1/168

Tema 1 - Microbiologia Clínica (evolución histórica,

conceptos generales, organización de laboratorio)

Microbiología - la ciencia que estudia los seres vivos no visibles al ojo

desnudo(microorganismos; aunque se incluyen metazoos parásitos no microscópicos),

que atribuyen el origen de la vida sobre la tierra y el mantenimiento del equilibrio en la

biosfera (en vida libre como saprofitos o depredadores con distinto grado de

simbiosis => comensalismo, mutualismo o parasitismo), aunque también tienen efectos

negativos como producir enfermedades; Los virus y viroides => parásitos endo-celulares

obligados (no se replica en vida libre); Microbiología medica => estudia a los

microorganismos que afectan al hombre (reino procariota/ bacterias, los eucariotas del

reino Fungí, los virus y viroides); Parasitología => estudia

los eucariotas microscópicas (protozoos) ymacroscópicas (metazoos) de endo o

ectoparásito (los artrópodos estudiados también comovectores y reservorios de

enfermedades transmisibles);

Microbiología medica:

- Microbiología general => se estudia conocimientos históricos, clasificación, estructura

y fisiología de los microorganismos.

- Microbiología especial => se estudia 4 grupos de agentes

infecciosos(bacteriología, virología, micología y parasitología) + recientemente los

viroides (moleculas circulares de ARN de bajo peso molecular que carecen de cubierta

proteica) y los priones(proteínas codificadas por genes celulares y actúan como señales

reguladoras, responsables de algunas enfermedades neurológicas graves - Creutzfeldt-Jacob

y el Kuru)

Evolución histórica de la microbiología - como ciencia especializada no aparece hasta

finales del siglo XIX; cuatro periodos:

2/168

-1º => periodo especulativo (desde la antigüedad hasta los primeros microscopistas)

-2º => desde 1675 hasta la mitad del siglo XIX (descubrimiento de los

microorganismos porLeeuwenhoek en 1675 - constructor de lentes holandes que inventó el

microscópio simple)

-3º => periodo de cultivo de microorganismos hasta finales de siglo XIX (Pasteur y

Kochlogro cristalizar a la Microbiología como ciencia experimental bien asentada.

-4º => desde principios del siglo XX hasta ahora (se

estudian fisiológica, bioquímica, genética, ecológica y surgimiento

de virología, inmunológia.

- Redi, Spallanzani y otros fisicos del siglo XVII demostraron que el microorganismo no se

genera espontaneamente (de novo), postularon la teoría de la biogénesis (ser vivo nace de

otro ser vivo).

- Pasteur (1822-1895) demostró que la fermentación era producida por microorganismos en

crecimiento.

- Se dobló el interes de muchos naturalistas tras la publicación de los libros de Darwin.

- Davaine (1863-1868) encontró grandes cantidades de m.o. en la sangre de las

vacas(bacteridios) y Robert Koch (1843-1910) en 1876 aisló con sus técnicas de cultivo

puro el bacilo de antrax (Bacillus anthracis); mas tarde Koch y su colegas confirmaron que

las esporas son formas diferenciadas y resistentes de bacilos y demostraron que la

enfermedad podía transmitir sucesivamente a ratones sanos inoculándose bacilos obtenidos

de cultivo puro; basados en los postulados su maestro Henle, Koch postuló siguentes

criterios:

- el microorganismo debe estar presente en todos los individuos enfermos

- el m.o. debe poder aislarse del hospedador y ser crecido en cultivo puro

- la inoculación del m.o crecido en cultivo puro a animales sanos debe provocar

la aparición de sintomas específicos de la enfermedad en cuestión (cada enfermedad

infecciosa esta causada por un tipo de bacteria diferente)

- el m.o. debe poder ser re-aislado del hospedador infectado de forma experimental.

Las 2 décadas siguientes, se aislaron una gran variedad de bacterias patógenas; en Francia

elInstituto Pasteur se concentro sobre los procesos infectivos, la inmunidad del hospedador

y la obtención de vacunas (vacuna antirrábica ensayada por Pasteur en 1885, contribuye al

nacimiento de la inmunológia).

Conceptos generales y clasificación - al finales del siglo XIX los microorganismos se

agrupan en un nuevo reino fuera de la teoría de Darwin => Protistas para los protozoos, las

algas microscópicas, los hongos microscópicos y las bacterias como

seres microscópicos;Chatton en 1932 clasifica a los seres vivos en 4 reinos => animalia,

plantae, protistas inferiores o procariotas (bacterias) y protistas superiores o eucariotas

(algas, hongos y protozoos); Whittaker en 1969 agrupa en 5 reinos => animalia, plantae,

fungi, procariotas y protista; Magulis en 1992 los agrupa definitivamente por ahora en 2

superreinos /dominios, 5 reinos y 2 subreinos =>

3/168

- Dominio: procaryotae, 1 reino: monera, subreino: archeobacteria y eubacteria (incluyendo

todas las bacterias divididas en grupos)

- Dominio: eucaryotae, con 4 reinos: protista, fungí, animalia y plantae (incluyendo

protozoos, hongos, algas, animales y vegetales); protista => son unicelulares eucariontes

pero que no cumplen con las características para estar en algún otro reino organismos de

este tipo (p.ej. protozoos)

Diferencias básicas entre los procariotas y los eucariotas:

- célula eucariótica => presenta un núcleo verdadero rodeado por una membrana nuclear

con determinado numero de cromosomas que están constituidos por ADN e

hitonas(proteínas del núcleo); el citoplasma contiene mitocondrias, cloroplastos,

ribosomas y otros orgánulos celulares y todo ello se recubre por una membrana que se

prolonga hacia el interior, organizando unos canales en el que forma el retículo endo-

plasmático (donde se encuentran los ribosomas - responsables de la síntesis de proteínas); la

membrana celular puede o no recubrirse de pared celular (carece de peptidoglicano)

para protección o dar la consistencia a la célula; posee celulosa o quitina.

- célula procariótica => mas primitiva, no esta organizada y no posee

verdadero núcleo (ADN no esta rodeado de una membrana - se encuentra libre); no posee

mitocondrias, sino mesosomas (repliegues de la membrana celular donde se hallan

lasenzimas responsables de la respiración); tampoco hay cloroplastos,

sino cromatóforos(contienen clorofilas); los ribosomas se encuentran pegados a la

membrana citoplasmática que están protegidas por una pared celular (peptidoglicano -

exclusivo de procariotas, aunque arqueo-bacterias y micoplasmas no lo poseen); las arqueo-

bacterias, las eubacterias y los eucariotas se difieren en => la estructura de RNA polimerasa

y en la composicion de los lípidos de su membrana.

4/168

- los virus => un grupo aparte que no se ha integrado en ningún reino y se discute si son o

no seres vivos; es incapaces de reproducirse por si mismos, dependen de un huésped que les

proporcione el mecanismo de la replicación y síntesis de macromoléculas); una vez que han

conseguido esto, salen de la célula infectada produciendo su muerte; hay virus que infectan

a celulas animales, otros a vegetales y otros a bacterias; un virus se define como => un

bloque de material genético rodeado por una cubierta proteica que le sirve

como vehículo de transmisión; algunos pueden llevar una envoltura circundante compuesta

de lípidos y carbohidratos; los viroides (30 especies) => agentes infecciosos (de menor

complejidad genética y estructural conocida) que solo afectan a plantas superiores;

constituidos por 1 cadena de ARN cíclica corta que no codifica proteínas; tamaño 10 veces

menor que los virus (parecen ser una etapa primitiva de los virus); los priones

(proteinceous infectious particle) => partículas patógenas de naturaleza proteica sin acido

nucleico; identificados en 1982, aunque desde el siglo XVIII se sospechaba de su

existencia; las enfermedades "prion" en el hombre (encefalopatías espongiformes

transmisibles) afectan al sistema nervioso y se cree que también a los musculos.

Organización de un laboratorio de microbiologia clínica Estructura (depende del tamaño y características, espacio que dispone y numero de

personal):

1. Áreas/ secciones básicas:

- Sección de toma de muestras

- Sección de recepción y registro de muestras

- Sección de siembra de muestras

- Sección de medios de cultivo

- Área de almacén

2. Áreas/ secciones especializadas:

- Sección de bacteriología (se divide en áreas => urocultivos, coprocultivos y parásitos,

exudados y anaerobios, hemocultivos)

- Sección de micobacterias

- Sección de micología

- Sección de antibióticos

- Sección de serología o inmuno-microbiología

- Otras secciones (virología o biología molecular)

5/168

Normas de seguridad e higiene en el trabajo - tratan de evitar el riesgo de infección al

personal que trabaja en el laboratorio así como su extensión a la comunidad (establecidas

por el CDC/ centro de control de la enfermedad) americano y del instituto nacional de salud

de ese país.

Niveles de seguridad biología:

Nivel 1 => valido para laboratorios de enseñanza que trabajan con microorganismo

no patógenos bien conocidos y patógenos oportunistas:

- las puertas permanecen cerradas mientras se trabaja

- las mesas de trabajo se desinfectan al terminar el trabajo y cuando es necesario

(derrame/contaminación)

- todo material contaminado debe ser esterilizado antes de desecharlo

- no pipetear aspirando con la boca

- no comer, fumar, aplicarse cosméticos, morder los lapices, bolígrafos o tener alimentos en

el laboratorio.

- lavarse las manos después de trabajar con microorganismos y al terminar la jornada (uso

de guantes).

- realizar las técnicas correctamente, evitando la producción de aerosoles.

- llevar bata durante el trabajo que se quitara al salir del laboratorio.

- los materiales que no pueden ser esterilizados en el propio laboratorio, se transportaran en

contenedores cerrados para el traslado hasta su descontaminación; debe existir autoclave

para descontaminar en el mismo edificio.

- deben existir programas de desinfección y desratización

- el diseño del laboratorio debe permitir una fácil limpieza incluso entre los muebles que

deben ser impermeable, resistentes a los ácidos, álcalis y al fuego.

- cada laboratorio debe tener un lavabo.

- si las ventanas se pueden abrir, deben estar protegidas con mosquiteros

Nivel 2 => permite el trabajo con microorganismo de peligrosidad potencial

moderada (hospitales o centros de salud a nivel primario); ademas de las normas del nivel

1, comprende las siguientes:

- es obligatorio el uso de bata o pijamas que no deben usarse fuera del laboratorio,

especialmente en el comedor o cafetería o salidas fuera del edificio.

- las técnicas serologícas con Ags sin capacidad infectante pueden realizarse en las mesas

de trabajo

- el acceso al laboratorio debe estar limitado.

- se deben utilizar guantes en todas las técnicas con productos potencialmente peligrosos o

animales.

- en un accidente de exposición a productos contaminados (derrame, pinchazos), comunicar

inmediatamente al responsable del laboratorio.

- se toma una muestra de suero del personal cuando comienza a trabajar, se archivara como

suero base.

- existirá un manual de normas de seguridad en el laboratorio que todo el mundo debe

conocer y donde se exponga lo que debe hacerse ante un accidente.

- se trabajara con cabinas de seguridad de nivel I, II o III cuando se realicen técnicas que

suponen producción de aerosoles como centrifugación, homogenización de muestras,

siembra o procesamiento de muestras en general.

Nivel 3 => es adecuado para trabajar con microorganismos de alto riesgo y comprende las

normas de los niveles 1 y 2 y ademas:

6/168

- todas las actividades con microorganismo o productos potencialmente patógenos se

realizaran en cabinas de seguridad; ningún trabajo se realizara en las mesas de trabajo.

- se utilizaran batas abiertas por la espalda, que no deben llevarse fuera del laboratorio;

utilizar guantes cuando se trabaja con material contaminado o animales que se desinfectaran

antes de desecharlos; en las habitaciones donde se tienen los animales se

utilizaranmascarillas rígidas.

- en el laboratorio no debe haber plantas o animales que no se utilicen en el trabajo.

- el laboratorio debe estar aislado de la circulación general, existiendo una doble puerta de

entrada con una habitación para cambiarse de ropa y con ducha.

- las superficies y los muebles deben ser de fácil limpieza; las ventanas deben cerrar

hermeticamente; las puertas se cerraran automáticamente.

- cerca de las puerta de salida existirán lavabos que pueden accionar con el pie, codo o

rodilla.

- existirá un autoclave para descontaminar en el propio laboratorio

- existirá un sistema de extracción de aire con circulación del mismo de la puerta de entrada

hacia el interior del laboratorio; regulación de la entrada y salida del aire acondicionado; el

aire de salida de las cabinas de seguridad tipo III saldrá directamente al exterior; el de las

cabinas tipo I y II se elimina directamente al exterior o al sistema general del edificio

pasando previamente por filtros de alta eficacia (HEPA).

Nivel 4 => este nivel solo se establece en laboratorios de experimentación y no en

laboratorios de microbiologia clínica; se necesita este nivel cuando se

manejanmicroorganismos de altísimo riesgo o que son exóticos en ese país, especialmente

virus.

Tema 2 - El Control de calidad de un laboratorio

microbiologia clínica

El control de calidad sirve para:

- Garantizar la fiabilidad de las técnicas que se realizan en el laboratorio

- Asegurar resultados rápidos y útiles

- Estandarizar las técnicas e interpretar correctamente los resultados

- Controlar la calidad de las muestras, estableciendo una buena comunicación con

los clínicos y el personal encargados de obtener muestras

- Aumentar la profesionalidad del personal del laboratorio y la confianza de los clínicos en

los resultados que reciben.

Metodos y áreas de control de calidad 1. Control de calidad de las muestras => se debe controlar desde su obtención, transporte y

procesamiento hasta la emisión de los resultados siguiendo normas elaboradas con criterios

claros de rechazo y establecer horarios fijos de recepción de muestras.

2. Medios de cultivo => deben ser empaquetados correctamente en bolsas cerradas para

evitar la desecación, almacenados correctamente y etiquetados con la fecha de caducidad (a

4ºC dura 8-10 semanas; sin empaquetar a 4ºC dura 2 semanas; los caldos y agar en tubo

con tapón a 4ºC - 6 meses); los que están preparados en el laboratorio, siguen un control

siguiente:

- Control de esterilidad => comprobar con 1 unidad de cada lote (<100) o 3 unidad si es un

gran lote mediante incubación a 37ºC durante 24 horas; si se contaminan, debe rechazarse.

7/168

- Control de crecimiento => se inocula un medio de cada lote con un inoculo reducido

microorganismo control (cepas de colección) que asegure el crecimiento o con un

inoculo estándar.

- Control de medios con características selectivas => se inocula con el germen que no debe

crecer en ello.

- Control de las características bioquímicas => se utiliza un control positivo que produce

la reacción bioquímica esperada.

3. Reactivos de identificación => se deben marcar con la fecha del primer uso y la

caducidad.

- Los reactivos de identificación se deben utilizar siempre con un control positivo y

negativo.

- No deben utilizarse reactivos caducados o cuyo aspecto no sea el adecuado y debe

asegurarse su almacenamiento correcto

- Hay que utilizar siempre el lote o el vial cuya caducidad este mas próxima

4. Cepas control => una colección de cepas de ATCC dispone de prácticamente todos los

microorganismo que se utilizan en controles de calidad.

5. Mantenimiento de las cepas control => se mantiene de manera que no pierdan

sus características típicas.

6. Control de aparatos => se debe mantener una temperatura ambiente en el laboratorio

entre 23-29ºC y la humedad entre 30-50 %; al final de jornada se limpian los superficies con

un antiséptico (fenol 5% o glutaraldehido)

- Limpieza => las neveras y congeladores se limpian y se

descongelan periódicamente (mínimo 1 vez al año); las cabinas de seguridad, centrifugas,

agitadores de tubos se limpian todos los días al acabar el trabajo con antiséptico fenol 5%;

lasestufas y baños se limpian cada 6 meses.

- Temperatura => un control diario de las estufas, baños, neveras y congeladores antes de

empezar el trabajo; se usa un termómetro para cada aparato colocado en el interior del

mismo

- Atmósfera de incubación => se controla la cantidad de CO2 de las estufas con un

indicador que suele estar acoplado con sistema de alarma; se controla

la atmósfera anaerobiamediante catalizadores e indicadores de azul de metileno.

- Cabinas de flujo laminar => un cambio periódico de los filtros y un control de

laslamparas ultravioleta.

- Autoclaves => control de esterilizacion (físico del aparato, químico - tiras y biológico -

esporas)

- Microscopios => se limpian con suavidad al terminar la jornada, taparlos con su funda; se

limpian cada semana los objetivos con alcohol-eter 50%; se realiza periódicamente un

ajuste de condensadores y objetivos.

Tema 3 - Técnicas de

descontaminación, desinfección y esterilización

En todo laboratorio de microbiologia se debe tener en cuenta:

- todo material para la recogida de muestra debe estar esterilizado

- todo material para la realización de las pruebas debe estar estéril

- antes de cualquier esterilización, el material debe estar limpio y/o desinfectado

- conviene utilizar material desechable

- el material de uso aséptico debe guardarse separadamente del uso séptico

- la limpieza de residuos en el suelo, mesas de trabajo y cualquier superficie se realiza

mediante desinfección periódica

8/168

- destreza y formación por parte del personal sanitario de laboratorio (deben trabajar en

condiciones de total asepsia)

- la manipulación de todo material debe seguir el protocolo de trabajo con medidas

cautelares para la prevención de accidentes laborales.

Fases de la manipulación del material del laboratorio - Material desechable (jeringas, guantes, lancetas) => se utiliza una sola vez y se desecha o

se destruye; material punzante o cortante se desecha en recipientes resistentes a la punción;

si no es punzante, se auto-clavar y se tirar en contenedores especiales.

- Material reutilizable (de vidrio, de metal, batas, gorro de tela) después de su utilización se

limpia, se desinfecta o se esteriliza (según los casos)

- Todo instrumento se limpia inmediatamente después de utilizar (según el protocolo de

cada caso), después se desinfecta o se esteriliza directamente para destruir cualquier forma

de vida incluidas formas de resistencia o esporas.

- Materiales no esterilizados (pero si se desinfecta - destruir toda forma de vida patógena)

que se pueden utilizar => portaobjetos para la tinción, frascos lavadores con agua destilada,

frasco de colorantes, etc.

Principios básicos de descontaminación - concepto de

limpieza, desinfección y esterilización

- Limpieza => se separa el material entre los de uso aséptico y séptico, se limpia; los

instrumentos se limpian primero con agua fría (la sangre se adhieren con

calor), después con agua caliente y jabón frotando en los ángulos, se enjuaga y se volverá a

aclarar con agua destilada; se seca y se comprueba su estado; se protege si es necesario.

- Desinfección => materiales o superficies inertes (suelo, mesa), se utilizan

metodos químicos (detergentes, hipocloritos, etc.); desinfección de manos, piel y mucosas

corresponde a técnicas de antisepsia (se aplica tópicamente antisépticos).

- Esterilización => se usa para la reutilización de cualquier material.

Técnicas de descontaminación física A. Tratamientos térmicos por calor seco y húmedo - consisten en

la esterilización o desinfección de los gérmenes por aplicación de calor seco o húmedo.

1. Descontaminación por calor seco (depende de la temperatura, se consigue o no

la esterilización)

- Flameado => exponer un objeto a la llama de un mechero durante un tiempo según el

material de que se trate (p.ej. la asa de siembra)

- Incineración => se usa un horno crematorio para destruir material

desechables(jeringas, catéteres)

- Horno seco => estufas de Pasteur o Poupinel (hornos metálicos de doble pared y bandejas

ajustables) mediante resistencias eléctricas, esterilizan durante 2 horas a 180º o 3horas y

media a 160ºC; tienen termómetro externo que mide la temperatura en el interior y un

selector de temperatura y un reloj;

2. Descontaminación por calor húmedo - Ebullición => se utiliza poco porque no es fiable; introducir el material en agua hirviendo

(100ºC) durante 10 minutos como mínimo; no es un método de esterilización (no destruyen

esporas)

- Autoclave => un recipiente cilíndrico que se cierra herméticamente; externamente lleva

un manómetro que registra la presión en el interior cuando esta en marcha; presenta

una válvula de seguridad que se abrirá espontáneamente cuando la presión interna supere la

elegida o resulte peligrosa, una llave de purga que permite la salida de vapor y un reloj que

selecciona el tiempo deseado con alarma que indica el final del proceso; interiormente hay

una rejilla que se coloca por encima de una resistencia eléctrica cubierta por agua destilada;

9/168

es muy utilizado y se conseguirá esterilización si sometemos el autoclave a

1 atmósfera durante 20 minutos (120ºC); en el se puede esterilizar => material metálico,

cristal, torundas, compresas, paños, batas, plásticos y gomas reutilizables; el

inconveniente=> con el tiempo los objetos metálicos se oxidan.

Técnica => con autoclave apagado y abierto, añadimos agua destilada hasta la rejilla, sin

cubrirla (para que el material que deseamos esterilizar no contacte directamente con el

agua); las piezas pequeñas se colocan en cestas/ cajas; se cierra la tapa y se ajusta a presión;

se abrirá la llave de purga para que permita la salida de vapor y se ajustara

la presión deseada para la esterilización y el tiempo (1 atmósfera - 20 minutos);

se pondrá en marcha el aparato y se espera hasta que salga vapor por la llave de purga; se

cerrara la llave de purga y la presión comenzara a subir hasta llegar al nivel programado; a

partir de aquí comenzara a contar el tiempo de esterilización; una vez realizada

la esterilización se apagara el interruptor del autoclave y se esperara a que

el manómetro baje a 0; cuando la presión este a 0, abriremos la llave de purga para que

salga gran parte del vapor que todavía se encuentra contenido; esto se realizara con cuidado

para evitar descompresiones bruscas que podrían originar la apertura de aquellos recipientes

tapados con algodón graso; una ves comprobado la salida de vapor, se abre la tapa del

autoclave y se extrae el material.

- Tyndalización => método de esterilizaciones consecutivas (repetidas en 3-4 días hasta

que se elimine el germen contaminante); se utiliza cuando existe

una contaminación de algún material o en el propio autoclave; teóricamente no se deben

alcanzar temperatura >100ºC y no se debe abrir el aparato o recipiente que se somete a

tyndalización; objetivo => destruir las esporas cuando germinan y evitar contaminaciones

por microorganismos resistentes.

- Vapor fluente => utilizar el autoclave siguiendo la técnica habitual, pero la llave de purga

abierta, lo que impedirá que se produzca presión y la temperatura nunca sea > 100ºC; es

utilizado para materiales o medios que no deban soportar temperaturas

>100ºC (p.ej. medios muy azucarados, para evitar su caramelización); es poco usado en

microbiologia.

- Uperización => método muy utilizado en la industria alimentaria (tratar el medio a una

temperatura de 149-150ºC durante unos instantes (1-5 segundos). No se alteran las

propiedades del medio y produce esterilización.

- Pasteurización => no es un método de esterilización y es utilizado en la industria

alimentaria (calentar el medio a temperaturas entre 62ºC (15 minutos) y 72ºC (30 minutos);

no destruye las formas de resistencia.

Tratamientos a temperatura ambiente 1. Radiaciones ionizantes - las utilizadas en microbiologia son:

- Rayos ultravioletas => para mantener la esterilidad de superficies y recintos; tienenpoca

penetracion; actúa impidiendo y alterando la duplicación del ADN celular; se debe evitar su

presencia en la piel;

- Rayos gamma => para conseguir esterilización en frió, producidos por isotopos

radiactivos; presentan un poder de penetración muy alto, constituyendo

el método de esterilización mas utilizado a nivel industrial (materiales de uso único o

10/168

desechable p.ej. guantes, jeringas, catéteres, prótesis, válvulas y que pudiera alterarse por

calor)

2. Sistemas de filtración (filtrar a las estructuras que sobrepasen un determinado

tamaño, según el tipo de filtro; la efectividad del filtro es proporcional al tamaño del poro,

pudiendo conseguirse esterilización); presencia de presión, vació y la carga del filtro (+); las

bacterias en medios neutros son (-).

- Filtros de membrana => filtros de celulosa muy purificada y con un tamaño de poro fino

o muy fino; existe desde sistemas sencillos hasta sistemas de piezas desmontables que

llevan acoplada una bomba de vació para ejercer succión sobre el medio a filtrar.

- Filtros de vidrio poroso o de fibra de vidrio => se utilizan en casos específicos y tienen

mas resistencia que los anteriores.

- Filtros de Chamberland => son de porcelana porosa, mas caros que los anteriores y

menos utilizados.

- Filtros de flujo laminar => dispositivos de filtrado donde entra aire contaminado y

sale estéril; utilizados como mecanismo de esterilización en campanas de flujo laminar, en

quirófanos y recinto que pretende crear o mantener un ambiente estéril; flujo => vertical u

horizontal.

