atlas de pruebas bioquimicas para identificar bacterias-libre

8/20/2019 Atlas de Pruebas Bioquimicas Para Identificar Bacterias-libre

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMAUNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMAUNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMAUNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMADE MÉXICO DE MÉXICO DE MÉXICO DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZAFACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZAFACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZAFACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

Q.F.B. Lucía Bailón Lira

Q.F.B. Roberto Cruz González Meléndez

M. en C. Armando Cervantes Sandoval

© 2003. Universidad Nacional Autónoma de MéxicoMaterial de uso libre con f ines académicos, con su correspondiente cita o ref erencia

Prohibida su reproducción t otal o parcial con f ines de lucroComentarios, Sugerencias, Correcciones o Porras; al E-mail: [email protected]. Todas serán

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CONTENI DOPágina

I nt r oducción 7

Generalidades de bact er ias 9Mor f ología y est r uct ur a 9Nut r ición 10

Quimiohet er ót r of os 12Aut ót r of os 12Fot oaut ót r of os 12Fot ohet er ót r of os 12

Reproducción 13Tr ansf ormación 14Conj ugación 14Tr ansducción 15

I dent if icación bact eriana 16Medios de cult ivo 16Medios básicos 18Medios enr iquecidos 19Medios select ivos, dif erenciales y

de enr iquecimient o 20Medios especiales 22Clasif icación por consist encia 23

SólidosSemisólidosLíquidos

Clasif icación por composición 23Sint ét icosNo sint ét icos



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Técnicas de inoculación 24En placa 26

Est r ía cr uzadaEst r ía en “Z”

Est r ía simpleSiembr a masivaVaciado en placa

En t ubo: medio semisólido 27Siembr a en medios líquidos 28En t ubo: medios sólidos 29

I ncubación de los medios 30

Mor f ología colonial 31

I dent if icación basada en car act er íst icas 35met abólicas: Pr uebas bioquímicas

Fer ment ación de car bohidr at os 35Pr ueba de cit r at o 42Licuef acción de gelat ina 48

Pr ueba de leche con t ornasol 52Reducción de leche con azul de met ileno 59Pr ueba de f erment ación y oxidación (O/ F) 63Pr ueba de ureasa 69Pr ueba de Voges - Pr oskauer 73Pr ueba de r oj o de met ilo 78Reducción de nit r at os 82Pr ueba de f enilalanina 87Sulf ur o, indol y movilidad: SI M 92Agar hier r o t r iple azúcar : TSI 102Agar lisina – hier r o: LI A 112Movil idad, indol y or nit ina: MI O 116



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Met abolismo 125Producción de energía 128Vía de degradación de las hexosas

Glucólisis 130

Ent ner-Duodorof f 134Pent osa f osf at o 135

Ciclo de Krebs 139Ferment ación 142

Láct ica 143Heteroláct ica 144Alcohólica 144Propiónica 146Ácido mixt a (f órmica) 147De met ano 148But ilenglucolít ica (acet oínica) 148

Respir ación anaeróbica con acept ores 149inorgánicos de hidrógeno

Fij ación de nit r ógeno 149Reducción de sulf atos 151

Mét odos para el aislamient o e ident if icación de bact er iasEnt erobact er ias 153Coprocult ivo 155Famil ia Micr ococaceae 157Est af ilococos 158Est rept ococos 160Urocult ivo 162

Hemocult ivo 163Exudado f ar ingeo 164

Ref erencias 165Direcciones elect rónicas 168



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Í NDI CE DE FI GURAS

No. Figura Refer encia Pág. 1 Mor f ología bact er iana Enciclopedia Encart a, 2002 92 Formas de nut r ición de bacter ias Enciclopedia Encart a, 2002 113 Reproducción bacter iana Enciclopedia Encart a, 2002 13

4 Reproducción bacter iana: Tr ansf ormación Enciclopedia Encart a, 2002 145 Reproducción bact er iana: Conjugación Enciclopedia Encar t a, 2002 156 Super f icie de placas de agar EMB que ilust r a el br ill o verde

producido por miembr os de las Ent erobact er ias que f erment anávidamente lact osa: Escherichia coli .

Koneman, 1992 16

7 Placa de agar soya - t r ipt icasa, inoculado con una bact er ia queproduce un pigment o amari llo. La producción de pigment o es unaimport ant e caracter ísti ca dif erencial para identi f icar bacilosGram negat ivos no f erment adores.

Koneman, 1992 18

8 Super f icie de placas de agar EMB que ilust r a cult ivo mixt o deEscher ichia coli y Shigella sp.

Koneman, 1992 19

9 Morf ología colonial en agar sangre. Enciclopedia Encart a, 2002 2010 Super f icie de placas de agra EMB que ilust r a el br ill o verde

producido por Escherichia coli. Koneman, 1992 21

11 Agar BCYE Koneman,1992 3112 St rept ococcus sp. Museun of Hist ory Nat ural 3713 Pr uebas bioquímicas: Fermentación de carbohidr atos 3814 Pruebas bioquímicas: Cit r ato 4515 Pr uebas bioquímicas: Licuef acción de gelat ina 5016 Micrococcus sp Sullivan, 2002 5117 Pr uebas bioquímicas: Leche con t ornasol 5718 Pruebas bioquímicas: Leche con azul de met ileno 6119 Salmonella sp. Enciclopedia Encart a, 2002 6220 Pruebas bioquímicas: Oxidación/ f erment ación 6621 I nter pret ación O/ F 6722 Pruebas bioquímicas: Ur ea 7123 Salnonella t yphi Enciclopedia Encart a, 2002 72

24 Pruebas bioquímicas: Voges - Proskauer 7625 Escherichia coli Próskznki, 2002 7726 Pr uebas bioquímicas: Roj o de met ilo 8027 Escher ichia coli , observese pili 8128 Pruebas bioquímicas: Reducción de nit r atos 8529 Pruebas bioquímicas: Fenilalanina desaminasa 9130 Salmonella t yphi Universit y of east Anglia

Norwich, 200296

31 Pruebas bioquímicas: SI M 9932 Salmonella t yphi 101 33 Escherichia coli Pf eizer , 2002 10134 Pruebas bioquímicas: TSI 10735 Salmonella sp. 107

36 Fundament o: TSI Koneman, 2002 11037 Pruebas bioquímicas: LI A 11438 Pruebas bioquímicas: MI O 12139 Shigella Museum of Hist ory Nat ural,

2002124

40 Pr oducción de quesos Black, 1996 14441 Producción de vino Black, 1996 145



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Í ndice de Tablas

No. Tabla Pág.

1 Report e de r esult ados: prueba de oxidación y f erment ación 682 Repor t e de r esult ados: Sulf ur o, indol y movilidad (SI M) 983 Aplicaciones: SI M 1014 Aplicaciones: TSI 1115 Aplicaciones: LI A 1156 Repor t e de r esult ados: MI O 1237 Aplicaciones: MI O 124

8 Car act er íst icas bioquímicas de bacilos Gr am negat ivos 1549 Car act er íst icas bioquímicas de la Famil ia Micr ococcaeae 15710 Car act er íst icas bioquímicas de St aphylococcus 159 11 Car act er íst icas bioquímicas de St r ept ococcus 161

Í ndice de Esquemas

No. Esquema Página

1 Glucólisis 1332 Vía de Hexosa monof osf at o 1383 Ciclo de Kr ebs 1414 Copr ocult ivo 155

5 Aislamient o de bact er ias pat ógenas de heces 1566 Aislamient o de St aphylococcus 158 7 Ur ocult ivo 1628 Exudado f ar ingeo 164



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I nt r oducción

Como est udiant e la licenciat ura de Q.F.B. la cual abarca engran par t e el est udio bact er iológico he observado que lamayoría de las veces, los alumnos al realizar las pruebasbioquímicas par a la ident if icación de bact er ias no t ienen unconocimient o real o suf icient e de los pr incipios o bases par ar ealizar las así como las precauciones e inconvenient es que sepresent an en cada pr ueba bioquímica.

Para poder conocer los pr incipios, bases bioquímicas, mét odos,aplicaciones, int erpret ación y precauciones así como losr esult ados esperados en cada prueba es necesar io a menudor ecur r ir a muchas r ef erencias bibliogr áf icas y publicacionesque no siempre se encuent r an a disposición de los alumnos omicr obiólogos en general.

En est e at las de pr uebas bioquímicas se han seleccionado laspruebas que se ut il izan a lo largo de la licenciat ura de QuímicoFar macéut ico Biólogo en la Facult ad de Est udios Super ioresZar agoza. Por lo t ant o el usuar io encont r ar á la inf ormaciónsuf icient e y necesar ia pero sobre t odo, sencil la y amena decada prueba, su pr incipio f undament al, bases bioquímicas,medios de cult ivo, react ivos empleados, r esult ados,

int erpret ación, r epor t e de r esult ados, precauciones yobservaciones, t écnicas de inoculación y condiciones deincubación así como ref erencias bibl iográf icas. Est as han sidor eunidas al f inal par a permit ir , cuando se desee unaprof undización acerca de un aspect o det erminado de algún



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t ema, donde se podr á t ambién observar dif erent es imágenesde algunas especies bact er ianas. En las ilust r aciones a color delos r esult ados de cada prueba t ambién se incluyen medios noinoculados par a una mej or y mayor comparación para los

lect or es.

Ant es de la par t e dedicada a la explicación de las bases par acada prueba bioquímica se encont r ar án t ambién clasif icacionesconcr et as y ej emplos de los medios de cult ivo, así como last écnicas de inoculación más empleadas.

No se ha t r at ado de simplif icar en exceso (per o t ampoco se haprof undizado en cada pr ueba), sino de hacer que est e at lasr esult e út il especialment e par a los est udiant es no solo de lalicenciat ur a de Q.F.B., sino t ambién par a ot r as car r eras,labor at or ios de análisis clínicos y por que no, par a ot r asinst it uciones.

Est e at las de colores y t ext o de micr obiología ha sido descr it ocon el obj et o de proporcionar a est udiant es de micr obiología,t ecnólogos médicos, r esident es de pat ología y ot r osint eresados en micr obiología clínica, una int r oducción práct icaa la ident if icación de labor at or io de los agent es micr obianosasociados con enf ermedades inf ecciosas y de las pr uebasbioquímicas más empleadas o las mínimas necesar ias para suident if icación.



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1. Mor f ología y est r uct ur a.

Las bact er ias son micr oor ganismos pr ocar iot as de

organización muy sencilla. La célula bact er iana const ade:

! Cit oplasma. Pr esent a un aspect o viscoso, y ensu zona cent r al apar ece un nucleoide quecont iene la mayor par t e del ADN bact er iano, yen algunas bact er ias apar ecen f r agment os

cir culares de ADN con inf or mación genét ica,dispersos por el cit oplasma: son los plásmidos.

Figura 1. Morfología bacteriana



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! La membr ana plasmát ica present ainvaginaciones, que son los mesosomas , dondese encuent r an enzimas que int ervienen en lasínt esis de ATP, y los pigment osf ot osint ét icos en el caso de bact er iasf ot osint ét icas. En el cit oplasma se encuent r aninclusiones de diversa nat ur aleza química.

! Muchas bact er ias pueden present ar f lagelosgeneralment e r ígidos, implant ados en lamembr ana mediant e un corpúsculo basal .

Pueden poseer t ambién, f imbr ias o pili muynumerosos y cor t os, que pueden servir comopelos sexuales par a el paso de ADN de unacélula a ot r a.

! Poseen ARN y ribosomas car act er íst icos, par ala sínt esis de pr ot eínas.

! Par ed celular r ígida y con moléculas exclusivasde bact er ias.

2. Nutrición

El éxit o evolut ivo de las bact er ias se debe en par t e a suver sat il idad met abólica. Todos los mecanismos posibles deobt ención de mat er ia y energía podemos encont r ar los en lasbact er ias.



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Según la f uent e de car bono que ut ilizan, los seres vivos sedividen en aut ót r of os , cuya pr incipal f uent e de car bono es elCO2, y het er ót r of os cuando su f uent e de car bono es mat er iaorgánica.

Por ot r a par t e según la f uent e de energía, los ser es vivospueden ser fotótrofos , cuya pr incipal f uent e de energía es laluz, y los or ganismos quimiot r of os , cuya f uent e de energía esun compuest o químico que se oxida.

Fi ura 2. Formas de nutrición de las bacterias



12

At endiendo a las ant er iores cat egor ías, ent r e las bact er iaspodemos encont r ar las siguient es f ormas, como puedeapreciar se en el esquema:

1. Las bact er ias quimiohet er ót r of as , ut il izan uncompuest o químico como f uent e de car bono, y a su vez,est e mismo compuest o es la f uent e de energía. Lamayor par t e de las bact er ias cult ivadas en labor at or iosy las bact er ias pat ógenas son de est e gr upo.

2. Las bact er ias quimioaut ót r of as , ut il izan compuest osinor gánicos r educidos como f uent e de energía y el CO2 como f uent e de car bono. Como por ej emplo,Nitrobacter yThiobacillus .

3. Las bact er ias f ot oaut ót r of as , ut ilizan la luz comof uent e de energía y el CO2 como f uent e de car bono.Bact er ias pur púr eas.

4. Las bact er ias f ot ohet er ót r of as , ut ilizan la luz comof uent e de energía y biomoléculas como f uent e de

carbono. Ej emplos como Rhodospirillum y Chlor of lexus .



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3. Reproducción

Generalment e las bact er ias se repr oducen porbipar t ición, como se ve en el siguient e esquema:

Tr as la duplicación del ADN, que est a dir igida por la ADN-polimerasa que se encuent r a en los mesosomas, la paredbact er iana crece hast a f or mar un t abique t r ansversalsepar ador de las dos nuevas bact er ias.

Pero además de est e t ipo de repr oducción asexual, las

bact er ias poseen unos mecanismos de reproducción sexual opar asexual, mediant e los cuales se int ercambian f r agment osde ADN. Est e t ipo de repr oducción puede realizar se por :

Figura 3. Reproducción bacteriana



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! TRANSFORMACI ON:Consist e en elint ercambio genét icoproducido cuando unabact er ia es capaz decapt ar f r agment os deADN, de ot r a bact er iaque se encuent r andispersos en el mediodonde vive.

! CONJ UGACI ÓN: En est e pr oceso, una bact er iadonadora F+ t r ansmit e a t r avés de un puent e opili , un f r agment o de ADN, a ot r a bact er iar ecept ora F-. La bact er ia que se llama F+ poseeun plásmido, además del cr omosoma bact er iano.

Figura 4. Reproducción bacteriana: Transformación



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! TRANSDUCCI ÓN: En est e caso la t r ansf erenciade ADN de una bact er ia a ot r a, se realiza at r avés de un vir us bact er ióf ago , que secompor t a como un vect or int er mediar io ent r e lasdos bact er ias. (Bibliot eca de Consult a Microsoft ® Encart a® 2002. © 1993-2 001 Microsoft Corporat ion.)

Figura 5. Reproducción bacteriana: Conjugación



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En la nat ur aleza los micr oor ganismos se encuent r an

f or mando poblaciones mixt as de una gran var iedad de t iposdif erent es. Sin embar go, el desar r ollo de la micr obiología seha conseguido mediant e el est udio de especies aisladas,cr ecidas en medios desprovist os de cualquier ot r a f or ma devida cont aminant e.

Los micr oor ganismos necesit an nut r ient es apropiados así

como condiciones ambient ales f avor ables. En pr imer lugar elmedio de cult ivo debe cont ener aquellos nut r ient esesenciales par a el cr ecimient o de una det erminada especie.

Como la mayor par t e de los est udios en el laborat or io ser ealizan los cult ivos pur os (una sola especie bact er iana), sedebe est er il izar el medio de cult ivo y mant ener lo en

condiciones est ér iles hast a que sea ut il izado.

Un medio de cult ivo es cualquiersust ancia que puede ser usada par a elcult ivo de micr oor ganismos, puede serllamada un medio o, dicho con mayorprecisión un medio de cult ivo.

Figura 6. Crecimiento de Escherichia coli en agar EMB



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Los medios sir ven par a dos propósit os pr incipales:

a) Foment ar el cr ecimient o micr obiano en f or ma quepuedan comprobar se las car act er íst icas de cult ivo.

b) Facilit ar algunas reacciones bioquímicas que luegopuedan ser demost r ables por observación dir ect a, obien, indir ect ament e por la reacción en presencia de

algunos r eact ivos adicionales.

Todas las reacciones de cult ivo así como las bioquímicas,dependen de la composición del medio y de la nat uraleza delcult ivo que se est udie. Los medios de cult ivo se puedenclasif icar en cuat r o t ipos dif er ent es:

1. Medios básicos2. Medios enriquecidos3. Medios select ivos, dif erenciales y de

enr iquecimient o4. Medios especiales



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1. Medios básicos

Solo cont ienen algún ext r act o de car ne u ot r a inf usión

simple, pept ona, sal y agua.

El ext r act o o la inf usión de car ne pr opor cionan al or ganismolos aminoácidos, vit aminas, sales, y pequeñas cant idades decar bono, nit r ógeno, hidr ógeno y ot r os element os.

Las sales (usualment e clorur o de sodio) sir ven par a obt ener

isot onicidad r equer ida par a el mant enimient o de pr esionesosmót icas const ant es.

El agua sir ve como disolvent e, como medio de t r anspor t e, opar a ambos f ines (siempr e se debe usar agua dest ilada par aprepar ar los medios de cult ivo).

Los medios de cult ivo que solo cont ienen ext r act o de car ne,pept ona, sal y agua, son líquidos; par a el est udio de lascar act er íst icas de las colonias es indispensable el uso demedios sólidos.

La solidif icación se consigueagregando agar , gelat ina, albúmina

de suero o de huevo, a los ot r osingr edient es.

Figura 7. Agar Soya - tripticasa



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Es pr ef er ible ut il izar el agar , ya que es un medio sólido queno se desint egr a por los medios f ísicos usados en el cult ivode la mayor ía de los micr oor ganismos.

Ej emplos de ést e t ipo de medios son los siguient es: 1. Caldo y agar nut r it ivo2. Caldo de t r ipt ona y soya3. Caldo de inf usión de cer ebro y

corazón4. Agar de inf usión de cerebro ycorazón

5. Caldo de inf usión de cor azón6. Agar y ext r act o de hígado7. Dext r osa de Sabor aud

2. Medios enriquecidos

Son aquellos medios básicos que han sido complement adoscon líquidos corpor ales, vit aminas específ icas, aminoácidos,pr ot eínas y ot r os nut r ient es clar ament e def inidos como

t ales.

