer un procés iteratiu que exigeix només ordenar cronològicament els individus, de manera que cap individu aparegui en la llista abans que els seus pares. Cal saber que les relacions de parentiu d’un individu A...: · amb si mateix és 1 (rAA = 1+FA) sempre i quan A no sigui consanguini · amb els seus progenitors és 1/2 · amb el seu germà complet és 1/2 · amb el seu mig germà és 1/4 · i amb els seus avis és 1/4.

Exemple: A partir del següent arbre genealògic i la informació anterior es pot realitzar una Matriu de parentius on es podrà observar els coeficients de parentiu (r) entre tots els individus:

A B C D E F A 1 0 0 0’5 0’5 0’5 B 0 1 0 0’5 0 0’25 C 0 0 1 0 0’5 0’25 D 0’5 0’5 0 1 0’25 0’625 E 0’5 0 0’5 0’25 1 0’625 F 0’5 0’25 0’5 0’625 0’625 1’125

Per calcular la r d’individus en una mateixa generació (rDE), es realitza la mitjana de r entre els pares d’ambdós individus: rDE = (rAA + rAC + rBA + rBC)/4 = (1+0+0+0)/4 = 0’25. Per calcular la r d’individus en diferents generacions (rCD), es realitza la mitjana de r entre l’individu més vell i els pares de l’individu més jove: rCD = rC,AB = (rCA + rCB)/2 = (0+0)/2 = 0. Per calcular la r d’un mateix individu (rFF), es realitza la següent fórmula: rFF = 1 + FF = 1 + rDE/2 = 1 + 0’25/2 = 1’125; en aquest cas, l’individu F és l’únic individu endogàmic, per lo que el rFF ha sigut l’únic superior a 1.

La matriu de parentius és una matriu simètrica, per lo que la 1ª fila és igual a la 1ª columna, la 2ª fila a la 2ª columna... El càlcul dels coeficients per a les noves generacions s’integren fàcilment en la taula. Les matrius de parentius són interessants per programar aparellaments entre individus, per a controlar l’increment de consanguinitat (de gran importància en poblacions petites o en perill d’extinció; a amés, permet realitzar una avaluació genètica dels individus, per a diferents caràcters d’interès productiu. Origen de la vida (21) Un món basat en el RNA (21.1) La hipòtesis més acceptada sobre l’origen de la vida és que a l’inici el món estava basat en el RNA, sent aquesta la molècula ancestral prèvia al DNA i les proteïnes. El RNA és una molècula amb una activitat catalítica de reaccions simples que li permetien realitzar escissions d’àcids nuclèics, polimeritzacions de nucleòtids, síntesis de proteïnes... considerant-se llavors un ribozim. Tot el conjunt de reaccions no podien tenir lloc en qualsevol espai ni en qualsevol concentració de RNA, sinó que es requeria una elevada concentració de molècules. La gran concentració necessària s’aconseguia utilitzant una bicapa lipídica que formava una membrana aïllant i concentrant de molècules diferents. Comparant les membranes de les cèl·lules dels 3 regnes principals, es veu que la membrana de les Archaea (formada per cadenes d’isoprens ramificats units al L-glicerol) són diferents a les membranes de bacteris i eucariotes (formada per cadenes d’àcids grassos no ramificats units al D-glicerol); això fa pensar que la primera membrana “cel·lular” va aparèixer durant els temps de l’ancestre universal dels 3 regnes, que abans residia en un compartiments inorgànics subaquàtics en suficients concentracions com per donar lloc a les primeres reaccions vitals. Seqüenciació de genomes (21.2) Mida del genoma i paradoxa del valor C (21.2.1) S’ha comprovat que la complexitat biològica dels éssers vius no està directament relacionada amb la mida del genoma, lo que va suposar l’anomenada paradoxa del valor C. L’Homo sapiens (humà) té 3000 Mb en el seu genoma, el Locusta migratoria (saltamartí) en té 5000, i el Triticum aestivum (cereal) en té 16.000; les investigacions van apuntar a que la complexitat dels éssers vius depèn doncs, dels mecanismes utilitzats en l’expressió dels gens. Seqüenciació del genoma del pollastre (2004) (21.2.2) L’estudi del genoma del pollastre ha demostrat que el seu genoma haploide té una mida estimada de 1’2 · 109 pb, és a dir, un 40% del genoma del ratolí o l’humà. Tanmateix, només té un 11% de contingut en DNA repetitiu, tenint un nombre estimat de gens d’entre 20.000 i 23.000. S’han identificat 2’8 milions de SNP. Seqüenciació del genoma caní (2005) (21.2.3) La seqüenciació del genoma d’una femella de raça Boxer i d’un Caniche va mostrar que tenen una menor proporció d’elements repetitius (34%) que els humans (46%) o els ratolins (40%). La comparació genòmica entre el Boxer i el Caniche revela l’existència de 10.000 insercions SINE polimòrfiques. Va desmostrar que el genoma dels gossos té uns 19.300 gens i més de 2’5 milions de SNP. L’estudi dels canins mostra que els animals pertanyents a una raça concreta tenen una baixa variabilitat, mentre que els individus de diferents races tenen una alta variabilitat entre ells, és a dir, els individus d’una raça són molt homogenis i entre races són molt diferents degut a una evolució independent degut a una deriva genètica (evolució independent). La domesticació va provocar que els gossos tinguessin una variabilitat genètica menor a la dels llops, a més, determinats efectes fundadors van establir les diferents races que

evolucionarien en diferents camins. Els efectes fundadors van crear un elevat desequilibri de lligament degut a que la diversitat d’haplotips (cromosomes ABC, ABc, AbC, aBC, …) va disminuir i per cada efecte fundador varen perdurar només els haplotips més freqüents. Seqüenciació del genoma boví (2009) (21.2.4) La seqüenciació va mostrar que els bovins tenen una mida del genoma de 2’7 Gb amb un 27% d’elements repetitius. Al menys hi ha 20.000 gens codificants de proteïnes i 496 gens miRNA. L’espècie Bos taurus i la Bos indicus varen ser separades gràcies a que la seqüenciació del genoma va mostrar que hi havia una divergència de 250.000 YBP. A més, s’ha trobat el genotip de 37.000 SNP després de seqüenciar el genoma de 493 bòvids. La investigació genòmica va mostrar que la població ancestral en boví va ser probablement més gran que en el cas del gos, per lo que va patir un coll d’ampolla menys estricte. Es va trobar que la diversitat entre B. indicus i B. taurus va venir determinada per la situació d’un centre major de domesticació en la índia i l’orient on es va domesticar la B. taurus, la qual cosa va fer, a més, que la variabilitat genètica fos superior que el dels animals que abandonen el centre de domesticació. També s’ha pogut observar com hi ha hagut pèrdua de diversitat genètica en races bovines sotmeses a selecció artificial i conseqüentment ha disminuït la població efectiva i augmentat la consanguinitat. Genomes extranuclears (21.3) Els mitocondris i els cloroplasts són els orgànuls cel·lulars que aporten una porció de genoma extranuclear a la cèl·lula on es troben. Tanmateix, moltes de les proteïnes que treballen en el mitocondri són codificades en el nucli cel·lular. El genoma mitocondrial és un genoma circular, petit, molt compacte i hipervariable, amb un únic origen de replicació i sense introns, recordant a un genoma bacterià; conté 13 gens codificants, 22 gens de tRNA i 2 gens Rrna, una regió D-loop que controla la replicació El genoma del cloroplasts és un genoma circular que conté 38 gens codificants, 37 gens de tRNA i gens rRNA. Teoria de l’endosimbiont (1960) (21.3.1) Aquesta teoria postula que els orgànuls cel·lulars provenen de bacteris que varen formar una associació simbiòtica amb una cèl·lula eucariota precursora fa 2500-5000 milions d’anys (proterozoic); la seqüència nucleotídica de molts gens mitocondrials són més similars a les de gens bacterians que a les de gens nuclears eucariotes. Es suposa que els ancestres dels mitocondris van ser uns bacteris semblants a la Rickettsia, mentre que els ancestres dels cloroplasts van ser uns bacteris semblants a les cianobacteries. Transferència de gens entre compartiments cel·lulars (21.3.2) S’ha documentat la transferència de gens entre el nucli i el mitocondri, per lo que es coneix que el genoma mitocondrial conté segments de DNA nuclear i que el genoma nuclear conté fragments curts del genoma mitocondrial. Recombinació del DNA (22) Tipus de recombinació (22.1) En la recombinació del DNA es poden donar quatre tipus:

· Recombinació general o homòloga: Es dóna entre regions homòlogues del DNA durant la meiosis. · Recombinació de lloc específic: Es dóna en una seqüència determinada del DNA reconeguda per un enzim. Un exemple és la integració del fag λ dels virus en el genoma d’un bacteri (E. coli) catalitzada per l’enzim Int codificat pel fag. La integració es produeix per recombinació en un lloc concret denominat att que conté una seqüència de 15 pb homòloga entre E. coli i el fag, flanquejada per regions diferents

· Transposició: Es dóna en elements mòbils. Enzims codificats pel transposó reconeixen seqüències de l’extrem de l’element i determinades seqüències diana del genoma per introduir-s’hi. Els elements transponibles són seqüències de DNA mòbils que es troben en el genoma de tots els organismes. Produeixen una empremta allà on s’insereixen: repeticions directes flanquejants curtes (3-12 pb) en el lloc d’inserció. Es realitzen talls esglaonats en el DNA específic; un element transponible s’autoinserta en el DNA; els talls esglaonats deixen fragments curts de DNA de cadena simple, al replicació dels quals produeix les repeticions directes flanquejants. · Recombinació il·legítima: Es dóna entre dos seqüències del DNA no homòlogues però normalment amb una certa similitud nucleotídica. La recombinació il·legítima pot generar delecions en un dels cromosomes i duplicacions gèniques en l’altre. Les duplicacions han estat importants per l’evolució de les famílies gèniques mentre que les delecions poden produir malalties hereditàries. Les talasèmies són unes malalties hereditàries caracteritzades per la disminució en la producció i la destrucció de glòbuls vermells; l’Hemoglobina Lepore i Kenia estan formades per una globina que és híbrida δ i β o γ i β, produïdes per recombinació il·legítima.

Recombinació general: models (22.2) S’han proposat diferents models per explicar la recombinació homòloga a nivell molecular, tanmateix, el model més acceptat és el Model de Holliday. El model de Holliday estableix que una de les dues cromàtides germanes d’ambdós cromosomes pateixen un quiasma entre elles. Una endonucleasa talla una de les cadenes d’ambdós cromàtides no germanes generant un trencament (NICK), provocant un desplaçament de les cadenes i la unió i invasió mútua entre cromàtides generant una bifurcació. Després es repara el NICK i la bifurcació es migra produint un canvi de nucleòtids entre les dues cromàtides generant un dúplex cada cop més llarg. Seguidament el dúplex es separa i es produeix una rotació de 180º, arribant a l’anomenada estructura de Holliday. Aquesta estructura es tallarà a l’atzar en el pla vertical o l’horitzontal i es reassociaran les cadenes de nucleòtids produint recombinants no sotmesos a entrecreuament compostos per dos molècules heterodúplex (no hi ha canvi en la situació dels gens) o recombinants sotmesos a entrecreuament compostos per dos molècules heterodúplex (hi ha canvi en la situació dels gens) segons la direcció del tall. El model de Holliday prediu la presència de DNA recombinant sense entrecreuament o amb ell, segons el tall es produeixi en el pla horitzontal o en el pla vertical. Reparació del DNA (22.3) Conversió gènica (22.4) Procés que es produeix durant la meiosis pel qual un al·lel determina la conversió de l’altre al·lel a la seva pròpia forma, generant una proporció de gamets diferent a l’esperada. Es va descriure inicialment en els fongs i en els llevats. És conseqüència de la recombinació i reparació del DNA.

Quan un fragment d’un cromosoma (al·lel silvestre) es recombina amb el seu cromosoma homòleg (al·lel mutant), és molt possible que hi hagi un mal aparellament en un homòleg després de la recombinació. Donat el cas, s’ha de realitzar l’escissió del nucleòtid que provoca l’error i reparar-lo segons el que pertoqui. Organització del DNA i estructura del gen (23) Cromosomes bacterians i vírics (23.1) El genoma dels virus poden ser de DNA o RNA, de doble cadena o senzilla, i circular o lineal. El genoma s’empaqueta dintre d’una càpside de proteïnes. Existeixen dos formes d’empaquetament:

· Forma filamentosa en la que unitats de proteïna s’uneixen al DNA i el condensen per interaccions DNA-proteïna.

· Forma polièdrica en la que es forma una càpside buida on el DNA és inserit i condensat a mesura que entra.

