PRUEBAS BIOQUIMICAS

PRUEBA SIM (SULFURO INDOL MOTILIDAD)

VOGES-PROSKAUER

Positivo negativo

PRUEBA DE LA REDUCCIÓN DE NITRATOS CATALASA

PRUEBA MRVP (rojo metilo Voges-Proskauer)

CITRATO DE SIMMONS TSI

DESCARBOXILACION DE LA LISINA TSI

MEDIOS DE CULTIVO

AGAR ENDO: El agar Endo es un medio de cultivo diferencial y ligeramente selectivo utilizado para la detección de coliformes y otros microorganismos entéricos.

Composición

Fosfato dipotásico 3,5 g Digerido péptico de tejido animal 10,0 gAgar 15,0 g Lactosa 10,0 g Sulfito de sodio 2,5 g Fucsina básica 0,5 g Agua destilada c.s.p. 1000 mL

Fundamento

La selectividad del agar Endo se debe a la combinación de sulfito de sodio y fucsina básica que inhibe ligeramente el crecimiento de los microorganismos gram positivos.

Colonias típicas

Los coliformes fermentadores de lactosa producen colonias rosadas a rojas, mientras que las colonias de los microorganismos que no pueden fermentar este carbohidrato son incoloras o rosado pálido. Las colonias típicas de E. coli en el Agar Endo son rosadas con un brillo verde metálico característico, debido a la elevada producción de ácidos y aldehídos como producto de la fermentación de la lactosa.

AGAR EMB: Eosina – azul de metileno – Lactosa – Sacarosa Selectivo para la demostración y aislamiento de Entero bacteriáceas patógenas.

COMPOSICIÓN

Peptona 10.0 Hidrogeno fosfato dipotásico 2.0 Lactosa 5.0 Sacarosa 5.0 Eosina amarillenta 0.4 Azul de metileno 0.07 Agar – agar 13.5

Selectivo: Eosina amarillenta y azul de metileno Diferencial: Lactosa y sacarosa Indicado: Azul de metileno Color del agar: Rojo

Forma de actuación: La lactosa y la sacarosa hace distinguir las colonias Lactosa y Sacarosa (-) es decir Salmonella sp y Shigella sp. Las bacterias Gram (+) se inhiben por los colorantes.

Colonias características: Salmonella sp Traslucidas Lactosa (-) Sacarosa (-) Shigella sp Traslucidas Lactosa (-) Sacarosa (-) Escherichia coli Verdes y brillantes Lactosa (+) Sacarosa (+)

FIG Contiene sucrosa y lactosa. Utiliza como inhibidor e indicador a eosina azul de metileno. Prueba negativa si se mantiene igual color al medio (rojo), indicativo de la no fermentación de azúcares, Escherichia coli produce un color verde metálico a la luz reflejada, con el centro negroazulado a la luz transmitida característico para esta prueba positiva

CALDO FLUOROCULT

FORMA DE ACTUACIÓN El contenido en laurel sulfato inhibe ampliamente el crecimiento de la flora acompañante. La detección de la presencia de E. coli se efectúa mediante fluorescencia al iluminar con luz UV. Para confirmar el ensayo se utilizan como indicadores a formación de gas debido a la fermentación de la lactosa y el ensayo del indol positivo. COMPOSICION (gr/Lt) Triptosa 25.0 Lactosa 5.0 Cloruro sódico 5.0 Laurilsulfato, sal sódica 0.1 Hidrogenofosfato dipotásico 2.75 Hidrogenofosfato potásico 2.75 L – triptófano 1.0 4 – metilbeliferil – β – D- glucorónido 0.1

EMPLEO E INTERPRETACIÓN El empleo y evaluación se efectúa en la forma habitual. Inocular los tubos. Para 1ml de inoculo utilizar como mínimo 10ml de caldo e incubar a 37ºC durante 10 – 24 horas o según los procedimientos preescritos. La fluorescencia se provoca mediante una lámpara UV. Las colonias que muestran fluorescencia azul claro corresponde a los de E. coli para la confirmación del diagnostico colocar sobre el cultivo una capa de aproximadamente 5mm de altura con reactivo de Kovac’s. Una coloración roja cereza en la capa del reactivo de 1 a 2 minutos indica la presencia de E .coli. El gas formado en el tubo de Durham indica la presencia de E. coli y/u otras bacteria coliformes.