Figura 8. Agar EMB con cultivo mixtode Escherichia coli y Shigella sp.



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Ej emplos:1. Agar pr ot eosa2. Agar sangr e3. Agar chocolat e4. Caldo de suer o5. Agar con suero6. Suer o de Loef f ler con

sangr e

7. Medios inclinados consuero

8. Agar de Bordet Gengou9. Medio de Levint hal10.Agar de Mueller -Hint on11.Agar inf usión de

cer ebro cor azón12.Agar sangre

3. Medios select ivos, dif erenciales y deenriquecimiento

Los medios select ivos son usualment e medios de agar básico,o enr iquecidos, a los cuales se les han agregado cier t osr eact ivos que impiden el cr ecimient o de la mayor ía de lasbact er ias, permit iendo por lo t ant o el aislamient o de unascuant as, seleccionadas en los especimenes que cont engangrandes números de organismos indeseables.

Los medios dif erenciales son medios básicos o enr iquecidos,a los cuales se les han agregado cier t os r eact ivos quer eaccionar án con algunos t ipos específ icos de bact er ias enciert a f or ma observable.

Figura 9. Morfología colonial en Agar sangre



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Los medios de enr iquecimient o son por lo general medioslíquidos enr iquecidos, que cont ienen algunas sust anciasinhibidoras, con lo que se crea un ambient e especialment ef avor able par a límit es más bien est r echos de bact er ias.

Ej emplos:1. Medio de Thayer

Martin2. Agar con f enilet anol3. Agar con sangre y bilis

al 40%4. Agar con esculina y bilis5. Agar con sangre y

telurito6. Medio de Tinsdale

modif icado7. Agar con Lowenst ein

J ensen en t ubosinclinados8. Agar con cit r at o y

desoxicolat o9. Agar de sulf it o de

bismut o10.Caldo selenit o de sodio

11. Agar XLD ( xilosa,

lact osa, desoxicolat o)11. Agar sangre con azida12. Agar con sal y manit ol13. Agar de Mc Conkey

14. Agar Salmonella -Shigella15. Agar con eosina y azul

de met ileno (EMB)16. Agar de bilis y rojo de

violet a17. Agar dext r osa y

t r ipt icaseina18. Agar ent ér ico Hekt oen19. Agar S-11020. Agar t er git ol 721. Agar ver de br illant e22. Agar Vogel J honson23. Agar Bair d-Par ker

Figura 10. Crecimiento de Escherichia coli en Agar EMB



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4. Medios especiales

Son los medios que no pueden ser f ácilment e agrupados

baj o alguno de los ant er iores grupos.

La mayoría de ellos serán medios empleados paracomprobar una o más a car act er íst icas bioquímicas.

Ej emplos:

Pr uebas bioquímicas

1. Ferment ación de car bohidr at os2. Pr ueba de cit r at o3. Pr ueba de leche con t or nasol4. Reducción de leche con azul de met ileno5. Pr ueba de oxidación y f erment ación: Hugh-Leif son

(O/ F)6. Pr ueba de ureasa7. Pr ueba de Voges – Pr oskauer8. Pr ueba con roj o de met ilo9. Reducción de nit r at os10. Pr ueba de f enilalanina11. Pr ueba de Sulf ur o, indol, movilidad: SI M

12. Agar hierr o y t r iple azúcar : TSI13. Descar boxi lación de la ar ginina y lisina: LI A14. Descar boxilación de la or nit ina: MI O



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Ot r as clasif icaciones de los medios de cult ivo son lassiguient es:

De acuerdo a la consistencia

1. Medios sólidos. Son út iles par a el cr ecimient o, aislamient o yobt ención de cult ivos pur os de bact er ias y hongos.

2. Medios semisólidos. Út iles par a la observación demet abolismo, así como la propagación y obt ención de cult ivosde bact er ias anaeróbicas.

3. Medios líquidos. Permit en la dif usión del micr oor ganismo.

De acuerdo a la composición

1. Medios sint ét icos

Es aquel en el que se conoce la composición química exact ade los ingr edient es.

2. Medio no sint ét ico

No se conoce de una manera def inida la composiciónprecisa de alguna o de t odas las sust ancias nut r it ivas.



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El desar r ollo o cosecha de micr oor ganismos obt enido enalgún medio se designa como un cult ivo. Cuando lasbact er ias de un cult ivo son t odas de la misma especie, sedice que son cult ivos pur os; cuándo dos o más especies debact er ias sé desar r ollan en un medio como un cult ivo mixt o.Si un cult ivo cont iene accident alment e más de una especiede bact er ias se habla de un cult ivo cont aminado.

Las bact er ias se cult ivan en alguno de los siguient es t iposde mat er ial de vidr io, una vez limpios y est er il izados.

1. Tubos de ensayo2. Caj as o placas de Pet r i3. Mat r aces de Florencia y Er lenmeyer

4. Tubos de f erment ación

Ant es de su est er il ización, un t ubo que cont iene medio decult ivo se t apa generalment e con algodón o con un t apón decaucho o plást ico. Así se evit a la ent r ada de nuevoscont aminant es a la vez que se permit e el l ibr e int ercambiode air e o gases.

Par a sembr ar un cult ivo bact er iano en un medio est ér il , uncier t o número de células: “inóculo”, se t r ansf ieren (seinoculan) al medio con precauciones especiales paraconser var la pur eza del cult ivo.



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En el procedimient o de inoculación el asa de cult ivo o aguj ade siembr a, debe calent ar se al r oj o sobr e la llamainmediat ament e ant es y después de hacer la t r ansf erencia.La f lama dest r uye cualquier f or ma de vida sobr e lasuper f icie de la aguj a o del asa. Se mant iene la aguj a haciaabaj o sobr e la f lama, par a calent ar la t ot alidad de la aguj a yla par t e inf er ior del mango.

Dur ant e la siembr a, se mant iene el t ubo en la mano izquierday se sost iene el t apón o capuchón ent r e los dedos meñique y

anular de la mano der echa. NO DEBE NUNCADEPOSI TARSE EL TAPÓN sobr e la mesa. Mant ener el t ubolo más cerca posible de la f lama durant e la siembr a. Lasbocas de los t ubos de donde t omamos los cult ivos y las deaquellos donde van a ser t r ansf er idos deben t ambiénf lamear se inmediat ament e ant es y después de que la aguj asea int r oducida y sacada. Además de dest r uir cualquier

or ganismo del borde del t ubo, la f lama t iende a cr earcor r ient es de convección hacia f uera, decreciendo así elr iesgo de cont aminación.

Después de inocular , un cult ivo bact er iano se conserva o seincuba en un lugar apropiado par a el cr ecimient o. En est ecaso “cr ecimient o”, signif ica el desar r ollo de una población

de células a par t ir de una o pocas células. La masa de lascélulas hij as llega a ser visible a simple vist a, bien como unaopacidad “ent urbamient o”, en medio líquido; o como unapoblación aislada “colonia” en medio sólido, donde el aspect ode ést as of r ece un medio par a dif erenciar especies.



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La inoculación pr imar ia puede hacerse con un asa, hisopo uot r os disposit ivos adecuados.

# Diseminación en placas:

a) Estría 1 Cr uzada2 En Z3 Simple (en ángulos rect os)

4 Masiva

b) Vaciado en placa

En el caso de la est r ía cr uzada el inóculo se disemina conun movimient o hacia at r ás y hacia delant e en cadacuadr ant e gir ando la placa a 90°. El asa o alambr e debe

est er il izar se en cada diseminación ent r e cada cuadr ant e.

El pr opósit o de est a t écnica consist e en diluir el inóculo enf or ma suf icient e en la super f icie del agar par a que seaposible obt ener colonias.

El mét odo de dilución o vaciado en placa proporciona por lo

general placas con un número apropiado de colonias, y sebasa en una dilución aproximadament e cuant it at iva de lamuest r a or iginal en un medio sólido.



27

Una t écnica muy común en medicina consist e en obt enerespecies de micr oor ganismos en un aplicador de algodón(hisopo). Si se ut il iza el aplicador inf ect ado par a sembr ardir ect ament e en caj a pet r i se obt iene una mezcla complej ade organismos sin ninguna colonia aislada, lo cual no r epor t aningún benef icio. Par a resolver est o exist e una t écnica queper mit e aislar una colonia pur a de un algodón inf ect ado, par alo cual; debe t r azar con el hisopo unas líneas, inoculando unapequeña zona en el borde de una placa. Cubr a la caj a y quemeel aplicador en el mecher o. Est er ilice el asa y pásela en el

sect or inoculado con el algodón par a recoger algunasbact er ias, luego inocule con ellos la ot r a zona en la mismacaj a (est r ía cruzada).

# I noculación de medios semisólidos en t ubo

Por picadur a en f or ma ver t ical

La inoculación de est e t ipo de medios se descr ibe en elAt las int er act ivo.

El agar inclinado es un t ubo cont eniendo un medio con agarque, dur ant e su enf r iamient o, se colocó inclinado. Elcont enido de un t ubo así inclinado const it uye un medio

adecuado par a el desar r ollo de bact er ias, especialment e deaerobias y anaerobias f acult at ivas. Algunas car act er íst icasde los cult ivos, como la f ormación de pigment os seobser van más f ácilment e sobr e cult ivos inclinados.



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Cuando se inocula agar semisólido en un t ubo par a pr uebasde mot ilidad (aunque no sea la única prueba que se valora),es impor t ant e que el asa de inoculación sea r et ir ada a lolar go del mismo camino que se usó para at r avesarinicialment e el medio. Solo se pica el agar con unmovimient o unif or me y rect o y par a ello se ut il iza el asar ect a.

# I noculación de medios líquidos (t ubo)

El cr ecimient o bact er iano en medios líquidos se obser va dela siguient e manera:1. Ent urbamient o, opacidad más o menos densa.2. Formación de velo, pequeña masa de células que

f lot an en la par t e superior del cult ivo.3. Sediment o, depósit o de células que permanece en la

par t e inf er ior del cult ivo, pero que se pone

nuevament e en suspensión si el t ubo se sacudesuavement e.

Dif usión

Los medios líquidos pueden inocularse como en el mét odoilust r ado (At las int er act ivo); el t ubo debe inclinar se

aproximadament e 30°, con un asa de inoculación se t oca lasuperf icie int erna del vidr io, exact ament e por encima delpunt o donde la super f icie del medio f orma un ángulo agudo.Se debe ut il izar el asa con ar il lo.



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Post er ior ment e se vuelve a colocar el t ubo en posiciónr ect a, así el área de inoculación queda sumergida en elmedio.

Agit ar suavement e cada t ubo. No dej ar que el líquidosalpique la t apa del t ubo. Por lo común es suf icient e un soloinóculo par a inocular una bat er ía de 8 a 10 t ubos.

Cuando se inocula una bat er ía con una misma especie debact er ia no hay necesidad de pasar por la llama ent r e cada

inoculación.

Cuando se ut iliza una aguj a o asa par a inocular una bat er íacon un solo inóculo, el t r aspaso de azúcar es de un t ubo aot r o es t an inf init o que no hay problema de que un t ubocont enga una mezcla de car bohidr at os.

Cuando se inocula una bat er ía no es necesar io obser var enf or ma apreciable el inóculo en cada uno de los t ubos. Unsolo inóculo espeso t omado de cult ivo cont iene millones debact er ias que son suf icient es par a inocular cada t ubo conun número apreciable de bact er ias necesar ias par a que seproduzca el met abolismo.

# I noculación de medios sólidos (t ubo): Pico de f laut a ocola de pescado

a) Por punción (picadur a)b) Por est r íac) Por punción y est r ía



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Los picos de f laut a (planos inclinados) de agar se inoculande la siguient e f or ma: pr imer o se at r aviesa t odo el f ondodel agar con el asa r ect a de inoculación, est o cuando seanecesar io ya que no t odos los medios lo r equier en,post er iorment e ést e se r et ir a con un movimient o en S at r avés del agar que se disemina el inóculo. Se ut iliza el asar ect a.

Las t emper at ur as ópt imas de incubación de las bact er iasson dif erent es. En laborat or ios pequeños donde esprobable que los recur sos sean limit ados, puede no serposible pr opor cionar t odas las t emper at ur as ópt imas par ael cr ecimient o de la t ot alidad de los aislamient os clínicos.La mayor ía de los micr oor ganismos ut ilizados en ellaborat or io así como los aislados de muest r a clínicascr ecen a una t emper at ur a de 35° C, por ende se debemant ener la incubadora a 35 – 37°C.

El cr ecimient o de muchas bact er ias se increment a con una

at mósf era de 5-7 % de CO2. Si solo se dispone de unaincubadora con air e ambient e sin CO2 los t ubos y placaspar a cult ivos pueden colocar se en una j ar r a con una velaencendida y cer r ar lo mej or posible la j ar r a.



31

La int erpret ación de los cult ivos pr imar ios después de 24 –48 horas de la incubación requiere de la observación oanálisis de la mor f ología colonial. La evaluación debe ser de lasiguient e f or ma:

1. Obser var las car act eríst icas y el número r elat ivo decada t ipo de colonia recuper ado en medios de agar .

2. Det erminar la pur eza,coloración de Gram ymorf ología de lasbact er ias en cada t ipode colonia.

3. Observar cambios en elmedio que rodea las colonias, que r ef lej an act ividadesmet abólicas específ icas de las bact er ias recuper adas.

La evaluación de las car act er íst icas macr oscópicas de las

colonias habit ualment e se lleva a cabo por medio de lainspección visual del cr ecimient o en la super f icie de lasplacas de agar .

Figura 11. Agar BCYE



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La int erpret ación de los cult ivos pr imar ios se lleva a cabosost eniendo la placa en la mano y observando la super f iciedel agar en busca de cr ecimient o bact er iano.

Colonias punt if or mes de bact er ias que crecen lent ament e,pueden pasar se por alt o ent r e colonias más grandes enpar t icular si el cr ecimient o t iene t endencia a diseminar sesobr e la super f icie de la placa.

Dur ant e el examen las placas deben inclinar se en diversas

dir ecciones, con una iluminación dir ect a br il lant e, de modoque la luz se r ef lej e desde var ios ángulos. Las placas deagar sangre t ambién deben examinar se con t r ansiluminacióncon una luz br il lant e desde det r ás de la placa par a det ect arr eacciones hemolít icas en el agar .

La morf ología de las colonias es una de las car act er íst icas

básicas de las bact er ias y es indispensable par a laident if icación pr eliminar .

El t amaño de las colonias bact er ianas es asumiendocondiciones de cult ivo f avor ables bast ant e unif or me det oda una especie.

La f or ma de la colonia viene det erminada por su borde y suespesor. El borde puede ser liso o irregular y aserrado.Cuando el gr osor es mucho mayor en el cent r o,disminuyendo unif ormement e hacia el borde, se dice que lacolonia es elevada.



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La consist encia y t ext ur a de la masa celular t ambién sonr asgos dist int ivos de la morf ología de las colonias. Puedent ener una consist encia desde seca y f r ágil a gr asient a y cr emosa, o viscosa y pegaj osa.

La consist encia viscosa de la colonia es propia de lasbact er ias que t ienen cápsulas. La super f icie de la coloniapuede ser unif or me, lisa y br il lant e, r ugosa y granular , oest r iada y dent ada. Al examinar la con luz t r ansmit ida, la

masa celular puede par ecer de una t ext ur a amor f a ogr anular , y var iar desde casi complet ament e t r anslucida,quizá con un t int e azulado pasando por var ios gr ados deopalescencia, hast a un color blanco o una opacidadamar il lent a.

No t odas las colonias bact er ianas son pigment adas: la

pigment ación es más f r ecuent e ent r e las bact er iasat r óf icas. Debido a que la mayor par t e de los pigment os sonsust ancias car ot enoides, las células pueden apar ecer decolor r oj o, nar anj a o amar il lo.

La dif erenciación con un cr it er io mor f ológico de las coloniases sólo or ient at iva, y par a poder ident if icar una bact er ia se

necesit a un est udio det allado de sus car act er íst icasf isiológicas e inmunológicas.



34

Lect ur a de mor f ología colonial

$

Tamaño: diámet r o en mm.$ For ma: punt if or me, cir cular , f ilament osa, ir r egular ,rizoide.

$ Elevación: plana, sobr e elevada, convexa, pulvonada,umbonada, umbilicada.

$ Margen (borde): ent ero, ondulant e, lobulado, lacerado,f ilament oso, r izado.

$ Color: blanco, amar illo, negro, nar anj a, et c.$ Super f icie: br il lant e, opaca, er izada, r ugosa.$ Tr ansmisión de luz: opaca, t r anslucida, t r anspar ent e.$ Consist encia: cr emosa, seca, mucoide (viscosa),

membr anosa).



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La mayor par t e de las pruebas usadas par a evaluar laact ividad bioquímica o met abólica de bact er ias (por mediode la cual puede hacerse una ident if icación f inal deespecie), se lleva a acabo mediant e el subcult ivo delaislamient o pr imar io en una ser ie de medios dif erenciales,cuyos result ados pueden int erpret ar se después de uno odos días de incubación.

1. FERMENTACI ÓN DE CARBOHI DRATOS

$

Medio de cult ivo: Caldo básico roj o de f enol

Composición:a) Pept ona 10g.b) Ext r act o de car ne 1g.c) Cloruro de sodio 5gd) Agua dest ilada 1000 ml.

e) I ndicador de pH: Roj o de f enol! Ácido: Color amarillo (pH = 6.8)! Alcalino : Color r oj o ( pH = 8.4)! Medio no inoculado: Roj o (pH = 7.4)



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$ Fundament o

La f erment ación es un pr oceso met abólico de oxido-r educciónque ocur r e en un medio ambient e anaerobio y, en lugar deoxígeno, un sust r at o or gánico sir ve como el acept or f inal dehidr ógeno (elect r ones). En los sist emas de pruebabact er iológicos, est e pr oceso se det ect a obser vando cambiosde color en indicador es de pH a medida que se f or manproduct os ácidos.