El genoma bacterià està format per una molècula de DNA de doble cadena. E. coli té un cromosoma circular de 1200 µm que s’empaqueta en una cèl·lula de 2 x 0’5 µm. Components moleculars de la cromatina (23.2) El DNA bacterià està compactat en una estructura anomenada nucleoide. No utilitzen histones, i són unes proteïnes diferents les que s’uneixen al DNA bacterià, d’entre les quals trobem les proteïnes HU i H que són molt abundants i tenen aminoàcids carregats positivament per unir-se al DNA. Al llisar els bacteris es poden observar llaços de DNA d’uns 40-100 kb. La cromatina es defineix com el DNA unit a les proteïnes dels cromosomes. Segons el grau de compactació del DNA (observat a través de la Tinció Feulgen) es diferencien zones d’eucromatina (no hi ha tinció degut a la poca compactació) o de heterocromatina (hi ha tinció degut a la compactació al no estar activa). Les histones utilitzades com a proteïnes de la cromatina per les cèl·lules eucariotes es separen en H1, H2A, H2B, H3 i H4. L’heterocromatina són regions del genoma inactives que no contenen gens o aquests no estan actius. Es repliquen més tard, durant la fase S i es localitzen en diferents regions dels cromosomes. Heterocromatina es troba en els centròmers i telòmers, en la major par del cromosoma Y de mamífers i en el cromosoma X inactiu de les femelles de mamífer. Nivells d’organització de la cromatina (23.3) Segons el nivell de compactació que tingui la cromatina rep diferents noms: · Nivell 0 � Doble hèlix de 2 nm.

· Nivell 1 � Fibra de nucleosomes de 11 nm (collaret de perles). El nucleosoma és DNA envoltat al voltant d’un nucli proteic. Cada nucli proteic està format per 8 molècules d’histones: 2H2A, 2H2B, 2H3 i 2H4. Les histones són positives, i per això s’enganxen al DNA, que té càrrega negativa; aquesta interacció entre histones i el DNA passa en tot el DNA. El filament de DNA (en doble hèlix) envolta els octàmers d’histones amb 146 parells de nucleòtids; més 54 parells de nucleòtids fins al següent nucleosoma. · Nivell 2 � Fibra en zig-zag de 30 nm. Aquest nivell està produït per una altre histona (H1). La H1 produeix un creuament de les cues del DNA plegant la fibra de nucleosomes per formar fibra amb forma zig-zag. Hi ha proteïnes que s’uneixen al DNA en seqüències específiques. Aquestes proteïnes s’enganxen al DNA en seqüències que no estan enrotllades (en aquest cas la proteïna desenrotlla una mica la doble hèlix del nucleosoma per que sigui més accessible). · Nivell 3 � Fibra de 300 nm (que també s’anomena llaços o bucles). Les proteïnes no histones són les que produeixen l’enllaç en la base de la fibra. L’RNA polimerasa i el DNA polimerasa poden passar al DNA sense desfer tots els nucleosomes. Quan és necessari transcriure o replicar el DNA, s’obre el segment del DNA a nivell de 11 nm per produir la transcripció / replicació.

· Nivell 4 � Cromàtide mitòtica o fibra enrotllada de 700 nm, per tant, dues cromàtides faran 1400 nm. La fibra de 300 nm s’enrotlla al voltant de si mateixa (forma helicoidal). En aquest nivell es troba l’empaquetament màxim del DNA. (Apunts 2008-2009 de Biologia Cel·lular)

Concepte de gen (23.4) Al 1940, Beadle i Tatum van realitzar la hipòtesis de que un gen equivalia a un enzim. Es varen fer experiments amb el fong Neurospora en el que es podien induir i aïllar mutacions de forma simple; aquest fong creix en medis mínims, és a dir, a partir d’una font de C i N és capaç de sintetitzar les molècules que requereix (9 tipus de vitamines, 20 aminoàcids, purines i pirimidines...). Es van identificar mutants que no creixen en medi mínim perquè tenien una mutació nutricional, però sí creixien en un medi sumplementat amb la molècula que no podien sintetitzar. Aquesta molècula en qüestió es va trobar experimentalment i va resultar ser un aminoàcid, per lo que es va deduir que la mutació va afectar a la síntesis d’aminoàcids (concretament va resultar ser la tirosina). Actualment la hipòtesi Un gen – un enzim ha de modificar-se com a Un gen – una cadena polipeptídica o una molècula de RNA funcional. Això és degut a que no tots els enzims són proteïnes; a més, algunes proteïnes estan constituïdes per vàries subunitats, cadascuna de les quals pot ser una cadena polipeptídica codificada per un gen diferent. Mapes genètics en fags (23.5) Hershey i Rotman al 1949 varen establir els mapes genètics en fags per recombinació entre gens de dos soques del fag T2 que diferien en l’aspecte de la calba i en la capacitat de lisar diferents soques d’E. coli.

Progènie de fags produïts a partir de h-r

+ x h

+r

- Fenotip Genotip

Clara i petita h- r+

Tèrbola i gran h+ r- Tèrbola i petita h+ r+

Clara i gran h- r- La metodologia per construir mapes genètics en bacteriòfags segueix aquestes etapes:

· Una cèl·lula d’ E. coli és infectada per dos soques diferents amb al·lels per 2 locus diferents (h+ r- i h- r+) trobats en el fag T2. · L’entrecreuament entre els dos cromosomes virals produeix una progenie recombinant: h+ r+ i h- r-. · Alguns cromosomes virals no s’entrecreuen, lo que produeix una progenie no recombinant (h+ r- i h- r+). · Els fags de la progenie es col·loquen en plaques sobre una barreja de cèl·lules d’ E. coli B i E. coli B/2...; lo que va permetre identificar els quatre genotips de la progenie. El percentatge de progenie recombinant va permetre traçar el mapa dels mutants h- i r-.

Recombinació intragènica (23.6) Durant el 1950-1960, Benzer va estudiar la recombinació intragènica mitjançant la prova de la complementació. Benzer va proposar doncs una sèrie de nous termes i va denominar cistró a la unitat de funció genètica, recó a la unitat indivisible de recombinació, i mutó a la unitat més petita de mutació. Va realitzar un mapa genètic detallat del locus rII del fag T4, un gen imprescindible per a que el fag T4 pugui infectar la soca K12 d’E. coli. Els mutants del locus rII donen lloc a calbes diferents al infectar la soca B d’E. coli. Així, va aïllar i identificar 20.000 mutants rII independents, els quals podien infectar i llisar E. coli B però no E. coli K12. Això li va permetre analitzar un gran nombre de descendents per detectar mutants i recombinants molt poc freqüents.

Quan s’infecta E. coli amb dos fags amb mutacions en cistrons diferents es produeix complementació. En la infecció simultània amb les mutacions en trans (una en A i l’altra en B), hi ha complementació perquè es produeixen ambdós productes funcionals A i B; en la infecció simultània amb les mutacions en cis (ambdues en A), no hi ha complementació perquè no es produeix el producte funcional A. Això és produït a causa de que el locus rII està dividit en 2 cistrons (A i B) que corresponen a gens diferents imprescindibles; actualment, cistró equival a gen (seqüència de DNA que codifica un polipèptid o una molècula de RNA funcional). Benzer va demostrar també que un gen estava format per unitats de mutació (mutó) i de recombinació (recó); actualment, es saps que aquestes unitats són els nucleòtids. Així, Benzer va obtenir un mapa genètic dels dos cistrons que formen el locus rII del fag T4. Organització de les seqüències dels gens en procariotes i eucariotes (23.8) En els gens procariotes tot el RNA està sintetitzat per una sola RNA polimerasa; en els gens eucariotes hi ha 3 RNA polimerases diferents responsables de les diferents classes de molècules de RNA. En els procariotes el mRNA és traduït mentre es fa la transcripció; en els eucariotes el mRNA és processat abans de ser transportat al citoplasma on és traduït, una cua i un cap són afegits i les parts internes de la transcripció són eliminades. En procariotes els gens són segments contigus de DNA que estan colinealment amb el mRNA que és traduït a una proteïna; en eucariotes els gens molts cops estan dividits, no són segments contigus de seqüències de codificació, més aviat, la seqüència codificadora està interrumpuda per seqüències intermèdies. En procariotes el mRNA molts cops és policistrònic; en eucariotes el mRNA sempre és monocistrònic. Un exemple de l’estructura dels gens procariotes són els gens de l’operó lactosa d’E. coli: Diversos gens estructurals es seguits en el cromosoma; quan el RNA és transcrit, s’obté un mRNA policistrònic, és a dir, amb diferents gens incorporats. Quan el ribosoma es mou al llarg del mRNA es tradueixen les diferents proteïnes que inclou l’operó lac en el cromosoma bacterià. Un exemple de l’estructura dels gens eucariotes és el gen de la β-lactoglobulina dels remugants: En el cromosoma en qüestió es troba el gen codificant dividit en segments traduïbles (exons) i segments no traduïbles (introns); quan el DNA és transcrit, s’obté un mRNA amb la regió codificant (unió d’exons) i un cap i una cua formats per regions UTR (untranslated region) utilitzades com a protecció enfront l’atac de DNAses però que no seran traduïts per formar part de la proteïna. Quan els ribosomes tradueixen la proteïna des del codó d’inici (AUG) fins al codó STOP, poden deixar pèptids senyals que no constituiran part de la proteïna però que són utilitzats per transportar la proteïna fins a un lloc específic. Els gens poden arribar a ser molt diversos en quant a la mida del gen, la mida del mRNA, el nombre d’introns... Seqüències repetides i identificació animal (23.9) Al llarg de tota l’arquitectura del genoma es poden trobar seqüències de DNA repetitiu, unes seqüències de copies de DNA repetides en tàndem (DNA satèl·lit, minisatèl·lits i microsatèl·lits) o disperses (transposons de DNA i retrotransposons). Els DNA satèl·lits són seqüències curtes (normalment de 5-200 pb) repetides moltes vegades al llarg del genoma. Aquestes zones són identificades com una banda minoritària de densitat diferent (contingut GC diferent) al centrifugar el DNA genòmic en un gradient de clorur de Cesi. El DNA satèl·lit es localitza principalment en els centròmers; és molt important per la determinació de la funció del centròmer durant la mitosis i la meiosis. En humans, una de les seqüència de DNA satèl·lit més conegudes és la família alfoide

que té una unitat repetida de 171 parells de bases i s’estén unes 3 Mb. Els minisatèl·lits són repeticions en tàndem de 10 a 200 pb (la mida de la unitat repetitiva és variable); s’estén des de 1 fins a 20 kb. Es localitzen en moltes posicions del genoma i el nombre de repeticions en tàndem és molt variable entre individus. Es detecten mitjançant el Southern de múltiples loci. Els minisatèl·lits deixen l’anomenada petjada molecular de DNA en els cromosomes quan s’hibriden loci amb minisatèl·lits i es llegeix el southern de l’individu. Transcripció (24) Formació i modificacions del mRNA, tRNA i rRNA (24.1) La transcripció en procariotes es produeix a partir d’un únic tipus de RNA polimerasa que transcriu tots els tipus de RNA. Per la iniciació és necessari el reconeixement del promotor dels gens a mans de la subunitat σ; el promotor és una seqüència de DNA reguladora localitzada a 5’ del gen i que determina la iniciació de la transcripció. Els promotors contenen seqüències conservades curtes però molt importants per la iniciació de la transcripció. En la seqüència del promotor, en les posicions -35 i -10 respecte l’inici de la transcripció, es troben unes seqüències consens molt comuns als promotors de procariotes. En eucariotes, l’estructura dels promotors són diferents segons el tipus de RNA polimerasa que hagi d’actuar. La RNA polimerasa I s’utilitza per obtenir rRNA, la RNA polimerasa II s’utilitza per obtenir mRNA, i la RNA polimerasa III s’utilitza per obtenir tRNA i petits RNA nuclears i citoplasmàtics. El promotor mínim dels gens de la RNA polimerasa II consisteix en la capsa TATA i l’iniciador. Són els promotors mínims que permeten una transcripció basal; una transcripció eficient i regulada requereix d’altres elements localitzats en les 200 pb a 5’ de l’inici de transcripció. La capsa TATA es localitza aproximadament entre -25 i -30 pb de l’inici de transcripció; és una seqüència consens que es troba en mig d’un context ric en GC, i és reconeguda per la TATA binding protein (TFIID). L’iniciador (Inr) es localitza entre -3 i +5 pb de l’inici de transcripció; és una seqüència consens de PyPy C A PyPy PyPy Py, sent A normalment la primera base del mRNA. En l’inici de la transcripció d’eucariotes es produeix l’acoblament de l’aparell de transcripció basal format per la RNA polimerasa i factors de transcripció general; la TFIID s’uneix a la TATA box, i altres factors de transcripció juntament amb la RNA polimerasa II formen el complex d’iniciació de la transcripció. Quan l’extrem C-terminal de la RNA polimerasa II es fosforila, s’inicia la síntesis de RNA. Un cop iniciada la transcripció degut a l’acoblament, es produeix l’elongació de la cadena de RNA. Els gens eucariotes són, en general, molt més grans que els procariotes perquè tenen introns, per lo que la RNA polimerasa II pot trigar hores en transcriure un gen. Són necessaris factors d’elongació per evitar que la RNA polimerasa II s’aturi o acabi la transcripció abans d’hora. Finalment, es produeix la terminació, que pot produir-se en múltiples llocs localitzats fins i tot a centenars o milers de pb de l’extrem 3’ del gen; el procés de terminació està acoblat amb la poliadenilació. Abans de ser transportat al citoplasma, el RNA heterògen nuclear o transcrit primari ha de ser processat per eliminar els introns i donar-li protecció (addició del CAP en l’extrem 5’ i addició de la cua de poliA en l’extrem 3’). La caputxa en l’extrem 5’ del mRNA està formada per una 7-metil-guanosina, la qual està implicada en l’estabilitat, el transport i la iniciació de la traducció del mRNA; la cua en l’extrem 3’ del mRNA està formada per una poliadenilació que es troba implicada en l’estabilitat del mRNA. Els introns són eliminats mitjançant un procés anomenat splicing en el qual es tallen i s’empalmen els exons; els introns són reconeguts per tenir unes seqüències conservades, com per exemple l’inici per GT i el final per AG... L’splicing es produeix a partir d’un tall en el lloc de tall i l’acoblament en 5’. Després es forma un llaç d’unió de l’extrem 5’ de l’intró (G) amb el