Fluorocult caldo LMX

Forma de actuación Gracias a la modificación del caldo LMX descrito en 1989 por MANAFI y KNEFEL se pudo aumentar claramente la conversión de sustrato. Esto, de una sensibilidad mejorada, lleva sobre todo a una clara reducción del tiempo de identificación, 24 horas generalmente. Debido a la alta calidad alimenticia y al tampón de fosfatos contenido garantiza un rápido crecimiento de coliformes. El contenido en laurilsulfato inhibe en gran medida el crecimiento de bacterias gram positivas. La identificación simultanea de coliformes totales y E. coli se hace posible por la adición del sustrato crómogeno 5- bromo-4-cloro-3-indol-β-D-1 tiogalactopiranósido (IPTG) actúa como sustancia intensificadora en la síntesis enzimática y aumenta el contenido de la actividad de β-D- galactosidasa. El sustrato fluorógeno 4- metillumbeliferil- β-D glucorónido (MUG) es escindido por la enzima β-D glucorónidasa altamente específico para E. coli . El contenido de triptófano mejora la reacción del indol para la confirmación adicional de E. coli y aumenta con ello la sensibilidad de identificación en combinación con la reacción X-GAL y la reacción MUG.

COMPOSICION (gr/Lt) Triptosa 5.0 Cloruro sódico 5.0 Sorbita 1.0 Triptófano 1.0 Hidrógenofosfato dipotásico 2.7 Dihidrógenofosfato potásico 2.o Laurilsulfato, sal sódica 0.1 5-bromo-4cloro-3-indoli- β-D-galactopiranósido (X-GAL) 0.08 4-metilumbeliferil- β-D-glucorónido (MUG) 10.05 L-isopropil- β-D-L-tiogalactopiranósido 0.1

EMPLEO E INTERPRETACIÓN El empleo se rige los correspondientes métodos de investigación para agua y alimentos. Incubación: 24 horas, eventualmente hasta 8 horas a 35-37ºC.

E. coli la lectura de la fluorescencia tiene lugar mediante un alambra UV. Una fluorescencia azul claro en el cultivo indica E. coli (reacción MUG).

AGAR CHROMOCULT

Composición Peptona: 3gr Cloruro sódico: 5gr Dihidrogenofosfato potásico: 1.7g Hidrogenofosfato dipotásico: 3.0g Piruvato sódico: 1.0gr Triptófano: 1.0grAgar – agar: 12.0gr Laurel sulfato sódico 0.1gr Mezcla de cromógenos 0.2grX

Forma de actuación Gracias a la acción conjunta de peptonas selectivas, piruvato y tampón de fosfatos, se garantiza un rápido crecimiento también de coliformes con daños subletables. El contenido de lauril sulfato inhibe ampliamente el crecimiento de bacteria Gram (+) sin tener influencias negativas sobre el crecimiento de coliformes. La identificación simultanea de coliformes totales y E.coli se hace posible por la nueva combinación de patente solicitada de dos sustratos cromógenos. El sustrato Salmo– GAL como x- glucoronido, las colonias se tiñen de verde-azul oscuro y debido a ello son fáciles de diferenciar de los restantes coliformes. Que se presentan de color rojo. En los tubos del caldo LMX se obtuvieron colores azul (cromógeno) debido a que la enzima de los coliformes β – D - galactosidasa reacciono con el x-Gal (5 – bromo, 4 – cloro, 3 – indolin, β- D - galactopiranoside) dando el color característico (verde-azulado). En los tubos de caldo de fluorogeno llamado MUG (4 – metilumbiliferil - β- - D glucoronido) que reacciona con la enzima característica del 94% de las especies de Escherichia coli la β- - D – glucoronidasa dando un compuesto fluorescente color azul a rayos U.V.

AGAR MAC CONKEY: Medio de cultivo utilizado en la investigación de organismos coliformes.

Fundamento Por la presencia de las sales biliares y el cristal violeta se inhibe el crecimiento de las bacterias Gram-positivas. Por la presencia de la lactosa, las bacterias capaces de fermentarla acidifican el medio, cambiando el color del rojo neutro y formando colonias rojas o rosadas, pudiendo presentar un halo turbio correspondiente al precipitado biliar. Las bacterias lactosa-negativas dan colonias incoloras.

Fórmula (por litro) Lactosa. 10,0 g Peptona 3,0 g Sales Biliares 1,5 g Peptona de Gelatina 17,0 g Rojo Neutro 0,03 g Sodio Cloruro 5,0 g Violeta Cristal 0,001 g Agar 13,5 g PH final: 7, 1 ±0, 2

FIG Agar Mac Conkey: medio selectivo y diferencial (permite diferenciar a los microorganismos que fermentan lactosa). Colonias grandes con halo y rojas

Selectivo: cristal violeta y sales biliares diferencial: lactosa indicador: rojo neutro color del agar: claros y rojo parduzco

Forma de actuación El cristal violeta y sales biliares inhiben biota gram (+). La degradación de lactosa se manifiesta por viraje a rojo del indicador de ph, sirve para comprobar la degradación de dicho azúcar.