Las bact er ias que f erment an un hidr at o de car bono son porlo general anaerobios f acult at ivos. Por medio del proceso def erment ación un hidr at o de car bono es degr adado ydescompuest o en dos moléculas de car bono (t r iosas) que sonnuevament e degr adadas en un númer o de compuest os de 1,2, 3 y 4 car bonos. Los product os f inales var ían con cada

especie bact er iana y depende del sist ema enzimát icoexist ent e en la especie y las condiciones del medioambient e.

El más impor t ant e ciclo f erment at ivo de la degr adación dela glucosa es el ciclo de Embden - Meyerhof aun cuandoést e t ambién puede producir se por la der ivación de pent osa

o el ciclo de Ent ner - Duodor of f . Pueden ut ilizarse diversoshidr at os de car bono. La bact er ia usada depende de lasdif icult ades que se pr esent en par a ident if icar un or ganismodet erminado.



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Ut il izando un indicador de pH con un det erminado hidr at ode car bono puede det erminar se si una bact er ia hadegradado el mismo en var ios pr oduct os t erminales,observando un cambio de color visible en el medio.

Bact er iaI ndicador de pH + CHO H2CO2

(aldehídos) glucólisis +cambio de color

$Consist encia del medio

Líquido

$ I noculación

Por dif usión, inóculo denso

$Condiciones de incubación

Tiempo: 24 - 48 horas

Temper at ur a: 35 - 37°CFigura 12. Streptococcus



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$Result ados

$ I nt er pr et ación

Posit iva = Color amar illo (ácido)

Negat iva = Color r osa - r oj izo (alcalina)

Color nar anj a

NEGATIVOMEDIO NO INOCULADO

POSITIVO

Figura 13. Pruebas bioquímicas de Fermentación de Carbohidratos



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$Observaciones

Exist en ocasiones que con algunas especies de bact er ias esnecesar ia la incubación más prolongada, est o se r ecomiendacuando apar ece un color nar anj a, se incuban baj o lasmismas condiciones 24 horas más. Sí aun así se present aest e color la pr ueba se r eport a como negat iva ya que lomás probable es que el micr oor ganismo est é f ormandoproduct os met abólicos que no necesar iament e son por

f erment ación por ello no alcanza el color r oj o esper ado.

El hecho de incubar por 24 horas más es poco práct ico yaque la mayor par t e de las ocasiones se t iene el t iemponecesar io par a la incubación de 24 horas, por ello en est emanual se considera que la pr ueba se t ome como negat iva sipresent a un color nar anj a.

$ Repor t e de result ados

A = ácidoK = alcalino

G = gas



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$ Aplicaciones

$Microor ganismos f erment ador es de car bohidr at os:

• Ferment adores de glucosa: Todos los miembr osde las Ent erobact er iaceae.

• Ferment adores de glucosa y lact osa:

Escherichia coli, Klebsiella y gruposEnterobacter. • Fer ment adores de manit ol: St aphylococcus

aureus • Fer ment ador es de inosit ol: Pr ot eus r et t ger i• Fer ment adores de lact osa: Neisser ia lact amica• Fer ment adores de adonit ol: Pr ovidencia

alcaligenes. • Fer ment adores de inulina: St r ept ococcus

salivar ius y St r ept ococcus sanguis.• Ferment adores de sacar osa: Yersinia

ent erocolit ica.• Fer ment adores de salicina: Listeria

monocyt ogenes.



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$Micr oor ganismos no f erment adores de Car bohidr at os:

• No f erment ador es de lact osa:Ent erobact er ias pat ógenas como Salmonella yShigella.

• No f erment ador es de manit ol: St aphylococcusepidermidis.

• No f erment adores de salicina: Especies de

Cor ynebact er ium.• No f erment ador es de r af inosa: Ot r as especies

de Aer omonas.• No f erment ador es de inosit ol: Pr ot eus

morganii. • No f erment ador es de adonit ol: Pr ovidencia

stuartii. •

No f erment ador es de inulina: St r ept ococcus del gr upo D.• No f erment ador es de sacar osa: Ot r as

especies de Yersinia.



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2. PRUEBA DE CI TRATO

$Medio de cult ivo: Cit r at o de Simmons

Composición:a) Sulf at o de magnesiob) Monof osf at o de amonio

c) Fosf at o dipot ásicod) Cit r at o de sodioe) Cloruro de sodiof ) Agarg) Agua dest iladah) I ndicador de pH: Azul de br omot imol (pH= 6)

Alcalino: color azul de Pr usia int enso (pH = 7.6)

Medio no inoculado: Color ver de (pH = 6.9)

$ Fundament o

Det ermina si un micr oor ganismo es capaz de ut il izar cit r at ocomo única f uent e de car bono par a el met abolismo ycr ecimient o, pr ovocando alcalinidad.

El medio incluye cit r at o de sodio, un anión como únicaf uent e de car bono y f osf at o de amonio como única f uent ede nit r ógeno.



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Nor malment e el met abolismo del cit r at o compr ende unacondensación de acet ilo con la coenzima A y oxalacet at opar a ent r ar en el ciclo de Krebs. El desdoblamient o delcit r at o comprende un sist ema enzimát ico sin la int ervenciónde la coenzima A. Est a enzima se denomina citritasa ocit r at o desmolasa.

Cit r at o Oxalacet at o + acet at o

Pir uvat o + CO2

Los pr oduct os obt enidos del met abolismo del cit r at odependen del pH del medio:

pH básico:

Cit r at o CO2 + ácido f ór mico + 2 ácido acét ico

pH ácido:

2 Pir uvat o acet at o + CO2 + lact at o

2 Pir uvat o acet oína + 2CO2



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$ Consist encia del medio

Sólido inclinado (pico de f laut a)

$ I noculación

Se t oma una colonia bien aislada de la super f icie del mediode aislamient o pr imar io y se inocula como una est r ía única

en la super f icie del pico de f laut a.

$ I ncubación

Tiempo = 24 - 48 hor as

Temper at ur a = 35 - 37°C

$ Pr ecauciones

El inóculo debe ser liviano.Sí ést e es demasiado gr ande, compuest os orgánicos

pr ef or mados dent r o de la par ed celular de las bact er iasque est án mur iendo pueden liberar suf icient e car bono ynit r ógeno como par a dar un result ado f also – posit ivo.



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Cuando se inocula una ser ie de t ubos de medios de cult ivodif erenciales con un micr oor ganismo desconocido, esimpor t ant e sembr ar pr imero el medio cit r at ado par apr evenir el ar r ast r e de pr ot eínas o car bohidr at os de losot r os medios, aunque se supone se est er iliza el asa en cadainoculación.

$ Result ados

MEDIO NO INOCULADO NEGATIVO

POSITIVOPOSITIVO POSITIVO

Figura 14. Pruebas bioquímicas de citrato



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Posit ivo: Cr ecimient o aunque no exist a cambio de color .Cr ecimient o y el medio de color azul int enso enpico de f laut a.

Negat ivo: No se obser va cr ecimient o y medio de colorverde.

Si se ut iliza car bono a par t ir de cit r at o de sodio, t ambiénse ext r ae nit r ógeno del f osf at o de amonio cont enido en elmedio, liber ándose amoniaco. En ocasiones se det ect a uncr ecimient o visible a lo lar go de la línea de siembr a ant esde la apar ición de color . Est e crecimient o visible t ambiénindica r esult ado posit ivo.


Negat ivo (-)

Posit ivo (+)



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$ Aplicaciones

$Micr oor ganismos posit ivos

Especies de:• Salmonella• Arizona• Citrobacter•

Enterobacter• Klebsiella• Ser r at ia licuef aciens• Pseudomonas cepacia

$Micr oor ganismos negat ivos

•

Edwarsiella• Yer sinia ent er ocolít ica • Escherichia coli• Shigella• Yersinia pseudot uberculosis• Ot r as especies de Moraxella• Pr ot eus mor ganii



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3. PRUEBA DE LI CUEFACCI ÓN DEGELATI NA

$Medio de cult ivo: Gelat ina nut r it iva

Composición:a) Ext r act o de car neb) Pept onac) Gelat inad) Agua dest ilada

$ Fundament o

Det erminar la capacidad de un organismo de pr oducirenzimas de t ipo pr ot eolít ico (gelat inasas) que licuan lagelat ina.

Las pr ot eínas que se pr oducen nat uralment e son demasiadogr andes par a ent r ar en una célula bact er iana; por lo t ant o,par a que una célula ut ilice las pr ot eínas, pr imero deben sercat abolizadas en component es más pequeños. Las enzimasexonuclear es de t ipo pr ot elít ico, gelat inasas, sonsecret adas por cier t as bact er ias par a desdoblar a laspr ot eínas y est a capacidad ayuda a la ident if icaciónbact er iana.



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gelat inasasPr ot eína + H2O polipépt idos

Pr ot easas

gelat inasasPolipépt idos + H2O aminoácidos

Pept idasas individuales


Semisólido

$ I noculación

Picadur a en posición ver t ical hast a una prof undidad de 2 -

2.5 cm, inóculo denso.

$ Condiciones de incubación


Temper at ur a: 35 - 37 °CAl t érmino de la incubación se coloca el t ubo en unr ef r iger ador o baño de hielo dur ant e dos hor as par adet erminar si se ha producido o no la digest ión de lagelat ina (licuef acción).



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MEDIO NOINOCULADO

NEGATIVO

$ Result ados


Posit ivo: Medio licuado (est ado líquido)

Negat ivo: Medio sólido

El medio de gelat ina nut r it iva par a punción no es convenient epar a las pr uebas de rut ina de la act ividad de la gelat inasa,

dado que muchas especies requier en una incubaciónprolongada ant es de que apar ezcan muest r as de licuef acción.En los mét odos diagnóst icos de rut ina par a ident if icarbact er ias, la dur ación de la incubación deber á alcanzar unperiodo razonable.

POSITIVO

Figura 15. Pruebas bioquímicas de licuefacción de gelatina



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Posit ivo (+)

Negat ivo (-)

$

Aplicaciones


• St aphylococcus aur eus• St aphylococcus epider midis (lent a) • Ser r at ia liquef aciens•

Serr at ia mar cescens• Pseudomonas aeruginosa • Especies de Flavobact er iumm

$Micr oor ganismos negat ivos

• List er ia monocyt ogenes

Figura 16. Micrococcus



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4. PRUEBA DE LA LECHE CON TORNASOL

$Medio de cult ivo: Medio de leche t or nasolada

Composición:a) Leche descremadab) Agua dest iladac) I ndicador de pH: Tor nasol

! Ácido: Color r oj o (pH = 4.5)! Alcalino: Color azul ( pH = 8.3)! Medio no inoculado: Azul purpúreo (pH = 6.8)

$ Fundament o

Permit e dif erenciar or ganismos sobr e la base de susmúlt iples reacciones met abólicas en un medio láct eo como:f erment ación de lact osa, caseólisis, y coagulación de lacaseína. El t ornasol incor por ado a la leche es un indicador

de pH y de oxidación-reducción que hace que el medio puedaindicar diver sas f unciones met abólicas. La leche cont ienelact osa, caseína, lact albúmina y lact oglobulina, por lo t ant o,un organismo puede most r ar una o var ias pr opiedadesmet abólicas en la leche t ornasolada ayudando así a laident if icación bact er iana:

1. Ferment ación de lact osa2. Reducción del t ornasol3. Formación de coágulo4. Pept onización (digest ión)5. For mación de gas



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1. Fer ment ación de lact osa

Cuando un or ganismo es capaz de f erment ar lact osa,produce pr incipalment e ácido láct ico, con una condiciónácida indicada por el cambio de color del medio que sevuelve r oj o r osado. A veces el ácido but ír ico es el product of inal.

Cier t as bact er ias que f or man álcalis no f erment an

lact osa, per o act úan sobre las sust ancias nit r ogenadas quese encuent r an en la leche liber ando amoniaco, y dando enconsecuencia un pH alcalino que se manif iest a por un colorpúrpura azulado.

Lact osa glucosa + galact osa

ácido láct icoGlucosa ácido pir úvico ácido but ír ico

CO2 + H2

2. Reducción del t or nasol

El t ornasol es un indicador de pH y un indicador deoxidación reducción; algunos or ganismos son capaces der educir el t ornasol a una leucobase.



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3. Formación de coágulo

Las enzimas pr ot eolít icas provocan la hidrólisis de lasprot eínas de la leche lo que da como result ado sucoagulación. La pr incipal enzima r esponsable de la f ormaciónde coágulo es la renina.

La f ormación del coágulo es causada por la precipit ación dela caseína, por la f ormación de ácidos o por la conversión de

la caseína en paracaseína por la enzima renina. La caseína esuna f osf opr ot eína complej a y es la pr ot eína más impor t ant ede la leche.

Formación de un coágulo ácido

La precipit ación de la caseína pr ovocada por los ácidos

or gánicos a par t ir de lact osa en condiciones ácidas produceun coágulo f ir me y gelat inoso que no se separ a de laspar edes del t ubo.

Lact osa ácido láct ico

caseinasaÁc. Láct ico + caseínat o de Ca caseinógeno (pp)



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Formación del coágulo

Ot r a f orma de coágulo es el coaj o, o sea el proceso decoaj ado de la leche por la conversión de la caseína enpar acaseína por las enzimas renina, pepsina o quimiot r ipsinacont enidas en la leche. La renina provoca el cuaj ado de laleche convir t iendo la sal de caseína soluble en unapar acaseína insoluble que es el cuaj o o r equesón.

reninaCaseína paracaseína (pp)

Ca

4. Pept onización (digest ión)

La hidr ólisis de la caseína por la act ividad enzimát icaproduce una conversión f inal del precipit ado caseinógeno enun líquido claro; el proceso se denomina pept onización y semanif iest a por una aclaración acuosa del medio causada poruna digest ión del pr ecipit ado (coágulo) y las pr ot eínas de laleche por las enzimas pr ot eolít icas de las bact er ias. Sin

embargo, solo se pr oduce una pept onización cuando labact er ia que se desar r olla en la leche t or nasolada cont ienela enzima prot eolít ica caseinasa.



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5. Formación de gas

Los gases CO2 y H2 se f or man como r esult ado f inal de laf erment ación de la lact osa.


Líquido

$ I noculación

Dif usión


Tiempo: 18-48 horas

Temper at ur a: 35 - 37°C



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$ Result ados


Rojo r osado: ácido; f erment ación de lact osa

Azul purpúreo: No f erment ación de lact osa; sin cambio delindicador de pH.Azul: Alcalino; Ausencia f erment ación de lact osa. Elorganismo at aca las sust ancias nit r ogenadas que seencuent r an en el medio. Blanco: Reducción del t ornasol a una leucobase.Formación de coágulo: Coagulación de la pr ot eína de la

leche.Aclar ación del medio: Digest ión; se a inger ido la prot eína dela leche.Gas: Pr oducción de burbuj as en la campana de Durham.

Medio noinoculado

Fermentaciónde lactosa

Digestión Reducciónde tornasol

CoágulNo fermentaciónde lactosa

Figura 17. Pruebas bioquímicas de leche con torna



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En la t abla de result ados solo se escr ibir án las let r as queapar ecen dent r o del par ént esis.

Roj o r osado (A)Azul purpúreo (SC)Azul (K)Blanco (Red)Coágulo (C)

Digest ión (D)Gas (G)

$ Aplicaciones

Ayuda a la dif erenciación de especies sobr e t odo delgénero Clost r idium .

Sin cr ecimient o:• Clost r idium cochlear ium• C. dif f icile• C. put r ef aciens• C. t et anomorphum• St r ept ococcus equinus

Con cr ecimient o:• St r ept ococcus bovis



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5. PRUEBA DE REDUCCI ÓN DE LA LECHE CONAZUL DE METI LENO

$Medio de cult ivo: Medio de leche con azul demet ileno

Composición:a) Leche descremada deshidr at adab) Agua dest iladac) I ndicador : Azul de met ileno

• I ncoloro : Est ado r educido• Azul : Est ado oxidado; medio no inoculado

(pH=6.4)

$ Fundament o

Permit e dif erenciar or ganismos por su capacidad de r educirel azul de met ileno en un medio con leche. El sist emacit ocr omo oxidasa act iva la oxidación del cit ocr omor educido por el oxígeno molecular que a su vez act úa comoun acept or de elect r ones en el per iodo t erminal del sist emade t r ansf erencia de elect r ones. Cuando exist en condicionesaeróbicas el oxígeno es el acept or f inal del hidr ógeno,

produciendo agua o peróxido de hidr ógeno según la especiebact er iana y su sist ema enzimát ico.



60

Los sust r at os ar t if iciales como el azul de met ileno, puedensust it uir a los acept or es de elect r ones nat ur ales encualquier lugar de la cadena de t r anspor t e de elect r ones,donde act úan como reduct or es del sist ema cit ocr omo.Cuando se agrega el colorant e sint ét ico r educible, azul demet ileno a un medio que cont enga organismosmet abolizant es, los elect r ones producidos por un sust r at ooxidable son desplazados de su ciclo normal, si se pr oduce r educt asa y son ut il izados par a r educir el colorant e.


Líquido

$ I noculación

Dif usión, inóculo denso

(CH3)2NN(CH3)2

N

(CH3)2NN(CH

N

(CH3)2NN(CH

N

S

H

Azul de metileno (estadooxidado, color azul).

Azul de metileno (estadoreducido, incoloro).



61


Tiempo: 18-24 horas

Temper at ur a: 35 - 37°C

$ Result ados


Posit iva: I ncoloro; reducción

Negat iva: Azul; no hay r educción

NEGATIVO POSITIVOMEDIO NOINOCULADO

Figura 18. Pruebas bioquímicas de leche con azul de metileno



62


R = Reducción

(-) = Negat ivo, sin cambio de color

$ Aplicaciones

Est a capacidad enzimát ica se ut il iza f undament alment epar a dif erenciar los ent erococos (especies deSt r ept ococcus del grupo D) de ot r os miembr os del géneroSt r ept ococcus .


Ent erococos (St r ept ococcus del grupo D)

$Micr oor ganismos negat ivosEspecies de St r ept ococcus que por lo general no sonent erococos.

Figura 19. Salmonella



63

6. PRUEBA DE OXI DACI ÓN FERMENTACI ÓN

$Medio de cult ivo: Medio básico de Hugh Leif son,medio O/ F.