punt de ramificació (A); l’enllaç de G amb A es produeix per transesterificació. Finalment es talla el lloc de tall i es produeix l’acoblament en 3’; i s’uneixen els dos exons. Importància del processament alternatiu en els gens que codifiquen per a les proteïnes làcties (24.2) L’splicing alternatiu té la capacitat de generar proteïnes diferents a partir d’un mateix mRNA primari, el qual és processat de diferents maneres. Aquesta facultat és molt important per poder adaptar-se a les necessitats de l’individu i no haver de tenir gens diferents per totes i cadascuna de les proteïnes necessàries: per exemple, el gen de la calcitonina (format pels exons 1, 2, 3, 4, 5a i 5b) pot donar lloc a la calcitonina que actua sobre la glàndula tiroides o a la CGRP que actua sobre el teixit neural; del gen s’obté un transcrit primari que patirà un processament diferent segons les necessitats. Els exons 1, 2 i 3 del gen es conservaran, tanmateix l’exó 4 s’utilitzarà per obtenir la calcitonina i els exons 5a i 5b s’utilitzaran per obtenir la CGRP, i actuaran com a introns segons convingui. La cua de poli-A també serà diferent segons s’utilitzi un tipus d’exó o l’altre. El codi genètic (25) Colinealitat gen-polipèptid (25.1) A l’any 1964, C. Yanofsky va realitzar la primera evidencia de la relació lineal de la seqüència del gen i de la proteïna. Va demostrar que la posició de diferents mutacions del gen trpA (subunitat A de la triptofan sintetasa) d’E. coli es correlacionava amb la posició de l’aminoàcid alterat en la proteïna. Desxifrat del codi genètic (25.2) El codi genètic està escrit de forma lineal utilitzant les bases del mRNA que deriven de la seqüència complementària del DNA. Cada aminoàcid està determinat per un triplet de nucleòtids anomenats codons; no conté ambigüitats, cada triplet codifica un únic aminoàcid. És degenerat, és a dir, un tipus d’aminoàcid pot ser codificat per més d’un codó. És un codi universal, encara que hi ha algunes excepcions, i no és solapat. El codi genètic està format per 64 codons diferents: 61 d’ells determinen diferents aminoàcids; 1 codó és d’iniciació de la traducció, l’AUG que codifica per Metionina; i 3 codons són de terminació, UAA, UAG i UGA. Universalitat del codi (25.3) El codi genètic és casi universal per virus, bacteris i eucariotes; només hi ha excepcions en els mitocondris, els bacteris micoplasmes i en alguns protozous. Pauta de lectura (25.4) Al 1966, Crick va establir la hipòtesis del trontoll per a la lectura del codi genètic. Va observar una degeneració del codi que es produïa bàsicament en la tercera posició del triplet; així, va postular que els dos primers nucleòtids són els més importants per la unió del tRNA, però que el tercer nucleòtid pot establir ponts d’hidrogen amb altres bases. El trontoll es produeix en l’extrem 3’ del codó i l’extrem 5’ de l’anticodó, seguint unes normes d’aparellament. Permet que un mateix tRNA s’uneixi a diferents codons, fent innecessaris 61 tipus de

tRNA i permetent un estalvi en aquestes molècules. La degeneració del codi fa que el trontoll determini sempre la traducció del mateix aminoàcid. En aquests casos, trobem que la Adenina de la posició 5’ del tRNA pot unir-se únicament al Uracil de la posició 3’ del mRNA; la Citosina del tRNA pot unir-se únicament amb la Guanina del mRNA; la Guanina del tRNA pot unir-se amb la Citosina o l’Uracil del mRNA; l’Uracil del tRNA pot unir-se amb l’Adenina o la Guanina del tRNA; i la Inosina (base modificada que es pot trobar en el tRNA) del tRNA pot unir-se amb l’Adenina, l’Uracil o la Citosina. Traducció (25.5) Les etapes de la traducció són:

· Iniciació: Formació del complex d’iniciació (subunitat petita del ribosoma, mRNA i tRNA) al que s’uneix la subunitat gran del ribosoma. El mecanisme és diferents en procariotes i eucariotes. · Elongació: Síntesis de la cadena polipeptídica segons el codi del mRNA. · Terminació: Al arribar a un codó de terminació (en el quals no hi ha cap tRNA que s’hi uneixi) es separen els components del complex de traducció.

L’inici de la traducció en els procariotes es produeix quan la subunitat petita del ribosoma s’uneix a factors d’iniciació i reconeix la seqüència Shine-Dalgarno (AGGAGG) localitzada uns 10 nucleòtids abans del codó d’inici (AUG). Després s’uneix un tRNA especial d’iniciació que té un aminoàcid modificat, la N-formilmetionina. Finalment s’unirà la subunitat gran del ribosoma. L’inici de la traducció en eucariotes es produeix quan la subunitat petita del ribosoma s’uneix a l’extrem 5’ del mRNA reconeixent la caputxa 7-metilguanosina. Reconeix el codó d’iniciació (AUG) perquè la seqüència del seu voltant està molt conservada, és l’anomenada seqüència de Kozak (ACCAUGG). S’utilitza el codó d’iniciació per a que el tRNAmet incorpori una metionina no modificada. Finalment, la subunitat petita del ribosoma (40 S) migrarà des de la caputxa fins el codó d’inici on provocarà la desnaturalització d’estructures secundàries del mRNA; quan reconegui la seqüència Kozak la subunitat gran del ribosoma (60 S) s’hi unirà i permetrà l’entrada de pèptids units als tRNA. Regulació en procariotes (26) Els procariotes activen i desactiven els gens en funció de les seves necessitats metabòliques. Els gens consten d’un promotor, una regió de DNA reguladora a 5’ d’un gen on s’han d’unir forçosament la RNA polimerasa; d’un operador, una regió de DNA on s’uneixen les proteïnes reguladores (activadores o repressores). Els gens procariotes venen regulats per un control positiu on cal un activador per haver-hi transcripció, un control negatiu on no cal activador per haver-hi transcripció, i proteïnes activadores i repressores. Operons reprimibles i induïbles (26.1) Les proteïnes activadores o repressores de la transcripció canvien de conformació quan se’ls hi uneix un efector. Els elements reguladors en CIS actuen només sobre gens localitzats en la mateixa molècula de DNA; mentre que els elements reguladors en TRANS poden actuar sobre gens localitzats en la mateixa o en diferent molècula de DNA. La seqüència d’unió d’un factor de transcripció en el promotor d’un gen és un element de regulació en CIS; el factor de transcripció (proteïna codificada per un altre gen) és un element TRANS. Al 1961, François Jacob i Jacques Monod varen realitzar el primer estudi de la regulació gènica; aquest va consistir en l’estudi del metabolisme de la lactosa en E. coli i varen establir el model de l’operó. L’operó és un conjunt de gens estructurals contigus que es transcriuen en un únic mRNA i els seus elements reguladors adjacents. L’operó lac té:

· 3 gens estructurals (per lo que és policistrònic):

· Z: És el gen de la β-galactosidasa, una proteïna que escindeix la lactosa per obtenir glucosa i galactosa. · Y: És el gen de la Permeasa, una proteïna que facilita l’entrada de la lactosa en el bacteri. · A: És el gen de la Transacetilasa, una proteïna implicada en l’eliminació de subproductes del metabolisme de la lactosa.

· 2 elements de regulació: · P: Promotor, el lloc d’unió de la RNA polimerasa i inici de la transcripció. · O: Operador, el lloc d’unió del repressor Lac. · I 1 Gen I: Codifica el repressor Lac. Control positiu i negatiu (26.2) En el control positiu cal que una proteïna activadora s’uneixi a la regió operador del DNA per a que es pugui produir la transcripció, ja que per si sola no es produeix. En el control negatiu cal que una proteïna repressora no s’uneixi a la regió operador del DNA per a que es pugui produir la transcripció, ja que per si sola es produeix. Control negatiu induïble (26.2.1) L’operó Lac té un control negatiu induïble constituït pel repressor Lac, el qual s’uneix a l’operador del gen bloquejant la transcripció. Quan hi ha lactosa en el medi (degut a que està en excés i cal escindir-la), aquesta actua com un inductor que s’uneix al repressor i determina un canvi de conformació que li impedeix unir-se al DNA, permetent doncs, que la RNA polimerasa iniciï la transcripció. Anàlisi genètic de l’operó lac (26.2.2) L’anàlisi genètic de l’operó Lac es va basar en l’anàlisi de mutacions en els gens estructurals, en el promotor i en l’operador. Es varen utilitzar inductors anàlegs de la lactosa, els quals s’uneixen al repressor Lac però no es digereixen per la β-galactosidasa. Es van fer estudis de complementació utilitzant factors F’ per obtenir bacteris diploides i heterozigots per mutacions de l’operó Lac. Es va descobrir doncs, que les mutacions en els gens estructurals són recessives. Mutacions en l’operador feien que el repressor no pogués unir-s’hi i determinen que els gens estructurals de l’operó lac s’expressessin de forma constitutiva (amb i sense inductor). Els operador actuen en CIS. També es va descobrir que les mutacions que determinen un repressor no funcional (I-) són constitutives; i que el fenotip induïble (I+) és dominant sobre el constitutiu (I-), per lo que una sola copia del gen I és suficient per regular ambdues còpies de l’operador. El producte del gen (I+) actua en TRANS. Control positiu (26.2.3) En presència de glucosa en el medi, no resulta energèticament eficient utilitzar la lactosa, per lo que existeix un altre sistema de regulació de l’operó lac denominat repressió per catabolit. Encara que no hi hagi repressor unit a l’operador, la transcripció dels gens de l’operó és poc

eficient, per lo que és necessària la unió del complex CAP-cAMP (proteïna activadora per catabolit unida a cAMP) al promotor per estabilitzar la unió de la RNA polimerasa. La presència de glucosa determina una disminució del nivell de cAMP en la cèl·lula, per lo que

no es forma el complex CAP-cAMP en el promotor. Gens reguladors i gens estructurals (26.3) L’operó triptòfan també consta de gens reguladors i gens estructurals. L’operó triptòfan està constituït per 5 gens que participen en la síntesis de triptòfan en E. coli. Al igual que l’operó lactosa, en presència de triptòfan el repressor canvia de conformació i s’uneix a l’operador, reprimint la transcripció. L’operó triptòfan té un altre sistema de regulació anomenat atenuació, en el que la transcripció s’inicia però finalitza prematurament abans d’arribar als gens estructurals. La regió 5’ UTR de l’operó trp (162 nt) conté regions complementaries (1, 2, 3 i 4) que es poden unir formant dues estructures secundàries diferents. Quan el triptòfan està alt la regió 3 s’aparella amb la regió 4, formant una estructura que finalitza la transcripció abans d’hora; quan el triptòfan està baix la regió 2 s’aparella amb la regió 3, formant una estructura que no provoca la precoç terminació de la transcripció. Quan el triptòfan està alt, la RNA polimerasa comença a transcriure el DNA i produeix la regió 1 de la 5’ UTR; un ribosoma s’uneix a l’extrem 5’ de la 5’ UTR i tradueix la regió 1, mentre que la regió 2 s’està transcrivint; la RNA polimerasa transcriu la regió 3 i el ribosoma no s’atura en els codons Trp perquè el triptòfan abunda; el ribosoma cobreix part de la regió 2, lo que impedeix que s’aparelli amb la regió 3. La regió 4 es transcriu i s’aparella amb la regió 3, lo que produeix l’atenuador que finalitza la transcripció. Quan el triptòfan és baix, la RNA polimerasa comença a transcriure el DNA i produeix la regió 1 de la 5’ UTR; un ribosoma s’uneix a l’extrem 5’ de la 5’ UTR i tradueix la regió 1, mentre que la regió 2 s’està transcrivint; el ribosoma s’atura en els codons Trp de la regió 1 perquè el triptòfan està baix, i donat que el ribosoma està aturat, la regió 2 no està coberta per ell quan es transcriu la regió 3. Quan es transcriu la regió 3, s’aparella amb la regió 2; quan la regió 4 es transcriu, no pot aparellar-se amb la regió 3 perquè aquesta ja es troba aparellada amb la regió 2; mai es forma l’atenuador i continua la transcripció. Regulació en eucariotes (27) Components de control gènic: senyals, nivells i mecanismes (27.1) La regulació de l’expressió gènica és més complexa en eucariotes degut a que el DNA està empaquetat amb proteïnes formant la cromatina; la transcripció es produeix en el nucli i la traducció al citoplasma; els transcrits són processats abans de ser transportats al citoplasma; la majoria d’eucariotes són organismes pluricel·lulars amb expressió gènica diferencial en cada tipus cel·lular; el nombre de gens és molt més elevat. L’expressió gènica es troba regulada en molts possibles nivells: a nivell de la transcripció; a nivell del tall, de l’empalme i del processament; a nivell del transport del RNA primari cap al citosol; a nivell de la degradació del mRNA; a nivell de la traducció; i a nivell de la modificació i activitat de la proteïna. Control transcripcional i post-transcripcional (27.2) La transcripció és controlada pels elements CIS i TRANS:

· El control en CIS utilitza promotors, és a dir, seqüències de DNA d’unes 200 pb a 5’ de l’inici de transcripció; el promotor mínim és una regió compresa entre la capsa TATA (-25, -30) i l’inici de transcripció, determinant una transcripció basal; els elements proximals són unes seqüències d’estructura modular localitzades de forma variable entre la capsa TATA i -200 pb (o més lluny), i que determinen una transcripció eficient i regulada del gen. A més, en el control en

CIS actuen elements amb independència de la distància, com els intensificadors (enhancers) o els silenciadors. Els intensificadors i silenciadors poden localitzar-se a 5’ o 3’ del gen, o inclòs a dins seu; poden invertir la seva orientació sense canviar el seu efecte. Al moure’ls a una altra posició del genoma afecten a l’expressió dels gens subjacents. Tenen una estructura modular amb diferents seqüència curtes de DNA i regulen l’expressió gènica específica tisular i temporal. · El control en trans utilitza proteïnes reguladores que s’uneixen a seqüències de reconeixement específiques del DNA. Aquestes proteïnes inclouen factors de transcripció basals o generals que s’uneixen al promotor mínim per iniciar la transcripció i que controlen l’inici de la transcripció; i factors de transcripció (normals) que es poden unir a seqüències del promotor de forma activadora (activadors) o silenciadora (repressors) afectant a la transcripció i controlant el nivell d’expressió i l’especificitat tisular i temporal.