11/168

- Ultrasonidos => introducir el material en tanques de distintos tamaños con liquido

desinfectante; una vez puesto en marcha el dispositivo, comienza a vibrar a gran velocidad

originando pequeñísimas burbujas que entran en todos los recodos del material

consiguiendo eliminar los microorganismos; es poco utilizado, caro y poco practico.

Técnicas de descontaminación química 1. Metodos químicos de desinfección (desinfectantes que se aplica sobre objetos y

superficies y antisépticos que se aplica sobre la piel y mucosas); condiciones que cumplir en

un buen método de desinfección:

- matar el mayor numero de gérmenes o al menos todos los patógenos

- ser económico

- no ser corrosivo, toxico ni irritante para los tejidos

- se deberá diluir al menos en agua

- tener un olor agradable

Los mas utilizados:

- Detergentes catiónicos => diluidos al 1% para desinfección de manos; mas frecuente para

limpieza y desinfección de paredes, suelos, ropa y objetos (sin diluir)

- Clorofenoles => muy eficaces y se asocian con los detergentes catiónicos para mejorar el

grado de desinfección.

- Compuestos clorados => para desinfección de superficies, ropas, urinarios; se suelen usar

diluidos en agua (lejias /hipocloritos)

- Acido fenico => diluido al 5% para la limpiar objetos y superficies.

-Amoniaco

Los antisépticos mas utilizados:

- Alcoholes => limpiar y desinfectar la piel, las manos (etanol), el filo de instrumental y

superficies pequeñas (metanol) que no tiene contacto con la piel (p.ej. alcohol

isopropilico70%)

- Mercurio-cromo => contiene mercurio y un buen desinfectante para heridas

superficiales (las mantiene secas y protegidas)

12/168

- Derivados yodados => para preparar la piel antes de una intervención quirúrgica, en

la punción lumbar, antes de punción para hemo-cultivo, etc.; son efectivos y ejercen

su acción por oxidación (p.ej. betadine, ibetane)

Metodos químicos de esterilización - los mas empleados son "Oxido de etileno" => en

forma de gas (10ºC) mezclado con CO2, ya que puro es muy oxidante y podría explosionar

al mezclarse con O2; presenta un gran poder de penetración y es muy efectivo y duradero;

la esterilización se produce a => temperaturas bajas (40ºC) con humedad relativa alta (40-

60%) durante un tiempo de 3-8 horas (media de 5); se

requiere cámaras o instalaciones especificas para ello, son muy caras; el oxido de etileno se

aplica a cualquier material sensible al calor y que no pueda esterilizarse por otros metodos

(p.ej. endoscopia, plásticos termo-lábiles, cauchos, material eléctrico); el material esta listo

para ser utilizado a las 48 horas después de la esterilización; deberá conservarse estéril en el

interior de una bolsa de plástico cerrada por procedimientos termoeléctricos y dura 6 meses.

Control de esterilización - permiten comprobar la eficacia del proceso de esterilización

1. controles de esterilizacion de tipo físico => incluidos en el aparato de esterilizacion

(manómetros - miden presión; vacuo-metros - miden el vació en el

interior; termómetros, gráficos que registran los valores parámetros mas significativos del

proceso: temperatura, humedad, presión, vació, tiempo etc.)

2. controles de tipo químico - comercializados en forma de cinta adhesiva, como

indicadores del proceso de esterilizacion (por encima de la temperatura determinada

cambian de color), fundamentalmente para el control térmico.

3. sistemas de tipo biológico - comercializados en forma de capsulas cerradas en cuyo

interior hay esporas de resistencia a la esterilizacion conocida; dichas ampollas, tras haber

sido sometidas a condiciones de esterilizacion, se incuban a 56ºC (Bacillus strearat-

haemophilus) o a 40ºC (Bacillus subtilis); a cabo de 24-48 horas, se procede a su lectura

donde la germinación y cambio de color indicara si se han producido condiciones de

esterilizacion.

Tema 4 - Toma de muestras (recogida, manejo y

tratamiento)

Selección de la muestra para tener significación diagnostica - representativa del

proceso patológico y cantidad suficiente (p.ej. no es relevante un esputo poco purulento y

contaminado por saliva); recipiente estéril adecuado (para un pus de un absceso =>

anaerobio, estériles);

Procedimiento para la toma de muestras:

- La toma de muestras debe realizarse antes de iniciar el tratamiento ATB (al menos

informar al laboratorio de ATB que esta recibiendo)

- Es muy importante seguir las normas necesarias para evitar la contaminación externa de

las muestras (descontaminar la piel, evitar áreas con flora normal, medio de

cultivo específicos para el patógeno sospechoso)

- La extracción o recogida de las muestras se debe realizarse en el estado adecuado de la

enfermedad (durante la fase aguda o diarreica)

- La cantidad recogida debe ser suficiente y es fundamental que se utilice

unrecipiente estéril y que se envié a laboratorio lo mas pronto posible.

Extracción de sangre para hemocultivos (septicemia)

13/168

La técnica de extracción (se hace en un pico febril > 38,5ºC /antes de la toma de

la siguiente dosis de ATB) => smarch en el antebrazo, escoger la vena antes de

la desinfección (alcohol 70º o clorhexidina alcohólica un área de 5cm - frotando

rigurosamente), yodo-povidona 2% desde el centro hacia afuera en el circulo, dejar secar 1

minuto, ponerse guantes estériles, realiza la extracción , cambiar la aguja antes de inyectar

la sangre en las botellas de cultivo, desinfectar otra vez la piel con alcohol (sensibilidad al

yodo), remitir las botellas de hemocultivos inoculadas inmediatamente; se recomienda 3

muestras de 10 ml (cada extracción para 2 botellas (aerobios y anaerobios) en 24 horas con

intervalo de >1 hora (al menos 2-3 extracciones separadas 30 minutes en 24 horas) en sitios

diferentespara dilucidar un posible contaminante de la piel; en niños es suficiente extraer 1-

5 ml máximo cada extracción; pacientes con tubuladora intravenosa/ catéter, se toma en

la vía mas abajo; se extrae lo mas limpio posible para no incluir bacterias saprofitas de la

piel;los frascos se marcan con etiqueta del paciente, numero de cama y hora de extracción.

Recogida de LCR (el procesamiento inmediato/ urgente) => se recoge insertando un

agua, de forma aséptica, en el espacio sub-aracnoideo a nivel lumbar, se recoge en 3-4

tubos estériles con tapa de rosca (tubo 3º o 4º => recuento celular, 1º y

2º =>microbiológicos y bioquímicos; si solo se llena 1 tubo => microbiologia retirara de

forma aséptica la cantidad necesaria, el resto => citológicos y bioquímicos; el volumen de

muestra es importante (10 ml) para la detección (p.ej.M.tuberculosis y C.neoformans); no se

deben refrigerar (temperatura ambiente o estufa a 37º) excepto para estudios virales se

pueden refrigerarse hasta 24 horas o congelarse a -70ºC si hay una mayor demora; la

muestra bacteriana => turbio (meningococo dentro de leucocitos), virales => transparente;

Recogida de otros líquidos estériles - la aspiración percutánea de liquido sinovial,

pleural, pericárdico y peritoneal se hace de forma aséptica y se inyecta inmediatamente en

un frasco o tubo esterilizadas (transporte anaerobio), antes, se expulsar las burbujas de aire

de la jeringa; se puede añadir una pequeña cantidad de heparina para evitar la coagulacion.

Recogida de muestras del tracto respiratorio superior:

- Exudado faríngeo => se realiza mediante una torunda de algodón, dacrón o alginato de

calcio frotando vigorosamente ambas áreas amigdalinas, la faringe posterior y las zonas

de inflamación, ulceración, exudación o formación de capsulas; la lengua se oprime con un

depresor para reducir al mínimo la contaminación del hisopo con secreciones bucales.

- Exudado nasal => se realiza introduciendo un hisopo profundamente en cada fosa nasaly

rotando suavemente.

Tractor respiratorio inferior - el esputo es una muestra menos relevante por la posibilidad

de la contaminación por saliva; una buena muestra => instruir debidamente al paciente

para lograr una expectoración profunda (ayudarle con fisioterapia respiratoria/

clapping, hidratación o nebulización); pacientes con traquestomías => se

recoge aspirando(en un frasco de Lukens); las secreciones bronquiales se recoge

mediante broncoscopio, instilando una pequeña cantidad de SF estéril en el árbol bronquial

(también puede estar contaminado por flora del tracto superior, aunque es mas relevante que

esputo); una muestra mas profunda se recoge mediante broncoscopio con lavado bronco-

alveolar (BAL) para buscar Pneumocistis carinii y hongos; cepillado bronquial es

una técnica mas agresiva en caso de neumonías por aspiración; muestras de

bacterias anaerobias se recoge por una punción transtorácica, biopsia transbronquial y

pulmonar abierta.

Recogida de heces (se procesa lo antes posible):

- Toma de muestras para coprocultivo - se recoge con un escobillón que se introduce en un

tubo estéril preparado con un medio de transporte adecuado (Cary y Blair) (tubo con una

14/168

cuchara y liquido rojo/transparente; también se puede utilizar frasco de orina estéril; medio

Cary y Blalir mantiene la viabilidad de los patógenos intestinales); basta con impregnar la

torunda en las heces en la parte donde se observa sangre, moco o pus;

- Muestras para estudio parasitológico - se recoge durante 3 días consecutivos, se

guardan en la nevera en un recipientes cerrados para evitar la desecación (temperatura 3-

5ºC); los huevos, las larvas y los quistes de protozoos permanecen viables varios días; la

cantidad de muestra es pequeña (1 cucharilla de café en un frasco con alcohol polivinilico

/PVA 1:3); para investigar oxiuros (parásitos) se utiliza preparación con cita de celofán; se

proporcionan al paciente 6 portaobjetos (se toma durante 6 días consecutivos) con cinta

adhesiva transparente; se toma la muestra a primera hora de la mañana antes de lavarse; se

aplica la cinta sobre los margenes del ano con una suave presión, se retira y se coloca de en

el porta;

Recogida de orina - el frasco estéril no debe abrirse antes de la recogida; las partes

genitalesse lava solo con agua; se recoge a primera hora de mañana para

estudio microbiológico, de forma aséptica, se echa el primer chorro, se recoge la segunda

mitad unos 20-30 ml.

Sondaje vesical (puncion de sonda) y puncion suprapubica - se realiza por el personal de

enfermeria

Recogida de muestra de tracto genital - se utiliza un tubo

con escobillón de algodón como medio de transporte; exudado uretral => el hisopo se

introduce 2 cm dentro de la uretra y se rota suavemente antes de retirarlo (muestras

separadas para el cultivo de gonococos y clamidias o ureaplasmas => se utiliza 2

escobillones,1º para estudio de gonococos 2º para clamidias o ureaplasmas); exudado

cervical => se inserta un hisopo especial (como uretral) en el canal cervical y rotando-

lo y moviendo-lo durante 30" antes de retirar; exudado vaginal => el hisopo se sumerge en

el fornix posterior de la vagina; para aislamiento de gonococos pueden ser transportados en

elmedio de Stuart modificado o en el medio de Amies con carbón en temperatura

ambiente, hasta su inoculación; para aislamiento de clamidias y micoplasmas, el medio

es tampon con sacarosa y ATB; se puede refrigerar si hay demora en el proceso.

Procedimiento para muestras en anaerobiosis - se obtiene mejor con una jeringa y aguja, a

los que debe expulsarse todo el aire.

Transporte de muestras:

- Metodos convencionales => el mas utilizado es hisopos en tubos de plástico que llevan

incorporados diversos medios de transporte que consiste en un agar semi-solido, pH

regulado, carece de nutrientes, pero contiene tioglicolato de sodio como reductor, para

prolongar la viabilidad de los microorganismos cuando exista demora entre la recogida y su

cultivo; los mas utilizados => (1) Medio de Stuart (los exudados faríngeos, conjuntivales,

nasales y heridas) que mantiene un pH favorable e impide la deshidratación de las

secreciones durante el transporte y la oxidación y autodestrucción enzimática de

los patógenos presentes (2)Medio de Cary y Blair (muestras fecales) donde las salmonellas

y las shigelas pueden recuperarse hasta 49 días después de la toma de muestras y Vibrio

cholerae hasta 22 días después.

- Transporte de muestras para estudio en anaerobiosis => cuando la muestra se va a

procesar dentro de 30 minutos, puede servir como transporte una jeringa con una aguja

insertada en un tapón de goma; si la demora va a ser mayor, se usa un tubo /frasco ampolla

lleno de CO2 y libre de O2 con N2/ H2 con indicador en agar o caldo; la muestra liquido se

15/168

inyecta a traves del tapón de goma después de expulsar el aire de la jeringa y aguja;

existe también un hisopo en un tubo anaerobiosis

Envió de muestras (las medidas especiales para un envió por correo a un laboratorio de

referencia):

- Muestras que contengan virus deben ser refrigeradas inmediatamente y enviarse en una

caja con unidades comerciales refrigerantes

- La sangre no se envía entera, se separa el suero y se envía en un tubo estéril

- La muestra <de 50 ml debe ser envasado en un recipiente hermético irrompible con

espacio suficiente entre ambos para retener en caso de rotura; el envase se coloca dentro de

otro envase para el envió; el envase externo se identifica con un rotulo rojo y blanco para

Agentes biológicos /Material bio-medico.

Manejo inicial de las muestras en el laboratorio - la mayor parte de las muestras para

estudio bacteriológico que vayan a demorarse en su procesamiento deben mantenerse en la

nevera a excepción de LCR; los fragmentos de pelos o raspados de piel y uñas para el

aislamiento de hongos pueden ser mantenidos a temperatura ambiente durante

varios días antes de ser inoculados (protegidos del polvo).

Tema 5 - Procesamiento de las muestras en

microbiologia clínica

(protocolos de siembra)

Normas básicas generales (antes de proceder al procesamiento de la muestra):

1. Volante de petición debe estar bien cumplimentada (filiación y datos administrativos del

paciente, datos clínicos, datos de la muestra, terapéutica seguida, determinación solicitada)

2. Tener constancia de que la obtención de la muestra ha sido realizada correctamente,

siguiendo las normas y criterios establecidos por el laboratorio, así como su recogida,

transporte y conservación.

3. La siembra de dicha muestra se hará en los medios idóneos para cada caso, bien en placa,

por agotamiento y/o método cuantitativo, o bien en tubo.

Procesamiento de las muestras 1. Orinas (debe llegar al laboratorio en contenedor estéril y ha de conservarse a 4ºC en

menos de 24 horas)

[a] Agar sangre, chocolate o Cled/Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient (medios

general y especifico para orinas) => se siembra en 3 direcciones/ cubrir totalmente la

superficie (cuantitativa en Cled o AS - para contar colonias; realizar

antibiograma); crecerán todo tipo de germenes: cocos Gram+, bacilos Gram-,

levaduras; en Cled/AS no crecen cocos Gram- (Neisseria, Moraxella, Chlamydia); en AS

se comprueba las características hemolíticas o no de las bacterias e.j. Stafilococcus

aureus (B hemolítico) y en Cled, las característica lactosa (+) => amarillas o lactosa (-) sin

cambio de color => azul verdosas.

[b] Agar Mac Conkey (selectivo para bacilos Gram-) => se siembra por agotamiento en

cuadrantes (puede ponerse un disco de Colistina en el inoculo para ayudar a

la identificación de E.coli (sensible a colistina - común en orinas); crecen bacilos Gram-

=> Enterobacterias y también Pseudomonas; observaremos las características de lactosa

(+) => colonias rojas y lactosa (-) sin cambio de color => rosa.

16/168

[c] Agar Citrato de Simmons (solo en algunos protocolos); se siembra enla lengüeta del

tubo preparado en pico de flauta; las colonias consumidoras decitrato (+) => vira a azul y

las que no, permanece verde; se usa para la diferenciación

deEnterobacterias (para diferenciar entre coliformes y coliformesfecales. Los coliformes

fecales no fueron capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono ni a las sales de

amonio como fuente de nitrógeno. Los coliformes no fecales como Enterobacter

aerogenes o Salmonella enteritidis podían utilizar el citrato en este medio dando una

reacción alcalina) en base a su capacidad de utilizar el citrato (mediante citrato permeasa)

Los gérmenes mas frecuentes que podemos encontrar (en orina se identifican especies):

- E. coli (el mas frecuente) => bacilo Gram-, móvil, sensible a Colistina, lactosa (+), indol

(+)

- Streptococcus faecalis => coco Gram+, catalasa (-), oxidasa (-).

- Proteus spp (todas) => bacilo móvil Gram-, resistente a Colistina, lactosa (-), oxidasa (-

), Triptófano Desaminasa/TDA (+), ureasa (+) tardío.

- Stafilococcus aureus => coco Gram+, catalasa (+), coagulasa (+), B hemolítico, oxidasa(-

).

- Candidas spp (todas) => morfología de levaduras (parece como hematíes)

- Klebsiella spp => bacilo Gram-, inmóvil, sensible a Colistina, ureasa (+), colonias

mucosas, lactosa (+), tardío.

- Pseudomonas spp => bacilo Gram-, móvil, sensible a Colistina, lactosa (-), oxidasa (+)

2. Coprocultivos (contenedor especifico para coprocultivo "Cary y Blair" / bote de

orina;conservada a 4ºC, procurar procesarla en <24H; se siembran por agotamiento en

cuadrantes).

[a] Hecktoen o SS => medios selectivos y diferenciales donde crecerán el

generoSalmonella y Shigella; en Hecktoen las Salmonellas spp => colonias lactosas (-),

verdosas y pueden ser SH2/sulfihidrogeno/ acido sulfidrico (+) con fondo negro,

sonbacilos móviles, sensible a Colistina; las Shigellas spp => lactosas (-) , SH2 (-

),bacilos inmóviles en fresco y sensibles a Colistina; las colonias lactosas (+) en este medio

serán amarillas;

en SS las Salmonellas y Shigella serán el del medio (caramelo) y también con el fondo

negro (Salmonellas SH+ y lactosa- ); colonias lactosa (+) => rojizas; las colonias lactosas+

no son patógenas (coliformes fecales) y no se investigan.

[b] Agar Yersinia CIN => para buscar colonias de Yersinia spp (rosa clarito - Yersinia

pestis, Yersinia enterocolitica y Yersinia pseudotuberculosis.) que aparece como lactosa

(+),sensible a Colistina y bacilos Gram- e móviles, fermentador de manitol. La inhibición

selectiva de organismos gram negativos y gram positivos se obtiene mediante cristal

violeta (inhibidor de Gram+), desoxicolato sódico (inhibidor de Gam+) y los agentes

antimicrobianos: cefsulodina, Irgasan (Triclosan) y novobiocina (inhibidor de

S.epidermidis).

17/168

[c] Agar Campylosel => crecerá Campylobacter spp (bacilos Gram- con flagelos) como

colonias pequeñas translucidas, sensibles a Nalidixico (especies C.

coli y C.jejuni) resistente a Nalidixico el C. fetus, en fresco aparecen en coma/en S, ureasa

(+) oxidasa (+) catalasa (+); al hacer la prueba del hipurato C.jejuni seran (+) y C.coli (-

); P. hipurato => un procedimiento cualitativo para determinar la capacidad de las bacterias

de hidrolizar enzimáticamente (hipuricasa) el hipurato sódico que da lugar a acido

benzoico y glicina un compuesto de color morado.

[d] Caldo Selenito => caldo enriquecido para los géneros Salmonella y Shigella. el

selenito de sodio inhibe la flora Gram+ y la mayoría de la flora entérica excepto Salmonella

spp.

[e] Agar McConkey (solo en algunos protocolos) => los coliformes aparecerán como

colonias rojas por ser lactosas (+); no es necesario???

[f] Agar TCBS /tiosulfato citrato bilis sacarosa (detectar Vibrio cholerae) => aparecen

colonias de color amarillo sacarosa (+), oxidasa (+) y son bacilos Gram- pleomórficos; el

extracto de levadura y la peptona proporcionan el nitrógeno y las vitaminas.El citrato

sódico, el tiosulfato sódico, la bilis de buey y un pH alcalino fuerte inhiben los organismos

Gram+ y suprimir los coliformes (inhibidor para la mayoría de las entero-bacterias),

favoreciendo el crecimiento de Vibrio cholerae porque este organismo es sensible a los

18/168

entornos ácidos. La alta concentración de sodio favorece el crecimiento de Vibrio cholerae

que es halotolerante (tolera el medio salado) y de otras especies de Vibrio, cuya mayoría es

halofílica. La sacarosa (+) es un carbohidrato fermentable, y el cloruro sódico estimula el

crecimiento. El tiosulfato sódico es una fuente de azufre y actúa con el citrato férrico como

indicador para detectar la producción de ácido sulfhídrico/SH2. El azul de bromotimol y el

azul de timol son indicadores de pH. En Mc, Vibrio Cholerae es lactosa (-).

3. Exudados vaginal y uretral (la muestra llegara en uno o varios escobillones; se siembra

por agotamiento en cuadrantes).

[a] Agar Sangre (medio general) => buscamos Streptococcus B hemoliticos del grupo

B(S.agalactiae), que aparecerán como colonias pequeñas translucidas con un halo de B

hemólisis alrededor de la colonia; son cocos Gram+, catalasa y oxidasa (-), anaerobio

facultativo, prueba de látex (+).

[b] Agar chocolate => buscamos Haemophilus spp como colonias muy pequeñas grisáceas

que crecen bien por ser gérmenes exigentes en su crecimiento que requieren factor X y/o

V (proceden de la degradación de la Hb); también podemos colocar discos de factor X y/o

V y mirar el satelitismo; al fresco como coco-bacilos inmóviles, Gram-; oxidasa y catalasa

variable.

[c] Agar Thayer Martin o New York => buscamos N.gonorrhoeae o N.meningitis que

aparecerán como colonias de color gris; son diplococos Gram-, catalasa (+), oxidasa (+) que

fermentan la glucosa pero no el resto de los azucares.

[d] Agar Gardnerella => buscamos Gardnerella vaginalis, como colonias B-hemolíticas y

al fresco como bacilo pequeño, Gram variable, anaerobio facultativo, oxidasa (-) y catalasa

(-). La presencia de sangre humana favorece el crecimiento de las especies estudiadas, ya

que producen ß-hemólisis alrededor de las colonias. La ß-hemólisis en agar con sangre

humana es altamente indicativa de presencia de G.vaginalis. Los antibióticos incluidos en el

medio inhiben la mayoría de los contaminantes Gram- y de las levaduras.

19/168

[e] Vagicult o Roiron (medio liquido) => crecen levaduras (Candidas spp)

yTrichomonas (protozoo unicelular flagelado).

[f] Agar Sabouraud (se puede incluir para detectar Candidas spp)

[g] Medio de detección de Micoplasmas y Chlamydias

4. Semen - la muestra llegara en contenedor estéril/ bote de orina; se siembra por

agotamiento en cuadrante en medios: Cled, McConkey , Agar Sangre, Agar chocolate,

Thayer Martin o New York, Roiron, y cultivo de Clamydias, buscando en cada caso los

mismos gérmenes que en el caso del exudado vaginal.

5. Esputo - la muestra ha de llegar en contenedor esteril y conservarse menos de 24H a 4ºC;

antes de sembrar se observa por el microscopio si la muestra es valida/ no esta contaminada

por saliva; se siembra por agotamiento en cuadrantes; solo se siembra cuando en el Gram, el

cociente leucocitos/ celulas epiteliales sea > 2,5 (recuento en fresco/al microscopio); si es <

a 1,5 es dudoso. Cuando sean muestras de UCI o provenientes de neumonías se siembran

siempre.

[a] Agar Sangre => buscamos colonias de Streptococcus pneumoniae oBranhamella

catharralis; S.pneumoniae >> colonias verdosas (alfa hemólisis) y al fresco como coco

Gram+, catalasa (-), sensible a la Optoquina; Branhamella catarralis >> colonias blanco-

grisáceas y al fresco como cocos Gram-, oxidasa (+), catalasa (+) que no utiliza ningún

azucar (no es fermentadora), pero reduce los nitratos a nitritos/ nitratasa+ (lo que le

diferencia del genero Neisseria que ademas es fermentadora de glucosa y maltosa).

[b] Agar chocolate => buscamos Haemophilus spp como colonias puntiformes

translucidas, que al fresco como coco-bacilos, Gram-, catalasa y oxidasa variable; agar

chocolate polyvitex (contiene factor V/ NAD y factor X /hemina procedente de

20/168

ladegradación de Hb)

[c] Agar McConkey => donde creceran Enterobacterias y otros bacilos Gram-.