Component es:a) Pept ona

b) Cloruro de sodioc) Fosf at o de pot asiod) Hidr at os de car bono (glucosa, lact osa, sacar osa,

malt osa).e) Agarf) Agua dest iladag) I ndicador de pH: Azul de br omot imol

• Ácido : Color amar il lo (pH = 6)• Alcalino : Azul de Pr usia int enso (pH = 7.6)• Medio no inoculado: Verde (pH = 7.1)

Se deben t ener dos t ubos par a est a prueba uno sin sello yot r o con sello de par af ina.

$ Fundament o

Det ermina el met abolismo oxidat ivo o f erment at ivo de unhidr at o de car bono.



64

La ut il ización que una bact er ia hace de los hidr at os decar bono t iene lugar por alguno de dos pr ocesos: def erment ación o de oxidación. Algunas bact er ias son capacesde met abolizar un car bohidr at o solo en condicionesaeróbicas, mient r as que ot r as pr oducen ácido t ant oaeróbica como anaeróbicament e. La dif erencia pr incipalent r e el met abolismo f erment at ivo y oxidat ivo depende de

los r equer imient os de oxígeno at mosf ér ico y de laf osf or ilación inicial. La f erment ación es un pr ocesoanaeróbico que requier e la f osf or ilación inicial de la glucosapreviament e a su degr adación, mient r as que la oxidación, enausencia de compuest os inor gánicos como nit r at o y sulf at o,es un proceso est r ict ament e aeróbico que comprende laoxidación dir ect a de una molécula de glucosa no f osf or ilada

(inicialment e). La f erment ación produce una acidez máselevada que el proceso met abólico oxidat ivo.

El medio OF cont iene una elevada concent r ación decar bohidr at os con una baj a concent r ación de pept ona,produciendo así una condición alcalina que neut r aliza la másliger a acidez producida por un organismo oxidat ivo. El

f osf at o de pot asio agr egado al medio f avor ece laf erment ación y act úa como buf f er par a cont r olar el pH. Laconcent r ación de agar empleado per mit e t ambién ladet erminación de la movilidad y ayuda a la dist r ibución port odo el t ubo del ácido pr oducido en la super f icie del medio.



65

Son necesar ios dos t ubos de cada medio de hidr at os decarbono par a la pr ueba. El medio en un t ubo se expone alair e, el ot r o se cubr e con aceit e mineral o par af ina líquidaest ér iles. Las bact er ias oxidat ivas pr oducen ácidos solo enel t ubo abier t o expuest o al oxígeno at mosf ér ico; losmicoor ganismos f erment adores pr oducen ácidos en ambost ubos; y las bact er ias no sacar olít icas son iner t es en est emedio, que per manece con un pH alcalino después de laincubación.

La prueba OF t iene algunas limit aciones; los bacilos nof erment ador es de crecimient o lent o pueden no pr oducircambios de color durant e var ios días, y especies que sonpar t icular ment e act ivas sobr e aminoácidos pueden hacerque reacciones ácidas débiles revier t an con el t iempo,conf undiendo la int erpr et ación f inal.


Semisólido (t ambién per mit e la observación de movil idad).

$ I noculación

Picadura, inóculo poco denso. Picar ambos t ubosaproximadament e hast a 0.6 mm de f ondo.



66

MEDIO NO INOCULADO

FERMENTADOR NO OXIDANTE NO FERMENTADOR

OXIDANTE NO FERMENTADOR

$ Condiciones de incubación:


Temper at ur a: 35-37°C

$

Result ados

Figura 20. Pruebas bioquímicas de Oxidación / Fermentación



67

Incubación

Oxidativo

No

fermentador

Fermentador No

oxidativo

No

fermentador

Figura 21. Diagrama de interpretación de la prueba de Oxidación / Fermentación


Amarillo: ácidoBur buj as: GasVerde: alcalino

$ Aplicaciones

1. Fundament alment e par a dif erenciar génerosint est inales no ent ér icos, Gr am negat ivos de la Famil ia

Ent erobact er iaceae.



68

2. Ayuda a la dif erenciación ent r e los géneros de laFamilia Micr ococcaceae.

• Micrococcus oxida glucosa• St aphylococcus f erment an glucosa

3. Ayuda a la ident if icación de Ent erobact er iasFerment adoras de glucosa: Escherichia coliOxidat ivas de glucosa: Pseudomonas aer uginosaNo sacar olít ico: Especies de Moraxella


Met abolismo Tubo

c/ reacción

Tubo sin sello Tubo con sello

Oxidación (O) Abier t o Amar illo (A) Ver de (-)

Ferment ación (F) Cubier t o Amar illo (A) Amar illo (A)Ferment ación (F) Cubier t o Amar il lo (AG) Amar il lo (AG)

Ni f erment aciónni oxidación (- )

Ninguno Azul o ver de (-) Ver de (-)

Fermentación y

oxidación (O+F)

Ambos Amar il lo (A ó

AG)

Amar illo (A Ó

AG)

Tabla 1. Reporte de resultados de O / F



69

6. REACCI ÓN DE LA UREASA

$Medio de cult ivo: Agar ur ea de Chr ist ensen

Composición:a) Pept onab) Clorur o de sodioc) Fosf at o monopot ásicoc) Glucosad) Ureae) Agar

f ) Agua dest iladag) I ndicador de pH: Roj o de f enol

! Ácido: Amarillo (pH = 6.8)! Alcalino : Rojo rosado (pH = 8.4)! Medio no inoculado: Amarillo (pH = 6.8)

$ Fundament o

Det ermina la capacidad de un or ganismo de desdoblar laurea f ormando dos moléculas de amoniaco por la acción de laenzima ureasa produciendo un cambio de color r oj o en elmedio.

La hidr ólisis de la ur ea es cat alizada por la ur easa, par a dardos moléculas de amoniaco. La ur easa es una impor t ant eenzima microbiana vinculada con la descomposición de loscompuest os orgánicos.



70

H2NC=O + 2 HOH CO2 + H2O + 2 NH3 (XH4)2CO2

H2N

Urea


Sólido en pico de f laut a (cola de pescado)

$ I noculación

Est r ía en pico de f laut a (no hacer punción).


Tiempo: 18-24 horas




71

$ Result ados


Posit ivo: Roj o rosado int enso en el pico de f laut a

Negat ivo: Amar il lo


Posit ivo (+)

Negat ivo (-)

MEDIO NO INOCULADO NEGATIVO

POSITIVOPOSITIVO

Figura 22. Pruebas bioquímicas: Urea



72

$ Observaciones

En muchas especies, la reacción posit iva de ureasa sedet ect a pr imero por un cambio de color r oj o en la par t e depico de f laut a, el cual, al pr incipio se vuelve roj o por que laacción alcalina, result ado de la degradación de pequeñascant idades de ur ea, es aument ada por las aminas f ormadasa par t ir de la descar boxi lación oxidat iva de los aminoácidosen la par t e del medio expuest a al air e.

$ Aplicaciones

1. Se usa par a dif erenciar los or ganismos Pr ot eusr ápidament e ur easa posit ivos de ot r os miembr os de lasent erobact er ias, ot r os géneros pueden ser posit ivos

r et ar dados.

- Klebsiella (+) - Escher ichia coli (-)- Pr ot eus (+ rápido)- Providencia (-)

Figura 23. Salmonella typhi



73

8. REACCI ÓN DE VOGES- PROSKAUER (VP)

$Medio de cult ivo: Medio de Clark y Lubs (caldo

RM/ VP)

Composición:a) Polipept onab) Dext r osac) Fosf at o de pot asiod) Agua dest ilada

$ Fundament o

Det ermina la capacidad de algunos or ganismos de pr oducirun pr oduct o f inal neut r o, la acet oína a par t ir de laf erment ación de glucosa.

La reacción de VP se basa en la det ección de acet oína comopr oduct o f inal neut r o der ivado del met abolismo de laglucosa. Ést a es met abolizada en ácido pir úvico,int ermediar io clave en la glucólisis. A par t ir del ácidopir úvico, una bact er ia puede seguir muchas vías. Laproducción de acet oína (pr ecur sor de la pr oducción de 2,3-

but anediol) que es uno de los ciclos par a la degradación dela glucosa en las bact er ias. La f ormación de acet oína ybut ilenglicol es una vía alt ernat iva del met abolismo del ácidopir úvico. Las bact er ias que ut il izan est a vía producen solopequeñas cant idades de ácidos mixt os que son insuf icient es



74

par a disminuir el pH del medio de r oj o de met ilo, lobast ant e como par a producir un cambio de color . Por est emot ivo muchas de las especies de Ent erobact er ias son VPposit ivas, con pocas excepciones son RM negat ivas yviceversa.

El pr imer r eact ivo agregado a una alícuot a incubada es elcat alizador alf a-naf t ol por que ést e act úa comoint ensif icador del color , lo que aument a la sensibilidad de lar eacción sin pér dida de su especif icidad. El segundo

r eact ivo es el KOH que cuando se agrega al medio de VPcont r ibuye a la absorción de CO2. No debe excederse de unvolumen exact o. El KOH r eaccionará con la pept ona dandoun color r osado salmón y con el agregado post er ior de alf a-naf t ol no habr á alt eración del color .

O H

+

C H 3

C O

C H O H

C H 2

C H 3

C O

C H 2

C O

+

C

N H 2

N H

N H R

Alfa-naftol (catalizador)

Acetoína

KOH

O2 OXIDADO

Diacetilo

Núcleo de guanidina

condensaciónColor rojo rosado



75


Líquido

$ I noculación

Dif usión

$

Condiciones de incubación

Tiempo: 24 - 48 hor as


$ React ivos adicionales

a) Alf a naf t ol al 5%, int ensif icador del colorb) Hidr óxido de pot asio 40%, agent e oxidant e

Agregar dir ect ament e los r eact ivos al t ubo después de laincubación en el siguient e or den:

1) 0.6ml de alf a naf t ol2) 0.2ml de KOH3) Agit ar el t ubo suavement e, dej ar r eposar de 10 a

15 minut os ant es de la int erpret ación.



76

$ Pr ecauciones

El or den de adición de los react ivos es impor t ant e, ya que lainversión de incor por ación dará como r esult ado un débilposit ivo o f also negat ivo.

No debe exceder se un volumen exact o de KOH ya que elexceso puede ocult ar una r eacción VP débilment e posit iva.

$

Result ados


Posit ivo: Roj o r osado en la super f icie del medio (presenciade acet oína).

Negat ivo: Amar il lo. Puede f or mar se un color cobr izo per oaún así la reacción es negat iva.

MEDIO NOINOCULADO

POSITIVO

NEGATIVO

Figura 24. Prueba bioquímicas de la reacción de Voges - Proskauer



77


Posit ivo (+)Negat ivo (-)

$ Aplicaciones

$

Micr oor ganismos posit ivos

- Klebsiella pneunoniae- Yersinia ent er ocolit ica

$Microorganismosnegat ivos

-Escher ichia coli -K. ozaenae

Figura 25. Escherichia coli



78

9. REACCI ÓN DE ROJO DE METI LO (RM)

$Medio de cult ivo : Medio de Clark y Lubs (caldo RM/ VP)

Composición:e) Polipept onaf) Dext r osag) Fosf at o de pot asio

h) Agua dest iladai) I ndicador : r oj o de met ilo

PH inicial = 6.9, medio no inoculado, color r oj o.Ácido: roj o (pH = 4.4)Alcalino: amar il lo (pH = 6)

$ Fundament o

Comprobar la capacidad de un organismo de producir ymant ener est ables los pr oduct os t erminales ácidos de laf erment ación de la glucosa y vencer la capacidadamort iguadora del sist ema. Es una prueba cuali t at iva de la

pr oducción de ácido (det erminación de pH). Las bact er iasque pr incipalment e siguen la vía de f erment ación de ácidosmix t os a menudo pr oducen suf icient e ácido par a mant enerun pH menor de 4.4.



79

La prueba de roj o de met ilo se basa en el empleo de unindicador de pH par a det erminar la concent r ación de ioneshidr ógeno present es cuando un organismo f erment aglucosa. Las bact er ias RM posit ivas producen ácidosest ables mant eniendo una alt a concent r ación de ioneshidr ógeno hast a alcanzar cier t a concent r ación y ent oncescesa t oda act ividad.

Los or ganismos RM negat ivo t ambién producen ácidos perot ienen una menor concent r ación de iones hidr ógeno por que

hay una rever sión hacia la neut r alidad debida a la nuevadegradación de los ácidos orgánicos en car bonat os.

La validez de la prueba de RM depende de un t iempo deincubación suf icient e como par a per mit ir que se produzca ladif erencia en el met abolismo de la glucosa. Los or ganismosen est udio se incubarán por lo menos 2 días, lo que per mit e

que t odos los or ganismos con baj a proporción gaseosamuest r en su límit e en la concent r ación de iones hidr ógeno.


Líquido

$ I noculación

Dif usión



80


Tiempo: 48 horas


$ React ivos adicionales par a Roj o de Met ilo

Roj o de met ilo. Adicionar 5 got as al t ubo previament eincubado.

I nt er pr et ar el r esult ado del color inmediat ament e.

Conser vación: Guar dar el r eact ivo en r ef r igeración (4°C)mient r as no se usa.

$ Result ados

MEDIO NO INOCULADO

POSITIVO

NEGATIVO

Figura 26. Pruebas bioquímicas de la reacción de Rojo de Metilo



81

$ I nt er pr et ación de r oj o de met ilo

No debe int ent ar se int er pr et ar un r esult ado con el r oj o demet ilo después de menos de 48 horas de incubación.

Posit iva: Roj o en la super f icie del medio (pH = 4.4)Algunas bact er ias pueden producir menores cant idades deácido a par t ir del sust r at o por ello es posible que apar ezcaun color nar anja. Est o indica una prueba posit iva.

Negat ivo: Amar il lo (pH = 6) ó nar anj a



$ Aplicaciones

! Micr oor ganismos posit ivos

- Escher ichia coli - Especies de Yersinia

! Micr oor ganismos negat ivos• Ent erobact er aerogenes• Ent erobact er cloacae• Klebsiella

Figura 27.



82

10. PRUEBA DE REDUCCI ÓN DE NI TRATOS

$Medio de cult ivo: Caldo con nit r at oI ngr edient es:

a) Ext r act o de car neb) Pept onac) Nit r at o de pot asiod) Agare) Agua dest ilada

f) PH inicial = 7.0

$ Fundament o

Det erminar la capacidad de un or ganismo de reducir elnit r at o en nit r it os o en nit r ógeno libr e.

La r educción de nit r at o en nit r it o y en gas nit r ógeno t ienelugar generalment e en condiciones anaerobias, en las cualesun or ganismo obt iene su oxígeno del nit r at o. El oxígenosir ve como un acept or de hidr ógeno.

Reducción del nit r at o en nit r it o

NO3 + 2 e 2 H+ NO2 + H2ONitrato nitr i to



83

Nit r at o en nit r ógeno molecular

2 NO3 + 10 e + 12 H+ N2 + 6 H2O

La r educción de nit r at o en nit r it o est á indicada por laapar ición de color cuando el nit r it o reacciona con los dosr eact ivos. La r eacción de color r esult ant e se debe a laf ormación de un compuest o diazoico, p-sulf obenceno-azo-alf a-naf t ilamina.

SO2H NH2

N N

P-sulfobenceno-azo-affa-naftilamina(rojo)

(C6H3NHNH3) – OSO3H

ArilhidracinaÁcido acético

NH2

SO2H NH2

+ HNO2

Ácido sulfanilico(incoloro)

Alfa-naftilamina

SO2H NH2

N N

+ CH2COOHZn



84


Líquido

$ I noculación

Dif usión, inóculo denso.


Tiempo: 18-24 horas

Temper at ur a 35 - 37 °C

Rar ament e es necesar ia una incubación prolongada de hast a5 días. La mayor ía de los organismos capaces de reducir elnit r at o, lo hacen dent r o de las 24 horas.


1. Alf a - naf t ilamina 0.05 %2. Ácido sulf anil ico 0.8 %

Adicionar dir ect ament e al t ubo de reacción en el siguient eorden:

1. Alf a - naf t ilamina 1 ml.2. Ácido sulf anilico 1 ml.



85

Conser vación: Guar dar ambos r eact ivos en el r ef r igeradormient r as no se usan. Por lo general se mant ienen est ablesdur ant e t r es meses.

$ Result ados


Se int erpret an los r esult ados un minut o después de adicionarlos r eact ivos.

Posit ivo: rosa a r oj o int ensoNegat ivo: Amar il lo

POSITIVONEGATIVO

MEDIO NO INOCULADO

Figura 28. Pruebas bioquímicas de Reducción de Nitritos



86

$ Pr ecauciones

Una prueba negat iva indica que los nit r at os, no han sidor educidos o que han sido r educidos a ot r os product os, comoamoniaco, nit r ógeno molecular , oxido nít r ico u óxido nit r osoe hidr oxilamina.

Dado que los react ivos de pr ueba det ect an solo nit r it os, est eúlt imo pr oceso llevar ía a una lect ur a f alsa – negat iva. Porende es necesar io agregar una pequeña cant idad de polvo de

zinc a t odas las reacciones negat ivas.

Los iones zinc reducen nit r at os a nit r it os y la apar ición decolor r oj o después del agr egado de zinc indica una r eacciónposit iva.



$ Aplicaciones

Ayuda a la ident if icación de Ent er obact er ias que por lo

general son posit ivas.

Todas las Ent erobact er ias, con excepción de cier t os t ipos deEnt erobact er agglomerans y especies de Erwinia , reducennit r at os a nit r it os.



87

11. PRUEBA DE FENI LALANI NA DESAMI NASA

$

Medio de cult ivo: agar f enilalanina

Composición:a) D-L-f enilalaninab) Ext r act o de levadur ac) Cloruro de sodiod) Fosf at o de sodio

e) Agarf) Agua dest iladag) PH inicial = 7.3

$ Fundament o

Det ermina la capacidad de un organismo de desaminar laf enilalanina en ácido f enilpir úvico por su act ividadenzimát ica, con la consiguient e acidez r esult ant e.

El aminoácido ar omát ico f enilalanina suf r e una desaminaciónoxidat iva cat alizada por un aminoácido oxidasa par a pr oducirel ácido cet ónico.

La desaminación oxidat iva da como r esult ado la ext r accióndel grupo amino del aminoácido par a f ormar un doble enlacealf a-cet oácido y libr e de amoniaco.