Factors de transcripció dels gens de les Lactoproteïnes (27.2.1) El MGF (Factor de la Glàndula Mamària), MPBF o STAT5 és un factor de transcripció que reconeix una seqüència específica en el promotor dels gens de les proteïnes làcties (TTCNNNGAA). És el responsable de la resposta a la prolactina. El receptor específic de prolactina situat a la membrana plasmàtica permet la unió de la prolactina. Sense prolactina, els STAT5 són monomèrics, desfosforilats, citoplasmàtics i inactius; tanmateix, la unió de prolactina al seu receptor permet la fosforilació i activació de JAK-2, una quinasa de tirosina que fosforila a l’STAT5. Els STAT5 fosforilats formen dímers, migren al nucli i s’uneixen a la seqüència de reconeixement localitzades en els promotors dels gens de les proteïnes làcties, activant la seva transcripció. Promotors (27.2.2) L’organització modular dels promotors eucariotes és diversa. Factors de transcripció (27.2.3) Els factors de transcripció tenen dominis d’unió al DNA amb motius característics. Hi ha diversos motius:

· Hèlix-gir-hèlix: Trobada tant en procariotes com eucariotes, està formada per dos hèlixs α adjacents separades per un gir de varis aminoàcids. Les hèlixs α interaccionen amb el solc major del DNA. · Dits de zinc: Format per un àtom de zinc unit a dos residus de cisteina (C) i dos residus histidina (H) formant un llaç; cada proteïna pot tenir 2-13 dits de zinc. Es troba en molts factors de transcripció i s’uneix al solc major del DNA. · Cremalleres bàsiques de leucina: Formades per un domini d’unió del DNA adjacent a una cremallera de leucina (L), una hèlix amb 4 leucines que permeten la formació d’un dímer amb forma de tisores.

Remodelació de la cromatina (27.2.4) Per a que es produeixi la transcripció d’un gen és necessària una estructura determinada de la cromatina, per lo que es produeixen canvis en la seva organització; és necessari per a que la RNA polimerasa i els activadors puguin unir-se al DNA. La remodelació de la cromatina es troba en mans de la DNasa I, per la qual són sensibles les regions de gens actius, sense nucleosomes o amb DNA unit dèbilment a aquests.

Epigenètica (27.2.5) La epigenètica és la ciència que estudia els canvis heretables en l’expressió gènica que es porten a terme sense canvis en la seqüència del DNA. S’utilitza com a sistema per activar o inactivar gens de forma selectiva. Els mecanisme d’acció epigenètics més típics són:

· Metilació de les citosines: En els vertebrats es produeix una metilació en la C del dinucleòtid 5’-CpG-3’, reduint l’expressió del gen en concret que es trobi metilat. El 60-90% de les seqüències CpG del genoma estan metilades. Els CpG no metilats es troben principalment en les illes CpG trobades en els promotors de molts gens. Es produeix una hipermetilació en els CpG de gens amb imprinting (1%), pseudogens silenciats i repeticions. Els patrons de metilació són específics de teixit. La empremta genòmica (o parental) o imprinting és un mecanisme epigenètic pel qual únicament s’expressa l’al·lel que s’hereta del pare o de la mare. La empremta materna genera la inactivació de l’al·lel matern i permet l’expressió de l’al·lel patern; la empremta paterna genera la inactivació de l’al·lel patern i permet l’expressió de l’al·lel matern. La metilació del DNA està relacionada amb la empremta genòmica perquè es produeix la metilació de l’al·lel inactiu. Es produeix una metilació diferencial durant la formació dels gàmetes masculins i femenins. Un cas conegut d’empremta genòmica és la que pateix el gen IGF2 porcí, el qual té una empremta materna que afecta a la variació fenotípica en massa muscular i gruix del greix dorsal. · Acetilació, fosforilació i metilació de les histones: L’acetilació de les histones està associada amb l’activació de l’expressió gènica. Les acetiltransferases afegeixen grups acetat (CH3CO) en aminoàcid de les cues de les histones, lo que fa disminuir l’atracció entre la proteïna i el DNA, provocant l’obertura de l’estructura de la cromatina. Les cues de les histones dels nucleosomes carregades positivament probablement interactuen amb els fosfats carregats negativament del DNA; l’acetilació de les cues debilita la seva interacció amb el DNA i pot permetre que certs factors de transcripció s’uneixin al DNA.

Regulació post-transcripcional (27.2.6) La transcripció i traducció del DNA es troba modificada en gran quantitat de moments al llarg de la vida del DNA, del RNA...:

· Processament alternatiu del mRNA: Permet generar diferents productes a partir d’un únic gen; és molt freqüent, en humans es dóna en el 30-60% dels seus gens degut a l’splicing alternatiu i la poliadenilació alternativa. · Edició del mRNA: Abans de la traducció el mRNA pot patir o no patir certes modificacions en la seva seqüència nucleotídica. L’edició del RNA es produeix per substitució (on es modifiquen nucleòtids individuals) i per inserció o deleció (on s’afegeixen o s’eliminen nucleòtids); l’edició del RNA és realitzada per complexos de proteïnes, i a vegades intervenen molècules de RNA. Un exemple conegut és l’edició del gen de l’apolipoproteïna B humana, on en l’intestí hi ha un enzim que desamina una C i la converteix en U, generant-se un codó de terminació i una proteïna truncada.

Els mRNA tenen una vida mitja molt variable, des de minuts fins a anys (com el cas dels oòcits), la qual la passen en el citoplasma. El mRNA es degrada per mitjà de diverses ribonucleases; la caputxa 5’, la cua poli-A i les seqüències 5’UTR i 3’UTR del mRNA afecten a la seva estabilitat. Existeixen uns RNA curts de 20-27 nucleòtids de longitud que estan implicats en la degradació del mRNA i la repressió de la seva traducció (en el citoplasma) i en el silenciament gènic per remodelació

de la cromatina (en el nucli). Hi ha dos tipus principals: els microRNA (miRNA) i els RNA d’interferència curts (siRNA); ambdós tipus es diferencien per la seva biogènesis però no per la seva funció:

· miRNA: Deriven de RNA llargs que es pleguen formant una forquilla imperfecta (doble cadena). Són processats per RNases de doble cadena denominades Drosha/Dicer. S’uneixen al complex de proteïnes RISC i s’elimina una de les cadenes per unir-se a una de mRNA en procés de traducció per determinar la repressió de la seva traducció (si hi ha una homologia parcial entre les dues cadenes), la degradació del mRNA (si hi ha una gran homologia entre les dues cadenes) i a vegades la metilació del DNA del gen diana. · siRNA: Deriven de RNA de doble cadena perfectes (virus, transposons de RNA, transcripció de cadenes sentit-antisentit de gens, repeticions invertides...) i són processats per membre de la família Dicer generant múltiples dsRNA curts. S’uneixen al complex proteic RISC i s’elimina una de les dues cadenes per unir-se a RNA diana (actuant en trans o en cis) per realitzar funcions com la defensa cel·lular contra virus degradant el seu RNA, la silenciació dels transposons remodelant la cromatina, la degradació de mRNA...

Genètica del desenvolupament (28) La genètica del desenvolupament estudia la determinació genètica dels processos que donen lloc a la formació d’un organisme adult a partir d’un zigot. En el desenvolupament d’un zigot adult es produeix: · Determinació: moment que queda fixat el destí del desenvolupament d’una cèl·lula. · Diferenciació: moment en que la cèl·lula arriba a la forma i funció final. L’expressió diferencial de gens controla el desenvolupament i diferenciació de cada cèl·lula. Hi ha similitud dels mecanismes de desenvolupament entre animals pluricel·lulars com per exemple els llevats, la mosca de la fruita, els nemàtodes, el peix zebra, el ratolí... Cèl·lules mare (28.1) Les cèl·lules mare (stem cells) són cèl·lules amb capacitat de multiplicar-se per mitosis i de diferenciar-se donant lloc a diferents tipus cel·lulars. Hi ha cèl·lules mare en el embrió i en teixits dels adults amb funció de regeneració d’òrgans i teixits. Segons el seu potencial, és a dir, la seva capacitat de diferenciar-se en diferents tipus cel·lulars, es classifiquen en:

· Cèl·lules totipotents: Potencial de diferenciar-se en qualsevol tipus cel·lular donant lloc a un organisme complet. · Cèl·lules pluripotents: Poden diferenciar-se en casi qualsevol tipus cel·lular. · Cèl·lules multipotents: Poden diferenciar-se en un nombre limitat de tipus cel·lulars de la mateixa família.

Cicle biològic de la Drosophila (28.2) Els nuclis de l’espermatozoide i de l’òvul es fusionen per crear un zigot unicel·lular diploide; múltiples divisions nuclears (però no de citoplasma) creen una cèl·lula multinuclear anomenada sinciti; els nuclis migren cap a la perifèria de l’embrió i es divideixen moltes més vegades (tampoc ho fa el ctiplasma), creant l’anomenat blastoderma sincitial; la membrana cel·lular creix al voltant de cada nucli, produint una capa de cèl·lules que envolten l’embrió i el protegeixen, creant-se

l’anomenat blastoderma cel·lular; els nuclis d’un dels extrems del blastoderma es converteixen en cèl·lules polars, les quals es convertiran en cèl·lules primordials. Seguidament, s’estableixen els eixos anterior-posterior i dorsal-ventral de l’embrió; després s’estableixen el nombre i l’orientació dels segments corporals que equivaldran a una part determinada del cos de la Drosophila després de que s’hagin identificat. Els gens d’efecte matern que envolten l’estructura generen uns gradients anterior-posterior que determinen aquest eix donant-li polaritat; aquest gradient està format per mRNA que actua com a factor de transcripció per totes les cèl·lules de l’embrió, les qual activaran uns gens o uns altres segons la seva posició i el mRNA que li arribi. Els gens de segmentació expressats per mitjà de les pròpies cèl·lules del zigot defineixen en cada zona unes subidivions de segments, que amb l’ajuda dels gens homeòtics (gens Hox) definiran quin tipus i quina funció tindrà cada segment. Aquests gens Hox són es troben en el cromosoma en el mateix ordre que els segments pels quals determinen la seva forma i funció. Són gens molt conservats entre espècies, tanmateix, algunes espècies com els humans els tenim dividits en diferents cromosomes. Polidactília (28.3) Les mutacions en els gens Hox poden produir letalitat si són gens que es requereix una molt temprana expressió, mentre que gens Hox tardans mutats només produeixen malformacions com la polidactília. És un síndrome comú en humans, entre 5 i 17 persones de cada 10.000 nascuts vius la pateixen. Està descrita només en vertebrats com els gats, els pollastres, els ratolins... Està causat per mutacions en el gen Shh, lo que genera rudiments de les extremitats en desenvolupament. Freemartinisme (28.4) El freemartinisme és un fenomen descrit en vaques, ovelles, cabres, porcs... que produeix una femella estèril nascuda amb un mascle bessó. És molt freqüent en boví, es dóna en el 90% de totes les bessonades mascle/femella. És produït per la fusió de placentes i anastomosis dels vasos sanguinis, lo que produeix una fusió entre eritròcits i leucòcits, esterilitat en femelles a causa d’una masculinització variable i mascles normal amb reducció de la seva capacitat reproductiva. Clonació animal (28.5) El desenvolupament està regular per molts factors genètics i epigenètics (metilació del DNA, modificacions de les histones, remodelació dels nucleosomes...). Durant el desenvolupament i la diferenciació, les cèl·lules acumulen modificacions epigenètiques que les diferencien de les cèl·lules mare i de les cèl·lules diferenciades d’altres llinatges. La clonació d’animals és ineficient degut bàsicament a que la majoria d’animals clonats tenen defectes epigenètics. Els animals poden ser clonats per dos mètodes:

· Divisió de l’embrió: Bisecció de l’embrió en temprà estadi de desenvolupament per generar bessons. És utilitzat per generar clons en diferents espècies animals. Als anys 80 es varen realitzar les primeres replicacions importants en animals lleters. El màxim nombre de clons que poden ser produïts en ovelles i vaques és de 4. · Transferència nuclear: El nucli d’una cèl·lula donant es transfereix en un oòcit infèrtil (prèviament anucleat); el nucli ha de ser fusionat amb l’oòcit mitjançant un pols elèctric o un tractament químic. El nucli pot derivar d’un embrió jove o de cèl·lules somàtiques. Va ser utilitzat en mamífers durant el principi dels anys 80 a partir d’un nucli d’un embrió molt jove, del qual es poden obtenir com a molt entre 8 i 32 clons. Nombrosos mamífers han sigut clonats a partir de cèl·lules embrionàries: ratolins, rates, vaques, conills, porcs, cabres, ovelles, monos... Al 1996, la ovella Dolly va ser el primer animal en ser clonat via transcerència nuclear a partir d’una cèl·lula somàtica. La transferència nuclear de cèl·lules somàtiques permet obtenir

potencialment un nombre il·limitats de clons a partir d’un animal adult els trets del qual són perfectament coneguts, per així utilitzar i criar animals d’elit. Nombrosos animals ja han sigut clonats utilitzant la transferència nuclear de cèl·lules somàtiques: vaques, ratolins, porcs, gats, conills, cavalls, gossos, rates, peixos zebra... L’èxit de la clonació depèn molt de la diferenciació de la cèl·lula, ja que cèl·lules poc diferenciades funcionen i donen molts millors resultats que cèl·lules molt diferenciades i antigues; la reprogramació del nucli és més fàcil en cèl·lules embrionàries. Nuclis obtinguts a partir de blàstules aporten un 30% d’èxit en la clonació, mentre que nuclis de cèl·lules adultes només aporten un 3% d’èxit.