[d] Medio de Lowestein-Jensen (o Coletsos) => para rescatar Mycobacterium

tuberculosis, bacilos acido alcohol resistente (Zhiel Neelsen+) de crecimiento muy lento;

los niveles bajos de la penicilina y el ácido nalidíxico también están presentes en el medio

de LJ para inhibir el crecimiento de lo Gram+ y Gram-, con el fin de limitar el crecimiento

de especies de micobacterias solamente. Presencia de verde malaquita en el medio inhibe

las floras mayoría acompañante; que se desinfecta y se solidifica mediante un proceso de

espesamiento; el Glicerol mejora el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis.

[e] Medio Legionella => muestras de UCI; la Legionella pneumophila es bacilo Gram-(en

realidad, se tiñe muy mal, aerobio exigente, movil; en general, no fermenta ni oxida los

azucares, sino que utiliza los aminoacidos; es hipurato+ => un procedimiento cualitativo

para determinar la capacidad de las bacterias de hidrolizar enzimáticamente (hipuricasa) el

hipurato sódico; necesita L-cisteina para crecer y también iones férricos Fe. La inhibición

del crecimiento de las bacterias Gram+, la mayoría de las bacterias Gram-, levaduras y

mohos, a través de una combinación optimizada de 3 antibióticos. Las colonias que crecen

en medio Agar Legionella y no crecen en medio AS deben considerarse, con alta

probabilidad, colonias de Legionella.

6. Cepillado bronquial (la muestra vendrá en el cepillo y se conservara a 4ºC < de 24H);se

siembra en los mismos medios que en el caso anterior (esputo) añadiendo ademas: agar

sangre anaerobios (ASA) o medio AKV (agar sangre kanamicina-vancomicina),

selectivopara bacilos Gram- anaerobios y Bacteroides (bacilo Gram-, anaerobio estricto).

7. Exudado faringeo y oral (la muestra viene en torunda, se sembrara por agotamiento en

cuadrante).

[a] Agar sangre => crecera todo tipo de gérmenes (medio general enriquecido)

[b] Agar chocolate => crecera todo tipo de gérmenes

[c] Agar Mac Conkey => creceran las Enterobacterias y otros bacilos Gram- poco

exigentes.

[d] Agar CNA /agar sangre (de cordero) colistina nalidixico, medio selectivo para Gram+/

inhibe los Gram- => para deteccion de Streptococcus B-hemoliticos, Enterococcus y

Staphylococcus??

[e] Agar Sabouraud (solo en orales) => deteccion de Candidas spp.

8. Exudados varios - abscesos heridas ... (se sembrara por agotamiento en cuadrantes. La

muestra ha de llegar en tubo estéril y se conservara a 4ºC menos de 24H.

[a] Agar sangre => crecerá todo tipo de gérmenes

[b] Agar chocolate => idem

21/168

[c] Agar Mac Conkey => crecerán las Entero-bacterias y otros bacilos Gram (-) poco

exigentes.

[d] Agar CNA /agar sangre (de cordero) colistina nalidixico, medio selectivo para Gram+/

inhibidor Gram- => crecerán bien los Steptococcus B-hemolíticos.

[e] Agar ANA (agar sangre anaerobios/ASA, aunque también puede utilizarse agar AKV,

agar sangre kanamicina y vancomicina) => medios selectivos para bacilos Gram-

anaerobios (estrictos) y Bacteroides.

[f] Caldo Tioglicolato => crecen bien todo tipo de bacterias aerobias o anaerobias; permite

el desarrollo de una amplia variedad de microorganismos, incluidos los nutricional-mente

exigentes. Además, se observa que las bacterias estrictamente aerobias, crecen en la parte

superior, mientras que las anaerobias facultativas o anaerobias estrictas crecen en las

profundidades del medio.

RELACION DE LAS BACTERIAS CON EL OXIGENO EN TIOGLICOLATO En

base a la relación de las bacterias con el oxígeno, estas se pueden clasificar en :

1. Aerobio estricto: Un organismo el cual requiere utilizar el oxígeno como aceptador

terminal de electrones , puede tolerar un nivel del oxígeno equivalente o mayor de una

atmósfera de aire (oxígeno del 21%), y tiene un tipo terminantemente respiratorio de

metabolismo (Mycobacterium tuberculosis, Bacillus).

2. Anaerobio o Aerobio facultativo: Un organismo que puede crecer bien en ausencia

del oxígeno y en la presencia de un nivel de oxígeno equivalente a una atmósfera del aire

(oxígeno de 21%) => Enterobacterias, Vibrio spp, Haemophilus spp..

3. Microaerofílico (anaerobio aerotolerante): Un organismo que es capaz de un

crecimiento oxígeno-dependiente, pero no puede crecer en la presencia de un nivel del

oxígeno equivalente a una atmósfera de aire (oxígeno de <21%) => Campylobacter fetus,

Pseudomonas y Neisseria.

4. Anaerobio estricto: Un organismo que es incapaz de crecimiento oxígeno-dependiente

y no puede crecer en la presencia de una concentración de oxígeno equivalente a una

atmósfera de aire (oxígeno de 21% - nada de O2). (Clostridium botulinum).

5. Anaerobios aero-tolerantes: Pueden crecer con o sin oxígeno

pero su metabolismo es siempre fermentativo (Lactobacillus)

9. Liquido cefalorraquídeo - se siembra por agotamiento en cuadrante del sedimento del

tubo centrifugado a 1500 rpm a 3000 rpm durante 20 minutos, si en el tubo hay mas de 1 ml

de muestra. Sino, vortear el tubo. La muestra se ha de procesar de inmediato y si no es

posible, conservarse a 37ºC.

[a] Agar sangre => buscamos Neisseria meningitidis, como pequeñas colonias no

hemolíticas y al fresco se ve como diplococos, Gram-, oxidasa (+), catalasa (+),

fermentador de glucosa y maltosa (la fermentación de este azucar le diferencia del

gonococo; también puede crecer Streptococcus pneumoniae (neumococo) que aparecen

como colonias verdosas (Alfa hemolisis) y al fresco como cocos Gram+, catalasa (-),

sensible a la optoquina.

22/168

[b] Agar chocolate => ídem y ademas pueden crecer Haemophilus spp como colonias

puntiformes translucidas, que al fresco aparecerá, como coco-bacilos, Gram-, catalasa y

oxidasa variable.

[c] Agar Thayer-Martin => medio selectivo para Neisserias, crecerán bien los

meningococos /N.meningitidis.

[d] Medio tioglicolato (caldo) => medios para anaerobios y aerobios.

(f) Ademas se hará una extensión para Gram.

10. Otros líquidos estériles (sinovial, pleural, pericardio...) - se siembran por agotamiento;

la muestra ha de llegar en tubo estéril y su conservación no se ha de demorar mas de 24H a

4ºC.

[a] Agar sangre => crecerán casi todo tipo de microorganismos, con características

hemolíticas de algunos de ellos.

[b] Agar chocolate => crecerán casi todo tipo de gérmenes, sobre todo exigentes.

[c] Agar McConkey => crecerán Enterobacterias y otros bacilos Gram- poco exigentes.

[d] Agar CNA => agar columbia colistina nalidixico (sangre de cordero), selectivo para

Gram (+)

[e] Agar ASA => agar sangre anaerobios selectivo para bacilos Gram- anaerobios

yBacteroides.

11. Cateteres y sondas - se siembra mediante la técnica de Maki (rodamiento del cateter)

[a] Agar chocolate => crecerán casi todo tipo de gérmenes, y podrán crecer bien algunos

exigentes como el Haemophillus.

[b] Agar sangre => crecerán bien casi todo tipo de gérmenes y podrá verse sus

características hemolíticas si las tuvieran.

[c] Caldo tioglicolato => si se observa crecimiento se hará un pase por Agar chocolate.

[d] También puede ponerse en una placa de agar MacConkey.

12. Hemocultivos - la muestra se introduce en el vial de hemocultivos, conservando a 37ºC

en el Bactec (detecta CO2) hasta su identificación.

Tema 6 - Medios de Cultivo en bacteriología

clínica (Clasificación y Preparación)

Medios de cultivo - compuesto por distintos nutrientes requeridos para cultivar gérmenes

como las bacterias, hongos y parásitos según sus necesidades nutricionales de cada uno; en

función de sus requerimientos, existen grandes diferencias entre los medios de cultivo que

nos sirven para diferenciar cada tipo de microorganismo que podrá crecer en unos medios

de cultivo y no en otros.

Función de medios cultivo:

- separar y aislar distintas especies microbiales presentes en una muestra.

- paso previo para el estudio de identificación de un microorganismo problema.

- conocer el metabolismo en función del nutriente o sustrato que utiliza (lactosa) o

metabolito que produce (indol).

- estudios macroscópicos => visualizar las características de las colonias en medios sólidos.

- realizar antibiogramas determinando la sensibilidad (mayor/menor) de la bacteria

problema a distintos antibióticos.

- pruebas de CMI (concentración minima inhibitoria)

- conservar las especies microbiales o muestras.

23/168

Requerimientos energéticos y no energéticos de los medios de cultivo - fuente de

energia (fuente de carbono y de nitrogeno) y fuente no energética (azufre, fósforo, iones

metálicos, factores de crecimiento, f. de arranque y inhibidores) necesarios para el

desarrollo (crecimiento) de cultivos microbiales; fuente de carbono => acido acetico,

alcohol, citrato sódico, azucares (mono o disacáridos incluso almidón => glucosa, lactosa,

maltosa), CO2 (bacterias fotosintetizantes y quimiolitotrofas); conocer el tipo de azucar

utilizado => útil para su identificación bioquímica y clasificación taxonómica; fuente de

nitrógeno (menos energética) => proteínas completas (gelatina - determinar actividad

proteolítica/gelatinasa; extractos de carne y sales de amonio), péptidos/polipeptidos

(peptonas - extractos de levadura, caseína - trípsica de caseína/triptófano => formación de

indol) o aminoácidos y otros => nitratos, nitrogeno organico, amoniaco, sales de amonio,

aminoacidos; conocer la fuente nitrogenada => util para clasificación taxonómica; fuente de

azufre => sulfatos, tiosulfatos, aminoacidos (metionina, cisteina, tiamina); fuente de

fosforo => fosfatos; iones metalico => hierro, potasio, sodio, magnesio y en

concentraciones mas bajas => cinc, manganeso, cobre, cobalto, etc;

Otros requerimientos no energéticos:

Factores de crecimiento => componentes que muchas bacterias no son capaces de fabricar

por si solas para su crecimiento (aminoácidos => cisteina; factor X y factor V procedente de

la degradación Hb; vitaminas, bases puricas y pirimidicas); factores de arranque =>

sustancias que permite a la bacteria salir de su fase de latencia y comenzar su fase de

crecimiento exponencial (fuentes de energía => glucosa; iones metálicos que estimula el

crecimiento); factores inhibidores => componentes que bloquar el proceso metabólicos de

algun microbio; muy útiles para la identificación y tipificación bioquímica de las bacterias

(azida sodica => impide Gram-; antibióticos => inhibidores y destructores; colorantes

laeosina azul de metileno utilizado por medio Levine; cristal violeta en medio Mac-Conkey

=> impide Gram+).

Condiciones que ha de cumplir un medio de cultivo:

1. Una composición de nutrientes adecuada (requerimientos energéticos y no energéticos)

2. Condiciones físico-químicas apropiadas:

- Temperatura optima/ideal (según la especie microbiana

=> psicrófilas <20ºC;mesófilas 18-45ºC; termófilas > 45ºC; las bacterias patógenas del

hombre 35-37ºC; fuera de estas no crecen o crecen mucho mas despacio;)

e.j.: Yersinia 22ºC, Campylobacter 45ºC (los dos son gastrointestinales)

- Grado de humedad (cantidad de agua que necesita para crecer)

- pH adecuado es en general cercano a la neutralidad +/- 7(estabilizante de pH => buffers o

tampones que facilitan el crecimiento); pH acido => Tiobacilos (cerca a 0); pH alcalino =>

bacilos ureasa positivo/ Proteus (en torno a 8) y Vibrio cholerae (pH 9)

- Presión osmótica en general isotónia (300 miliosmoles)

- Presencia o ausencia de oxigeno; la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias son

facultativos que se desarollan bien con y sin O2; existen pocos anaerobios estrictos;

bacterias microaerofílica => produce mas CO2.

Principales tipos de medios de cultivo - según su proporción de agua / su consistencia (sólidos, líquidos, caldo)

- según su uso / su utilización (para aislamiento, crecimiento en general /recuento,

identificacion, mantenimiento de cepas, para antibiogramas)

- según su origen del que proceden (naturales, sintéticos y semi-sintéticos, complejos)

- según su presentación (deshidratados o liofilizados, sólidos en placa petri, sólidos en

tubo, líquidos en tubo, semi-sólidos en tubo, doble fase en frasco o tubo).

24/168

Medios de cultivo según su proporción en agua:

- Medios sólidos > 15% de agar; para aislamiento, identificación, elaboración de

antibiogramas) =>1881 Koch utiliza la gelatina (inconveniente => se funde a 24oC y

existen bacterias gelatinasa positiva que destruiran tal medio); posteriormente Hesse su

alumno usa el agar (medio inerte).

- Medios líquidos/caldos => contiene agua, fuente de carbono, sales minerales y algunos

lleva factores de crecimiento, vitaminas, peptonas y aminoácidos.

- Medios semisolidos => agar semi-sólidos (<5% de agar)

Medios de cultivo según su uso o utilización:

- Medios para aislamiento => {a} medios enriquecidos (componentes basicos + caseina

soja, triptofano para microorganismo exigente; e.j. agar sangre/chocolate {b} medios

selectivos (componentes basicos + componentes que impiden el crecimiento de algún tipo

bacteriano para seleccionar) e.j. medio Rothe (para aislar Streptococcus

faecalis /Gram+)contiene azida sódica que impide Gram-; la mayoria de medios selectivos

son también medios diferenciales {c} medios diferenciales (= medios selectivos +

sustancias resalta las caracteristicas microbiales de algunas; e.j. medio Levine (contiene

eosina y azul de metilenoque inhibe Gram+ y algunas Gram-, facilita a las enterobacterias

y lactosa (para las fermentadoras)

- Medios para crecimiento en general => liquida o solida sirve para el crecimiento de la

mayor parte de las bacterias (componentes basicos + sales y agua) ; e.j. el caldo comun

(contiene extracto de carne, peptona, glucosa, cloruro sodico y agua); el caldo Tioglicolato.

- Medios de identificación (= medios diferenciales) => sirve para clasificar taxonómica-

mente el microoganismo; e.j. agua peptonada = indol positivo; caldo Stuart urea-indol =

ureasa; glucosa = fermentación de glucosa (sacarolitico = sacarosa positivo).

- Medios de mantenimiento de cepas => mantener las cepas vivas durante periodos de

tiempo relativamente largos a temperaturas bajas para impedir su crecimiento; e.j. leche

descremada congelada

- Medios para antibiogramas; e.j. Proctor (antibiogramas fungicas), Mueller

Hinton(a.b.bacterianas), Wilkins-Chapman (a.b. bacteriana anaerobicas).

Medios de cultivo según su origen - Medios naturales => poco utilizados, se preparan artesanalmente, constituidos por ciertos

tejidos, liquidos organicos (leche, huevo, patata, suero sanguineo)

- Medios semi-sintéticos => parte de su composicion son extractos naturales (levadura,

malta, patata, sagre, leche) + constituyentes sintéticos

- Medios sintéticos => estructuras sintéticas mas o menos puras y químicamente definidas

disueltas en agua destilada (los mas utilizados en bacteriologia y en general); contiene:

fuente de carbono o azucar, fuente de nitrógeno inorgánica como iones NO-3, NH+4 o

orgánica como peptona, aminoácidos, aminas, etc., compuestos minerales como

oligoelementos, factores de crecimiento (vitaminas, aminoacidos, bases puricas o

pirimidínicas).

- Medios complejos => son los primeros que se utilizaron en bacteriología; en actualidadse

uss mas en parasitología y virología; se preparan de forma compleja (tejidos animales/carne

de musculo, higado, corazon, yema de huevo, azucares, pepetonas, vegetales, etc.

Medios de cultivo segun su presentacion - Medios deshidratados o liofilizados

- Medios ya preparados

- Medios solidos en placa Petri

- Medios solidos en tubo

25/168

- Medios liquidos en tubo

- Medios semisolidos en tubo

- Medios de doble fase en frasco

Principales medios utilizados en microbiología 1. Agua peptonada (peptona en medio acuoso con pH 7 a 37ºC 24-48 horas) =>

determinación de la producción de indol debido a su alto contenido en triptófano; tras

laadición de 5/6 gotas de reactivo Kovacs en hidróxido potásico (KOH 40%) => anillo rojo

en la superficie indicara indol positivo.

2. Medio Chapman (selectivo y diferencial) => aislamiento

de Staphylococcus (halófilos)S.aureus (coagulasa+); Comp: alto contenido de cloruro

sódico 75 gr (agar manitol salado); 15 gr de D-manitol (diferencial => azucar utilizado por

algunos estafilococos), 25 gr de rojo fenol (indicador positivo de pH a 37ºC 24-48 horas =>

amarillo dorado); es orientativa, se debe completar la prueba con pruebas bioquímicas

(coagulasa/latex); S.epidermidis no fermentan el manitol, por tanto el color sigue rojizo o

purpureo.

3. Agar de Thayer y Martin (Agar New York City) => no permite el crecimiento de

muchos microorganismos, pero si permite aislar gonococos y meningococos (Neisseria);

Comp: agar chocolate/ sangre calentado + formula polyvitex (vitaminas y aminoácidos) +

VCAT (vancomicina => inhibe los Gram+, colistina => inhibe los coliformes /Gram-

,anfotericina => antifúngico, trimetropinsulfametroxazol => antibiótico de amplio espectro).

26/168

4. Agar chocolate Polyvitex => medio general enriquecidos donde crecen la mayoría de

bacteria y Haemophyllus); Comp: agar chocolate + formula polyvitex (vitaminas y

aminoácidos) incluyendo factores X (hemina) y V (NAD/ nicotinamida adenina

dinucleótido) proporcionados por la hemoglobina y PolyViteX.

5. Medio base Christensen (líquidos y sólidos) => para la prueba de la ureasa; ureasa+ de

rojo => rosa; gérmenes con ureasa+ => Proteus y Helicobacter pilory

6. Medio citrato de Simmons (agar solido) => prueba de citrato (como fuente de energía)

para la investigación de bacilos Gram- (la diferenciación entre coliformes y coliformes

fecales. Los coliformes fecales (E.coli) no fueron capaces de utilizar el citrato como fuente

de carbono ni a las sales de amonio como fuente de nitrógeno. Los coliformes no fecales

comoEnterobacter aerogenes o Salmonella enteritidis podían utilizar el citrato en este

medio dando una reacción alcalina); Comp: citrato sódico, azul de bromotimol (indicador

pH, de que el citrato esta consumido /se alcalina; verde => azul); gérmenes con citrato

permeasa =>Klebsiella pneumoniae, Salmonella, Enterobacter aerogenes.

7. Medio Clark y Lubs (caldo/ liquido) => para diferenciar entero-bacterias

medianteprueba de Voges-Proskauer (producción de acetoína/ acetil metil carbinol => por

reducción a 2,3 butanodiol o por oxidación a diacetilo); y prueba de Rojo de

Metilo (acidificación del medio con pH <4,5 y cambio de color a rojo); gérmenes

con VP+ => Klebsiella pneumoniae yEnterobacter aerogenes; gérmenes

con RM+ => Proteus, E.coli y Salmonella.

27/168

8. Medio Cled/Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient (solido) => recuento e

identificación de gérmenes en las vías urinarias; Comp: lactosa en alta cantidad, azul de

bromotimol (indicador del consume lactosa verde => amarillo); las colonias mas frecuente

=> E.coli (amarilla L+), Proteus (azul L-), Klebsiella (amarilla azulada y muy mucosa (L+),

Pseudomonas aeruginosa (verde L-), Streptococcus faecalis (amarilla L+), Staphylococcus

aereus (amarilla L+).

9. Agar sangre (se comercializa con nombre TSA => tripticasa, soja, agar)

=> investigación de microorganismos hemolíticos (consume hematíes); es un medio general

enriquecida; Comp: sangre de cordero (agar columbia) o caballo o ternero => estériles y

desfibrinadas; alfa hemólisis/ neumococo (parcial) => halo verdoso/difuso alrededor de la

colonia; beta hemólisis/ Streptococcus B-hemolítico y Staphylococcus aureus que causan

anginas (total) => halo transparente; gamma hemólisis/ Pseudomona causa gastro

intestinales (no hemolizar) => sin halo.

10. Medio eosina azul de metileno /EMB (Medio Levine) => selectivo y diferencial, para

aislamiento de entero-bacterias Gram- (E.coli, Enterobacter, Salmonella, Shigella, Proteus,

28/168

Klebsiella) Comp: alto contenido de lactosa (indicador fermentadora), eosina azul de

metileno(indicador de pH y inhibidor los Gram+ y las floras de Gram- fastidiosas).

11. Medio de agar Hektoen (diferencial y selectivo) => aislamiento de entero-bacterias

patógenas Gram-; Comp: sales biliares (inhibe Gram+), lactosa (indicador de L+ =>

amarillo/naranja) sacarosa, peptona, tiosulfato sódico y citrato férrico amoniacal (indicador

de la producción SH2/H2S => puntos negro), azul de bromotimol, fuschsina

ácida (indicadores de pH); en condición normal es verde => fermentacion de

lactosa/acidificación => vira a amarillo/naranja (características de fermentadora

L+Escherichia, Serratia, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter y Vibrio cholerae); cuando se

consume lactosa + peptona (se acidifican primero, y después se basifican) => verde; cuando

se consume azufre/ disulfurasas+ => precipita el hierro y la colonia se vuelve negro

(característica de Salmonella y Proteus vulgaris).

12. Medio Kliger o KIA (Kliger Iron Agar) => medio solido en tubo (color caramelo); muy

semejante y mas utilizado es TSI (triple sugar, iron) + 10 gr de sacarosa; muy utilizado para

la identificación de entero-bacterias, pruebas de la lactosa, glucosa, gas y SH2; Comp:

lactosa (indicador de L+), peptonas, glucosa, citrato férrico amoniacal y tiosulfato

sódico(componentes para producir SH2), rojo fenol (indicador de pH); los gérmenes

productor deSH2+ => Proteus, Salmonella y Citrobacter; los productores del

gas CO2+ => Salmonella y Citrobacter y E.coli.

29/168

13. Medio MacConckey (color rosa) => aislamiento e identificación de entero-bacterias

Gram-/ poco exigentes; Comp: sales biliares (inhibidor Gram+), lactosa (indicador L+),

cloruro sodico, rojo neutro, cristal violeta (inhibidor los cocos de Gram+); L+ (consumidor

de lactosa) => rojo (E.coli y Enterobacter aerogenes), L- (no fermentador)=> Salmonella,

Shigella y Pseudomonas; Gram- exigentes => Neisseria, Haemophyllus.

14. Medio Mueller Hinton (general) => para la realizacion de antibiograma por el método

de Bauer-Kirby

15. Medio Ornitina Movilidad/ MIO (preparado en tubo/ semisolido) => identificación de

la movilidad bacteriana (entero-bacterias), capacidad para descarboxilar la

ornitina (orinitina descarboxilasa /está dada por un color púrpura/ alcalinidad del medio y

la producción de indol (al añadir reactivo de Kovacs); La movilidad se demuestra por un

enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas allá de la línea de

inoculación; el germen que da resultado positivo de los 3 pruebas => E.coli.

16. Medio caldo F-Selenito (selectivo) => medio enriquecido con fosfato para el

30/168

aislamiento de Salmonella; Comp: selenito sódico (inhibidor de flora Gram+ y Gram-

excepto Salmonella); después también se hace cultivo con agar SS.

17. Medio agar S-S (color caramelo) => aislamiento de las bacterias patógenas

importantesSalmonella y Shigella; Comp: lactosa (indicador fermentadora de L), tiosulfato

sódico y citrato de hierro (indicador de SH2), sales biliares y verde brillante (inhibidor

bacillos Gram+), rojo neutro (indicador de pH); L+ (coliformes - E.Coli y Klebsiella) =>

rojas o rosadas; L- y SH2- => incoloras (típico de Shigella); L- y SH2+ con la precipitación

de hierro => negro (típico de Salmonella).