88

Est e es un pr oceso en dos et apas:

1. La ext r acción del hidr ógeno dando un aminoácido y elhidr ógeno se combina con el oxígeno par a f ormar agua.

2. El aminoácido es hidr olizado en un cet oácido

Química de la acción react iva

Como la f enilalanina se encuent r a desaminada, el colorproducido como consecuencia del agregado de clorurof ér r ico al 10 % se debe a la f or mación de un cet oácido el

CH2 CH

NH2

COOH

+ 1/2 O- 2H

FLAVOPROTEÍNA

FENILALANINA

CH2 COOH

O

C

+ NH2

AMONIACO

ÁCIDO FENILPIRÚVICO



89

ácido f enilpir úvico. La r eacción posit iva con est e react ivo sedebe a la f or mación de una hidr azona. El clorur o f ér r icoact úa como agent e quelant e act uando con el ácidof enilpir úvico par a f or mar un color ver de.

Cuando se expone al oxígeno at mosf ér ico un t ubo de cult ivocon f enilalanina después del agr egar el clorur o f érr icoaument a la producción y la int ensidad de la r eacciónposit iva.


Sólido en pico de f laut a

$ I noculación

Est r ía en pico de f laut a, inóculo denso.

CH2 C COOH

O + RNH NH2

CH2 C COOH

N NHR

Ácido fenilpirúvico

Hidracina

Fenilhidrazona



90


Tiempo: 18-24 horas

Temper at ur a 35 - 37°C


Clor ur o f ér r ico 10%

Adicionar de 4-5 got as a un t ubo incubado

Hacer r ot ar suavement e el t ubo par a que el cr ecimient o sesepare.

Esperar de 1 a 5 minut os par a leer la reacción.

Conser vación: Guar dar los r eact ivos en r ef r igeración ycolocar los en f r ascos oscur os par a evit ar ladescomposición.

$ Aplicaciones

Est a act ividad enzimát ica es car act er íst ica de t odas lasespecies de Pr ot eus y del grupo Providencia , y se usa parasepar ar est os dos géneros de ot r os miembr os de lasEnt erobact er ias.



91

$ Result ados


Posit iva: Roj o clar o a int enso en el pico de f laut a.Negat ivo: Amar il lo



MEDIO NO

INOCULADO

POSITIVO

NEGATIVO

NEGATIVO

Figura 29. Pruebas bioquímicas de fenilalanina desaminasa



92

12. PRUEBA DE SULFURO I NDOL MOVI LI DAD(SI M)

$Medio e cult ivo: Medio SI M

Composición:a) Ext r act o de car neb) Pept onac) Hierr o pept onizado (indicador de SH2)

d) Tiosulf at o de sodio (indicador de SH2)e) Agarf) Agua dest iladag) pH = 7.3

$ Fundament o

Det erminar si un organismo es móvil o inmóvil, si es capaz deliberar ácido sulf hídr ico por acción enzimát ica de losaminoácidos que cont ienen azuf r e produciendo una reacciónvisible de color negr o y por últ imo la capacidad dedesdoblar el indol de la molécula t r ipt óf ano, además que laconsist encia del medio per mit e la obser vación de la

movilidad de algunas bact er ias.

1. Pr oducción de ácido sulf hídr ico2. Pr oducción de indol3. Movil idad



93

1. Prueba de ácido sulf hídrico

La prot eolisis de las pr ot eínas en aminoácidos (aa.)individuales, algunas especies bact er ianas son capaces deliberar azuf r e enzimát icament e de los dif erent es aa. quelas cont ienen, produciendo el gas ácido sulf hídr ico (SH2). Lapept ona, cist eína y t iosulf at o, t odos son f uent es de azuf r e,pero las dif erent es especies ut il izan dist int os compuest os oaa. que cont ienen azuf r e par a producir SH2. La enzima

r esponsable de ést a act ividad es la cist einasa.

Primera etapa:

La bact er ia reacciona con el t iosulf at o de sodio por mediode una r eacción de reducción que da un sulf it o y un sulf at o.

Est e es un pr oceso de r espir ación anaeróbica donde elát omo de azuf r e sir ve como acept or de elect r ones par a laoxidación de los sust r at os or gánicos. El t iosulf at or eemplaza al sulf at o como acept or de elect r ones y es unaf uent e de azuf r e par a el organismo.

Segunda etapa:

El gas incoloro SH2 r eacciona con una sal pesada, cit r at of érr ico de amonio par a pr oducir un pr ecipit ado negr oinsoluble, sulf ur o f err oso.



94

Bact er ia (medio ácido) + t iosulf at o de sodio gas SH2

SH2 + iones f érr icos sulf ur o f er r oso (pp. negr o)

Medios para la detección de H2S

$ Agar sulf it o de bismut o$ Agar cit r at o sulf ur o$ Agar desoxicolat o - cit r at o$Medio LI A$Medio TSI

$ Agar acet at o de plomo$ Agar S-S$ Agar XLD$Medio SI M

2. Prueba de la producción de indol

El t r ipt óf ano es un aminoácido que puede ser oxidado porciert as bact er ias par a f or mar t r es met abolit os pr incipales:indol, escat ol e indolacét ico. Diversas enzimasint r acelulares que int ervienen en ést e proceso r eciben el



95

nombr e de t r ipt of anasa, lo que implica el sist ema complet ode enzimas vinculadas con la producción del indol. Elpr incipal int ermediar io en la degr adación del t r ipt óf ano esel ácido indolpirúvico.

La degr adación del t r ipt óf ano liber a indol, ácido pir úvico,amoniaco y energía. El ácido pir úvico puede ser nuevament emet abolizado por medio del ciclo glucolít ico o ent r ar en elciclo de Krebs para liberar CO2 y H2O y una gran pr oducciónde energía. El NH3 puede ser ut il izado par a sint et izar

nuevos aminoácidos empleando la energía que se encuent r apar a la r eacción anabólica.

La prueba de indol se basó en la f ormación de un complej ode color r oj o cuando el indol r eacciona con el grupo aldehídode p-dimet ilaminobenzaldehído (sust ancia act iva delr eact ivo de Kovacs).

La f ormación de indol se produce solament e en aquellosor ganismos capaces de f erment ar los hidr at os de car bono.La elevada acidez producida por la f erment ación de laglucosa puede impedir el cr ecimient o del or ganismo o inhibirla enzima.

El agr egado de t r ipt óf ano est imula la producción de indolmient r as que la glucosa la inhibe.



96

3. Movilidad

Det ermina si un organismo es móvil o inmóvil. Las bact er ias

t ienen movilidad por medio de sus f lagelos, que seencuent r an pr incipalment e ent r e los bacilos; sin embar goalgunas f ormas de cocos son inmóviles.

Las bact er ias móviles pueden cont ener un solo f lagelo omuchos; además su localización varíacon su especie bact er iana y las

condiciones de cult ivo. A veces, lasbact er ias con movilidad producenvar iant es no móviles que par ecen serest ables y rar ament e se revier t en enf or mas móviles.

NH

COOH

NH 2

L - T r i p t ó f a n o

NH

I n d o l

+H 3 C COOH

O

Á c i d o P i r ú v i c o

+ N H 3

A m o n i a c o

T r i p t o f a n a s a

H 2 OD e s a m i n a c i ó n

Figura 30. Salmonella typhi



97

Medios para la det ección de movilidad

1. SI M2. MI O


Semisólido en f or ma ver t ical

$ I noculación

Picadur a en f or ma ver t ical


Tiempo: 24 - 48 hor as

Temper at ur a 35 - 37°C

Los cult ivos que van a somet erse a pruebas de indol deber án

ser incubados aeróbicament e el descenso de la t ensión deoxígeno disminuye la producción de indol.



98


Prueba de indol

React ivo de Kovacs

Adicionar 5 got as y agit ar suavement e el t uboI nt er pr et ar inmediat ament e.

Conservación: Los react ivos deber án guar darse en elr ef r iger ador (4°C) mient r as no se usan, su est abil idad esvar iable, por lo t ant o se har á t odas las semanas un cont r olde calidad, desechándolos si muest r an una r eacción débil onegat iva con un organismo posit ivo conocido.


PRUEBA POSI TI VO NEGATI VOSulf uro + -

I ndol + -Movilidad + -

Tabla 2. Reporte de resultados del medio SIM



99

$ Result ados


1. Ácido sulf hídrico

Posit ivo: Ennegr ecimient o del medioNegat ivo: Sin ennegr ecimient o

MEDIO SININOCULAR

INDOLNEGATIVO

INDOLPOSITIVO

H2SNEGATIVOH2S

POSITIVO GAS

Figura 31. Pruebas bioquímicas del medio SIM



100

2. I ndol

Posit ivo: Anil lo roj o en la super f icie del medio.Negat iva: No se produce colorNegat iva: Color nar anj a en la super f icie del medio. I ndicadesar r ollo de escat ol, un compuest o met ilado que puede serel pr ecur sor de la f or mación de indol.

La r eacción posit iva después de 24 horas indica una pr uebacomplet a.

Si el cult ivo de 24 horas es negat ivo deberá incubarse ot r as24 hor as y repet ir se la pr ueba.

3. Movilidad

Posit iva. Los organismos móviles migran de la línea de siembr ay se dif unden en el medio pr ovocando t ur biedad.

Negat iva. Cr ecimient o bact er iano acent uado siguiendo la líneade siembra.



101

$ Aplicaciones

Bact er ias Producción deH2S

Producción deindol

Movilidad

Salmonella

t yphi + o - - +

Salmonella + o - - +

E. coli - + + o -

Klebsiella - + o - -

Enterobacter - - +

Citrobact er + - +

Shigella - + o - + o -

Tabla 3. Aplicaciones del medio SIM

Figura 33. Escherichia coli Figura 32. Salmonella typhi



102

12. AGAR TRI PLE AZUCAR HI ERRO: TSI

$Medio de cult ivo: Agar hier r o t r iple azúcar (agar hier r ode Kligler , AHK)

Composición:f ) Ext r act o de car neg) Ext r act o de levadur a

h) Pept onai) Pr ot easa j ) Lact osak) Dext r osal) Sulf at o f er r osom) Cloruro de sodion) Tiosulf at o de sodio

o) Agarp) Agua dest iladaq) I ndicador : Roj o de f enol

! Ácido: amarillo! Alcalino: r oj o! Medio no inoculado: nar anj a r oj izo (pH =7.4)



103

$ Fundament o

Det ermina la capacidad de un organismo de at acar un hidr at ode car bono específ ico incor por ado en un medio decr ecimient o básico, con pr oducción o no de gases, j unt o con ladet erminación de posible ácido sulf hídr ico.

El agar AHK es un medio dif erencial que det ermina t ant o laf erment ación de los hidr at os de car bono y la pr oducción deácido sulf hídr ico. Las bact er ias pueden ut il izar cualquier a de

los sust r at os incor por ados en el medio y ser met abolizados,car act er íst icas que son ut il izadas par a la dif erenciación deést as, pr incipalment e par a las Ent erobact er ias.

Est e medio cont iene lact osa con una concent r ación de 1% yglucosa 0.1%, lo cual per mit e la obser vación de laf erment ación de uno o de ambos car bohidr at os por par t e de

las bact er ias, además de la pr oducción de gas y de ácidosulf hídr ico.

La f er ment ación es un proceso que se lleva acabo encondiciones aeróbicas (pico de f laut a) y anaeróbicament e(capa inf er ior). En el pico de f laut a la glucosa (monosacár ido)es cat abolizada inicialment e por medio del ciclo anaeróbico de

Embden-Meyerhof , ut il izado t ant o por los aerobios como porlos anaerobios par a dar ácido pir úvico, y post er iorment e ést eser á degr adado a t r avés del ciclo de Kr ebs par a dar CO2, H2Oy energía.



104

Por ot r a par t e la lact osa (disacár ido) ser á pr imero degr adadaa sus monosacár idos cor r espondient es (glucosa y galact osa).

Bet a-galact osidasaLact osa glucosa + galact osa

Ciclo de Krebs

Glucosa o galact osa CO2 + H2O + energía anaeróbico

El medio TSI cont iene una cant idad limit ant e de glucosa y unaconcent r ación 10 veces mayor de lact osa. LasEnt erobact er ias y los f erment adores de glucosa comienzanmet abolizando est e azúcar , ya que las enzimas que ut ilizan laglucosa est án present es como const it uyent es de las

bact er ias, y ést as pueden obt ener mayor energía porut ilización del azúcar más simple.

Todos los ot r os car bohidr at os deben ser conver t idos englucosa par a ent r ar en el ciclo de Embden-Meyerhof . Laut il ización de la glucosa se r ealiza en f or ma aerobia sobr e laest r ía, donde el oxígeno pr esent e act úa como acept or

t erminal de elect r ones y en la par t e t erminal de la columna encondiciones de anaerobiosis. Una vez que una bact er iaf erment adora de glucosa ha reducido t oda la glucosadisponible a pir uvat o, comenzar á a met abolizar el pir uvat o at r avés del ciclo aeróbico de Kr ebs (sobr e la est r ía), f or mando



105

pr oduct os f inales ácidos. El ácido en el medio hace vir ar elamar il lo del indicador de pH, r oj o de f enol. Ent onces, luego de6 horas de incubación, la zona de la est r ía y el f ondo del t uboinoculado con un f erment ador de glucosa t endr án un coloramar illo. Si el micr oor ganismo no f erment a la glucosa, elf ondo permanecerá r oj o (indicando que no hay var iación delpH) o se alcalinizará (lo que puede visualizarse por un colorr ojo algo más int enso que del medio or iginal), demost r andoque la bact er ia no es miembr o de la f amil iaEnt erobact er iaceae.

Después de haber agot ado la cant idad l imit ada de glucosa,una bact er ia con capacidad par a ut ilizar la lact osa o sacar osacomenzar á a degradar las. Como el medio cont iene 10 vecesmás lact osa que glucosa, las bact er ias encont r ar án sust r at osuf icient e par a cont inuar la f or mación de pr oduct os f inalesácidos. Luego 18 – 24 horas de incubación t odo el medio TSI

per manecerá de color amar illo. Est a reacción se denominaácido sobr e ácido (A/ A) y el organismo se ident if ica como unf erment ador de lact osa. La pr oducción de gas pr ovocar á lar upt ura de la columna de agar o la empuj ar á hacia la par t esuper ior, de modo que un f erment ador de lact osa que pr oducegas dará una r eacción A/ A más gas.

Si el organismo en est udio no es capaz de usar la lact osa delmedio, debe pr oducir energía en f or ma menos ef icient e alut il izar las pr ot eínas y aminoácidos del medio como f uent esnut r it ivas.



106

El met abolismo pr ot eico se pr oduce en la super f icie de lazona inclinada donde el oxígeno es abundant e. Los product osde la degr adación de la pept ona (como el amoniaco) sonalcalinos y pr ovocan el vir aj e del indicador r oj o de f enol a sucolor r oj o or iginal. Un TSI inoculado con una bact er ia que nof erment a la lact osa al cabo de 18-24 hor as de incubaciónpresent ar á la zona inclinada r oj a y el f ondo del agarper manecerá amar illo debido al met abolismo anaerobio de laglucosa dur ant e la pr imera et apa. Est a reacción se denominaalcalina sobr e ácido (K/ A).

Las bact er ias que f erment an la glucosa t ambién puedenf or mar pr oduct os alcalinos a par t ir de la ut il ización de lapept ona, sobr e la zona inclinada. Est as r eacciones ser án K/ K.



$ I noculación

Picadur a y est r ía en pico de f laut a



Temper at ur a: 35 - 37 °C



107

$ Result ados

MEDIO

NO INOCULADO

K/A

A/A

K/K

H2S

GAS

MEDIO

NO INOCULADO

K/A

A/A

K/K

H2S

GAS

Figura 34. Pruebas bioquímicas del medio TSI

Figura 35. Salmonella



108

$ I nt er pr et ación1. Rojo en pico de f laut a: alcalino; degr adación aeróbica de

glucosa.Amar illo en capa prof unda: ácido; degr adación anaeróbica

de la glucosa.2. Amarillo en pico: ácido

Amar illo en capa prof unda: ácido3. Roj o en pico de f laut a: alcalino

Sin cambio de color en capa prof unda: alcalina.4. Pr oducción de H2S: precipit ado negr o

5. Pr oducción de gases: Pr oducción de burbuj as,descomposición del medio, ligera muesca del medio sobr eel cost ado del t ubo o desplazamient o del medio del f ondo,dej ando un espacio libr e.

$ Observaciones

Una bact er ia pr oduct or a de H2S puede dar t al cant idad depr ecipit ado negr o de sulf ur o f err oso que ocult ecomplet ament e la acidez pr oducida en la capa prof unda. Sinembar go, si se f or ma H2S es que exist e en la capa prof undauna condición ácida, aun cuando no se obser ve, y debe serr egist r ada como t al.

Es esencial que se int erpr et e la f erment ación al t érmino de18 – 24 horas de incubación, ya que una int erpret aciónpremat ur a o demor ada dar á f or mas de f erment ación noválidas que llevar án a er r ores en el agr upamient o del géneroo especie.



109


1. K / A (Fer ment ación de glucosa solament e)2. A / A (Ferment ación de glucosa y lact osa)3. K / K (No f erment ación de glucosa y lact osa).

Los result ados se escr iben siempre siguiendo un pat r ón.Pr imer o la reacción del pico de f laut a seguida por la reacciónde la capa prof unda, separ adas por una bar r a.

$ Reacciones de TSI

Pico de f lauta alcalino / prof undidad alcalina (K/ K). Nof erment ación de hidr at os de car bono. Car act eríst ico debact er ias no f erment ador as como Pseudomonas aer uginosa.

Pico de f laut a alcalino / prof undidad ácida (K/ A). Glucosaf erment ada, lact osa no f erment ada. Car act er íst ico debact er ias no f erment adoras de lact osa como especies deShigella.

Pico de f laut a alcalino / prof undidad ácida (negra)(K/ A/ H2S). Glucosa f erment ada, lact osa no f erment ada;

producción de H2S. Car act eríst ico de bact er ias nof erment ador as de lact osa y pr oduct or as de H2S como:Salmonella, Ar izona, Cit r obact er y algunas especies dePr ot eus.