Hi ha moltes anomalies severes anomenades “síndromes dels grans recents nascuts” (traducció literal) que es poden observar en animals clonats: · Naixement amb augment de pes per creixement excessiu fetal o una gestació prolongada. · Alts nivells de pèrdues durant tota la gestació · Naixements prenatals · Morts postnatals d’hora · Curta vida útil · Obesitat · Malformacions... Tanmateix, aquests síndromes poden ser associats a altres tecnologies de reproducció assistida comunament utilitzades. Anomalies relaciones amb la transferència nuclear poden ser causades per: · Reprogramació inadequada del genoma donant (metilacions i gens imprinting)

· Sincronització inadequada entre les fases del cicle cel·lular del nucli donant i el recipient citoplasmàtic. · Cèl·lula donadora o oòcit receptor inadequats. · Manejos inadequats d’oòcits, cèl·lules i embrions.

Tanmateix, les anomalies observades en clons no són heretables, per lo que es produeixen gametogènesis totalment correctes; això es dóna perquè aquestes anomalies estan causades per factors epigenètics. Elements gènics mòbils (29) Els elements genètics mòbils o transposons varen ser descoberts als anys 40 per Barbara McClintock (premi Nobel de medicina i fisiologia al 1983) quan estudiava la coloració dels grans de blat de moro mutants. Als anys 60 es van descobrir els primers elements transponibles en E. Coli i posteriorment en el genoma de molts més organismes. Són seqüències de nucleòtids mòbils que poden transposar-se a noves posicions del genoma, tenint la capacitat d’inactivar i impedir l’expressió del gen en el qual s’insereixen. Els transposons Ac són autònoms, és a dir, tenen capacitat de moure’s per si mateixos; els transposons Ds no són autònoms, és a dir, a causa de les mutacions patides requereix de les proteïnes sintetitzades per un transposó Ac per moure’s. Elements transponibles en bacteris (29.1) Els transposons de procariotes estan formats pel gen de la transposasa i les anomenades Seqüències d’Inserció o elements IS. Seqüències d’inserció (29.2) Els transposons codifiquen per l’enzim transposasa, la qual els permet fer la mobilització. Aquests transposons contenen en els seus extrems seqüències repetides invertides i curtes que només codifiquen les proteïnes necessàries per realitzar la seva mobilitat (elements IS); la mida dels elements IS pot variar entre 800 i 2000 parells de bases de longitud. L’acoblament en la regió codificant d’un gen o la utilització de senyals de terminació de la transcripció i de la traducció que conté poden produir la inactivació del gen.

Transposons bacterians (29.3) Hi ha dos tipus de transposons en procariotes:

· Compostos: Contenen els gens entre dos elements IS casi idèntics però en direcció oposada (IR); la transposasa és codificada per un dels elements IS. · Simples: Codifiquen la seva pròpia transposasa i són portadors d’altres gens bacterians que aporten noves funcions a les cèl·lules bacterianes. Aquests es troben flanquejats per seqüències invertides (IR) curtes, de menys de 50 pb.

El mecanisme de transpocició s’inicia quan els gens que es transcriuen per la transposasa s’activen, provocant que l’enzim talli els llocs d’unió o diana d’un altre gen on s’inserirà l’element transponible. Un cop adherit, es recuperen els nucleòtids de les cadenes afectades. La transposició pot ser de dues maneres:

· Replicativa: El transposó produeix una rèplica de ell mateix que serà la que realitzarà el trasllat de cromosomes. · Conservativa: El transposó realitza un trasllat sense deixa cap tipus de rèplica en el lloc on es trobava prèviament.

Elements mòbils en eucariotes (29.4) Els elements mòbils d’eucariotes es divideixen en varis tipus: · Transposons de DNA (classe II):

· Ac: Els transposons Ac són autònoms, és a dir, tenen capacitat de moure’s per si mateixos. Ds: Els transposons Ds no són autònoms, és a dir, a causa de l’excés de mutacions patides requereixen de les proteïnes sintetitzades per un transposó Ac (transposasa) per moure’s. · Elements P (Drosophila): Els elements P són uns fragments mòbils del DNA de les mosques que va entrar (suposadament) fa 50 anys provinents d’una altra espècie i transmès a partir d’un àcar invasor dels ous d’ambdues espècies; s’ha de dir que hi ha molts pocs elements mòbils que es puguin transmetre horitzontalment entre diferents espècies. Es va descobrir arran de creuar mosques de laboratori amb mosques salvatges. L’element P provoca mutacions en determinats gens, tanmateix, les mosques salvatges han desenvolupat un repressor de l’element mòbil que es troba en el citoplasma de les cèl·lules i òbviament en el citoplasma de l’oòcit. Es va comprovar que al creuar mosques mascles de laboratori (P-) amb mosques femelles salvatges (P+), els fills obtinguts heretaven el P+ de la mare, el qual no causava alteracions (infertilitat) degut a que l’oòcit salvatge tenia el repressor; tanmateix, al creuar mosques mascles salvatges (P+) amb mosques femelles de laboratori (P-), els fills obtinguts heretaven el P+ del pare, el qual provocava infertilitat degut a que l’oòcit de laboratori no tenia el repressor contra l’element P.

· Retrotransposons (Classe I): Són un tipus de transposons que sintetitzen l’enzim transcriptasa inversa per transformar el RNA en DNA que s’introduirà en el DNA de doble cadena:

· Amb LTRs (repeticions directes invertides): · Retrovirus: Són repeticions llargues (entre 250 i 1400 pb) i directes produïdes per la inserció de la part cromosòmica. Entre les LTR es conserven 2 o 3 gens diferents que es traduiran per les proteïnes estructurals (gag), les proteïnes polimerases com la transcriptasa inversa o la proteasa (pol), i les proteïnes d’embolcall víric (env). El seu cicle de vida s’inicia quan un virus s’introdueix càpside inclosa en una cèl·lula hoste. Gràcies al gen de la transcriptasa inversa, sintetitza una còpia de DNA a partir del RNA viral quan la càpside es degrada; seguidament la transcriptasa inversa generarà la segona cadena del DNA, obtenint-se un DNA

de doble cadena. La doble cadena viral s’integra en el DNA de la cèl·lula hoste, aconseguint que la part de DNA viral es transcrigui múltiples vegades gràcies a la maquinària de replicació de la cèl·lula. De cada nou mRNA viral es sintetitzaran nous virus. En el DNA humà se’n poden arribar a trobar 450.000 còpies, representant un 8% del genoma humà. · Ty (del llevat), Copia (de Drosophila): Són retrotransposons que no tenen el gen que codifica per les proteïnes d’embolcall víric (env).

· Sense LTRs: · LINEs: Són elements mòbils autònoms dispersos per tot el genoma que poden arribar a mesurar vàries kb de longitud (6 kb en humà). Són capaços de codificar com a mínim una transcriptasa inversa i una nucleasa si són autònoms; alguns són no autònoms degut a una que es poden produir retrotranscripcions incompletes i es troben truncats per la banda 5’. En l’extrem 3’ tenen una cua de poli-A. Produeixen repeticions directes en el lloc d’inserció. En el DNA humà se’n poden arribar a trobar 850.000 còpies, representant un 21% del genoma humà (la família L1 dels LINEs representa un 17 % per si sola). · SINEs: Són elements mòbils no autònoms i petits que poden arribar a mesurar unes 80-500 pb. Estan originats per retrotranscripcions accidentals de varis transcrits de la RNA polimerasa III (productora de tRNA, 7SL RNA i 5S RNA). Únicament sembla que contenen un promotor per la RNA polimerasa III. Produeixen repeticions directes en el lloc d’inserció. En el DNA humà se’n poden arribar a trobar 1.500.000 còpies, representant un 13% del genoma humà.

Quant més complexa sigui un genoma, més quantitat d’elements mòbils s’hi poden trobar. Les transposicions que es produeixen al llarg del genoma poden desencadenar certes conseqüències:

· La inserció d’elements transponibles pot produir mutacions; l’espècie que més ha patit aquesta conseqüència és la Drosophila, en la qual més d’un 50% del genoma està mutat a causa dels elements mòbils (10% en ratolí i 0’3% en humans). · Els elements mòbils també poden produir malalties com l’hemofília, fibrosis quístiques, càncers de mama... · En gossos es troba una família de SINEs específica que deriva del tRNA transportador de Lysina (tRNALys), el qual és molt actiu i genera gran quantitat de polimorfismes en els cromosomes generant diferents al·lels en gens que no en tenien. La seva freqüència és 10-100 cops més elevada que el seu homòleg humà.

· La narcolepsia canina (i humana) és un trastorn de la son que produeix cataplegia (pèrdua de to muscular desencadenada per emocions fortes) i trastorns de la son. És freqüent en Doberman, Labrador Retriever i Dashchund. És una malaltia associada a un dèficit del neurotransmissor hipocretina causat per la inserció d’un SINE en el gen Hcrtr2 que condueix a un mal processament del mRNA en el que es considera com a intró un exó, és a dir, es produeix un splicing erroni. · La miopatia centronuclear canina és una malaltia recessiva descrita en el Labrador, la qual produeix debilitat muscular generalitzada, postures anormals, un caminar maldestre, intolerància a l’exercici... És causada per la inserció d’un SINE en el gen PTPLA que produeix un splicing aberrant del mRNA en el múscul esquelètic, en el qual només un 1% del mRNA es processa correctament. · El color merle en gossos (taques blau grisós o vermellós sobre un fons sòlid de color marró vermellós o negre) està provocat per l’inserció d’un SINE en el gen SILV.

La mutació (30) La successió de mutacions ha sigut el desencadenant de la variabilitat dels éssers vius. Les taxes de mutació normalment són molt petites: de 10-8 en virus i bacteris, de 10-5 o 10-6 en humans, i de 10-4 o 10-5 en ratolins. Tipus de mutació (30.1) Hi ha molts tipus de mutacions:

· La mutació espontània és aquella mutació que es produeix a l’atzar i és natural; la mutació induïda és aquella que els científics indueixen mitjançant substàncies mutagèniques. · La transició es produeix quan hi ha un canvi de purina per purina o primidina per primidina; la transversió es produeix quan hi ha un canvi de purina per primidina o primidina per purina. · La mutació somàtica és aquella es afecta a zones concretes de l’organisme i que es produeix al llarg del desenvolupament i no s’hereta; la mutació germinal és aquella que afecta als gàmetes i per tant, afecta a tot l’organisme en general i s’hereta.

Les mutacions per substitucions de bases, per supressions... que es produeixen poden tenir conseqüències diferents en la regió codificadora:

· Mutació de canvi de sentit: El codó nou codifica un aminoàcid diferent, lo que condueix a un canvi en la seqüència d’aminoàcids de la proteïna. · Mutació sense sentit: El codó nou és un codó de terminació, lo que condueix a una interrupció prematura de la traducció. · Mutació silenciosa: El codó nou codifica pel mateix aminoàcid, lo que condueix a que no hi hagi cap canvi en la seqüència aminoacídica.