Colonias características Salmonella sp traslucidas sin precipitado lactosa (-) Shigella sp traslucidas sin precipitado lactosa (-) E.coli rojas con precipitado lactosa (+)

AGAR BISMUTO SULFITO (B.S): Selectivo para el aislamiento y diferenciación de Salmonella sp a partir de material clínico y otros clases.

COMPOSICIÓN Extracto de carne 5.0 Peptona de carne 10.0 D (+)-glucosa 5.0 Hidrogeno fosfato disódico 4.0 Sulfato ferrosos 0.3 Verde brillante 0.025 Indicador bismuto-sulfito 8.0 Agar – agar 15.0

Selectivo: Verde brillante y bismuto Diferencial: sulfuro de hierro y bismuto sulfito Color del agar: Crema

Forma de actuación El verde brillante y el bismuto inhiben considerablemente los gérmenes de acompañamiento. Las colonias de Salmonella sp H2S (+) presentan ennegrecimiento debido al sulfuro de hierro. El brillo metálico alrededor de las colonias se debe a la reducción de los iones bismuto a bismuto metálico.

Colonias características: Shigella sp: centro negro, borde claro, precipitado negro, brillo metálico alrededor de las colonias. Coliformes: pequeñas, verdes hasta pardas, a veces mucosas.

FIG colonias marrones o negras, algunas veces con brillo metálico alrededor de la colonia (S.typhi). Algunas cepas producen colonias verdes con poco o ningún oscurecimiento del medio.

El medio de cultivo contiene lactosa, cuya degradación a ácido se reconoce por el viraje a amarillo del rojo de fenol que actúa como indicador de pH. En ambiente alcalino presenta un color rojo intenso la flora acompañante Gram positiva, así como Salmonella thypi y Shiguella resulta muy reprimidas por la presencia de verde brillante. Para la inhibición en grupo de Proteus, recomienda ADAM la adición de 0.2% sodio de desoxicolato, al medio de cultivo.

EMPLEO E INTERPRETACIÓN En medio de cultivo se siembra masivamente en superficie con material objeto de investigación directamente, o a partir de un cultivo de enriquecimiento, incubación de 18-24 horas a 37ºC.

Colonias Microorganismo Rosa pálido, transparentes con halo rojo. Lactosa- Negativa: Salmonella y

ocasionalmente Proteus, Citrobacter. Verde- amarillenta, opacas con halo verde amarillento

Lactosa positiva: E. coli, Enterobacter, klebsiella, con buen crecimiento. De lo contrario notable inhibición

AGAR S.S (SALMONELLA - SHIGELLA)

FIG Medio de cultivo selectivo para Salmonella y Shigella. Está compuesto por sales biliares que inhiben el crecimiento de coliformes, lactosa y rojo neutro (indicador de pH). Las colonias fermentadoras de lactosa producirán ácidos y cambiará el color del medio a rosa. Como Shigella y Salmonella no utilizan este azúcar forman colonias transparentes. El tiosulfato es la fuente de azufre para la producción de ácido sulfhídrico de las bacterias sulfato-reductoras. Este ácido reacciona con la sal de hierro y se forma sulfuro de hierro de color negro. Las colonias de Salmonella se observan transparentes con un precipitado negro en el centro.

Para el aislamiento de Salmonella sp, Shigella sp a partir de heces, alimentos y otros materiales objetos de investigación.

Selectivo: Verde brillante, Bilis de Buey, Tiosulfato de sodio y citrato Diferencial: Tiosulafato, iones de hierro y lactosa. Indicador: Rojo neutro Color del agar: Claras y parduscas

Forma de actuación: El brillante y la Bilis de Buey y la elevada concentración de tiosulfato y de citrato inhiben considerablemente la biota acompañante. Con tiosulfato y los iones de hierro se pone en manifiesto la formación de sulfuro, para las colonias H2S (+). Las colonias de coliformes quedan señaladas para la degradación de lactosa y producción de ácido demostrado por el viraje del indicador (rojo neutro).

Colonias características:

Salmonella sp. Traslucidas y centro negro Lactosa (-) sulfuro (+) Shigella sp. Traslucidas sin centro negro Lactosa (-) sulfuro (-) Escherichia coli Rojas a rosadas sin precipitado Lactosa (+) sulfuros (-)

AGAR HEKTOEN

Agar selectivo para la demostración y aislamiento de bacterias intestinales patógenas, inclusive shigella sp a partir de los más diversos materiales, tales como: heces, alimentos y otros.