18. Medio Agar XLD (agar xilosa-lisina-desoxicolato) => se utiliza para el aislamiento y

diferenciación de bacilos entéricos Gram-, especialmente del género Salmonella y

especialmente Shigella (entero-bacterias patógenas); Comp.: xilosa (la fermentan

los entéricos menos Shigella), sacarosa y lactosa, desoxicolato de sodico (inhibe Gram+); se

puede utilizar para la identificación de lactasa+, lisina descarboxilasa+ => Salmonellaque

alcaliniza el medio y SH2+ (tiosulfato sódico + citrato de hierro amoniacal).

19. Medio caldo Columbia => caldos para hemocultivos.

20. Medio Castañeda (caldo y solido) => búsqueda de gérmenes Brucella, Vibrios y

Pasteurella en sangre (hemocultivos).

21. Medio de Lowenstein-Jensen (selectivo) => cultivo de Mycobacterium tuberculosis y

otras micobacterias; Comp: fécula de patata, verde malaquita => inhibidor de la mayoría de

gérmenes; la prueba se confirma con tinción de acido alcohol resistencia (Con la tinción de

31/168

Ziehl-Neelsen las micobacterias se observan como bacilos de color rojo); micobacterias

patógenas crecen muy lenta (+ 7 días); los niveles bajos de la penicilina y el ácido

nalidíxicotambién están presentes en el medio de LJ para inhibir el crecimiento de Gram+ y

Gram-, con el fin de limitar el crecimiento => único de micobacterias.

22. Medio Sabouraud => para el aislamiento e identificación de hongos micelares y

levaduriformes.

23. Medio Sabouraud gentamicina tetrazolium => para el aislamiento

e identificaciónde Candida (levaduriformes); La gentamicina inhibe el crecimiento de la

mayoría de las bacterias Gram- y Gram+.

24. Medio Schaedler con vitamina K3 (caldo o agar solido) => para cultivo deanaerobios

(estrictos y facultativos); La presencia de factores de crecimiento como el extracto

de levadura, la hemina y la vitamina K3 y la adición de sangre de cordero permite el

crecimiento incluso de las especies más exigentes.

El agente reductor (L-cistina) y la elevada concentración de dextrosa en el medio favorecen

el crecimiento

de especies anaerobias p.ej. Lactobacillus, Streptococcus, Clostridios y Bacteroides.

25. Medio CPS cromogénico (agar/ solido) => es un medio de aislamiento y

de identificación destinado a las muestras urinarias; permite realizar (1) el recuento

microbiano (método de inoculación estandarizado); (2) identificación de: Escherichia

coli, Enterococcus del grupo D, KES (Klebsiella, Enterobacter, Serratia), Proteeae (Proteus,

Providencia, Morganella); la concentración elevada de agar evita el crecimiento invasivo de

Proteus; el medio se inocua directamente a partir de la orina, respetando técnicas adecuadas

de toma de muestras y su transporte; permite la identificacion directa de:

a. E.coli => coloración espontanea (rosa a burdeos) de las colonias productores de B-

glucuronidasa (B-GUR) y coloración azul revelada por el reactivo indol cuando la cepa

32/168

genera triptofanasa.

b. Enterococcus y KES => coloración espontanea azul-verde de las cepas que producen B-

glucosidasa (B-GLU).

c. Proteeae => coloración marrón revelada por el reactivo TDA cuando la cepa

genera triptófano desaminasa (sin reactivo es incoloro).

Modo operativo - dejar atemperar las placas a temperatura ambiente; inocular la muestra

con el asa calibrada de 10ul => sumergir el asa en la orina, mantenerlo verticalmente;

descargar el asa al realizar una estría sobre un radio de la placa;

realizar estrías perpendiculares muy apretadas sobre toda la superficie de la placa; incubar

en la estufa con la tapa hacia abajo a 37ºC en aerobiosis; se examinan los

cultivos después de 24 horas de incubación.

Lectura e interpretación:

Recuento - estimar la concentración bacteriana comparando la densidad de las colonias

presentes sobre la mitad superior de la placa con la del esquema; <1000 (negativo), entre

1000 - 100.000 (dudoso), mas de 100.000 (positivo)

Identificación - observar las colonias

(1) Colonias de color rosa a burdeos o translucidas con centro rosa a

burdeos=> presunción de E.coli; confirmar mediante una detección de indol (depositar una

colonia sobre un disco de papel previamente embebido de una gota de reactivo R1 del

envase ID Indol TDA) => indol+ da una coloración azul (E.coli); la ausencia de color azul

(indol-) se debe proceder a la pruebas de API.

(2) Colonias de color azul-verdoso y observación de cocos Gram+ mediante examen directo

=> Enterococcus; si no cumple esta condición, se debe proceder a las pruebas de API.

(3) Colonias de color azul-verdoso y observación de bacilos Gram- mediante examen

directo => grupo KES; la identificación se debe proseguir mediante pruebas bioquímicas

(ureasa+ => Klebsiella; ornitina descarboxilasa+ => Enterobacter; gelatinasa+ => Serratia).

(4) Colonias incoloras a marrón-anaranjado => efectuar TDA (depositar sobre algunas

colonias idénticas, una gota de reactivo R2 del envase ID Indol TDA), observar

la coloración después de unos 30 segundos => TDA+ da una coloración marrón +/- oscuro;

efectuar indol => indol+ da color azul (Proteus, Providencia o Morganella); ausencia

de coloración azul es indol- (Proteus mirabilis); TDA- da una coloración amarilla y

la identificación se debe proceder a las pruebas de API.

Tema 7 - Metodos de Siembra (cultivo de las cepas)

Sembrar - cultivar la muestra utilizando técnica y medios adecuados para conseguir el

objetivo (identificar el microorganismo).

33/168

Preparación de inóculos (pequeña parte de muestra)

- Muestras viscosas o concentradas (análisis cuantitativo) => suspender un cultivo joven y

puro o un producto patológico (muestra biológica) en 5 ml de solución diluyente (caldo de

cultivo, suero fisiológico estéril o agua destilada estéril.

- Ajustar con la escala con un gradiente de turbidez (tecnica de Kirby-Bauer) => tubos

numerados como patrón de referencia según la concentración de microorganismos; se ajusta

mediante comparación visual aproximada o mediante la absorbancia de

espectrofotometría;escala de Mcfarland => una serie de tubos con precipitación blanco de

sulfato de bario por reacción de acido sulfúrico + cloruro de bario (escala 0,5 = 1,5 x

10.6/ml de microorganismos en el inoculo; escala 1 = 3 x 10.6 /ml; escala 2 = 6 x10.6./ml.

Metodos de inoculación y aislamiento de microorganismos 1. Metodos de siembra - inoculación:

{a} En medio liquido; con asa => se sumerge el asa cargada en el medio y se agita; con

pipeta => se vierte el contenido de la pipeta sobre el medio de cultivo y se homogeneiza;

con escobillón = con asa.

{b} En medio solido (en placa):

- Inoculación previa al vertido en placa (técnica de Barry - no se utiliza mucho) => 0,1 ml

de inoculo + 25 ml de medio cultivo => fundido/ atemperado a 45-55ºC para no esterilizar

=> homogeneizar => verter en la placa de Petri.

- Inoculación sobre la superficie del medio solidificado (técnica de Kirby-Bauer) => se

prepara el inoculo en un tubo estéril; se introduce un escobillón estéril impregnando; se

elimina el exceso presionando el escobillón con movimiento de rotación contra las paredes

del tubo; se siembra la placa emplenando la técnica de los tres giros distribuyendo

uniformemente el inoculo; se deja secar la placa 4-5 minutos en posicion semiabierta e

invertida, quedando lista para ser utilizada (en los antibiogramas).

{c} En medio solido (en tubo):

- Siembra por estria en superficie inclinada => se toma la muestra con el asa /hisopo; se

introduce en el tubo que contiene el medio; desde el fondo y en progresión ascendente se

desliza el asa en movimiento de zig-zag (se utiliza para pruebas bioquímicas y renovar

cepas).

- Siembra en picadura (para ver la movilidad de los gérmenes en la zona de punción +

pruebas bioquímicas) => se toma la muestra con la aguja o hilo; se punciona en el centro

del medio introduciendo la punta de la aguja hasta 2-3 mm del fondo del tubo; se extrae la

aguja por la misma linea que se introdujo; medio solido inclinado => puede realizarse

tambien una siembra en estría por la superficie del medio con la misma aguja; agar semi-

solido => puede usar el asa en lugar de la aguja.

34/168

2. Metodos de siembra - aislamiento (para obtener cepas puras/ bien aisladas) :

{a} Siembra en estria o zig-zag => se deposita el inoculo en el extremo superior de la placa;

se siembra con el asa o con hisopo, a partir del inoculo, con un movimiento en zig-zag cada

vez mas amplio de lado a lado de la placa; el estriado ha de hacerse sin presionar el medio,

suavemente, sin levantar el asa y sin flamearla; las colonias mas aisladas las obtendremos

en la zona mas distal del inoculo, es decir al acabar la siembra.

{b} Siembra en tres direcciones => se deposita el inoculo en el extremo superior de la placa

dejando deslizar hacia el centro para ello inclinaremos la placa (también se puede arrastras

con el asa); mediante asa o escobillón, haremos movmientos laterales de un lado a otro de la

placa, dejando las estrias muy juntas; giramos la placa 90º y realizamos la misma operación,

sin flamear o cambiar de asa; volvemos a girar la placa haciendo lo mismo; al final nos

queda una placa muy bien tapizada. Se realiza en urinocultivos para el contaje de las

colonias.

{c} Siembra en estría multiple => se deposita el inoculo en un extremo de la placa; con el

asa se reparte en varios tramos, siguiendo el borde de la placa; entre cada tramo se ha de

flamear o cambiar el asa; los segmentos seguidos describen un poliedro regular y el ultimo

tramo se efectua hacia el interior en el que se obtendran colonias aisladas.

{d} Técnica por agotamiento en cuadrantes (lo que usamos) => es muy similar a la anterior

pero sin flamear el asa y estriando mas los cuadrantes, aprovechando mas la placa.

{e} Técnica de los 4 cuadrantes => se divide la placa en 4 cuadrantes (pueden rotularse por

la parte posterior); se deposita el inoculo en el extremo superior de uno de los cuadrantes y

se siembra en estría; sin flamear el asa, se realiza la misma operacion sucesivamente en los

otros 3 cuadrantes; en cada uno de ellos se sembrara el inoculo que queda adherido al asa,

tras la siembra del anterior; en el ultimo de los cuadrantes sembrado, se encuentran las

colonias aisladas.

{f} Técnica de los tres giros => se siembra en estría la mitad de la placa; flamear el asa; se

gira la placa 90º, sembrando en estría la mitad superior de la misma; se repite la operación,

es decir se ha de flamear el asa, se gira la placa y se estría; la colonia aisladas aparecerá en

la zona sembrada en ultimo lugar.

35/168

Tema 8 - Características biológicas de la bacteria

(Morfología)

Bacterias - organismos unicelulares de tamaño 0,2-2 um, relativamente sencillos,

cuyamaterial genético no esta rodeado por una membrana nuclear especial (procariotas).

Estructura - constituidos por elementos obligados (presentes en todas las bacterias

eindispensables para su vida => pared celular, membrana plasmática, citoplasma, ribosomas

y la región nuclear); elementos facultativos (son elementos de supervivencia y

virulenciaque pueden estar o no presentes en la bacteria => capsula, flagelos, pelos/pilis,

endosporas e inclusiones citoplásmicas)

Pared celular - es el limite externo de la célula con estructura rígida, parecida a la pared

celular de las células vegetales; funciones => protegerse de cambios externos

adversos,mantener la morfología de la célula, proporciona la resistencia a los antibióticos,

dar un paso selectivo de algunas sustancias, proporciona la especificidad de grupo y de tipo

(clasificación), implicada en la patogenicidad; dar el color en la tinción de Gram, violeta

oscuro => Gram+ y color rosa => Gram-.

Estructura y composicion de la pared celular - Gram+ => mono-estratificada y gruesa,

compuesta por mureina (peptidoglicano - mono-capa, 50% peso seco/mucha cantidad),

polisacáridos, proteínas y ácidos teicoicos; Gram- => biestratificada y fina (1ª capa es

mureina en poca cantidad y 2ª capa formada por polisacáridos proteínas, fosfolipidos y

lípidos, no tiene ácidos teicoicos); las bacterias que no son sensibles a la tinción de Gram

=> BAAR/ acido alcohol resistentes (micobacterias); las que sin pared celular => los de

genero mycoplasma/ patógenas; la que tienen (formas S), pero la pierden (formas L).

Membrana plasmática - estructura delgada que se extiende por dentro de la pared celular,

encerrando al citoplasma; funciones => actúa como barrera selectiva, interviene en

ladegradación de nutrientes y producción de energía, en algunas se encuentran pigmentos y

enzimas para la fotosíntesis; estructura y composición => fosfolípidos, proteínas y

36/168

glicolípidos; mesosomas => plegamientos hacia dentro de la membrana plasmática,

irregulares (no existen en las celulas eucarióticas), se encargan de dirigir la duplicación del

ADN bacteriano y realizar la respiración.

Citoplasma - es todo lo que hay en el interior de la membrana plasmática; función =>

engloba los orgánulos celulares (región nuclear, ribosomas, inclusiones/depósitos de

reserva, vacuolas); no tienen ni aparato golgi, ni retículo endotelial plasmática, ni

mitocondria;composicion => 80% de agua, enzimas, iones y principios inmediatos.

Región nuclear - una zona en el interior del citoplasma donde se acumula el acido

nucleico;funciones => el acido nucleico transmite la información genética de la célula sobre

estructuras y funciones celulares; estructura y composicion => es un núcleo difuso que

contiene 1 molécula ADN bicatenario, formando N cromosomas (enroscada en forma de

anillo); plásmidos => estructuras que pueden existir ademas de ADN cromosómico

(formadas por moleculares de ADN extra-cromosómico bicatenario, pueden estar libres o

unidos al ADN cromosómico /episomas), se replican independientemente, se transmite por

conjugación, portan genes muy importantes que determinan la resistencia a antibióticos,

tolerancia a metales tóxicos y síntesis de enzima.

Ribosomas - son orgánulos celulares muy abundantes (presentes en eucariotas y

procariotas) dan aspecto granuloso a su citoplasma; funciones = > síntesis de

proteínas;estructura y composicion => en grupos de 3 o 4 unidos por un filamento de ARN

mensaje (polirribosomas), cada ribosoma tiene 2 subunidades de 30 y 50 Svedberg

(velocidad relativa de sedimentación), procariotas - 70S y eucariotas - 80S; comp:

60%ARNr y 40% proteínas.

Elementos facultativos (algunos no tienen - variables) - son elementos de supervivencia y

virulencia

Inclusiones citoplásmicas - aparecen en el citoplasma y no tienen una estructura

uniforme; funciones => depósitos de reserva e intervienen en funciones de regulación;

Tipos: (1) Gránulos de reserva => lipídicos, corpúsculos metacromáticos (fosfato

inorgánico), polisacáridos (glucógeno y almidón), gránulos de azufre; (2) Vacuolas =>

acúmulos de gases o líquidos rodeados de membrana (donde se fija CO2).

Flagelos - largos apéndices filamentosos frecuentes solo en los bacilos (su presencia es

rara);funciones => responsable de la movilidad (elementos patogénico: facilitar la difusión

de las bacterias a traves de las

membranas); estructura => tres partes (filamento, codo y corpúsculo

basal); tipos =>monótricas (1 solo flagelo en un extremo), lofótricas (2 o mas en un

extremo), anfítricos (un grupo de flagelos en un extremo y otro grupo en el otro

extremo), perítricos (flagelos distribuidos en toda la superficie de la bacteria);

Pelos /pilis o fimbrias - elementos rígidos constituidos por una proteína (pilina); cortos,

muy numerosos, distribuidos sobre la superficie, mas frecuentes en Gram- que en

Gram+;funciones => capacidad de fijación a superficies (pelos comunes), proporcionan

pelos comunes y sexuales (son morfológicamente iguales), sistema de intercambio de

información genética por conjugación (pelos sexuales).

Endosporas - solo en bacilos (Bacillus aerobio estricto y Clostridium anaerobio estricto);

una forma de resistencia que adoptan algunas bacterias ante situaciones adversas

(deficiencia nutricional, desecación, frio, temperaturas elevadas, agentes químicos); se

forman por un proceso de esporulación /esporogénesis, pueden permanecer latentes durante

37/168

cientos de años y volver a una forma vegetativa por un proceso

germinación; localización => zona central, subterminal o terminal (depende de su tamaño,

pueden o no deformar el bacilo); la espora=> célula en reposo con capacidad de resistencia

a la desecación, calor y agentes químicos;esporulación => la producción de estructuras,

enzimas y metabolitos nuevos y la desaparición de muchos componentes celulares;

Morfológicamente comienza con el aislamiento del núcleo y elementos energéticos

mediante el crecimiento en vaginante de la membrana; los elementos esenciales para la vida

quedan protegidos en esa nueva estructura (endosporas); la bacteria queda en estado latente

esperando una condición externas favorables para resurgir.

Capsula - estructura que rodea la pared bacteriana; se visualiza con tinción negativa (tinta

china); funciones => regula el intercambio de agua, iones y nutrientes, sirve como almacén

externo de nutrientes, defensa frente a Acs, fagos y celulas fagocíticas (elemento

virulencia),protege de la desecación (contiene agua), formación de colonias (habitualmente

engloba mas de una bacteria); estructura y composición => polisacáridos y proteínas.

Tamaño y Morfología de las Bacterias - 0,2 - 2 um; es preciso utilizar el microscopio

óptico; la morfología => información primaria sobre el tipo de bacteria, pero no de forma

concluyente (viene dada por la rigidez de la pared; formas => esférica/coco, coco-bacilo,

bastoncillo/cilíndrica/bacilo, helicoidal/espirilo, en coma/vibrio, espiral/espiroqueta, estrella

y cuadrangular /forma de hifas de hongos (actinomyces/ streptomyces - productor de

muchos ATB, ATF y inmunosupresores); agrupación de los cocos => aislados, en

parejas/diplococos (granos de cafe - típico de neisserias/meningitis), en

cadenas/estreptococos, tetradas o tretacocos (4 celulas => micrococcus/micrococacceae), en

racimos/estafilococos, en formas cubicas de 8 elementos/sarcinas (sarcinas ventriculi -

tolerancia al medio ácida/ estomago); agrupación de los bacilos => aislados, en

parejas/diplobacilos, en cadena/estreptobacilos, algunos se parecen a

cocos/cocobacilos(E.coli), en forma empalizada/letra china (corynebacterium - algunos son

saprofitos de la piel y también causante de difteria).

Aroma típicos => Pseudomonas aureginosa (olor a jabón); Haemophyllus (olor

asemen/yeso); Citrobacter (olor a fétido); Proteus (olor a amoniacal); Klebsiella y E.

coli (olor a levadura de pan).

38/168

Tema 9 - Fisiología de las bacterias

Morfología macroscópica - estudio de la forma y estructura de las colonias (masas

constituidas por muchos millones de bacterias, se aprecian a simple vista y originadas a

partir de una bacteria en el medio solido); reconocible en función de => 1. características o

tipo de medio de cultivo solido donde se ha desarrollado (un microorganismo puede dar

lugar a distintos tipos de colonias) 2. tipo de microorganismo (mayor movilidad => colonias

extendidas y planas); la verificación de las colonias (siempre en medios sólidos

sembrándolo por estría) => en placa y en tubo con agar inclinado.

Las colonias en placa - sembrándolo por estría El tamaño y el aspecto de cada colonia son bastante constante para cada genero y especies,

hecho que se puede utilizar como característica diferencial; tamaño => 1-2 mm (E.coli); 4-

6mm (stafilococcus en agar sangre); extendidas en forma de velo invadiendo toda la

superficie del medio (Proteus en AS); puntiformes +/- 0,5 mm o inferiores (stafilococos en

AS); forma => según el espesor (planas, elevadas, semiconvexas, cóncavas semicóncavas,

semiesféricas, en meseta); según los bordes (lobuladas, onduladas, rizoides, redondeadas,

filamentosas, especuladas); superficie de la colonia/ elevación/ aspecto => lisa, rugosa

(con capsulas), plana, acuminada, umbilicada, mucosa, seca; consistencia de la colonia=>

duras, viscosas, mucosas, secas, muy secas, cremosas; transparencia y coloración=>

debido a la elaboración de algún tipo de pigmento, formación de alguna sustancia por parte

de la bacteria o la utilización de algún sustrato del medio que se acidifique o basifique;la

presencia o no de halos de transparencia => generado por la prueba de la gelatinasa (+) en

placa y también por la actividad hemolítica de ciertas bacterias con hemolisinas

(estreptococos hemolíticos tipo alfa, beta y gamma).

Las colonias en tubo, con agar inclinado - sembrándolo por estría Las colonias presentan las mismas características que en placa, pero su visualización es

mucho peor (menor superficie); aspecto => filiforme, rizoide, arborescente, filamentoso,

difuso, perlado, equinulada, arrosariada.

39/168

Morfología microscópica - estudio de la estructura fina de las bacterias 1. Estudio de su forma como célula procariota individual:

oval/esférica => coco/cocoidea; cilíndrica/bastón => bacilo; espiral/helicoidal =>

espirilo/sacacorchos /espiroquetas; filamentosa/forma de hifas de hongos => filamentosas

(actinomyces/ streptomyces), formas intermedias => vibrio, coco-bacilos; bacterias

helicoidales => Borrelia (poca espiras y amplitud), Treponema (tiene mas espiras) y

Leptospira (muy apretadas y enroladas).

2. Estudio de su agrupación bacteriana (no todas las formas bacterianas se agrupan, p.ej.

los espirilos y los actinomicetos) => los mas frecuentes son las formas cocoideas y las

bacilares son menos frecuentes; las cocoideas => diplococos (parejas /granos de café =>

neisserias y neumococos); estreptococos (paralelos/cadenas => streptococcus); tetradas o

tretacocos (4 celulas => micrococcus/micrococacceae); estafilococos (racimos =>

staphylococcus/ micrococcus); sarcinas (cuboidales de 8 celulas o mas; sarcina ventriculi y

también stafilococcus); las bacilares => diplobacilos/parejas, estreptobacilos/ cadenas y

formas irregulares/en empalizada/letra china (corinebacterium).

TAXONOMÍA - CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS La clasificación definitiva de las bacterias esta aun por establecer; los que se utilizan

actualmente deben considerarse como provisionales o transitiva; la mas utilizada suelen ser

recogidas de las manuales BERGEY'S en la 9ª edición de Bergey's Manual of

Determinative Bacteriology de 1994, se agrupan a las bacterias en 35 grupos, situados en 4

categorías mayores:

1. Eubacterias Gram- (bacterias verdaderas) con 16 grupos; en esta categoría se

incluyen a la mayor parte de las bacterias que provocan a la patología humana.

Espiroquetas:

- Familia Leptospiraceae (genero - Leptospira)

- Familia Spirochaetaceae (genero - Borrelia, Treponema)

Helicoidales /vibrioides aerobias - microaerófilas móviles (crecen mejor a bajas

presiones de oxígeno):

- Familia Campylobacteriaceae (genero - Campylobacter, Helicobacter)

Bacilos y cocos aerobios - microaerófilos (crecen mejor a bajas presiones de oxígeno):

- Familia Pseudomonadaceae (genero - Pseudomonas, Stenotrophomonas)

- Familia Alcaligenaceae (genero - Bordetella) => bacilos y coco-bacilos

- Familia Legionellaceae (genero - Legionella)

- Familia Neisseriaceae (genero - Neisseria) => diplococos

- Familia Moraxellaceae / Familia Branhamaceae (genero - Moraxella, Branhamella) =>

diplococos

- Otros generos => Brucella (cocobacilos)

Bacilos anaerobios y facultativos:

40/168

- Familia Enterobacteriaceae (genero - Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella,

Serratia, Hafnia [coliformes] Morganella, Proteus, Providencia, Salmonella, Shigella,

Yersinia/peste)

- Familia Vibrionaceae (genero - Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas)

- Familia Pasteurellaceae (genero - Haemophilus)

- Otros generos => Gardnerella

Cocos Gram- anaerobios => genero - Veillonella

- Familia Rickettsiaceae (genero Coxiella, Ehrlichia, Rickettsia) - son parásitos

intercelulares obligados, altamente pleomórficas cocos/bacilos/hilos

- Familia Chlamydiaceae (genero Chlamydia) - son parásitos intercelulares obligados de

forma esférica.