110

Pico de f laut a ácido / prof undidad ácida (A/ A). Glucosa ylact osa f erment adas. Car act er íst ico de colif or mes quef erment an lact osa como: E. coli y grupo Klebsiella- Ent er obact er .

$ Aplicaciones

Est e t ipo de pr uebas se ut il izan pr incipalment e par a laident if icación pr imar ia de los miembr os de lasEnt erobact er ias.

No fermentaciónpH = 7.4 Aminas Péptidos

O2 Pico de f lauta alcalino/ profundidad alcalina

Dextrosa

Ácidos mixtos Aminas Péptidos

Aminas Péptidos

O2

O2

Pico de f lauta ácido/ prof undidad ácidaReacción inicial

O2Aminas Péptidos

Pico de f lauta alcalino/ profundidad ácidaReacción retardada

Pico de f lauta ácido/ prof undidad ácida

DextrosaÁcidos mixtos

Dextrosa + lactosaÁcidos mixtos

No fermentador

No fermentador de lactosa

Fermentador de lactosa (sacarosa)

Figura 36. Fundamento de la Prueba bioquímica TSI



111

Especiebacteriana

Superf icieinclinada

Fondo Gas H2S

Ent erobacter A K + + -

Haf nia K A + -Klebsiella A A + + -E. coli A A + -Shigella K A - -Salmonella

t yphi

K A - +

S. paratyphi K A + -

S.choleraesuis

K A + -

Otras

Salmonellas

K A + + + +

Citrobact er K A + + + +Edwarsiella K A + + + +Serratia K A - -Prot eus

vulgarisK A + + + +

P. mirabilis K A + + + +P. morganii K A - -P. rettgeri K A - -Providencia K A + o - -

Tabla 4. A licaciones de la Pruba con TSI



112

13. Agar lisina hierro: LI A

$Medio de cult ivo: Base de descar boxi lasa de Moller

Composición:a) Pept onab) Ext r act o de car nec) Pir idoxald) L-l isinae) Cit r at o de amonio

f ) Tiosulf at o de sodiog) Glucosah) Agua dest iladai) Agar

j ) I ndicador de pH: Púrpur a de br omocresol! Ácido: color amarillo (pH = 5.2)! Alcalino: color púr pur a (pH = 6.8)

! Medio no inoculado: color púr pur a int ensobr illant e (pH = 6.0)

$ Fundament o

Mide la capacidad enzimát ica de un organismo par adescar boxi lar un aminoácido (lisina y ar ginina) par a f or maruna amina, con la consiguient e alcalinidad.



113

La descar boxilación es el proceso mediant e el cual lasbact er ias que poseen enzimas descar boxilasas específ icasson capaces de at acar a los aminoácidos en su grupocarboxilo dando una amina o una diamina y anhídr idocarbónico. La descomposición de los aminoácidos se produceanaeróbicament e. El proceso de descar boxilación esir r eversible, no oxidat ivo y r equier e una coenzima común, elf osf at o de pir idoxal.

El aminoácido L-lisina suf r e la descar boxi lación par a dar

cadaver ina y CO2 por acción de la enzima específ ica lisina-descarboxilasa.



$ I noculación

Por picadur a y est r ía, inóculo liviano.


Temper at ur a: 35 –37°C

Tiempo: 18 – 24 horas

$ Repor t e der esult ados

A = ÁcidoK = AlcalinoN = Neut r aR = Roj o (desaminación

oxidat iva)



114

$ Result ados

MEDIO

NO INOCULADO

H2S K/K

K/K

K/A

GAS

H2S

MEDIO

NO INOCULADO

H2S K/K

K/K

K/A

GAS

H2S


K/ K = azul de Pr usia / azul de Pr usiaDesaminación oxidat iva / descar boxi lación

K/ A= azul de pr usia / li laNo desaminaciónPr oducción de H2S = Ennegrecimient o del medioPr oducción de gas = Bur buj as o levant amient o delmedio de cult ivo de las par edes del t ubo.

Figura 37. Pruebas bioquímicas con medio LIA



115

$ Aplicaciones

Especie

bacteriana

Superf icie

inclinada

Fondo Gas H2S

E. coli K K o N - o + -

Shigella K A - -

Salmonella

typhi

K K - + o -

S. paratyphi K A + o - - o +

Otras

Salmonellas

K K o N - +

Arizona K K o N - +

Citrobacter K A - o + + o -

Edwarsiella K K - o + +

Klebsiella K K o N + o - -

Enterobact er

cloacae

K A + o - -

E. aerogenes K K o N + -

E. haf niae K K o N - o + -

Proteus

vulgaris

R A - -

P. mirabilis R A - -

P. morgarnii K o R A - -P. rettgeri R A - -

Providencia R A - -

Tabla 5. Aplicaciones de la Prueba Bioquímica LIA



116

13. Movilidad, indol y ornit ina: MI O

$Medio de cult ivo

Composición:a) Ext r act o de levadur ab) Pept onac) L-or nit inad) Dext r osa

e) Agarf ) Aguag) I ndicador de pH: púr pur a de bromocresol! Ácido: color amarillo (pH = 5.2)! Alcalino: color púr pur a (pH = 6.8)! Medio no inoculado: color púr pur a int enso

br illant e (pH = 6.0)

$ Fundament o

El medio MI O se ut il iza par a la ident if icación deEnt erobact er ias sobr e la base de movilidad, la pr oducción deor nit ina descar boxi lasa y de indol.

1. Descar boxi lación de or nit ina 2. Pr oducción de indol3. Movilidad



117

1. Descarboxilación de ornit ina

Mide la capacidad enzimát ica de un organismo par adescar boxi lar un aminoácido (ornit ina) par a f or mar unaamina, con la consiguient e alcalinidad.

La descar boxilación es el proceso mediant e el cual lasbact er ias que poseen enzimas descar boxilasas específ icasson capaces de at acar a los aminoácidos en su grupocarboxilo dando una amina o una diamina y anhídr ido

carbónico. La descomposición de los aminoácidos se produceanaeróbicament e. El proceso de descar boxilación esir r eversible, no oxidat ivo y r equier e una coenzima común, elf osf at o de pir idoxal.

El aminoácido L-lisina suf r e la descar boxi lación par a darcadaver ina y CO2 por acción de la enzima específ ica lisina-

descarboxilasa.

El aminoácido L-ornit ina es descar boxilado por la enzimaor nit ina descar boxi lasa par a dar la diamina put r escina y CO2,producidos en condiciones anaerobias.

2. Prueba de la producción de indol

El t r ipt óf ano es un aminoácido que puede ser oxidado porciert as bact er ias par a f or mar t r es met abolit os pr incipales:indol, escat ol e indolacét ico.



118

Diversas enzimas int r acelulares que int ervienen en ést eproceso reciben el nombr e de t r ipt of anasas, lo que implica elsist ema complet o de enzimas vinculadas con la produccióndel indol. El pr incipal int ermediar io en la degradación delt r ipt óf ano es el ácido indolpír úvico.

La degr adación del t r ipt óf ano liber a indol, ácido pir úvico,amoniaco y energía. El ácido pir úvico puede ser nuevament emet abolizado por medio del ciclo glucolít ico o ent r ar en el

ciclo de Krebs para liberar CO2 y H2O y una gran producciónde energía. El NH3 puede ser ut il izado par a sint et izar nuevosamioácidos empleando la energía que se encuent r a par a lareacción anabólica.

La prueba de indol se basa en la f ormación de un complej o decolor r oj o cuando el indol r eacciona con el grupo aldehído de

p-dimet ilaminobenzaldehído (sust ancia act iva del r eact ivo deKovacs).

La f ormación de indol se produce solament e en aquellosor ganismos capaces de f erment ar los hidr at os de car bono.La elevada acidez producida por la f erment ación de laglucosa puede impedir el cr ecimient o del organismo o inhibir

la enzima. El agregado de t r ipt óf ano est imula la pr oducciónde indol mient r as que la glucosa la inhibe.



119

3. Movilidad

Det ermina si un or ganismo es móvil o inmóvil. Las bact er iast ienen movil idad por medio de sus f lagelos, que seencuent r an pr incipalment e ent r e los bacilos; sin embar goalgunas f ormas de cocos son inmóviles.

Las bact er ias móviles pueden cont ener un solo f lagelo omuchos; además su localización var ía con su especiebact er iana y las condiciones de cult ivo. A veces, las

bact er ias con movilidad pr oducen var iant es no móviles quepar ecen ser est ables y rar ament e se revier t en en f or masmóviles. Los or ganismos no móviles carecen de f lagelos.

Medios para la det ección de movilidad

3. SI M4. MI O


Semisólido en f or ma ver t ical

$ I noculación

Por picadur a, en f or ma ver t ical



120


Tiempo: 24 – 48 horas

Temper at ur a: 35 –37°C

$

React ivos adicionales

Prueba de indol

React ivo de Kovacs

Adicionar 5 got as y agit ar suavement e el t ubo

I nt er pr et ar inmediat ament e.

Conservación: Los react ivos deberán guar darse en elr ef r iger ador (4° C) mient r as no se usan su est abil i dad esvar iable, por lo t ant o se har á t odas las semanas un cont r olde calidad, desechándolos si muest r an una reacción débil onegat iva con un organismo posit ivo conocido.



121

$ Result ados

MEDIO NOINOCULADO

ORNITINA POSITIVOMOTILIDAD NEGATIVO

ORNITINA NEGATIVOMOTILIDAD POSITIVO

INDOLNEGATIVO

INDOLPOSITIVO


1. Ornit ina descarboxilasa

Posit ivo: color púr pur a del medio

Negat ivo: Color amar il lo en el f ondo del t ubo que puede serpúr pur a al f inal.

Figura 38. Pruebas bioquímicas del medio MIO



122

2. I ndol

Posit ivo: Anil lo roj o en la super f icie del medio.Negat iva: No se pr oduce colorNegat iva: Color nar anj a en la super f icie del medio.

I ndica desar r ollo de escat ol, un compuest o met ilado quepuede ser el precur sor de la f or mación de indol.

La r eacción posit iva después de 24 horas indica una

prueba complet a.

Si el cult ivo de 24 hor as es negat ivo deberá incubar seot r as 24 horas y repet ir se la pr ueba.

3. Movilidad

Posit iva. Los organismos móviles migran de la línea desiembr a y se dif unden en el medio provocando t ur biedad.

Negat iva. Cr ecimient o bact er iano acent uado siguiendo lalínea de siembra.

*Se leen las reacciones de movilidad y de or nit inadescar boxilasa ant es de agregar el r eact ivo de Kovacs par ala pr ueba de indol.*



123

$ Repor t e de r esult ados

Prueba Movilidad I ndol Ornit ina

Posit ivo + + +Negativo - - -

$ Aplicaciones

$Micr oor ganismos or nit ina posit ivos

• Especies de Ent er obact er • Pr ot eus mir abil is• Pr ot eus morganii

• Yer sinia ent erocolit ica

$Micr oor ganismos or nit ina negat ivos

• Especies de Klebsiella• Ent erobact er aglomerans• Pr ot eus vulgar is • Pr ot eus r et t ger i• Yersinia pest is• Yersinia pseudot uberculosis

Tabla 6. Reporte de resultados del medio MIO



124

Bact er ias Producciónde indol

Movilidad Producciónde H2S

Salmonellat yphi - + + o -

Otras

Salmonellas

- + + o -

E. coli + + o - -

Klebsiella + o - - -

Enterobacter - + -

Cit robact er - + +

Shigella + o - + o - -

Tabla 7. Aplicaciones de la Prueba bioquímica MIO

Figura 39. Shigella



125

El met abolismo se def ine como una ser ie de reaccionesquímicas que se llevan acabo en el micr oor ganismo de t ipof isiológico par a que se adapt e al medio.

Las f unciones específ icas del met abolismo son cuat r o:

1. Obt ención de ener gía química de las moléculascombust ibles.

2. La conver sión de pr incipios nut r it ivos exógenos ensillar es de const r ucción o precur sor es de loscomponent es macr omoleculares de la célula.

3. El ensamblaj e de est os mat er iales par a f or mar ,prot eínas, ácidos nucleicos, lípidos y ot r oscomponent es celulares.

4. La f ormación y degr adación de las biomoléculasnecesar ias par a las f unciones especializadas de lascélulas.

Anabolismo: Sínt esis de macromoléculas (cápsulas,membr anas, prot eínas, et c).

La biosínt esis de las moléculas orgánicas a par t ir de est os,precisa del consumo de ener gía química apor t ada por el ATPgener ado durant e el cat abolismo.



126

Cat abolismo: Degradación o r ompimient o de moléculasgrandes (glúcidos, lípidos y prot eínas), se degr adan par aproducir moléculas más sencillas.

El cat abolismo va acompañado de la liber ación de la energíaquímica inher ent e a la est r uct ur a de las moléculas orgánicaso nut r it ivas y a su conser vación en f or ma de ATP.

Las células pueden dividir se en dos gr andes gr upos según laf or ma química del car bono que precisan t omar del ent or no:

$ Aut ót r of as: (aut o aliment adas), pueden ut il izar elCO2 como f uent e única de car bono y const r uir apar t ir de él los esquelet os car bonados de t odas susbiomoléculas or gánicas.

$ Het er ót r of as: (aliment adas de ot r os), que no

pueden emplear el CO2 y t ienen que obt ener elcar bono de su ent orno en una f orma r educidar elat ivament e complej a, t al como la glucosa.

El segundo cr it er io por el que pueden clasif icarse las célulases la nat ur aleza de su f uent e de energía:

$ Fot ót r of as. Células que emplean la luz como f uent ede energía.

$ Quimiot r óf as. Las que emplean energía de lasreacciones de oxidación-reducción.



127

• Quimiorganót r of os. Quimiot r óf os que necesit anmoléculas or gánicas complej as como dador eselect r ónicos, t ales como glucosa.

• Quimiolit ót r of os. Or ganismos que pueden empleardadores elect r ónicos inor gánicos sencil los, t alescomo el hidr ógeno, sulf ur o de hidr ógeno, amoniacoo azuf r e.

Los het er ót r of os pueden dividi r se en las siguient es clases:

$ Aerobios. Emplean oxígeno molecular como últ imoacept or de elect r ones en sus dadores elect r ónicosorgánicos.

$ Anaerobios. Emplean como acept or elect r ónico algunaot r a molécula en lugar del oxígeno.

$ Facult at ivos. Células que viven en condiciones ya sean

aeróbicas o anaeróbicas.$ Anaer obios est r ict os. Células que no pueden ut ilizar

el oxígeno en ninguna cir cunst ancia.

Hay dos gr upos pr incipales de bact er ias: las saprof it as, queviven sobr e los cuerpos muer t os de animales y veget ales, ylas simbiont es, que viven en animales o plant as vivas. Las

saprof it as son impor t ant es por que descomponen los cuerposde las plant as y animales muer t os en sus component esesenciales, haciéndolos accesibles par a ser ut il izados comoaliment o por las plant as.



128

Muchas bact er ias simbiont es se encuent r an, en condicionesnormales, en los t ej idos humanos, incluso en el t ubo digest ivoy la piel, donde pueden r esult ar indispensables par a losprocesos f isiológicos. Est e t ipo de relación r ecibe el nombr ede mut ualismo . En el comensalismo , las bact er ias simbiont esobt ienen los nut r ient es de sus huéspedes vivos causándolesun daño consider able. Los par ásit os , el t er cer t ipo, puedenprovocar la dest r ucción de las plant as o de los animales enlos que viven.

Por lo general las macromoléculas son hidrolizadas en elext er ior de la célula por la acción de exoenzimas y sonint r oducidos en la célula en f orma de monómeros o dedímer os.

Las hexosas t r as unos pasos pr evios de t r ansf ormación sonhidr olizados en dos mit ades; los product os de est a hidr ólisis

se convier t en en ácido pir úvico; ést e últ imo ocupa un lugarclave en el met abolismo int ermediar io y const it uye el punt ode par t ida de numerosas vías anabólicas y cat abólicas.

PRODUCCI ÓN DE ENERGÍ A

Las células en cr ecimient o r equieren una provisión const ant ede energía met abólica, en una f orma que pueda ser usadapar a la biosínt esis. El mundo micr obiano ha desar r olladomodelos product or es de energía ext r aor dinar iament e



129

diversos. Algunos de ellos usan donant es de elect r onesinor gánicos y var ios acept or es de elect r ones (oxígeno,nit r at os, sulf at os) par a pr opor cionar energía dest inada af or mar sus pr opios const it uyent es or gánicos a par t ir delCO2.

El f in pr imor dial de la degr adación de los sust r at os consist een obt ener energía (ATP). Las reacciones que vanacompañadas de una obt ención de energía son r eaccionesoxidat ivas. Las células se liber an del car bono oxidado en

f or ma de anhídr ido car bónico, los dist int os micr oor ganismosut il izan dif erent es caminos par a eliminar el hidr ógeno que seva f or mando de manera const ant e (NADH2), est o es, par ar egenerar el NAD. Según sea el acept or f inal de H+ sedif erencian la respir ación, la f erment ación y la respir aciónanaeróbica.

VI AS DE DEGRADACI ÓN DE LAS HEXOSAS

Rut as cat abólicas:

- Glucólisis- Pent osa f osf at o- Ent ner -Duodor of f



130

I . Glucólisis

Se r ef ier e a la degr adación de la glucosa hast a pir uvat o. Laglucólisis puede ocurrir en condiciones aerobias o anaerobias.En aerobiosis generalment e f unciona en conj unt o con el ciclode Kr ebs en el cual el pir uvat o se oxida hast a CO2 y agua. Enanaerobiosis el pir uvat o se lleva a la f erment ación.

En la glucólisis ocur r en dos f osf or ilaciones a nivel del

sust r at o:1) En el paso de 3-f osf oglicer at o a 2- f osf oglicer at o endonde se sint et iza un ATP.

2) En el últ imo paso de la vía, en la t r ansf ormación def osf oenilpir uvat o a pir uvat o, en donde se f or ma ot r oATP.

Secuencia de reacciones en la glucólisis

En conj unt o, la ecuación de la glucólisis par a producir lact at oes la siguient e:

Glucosa + 2 ADP (adenosina dif osf at o) + 2 f osf at o + 2lact at o + 2 ATP (adenosina t r of osf at o) + 2 H2O



131

Aunque las et apas int ermedias implicadas son muchas ycomplej as, una visión simpli f icada podr ía descr ibir el procesocomo:

1. La incor por ación inicial de dos grupos f osf at o dent r ode la molécula de glucosa de seis át omos de car bono.Los gr upos f osf at o los pr oporcionan dos moléculas deATP, mediant e la ut ilización de energía.