Altres classes de variants genètiques estructurals típiques en els mamífers són: · Variació única d’un nucleòtid (SNP) · Variació per inserció o deleció · Substitució en bloc · Variació per inversió · Variació del número de la còpia Un exemple en quant a mutacions ja produïdes al llarg de la evolució és la doble gropa que afecta a races bovines com la Blanc Blau Belga i l’Asturiana i que és causada per una deleció de 11 pb en el gen de la miostatina que provoca una alteració de la pauta de lectura, generant una hiperplasia del múscul esquelètic que es tradueix a un 20% d’increment en la massa muscular; un altre exemple és la mutació que pateix el porc en el intró 3 del gen IGF2 que determina diferències importants en la massa muscular i espessor del seu greix dorsal. Caràcter preadaptatiu de la mutació (30.2) El caràcter preadaptatiu de les mutacions va ser estudiat al 1943 per Luria i Delbrück mitjançant el test de fluctuació en quant a la resistència de E. coli al fag T1. Fins llavors, no es podia afirmar si les mutacions eren adaptatives o aleatòries (preadaptativa). Per a aquest experiment es varen separar dos cultius iguals de bacteris procedents d’una mateixa mostra; un dels cultius es va inocular sencer en 20 plaques que contenien medi agar amb el fag virulent, mentre que de l’altre cultiu es varen fer 20 alíquotes independents i cadascuna es va sembrar en una placa que contenia medi agar amb el fag virulent. Si la mutació fos adaptativa s’esperaria poca fluctuació en el nombre de colònies resistents entre els diferents cultius petits i entre les alíquotes del gran; tanmateix, es varen produir grans fluctuacions

entre els cultius petits i petites diferències entre les alíquotes del gran, lo que indica que realment es produeix una mutació aleatòria. Al 1952, Joshua i Esther Lederberg van realitzar un experiment similar en el que es sembrava un cultiu de bacteris sense antibiòtic i es feia una rèplica en plaques amb antibiòtic, on només sobrevivien aquelles colònies que haguessin patit una mutació de resistència, amb independència d’entrar o no en contacte amb l’antibiòtic. Mutacions espontànies (30.3) Les mutacions espontànies estan produïdes per errors en la replicació i per la modificació de bases. Alguns mecanismes de mutació espontània són:

· Canvis tautomèrics: Els tautòmers són isòmers naturals de bases nucleotídiques que produeixen un aparellament incorrecte de les bases. Hi ha una estranya forma imino de la citosina que s’aparella amb l’adenina; hi ha una estranya forma enòlica de la timina que s’aparella amb la guanina; hi ha una estranya forma imino de l’adenina que s’aparella amb la citosina; i hi ha una estranya forma enòlica de la guanina que s’aparella amb la timina. · Depurinació i desaminació: La depurinació implica la pèrdua d’una base purínica que produirà una transcripció errònia; la desaminació és molt freqüent i implica la pèrdua d’un grup amino en l’adenina o la citosina que pot generar un altre tipus de base diferent (com l’uracil). · Oxidació: La oxidació ve provocada per alguns processos metabòlics normals que generen oxigen reactiu i conseqüentment la modificació de bases i mutacions en la replicació del DNA. · Desplaçament de les cadenes de replicació (Slippage): Durant la replicació de les seqüències molt repetitives (com és el cas dels microsatèl·lits) es pot produir un desplaçament de la cadena motlle o de la nova cadena en la que s’obtindrà un DNA amb més o menys nombre de bases que l’original. Aquest mecanisme és el desencadenant de moltes malalties, per exemple, hi ha més de 20 desordres neurològics en humans causats per repeticions extres de microsatèl·lits. Són mutacions dinàmiques, és a dir, s’hereten i augmenten de generació en generació de forma clarament visible, lo que provoca que les malalties s’anticipin en el temps o es facin més greus amb la successió de descendents. Les variacions del triplet CAG és la repetició més comú i la causant de generar glutamines extres en les proteïnes i conseqüentment defectes neurodegeneratius associats a agregats proteics neuronals. Quan el nombre de repeticions supera determinat llindar es produeixen les malalties i els defectes. Una mutació molt típica en humans que produeix retràs mental és anomenada síndrome de l’X fràgil. Està causada per una metilació que indueix un silenciament transcripcional (reducció de l’expressió gènica) del gen FMR1. Aquest silenciament apareix quan es produeix una expansió de repeticions CGG en el 5’UTR a causa del Slippage. La repetició normal de CGG és de 6-60 vegades, però quan CGG es repeteix entre 60 i 200 vegades es produeixen transmissions inestables del gen amb propensió a l’expansió; tanmateix, no és fins que CGG supera les 200 repeticions que no es permet la metilació del cromosoma i conseqüentment el bloqueig de la transcripció. L’epilèpsia mioclònica canina és una forma poc freqüent d’epilèpsia (malaltia de Lafora en humà) que afecta al 5% dels individus i que es presenta com a convulsions i salivació sense pèrdua de consciència; és freqüent en la raça Dachshund (salsitxa). Ve determinada per l’expansió d’un motiu (D) de dotze nucleòtids en el únic exó del gen Epm2b. Normalment, els animals sans presenten com a molt 2 còpies i una similar al motiu, mentre que els animals afectats presenten una expansió de 19-26 còpies del motiu D, lo que produeix una reducció dràstica en l’expressió del gen.

Mutacions induïdes per agents químics i per radiacions (30.4) Els mutàgens són els agents químics que són capaços d’induir mutacions. Alguns mecanismes típics productors de mutacions induïdes són:

· Anàlegs de bases: Són compostos químics semblants a les bases nitrogenades amb capacitat d’incorporar-se en el DNA. Tenen propietats d’aparellament diferents i poden provocar mutacions durant la replicació. Uns exemples són el 5-bromouracil que actua com a anàleg de la timina, i la 2-amino-purina que actua com a anàleg de la Adenina. · Agents alquilants: Són mutàgens que alteren les bases provocant un aparellament erroni de les mateixes. Afegeixen grups alquil (com grups metil o etil) a les bases. Uns exemples són el Metanosulfat d’etil, la Nitrosoguanidina o el gas mostassa. · Agents intercalants: Són molècules planes de mida similar a un nucleòtid i que s’intercalen entre les bases de la doble hèlix. Al intercalar-se poden produir la inserció o la deleció d’un nucleòtid. Uns exemples són la Proflavina, el Taronja d’Acridina, el Bromur d’Etidi i la Dioxina. · Radiació: La llum amb una longitud d’ona més curta que la visible, és a dir, la llum ultraviolada, els raigs X i els raigs γ actuen com a mutàgens. La radiació ultraviolada forma dímers de timina que distorsionen la doble hèlix i poden inhibir la replicació; la radiació ionitzant (X i γ) penetra en les cèl·lules produint radicals lliures i ions reactius que poden afectar de forma directa o indirecta el DNA produint mutacions.

Test de Ames (30.5) El test d’Ames és un experiment utilitzat per testar la capacitat mutagènica dels productes químics ambientals (com l’Aflatoxina B1). S’utilitzen els bacteris d’una soca bacteriana amb una mutació coneguda (Histidina negatiu, lo qual no li permet viure en medis sense histidina) i es posa en contacte amb el possible agent mutàgen i enzims de fetge de rata; l’efecte mutagen del producte es veurà quan els bacteris sobrevisquin en un medi sense histidina, per lo qual es dedueix que el producte ha causat una reversió de la mutació bacteriana. Quant més mutàgen hi hagi en l’ambient, més reversions es produiran. Tanmateix, no tots els mutagens actuen de la mateixa manera sobre els bacteris, sinó que cada mutagen actua de forma diferents segons l’espècie bacteriana. Variacions cromosòmiques estructurals en espècies domèstiques (31) Mutacions cromosòmiques (31.1) Les mutacions cromosòmiques són alteracions a gran escala de l’estructura dels cromosomes o del nombre de cromosomes d’una cèl·lula. La majoria produeixen letalitat o efectes importants sobre el fenotip. Canvis en l’estructura dels cromosomes (31.2) En el genoma es poden donar duplicacions, delecions, inversions, translocacions... que poden alterar l’equilibri gènic. Per a que els reordenaments cromosòmics es transmetin a la descendència han de segregar-se correctament durant la meiosis. Els reordenaments cromosòmics poden ser causats per trencaments del cromosoma i unió dels extrems pels sistemes re reparació, o per recombinació entre regions duplicades del genoma o elements repetitius. · Deleció: Consisteix en la desaparició i pèrdua d’un element del DNA.

· Trencament i unió:

· Recombinació: Les delecions poden produir pseudodominància d’al·lels recessius que s’expressen en individus heterozigots a causa de la pèrdua dels al·lels dominants. Un exemple de malaltia causada per deleció és la Displàsia ectodèrmica anhidròtica bovina; els individus afectats presenten hipotricosis (deficiència en el creixement del pèl), reducció en el nombre de glàndules sudoríferes i dentició incompleta. En l’home i el ratolí està causada per mutacions en el gen ED1, el qual està implicat en la formació de fol·licles del pèl i dels dents. En boví es troba causat per una deleció d’un fragment del gen ED1.

· Duplicació: Consisteix en l’acoblament d’un tros del DNA del cromosoma homòleg mentre que ell pateix una deleció.

· Trencament i unió:

· Recombinació: En les delecions i duplicacions es pot observar al microscopi la formació d’un bucle d’inversió en els cromosomes meiòtics en la metafase d’individus heterozigots. Aquest bucle no es pot aparellar. Les duplicacions poden produir canvis fenotípics, redundància gènica (factor que afavoreix el manteniment de gens essencials), i famílies gèniques.

· Les duplicacions segmentals són un tipus de duplicacions que pateixen els segments del DNA amb un 90% de similitud nucleotídica que es troben duplicats en el genoma i que es poden trobar disperses en el genoma o estar en tàndem. Representen un 5% del genoma, i són el substrat de la recombinació homòloga no al·lèlica (NAHR), donant lloc a polimorfismes estructurals. En el genoma boví es poden trobar 94’4 Mb (3’1%) de duplicacions segmentals.

· Variacions en el nombre de còpies (CNV): Són un tipus de reordenaments cromosòmics que pateixen fragments de DNA que presenten un nombre variable de còpies en comparació amb la seqüència de referència del genoma; poden ser donades delecions, insercions, duplicacions i variacions complexes. Al 2006, Redon et al va publicar el primer mapa de CNVs del genoma humà i hi va identificar 1.477 CNVs que equivalen a unes 360 Mb (12% del genoma), tanmateix, actualment s’estima que els CNVs representen únicament el 5% del genoma. Els CNVs contenen centenars de gens, loci que determinen malalties i elements funcionals; els CNVs poden influenciar l’expressió gènica i la variació fenotípica mitjançant la disrupció de gens o alterant la dosis gènica. Per mesurar aquestes variacions en el nombre de cromosomes s’utilitza un mètode en el que es talla el genoma en milers de seqüències i es distribueixen al llarg de l’aparell anomenat array, on es poden mesurar les fluorescències de dos cromosomes diferents (el que es testa i el DNA de referència) i comparar-les per esbrinar en quines situacions es troben delecions o duplicacions que facin variar el nombre de còpies. El gen KIT del porcí és un gen que sol patir duplicacions i generar al·lels diferents segons el seu nombre de còpies i conseqüentment aconseguir uns fenotips diferents segons la combinació dels al·lels. L’al·lel G produeix un porc de coloració tipus salvatge o de coloració roà amb cinturó, l’al·lel G duplicat produeix un porc amb taques, i els al·lels G-A, G-G-A i G-A-A produeixen un porc de coloració blanca dominant. Les races canines Rhodesian i Thai Ridgeback pateixen una mutació dominant que produeix una cresta dorsal de pèl. Aquesta mutació els predisposa a desenvolupar el desordre anomenat sinus dermoid caní. Aquest fenotip està associat a una duplicació de 133 kb que inclou els gens FGF3, FGF4, FGF19, ORAOV1 i el final 3’ del CCND1; la duplicació pot actuar com una mutació reguladora generant la interrupció de seqüències codificants en relació amb importants elements reguladors.

· Inversió: Consisteix en l’aparició d’un segment determinat en l’ordre de nucleòtids invers.

· Trencament i unió:

· Recombinació: No hi ha pèrdua de d’informació genètica, per lo que els individus afectats són normalment viables. La inversió pot produir la interrupció d’un gen. En la meiosis d’un heterozigot es produeix un bucle d’inversió per cada inversió. Hi ha dos tipus d’inversions:

· Inversió pericèntrica: El centròmer està inclòs en la inversió. Si en un heterozigot (ABCD i ACBD), per a una inversió paracèntrica es produeix un entrecreuament en la inversió, es produeixen gàmets amb duplicacions i delecions (en els cromosomes recombinants dels quals s’obté ABCA i DBCD) que no poden donar lloc a zigots viables. · Inversió paracèntrica: El centròmer no forma part de la inversió. En una inversió paracèntrica, l’entrecreuament dins de la inversió en la meiosis d’un heterozigot produeix fragments de cromàtides recombinants dicèntrics (2 centròmers) i acèntrics (sense centròmer); el fragment acèntric desapareixerà mentre que els cromosomes dicèntrics es partiran i produiran cromosomes no equilibrats els zigots dels quals no són viables.

· Translocació: Consisteix en l’intercanvi de material genètic entre dos cromosomes no homòlegs.

· Trencament i unió:

· Recombinació: En un heterozigot per a una translocació recíproca, els cromosomes en la meiosis s’aparellen en forma de creu i poden segregar de dues formes: de forma Adjacent on s’obtenen els 4 cromosomes amb delecions o duplicacions (no viables), o de forma Alternada on s’obtenen 2 cromosomes amb translocació recíproca (no viables) i 2 cromosomes normal (únics viables).

La translocació Robertsoniana o Fusió cèntrica està produïda per un trencament dels braços curts de dos cromosomes acrocèntrics no homòlegs, els quals es perden; tanmateix, els braços grans es fusionen pels centròmers i es produeix un cromosoma metacèntric o submetacèntric. Són la reordenació cromosòmica més freqüent en l’home. La translocació Robertsoniana t(1:29) és la reordenació cromosòmica més estesa en diferents races bovines; la seva freqüència pot ser de fins a un 20-25% en algunes poblacions. Determina una reducció de la fertilitat en un 5-10% dels casos. S’han descrit un gran nombre de reordenacions cromosòmiques en porcí amb una prevalença d’un 0’47% aproximadament; translocacions recíproques, translocacions Robertsonianes i inversions són les més freqüents. Les translocacions recíproques redueixen la prolificitat generant una elevada mortalitat embrionària.