Selectivo: sales biliares Diferencial: bisulfato, sales de hierro, fucsina ácida y lactosa. Indicador: azul de bromotimol Color del agar: azul verdoso claro

Forma de actuación Las colonias lactosa (-) muestra una expresiva diferencia cromática frente a las colonias lactosa (-) por el viraje a rojo – anaranjado. La combinación de tiosulfato y una sal de hierro dan una coloración negra de las colonias sulfuro (+) Salmonella sp. Las sales biliares inhiben la biota acompañante.

Colonias características Salmonella sp verdes con o sin precipitado negro en el centro lactosa (+) sulfuros (-) Shigella sp verdes, húmedas, planas y trasparentes lactosa (+) sulfuros (-) E.coli rojas- anaranjadas con halo de precipitado lactosa (+) sulfuros (-)

AGAR XLD (xilosa –lisina-desoxicolato)

Para el aislamiento y diferenciación de enterobacterias patógenas, especialmente de Salmonella sp y shigella sp .

Selectivo: tíosulfato, desoxicolato de sodio y sales biliares Diferencial: Tíosulfato, sales de hierro, Xilosa, Lisina, Lactosa. Indicador: Rojo de fenol. Color del agar: Rojo claro.

Forma de actuación La degradación a acido de xilosa, lactosa y sacarosa vira el medio amarillo. El tiosulfato y sales de hierro revelan la formación de H2S. La descarboxilación de lisina (Producción de cadaverina) se reconoce por la presencia de un color rojo púrpura, por aumento del pH alrededor de la colonia. Varias de estas reacciones pueden presentarse simultáneamente o sucesivamente, lo que puede dar lugar a diversas matices de color del indicador de pH, o a un viraje de a Amarillo a Rojo en el transcurso de una incubación mas prolongada. El efecto inhibidor de este medio de cultivo es débil.

Colonias características Salmonella sp Traslucidas con precipitado negro. Lactosa (-) Sulfuros (+)

Shigella sp Traslucidas en contraste con el medio. Lactosa (-) Sulfuros (-) E. coli Amarillas, con zonas amarillas alrededor opacas, halo de precipitación. Lactosa (+) Sulfuros (-)

AGAR RAMBACH

Medio de cultivo para diagnostico diferencial para identificación de Salmonella sp en muestras clínicas.

Selectivo: desoxicolato sódico Diferencial: prolenglicol

Color del agar: guayaba Forma de actuación El desoxicolato inhibe biota gram (+). Las Salmonellas sp forman acido a partir del propilenglicol y en combinación con el indicador de pH producen colonias rojas características. Para diferenciar las colonias coliformes con las de Salmonella sp hay un compuesto cromógeno, que indica la separación de B-Galactosidasa, características para los coliformes totales.

Colonias características

Salmonella sp Rojas Shigella sp Incoloro-amarillento E. coli Verde azulado

CALDO RAPPAPORT (CALDO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO) Para el enriquecimiento selectivo de Salmonella sp, con excepción de S. Typhi a partir de material de investigación de origen fecal.

Selectivo: verde de malaquita, cloruro de magnesio Diferencial: tetrationato y amarillo de metacromo Color del caldo: azul.

Forma de actuación

El verde de malaquita y el cloruro de magnesio inhiben notablemente la biota intestinal normal, en tanto que la mayoría de Salmonellas se multiplican sin obstáculos. Por regla general, únicamente S. Typhi y Shigellas resultan inhibidos también por el verde de malaquita. Por este motivo no es adecuado este medio de cultivo para el enriquecimiento de estos agentes patógenos.

CALDO SELENITO (CALDO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO)

Para el enriquecimiento de Salmonellas a partir de heces, alimentos y otros materiales.

Forma de actuación El selenito inhibe el crecimiento de bacterias coliformes y Enterococos en las primeras 6-12 horas siguientes al inicio de la incubación. Después el efecto inhibidor disminuye lentamente. Por el contrario Salmonella sp, Proteus sp, Pseudomonas sp no son inhibidas.

CALDO DE ENRIQUECIMIENTO TETRATIONATE Para el enriquecimiento selectivo de Salmonellas, a partir de diversos materiales de investigación.

Forma de actuación El tetrationato junto con el tiosulfato excedente, inhiben a coliformes y otras bacterias acompañantes. En cambio, todas las bacterias reductoras de tetrationate, como por ejemplo: Salmonella sp y Proteus sp pueden multiplicarse mas o menos sin obstáculo. El ácido procedente de la reducción del tetrationato es neutralizado por carbonato calcio. Las sales biliares inhiben considerablemente a todos los microorganismos de presencia no obligatoria en el intestino. La adición del verde brillante sirve, sobre todo para inhibir a la biota gram (+). Dado que le medio de cultivo con verde brillante posee un efecto inhibidor muy intenso, resulta ventajoso a veces suprimir la adición de verde brillante a fin de obtener un rendimiento satisfactorio de Salmonellas.