2. Eubacterias Gram+ con 13 grupos (17-29); en este grupo hay los que provocan

patologia humana (la mayoria).

Cocos => genero - Staphylococcus y Streptococcus

Bacilos esporulados => genero - Bacillus (aerobio) y Clostridium (anaerobio)

Bacilos regulares no esporulados => genero - Lactobacillus y Listeria

Bacilos irregulares no esporulados:

- Familia Corynebacteriaceae (genero - Corynebacterium)

Micobacterias:

- Familia Mycobacteriaceae (genero - Mycobacterium)

3. Micoplasmas (Mollicutes / bacterias sin pared) de 1 solo grupo (30); dentro de este

grupo, los que provocan patología humana => genero Mycoplasma/ Mycoplasma

pneumoniae y Ureaplasma.

4. Arqueobacterias con 5 grupos (31-35); todas las bacterias de este grupo no provocan

patologia humanas (viven en las situaciones extremas => termofilas/ termogenas)

Taxonomía => la ciencia de la clasificación que agrupa y separa los organismos de acuerdo

con su características fenotípicas, estructurales o genéticas para facilitar su estudio; la

misión => construir un esquema racional, para clasificar y nombrar los organismos; el

sistema jerárquico de la taxonomía se ha formado gradualmente a partir del sistema

binomial / binominal / binaria de nomenclatura genero y especie establecida por Linneo en

1758 (un botánico); la taxonomía no es una ciencia estático, goza de gran dinamismo y esta

en la relacion con los avances de los procedimientos empleada para su estudio; el termino

de sistemática se utiliza como sinónimo de taxonomía; los grupos de taxonomía van

de dominio - imperio - reino - tribu - división - clase - orden - familia - genero y especie.

Para la asignación de una bacteria, se siguen las normas recogidas por el código

internacional de nomenclatura bacteriana y adquieren validez cuando ha sido publicado por

el Int´l Journal of Systematic Bacteriology; bien en un articulo o bien dentro de los sistemas

en las listas de las bacterias aprobadas que incluyen sus números; una especie bacteriana,

viene definida por un nombre genérico de un nombre especifico latinizado o helenizado y

concuerdan gramaticalmente; la inicial de genero va con letra mayúsculas y el de especie

con minúsculas; tanto el nombre de genero o especie se escriben con letra cursiva/ italica o

en su defecto, subrayado; en la denominación de un especie, la palabra que define genero

puede ser abreviada a su inicial seguida de un punto (p.ej. E.coli o E.coli); los nombres de

las bacterias no se eligen de manera arbitraria, sino que pueden ser descriptivos, p.ej.

Staphilococcus aureus (cocos en forma de racimos - dorados); o pueden dar homenaje a un

autor p.ej. Pasteurella, Bacilo de Koch, también puede dar referencia a un acontecimiento

p.ej. Legionella; el nombre generico es único; para referirse a un especie o varios especies

41/168

no determinadas su genero => E.spp/ sp; algunas de las categorías taxonomia superiores, se

forman añadiendo las palabras que las asignan distintas terminaciones, p.ej. aceae; para el

orden => ales (sufijo) p.ej. Mycoplasmatales; todas las categorías taxonomía se expresa en

cursiva o itálica.

FLORAS BACTERIANAS Flora Normal de la especie humana => la población de microorganismos comensales que

normalmente coloniza la piel y las membranas mucosas de las personas adultas sanas; la

piel y las mucosas colonizadas por microorganismos dinámicos => cambios cualitativos y

cuantitativos constantemente; 2 poblaciones:

1. La flora residente (FR) => un numero relativamente fijo de especies de

microorganismos (comensales y oportunistas) en una zona definida (si se producen

alteraciones, suelen ser temporales); permanecen intactas; encuentran condiciones

fisiológicas y nutritivas adecuadas; no es esencial para la vida, pero es normalmente

beneficiosa (produce vitamina K en el intestino y ayudan en la absorción de nutrientes y

impide la colonización de microorganismos potencialmente patógenos.

2. La flora transitoria (FT) => microorganismos no patógenos o potencialmente

patógenos, que colonizan la piel o las mucosas en periodo corto de tiempo; tiene poca

importancia, pero si la flora residente se altera, la flora transitoria puede multiplicarse y

producir infecciones.

La supresión de FR => vació ecológico => ocupación de microorganismos ambientales o de

otras zonas de cuerpo => infecciones.

FR oportunistas => los que tienen acceso a lugares estériles; algunos ejemplos:

- Streptococcus viridans son comensales del tracto respiratorio superior y de la boca, si

alcanza el torrente sanguíneo => si válvula cardíaca dañada => posible endocarditis;

- Bacteroides son comensales del intestino grueso => si apendicitis perforada => posible

peritonitis o bacteriémia.

- Infecciones de pacientes inmunodeprimidos por causas diversas (cáncer, leucemias,

linfomas, SIDA)

- E.coli es comensal del colon => lugar estéril (o no habitual) a traves de uretra => infección

urinaria

Las causas de las interpretaciones erróneas => no se toma en cuenta al microorganismo

como patógeno o se le descarta (como mero contaminante); la omisión o inclusión de una

especie en una de las categorías no implica que no pueda ser aislada en otra zona del cuerpo

o que en condiciones especiales, pueda producir enfermedad.

Flora normal de la piel, boca y vías respiratorias superiores - Las principales (en faringe y traquea) => Staphylococcus epidermiditis (coagulasa-

),Staphylococcus aureus (coagulasa+) en pequeñas cantidades, Micrococcus spp,

Neisseria de especies no patógenas, Estreptococos A-hemolíticos y no hemolíticos, las

anaerobias facultativas, Candidas.

- FT/no residente se elimina o se disminuye => pH acido, los ácidos grasos de las

secreciones sebáceas, lisozima, el sudor y el lavado diario con jabones desinfectantes; se

disminuye de forma temporal => la repoblación es muy rápida.

- Al nacer => la boca y faringe son estériles; tras 12 horas => Streptococcus viridas (las

mas abundantes en la boca), posteriormente => estafilococos (S.epidermiditis), diplococos

Gram-, difteroides (Corynebacterium); salida de dientes => espiroquetas de Bacteroides,

Fusobacterium e Actynomicetes, vibrios anaerobios, Lactobacilos y levaduras; Adulto

normal=> las principales (mira arriba!!)

- Los bronquios, bronquiolos y alvéolos suelen ser estériles.

42/168

Flora normal del tracto intestinal - Al nacer => estéril, posteriormente => colonizado por microorganismos de los alimentos

dependiendo de la dieta (p.ej. la leche materna => Estreptococos y Lactobacilos y el biberón

=> flora mixta con menos Lactobacilos) .

- Adulto normal => el esófago contiene lo que previenen de la saliva y comida; en el

estomago hay poco (pH acido protegen la cólera y salmonelosis - excepto Helicobacter

pilorique puede causar ulcera péptida, tiene ureasa que alcalina/neutralizar el acidez:

degradar la urea => amoniaco); el intestino delgado superior contiene Lactobacilos y

enterococos;intestino delgado inferior (íleon y ciego) contiene la flora fecal; el

colon contiene >100 especies 96-99% anaerobios facultativo y estricto => Bacteroides spp,

Fusobacterium spp, Lactobacilos/ Bifidobacterium spp, Clostridium spp, cocos Gram+

anaerobios (Peptostreptococcus spp).

- La utilidad/beneficio => sintetiza la vitamina K, transformación de los pigmentos biliares

en ácidos biliares, absorción y metabolismo primario de nutrientes.

- La administración de anti-microbianos orales => la posible proliferación de cepas

resistentes al anti-microbiano administrado y pueden ser diseminada.

- La administración de ATB por vía parenteral en una cirugía intestinal => necesario para

reducir al mínimo posible el numero de microorganismo, evitar trauma en el acto quirúrgico

y infección peritoneal e diseminada.

Flora normal de la uretra - Los mas frecuentes son estafilococos, enterococos, Corynebacterias, Neisserias no

patógenas, enterobacterias (la mayoría son pobladores de la piel que recubre esta zona).

- En los cultivos de orina, se deben limpiar con cuidado la zona perineal antes de tomar una

muestra.

Flora normal de la vagina - Al nacer, esta colonizada por Lactobacilos aerobios (produce pH acido), posteriormente el

pH acido se convierte en neutro y aparece flora mixta de cocos y bacilos, hasta la pubertad.

- En la pubertad esta colonizada por Lactobacilos aerobios y anaerobios que produce ácidos

por su metabolismo de hidratos de carbono => cambio a pH acido (protección a los otros

microorganismos potencialmente patógenos.

- En la mujer adulta esta colonizada ademas de los anteriores (Lactobacillus acidophillus -

aerobios y anaerobios), estreptococos anaerobios (hemoliticos o no hemoliticos) y otros; el

moco cervical contiene lisozima con actividad bactericida.

- En la menopausia la flora vaginal cambia, aparece de nuevo una flora mixta de cocos y

bacilos.

- La administración de antibióticos de amplio espectro, puede eliminar las especies

protectoras, produciéndose una multiplicación excesiva en la vagina de levaduras (candidas)

u otras causantes de vaginitis.

Flora normal de la conjuntiva del ojo Predomina los difteroides (Corynebacterium xerosis), Staphylococcus epidermidis y

estreptococos no hemolíticos; pueden estar presentes otras especies; el control de la flora lo

ejercen las lagrimas, por su contenido en lisozima.

Tema 10 - Examen Microscópico (observación de

microorganismos vivos)

Nociones de microscopia (repasar apuntes de 1º curso)

43/168

Microscopio – instrumento que permite amplificar la imagen de un objeto o de un ser

pequeño (micros: pequeño y scopein: ver); inventado 1610 por Galileo, el primer científico

italiano observando el exterior de una abeja o Jansen, el holandés.

Fundamento – Si se sitúa entre el ojo y el objeto un sistema óptico capaz de aumentar el

angulo visual, se podrá ver el objeto con mayor amplitud y claridad. El sistema de lentes -

produce una imagen aumentada de una muestra diminuta. El objetivo - pequeña lente de

proyección que aumenta y proyecta la imagen primaria del objeto hacia el extremo superior

del tubo del microscopio (imagen aérea). El ocular (lupa) - aumentando la imagen aérea. La

imagen final - se forma en la retina del ojo. La imagen virtual (el ojo percibe la imagen final

en el plano virtual).

Aumento – es el numero de veces que se ve el tamaño de un objeto por encima de su valor

real. En el microscopio óptico compuesto, se calcula multiplicando el aumento individual

del objetivo por el aumento individual del ocular. Objetivo - x4, x10, x40, x100. Aumento

óptico ocular - x5, x10

Resolución – la capacidad del microscopio para mostrar los detalles más finos de un objeto.

Poder de resolución (limite de resolución o distancia resoluble) – la distancia minima entre

dos puntos que permite distinguirlos como tales (la capacidad de microscopio para

distinguir 2 puntos separados aunque están muy próximos entre si).

Disminuir la distancia resoluble = aumentar el poder de resolución = aumentar la apertura

numérica (AN) = disminuir la longitud de onda de la luz empleada = aumentar el ángulo

alpha en el espacio objeto = aumentar el índice de refracción (IR) en el espacio objeto

(rellenar el espacio existente entre la muestra y el objetivo con una sustancia de mayor

índice de refracción, como aceite).

Numero de campo – diámetro de la imagen observada a través del ocular (en mm).

Profundidad de foco – el espesor de la muestra que es posible tener enfocado por completo

>< aumento y AN (apertura numérica) de la lente.

El contraste – para mejorarlo, disminuye el cono de iluminación (se controla mediante el

diafragma de apertura) procedente del condensador.

Partes de un microscopio óptico compuesto:

Parte mecánica – sistema de soporte o estático (pie, brazo, cabezal); sistema de ajuste

(anillo de ajuste de las dioptrías, tornillo de fijación del cabezal, tornillos reguladores de la

platina, tornillo de elevación del condensador, tornillos de centrado del condensador,

tornillo de seguridad del condensador, control del diafragma de apertura del condensador,

anillos de enfoque macro-métrico y micrométrico, control de ajuste de la claridad/ la luz).

Parte óptica – sistema de iluminación (fuente de luz - lampara halogena de intensidad

graduable; condensador - dispositivo que contiene una lente que concentra la luz, generada

en la lampara, hacia la preparación; diafragma de apertura - el control adecuado del cono de

iluminación que atraviesa la muestra y entra en el objetivo = se ajusta AN); lentes (objetivos

- generan imagen real, invertida y aumentada del objeto; oculares - captan la imagen

formada por el objetivo y la amplian)

44/168

Material necesario para la visualización microscópica – portaobjetos esmerilado y

biselado, cubreobjetos 22x22, líquido de inmersión (se usa sin cubreobjetos) es

imprescindible cuando se observa muestra desecada con objetivo de 100x (tradicionalmente

aceite de madera de cedro, actualmente aceites sintético)

Tipos de microscopios:

Microscopio de campo oscuro – si dentro de la muestra hay elementos transparentes, con

un indice de refracción diferente al del medio que los circunda, la luz es difractada e incide

sobre el objetivo y pueden ser visualizados; permite la observación de seres microscópicos

transparentes y no teñidos (Treponema pallidum – preparación en fresco).

Microscopio de fluorescencia – consta de una fuente de luz muy intensa (lámpara de Hg a

alta presión), emite una radiación que puede incidir en la muestra desde abajo, tras atravesar

un condensador de campo oscuro (iluminación transmitida); se emplea un tipo especial de

liquido de inmersión (glicerina); Tipos de fluorescencia: Fluorescencia primaria -

fluorescencia natural (auto fluorescencia) - vitamina A-tiamina, vitamina B-riboflavina;

Fluorescencia secundaria - colorantes fluorescentes: auramina (demostrar la presencia del

bacilo de Koch en esputos), naranja de acridina (detectar Gardnerella vaginalis en los

exudados vaginales; Fluorescencia terciaria inmunofluorescencia - fijación del fluorocromo

(colorante) como rodamina y ficoeritrina al elemento investigado (a traves de Ac marcado).

Fuente de luz => Filtro primario => Muestra Fluorescente => Filtro secundario => Luz

fluorescente

de exitacion (UV) Observador

Microscopios electrónicos de transmisión (TEM) – una gran amplificación y permite la

observación de elementos que son demasiado pequeños como para ser vistos en un

microscopio óptico, pero no sirve para observar elementos vivos, a causa del vacío que ha

de establecerse dentro del tubo y es muy costoso (solo se usa en lab de investigación). El

poder de resolucion en microscopio electronico es x1000 > que microscopio óptico;

emplean electrones en lugar de unas fotones; microscopio óptico < 200 nm - fotones: 400 -

700 nm longitud de onda.

Microscopio electrónico de barrido (MEB) – no tiene tanto poder de resolución como el

de transmisión, pero sin embargo, proporciona una enorme profundidad de campo y genera

unas imágenes que producen una gran sensación de tri dimensionalidad. 1973 se

comercializo el 3º modelo que une las caracteristicas de los 2 anteriores (la gran resolucion

de los TEM y la gran definicion y contraste de los MEB.

Examen en fresco de bacterias vivas (Gota pendiente) - para conocer la movilidad y la

disposición bacteriana en una muestra se debe observar los gérmenes vivos a partir de

45/168

cultivos jovenes (lleva pocas horas), que permiten visualizar mejor su movilidad y su

preparación en fresco.

Condiciones que debe cumplir para este fin:

- cantidad de muestra adecuada (ni mucho ni poco)

- la muestra recogida en condiciones de esterilidad

- adecuadamente distribuida en el portaobjetos (amplia y homogénea)

- cantidad de agua o colorante adecuada

- para la fijación por calor => no debe calentarse demasiado (no quemar el dorso de la mano

y la gota +/-consumida) => para hacer tincion

- seguir el método o técnica adecuada, se trabaja con limpieza y orden, evitando cualquier

contaminación.

Técnicas para observar los microorganismos vivos - examen en fresco, entre

portaobjetos y cubreobjetos, sobre gota pendiente en porta excavado (no lo hacemos) y con

tinción vital.

Examen en fresco - suspender el microorganismo en agua destilada o SSF colocandolo en

un portaobjetos y posteriormente visualizarlo por microscopio su morfología (cocos o

bacilos), disposición/agrupación y motilidad; Material => portaobjetos, microscopio,

portaobjetos excavado, cubreobjetos, asa de siembra, mechero Bunsen o de alcohol (para

flamear el asa de siembra), muestra de microorganismo problema, agua destilada estéril,

vaselina (opcional).

Técnica - Método de examen en fresco entre portaobjetos y cubreobjetos:

- preparar portaobjetos y cubreobjetos limpios y desengrasados

- depositar una gota de agua estéril en el portaobjetos (50ul/lambdas)

- con el asa de siembra esterilizada por flameado, tomar un poco de muestra del

microorganismo y suspenderla en la gota.

- homogeneizar la muestra, colocar con cuidado sobre la suspensión un cubreobjetos,

evitando que se formen burbujas de aire al caer el cubre sobre la suspensión.

- observar al microscopio con objetivo de 40 aumentos.

Método de examen en fresco sobre gota pendiente en porta excavado:

- colocar en el centro de un cubreobjetos una gota de la suspensión microbiana con una asa

de siembra estéril.

- colocar vaselina en los bordes del pocillo del porta excavado

- invertir el cubre sobre el porta excavado, colocandolo encima del área cóncava del

portaobjetos.

- la vaselina adherirá el cubre al porta formando una cámara evitando su evaporación y

corrientes de aire.

- se invertirá la preparación

- observar al microscopio con objetivo de 40 aumentos.

Resultados - es importante no confundirlos con los movimientos brownianos que se

producen cuando se desplaza el medio liquido y hace que todos las bacterias siga dicha

corriente en dicha dirección; el sellado con vaselina evita este problema.

Coloración vital - es una técnica intermedia entre los exámenes en fresco y las técnicas de

tinción después de fijación previa???; consiste en teñir las muestras bacterianas con

colorantes muy diluidos, permite al microorganismo acumular parcialmente dichos

colorantes; la dilución debe ser muy altas para que no resulten toxicas para las bacterias,

evitando la muerte de tales gérmenes; material => microscopio, asa de siembra estéril,

portaobjetos, cubreobjetos, mechero, papel de filtro, una suspensión de muestra problema,

46/168

aceite de inmersión, altas diluciones de colorantes para disminuir su toxicidad (rojo neutro

en solución acuosa al 1:1.000 o 10 lambas : 10 ml y azul de metileno en solución acuosa al

1:1.000 o 1:500).

Técnica (se puede hacer igual como en fresco) - colocar sobre el portaobjetos limpio y

desengrasado una gota de suspensión muestra junto con otra gota del colorante diluido

utilizado; mezclar bien ambas gotas con el asa de siembra y colocar el cubre objetos con

cuidado para evitar que se formen burbujas de aire; observar al microscopio con objetivo de

inmersión; resultados => los microorganismos se visualizaran vivos y ligeramente

coloreados de rojo, en el caso de haber utilizado como colorante el rojo neutro o de color

azul si se utiliza el azul de metileno.

Tema 11 - Las tinciones en bacteriología

La morfología bacteriana (es incolora) puede ser estudiada por visualización de los

microorganismos => vivos sin teñir (observar su posible movilidad) y teñidos mediante

colorantes con una concentración que matan la bacteria y no permiten observar su

movilidad, pero mejora notablemente la visualización de su morfología y estructuras.

Ventajas de las técnicas de tinción:

- observar mas adecuadamente su morfología y permite diferenciar entre los distintos tipos

- dar información complementaria de sus estructuras internas y/o externas que no se observa

en fresco.

- al conocer sus características tintoriales, nos orienta hacia un grupo u otro en la

clasificación bacteriana.

Factores que afectan a toda técnica de tinción:

- pureza del colorante (a + impurezas => + error y - calidad en la tinción).

- concentración del colorante (valores ideales oscilan entre 0,2 y 2%)

- pH del colorante (en general son neutro +/- 7 o entre 6,8-7,4)

- conservación del colorante

- elaboración (no lo hacemos /vienen preparadas)

- técnica empleada (material limpios y seguir los pasos de la técnica)

- temperatura (en general la ambiental)

- cantidad de muestra (representativa y homogénea)

- realizar correctamente el frotis (fijarlo bien, en general por calor => coagula las proteinas

bacterianas, para que no se arrastre con el colorante mordientes y decolorantes)

- soluciones mordientes (ayudar a fijar el colorante a las estructuras microbianas, p.ej. lugol

en la Gram)

- tiempos de tinción (según el colorante que usemos)

Principales técnicas de coloración - clasificación de colorantes => [1] según su origen

(naturales y artificiales) [2] según su comportamiento químico (ácidos, básicos y neutros).

Colorantes naturales - extraído de plantas como la hematoxilina (del tronco de una planta

que por oxidación produce hemateína; el azul de índigo (de una leguminosa); extraído de

animales como el carmin (de una cochinilla)

Colorantes artificiales - preparados artificiales y obtenidos de alquitrán de hulla(colorantes

anilina ácidos, básicos y neutros en forma de sales) p.ej. cristal violeta, violeta de genciana,

fucsina básica, acido pícrico, azul de metileno, etc.

Colorantes según su comportamiento químico - se unirá de forma mas estable a la

estructura que tiñe, dependiendo de su estructura físico-química; constituido por un anillo

bencénico que unen distintos radicales => radical cromóforo; a+ numero de radicales =>

47/168

+poder colorante de la solución;

[1] colorantes ácidos o aniónicos: la carga del radical colorante es (-) => colorantes

citoplasmáticos que son básicos (los componentes citoplasmáticos captan muy bien los

colorantes ácidos) => las eosinas, las auraminas.

[2] colorantes básicos o catiónicos: la carga del ion cromóforo es (+) => colorantes de la

zona nuclear que son ácidas o ligeramente ácidas => fucsina básica, cristal violeta o violeta

de genciana, azul de toloudina, azul de metileno o las tioninas.

[3] colorantes neutros: es una sal compuesta de un colorante acido y un colorante básico

=> el eosina azul de metileno; es hidro-solubles (posee las propiedades de colorantes ácidos

y básicos).

[4] colorantes indiferentes: insolubles en agua y solubles en alcohol, no predomina ni la

carga+ ni (-), pero tampoco es de carácter neutro => colorantes de los lípidos como Sudan

III, Negro Sudan, etc.

En bacteriología es frecuente la utilización de => fucsina fenicada, violeta de genciana, azul

de metileno (son colorantes básicos) y de añadir un mordiente que ayude a fijar dicho

colorante; los colorantes ácidos se utiliza como un contraste y los colorante neutros e

indiferente como coloraciones particulares; el proceso de tinción => reacción de

intercambio de iones entre colorante y sitios activos de la superficie o del interior de la

célula (los iones teñidos/colorantes reemplazan iones de los componentes celulares) y esto

permite contrastar mucho mas el germen con respecto al medio que le rodea.

Preparación de un frotis - realizar una extensión y fijar la muestra problema para posterior

coloración y visualización al microscopio; poner en un portaobjetos, a traves de un asa de

siembra una cantidad de microorganismo problema suspendido en medio liquido estéril,

extendiéndolo adecuadamente hasta formar una fina película homogénea que

posteriormente se fijara generalmente con calor cuando sea requerido, según el método de

tinción que se utilizara posteriormente; material => portaobjetos, asa de siembra o platino,

agua estéril, muestra problema; técnica => pequeña cantidad de la muestra liquida se

deposita y se extiende homogéneamente en el centro del portaobjetos con el asa de siembra

para tener una capa fina (según la viscosidad, se puede diluir con unas gotas de agua

estéril); si la muestra es solida (una colonia), se deposita primero una gota de agua estéril y

se añade con el asa de siembra una pequeña cantidad de la colonia, se extiende

homogéneamente; dejar secar al aire; se fija mediante el flameado (en algunos casos se

podrá hacer con alcohol) para coagular las proteínas y los gérmenes quedan adheridos al

portaobjetos.

Técnica de tinción - los pasos:

-realizar un frotis y fijación por calor (generalmente), con la intensidad de calor adecuada

que soporte el dorso de la mano.

-coloración segun el tipo de tincion (generalmente con colorantes basicos que tiñen

estructura acida)

-decoloración que permite diferenciar distintos grupos bacterianos (genero Micobacterium

son resistentes a la decoloracion ácida/BAAR); Gram- decoloradas con el alcohol

96º/alcohol acetonas, alcohol acido, acidoclorhidrico => micobacterias

-lavado siempre entre paso y paso con agua destilada para evitar interferencias entre un

producto y otro.