2. El compuest o int ermedio de seis át omos de car bono quese f or ma, f r uct osa 1,6-dif osf at o, se r ompe en dos

compuest os más simples, con t r es át omos de carbonocada uno.3. Est os compuest os de t r es át omos de car bono, f osf at o

de dihidr oxiacet ona y glicer aldehído-3-f osf at o, soncada uno met abolizados par a dar pir uvat o, en una víacon numerosos pasos int ermedios. Dur ant e est eproceso, cada uno de los compuest os de t r es át omos de

carbono produce dos moléculas de ATP que seut ilizaron en la et apa 1. Además se pr oducen dosmoléculas del cof act or int ermediar io NADH, las cualespueden ser oxidadas baj o condiciones aerobias, en unar ut a separ ada que r inde seis moléculas de ATP. De est af orma, la glucólisis puede pr oducir seis moléculas deATP por cada molécula de glucosa cuando hay oxígeno

disponible, pero sólo dos moléculas de ATP baj ocondiciones con déf ici t de oxígeno.

4. Las dos moléculas de pir uvat o r esult ant es pueden serut il izadas por el ciclo mit ocondr ial del ácido cít r icodespués de conver t ir se en acet il -CoA produciendo



132

ot r as 30 moléculas de ATP. En resumen, se puedenproducir un t ot al de 36 moléculas de ATP mediant e elmet abolismo complet o de molécula de glucosa baj ocondiciones aerobias, per o sólo dos moléculas de ATPbaj o condiciones anaerobias.

5. Por últ imo, una de las moléculas int ermediar ias de t r esát omos de car bono, el gliceraldehído-3- f osf at o puedeen una r eacción lat eral, conver t ir se en 2,3-dif osf oglicer at o.

Todas las r eacciones del sist ema son f ácilment er eversibles, con la excepción de t r es de ellas: laf osf or ilación de la glucosa cat alizada por la hexocinasa, lade la f r uct osa-6- f osf at o cat alizada por laf osf of r uct ocinasa y la conver sión de f osf oenolpir uvat o enpir uvat o cat alizada por la pir uvat o cinasa.

La coenzima esencial NAD (dinucleót ido de adenina ynicot inamida) es necesar ia par a un pr oceso de conversiónenzimát ica en la f or mación del pir uvat o. Cuando el oxígenoes def icient e, est a coenzima sólo puede r egenerar se porreoxidación del NADH en presencia de oxígeno,produciendo NAD, energía y agua. La glucólisis puedecont inuar en condiciones anaerobias en la f ormación de

lact at o y la r egeneración del NAD, per o a cambio deproducir menos energía por molécula de glucosamet abolizada.



133

GLUCÓLI SI S

Glucosa

Glucosa-6-fosfato

Fructosa-6-fosfato

Fructosa-1,6-bifosfato

3-fosfogliceraldehídoDihidroxiacetona fosfato

2 1,3-bifosfoglicerato

2 3-fosfoglicerato

2 2-fosfoglicerato

2 fosfoenolpiruvato

2 piruvatoATP ADP

ATP ADP

2 NAD 2 NADH

2 PO4

2 ADP 2 ATP

H2O

2 ADP

2 ATP

Es uema 1. Glucólisis



134

I I . Rut a de Ent ner -Duodor of f

• En est a vía se produce sólo una molécula de ATP porcada molécula de glucosa.

• Sus product os f inales son pir uvat o y gliceraldehído-3-f osf at o.

• Est a vía es mucho menos usada por los micr oor ganismosque la rut a de la glucólisis.

• Es más rápida que la glucólisis por la menor cant idad de

r eacciones que se llevan acabo.

En est a vía la glucosa 6- f osf at o suf r e en pr imer lugar unadeshidr ogenación y se convier t e en 6- f osf oglucónico. Por laacción de una 6- f osf ogluconat odeshidr ogenasa se pierde unamolécula de agua y se f or ma ácido 2-cet o-3-desoxi-6-f osf oglucónico (KDPG), el cual se divide por acción de una

aldosa específ ica, en ácido pir úvico y 3- f osf oglicer aldehído.



135

I I I . Hexosa monof osf at o (rut a de pent osas- f osf at o)

Aunque la glucólisis y el ácido del ciclo t r icarboxílico son las

pr incipales vías cat abólicas de la glucosa en la mayor ía de lost ej idos, algunas células poseen vías alt ernat ivas par apr oducir met abolit os út iles a par t ir de la glucosa.

La vía hexosa monof osf at o es de gr an int erés por ser lapr incipal f uent e de NADP r educido en el organismo (el NADPr educido par t icipa en muchas reacciones de sínt esis,

apor t ando sus hidr ógenos).

Est a vía comprende una ser ie de r eacciones est r echament econect adas con la glucólisis, ya que ambos procesos f ormanint ermediar ios comunes.

La vía puede dividi r se en dos f ases:

En la pr imera, la glucosa 6- f osf at o suf r e dos oxidaciones pordeshidr ogenación y una descar boxilación que la t r ansf ormaen una pent osa f osf at o. Se f or ma r ibulosa-5-f osf at o y selibera CO2 y con la f or mación de la r ibulosa 5-f osf at o sepone f in al verdadero proceso oxidat ivo.

En la segunda f ase la r ibulosa-5- f osf at o da lugar a dosisómeros dist int os. Ést a j unt o con la xilosa-5-f osf at o secombina par a f or mar una t r iosa-f osf at o y una hept osa-f osf at o, las cuales a su vez darán una hexosa-f osf at o y unat r iosa f osf at o.



136

En un ciclo que per mit e la oxidación complet a de loscar bohidr at os no par ece oper ar en su f or ma complet a ensist emas micr obianos anaerobios.

En est a r ut a se f orman pent osas y luego est as se r ompen enunidades de 3 y 2 carbonos, dando lugar a lact at o y et anol. Elr endimient o net o en la vía de las HMP es de una molécula deATP por cada molécula de glucosa cat abolizada.

Es la única vía o f uent e de D-r ibosa par a la sínt esis denucleót idos. Se lleva a cabo en el cit oplasma; t odas lasenzimas que int ervienen son solubles.

Es una vía energét ica par a micr oor ganismos aerobiosf acult at ivos.

Sus f unciones met abólicas son diversas per o se r esumen enlo siguient e:

1. Es una vía alt ernat iva de degradación de la glucosa par aobt ener ATP acoplada con la f osf or ilación oxidat iva.

2. Es la f uent e pr incipal, sino la única, de NADPHcit oplasmát ico en células eucar iót icas como f uent e de

poder r educt or , el cual es necesar io par a la biosínt esisde ácidos gr asos y ot r os procesos como la reduccióndel glut at ión, la biosínt esis de est eroides y lasr eacciones de hidr oxilación.



137

3. Es la vía que pr oporciona pent osas f osf at o par a lasínt esis de r ibosa y desoxir r ibosa necesar ias par a labiosínt esis de ácidos nucleicos en general; además par ala sínt esis de hist idina cuyo precur sor es elf osf or r ibosil pir of osf at o, der ivado de la pent osa.

4. Es la vía de degr adación de la r ibosa y la desoxir r ibosa,procedent es t ant o de la digest ión de ácidos nucleicoscomo del r ecambio met abólico de nucleót idos.

5. Es la rut a que conect a el met abolismo de las hexosascon el de ot r os azúcar es, t ales como ar abinosa, y

xilosa, component es est r uct ur ales de glucoprot eínas ypar edes celular es de veget ales, así como pr incipalesf uent es car bonadas de muchas bact er ias. Por ot r o ladola sínt esis de r ibulosa-5-f osf at o, int ermediar io de lavía de las pent osas, es f undament al en las plant asverdes para llevar acabo el ciclo de Calvin.

6. Es la f uent e de un impor t ant e azúcar de cuat r o

car bonos, la er it r osa-4-f osf at o, pr ecur sor par a labiosínt esis de los compuest os ar omát icos en bact er iasy plant as.



138

Glucosa

Glucosa-6-fosfato

5-P-gluconato

Ribulosa-5-P

F r u c t o s a

- 5 -

P

G l i c e r a l d e h í d o

- 3 -

P

E r i t r o s a

- 4 -

P

G l i c e r a a l d e h í d o

- 3 -

P

S e d o h e p t u l o s a

- 7 -

P

X i l u s a

- 5 -

P

N ADP N ADPH

CO2

N ADPH

N ADP

R i b o s a

- 5 - p

F r u c t o s

a

- 5 -

P

G L U C O L I S I S

VÍ A HEXOSA FOSFATO

Es uema 2. Vía Hexosa - fosfato



139

CI CLO DE KREBS

Es el proceso de la r espir ación mediant e el cual, las células

aeróbicas obt ienen energía a par t ir de la oxidación de lasmoléculas combust ibles por el oxígeno molecular .

El ciclo de los ácidos t r icar boxílicos es una secuencia der eacciones que t iene ef ect o en los or ganismos aeróbicos.Est a cat alizada por un sist ema mult ienzimát ico que acept a elgrupo acet ilo del acet il CoA como combust ible degr adándolo

hast a CO2 y H+

. Est os últ imos son conduct or es a t r avés deuna secuencia de pr ot eínas t r anspor t adoras de elect r oneshast a el oxígeno molecular , que se reduce par a f ormar agua.

El pir uvat o ocupa una posición clave en las dif erent es rut asde degr adación de car bohidr at os, es el pr incipal product o dela glucólisis y puede suf r ir una gran var iedad de

t r ansf ormaciones, dependiendo de sí el organismo seencuent r a en un ambient e aerobio o anaeróbico:

1. En aerobiosis el pir uvat o pasa al ciclo de Kr ebs.2. En anaerobiosis puede ser t r ansf ormado en alcoholes oácidos.

Mediant e la descar boxi lación del ácido pir úvico se f or mancompuest os con dos át omos de car bono que se unen acont inuación con la molécula acept ora adecuada (ácidooxalacét ico) y ent r ar a f or mar par t e del ciclo de los ácidost r icarboxi licos (TCC) y mediant e una ser ie de reacciones



140

escalonadas son oxidados hast a anhídr ido car bónico; losát omos de hidr ógeno que se liber an en los pasos que suponenuna deshidr ogenación ent r an a f or mar par t e de la cadenar espir at or ia pr oduct or a de ATP (f osf or ilación oxidat iva).

Sin embar go, ent r e los compuest os int ermediar ios del TCCse encuent r an diversos ácidos orgánicos que const it uyen losproduct os iniciales de var ias cadenas biosint ét icas (ácidoalf a-cet oglut ár ico, ácido f ór mico, ácido oxalacét ico).

El TCC no const it uye únicament e una oxidación t erminal delas sust ancias nut r it ivas sino que es t ambién un gran <<pívot >>y como t al t ambién suminist r a los product os iniciales par a lasínt esis de los compuest os element ales de la célula. Si est osácidos f uesen const ant ement e eliminados del ciclo, no podr íar egenerar se la molécula acept or a y el ciclo se det endr ía.

Mediant e las denominadas r eacciones complement ar ias(secuencias anaplet ór icas) se consigue que el número decompuest os int ermediar ios que se int egr an secundar iament eal TCC iguale a la pérdida que ocasionan los pr ocesosbiosint ét icos.

Oxidación complet a

Se le conoce t ambién como ciclo de los ácidost r icar boxil icos, sir ve par a la oxidación complet a del pir uvat oy const it uye un eslabón clave del met abolismo, ya quemuchos de sus compuest os int ermediar ios pueden aliment ar



141

Piruvato Acetil CoA

oxalacetato

isocitratomalato

fumarato

succinato Succinil CoA

Alf a-cetoglutarato

citrato

NADH NAD

CO2CoA

NADH

NAD

H2O

FAD

FADH2

CoA

CoA

CO2NAD

NADH

NAD

NADH

CO2

CoA

GTP GDP

r ut as de biosínt esis de aminoácidos, pir idinas, t et r apir r olesy lípidos. Comprende la f ase aeróbica de la oxidación de laglucosa y es donde se obt iene un mayor r endimient o deenergía.

Sus product os f inales son: CO2 y H2O. En el pat r ón máscomún el pir uvat o de la rut a glucolít ica se oxida par a daror igen a una molécula de acet il-CoA y CO2 y la acet il-CoA seoxida en el ciclo de Krebs.

El balanceo net o de una molécula de glucosa que se haoxidado por glucólisis primero y luego por el ciclo de Krebses de 38 ATP.

Además de t ener f unciones degr adat ivas, en el ciclo deKr ebs se sint et izan sust ancias que act úan como precur sor esde aminoácidos, pir imidinas y por f ir inas.

CI CLO DE KREBS Esquema 3



142

METABOLI SMO AEROBI O Y ANAEROBI O

Las bact er ias se int egr an en var ios gr upos según el ef ect odel O2, sobr e su cr ecimient o y met abolismo, est aspropiedades son impor t ant es par a la pat ogenia y par a elaislamient o e ident if icación de las bact er ias.

FERMENTACI ONES

En sent ido est r ict o se designan f erment aciones aquellosprocesos de consecución de energía en los que el hidr ógenopasa f inalment e a un acept or orgánico de elect r ones. Eloxígeno no int erviene en los pr ocesos f erment at ivos.

El t érmino f er ment ación hace r ef erencia al met abolismoanaerobio de los hidr at os de car bono.

En la f erment ación el acept or de elect r ones es un compuest oorgánico, mient r as que en la respir ación suele ser el oxigeno(respiración aerobia).

Cier t o número de f erment aciones est án basadas en la víaglucolít ica (Embden Meyerhof ). Est a vía genera ATP dos

veces: pr imer ament e a t r avés de la oxidación delglicer aldehido-3-f osf at o y de nuevo a t r avés de laconver sión del f osf oenolpir uvat o.



143

1. Ferment ación láct ica

Es la f ement ación más simple: Una r eacción en un solo paso

cat alizado por la lact icodeshidr ogenasa ligada a ADN r educeel pir uvat o a lact at o. No se f orma gas. Dado que se consumendos moléculas de ATP en la f or mación de hexosa dif osf at o apar t ir de glucosa y que se producen cuat r o moléculas deATP, el r endimient o net o son dos ATP por hexosa.

La f erment ación homoláct ica que f or ma solament e lact at o.

$ St r ept ococcus lact is$ S. f aecalis$ S. salivarius$ S. pyogenes$ S. cr emor is$ S. t hermophilus

$ S. diacet ilact is$ Lact obacillus lact is$ L. acidophilus$ L. bulgar icus$ L. casei$ L. plant ar um$ L. inulinus



144

Fer ment ación het eroláct ica convier t e solament e cadamolécula de glucosa en lact at o y producen ademáscant idades considerables de et anol, acet at o y CO2.

$ Leuconost oc mesent eroides$ Leuconost oc cir ovorum$ Lact obacillus br evis$ Lact obacil lus vir idescens

C6H12O6 CH3-CHOH-COOH + CH3-CH2OH + CO2

2. Ferment ación alcohólica

El pir uvat o se convier t e en CO2 más acet aldehído que

después se r educe a et anol en una r eacción ligada a NAD.Est a f erment ación es r ar a en las bact er ias como víapr incipal, es más bien car act er íst ica en las levadur as.

Black J.G. 1996

Figura 40. Producción de queso



145

El et anol es uno de los product os más ext endidos ent r e losmicr oor ganismos result ant es de la f erment ación de losazúcar es. Los pr incipales product ores de et anol son laslevaduras (Saccharomyces cerevisiae ); el alcohol aparecet ambién como pr oduct o secundar io de la f erment ación de lashexosas y de las pent osas en diversas bact er ias anaerobias yaerobias f acult at ivas.

La t r ansf ormación del pir uvat o en et anol abar ca dos pasos.En el pr imero el pir uvat o es descar boxilado en una r eacción

cat alizada por la pir uvat odescar boxilasa y en la que par t icipael t iaminpir of osf at o dando acet aldhído, el cual es r educidocon NADH2 por la alcoholdeshidr ogenasa convir t iéndose enet anol.

2 C6H12O6 + H2O CH3-CH2OH + CH3-COOH

+2CO2 + 2 C3H8O3

Figura 41. Producción de vino



146

3. Ferment ación propiónica

Est a vía ext r ae energía adicional del subst r at o. El pir uvat o

es car boxi lado par a pr oducir oxalacet at o, que es reducidopar a proporcionar succinat o y después es descar boxiladopar a pr opor cionar propionat o.

$ Género Pr opionibact er ium$ Clost r idium propionicum$ Selenomonas r uminant ium

La producción de ácido propiónico a par t ir de ácido láct ico seef ect úa de acuerdo a la siguient e reacción:

3CH3-CHOH-COOH 2CH3-CH2-COOH + CH3-COOH+

CO2 +H2O

La r educción del lact at o o del pir uvat o a propionat o se llevaacabo con un complej o biot ina-CO2, el pir uvat o escar boxi lado en pr imer lugar hast a oxalacet at o y ent onces esr educido hast a succinat o pasando por malat o y f umar at o. Elsuccinat o es t r ansf or mado en succinil-CoA de la f or mahabit ual con la par t icipación de ATP y de la CoA,

post er iorment e es t r ansf or mado en met il -malonil-CoA en unar eacción cat lizada por la met il -malonil-CoA- isomerasa y en laque int erviene t ambién la vit amina B12. El succinil-CoA esdescarboxilado y el propionil-CoA es hidrolizado dandopropionat o y CoA.



147

La liber ación de una molécula de CO2 se lleva a cabo conayuda de una t r anscar boxilasa que cont iene biot ina que lot r ansf ier e nuevament e a pir uvat o.

4. Ferment ación ácido mixt a (f órmica)

Es car act er íst ica de las Ent erobact er ias. Est os or ganismosut il izan su sust r at o, par cialment e a t r avés de unaf erment ación láct ica, per o de modo pr incipal a t r avés de unaf erment ación car act er izada por el desdoblamient o del

pir uvat o a f or mat o y acet il CoA, a su vez ést e últ imo generaun ATP.