Més del 20% de totes les variacions genètiques humanes estan produïdes per variacions estructurals, i més del 70% de les variacions de les bases estan produïdes per variacions estructurals. Cadascuna de les variants estructurals constitueixen entre 9 i 25 Mg del genoma, és a dir, un 0’5-1%.

Reordenacions cromosòmiques i càncer (31.2.1) Alguns tumors estan associats a reordenacions cromosòmiques com és l’exemple del limfoma de Burkitt i la leucèmia mieloide crònica. El primer està format per la unió entre el promotor d’un gen A i la zona codificant d’un gen B, la qual cosa provoca una alteració en l’expressió del gen B que genera limfomes i leucèmies. El segon està format per la unió entre la zona codificant del gen A i del gen B, la qual cosa provoca l’expressió de proteïnes híbrides. Variacions cromosòmiques numèriques espècies domèstiques (32) Hi ha molts tipus de variacions cromosòmiques que afecten al nombre general o concret de cromosomes:

· Euploidia: Es produeix quan es troben canvis en el nombre de dotacions completes de cromosomes, és a dir, tots i cadascun dels cromosomes tenen una variació numèrica. Els organismes que presenten múltiples de la dotació cromosòmica bàsica de l’espècie són euploids.

· Nuliploidia (0n): Cèl·lules sense dotació cromosòmica. Exemples d’aquest tipus són els eritròcits de mamífers, els queratinòcits... · Monoploidia (n): Individus amb una sola dotació de cromosomes en una espècie diploide; és un concepte diferent al d’espècies i cèl·lules haploides. Un exemple de monoploidia són els mascles d’abelles, vespes i formigues desenvolupades per partenogènesis (desenvolupament d’un gàmeta no fecundat) i que produeixen gamets per mitosis. En la resta d’espècies, normalment els zigots monoploids no es desenvolupen i si arriben a adult són estèrils degut a que les cèl·lules germinals no poden realitzar una meiosis normal. · Diploidia (2n): Individus amb dos dotacions de cromosomes. · Poliploidia (o autopoliploidia): Individus amb més de dos dotacions cromosòmiques que provenen de la mateixa espècie: Triploidia (3n), tetraploidia (4n), pentaploidia (5n)... Un exemple de cèl·lules tetraploides sóm algunes cèl·lules hepàtiques humanes, les quals es formen per nuclis 2n que no es separen durant la mitosis; i uns exemples de cèl·lules poliploids múltiples són els megacariòcits, els mioblasts... La poliploidia s’ha descrit en peixos, rèptils, amfibis i plantes; en peixos es pot induir la poliploidia mitjançant un shock tèrmic. En plantes existeixen varietats modificades genèticament per ser (auto)triploids, les quals són estèrils degut a que es produeixen gamets desequilibrats (1 trivalent o 1 bivalent i 1 univalent) per tenir dotacions cromosòmiques molt heterogènies, per la qual cosa no tenen llavors; exemples són les patates del gènere Solanum, pomes, bananes comercials (3n = 33), síndries sense llavors... També existeixen varietats (auto)tetraploids, la majoria de les quals són fèrtils degut a que es produeixen gamets equilibrats (2 bivalents o 1 quadrivalent), i es comercialitzen per tenir una mida superior; exemples són l’alfals, la poma McIntosh, les patates (hi ha fins i tot pentaploides)... I a més, existeixen varietats octaploids com el maduixot.

· Anfidiploidia (o alopoliploidia): Individus amb més de dos dotacions cromosòmiques que provenen de diferents espècies. En l’alopoliploidia es creen híbrid estèrils degut a que els cromosomes dels progenitors de diferents espècies són incapaços d’aparellar-se. Només es poden obtenir gamets viables si es dupliquen els cromosomes de les cèl·lules progenitores. Al 1928, G. Karpechenko va crear un híbrid fèrtil del rave (2n = 18) i de la col (2n = 18) a partir de la duplicació espontània que va patir l’híbrid estèril (2n = 9 + 9 � 2n = 18 + 18). Tanmateix, en plantes es poden trobar alopoliploidies naturals com és el cas del blat (6n = 42), del cotó (4n), del café (4n) i dels cacauets (4n); aquesta alopoliploidia es va generar quan es van fusionar (segles enrere) els genomes de plantes diferents. També es poden trobar alopoliploides artificials com és el cas del triticale (2n = 56), un híbrid anfidiploid derivat del blat (6n = 42) i de la civada (2n = 14).

· Aneuploidia: Es produeix quan es troben canvis en el nombre d’un (o més, però no tots) cromosoma determinat, és a dir, un cromosoma (o més, però no tots) que pateix una variació numèrica mentre que la resta es mantenen constants. Solen ser letals si afecten als autosomes.

· Monosomia (2n – 1): Implica la pèrdua d’un cromosoma. Normalment els animals monosòmics no són viables. Un exemple viable és el Síndrome de Turner en el que falta un dels cromosomes sexuals (X0), generant una femella estèril. · Trisomia (2n + 1): Implica l’addició d’un cromosoma. Normalment els animals no són viables o presenten anomalies. Un exemple viable és el Síndrome de Klinefelter en el que sobra un cromosoma sexual X (XXY), generant un mascle estèril; un altre exemple molt conegut és el Síndrome de Down en el que hi ha una trisomia en el cromosoma 21(47, +21), el qual el pateixen el 0’15% dels nascuts vius. En bovins s’han descrit diverses malalties produïdes per trisomies de cromosomes sexuals, ja que les aneuploidies en autosomes són letals. S’han descrit el Síndrome de Turner (vaca X0 estèril), el Síndrome de Klinefelter (toro XXY amb 61 cromosomes i estèril), i el cas de vaques XXX (amb 61 cromosomes i fèrtil) en el que produeix mascles amb síndrome de Klinefelter i femelles normals. · Tetrasomia, pentasomia... (2n + 2, 2n + 3...)

Les aneuploidies es produeixen per una no separació dels cromosomes durant la primera divisió meiòtica o la segona. La majoria de les aneuploidies es produeixen per errors en la primera divisió meiòtica materna i estan corelacionades amb l’edat de la mare.

Uns altres fenòmens relacionats amb una variació en el nombre de cromosomes són:

· Mosaic: Individu compost per cèl·lules de diferent genotip o constitució cromosòmica, totes derivades del mateix zigot. És a dir, alguna de les cèl·lules d’un zigot pateix una mutació que li genera un canvi de fenotip, el qual s’hereta en la resta de cèl·lules que descendeixen d’ella; el fenomen del mosaic serà més marcat quant abans es produeixi la mutació de la cèl·lula en el zigot. En les femelles de mamífer es produeix el fenomen del mosaic degut a la inactivació d’un dels cromosomes X (a l’atzar) de les cèl·lules. · Quimera: Individu compost per diferents tipus cel·lulars que provenen de diferents zigots. És a dir, es produeix la fusió de dos zigots amb genotips diferents. La primera quimera entre espècies va ser creada als Estats Units per la Universitat Davis de Califòrnia al 1985, on van crear la “Geep”, una quimera entre cabra i ovella. · Freemartinisme: Aquest fenomen produeix una femella estèril quan neix juntament amb un mascle bessó. S’ha descrit en vaques, ovelles, cabres, porcs... En boví és molt freqüent, tant que el 90% de les femelles que tenen un mascle bessó pateixen freemartinisme. Està produït per la fusió de les placentes i anastomosis dels vasos sanguinis que genera un intercanvi de cèl·lules i

hormones masculines que afecten a la femella. Es sol produir quimerisme entre eritròcits i leucòcits. Les femelles són estèrils i tenen una masculinització variable en les gònades; els mascles són normals, tanmateix tenen una reducció de la seva capacitat reproductiva a causa de les hormones femenines que li arriben. És un factor limitant en la producció.

Tecnologia del DNA recombinant (33) Enginyeria genètica (33.1) A partir del 1971, l’enginyeria genètica aconsegueix indentificar, aïllar i amplificar un fragment de DNA. Les tècniques utilitzades en l’enginyeria genètica són: · Purificació de DNA

· Digestió amb enzims de restricció: Els enzims de restricció són uns enzims que reconeixen una seqüència específica de nucleòtids, és a dir, la diana de restricció, i tallen el DNA. En bacteris s’han aïllat més de 200 enzims de restricció diferents. Normalment reconeixen seqüències polindrómiques i generen extrems roms o cohesius. · Lligament d’un fragment de restricció amb un vector generant una molècula recombinant: La DNA Lligasa uneix de forma covalent fragments de DNA generant molècules recombinants. La hibridació de dos cromosomes homòlegs de diferents individus permet la formació de molècules de DNA recombinant per emparellament de bases complementàries; les dues cadenes no estan covalentment unides, sinó que deixen espais que hauran de ser segellats per la DNA lligasa unint covalentment les dues cadenes. · Transferència del DNA recombinant a una cèl·lula hoste generant clons: Els vectors de clonació incorporen fragments de DNA i permeten la seva transferència a una cèl·lula hoste per a que es produeixi la seva replicació. Aquesta cèl·lula hoste és un bacteri al qual se li ha realitzat un shock tèrmic per debilitar la paret bacteriana i així facilitar l’entrada del vector amb el DNA recombinant. Aquest vector és un plàsmid amb una zona polylinker on hi ha moltes dianes de reconeixement per varis enzims de restricció que són capaços de tallar-lo per permetre la incorporació (hibridació) del fragment de DNA pendent de copiar un cop aquest s’ha extret del cromosoma d’origen. Aquests plàsmids amb diferents incorporacions genòmiques es repliquen de forma independent al cromosoma bacterià. Els vectors plasmídics són molt petits i es poden introduir en molècules de DNA major. El seu origen de replicació és autònom, és a dir, produeixen múltiples còpies del plàsmid independentment de la replicació del bacteri. El sistema de selecció de bacteris es basa en els supervivents a un antibiòtic (ampicil·lina), supervivència que ha sigut produïda pel gen de resistència a antibiòtic que hi ha als plàsmids. Per excloure de la selecció els bacteris resistents que han introduït un plàsmid sense el genoma que ens interessa, s’utilitza com a polylinker una zona d’un gen del plàsmid que es tradueix per a lacZ; si hi ha hagut integració en el plàsmid, aquest gen quedarà bloquejat degut a que el tros de genoma integrat ha trencat la pauta de lectura del gen lacZ; en el medi s’utilitza Xgal, substància que és metabolitzada per la proteïna lacZ i que dóna

un color blau a la colònia que consta encara del gen lacZ intacte, mentre que a les altres es distingeixen pel seu color blanc. Vectors de clonació n’hi ha de diversos tipus: · Els plàsmids només són capaços d’integrar trossos genòmics de 10 Kb.

· Els fags són capaços d’integrar trossos genòmics de 20 Kb. La molècula del gen del fag λ està formada per 2 braços exteriors i un grup gènic central que conté els gens necessaris per realitzar una infecció amb un cicle lisogènic. Es realitza un procés on es modifica genèticament el fag, eliminant la regió central per digestió amb un enzim de restricció i inserint i lligant a l’espai entre els dos braços el tros de DNA exogen destinat a ser clonat. Finalment es produeix l’empaquetament in vitro d’un DNA de 48 Kb com a molt, permetent que la partícula vírica recombinant pugui infectar cèl·lules hoste que contindran la inserció exògena clonada, i es replicarà formant calbes. A partir d’aquest procediment es poden realitzar les anomenades genoteques de DNA. Aquestes genoteques estan formades per tot un conjunt de fags que en junts contenen TOT el genoma que interessa clonar. S’aconsegueix mitjançant un procés complex: el genoma en qüestió pateix una digestió parcial on s’aconsegueix una divisió de tot el genoma en fragments de mida aleatòria i solapats gràcies a l’acció dels enzims de restricció Sau3A que tenen com a diana les

seqüències . Tanmateix, els fags es tallen amb l’enzim BamHI que tenen com a diana les seqüències del fag

per a que els trossos genòmics en qüestió siguin compatibles amb aquests; finalment es produeix l’anomenat concatenàmer (unió de tots els fags en una sola molècula dintre del bacteri). A partir de les proteïnes d’empaquetament que es tradueixen dels gens dels braços drets i esquerres es separen els fags del concatenàmer i s’introdueixen en càpsides que s’alliberaran i es multiplicaran envaint molts bacteris formant calbes en les plaques allà on la introducció del fag ha sigut reeixida (exitoso en catalán).

· Els còsmids són capaços d’integrar trossos genòmics de 45 Kb. Són plàsmids amb unes seqüències anomenades cos, les quals es troben en els extrems dels braços dels fags per on es tallen, és a dir, són els finals cohesius que es troben als braços. A partir dels fags es realitza la unió dels fragments del genoma a clonar i s’integren en forma de concatenàmer; finalment es separen els còsmids amb forma de fags recombinants i s’introdueixen en les càpsides que infectaran de forma lisogènica a un bacteri i es replicarà com un plàsmid. Aquests còsmids poden penetrar en la cèl·lula bacteriana mitjançant el mètode de transformació (introducció de plàsmid) o de infecció (introducció de genoma que lisarà la cèl·lula). · Els YAC (Cromosoma Artificial de Llevat) són capaços d’integrar trossos genòmics de fins a 1000 Kb. Són plàsmids amb zones de cromosomes derivats del llevat: el centròmer, els 2 telòmers i l’origen de replicació. S’introdueix el tros de DNA genòmic en el YAC; aquesta molècula recombinant s’integra en un llevat el qual la replicarà com un cromosoma més. Els problemes que té aquest mètode és la dificultat de treballar amb llevats, la dificultat de purificar el YAC... · Els BAC (Cromosoma Artificial de Bacteri) són capaços d’integrar trossos genòmics de 300 Kb. Són derivats del factor F de fertilitat del bacteri E. coli modificats per tenir la capacitat d’introduir el gen determinat a clonar. · Els PAC (Cromosoma Artificial basat en el Fag P1) són capaços d’integrar trossos genòmics de 300 Kb.