-coloración de contraste (generalmente ácido), se aplican al final para las estructuras

decoloradas con el decolorante, p.ej. safranina.

-observación al microscopio

Tipos de tinciones bacterianas:

48/168

(1) Tinción simple => fijación previa, se utiliza 1 solo colorante, permite la visualización

de la morfología y la agrupación bacteriana; clasificación => tinciones simples con

colorantes básicos, ácidos y neutros; se basa en => la afinidad de los colorantes que suelen

ser de tipo básico (azul de metileno, violeta de genciana, azul de toloudina => 1-2 minutos,

dan color azul a las celulas o fucsina fenicada diluida => da color rojo a los componentes

celulares.

(2) Tinción negativa => es un tinción simple (1 solo colorante => tinta china o solución

acuosa de nigrosina al 1%) con diferencias que no necesita fijación previa (no mata las

bacterias), permite observar características estructurales de la bacteria ademas de su

morfología sobre un fondo oscuro, como es la presencia de capsulas p.ej. los

neumococos; se basa en => colorante acido cargado negativamente, los microorganismos no

se tiñen (se quedan claros y brillantes sobre un fondo teñido oscuro); para obtener una capa

fina (para dejar pasar el paso de luz del microscopio y evitar a formarse grietas al secarse el

colorante) se puede hacer una extensión con el borde de otro portaobjetos; resultado => se

observan las capsulas (si las tienen) en forma de un halo mas claro que rodea el cuerpo de la

bacteria.

(3) Tinciones diferenciales => fijación previa (en general por calor), se utiliza 2

colorantes(el ultimo es de contraste), permite visualizar su morfología y características

estructurales (composicion de la pared bacteriana, su resistencia a la decoloración ácida

(t.Gram y t.ZhielNeelsen).

(4) Tinciones estructurales => fijación previa (en general por calor), se utiliza al menos 2

colorantes, nos permite observar su morfología y características estructurales como esporas,

flagelos, cilios, capsulas, corpúsculos metacromáticos (utiliza 1 solo colorante???).

Tinción diferenciales de Gram => descubierto en 1883 por Cristian Gram, cuando

trabajaba con material de biopsias y utilizada a partir de 1886 como tinción diferencial; es

mas empleado en bacteriología, para clasificar 2 grandes grupos (Gram+ y Gram-); distinto

comportamiento debido a la distinta composicion de la pared de las celulas bacterianas; se

emplea como el primer colorante básico (cristal violeta o violeta de genciana) que teñirá de

color azul violeta todas las bacterias, posteriormente un mordiente el lugol que aumenta la

afinidad del primer colorante a las celulas (lo fijara), finalmente un agente decolorante que

decolora solamente un tipo de bacterias (Gram-) que serán teñidas con el colorante de

contraste o segundo colorante (la safranina) de color rosa-rojo; si se quedan con el color

azul violeta serán Gram+.

49/168

Material de la tinción Gram => portaobjetos, pinzas de madera, asa de siembra, mechero

de Bunsen, pipeta Pasteur, asa de tinción (punte), frasco lavador, muestra problema, aceite

de inmersión, colorantes para la tinción de Gram.

Técnica:

- realizar la preparación de frotis => extender 1 gota de agua destilada estéril + una colonia

de la bacteria problema por la superficie de la portaobjeto

- fijación por el calor, pero no quemar las bacterias

- aplicar el colorante cristal violeta durante 1,5 minuto o violeta de genciana durante 2

minutos

- lavar abundantemente con agua para eliminar el exceso de colorante

- añadir un mordiente, el lugol durante 1 minuto (solución iodoiodura de potasio con OH de

96º o con acetona a 5/1 o con OH 50%)

- vuelve a lavar con agua el exceso

- decolorar con solución decolorante (alcohol 90º)

- lavar abundantemente con agua

- cubrir el portaobjetos con la safranina durante 1 minuto

- lavar con agua para arrastrar los restos de colorantes y dejar secar al aire

- observar con objetivo de inmersión (100x).

Tinción de gérmenes del acido alcohol resistentes (BAAR + criptococo)

A. Tinción de Ziehl-Neelsen

Este método fue desarrollado por Ehrlich en 1882 trabajando con bacilo de Koch y

mejorado posteriormente por Ziehl-Neelsen; objetivo => diferenciar del resto, las bacterias

tipos BAAR (bacterias acido alcohol resistentes, p.ej. Mycobacterium), debido a su gran

cantidad de componentes micólicos (lipoideos y cereos/cera) que forman parte de la pared

de este tipo de bacteria (los colorantes convencionales no penetran en el interior de estas

bacterias); De ahí se necesitan colorantes altamente concentrados y la presencia de calor

que facilite su penetración al interior de dichas bacterias; una vez teñidas, su decoloración

posterior no es posible (resiste incluso a decoloraciones ácidas); dicha tinción se emplea

principalmente para el diagnostico y estudio de enfermedades como tuberculosis y la lepra.

Material => es el mismo que esta descrito en la tinción simple, pero en cuanto los

reactivos:1º colorante - solución fenicada de fucsina básica (carbo fucsina), 2º colorante de

contraste - solución hidro-alcohólica de azul de metileno fenicado, 3º decolorante - alcohol

acido al 3%(97% alcohol).

Técnica => preparación de frotis y fijación calor; cubrir el frotis con fucsina fenicada

básica 5 minutos aplicando en este tiempo calor, hasta la emisión de vapores, evitando que

se caliente demasiado o que se seque el colorante; lavar abundantemente con agua

destiladahasta arrastrar el colorante; decolorar con alcohol acido para arrastrar restos del

colorante (10-30 segundos); lavar abundantemente con agua destilada; cubrir el frotis

con colorante de contraste /azul de metileno fenicado 30 segundos sin necesidad de

calentar, para teñir aquellas bacterias que no son resistentes a la decoloración (se han

decolorado) y resaltar el color rojo de los BAAR+; lavar, secar, rotular y observar con

objetivo de inmersión.

50/168

Resultados => con el 1º colorante, BAAR- y BAAR+ (ambas) se tiñen de rojo; con el

decolorante, BAAR- se decoloran y BAAR+ no se decoloran; con el 2º colorante (de

contraste), BAAR- setiñen de azul y BAAR+ permanecen de color rojo/ acido alcohol

resistencia+ (bacilos Mycobacterium y algunos Nocardia)

B. Método de Kin Youw modificado (coloración en frió) Reactivos => 1º colorante:

fucsina fenicada (con fenol) de KinYouw, decoloración a 3%, 2º colorante: azul de metileno

fenicado (con fenol); técnica => idéntica, salvo para la fucsina de KY, dejamos actuar 5

minutos sin calentamiento; existen otras técnicas de tinción de los BAAR => tinción de

auramina o de rodamina que usan microscopio de fluorescencia.

Tinción de espiroquetas (para las espiroquetas)

Tinción estructurales => tinción de esporas, de flagelos, de cilios (similar a flagelos, pero

corto y se extiende por todo el cuerpo, como pilis), de corpúsculos metacromáticos y de

capsulas.

Tinción especiales => tinción de auramina y de naranjo de acridina.

Tema 12 - Pruebas bioquímicas para la detección del

metabolismo hidrocarbonado de las bacterias.

Metabolismo - conjunto de reacciones químicas que tiene lugar en las celulas vivas;

necesitan energía que se obtiene por oxidación (perdida de electrones) de sustancias

introducidas en forma de alimentos; la gran mayoría de las bacterias (heterótrofas) se nutren

de sustancias orgánicas que proceden de otros seres vivos y otras (autótrofas -

cianobacterias) se nutren de sustancias orgánicas que sintetizan ellas mismas a partir de

sustancias inorgánicas; 3 etapas en metabolismo =>

1ª-catabolismo/hidrólisis/degradación de sustancias nutritivas => compuestos mas sencillos

+ energía en forma de ATP (adenosin trifosfato)

2ª-anfibolismo/metabolismo intermedio del producto del catabolismo => compuestos de

bajo peso molecular

3ª-anabolismo/metabolismo biosintético de sustancias simples => biosíntesis de

macromoléculas /moleculas complejas + gasto de energía.

Enzima - catalizadores biológicos (proteínas); cada enzima afecta solo a un sustrato

especifico.

Reducción => captan electro nes.

Catabolismo de hidratos de carbono - oxidación de azucares para obtener la energía es

muy importante, aunque también se catabolizan lípidos y proteínas; la 1ª etapa de la

degradación de la glucosa => oxidación de esta para formar acido pirúvico (glucólisis); 2

procesos => la respiración (necesita O2) o la fermentación (no necesita O2); la glucólisis

(no precisa O2) se produce en 3 vías, en función de la dotación enzimática.

1º vía glucolítico/ ruta de Embden-Meyerhof Parna (EMP) fue descubierto

porPasteur => se obtiene 2 moleculas de ATP mediante fosforilación por cada molécula de

glucosa que se oxida; este proceso se puede realizar en presencia o no de O2; a partir de la

formación de acido pirúvico, las bacterias que usan esta vía, normalmente utilizan la vía

fermentativa para acabar transformando este acido pirúvico en ácidos mixtos; degradación/

hidrólisis de glucosa (6C) => acido pirúvico + 2 ATP (fosforilación) => ácidos mixtos

(fermentacion); son 9-10 reacciones químicas con un enzima diferente en cada una;

utilizados por las bacterias fermentadoras que poseen deshidrogenasas (Clostridium,

51/168

Enterobacter, Salmonella)

2º vía de las pentosas fosfato /vía fosfoglucónica (vía HMP) - es una ruta mixta y vía

alternativa; este ciclo rompe los azucares de 5 carbonos /pentosas

y también glucosa,mediante sucesivas reacciones y produce => pentosas

intermedias (precursores de síntesis de ácidos nucleicos y ciertos aminoácidos) de gran

utilidad para las celulas; ademas de la glucólisis via EMP, muchas bacterias utilizan HMP

como una vía alternativa para la oxidación de la glucosa => produce acido láctico o acido

mixto + 1ATP (p.ej.Enterobacterias/ E.coli); esta vía es un híbrido de la vía ED y la EMP,

ya que en las primeras etapas, la oxidación de la glucosa es similar a la via ED y en las

etapas posteriores es similar a la vía EMP, es decir: proporcionan a las bacterias no

oxidativas un medio de oxidar la glucosa a acido pirúvico puro, porque no tienen las

enzimas necesarios para comenzar la vía EMP, apareciendo en los sistemas analíticos como

fermentadoras.

3º vía de Entner-Doudoroff (vía ED/ vía aerobia => requiere O2) - es otra vía por la cual

la glucosa se oxida a acido pirúvico; por cada molécula de glucosa se producen 1 molécula

de ATP para ser utilizada por la célula en reacciones bio-sintéticas; esta vía requiere

enzimas específicos y solo los microorganismos que las poseen pueden utilizarla sin seguir

la vía de las pentosas fosfato ni la glucólisis; los microorganismos que la utilizan

sonPseudomonas y Neisseria (aerobio estricto), por carecer de las deshidrogenasas

necesariaspara oxidar el acido pirúvico al acido láctico u otros ácidos; los hidrogeniones se

transfieren al ciclo de Krebs y se acabaran obteniendo agua; oxidación de glucosa => acido

pirúvico + 1ATP (no producen acido láctico ni acido mixto)

Respiración - es un proceso fosforilación oxidativa de generación de ATP y se caracteriza

por el aceptor final de electrones generalmente es una molécula inorgánica (O2); la glucosa

se degrada => acido pirúvico se sigue oxidando por la vía de la respiración o la

fermentación (en función del sistema enzimático que tienen) => ATP + CO2 + H2O;

durante la respiración, cualquier molécula orgánica puede ser degradada /oxidada con un

mayor rendimiento que en la fermentación.

Respiración aeróbica - cuando el aceptor final de Hidrógenos (electrones) es el O2; en la

respiración, el acido pirúvico producido por la glucólisis se escinde en 2 partes: una parte se

unen con CoA => forman acetil CoA que entra en el ciclo de Krebs donde se liberan

electrones y protones (H+); la otra parte para biosíntesis???

Cadena de transporte de electrones (se encuentra en la membrana citoplasmática de las

celulas procarióticas y en las membranas internas de las mitocondrias en las celulas

eucarióticas) - los electrones se mueven desde los coenzimas reducidos hasta una molécula

inorgánica como O2 en la respiración aeróbica o hasta una molécula inorgánica diferente

del oxigeno NO3- ion nitrato, SO2-4 ion sulfato, etc.; las moleculas transportadoras de

electrones son 3 tipos => [1] flavoproteínas - realizan reacciones de oxidación reducción,

[2] citocromos - proteínas con un grupo prostéticos (Fe) en forma oxidada, [3] ubiquinonas

o coenzima Q - transportadores no proteicos de bajo peso molecular.

Respiración anaeróbica - cuando el aceptor final de electrones (H-) es una sustancia

inorgánica distinta del O2, tal como iones nitratos NO-3, sulfatos SO2-4, carbonatos CO2-

3. (Pseudomonas y Bacillus)

Fermentación - proceso que se inicia a partir de acido pirúvico formado en la glucólisis de

EMP /HMP, en cual el aceptor final de los electrones es un compuesto orgánico y no

requiere O2; características principales => (1) no precisa O2, pero se puede ocurrir en su

presencia, (2) no necesita el ciclo de Krebs ni cadena transportadora de

52/168

electrones, (3) utiliza1 molécula orgánica como aceptor final de electrones, (4) libera

energía a partir de azucares y otras moleculas orgánicas (aminoácidos, ácidos orgánicos,

purinas, pirimidinas), (5) libera solamente 2 moleculas de ATP por cada molécula del

sustrato inicial, (6) los productos finales pueden ser acido láctico, etanol y CO2, acido

propiónico, acido acético, CO2 y agua, acido butírico, etc. (compuesto orgánico); cuando el

aceptor final de electrones es el lactato, se producirá acido láctico y en general cuando el

aceptor final sean otras sales orgánicas, se formaran ácidos mixtos p.ej. acido succínico, que

son responsables de la caída de pH en las pruebas empleadas, para la identificación

bacteriana; ademas, las bacterias que tienen la dotación enzimática apropiada, pueden seguir

degradando estos ácidos mixtos hasta CO2 y otros compuestos orgánicos; es útil el análisis

de los productos finales para identificar así los microorganismos; la mayor parte de la

energía producida en la fermentación queda almacenada en los productos finales; las

fermentadoras => Streptococcus, Lactobacillus, Clostridium, Escherichia, Salmonella,

Enterobacter.

Prueba de la B-D Galactosidasa (ONPG) - se basa en la capacidad que tienen los

microorganismos de fermentar lactosa, mediante 2 enzimas => Lactosa Permeasa (esta en la

membrana celular y es capaz de transportar la lactosa a traves de ella) y B-D-

Galactosidasa (esta en el interior de la célula y es capaz de desdobla la lactosa en glucosa y

galactosa).

Clasificación de los microorganismos segun su capacidad de fermentar o no la lactosa:

- fermentadores activos de lactosa en 24 horas (poseen ambos enzimas)

- no fermentadores de lactosa (carecen de ambos enzimas, no degradan la lactosa, no

penetra en la célula)

- fermentadores tardíos de lactosa (poseen el enzima B-D-Galactosidasa, permeabilizar la

lactosa ligeramente cuando la concentración es alta en 2-15 días).

La aplicación fundamental es la diferenciación de Enterobacteriaceae =>Escherichia

(+) es fermentadora activo, Proteus (-) es no fermentadora y Klebsiella (+) es una

fermentadora tardía de lactosa, es decir lactosa (-) y ONPG (+); para detectar la enzima B-

D-Galactosidasa => se utiliza un compuesto similar a la lactosa (orto-nitrofenol): al

liberarse al medio alcalino por la acción de BDG produce un color amarillo.

Material => 1 tubo de ensayos estériles, baño maría o estufa a 37ºC, asa de siembra,

solución fisiológica esteril, discos de ONPG, microorganismo problema

Técnica => una suspensión densa (con muchas colonias) de un cultivo puro en 0,5 ml de

suero fisiologico estéril se añade un disco de ONPG y mezclar durante unos segundos,

incubar a 37ºC durante 30-60 minutos (en general se vira antes de 30 minutos)

Resultados => en ONPG+ se produce una coloración amarillo y en ONPG- no se produce

color (incoloro).

53/168

Tema 13 - Pruebas bioquímicas para la detección del

metabolismo proteico de las bacterias

Principal productor de energía => catabolismo de la glucosa y las oxidaciones de

proteinas y lípidos (estan relacionados entre si); la hidrólisis de proteínas/ proteína+agua

(mediante enzimas proteolíticos extracelulares, secretadas por ciertas bacterias que sirve

para su tipificación/tipación) => polipéptidos y aminoácidos; las pruebas bioquímicas

investigan fundamentalmente la capacidad de un microorganismo de producir la hidrólisis

de la gelatina; catabolismo de proteínas/ proteólisis se realiza mediante

proteinasas/proteasas y peptidasas (desaminación) para obtener => ion amonio NH4+ (+)

acido orgánico; acido orgánico entrar al ciclo de Krebs y ion amonio NH4+ es secretado de

la célula.

Producción de acido sulfhídrico - técnica con indicador incorporado al tubo/a la placa =>

algunos microorganismos actúan metabolizando proteínas con aminoácidos

azufrados (cistina, cisteina) y liberan azufre en forma de gas acido sulfhídrico SH2; el gas

es detectado a traves del medio que contiene fuente de hidrógeno (azucar) fuente de

azufre(tiosulfato sodio, cistina, cisteina) y un indicador de pH (sales de hierro /citrato

férrico amoniacal) => un precipitado negro); se observara la liberación del gas SH2 por

algunos microorganismo que poseen enzimas desulfurasas (activada por la fermentación de

la glucosa => acidifica/produce ácidos/baja el pH) que actúan sobre los aminoácidos

azufrados; la temperatura de incubación (estufa) tiene que oscilar entre 35-36ºC (superior a

37º se inhibiría la producción de SH2).

Material => tubo de cultivo (KIA/kliger iron agar y TSI/triple sugar iron), agujas y asas de

siembra, estufa de cultivo, muestras de problema; si se realiza en placa de cultivo (Hektoen

y SS);

Técnica => a partir de un cultivo puro y reciente de microorganismo problema se tomara

una muestra con una aguja; sembrar en picadura (tubo de KIA o TSI) o con agotamiento en

cuadrante (Hektoen o SS); incubar durante 18-24 horas; si la técnica se realiza

con Brucella(microaerofila), se debe incubar con una atmósfera de CO2.

Resultados => SH2 positivo (Salmonela y Proteus) se observa a lo largo de la linea de

inoculación ennegrecimiento del medio; SH2 negativo (Brucella y Shigella) no se

ennegrece el medio.

Bacteria con enzimas desulfurasas (activada por la fermentación de azucar) + indicador de

pH/sales de Fe + fuente de S + (H+) => H2S gas + indicador pH => precipitado negro

insoluble/ puntos negros (FeS)

Prueba de las descarboxilasas - enzimas que actúan sobre el grupo carbóxilo de los

aminoácidos Lisina, Ornitina, Arginina para formar => aminas (alcalinas) y se desprende

CO2 (el proceso se realiza en anaerobiosis) => se realiza mediante el sistema multiprueba

(API - buscar el código en el libro); estas pruebas se aplican para la identificación de

Enterobacteriaceas; se investiga la alcalinización del medio inicialmente de color purpura,

54/168

se observara el viraje del color del indicador del pH; la presencia del enzima investigado

supondrá la alcalinización del medio (sigue el mismo color como el inicio); cada pocillo

contiene indicador de pH y amino acido correspondiente al enzima a investigar; cada

descarboxilasa actúa sobre un aminoácido especifico; en cada reacción se desprende CO2 y

se alcaliniza el medio:

- L-lisina + LDC/lisina descarboxilasa => Cadaverina + CO2

- L-ornitina + ODC/ornitina descarboxilasa => Putrescina + CO2

- L-arginina + ADH/arginina deshidrolasa => L-citrulina + NH3 (descarboxilación) =>

Putrescina +CO2

Material => pruebas de API, pipeta Pasteur.

Reactivos => caldo de Moller para descarboxilasas (lleva pequeña cantidad en su

composicion una pequeña cantidad de glucosa, peptonas y los indicadores rojo cresol y

purpura de bromo cresol, pH6); aminoácidos ensayados en forma L, muestra de problema y

papel parafina.

Técnica => se añade una gota del inoculo (suspensión microbiana) en cada pocillo de la

prueba de API; se incuba a 35ºC durante 18-24 horas.

Resultados => durante las primeras horas de incubación, el caldo vira a amarillo, por la

fermentación de glucosa que lleva el medio; pero si el aminoácido es descarboxilado, el pH

vuelve a subir, ya que se forma aminas alcalinas que es de color purpura (descarboxilasa+);

si se queda amarillo sera descarboxilasa-; gérmenes con descarboxilasa+ (Escherichia no es

100% descarboxilasa+ de Lisina, Arginina y Ornitina):

- Lisina => Klebsiella, Serratia, Salmonella

- Ornitina => Serratia, Proteus, Salmonella

- Arginina => Salmonella, Pseudomonas

Tema 14 - Pruebas bioquímicas para la detección de la

actividad enzimática de las bacterias

Pruebas oxidasa - esta denominación se le da de forma genérica al enzima citocromo

oxidasa que participa en la transferencia de electrones en la cadena respiratoria hacia el

oxigeno; oxidasa => enzima que cataliza la transferencia de electrones del sustrato al

oxigeno; los aerobios o anaerobios facultativos obtienen su energía por la respiración y la

almacenan en forma de ATP, el oxigeno es reducido a partir de un sustrato orgánico que

procede de la nutrición con la intervención de un sistema de transporte de electrones

denominado cadena respiratoria, produciéndose agua o peróxido de hidrógeno según la

especie microbiana; los citocromos son hemo-proteínas que contiene Fe y actúan como

ultimo eslabón de la

cadena respiratoria aerobio, transferiéndo H+ al O2 con formación de H2O; este sistema se

encuentra en los organismos aerobios y anaerobios facultativos, carenciandolo de ello los

anaerobios estrictos; se observara el cambio de color de un indicador de pH incoloro cuando

55/168

esta reducido (p-fenilendiamina=> formar indofenol de color violeta oscuro) y coloreado

cuando se oxida;

Aplicación => detectar en el microorganismo estudiado el enzima citocromo oxidasa;

diferenciar entre Enterobacteriaceas (oxi-) de Pseudomonadacea (oxid+); diferencia entre

géneros Moraxella (oxi+), Neisseria (oxi+) de Acinetobacter (oxi-).

Material => placa sembrada con microorganismo problema, asa de plástico, papel de filtro,

porta, reactivo oxidasa de Kovacs.

Técnica => mezclar una pequeña muestra pura con el reactivo en el papel de filtro que se

sitúa por encima de una porta, esperar 30-60 segundos y se observar el posible cambio de

color; otra manera: se añade directamente el reactivo oxidasa de Kovacs sobre las colonias

de la placa Petri con agar sangre y también en otro medio; si son oxidasa positivo toman un

color marrón y en seguida pasan a negro parduzco.

Resultados => oxidasa+ aparece un color purpureo en el papel, si se desarrolla el color a

los 10-60" se considera oxidasa retardado positivo, después de 60" es negativo; oxidasa- no

se produce color.

Pruebas de catalasa La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayoría de los microorganismos aerobios

y anaerobios facultativos que contienen citocromo; es un enzima fundamental que actúa

sobre el peróxido de hidrógeno /H2O2 (es un producto final de la degradación aerobica

oxidativa de los hidratos de carbono); si se acumula H2O2, estos gérmenes morirían;

fundamento: si el microorganismo tiene el enzima catalasa y se pone en contacto con H2O2

=> se descompone en H2O + O2; aplicación => diferenciación de Streptococcus (-) de

Staphylococcus (+) y Micrococcus (+);

Material => portaobjeto, pipeta Pasteur, asas de siembra de plástico (las de platino

catalizará la reacción)

Reactivo => H2O2/ agua oxigenada, microorganismo de problema

Técnica => se coloca una gota de H2O2 (agua oxigenada) en un porta objeto,

simultáneamente, con una asa se añade una colonia del cultivo del microorganismo de 12-

24 horas, homogeneizar y observar.

Resultados => catalasa+ forma burbujas de O2 inmediatamente; catalasa- no aparecen

burbujas; se podrán observar falsos positivos si se utilizaran medios de cultivo agar sangre o

otros que lleven hematíes (los hematíes contiene catalasa).