Pr oducción de gas: El f or mat o pr oducido en est e t ipo def erment ación puede permanecer como t al siempre que el pHsea alcalino. Sin embargo en la mayoría de lasf erment aciones, el pH se acidif ica: al alcanzar se un pH igual

o menor a 6.0 las bact er ias pr oduct or as de gas pr oducen unaenzima, llamada hidr ogenasa f órmica que convier t e el ácidof ór mico en CO2 y H2. Las ent erobact er ias que no f or manest a enzima producen ácido pero no gas.

La f erment ación se lleva acabo con la f ormación de gr annúmer o de compuest os en los que predominan los ácidos

or gánicos; los pr oduct os más impor t ant es de la f erment aciónson el ácido acét ico, f ór mico, málico, láct ico; et anol;glicer ina; acet oína; 2,3- but anodiol, CO2 e hidrógenomolecular.



148

5. Fermentación de met ano: CO2 como aceptor dehidrógeno

Las bact er ias met ánicas (Met hanobact er ium ) son t ambiénorganismos anaerobios obligados. Tr ansf orman los alcoholesy ácidos orgánicos en met ano (CH4) y CO2, con lo que algunosácidos or gánicos son par cialment e oxidados:

CO2 + 4 H2 CH4 + 2 H2O

Se oxidan los ácidos grasos a hidr at os de car bono aexpensas del CO2 a CH4.

6. Ferment ación but ilenglucolíca (acetoína)

El acet aldehído act ivo r esult ant e no es oxidado, si no que secondensa con un pir uvat o. El product o de est a r eacción es

t r ansf or mado en but ilenglicol (but anodiol) en las r eaccionessiguient es, en las que los cuat r o hidr ógenos absorbidosequilibran los hidrógenos liberados en la producción de lasdos moléculas de pir uvat o.

Est a f erment ación al igual que la alcohólica, da soloproduct os neut r os, f or mándose dos ATP por unidad de

glucosa. Se denomina con f r ecuencia f erment ación acet oínicadebido a que con la exposición al air e se oxida par t e delbut ilenglicol que se t r ansf or ma en acet oína, la cual ser econoce con f acilidad con una prueba específ ica: Voges-Pr oskauer .



149

El ácido but ir ico, but anol, acet oína, isopropanol, y ot r osácidos or gánicos son pr oduct os t ípicos de la f erment ación delos hidr at os de car bono que llevan acabo los product oresanaerobios de espor as (Clost r idium ). Dur ant e laf erment ación se f or man cant idades var iables de ácidos,alcoholes, acet ona y gas. Como sust r at os se ut ilizan laglucosa y algunos polisacáridos, ácidos orgánicos y alcoholes.

El ácido but ír ico se f orma por la condensación de dos

moléculas de Acet il CoA, r eacción cat alizada por la enzimat iolasa. El acet il CoA es r educido a cont inuación con NADH2 r eacción cat alizada por la bet a-hidr oxibut ir il-CoA-deshidr ogenasa, una f lavoenzima, dando but ir il-CoA.Mediant e una desacilación se liber a ácido but ír ico.

RESPI RACI ÓN ANERÓBI CA CON ACEPTORESI NORGÁNI COS DE HI DRÓGENO

FI JACI ÓN DE NI TRÓGENO

El nit r ógeno at mosf ér ico se ut il iza en pr imera inst ancia par a

la sínt esis de biomoléculas. Sin embargo sólo un númeror elat ivament e pequeño de bact er ias son capaces de ut il izarel nit r ógeno en est a f or ma. Las bact er ias f ij ador as denit r ógeno r educen nit r ógeno molecular par a sint et izaramoniaco.



150

En cier t a f or ma el sulf at o y el nit r at o act úan comot r anspor t adores de oxígeno el hidr ógeno procedent e delsust r at o los r educe. La capacidad de t r ansf er ir elect r ones alsulf at o o al nit r at o per mit e a las bact er ias oxidar elsust r at o incluso en ausencia de oxígeno molecular y de est af or ma obt ener más energía que por simple f erment ación.

Reducción de nit r at os

La r educción de nit r at os t iene en las bact er ias dos dest inosdif erent es: asimilación y desasimilación.

En el primer caso ocurren una serie de reducciones desdenit r at os hast a nit r it os y amoniaco. Est e últ imo se ut il izapar a la sínt esis de aminoácidos, prot eínas y basesnit r ogenadas, ent r e ot r os compuest os.

En el segundo caso los nit r at os se ut ilizan como acept ores deelect r ones; lo cual ocur r e en la respir ación anaerobia.

NH2OH NH3

NO3 NO2 NO

N2O N2 NITRATO NITRITO

ÓXIDO DENITRÓGENO

ÓXIDONITRÓSO

HIDROXILAMINA AMONIACO

NITRÓGENO



151

REDUCCI ÓN DE SULFATOS

Var ios Compuest os inorgánicos de azuf r e son acept ores deelect r ones en la respir ación anaeróbica.

El sulf at o la f or ma más oxidada del azuf r e, es uno de losaniones pr incipales en el agua de mar y se ut iliza por lasbact er ias r educt or as de sulf at o.

El product o f inal de la r educción del sulf at o es el sulf it o, unimpor t ant e pr oduct o nat ur al que par t icipa en muchosprocesos bioquímicos.

La mayor ía de las plant as y los micr oorganismos ut ilizan elsulf at o como f uent e de azuf r e y obt ienen el sulf ur onecesar io par a la sínt esis de los aminoácidos sulf urados por

r educción asimilat or ia de sulf at o. Como pr oduct o secundar iode est a r educción del sulf at o apar ece el sulf ur o dehidrógeno:

8 H+ + SO4 H2S + 2 H2O + 2 OH

Est as bact er ias r educt or as de sulf at o, t ambién llamadasdesulf at izant es, son f r ent e a los r educt or es de nit r at osorganismos anaerobios obligados y requier en condicionesest r ict ament e anaerobias.



152

El met abolismo de los desulf at izant es es oxidat ivo. Obt ienenla energía por f osf or ilación oxidat iva.

La r educción del sulf at o se inicia en la célula mediant e unaact ivación del sulf at o; por una ATP-sulf ur ilasa seint er cambia el r est o pir of osf at o del ATP con el sulf at o. Elpir of osf at o es hidr olizado por la pir of osf at asa. El adenosin-5-f osf osulf at o (APS) es f inalment e r educido con f or maciónde sulf it o y liberación de AMP.

Ej emplos de micr oor ganismos que reducen elsulf at o:

$ Desulf ovibr io desulf ur icans$ D. vulgaris$ Desulf ot omaculum nigr if icans

$ D. or ient is$ D. ruminis



153

ENTEROBACTERI AS

Las ent erobact er ias más impor t ant es se incluyen en laf amil ia Ent erobact er iaceae, la cual est á const it uida porbacilos Gr am negat ivos. Hay especies móviles e inmóviles.Todas f erment an glucosa con pr oducción de ácido y gas,r educen los nit r at os a nit r it os y dan r esult ado negat ivo en laprueba de indof enol oxidasa. Est a f amil ia compr endebact er ias pat ógenas y no pat ógenas. Conviene recalcar quelas car act er íst icas de pat ogenicidad r elat iva en lasent erobact er ias en su hábit at nat ur al, que es el t r act ogast r oint est inal, se modif ican r adicalment e cuando est as

bact er ias alcanzan una localización ext r a int est inal, en sit ioscomo el t r act o genit our inar io, líquido cef alor r aquídeo,t orr ent e sanguíneo, médula ósea o la cavidad per it oneal.

En vist a de lo ant er ior , es posible aislar y cult ivar miembr osde la f amilia Ent erobact er iaceae t ant o a par t ir de muest r asf ecales y pr oduct os que pudieron haber suf r ido una

cont aminación f ecal como el agua, aliment os, ut ensilios, et c.



154

Es muy impor t ant e recor dar que las muest r as de cualquiert ipo que se envían al labor at or io par a invest igar la pr esenciade est as bact er ias, deben ser colect adas en condicionesasépt icas t r anspor t adas y pr ocesadas con la mayor r apidez,a f in de evit ar alt eraciones de muest r as y pérdida deviabil idad de las bact er ias que se buscan, o cr ecimient oexcesivo de gérmenes banales que pudieran ent orpecer elest udio.

++++-+++----Arizona

++---+-+---Salmonella

-+---+-+-+-Edwardsiella

+------+-+-Shigella

-------+-+-E. Coli

ARGININA

DESC.

LISINADESC.

GELATINA

MOVI LIDAD

UREASH2CITRATORMVPI NDOLOXIDASABACTERIA

------++-+-Provide ncia

--++++++-+-Proteus

vulgaris

-+++--+++--Serratia

-+++--+-+--Enterobacter

-+--+-+-++-Klebsiella

-----+++---Citrobacter

Tabla 8. Características bioquímicas de bacilos Gram negativos



155

COPROCULTI VO En cualquier caso, es impor t ant e cont ar con pr ocedimient osde labor at or io bien cont r olados que permit an det ect ar la

presencia de agent es pat ógenos o bien dar algunainf or mación sobr e alt eraciones en el equil ibr io de la f or manor mal.El esquema que se propone en ést e at las par a aislamient o eident if icación de ent erobact er ias pat ógenas f igur a ent r enumerosas var iant es de t r abaj o ut il izadas por dif erent esaut ores. Se considera que est e esquema es uno de los más

usuales y que puede dar r esult ados consist ent es ysat isf act or ios.

COPROCULTIVOCOPROCULTIVOMEDIOSPARA AI SLAMI ENTO PARA ENRI QUECI MI ENTO PARA I DENTI FI CACI ÓNAgar entérico Hektoen Base de caldo tetrat ionato Agar de hierro y t riple azúcarAgar de eosina y azul de met i leno Caldo de seleni to y cist ina Caldo rojo de fenol y carbohidratosAgar ENDO Medio ureaAgar XLD Medio SIMAgar Salmonella Shigella Agar hierro y lisinaAgar verde brillante Medio MIO

Agar citrato de Simons

AISLAMIENTO

PLACA: Agar EMB

ó ENDO, XLD, MacConkey

IDENTIFICACIÓNBIOQUÍMICA

TSI, MIO, LIA, SIM,fenilalanina,RMVP,Citrato deSimmons, urea

ENRIQUECIMIENTO

TUBOS: Caldotetrationato y/ocaldo s elenito

INCUBACIÓN24 h – 37°C

PLACAS: Agarverde bri llante,sulfitodebismuto,XLD,EMB,

ENDO, MacConkey.

PLACAS: Agar S-S ,verde brillante, sulfito debismuto.

Agar sangre

Esquema 4. Coprocultivo



156

Aislamiento de bacterias patógenas enAislamiento de bacterias patógenas en

hecesheces

Salmonella, Shigella, E. coli, Y. enterocolitica

Materia fecal

Mac Conkey EMB o XLD Sulfito de bismuto Caldo de selenito

Seleccionar colonias lactosa (-) = Salmonella Colonia negra = Salmonella Sulfito de XLD, VBLactantes: colonias lactosa (+ )= E. coli y

Shigella

Cer tifique Y. enterocolit ica Colonia negra Colonia lactosaSalmonella (- ) =

Salmonella

t yphi

Esquema 5. Aislamiento de bacterias patógenas de heces



157

FAMI LI A MI CROCOCACEAE

CARACTERÍ STI CA MI CROCOCCUS STOMATOCOCCUS PLANOCOCCUS STAPHYLOCOCCUS

Racimosirregulares

+ + + +

Tétradas + - - -

Cápsula - + - -

Movilidad - - + -Crecimiento G-f urazolidona

+ - - -

Fermentaciónde glucosa

- + - +

Oxidasa + - Nodesarrolla

-

Resistencia delisostaf ina

R R R S

Glicina depéptido- glicana

- - - +

Ácidosteicoicos enpared celular

- - - +

Tabla 9. Características bioquímicas de la Familia Micrococaeeae



158

ESTAFI LOCOCOS

El est af ilococo es un micr oor ganismo poco exigent e y de

f ácil desar r ollo. En los medios no select ivos sus colonias songrandes, opacas, lisas, cir cular es y ent eras. A veces puedenpresent ar bordes liger ament e ondulados, coloración amar il lao blanca.En agar sangr e las colonias t ienen los car act eresant er iorment e mencionados y pueden además pr esent arhemólisis. La mayor par t e de las cepas vir ulent as son

hemolít icas, f erment an manit ol, r esist en alt asconcent r aciones de clorur o de sodio y generalment eproducen pigment o dorado, aunque ot r as cepas vir ulent as sonblancas car ecen de pigment o.La mej or prueba de vir ulencia es la f acult ad que t iene decoagular el plasma (est af ilococos coagulasa posit ivos).

MEDI OSPARA AI SLAMI ENTO PARA I DENTI FI CACI ÓNAgar S-110 Medio CTAAgar sal y manitol Caldo rojo de fenolA ar de Vo el Johnson Caldo SF

1.Examen directo

2. Siembra

Tinción de Gram

Agar S-110

Agar sal y manitolAgar de Vogel Johnson

3. Frotis

4. Pruebas bioquímicasCoagulasa

CatalasaFermentación demanitol

Susceptibilidad anovobicina

Esquema 6. Aislamiento de Staphylococcus



159

PRUEBA S. aur eus S. epider midis S. saprophyt icus

Pigment o colonial + - 10- 90% cepas +

Coagulasa + - -

Fact or de agregación + - -

Nucleasa t ermoest able + - -Fosf at asa alcalina + + -

Or nit ina descar boxi lasa - 10-90% cepas + -

Ur easa 10-90% cepas + + +

Bet a-galact osidasa - - +

Pr oducción de acet oína + + +Resist encia a novobiocina - - +

Resist encia a polimix ina + + -

Tr ehalosa + - +

Manit ol + - 10- 90% cepas +Manosa + + -

Xilosa - - -

Celulosa - - -

Malt osa + + +Sacar osa + + +

Tabla 10. Características bioquímicas de Staphylococcus



160

ESTREPTOCOCOS

El est r ept ococo puede est ar present e en grandes númeroscomo component es de la f lora nor mal, per o baj o cier t ascir cunst ancias puede est ar asociado con inf ecciones o ser elr esponsable pr incipal de las mismas.

Los est r ept ococos más impor t ant es generalment e pueden

demost r ar se por la pr oducción de hemólisis en los mediosque cont ienen sangr e.

Los St r ept ococcus del gr upo A son bet a hemolít icos y seaíslan gener alment e de exudados f ar íngeos. Sin embargo,ent r e la f lor a exist en diver sos t ipos de est r ept ococos, loscuales pueden ser alf a o bet a hemolít icos es necesar io

ef ect uar ot r as pr uebas par a ident if icar los, t ales como lacomposición ant igénica y la pr ueba de sensibilidad debacit r acina.

En agar sangr e las colonias de est a bact er ia son pequeñas,elevadas, de color blanco a gr is, duras y secas con un haloclaro bien def inido de hemólisis complet a (hemólisis bet a).



161

Especie Susceptibilidadbacitracina

Susceptibilidadoptoquina

Hidrólisishipúrato

Hidrólisisesculina

Crecimientoen bilis

Crecimientoen NaCl6.5%

CAMP Fenómenosatelitismo

Est reptococosbeta-hemolít icos

Grupo AGrupo B

SR

RR

+-

-+

--

-+

-+

--

EnterococosNoenterococos

R

R

R

R

+

-

-

-

+

+

+

-

-

-

-

-

S. viridans R R - - - - - +

S.

pneumoniae R R - - - - -

Tabla 11. Características bioquímicas de Streptococcus



162

UROCULTI VOEl ur ocult ivo debe hacerse cuando hay signos o sínt omas deinf ección ur inar ia, insuf iciencia renal o hiper t ensión.

Llevándolo a cabo siempre en personas en que se sospechainf ección sist émica o que pr esent en f iebr e de or igendesconocido.

Las inf ecciones agudas o cr ónicas pueden af ect ar en f or maascendent e desde la ur et r a hast a los r iñones,especialment e cuando se t r at a de una invasión por la f lor a

nor mal del t r act o genit our inar io que al act uar sobr e elmismo provoca una acción pat ogénica impor t ant e.

MEDIOSPARA AISLAMIENTOAgar sangreAgar EMBAgar S-110Agar sal y manitolAgar Biggy

PARA IDENTIFICACI NTSI, Caldo rojo de fenolUrea, SIM, MIO, LIA, Citratode simmons

PARA SENSIBILIDAD AANTIBIÓTICOSAgar de Mueller HintonAgra soya tripticaseína

Agar sangre,identificación de:

EstafilococosEstreptococosNeumococosObservación dehemólisis

Agar EMBIdentificación de:EnterobacteriasPseudomonasSalmonella yShigella

Tinción de GramAgar S-110 ó saly manitol

Identificación deStaphylococcus yotros Micrococos

AISLAMIENTO EIDENTIFICACIÓN

Orina

Esquema 7. Urocultivo



163

HEMOCULTI VO

En el pacient e con f iebr e, con o sin signos o sínt omas delocalización el hemocult ivo es la pr ueba más út il y más usadapar a demost r ar la f r ecuencia de inf ección sist émica. Lademost r ación de bact eremia es t ambién esencial en lasper sonas en que se sospecha endocar dit is bact er iana.

Es impor t ant e conocer las inf ecciones en las que se pueden

aislar micr oor ganismos de la sangre. Ent r e est os seencuent r an la f iebr e t if oidea, neumonías, meningit is,endocar dit is bact er iana, ost eomielit is, per it onit is, et c.

La posibilidad de obt ener cult ivos posit ivos depende de laet apa de la enf ermedad en que se t ome la muest r a y elgrado de evolución de la misma. En la mayoría de los casos,

por lo general es convenient e t omar var ias muest r as aint ervalos apropiados ya que un solo cult ivo puede serinsuf icient e.



164

EXUDADO FARI NGEO

MEDIOSPARA AISLAMIENTOAgar sangre Agar S-110Agar eosina y azul de metileno Medio de transporte StuartAgar sal y manitol Agar BIGGY

Tinción de Gram

Agar sangre

Agra eosina yazul de metileno

Agra S-110, saly manitol

Agar BIGGY

StreptococcusNeumococos

Enterobacterias

Staphylococcusaureus y otrosMicrococos

Candida albicans

Hemolítico grupo ADisco de bacitracina

Disco de optoquinaSolubilidad de bilis

TSI, LIA, MIO, citrato y urea

Catalasa y coagulasa

Tubos germinales yclamidiosporas

Esquema 8. Exudado faringeo



165

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