· Purificació i anàlisis del DNA recombinant · Transcripció i traducció del DNA recombinant

Genoteques (33.2) Les genoteques són un conjunt de clons que contenen totes les molècules de DNA d’un genoma complet en un vector de clonació. Hi ha dos tipus de genoteques, la genoteca de DNA genòmic (explicada anteriorment) i la genoteca de cDNA. La genoteca de cDNA s’utilitza per realitzar un recompte de la quantitat de gens actius que hi ha en una cèl·lula concreta. Per realitzar-los s’ha de lisar una cèl·lula d’un teixit o òrgan específic que es trobi en estadi de desenvolupament, després realitzar l’extracció de tot el RNA i finalment purificar-lo per separar el mRNA de tot el conjunt de RNA. El mRNA aïllat ha de passar per un procés de transcripció inversa a partir d’una DNA polimerasa que reconeix la seqüència poli-A del mRNA, obtenint-se un mRNA/cDNA heterodúplex; després ha de destruir-se el mRNA i replicar el cDNA que queda mitjançant una DNA polimerasa. Finalment s’afegeixen a les bandes del cDNA uns adaptadors amb dianes per enzims de restricció EcoRI que provocaran que la seqüència es trenqui amb extrems cohesius, fet que facilita el lligament al vector (fag) i la posterior clonació de la seqüència. Per poder seleccionar els clons adequats, a partir de la genoteca de clons de fag es realitza un cultiu confluent de bacteris on es trobaran calbes creades per un clon del fag. Aquestes calbes es transfereixen a una membrana absorbent que s’incubarà amb una sonda radioactiva. A partir d’aquesta

membrana es realitzarà una autoradiografia per localitzar el clon desitjat; un cop localitzat s’infecta amb ell un nou hoste bacterià i s’amplifica el gen desitjat. Aplicacions de l’enginyeria genètica a veterinària (34) Detecció de malalties hereditàries (34.1) L’enginyeria genètica es pot utilitzar per detectar individus portadors de malalties hereditàries, per detectar de forma aviat els homozigots, i per realitzar un diagnòstic prenatal. El diagnòstic prenatal es pot realitzar per amniocentesis o per una biòpsia de corion. L’amniocentesis consisteix en l’aspiració de líquid amniòtic per recuperar i analitzar cèl·lules fetals; la biòpsia de corion consisteix en la recollida de cèl·lules de la placenta. Amb aquestes proves es poden realitzar anàlisis químics, anàlisis del DNA i anàlisis cromosòmics. Producció de proteïnes recombinants (34.2) Al 1982 es va aconseguir sintetitzar insulina humana en bacteris; va ser el primer producte recombinant autoritzat per a ús terapèutic. La insulina funcional és una hormona composta per dues subunitats enllaçades (a i b), les quals s’obtenen després de realitzar modificacions de la proinsulina. Per sintetitzar insulina recombinant humana, els oligonucleòtids sintètics que codifiquen les cadenes A i B de la insulina s’insereixen en l’extrem del gen lacZ clonat d’E. coli. Els plàsmids recombinants es transfereixen a hostes d’E. coli en els que es sintetitza i s’acumula la proteïna de fusió β-gal/insulina. Les proteïnes de fusió s’extreuen de les cèl·lules hoste i es purifiquen. Les cadenes d’insulina s’alliberen de la β-galactosidasa mitjançant un tractament amb bromur de cianògen. Es purifiquen les subunitats de la insulina i es barregen per produir molècules funcionals d’insulina. Moltes altres proteïnes ja han sigut clonades utilitzant aquest sistema de bacteris per utilitzar-se com a tractaments terapèutics (interferons, hormona de creixement, IL-2...). La transfecció és el sistema utilitzat per produir proteïnes recombinants a partir de cèl·lules de mamífer. Al 1987 es va crear el primer producte d’ús terapèutic produït per aquest sistema, l’activador plasminògen tisular. La transfecció es pot utilitzar a través de diferents mètodes com la utilització de liposomes on vesícules lipídiques artificials contenen DNA, la utilització de fosfat càlcic que co-precipita juntament amb el DNA sobre la superfície cel·lular, la utilització d’electroforació on es realitza un shock elèctric que canvia la polarització de la membrana cel·lular... Els avantatges que presenta l’ús de cèl·lules eucariotes en la producció de proteïnes recombinants són la capacitat d’aquestes per plegar-se correctament i ser solubles, i la capacitat de les cèl·lules per realitzar modificacions posttraduccionals de les proteïnes de forma senzilla. Animals transgènics (34.3) Els animals transgènics són aquells animals amb un genoma modificat degut a la introducció d’un transgen (seqüència de DNA exògena manipulada, de la mateixa o de diferent espècie) o per deleció d’un fragment de DNA propi. La cronologia dels animals tran sgènics mostra com va evolucionar el procés des del 1980 fins al 1997. Al 1980 es varen crear els primers ratolins transgènics produïts per microinjecció. Al 1982 es varen crear ratolins transgènics per la hormona de creixement, mostrant un major creixement. Al 1985 es varen produir ovelles, porcs i conills transgènics per microinjecció. Al 1986 es varen crear ratolins transgènics obtinguts de cèl·lules embrionàries totipotents. Al 1987 es varen crear els primers ratolins transgènics que expressaven una proteïna terapèutica en la llet. Al 1988 es va crear la primera ovella transgènica utilitzant la glàndula mamària com a biorreactor. Al

1997 es varen obtenir ovelles per transferència nuclear de cèl·lules somàtiques d’un adult (Dolly). Les tècniques per realitzar una transferència de gens són vàries:

· Microinjecció: Consisteix en la injecció d’una solució amb moltes còpies d’un gen en un dels 2 pronuclis que es troben en el zigot just abans de fusionar-se; aquesta operació es realitza en molts zigots. Els gens introduïts s’integren en una part del genoma aleatòriament en forma de concatenàmer (tàndem del mateix gen) i es cultiva el zigot per comprovar la seva viabilitat; si el zigot sobreviu s’implanta en una femella receptora (prèviament tractada per aquest fet). Les cries nascudes hauran integrat el gen i se les considera com animals transgènics. L’eficiència d’aquest procés és del 20-30% en ratolins, però únicament del 1-4% en espècies domèstiques com l’ovella i la vaca. · Cèl·lules embrionàries totipotents: Consisteix en la captació i el cultiu de cèl·lules totipotents d’un embrió en etapa de blastocist; aquestes cèl·lules són fàcils de modificar genèticament, i efectivament es modifiquen inserint un transgen en una localització escollida voluntàriament (no hi ha atzar). Aquestes cèl·lules transgèniques s’incorporen en un altre embrió en fase de blastocist generant un embrió quimera que es desenvoluparà i naixerà com a individu quimera i transgènic. · “Gene targeting”: És una tècnica basada en una recombinació homòloga que permet inactivar o introduir mutacions en un gen d’una cèl·lula in vitro; és una tècnica amb una baixa freqüència d’èxit ja que la integració del transgen per recombinació homòloga és dificultosa. Quan mitjançant aquest procés (o altres) s’inactiven per enginyeria genètica un o més gens d’un ratolí s’obté l’anomenat ratolí knock-out; aquesta tècnica permet investigar la utilitat dels gens i comprovar la seva utilitat en els animals. La integració d’un gen requereix de la recombinació simple o doble entre els dos trossos genòmics, un dels quals (transgen) integra un marcador que permet comprovar l’èxit de la recombinació. El “Conditional gene targeting” permet controlar el precís moment en el que es procedeix a inactivar el gen on s’introdueix el transgen degut a que el gen en qüestió és imprescindible per la viabilitat de l’individu en determinats moments de la seva vida. Per a aquest fi s’utilitza el sistema de recombinació Cre-loxP, un sistema de recombinació específica derivat del fag P1; la recombinasa Cre (induïda per un promotor fàcilment activable mitjançant un fàrmac) produeix la recombinació entre 2 seqüències loxP (de 34 pb) en la mateixa orientació. Permet produir knock-outs específics per a un teixit o tipus cel·lular. Es creuen dos ratolins, un ratolí amb un cromosoma A determinat flanquejat per les seqüències loxP i un ratolí transgènic amb el gen Cre lligat a un promotor específic fàcilment activable; a la descendència del creuament, que serà portadora d’ambdós gens, se li aplicarà un fàrmac que permet l’expressió de Cre i la conseqüent deleció del gen A. · Vectors vírics: retrovirus, adenovirus i lentivirus · Transfecció d’espermatozoides + Injecció espermàtica intracitoplasmàtica · Transferència de nuclis: Clonació animal: Consisteix en la selecció de cèl·lules (fibroblasts) que han integrat prèviament un transgen i la introducció dels seus nuclis en oòcits anucleats; procés a partir del qual s’obtenen clons transgènics.

Les aplicacions dels animals transgènics en espècies domèstiques són: · Millora genètica de caràcters productius: augment del pes de la canal... · Reducció de la contaminació ambiental: disminució de la producció de fosfats ens purins... · Resistència a malalties

· Model animal per malalties humanes: obtenció d’animals que pateixen malalties exactes a les dels humans... · Producció d’òrgans per trasplantaments: obtenció de cors de porc útils pels humans... · Síntesis de proteïnes industrials · Síntesis de productes terapèutics

La glàndula mamària dels animals transgènics s’utilitza com a bioreactor, és a dir, com a gran productor de proteïnes. Per a això s’introdueix el gen de la proteïna en qüestió que es vol sintetitzar a davant del promotor de la β-lactoglobulina, una proteïna que es sintetitza en grans quantitats durant la lactació i que es troba en la llet. Un cop obtinguda la llet amb la proteïna en qüestió es separa de la llet i s’utilitza. Els avantatges de la glàndula mamària d’animals transgènics com a bioreactor són: · Elevada síntesis proteica i gran volum de llet secretada · Gran capacitat per realitzar modificacions post-traduccionals · Fàcil recol·lecció de la llet · Fàcil purificació de la proteïna recombinant · Risc reduït d’afectar a la salut de l’animal degut a que la llet és una secreció exocrina. D’igual manera s’utilitzen com a bioreactors de proteïnes recombinants els ous, ja que contenen de 3’5 a 4 grams de proteïnes en la clara d’ou, més de la meitat produïda pel promotor d’un únic gen, el gen de l’ovalbúmina. Aquest sistema té certs avantatges com són la secreció de l’ou a fora de l’animal, la capacitat de realitzar modificacions post-traduccionals de les proteïnes (glucosilació), la fàcil recombinació de la proteïna recombinant; tanmateix, l’obtenció de gallines transgèniques és difícil i amb baixa eficiència. A partir dels ous s’estan obtenint productes terapèutics en fase de proves clíniques com el col·lagen tipus II d’humà útil per tractar l’artritis reumatoide. Unes de les proteïnes típiques produïdes per la llet d’animals són el fibrinogen, l’antigen de la malària, l’albúmina... El primer producte d’aquest tipus que va sortir al mercat va provenir de la llet de cabres transgèniques. Sistemes per la producció de proteïnes recombinants (34.4) Per obtenir proteïnes recombinants es poden utilitzar bacteris, llevats, fongs, cèl·lules de mamífer, plantes o animals, cadascun dels quals té certs avantatges i certs inconvenients:

· Per la velocitat de producció la utilització d’animals és nefasta, mentre que la utilització de bacteris proporciona la màxima velocitat. · Pel cost / g que suposa la producció la utilització de cèl·lules de mamífers és nefast, mentre que la utilització de plantes proporciona el millor cost / g. · Per les modificacions post-transcripcionals la utilització de bacteris és nefasta, mentre que la utilització de cèl·lules de mamífer proporciona les millors modificacions post-traduccionals. · Per l’estabilitat (nombre d’éssers transgènics que s’obtenen generació rere generació) la utilització de cèl·lules de mamífer és nefasta, mentre que la utilització de plantes proporciona la millor estabilitat. · Per la regulació (èxit per treure el producte al mercat) la utilització d’animals és nefasta, mentre que la utilització de cèl·lules de mamífers proporciona els menors problemes de regulació.

Teràpia gènica (34.5) La teràpia gènica consisteix en la modificació genètica de les cèl·lules d’un pacient per tractar una malaltia. Hi ha dues estratègies per realitzar-la: In vivo consisteix en la introducció de DNA en les persones a través d’un virus, lo que provoca el risc de patir una malaltia generada pel virus; ex vivo consisteix en l’extracció de cèl·lules del pacient i transferir en elles un gen que permeti el tractament de les cèl·lules, la seva curació i la posterior amplificació d’aquestes cèl·lules transgèniques per ser reintroduïdes en el cos del pacient. En gossos amb una mutació en el gen RPE65 (lo que causa ceguesa) se’ls hi va poder restaurar la vista per teràpia gènica a través de la injecció en la subretina d’un adenovirus portador del gen RPE65 normal.