56/168

Pruebas de Nitrato reductasa o Nitratasa (se realiza con multiprueba de API)

La nitratasa (nitrato reductasa) es el enzima que cataliza el proceso en cual el nitratos son

reducidos a nitritos (presentes en algunos microorganismos anaerobios o anaerobios

facultativos que utilizan nitrógeno como ultimo aceptor de electrones en el proceso

metabólico/ respiración anaeróbica); depende de la especie bacteriana se trate, se pueden

producir diversos productos finales; reacción: nitrato/NO-3 + nitratasa => nitrito/NO-

2 =>N2 (nitrógeno molecular/ gas nitrógeno) o otros => amoniaco / oxido nítrico / oxido

nitroso / hidroxil amina; la prueba detecta los productos finales liberados al medio mediante

un reactivo colorimétrico API; aplicación => diferenciación de especies de Haemophilus y

Neisserias; cuando no se forma color (rojo) al añadir los reactivos, puede

significar => [1] no se ha reducido el nitrato, se comprueba añadiendo polvo de zinc que

actúa como reductor y si hay un cambio al rojo, es nitratasa (-) y si no hay cambio de color,

sera nitratasa (+); [2] la reducción de nitratos ha sido llevada hasta la formación de N2, se

observa con la aparición de grietas o burbujas; [3] la reducción de nitratos ha formado otros

productos nitrogenados (oxido nítrico, amoniaco, hidroxil-amina, etc.);

Material => multiprueba de API; reactivo => Nit A y Nit B, Zinc en polvo,

microorganismo; el medio no debe contener azufre ya que si el microorganismo es

productor de H2S (acido sulfhídrico) este impide la formación de color; técnica =>

hacemos un inoculo a partir de un cultivo puro reciente de 12-24 horas, inoculamos el

medio; incubar a 37ºC durante 12-24 horas, agregar 1 gota de Nit A y 1 gota de Nit B,

observar si hay un cambio o no antes de 30 segundos (se interpreta rápido, ya que el color

puede desaparecer); si no se forma color, se añade al tubo un poco de polvo de

Zinc; resultados => hay 2 posibilidades de que sean Nitratasa+ (Haemophilus y

Branhamella Catarallis): [1] cuando aparece color rojo o rosado fuerte al añadir el reactivo

A y B que indica la reducción de nitratos a nitritos; [2] al añadir polvo de zink no se

desarrolla color indica formación de otros productos nitrogenados;Nitratasa- => cuando se

forma color rojo o rosado al añadir polvo de zinc en menos de 30 segundos.

Prueba de Ureasa (se hace en manual y con el sistema API) - detecta la presencia de la

ureasa en los microorganismos cuando se observa la alcalinización de un medio liquido; la

ureasa cataliza la hidrólisis de la urea => carbonato amónico, que sube el pH, con lo que el

medio se alcaliniza; aplicación => diferenciar Proteus (+) de otras Enterobacteriaceas /

E.coli (-) o positivo retardado (+) como Klebsiella;

57/168

Material => tubos de cultivo, asas, pipeta Pasteur, estufa de cultivo o baño maría.

Reactivo => caldo urea de Stuart/ urea-indol (de color ámbar) y microorganismo de

problema

Técnica => con el asa estéril se toma una muestra de cultivo puro reciente 18-24 horas;

inoculamos el microorganismo en un tubo con caldo urea de Stuart; incubar 37ºC; la

reacción se produce entre 1-4 horas

Resultados => en ureasa (+) el caldo de color ámbar vira a rosa fuerte durante el tiempo de

reacción (1-4 horas); en ureasa (-) no vira el indicador; algunas cepas de Klebsiella,

Enterobacter, Brucella, requieren 6 días de incubación.

Prueba de Coagulasa (se hace con el kit comercial que contiene Acs anti coagulasa) -

observar la coagulacion del plasma en forma de grumos o precipitación al ponerse en

contacto el microorganismo con el reactivo (si se utiliza el plasma en la prueba); la

coagulasa es un enzima producido por microorganismos capaz de coagular en

plasma; aplicación => diferenciar Staphylococcus aureus (coco Gram+, catalasa+, beta

hemolítico + y coagulasa+) de otro Staphylococcus; esta prueba solo se hace si el germen es

coco Gram+, catalasa+, beta hemolítico +; técnica => (usando el kit comercial /prueba de

látex) seguir la instrucción de la casa comercial que hacen el

reactivo; resultados => coagulasa+ se observa en forma de grumos (si se utiliza un plasma

como reactivo => se observara la formación de un hilo de fibrina en la reacción) y

en coagulasa- no se forma grumos.

Prueba de Triptófano Desaminasa (TDA) - se basa en la capacidad que tienen algunas

bacterias de desaminar el triptófano por la acción de TDA, produciendo => acido indol

pirúvico que reacciona con citrato férrico amoniacal y el cloruro férrico que lleva el medio

produciendo un color marrón (determina la presencia de la enzima TDA); técnica => en un

medio liquido de TDA (color ámbar); se puede utilizar el reactivo urea-indol; añadimos 1

sola colonia de un cultivo puro y 1 gota de reactivo TDA del API, incubar a 37ºC entre 18-

24 horas, y leer; resultado => el color marrón/café indica la presencia de TDA+ y sera

negativo si no hay cambio de color; los géneros que tienen TDA+ => Proteus, Providencia

y Morganella.

Tema 15 - Pruebas bioquímicas simultaneas (macro-

técnicas, micro-técnicas, sistemas rápidos, otros

métodos)

58/168

Macrotécnicas - sistemas multiprueba que permiten realizar varias pruebas bioquimicas

simultáneamente, facilitando notablemente la identificación del microorganismos:

- Kliger Iron Agar (KIA)

- Triple Sugar Iron (TSI)

- Agar Sulfuro Indol Motilidad (ASIM) Motility Indol Agar (MIA)

- IMVIC

- Lisina Iron Agar (LIA)

- Motilidad Indol Ornitina (MIO)

KIA (Kligler Iron Agar) - se pueden realizar 3 pruebas a la vez:

- utilización de azucares (fermentacion glucosa 0,1% y lactosa 1%)

- producción de gas (CO2)

- producción de acido sulfhídrico (SH2)

Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador

rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce

a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico

sulfuro de hierro de color negro.

Fundamento => cuando el microorganismo fermenta los azucares, se acidifica el medio

porque se forman ácidos orgánicos; si el medio no tienen azucares como fuente de hidratos

de carbono, utilizara proteínas que alcalinizan el medio por la formación de aminas; las

proteínas en condiciones de aerobiosis (en el pico) se metabolizan mejor por la vía de

descarboxilación oxidativa de los aminoácidos que en anaerobiosis (en el fondo); la glucosa

se metaboliza mejor que lactosa (la molécula es mas pequeña/sencilla); para metabolizar la

lactosa, el microorganismo debe tener B-D galactosidasa y lactosa permeasa.

Material => tubos de cultivo, asa y aguja de siembra, estufa de cultivo

Reactivo => tubo con agar KIA en pico de flauta (color rojo anaranjado), microorganismo

Técnica => es importante tener un tubo de control; se recoge una colonia puro y joven con

un aguja; inocular por picadura y estría un tubo de cultivo con medio KIA en pico de flauta;

incubar 18-24 horas a 37ºC; la reacción se ha de observar justo después de terminar el

periodo de incubación (suficiente tiempo para la fermentación del azucar); si se lee después

de 24 horas, se puede dar un falso alcalino, porque el germen habría utilizado la peptona y

el medio se alcaliniza; el pH esta ajustado a 7,4 (neutro) e indicador rojo fenol a 6,8

(cualquier cambio de pH va a virar el medio);

Resultados => se observaran los 3 parámetros: cambios de pH/color, producción de gas

CO2 (grietas en el medio/ se desplaza) y producción de acido sulfhídrico SH2 (precipitado

negro); siempre se compara con un tubo de control no inoculado.

Cambios de pH - [a] resultado final de la fermentación solo de la glucosa => K/A zona

superficial roja (reacción alcalina de las aminas) y zona profunda amarillo (reaccion

ácida);después de la fermentación de la glucosa, el medio de cultivo inicialmente es

amarillo entero, pero posteriormente la parte del pico se alcalina/rojo (había poca cantidad

de glucosa) por la descarboxilación oxidativa de los aminoácidos (que forman la peptona)

que se produce mejor en aerobiosis; la fermentación de glucosa en el pico es inicialmente

mediante la vía EMP, utiliza tanto para los aerobiosis y anaerobiosis, dando un intermedio

clave (acido pirúvico), que a su vez el acido pirúvico es degradado mediante el ciclo de

59/168

Krebs por los aerobiosis o anaerobiosis facultativos dando CO2 + H2O y ATP; en cambio,

en el fondo, el acido pirúvico es degradado hacia acido láctico y acido mixtos que mantiene

el pH acido de manera estable.; son características de Morganella, Providencia y

Shigella; también P.mirabilis, S.typhimurium, S.enteritidis, S.flexneri.

[b] en la fermentación de glucosa y lactosa => A/A zona superficial y profunda son

amarillas (características de E.coli y K.pneumoniae);

[c] no metabolizan ni lactosa ni glucosa (pero si la peptona) => K/K todo el tubo es de color

rojo (si se trata de anaerobiosis) o si se trata de aerobiosis, la zona profunda es de color

naranja (se alcalina mas la zona con mas O2 => Pseudomonas, P.aeruginosa)

[d] si no se consume ni glucosa, ni lactosa ni peptona => no hay cambio de color en el tubo

(gérmenes inertes).

Producción de gas CO2 - aparecen burbujas, agrietamiento o desplazamiento del medio

del fondo del tubo, debido a la formación de hidrógeno y de anhídrido carbónico (CO2)

Producción de acido sulfhídrico SH2 - se manifiesta por el color negro de la capa

profunda o un anillo negro cerca de la parte superior de la capa profunda o un precipitado

negro en la capa profunda (que puede enmascarar la acidificación del medio =>

fermentación de la glucosa activa la desulfurasas); SH2+ => Proteus y Salmonella.

TSI (Triple Sugar Iron) - identificación de Yersinia enterocolitica como sacarolítica

(también Proteus, Lactobacillus y Clostridium), ya que el medio lleva el 3er hidrato de

carbono (sacarosa al 1%); los fundamentos y la interpretación de los resultados son los

mismos que en el método anterior, pero es imposible saber si el azucar utilizado es uno u

otro o ambos.

Agar sulfuro-indol-motilidad/ ASIM o motility-indol-agar (MIA) - tal como indica su

nombre, sirve para determinar la motilidad de los microorganismos, la produccion de indol

y la formacion de acido sulfhidrico; la forma de realizarla es la siguiente => se siembra en

picadura y se incuba a 37ºC durante 18-24 horas; la motilidad se vera por la zona del

inoculo con un zig-zag (en la picadura); la produccion de indol se vera con un cambio de

color a violeta purpura (el medio es de color violeta clarito); la produccion de SH2 se vera

por un cambio a negro.

60/168

IMVIC (Indol - Motilidad - rojo de Metilo - Voges-Proskauer - Citrato) - se emplean en

la identificación de la familia enterobacteriaceas; se hacen de una en una y conjuntamente;

Prueba de indol => estudia el metabolismo proteico/ la capacidad de degradar el triptófano

(aminoácido) y de formar según la bacteria: indol y productos indólicos (escatol, acido

indol-acético), mediante triptofanasa (enzima intracelular).

Material => tubos de ensayo, asa de siembra, pipeta Pasteur, estufa de cultivo, mechero.

Reactivo => caldo urea-indol de la casa Biomerieux, reactivo indol de Kovacs,

microorganismo.

Técnica => Método de Kovacs: en el tubo con 500 lambdas de reactivo urea-indol, se

siembra el microorganismo problema, incubar a 37ºC durante 4 horas, añadir al cultivo 2

gotas de reactivo indol de Kovacs (debe ser siempre fresco), agitar suavemente el tubo y

dejar unos segundos en reposo.

Resultado => en indol+, aparece un anillo rojo en la superficie del medio (E.coli); en indol-,

no hay cambio de color (Klebsiella pneumoniae)

Prueba de rojo de Metilo => muchas enterobacteriaceas con importancia clínica (E.coli,

Proteus mirabilis, Yersinia, Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii, Sighella, Vibrio)

son anaerobios facultativos, que para tener energía para sus reacciones metabólicas, utilizan

la fermentación acido-mixta de los hidratos de carbono produciéndose => acido succínico,

acido acético, alcohol etílico (ácidos mixtos); en RM positivo, aparecen un color rojo fuerte

en la superficie y en RM negativo, no hay cambio en la superficie del medio.

Material => igual que anterior

Reactivo => Medio de Clark y Lubs en tubo (liquido amarillo), solución de rojo de metilo y

microorganismo

Técnica => (a) en el tubo del medio Clark y Lubs se siembra el microorganismo problema

(b) actualmente se utiliza la modificación de Barry que es poner un inoculo abundante en

0,5 ml de reactivo de Clark y Lubs y dejar incubar entre 18-24 horas (c) a este cultivo se le

añaden unas 5 gotas de indicador rojo de metilo que es rojo a pH 4,5 y amarillo a pH 6,3; el

medio cambiara de color cuando el pH sea inferior a 4,5.

61/168

Resultados => RM+ superficie del medio rojo fuerte y RM- => color amarillo en la

superficie del medio

Prueba de Voges Proskauer (2 microbiólogos) - lo podemos hacer en el API => la

fermentación butanodiólica/ butilenglicólica/ acetoínica (acetil metil carbinol) que es una

vía alternativa de metabolismo de acido pirúvico, se produce => un metabolito neutro

(producto intermediario), en presencia de aire y hidróxido potásico 40%/KOH (por

oxidación) se forma => diacetilo y añadiendo alfa naftol, se forma un complejo rojo; por

reducción, la acetoína forma => 2,3 butanodiol;

Material => multiprueba API y resto igual

Reactivo => Medio de Clark y Lubs (liquido amarillo), solución de alfa naftol

(VP2),solución de hidróxido potásico al 40% o hidroxilo sódico al 40% (KOH),

microorganismo problema.

Técnica => en un tubo de ensayo que contenga un medio de Clark y Lubs se siembra el

microorganismo problema, se incuba 24 horas a 37ºC, se añade 0,2 ml (200 lambdas)

solución KOH 40%, luego 0,6 ml de la solución alfa naftol, agitar e inclinar casi

horizontalmente el tubo para que se favorezca la oxidación de la acetoína, reposar el tubo

10 minutos e interpretar los resultados.

Resultados => en VP positiva (+), p.ej. Klebsiella pneumoniae y Enterobacter aerogenes,

antes de 1 hora aparece coloración rojo rosada en la superficie del medio; VP negativa (-

) p.ej.E.coli y Proteus, la superficie del medio queda de color amarillento o cobrizo (la

reacción de los reactivos al mezclarse); la mayoría de enterobacteriaceas en VP dan

reacciones opuestas a la reacción de RM (VP+ => RM- o VP- => RM+); las bacterias VP+

producen menor cantidad de ácidos mixtos que serán insuficientes para bajar pH del medio

con rojo metilo, por ello, cuando una bacteria es RM- => VP+.

62/168

Prueba del Citrato => se investiga la capacidad del microorganismo de utilizar el citrato

como única fuente de carbono y sales de amonio inorgánicas como fuente de nitrógeno, por

el crecimiento de colonias y el viraje de color del indicador incorporado en el medio

causado por la alcalinización; los microorganismos que utilizan el citrato, también utilizan

las sales de amonio; citrato sódico es una sal de acido cítrico que es uno de los metabolitos

del ciclo de Krebs y algunas bacterias pueden obtener energía por una vía diferente a la de

la fermentacion de los hidratos de carbono, utilizando al citrato como única fuente de

carbono;la alcalinización del medio es producido por la formación de amoniaco a partir de

las sales de amonio que había y la formación de carbonatos y bicarbonatos se debe a la

degradación del citrato.

Material => igual que anterior

Reactivos => medio solido de Citrato de Simmons en tubo con azul de bromotimol (agar

inclinado) y microorganismo de problema

Técnica => inocular un tubo de Citrato de Simmons con microorganismo mediante

escobillón, solo la lengüeta y guardar otro tubo que sirve de control negativo; incubar 24-48

horas a 37ºC dejando los tubos destapados para que se desprenda el CO2, leer los resultados

a las 18-24 horas de incubación.

Resultados => en Citrato (+) p.ej. Enterobacter aerogenes, aparece color azul intenso en la

superficie del medio y crecimiento de colonias en la lengüeta; en Citrato (-) p.ej. E.coli, no

aparece cambio de color (verde) ni crecimiento.

Micro-técnicas 1. Sistema en Tiras (API - Biomerieux)

El material y reactivos necesarios para la realización de estas pruebas se encuentran

comercializados en kits; fundamento => los medios deshidratados en micro-tubos se re-

hidratan mediante una suspensión de 5 ml de agua estéril con 1 colonia bacteriana y se

incuban; el proceso metabolismo del microorganismo, genera cambios del color en el medio

63/168

de cultivo o al añadir reactivos y esos cambios se interpretan mediante tablas de lectura o

ordenadores (se deben seguir rigurosamente las instrucciones del fabricante);

principalmente se utiliza para la detección de Enterobacteriaceas, bacterias aerobios no-

fermentativas, anaerobios, levaduras, estafilococos; después de utilizar todo debe ser

incinerado o descontaminado en autoclave o sumergido en un germicida.

2. Sistemas en Tubos (entero-Tube BBL)

Se utiliza para identificación de Enterobacteriaceas y otras aplicaciones; fundamento => un

tubo en forma de lápiz con numerosos compartimentos (normalmente son 8 con diferentes

medios, donde pueden leer hasta 11 características); este tubo se inocula (con 1 colonia del

medio y alambre de la inoculación atraviesa todas las cámaras) y se incuba, produce

cambios de color en cada compartimento; mediante un código numérico o colorimétrico, se

puede identificar al microorganismo.

3. Sistema rápidos - metodos automatizados

Cuando las muestras son procesadas a traves de metodos automatizados se logran

excelentes resultados en tiempo muy cortos (se deben seguir las normas dadas por los

64/168

fabricantes);

- Para detección primaria del crecimiento (espectrofotometría infrarroja) => detecta los

niveles de anhídrido carbónico (CO2), p.ej. BACTEC

- Para identificación (fotometría) => VITECK (crecimiento, identificación y antibiograma)

65/168

66/168

67/168

Tema 16 - Pruebas de sensibilidad a los anti-

microbianos

Antibiograma - estudio de la sensibilidad del microorganismo patológico a los

antimicrobianos; se debe hacer antes de establecer el tto de una infección microbiana;

diferentes metodos de antibiograma => (1) por difusión que daran resultados

cualitativos de resistencia, sensibilidad o intermedios a los diferentes ATB (2) por dilución

nos dará resultados cuantitativos en base a 2 conceptos (CMI/ Concentración Mínima

Inhibitoria y CMB/ CM Bactericida) (3) por detección enzimática, consiste en detectar la

enzima del germen que confiere resistencia a los ATB p.ej. detección de betalactamasa,

adenilasa, acetilasa, etc.

Clasificación de las sustancias anti-microbianas:

(a) un microorganismo es sensible => cuando ATB alcanza niveles plasmáticos => a CMI

en el lugar de la infección; CMI => la mínima cantidad de ATB capaz de inhibir el

crecimiento de un germen; CMB => la mínima cantidad de ATB que mataría al germen;

normalmente CMI es suficiente para combatir una infección y los mecanismos

inmunitarios se encargan de eliminar el microorganismo, siendo por tanto la CMI es el

termino mas utilizado.

(b) un microorganismo es resistente => cuando la concentración máxima de ATB que se

puede localizar en el lugar de la infección no es suficiente para eliminar el germen, es

decir, la concentración de ATB necesario para destruir el germen no se puede elevar mas

68/168

por efectos tóxicos secundarios.

(c) microorganismo de sensibilidad intermedia => no esta afectado por dosis normales de

ATB dadas a intervalos normales, pero con una dosis alta en el lugar de la infección sin

llegar a dosis que produzcan efectos tóxicos, puede eliminar el germen.

Casos clínicos => Pseudomonas que da problemas respiratoria/ urinaria y es resistente a

casi todos los ATB, se dará una dosis toxico o una combinación de ATB por vía

endovenosa.

Normas básicas => no efectuar un antibiograma directamente del producto patológico, ni

tampoco utilizar mezclas de gérmenes (se debe realizar un aislamiento por agotamiento en

placa), excepto para muestras de orina ambulatoria (normalmente es una infección mono-

microbiana); para elegir un ATB se deberá ensayar aquellos que son útiles clínicamente y se

encuentran disponibles en el mercado farmacéutico.

Factores a tener en cuenta => (1) características tintoriales del germen (Gram+o-) (2)lugar

de la infección (especialmente las vías urinarias y meningitis); es importante porque es

necesario que la CMI sea alcanzable en los líquidos corporales para que sea

efectivo (3)bacteria investigada.

La selección de ATB representativo de cada grupo para realizar las pruebas de

sensibilidad Normalmente se selecciona un ATB representativo de cada grupo para realizar las pruebas

de sensibilidad; habitualmente se acepta que no es necesario hacer pruebas de sensibilidad

para un ATB cuando no se han descrito resistencias en esas especies, p.ej. Streptococcus

pyogenes.

69/168

1. Betalactámicos => todo el grupo tiene en común que presenta un anilla betalactámico y

el mecanismo de acción consiste en inhibir la formación de peptidoglicano de la pared

celular; son bactericidas.

a. Penicilinas - tiene espectro desigual => aveces es mas efectivo a uno pero no a otro.

* Penicilina G sodica - la forma oral es P V

* Amoxicilina - infección del tracto respiratorio inferior: bronquitis aguda y crónica,

neumonías bacterianas y bronconeumonía, producidas por

estreptococo, estafilococo sensible,neumococo y H.influenzae. Gastrointestinal: fiebre

tifoidea o paratifoidea. Genitourinaria: cistitis, uretritis, pielonefritis, bacteriuria, gonorrea,

aborto séptico, sepsis puerperal. De piel y tejido blando (incluida infección de herida

quirúrgica), por estreptococo, estafilococo sensible y E. coli.

* Amoxicilina + acido clavulanico (es un inhibidor de las betalactámasas producida por

algunas bacterias)

b. Cefalosporinas - actualmente se ha desarrollado la 4ª generación (semi-

sintéticos; bacteriostáticas frente a cocos Gram+ y bacilos Gram-)

* Cefotaxima (indicado para gonorrea; profilaxis quirúrgica; epiglotitis y meningitis

porHaemophilus)

* Cefuroxima (efectividad contra Neisseria gonorrheae y otras bacterias productoras de

penicilinasa; es activa contra Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus,

Staphylococcus epidermidis y estreptococo beta-hemolítico; son susceptibles Escherichia

coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis)

2. Derivados de betalactámicos:

* Aztreonam - se utiliza comúnmente frente a las infecciones causadas por Pseudomonas

aeruginosa, pero su espectro abarca a las enterobacterias (incluida Escherichia coli), como

p.ej. Klebsiella, Haemophilus, Citrobacter y Proteus.

3. Aminoglicosidos => en general su mecanismo de acción es la inhibición de la síntesis de

proteína en diferentes fases según el ATB; en general derivan de los hongos y son

potentesbactericidas; son de amplio espectro y provocan toxicidad renal y audio

vestíbular en alta dosis o a las personas susceptible.

* Estreptomicina (tratamiento de infecciones causadas por gérmenes sensibles,

como:Mycobacterium tuberculosis, Salmonellas, enterococos, estreptococos, neumococos y

algunos Gram- como Haemophilus influenzae; es eficaz en infecciones del tracto

respiratorio)

* Gentamicina (Actúa sobre bacterias Gram- aerobias, incluyendo enterobac-

teriáceas,Pseudomonas y Haemophilus. Actúa también sobre estafilococos (S.aureus y

S.epidermidis)

* Tobramicina (Infecciones del tracto respiratorio inferior como neumonía,

bronconeumonía y bronquitis aguda causadas por P.aeruginosa, Klebsiella sp.,

Enterobacter sp., Serratia sp., E.coli y S.aureus)

* Neomicina (es activo in vitro contra Escherichia coli, Klebsiella y contra flora anaeróbica

intestinal)

4. Lincosamidas => inhibe la síntesis proteica

* Clindamicina (es un buen ATB frente anaerobios) - Su actividad antibacteriana es similar

a la de eritromicina (macrolidos) en contra de estafilococos y estreptococos; además es

efectiva en contra de anaerobios, en especial Bacteroides fragilis.

5. ATB polipeptídicos y glucopeptídicos => su mecanismo de acción es inhibir la

70/168

formación de peptido glicano de la pared celular (bactericidas)

a. Activos frente a Gram+ * Bacitracina - es utilizado para la identificación del estreptococo del grupo A a cual es

sensible; es bactericida; se utiliza tópicamente para infecciones cutáneas (por su efecto de

nefrotoxicidad) actúa sobre cocos y bacilos Gram+ (Neisseria y Treponema pallidum)

* Vancomicina - por su alta toxicidad renal y óptica, se reservan para infecciones de

Gram+ resistentes; es bactericida; tiene acción ante cocos Gram+ y bacilos Gram+

b. Activos frente a Gram- => ambas (polimixinas) se usan tópicamente sobre Gram-,

también se usa como ATB de identificación; tienen acción ante entero-

bacterias (exceptoProteus, Providencia y Serratia), Pseudomonas aeruginosa, Vibrio,

Pasteurella, Haemophillus y Bordetella; son ATB de segunda elección (para bacilos Gram-

resistentes a otros ATB)

* Polimixina B

* Polimixina E (Colistina)

c. Activos frente a Mycobacterium tuberculosis

6. Otros * Fosfomicina - es un ATB de origen español de un amplio espectro que actúa sobre la

pared celular (se usa en infección urinaria)

* Acido fucsidico - actúa sobre la síntesis proteica y destaca su acción sobre Staphylococcus

aureus.

7. Tetraciclinas - son bacteriostáticas y su mecanismo de acción es inhibir la síntesis de las

proteínas; no se deben administrar a menores de 8 años por tener efecto secundarios

sobre la dentición y los huesos; también pueden producir toxicidad sobre el tracto

gastrointestinal y el higado; son de amplio espectro; origen biológico o semi-

sintético; activas frente a cocos y bacilos Gram+ y Gram- aerobios;

son fármacos de elección en brucelosis, cólera, granuloma inguinal (ETS).

* Tetraciclina

* Doxiciclina - es el tratamiento de fiebre tifus, fiebre Q, erupciones

pustulosas por Ricketsiasy fiebre de las montañas rocosas por Ricketsias, infecciones del

tracto respiratorio causadas por Mycoplasma pneumoniae; el tratamiento de infecciones

causadas por Gram-: chancroidecausado por Haemophilus ducreyi, plaga debida a Yersinia

pestis (anteriormente Pasteurella pestis), tularemia debida a Francisella

tularensis (anteriormente Pasteurella tularensis), cólera causada por Vibrio chole-

rae (anteriormente Vibrio comma), infecciones por Campylobacter en fetos causadas

por Campylobacter fetus (anteriormente Vibrio fetus), brucelosis causada por especies

de Brucella (junto con estreptomicina), bartonelosiscausada por Bartonella

bacilliformis, granuloma inguinal causado por Calymmatobacterium granulomatis.

8. Cloranfenicol - es de amplio espectro; inhibe la síntesis proteica y es toxica a nivel

medular; es de origen sintético, bacteriostático, actúa frente a Gram+ y -

(especialmenteHaemophilus influenzae y Salmonella)

9. Macrolidos y similares - inhiben la síntesis proteica; amplio espectro; se dan cuando es

alérgica a penicilina; son bacteriostáticos y bactericidas en alta dosis.

a. Eritromicina (un buen ATB frente neumónia atípica, legionelosis, difteria, tos ferina)

b. Azitromicina - para tratar ciertas infecciones causadas por las bacterias, como la

bronquitis; neumonía; enfermedades de transmisión sexual (ETS); y las infecciones en los

oídos, pulmones, piel y garganta; no tienen ningún efecto sobre los resfriados, la gripe y

otras infecciones virales.

71/168

c. Claritomicina - interfiere la síntesis de proteínas en las bacterias sensibles; faringitis,

amigdalitis, sinusitis, bronquitis aguda, reagudización de bronquitis crónica, neumonía

bacteriana (adquirida en la comunidad), infección de piel y tejidos blandos leve-moderada,

foliculitis, celulitis, erisipela, infección localizada o diseminada por Mycobacterium

avium oM.intracellulare, infección localizada por M.chelonae, M. fortuitum y M.kansaii.

Prevención de infección diseminada por M.avium complex en pacientes con VIH de alto

riesgo

10. Quimioterápicos de síntesis a. Sulfamidas (es bacteriostático, de origen sintetico; inhibe la síntesis de acido fólico;

activo frente Gram+ y -, Clamidias, Nocardia)

b. Trimetropin+sulfametoxazol (cotrimoxazol) - inhibe la síntesis de acido fólico; elimina

las bacterias que provocan infecciones, incluyendo las infecciones que afectan las vías

urinarias, los pulmones (neumonía), oídos e intestinos

c. Quinolonas (6) - inhiben la replicacioón del ADN bacteriano son buenos ATB de amplio

espectro, pero se ha abusado mucho.

d. Norfloxacina - infecciones de las vías urinarias y la próstata; inhibe la replicación del

ADN bacteriano. La norfloxacina pertenece a una clase de antibióticos

llamados fluoroquinolonas; tomar norfloxacina aumenta el riesgo de que desarrolle

tendinitis.

e. Ciprofloxacina - inhibe la replicación del ADN bacteriano; para tratar o prevenir

determinadas infecciones bacterianas, también se usa para tratar o prevenir el ántrax (una

infección grave que se puede propagar en forma intencional como parte de un ataque

bioterrorista) en quienes han estado expuestos a los gérmenes del ántrax suspendidos en el

aire; tomar ciprofloxacina aumenta el riesgo de que desarrolle tendinitis.

11. Quimioterapia antituberculosa - actualmente se emplea:

* Rifampicina - ATB sistémico, antituberculoso, bactericida. Inhibe la síntesis de ARN

bacteriano. Tuberculosis en todas sus formas (asociado a otros

tuberculostáticos). Brucelosis.Erradicación de meningococos en portadores asintomáticos,

no enfermos. Alérgicos o con contraindicaciones a otros antibióticos o quimioterápicos.

Infecciones causadas porestafilococos (S.aureus, S.epidermidis, cepas polirresistentes) y

por enterococos (S.faecalis, S.faecium).

* Isoniacida - para tratar la tuberculosis, y para prevenirla en personas que han tenido

contacto con las bacterias de la tuberculosis. Elimina sólo las bacterias activas (en

crecimiento). Debido a que las bacterias pueden estar en un período de incubación (sin

crecimiento) durante largos períodos, la terapia con isoniazida (y otros medicamentos para

evitar la tuberculosis) debe hacerse durante mucho tiempo (por lo general entre 6 y 12

meses).

* Etambutol - el tratamiento de tuberculosis pulmonar; debe ser usado en conjunción con

otros fármacos antituberculosos.

12. Quimioterapia antimicótica:

* Nistatina

* Miconazol

* Amfotericina B.

* Fluconazol

13. Quimioterapia anti-viral * Aciclovir - antiviral activo frente al virus herpes humano, inhibe la replicación de ADN

viral, interfiriendo con el ADN polimerasa viral.

* Ribavirina - La ribavirina se utiliza con un medicamento interferón, para tratar la hepatitis

72/168

C en personas que no han sido tratadas con interferón antes. La ribavirina pertenece a una

clase de medicamentos antivirales llamados análogos de nucleósidos. Esta actúa impidiendo

que el virus que provoca la hepatitis C se propague dentro del cuerpo.

Pruebas de sensibilidad anti-microbiana - técnicas que investigan la actividad anti-

microbiana de distintos quimioterápicos frente al microorganismo estudiado; sus principales

aplicaciones:

- contribuir a la identificación de los microorganismos (p.ej. sensibilidad del

neumococo/S.pneumonia a la optiquina; del S.pyogenes a la Bacitracina)

- constituye una base fundamental para la instauración de una terapia adecuada.

Son técnicas estandarizadas y se ha demostrado que existe un paralelismo entre los

resultados de sensibilidad obtenidos in vitro con los efectos terapéuticos in vivo; la prueba

mas utilizada es la difusión en medio solido a excepción de los grandes laboratorios que

utilizan sistemas multiprueba o métodos automatizados (Vitec, Pasco...)

Antibióticos - un grupo de compuestos químicos terapéuticamente muy útiles y

que antañose caracterizaban por ser subproductos metabólicos de un

microorganismo siendo casi siempre letal para otros gérmenes (p.ej. a los hongos);

actualmente la mayoría son sintetizados en el laboratorio; uno de los primeros

es descubierto en 1927, cuando Alexander Flemming descubrió la penicilina extrayendo-lo

de un hongo (Penicillium notatum) siendo en 1929 cuando efectuó los primero ensayos de

sensibilidad anti-microbiana (se contaminaron las placas sin querer por un hongo); en 1939

Rose y Miller intentaron estandarizar las múltiples variantes de los análisis de sensibilidad

microbiana por difusión en placa y posteriormente en los años 50, Kirby-Bauer y Anderson

estandarizaron la técnica que se utiliza actualmente por difusión en medio solido o en placa.

Los principales pruebas para hacer un antibiograma:

a. Manuales 1. Prueba de dilución en medio solido y liquido

2. Prueba de elución en disco

3. Prueba de detección enzimática

4. Prueba de difusión en medio solido (de Kirby-Bauer)

b. Automatizadas

Términos utilizados en las pruebas anti-microbianas:

- Microorganismo sensible o sensibilidad => es inhibido por un ATB a dosis habituales

- Microorganismo de sensibilidad intermedia => el germen "in vitro" no es claramente

sensible al ATB, pero si lo seria "in vivo" incrementando la dosis habitual sin llegar a dosis

toxicas

- Microorganismo resistente o resistencia => no es sensible al ATB a dosis habituales y es

necesario administrar dosis toxicas

- CMI (cantidad mínima inhibitoria) => es la menor concentración de un ATB capaz de

73/168

inhibir el crecimiento bacteriano de una cepa dada

- CMB (cantidad mínima bactericida) => es la menor concentración de un ATB con la que

no quedan bacterias vivas de una cepa dada

Técnicas manuales de realización de las pruebas de sensibilidad anti-microbiana a. Pruebas de dilución (es una técnica de centros de investigación /lenta /engorrosas) => se

basan en el estudio al unisono de diferentes concentraciones de ATB, lo que les da un

carácter cuantitativo en base a los conceptos CMB y CMI; 2 tipos => en medio liquido y

solido; se utilizan 10 tubos con gérmenes en caldo nutritivo o agar y a cada tubo se le añade

una cantidad prefijada de ATB diluido seriadamente, excepto en el tubo de control; se

incuban 18-24 horas a 37ºC y se examina la turbidez que indica crecimiento de gérmenes;

en el tubodonde no hay turbidez se ha inhibido el crecimiento de los gérmenes; con estos

datos estudiamos la CMI y la CMB de los antibióticos.

b. Pruebas de elución en disco (disolver) => se realiza introduciendo discos de un ATB en

tubos con caldo nutritivo; el ATB se disuelve en el caldo alcanzando una concentración

final conocida, posteriormente se inocula un volumen de una suspensión microbiana y se

sigue la misma metodología descrita antes obteniéndose resultados cuantitativos o

cualitativos en base a sensibilidad, sensibilidad intermedia o resistencia (no se utilizan

habitualmente).

c. Pruebas enzimáticas de detección => fundamentalmente se detectan las beta-

lactamasas; un reducido numero de bacterias son resistentes a las penicilinas y

cefalosporinas(ATB B-lactámicos) debido a que producen un enzima (b-lactamasa) capaz

de inactivar estos ATB, p.ej. los gonococos, pneumococo y algunos estreptococos; consiste

en observar el crecimiento de los gérmenes en presencia de dichos ATB; se toma la colonia

sospechosa y mezclar-la con un sustrato que si cambia de color nos indica que la colonia es

B-lactamasa (+), por lo tanto es resistente a los ATB B-lactamico; se denomina Prueba de

NITROCEFIN.

d. Prueba de difusión en medio solido (antibiograma clásico) => estandarizadodesde los

años 50 (se hace igual en todo el mundo) por Kirby-Bauer y Anderson en todos sus pasos y

es mas utilizado actualmente en forma manual; fundamento => depositar discos

impregnados de ATB sobre cultivos de microorganismos en placa; la difusión del ATB a

traves del medio produce un halo de inhibición del crecimiento cuyo diámetro sera

proporcional a la potencia del ATB dando resultados cualitativos de resistencia, sensibilidad

o sensibilidad intermedia a los ATB; material => placas de Petri (9cm), pinzas metálicas

estériles o dispensador automático, pie de rey o regla milimetrada, medio Mueller-Hinton,

discos de ATB, suspensión microbiana al 0,5 escala Mc Farland (10 elevado 8 u.f.c./ml;

escala Mc Farland => el 0,5 se prepara añadiendo 0,5 ml de Cl2Ba 0,04 M a 99,5 ml de

acido sulfúrico 0,36M); una placa llena => mas de 10 elevado 6.

Técnica => el medio Mueller-Hinton se vierte en placas con un espesor de 4 mm; la

siembra utilizada preferentemente (a) la de Kirby-Bauer: se introduce un escobillón en el

inoculo preparado al 0,5 Mc Farland (no tenemos) y se siembra en 3 direcciones y se deja

aproximadamente 4 minutos la placa semi-abierta e invertida antes de colocar los

discos; (b)la de Barry: se hace una inoculación previa al vertido de las placas, se añaden 0,1

ml del inoculo a 25 ml del medio Mueller-Hinton fundido y se vierte en placa (no se usa

mas)

74/168

Elección de ATB => se debe seleccionar un ATB representativo de cada grupo excepto en

los casos donde existan diferencias significativas en los espectros de actividad o

resistencia; los aspectos importantes que prevalecen a la hora de seleccionar un ATB => las

características tintoriales del germen (Gram+o-), el lugar de la infección (orina, meningitis)

y la bacteria investigada.

Concentración de los discos => tiene que estar perfectamente estandarizada siguéndose las

normas de la Federación de Drogas y Alimentos/ FDA => la actividad del disco debe estar

entre 65% y 150% y de la OMS => entre 75% y 135%; siempre se debe utilizar un control

para controlar la actividad de los discos; en general, se escogen discos con una

concentración que producen un halo de inhibición entre 20 y 30 mm para organismos

tipificados como sensibles y de menos de 10 mm para los resistentes.

Implantación de los discos (papel de filtro grueso de un diámetro 6mm que van

impregnados con una concentración determinada de ATB); Manual => se saca el disco de

ATB con unas pinzas estériles y se deposita en la placa, la distancia mínima entre los discos

es de 24 mm para evitar la superposición de los halos, deben estar situados a 15 mm del

borde como mínimo (se colocan 8 discos) una vez depositado el disco se presiona

ligeramente con la punta de pinzas; Automática => se utilizan dispensadores automáticos

que son unos dispositivos de plástico del tamaño de una placa de Petri con unos orificios

guía que permiten la colocación simultanea de todos los discos en el lugar adecuado, y con

una pinza se presionan ligeramente los discos para que al girar o invertir la placa no se

caigan los discos.

Incubación => 18-24 horas a 35-37ºC (máximo 48 horas)

Lectura e interpretación del antibiograma => los resultados se expresan según el halo de

inhibición que aparece alrededor de cada disco; el halo se mide con una regla calibrada o

pie de rey midiendo los diámetros, y según cual sea clasificaremos al germen como sensible

(la dosis habituales es eficaz), intermedio (se deben incrementar las dosis habituales sin

llegar a dosis toxicas) o resistente (ATB es totalmente ineficaz);

Observación al método:

1. preservar la estandarización en todos sus pasos

2. puesto que la difusión del ATB es casi instantánea no debe moverse ningún disco una vez

que se ha puesto en contacto con la superficie del agar

3. los discos se tienen que conservar en la nevera

4. procurar que la lectura se haga a las 18-24 horas, evitándose el exceso de incubación

5. Aunque el medio elegido es el Mueller-Hinton, se pueden emplear medios enriquecidos

como AS (estreptococo), agar chocolate (Haemophylus) para gérmenes exigentes

6. de vez en cuando hay que colocar controles de calidad

7. cuando el germen sea anaerobio el método es diferente

Método automatizados de identificación y susceptibilidad - actualmente existen

diferentes metodos automatizados para realizar el antibiograma; los mas utilizados se basan

75/168

fundamentalmente en la medida bien fotométrica o bien turbidimétrica del efecto de un

ATB sobre el crecimiento de una bacteria en medio liquido comparándolo con el de la

misma bacteria en un medio sin ATB; otros metodos se basan en técnicas de impedancia

eléctrica microcalorimetría bioluminiscencia, radiometría ...

Los metodos fotométrico y turbidimétrico p.ej. sistema Vitec, se resume:

- se utilizan unas tarjetas desechables del tamaño de un naipe donde se inyecta la muestra ya

diluida mediante un modulo inyector; la tarjeta presenta unas perforaciones donde lleva

incorporadas diferentes medios selectivos liofilizados;

- la tarjeta se sella y se coloca en un modulo incubador y de lectura, leyéndose de manera

automática los resultados cada hora; los datos los almacena un ordenador que los compara

con valores umbrales ya almacenados; el ordenador puede dar resultados a las 4 horas (lo

normal entre 4 -13 horas)

El sistema Microscan utiliza un sistema semejante al de dilución en caldo pero en

miniatura utilizando paneles con caldo de Mueller-Hinton deshidratado (como API); tras la

inoculación y re-hidratación con una suspensión estandarizada del microorganismo y

suincubación a 35ºC por un mínimo de 16 horas, la CIM o una sensibilidad cualitativa

(sensible, intermedio o resistente) para el organismo en prueba se determina observando la

menor concentración ATB, que muestre inhibición de crecimiento; esta detección puede

hacerse manualmente mediante un visualizador de micro-dilución o mediante un lector

conectado a un ordenador; viene en tripletes de un ATB con diferentes concentraciones.

Agentes antimicrobianos (ATB) activos frente a Gram- => Cefuroxima, Cefotaxima,

Colistina, Tobramicina, ; frente a Gram+ => Eritromicina, Tetraciclina, Vancomicina,

Meticilina, Clindamicina, Doxicilina; frente a ambos Gram+ y - => Ampicilina, Cefalotina,

Gentamicina, Cotrimoxazol, Cloranfenicol, Imipenem, Amoxicilina+acido clavulonico.

Clasificación de los antibióticos según su efecto bacteriano

76/168

Bactericidas => Penicilinas, Cefalosporinas, Aminoglucósidos, Rifampicina, Quinolonas,

Monobactámicos, Polimixinas.

Bacteriostáticos => Tetraciclinas, Eritromicina, Sulfonamida, Novobiocina, Cloranfenicol

Clasificación de los antibióticos según su mecanismo de acción sobre la estructura

bacteriana

I. Inhibición de la síntesis de la pared celular Penicilinas

Cefalosporinas

Vancomicina

Fosfomicina

Tercoplanina

Bacitracina

II. Lesión en la permeabilidad de la membrana celular Poliomixinas

Colistinas

Nistatina

Anfotericín B

III. Inhibición de la síntesis proteica Cloranfenicol

Tetraciclina

Aminoglucósidos

Lincomicinas

Eritromicina

IV. Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos Quinolonas

Sulfonamidas

Rifampicina

Trimetropín

Nota: (*) Penicilina semisintética resistente penicilinasa

77/168

Estudio de la orina

Función del riñón:

- La eliminación de nuestro organismo de una importante cantidad de residuos metabólicos,

muchos de ellos inútiles, y de otros que incluso pueden comportarse como tóxicos.

- La regulación de la composición de los fluidos de nuestro organismo facilitando así, tanto

la supervivencia de las células como el optimo desarrollo de todos los

procesos metabólicos.

- El control hormonal de la presión arterial (adrenalina, noradrenalina)

- El control de los niveles orgánicos del calcio (mineral corticoides aldosterona, 1,25

dihidroxicolecalciferol)

- El control de la eritropoyesis (eritropoyetina)

Nefronas - son unidades funcionales básicas consiste de 2 partes => el glomerulo (dentro

de la cavidad "capsula de Bowman") y la red tubular.

El glomerulo - rodeado de una cavidad (capsula de Bowman) y dispone de una extensa red

vascular; filtrar/ depurar el plasma 25 ml de sangre por minuto (150 litros de plasma/ dia);

se filtra agua, urea, creatinina, aminoácidos, ácido úrico, glucosa, proteínas de bajo pm.

La red tubular - el filtrado por el glomerulo es recogido en la capsula de Bowman y se

dirige hacia la red tubular donde se lleva a cabo un proceso de reabsorción selectiva =>

reabsorber agua, ciertos elementos útiles para el organismo y que deben ser recuperadas

(glucosa, agua, sodio, cloruro, potasio, bicarbonato, urea, aminoácidos, proteina) y permite

la secreción de otras que, por su toxicidad, deben ser posteriormente eliminadas mediante

la micción (amonio, urea, hidrogeniones/H+); se elimina 1 ml de orina por minuto (1500 ml

78/168

diarios); la red tubular esta formada por => túbulo contorneado proximal, asa de

Henle, túbulo contorneado distal y túbulo colector.

Mecanismo de la función renal:

- Filtración glomerular => filtra el plasma desde los capilares que lo envuelven hasta la

capsula de Bowman.

- Reabsorción tubular => el producto de la filtración glomerular se modifica su composicion

al atravesar la red tubular.

- Secreción tubular => transporte de sustancias, desde la red capilar hacia

los túbulos renales; destaca la secreción activa de iones H+, que permite la regulación del

equilibrio acido-base en el organismo.

Procedimiento de la recogida de muestra (el personal facultativo determina el tipo de

muestra necesaria para el análisis) => informar a la persona del objeto del análisis; indicar

el tipo de muestra deseada; orientar acerca de la técnica de obtención de la misma;

indicar las pautas de almacenaje y transporte adecuado (si se toma fuera del laboratorio);

insistir en la importancia de la limpieza en general y de la higiene antes de la recogida

(evitar la contaminación involuntaria); describir el tipo y características mas adecuadas

delrecipiente a utilizar; tener en cuenta la capacidad del paciente para evacuar la vejiga de

forma voluntaria y la necesidad de utilizar técnicas invasivas para obtener la orina en

condiciones adecuadas.

Recogida de muestras de orina - Micción espontanea => paciente responsable de la misma para obtener muestra

sin contaminación; prevención: eliminar la primera porción de la micción y asegurar el

lavado minucioso previo de los genitales; indicaciones: análisis fisico-químico, estudio del

sedimento, concentración de creatina y microbiologia (en ocasiones).

- Cateterismo vesical/ sondaje (realizada por personal enfermería) => pacientes que

presentan dificultades de la micción, mujeres para evitar la contaminación vaginal.

- Punción supra-púbica (realizada por personal facultativo) => diagnostico de infección por

microorganismos extraños en niños.

Tipos de muestras para un análisis de orina (sin supervisión - micción espontanea):

- Primera orina de la mañana => se recomienda porque la concentración de solutos es

variable a lo largo del día y esta en relación con la ingesta de liquidos.

- Orina tomada al azar => muestra valida para cultivos microbiologicos

- Orina minutada (fraccionada, de 2 horas, de 24 horas) => gran utilidad para el paciente

diabeticos

Análisis de orina - procedimiento técnico encaminado a examinar los componentes que la

integran, su cantidad y la proporción en que se encuentran; su estudio proporciona

gran información acerca de múltiples alteraciones orgánicas y de muy

diversa etiología (riñon, procesos metabólicos) => permite detectar alteraciones patológicas,

estados fisiológicos particulares no patológicos (embarazo) y un buen funcionamiento renal.

Objetivos:

- obtener información del estado general del riñon y las lesiones que pudieran afectarlo

- detectar la existencia de una alteración a nivel de las vías urinarias

- teniendo en cuenta aquellos productos que se eliminan vía urinaria, detectar alteraciones

funcionales de otros órganos

- detectar las alteraciones metabólicas de diversa etiologia

- se intenta encontrar sustancias o componentes que normalmente no se encuentran en la

orina

79/168

- detectar alguna alteración en la concentración (por defecto o por exceso) de componentes

que habitualmente se encuentran en la orina

Tipos de análisis de orina => análisis elemental, completo, rutinario, anormales y

sedimento.

Parámetro bioquímico => Densidad - Bilirrubina - Cuerpos cetónicos - Proteínas -

Urobilinogeno - Glucosa - Hemoglobina - Nitritos - pH - Hematíes - Leucocitos

(actualmente se utiliza determinación por química seca / tiras reactivas).

Análisis general de una muestra de orina:

- Físico/macroscópico => cantidad, aspecto/turbidez, color, olor, densidad, pH

- Químico/anormales => proteínas, glucosa, cuerpos cetónicos,

sangre/hemoglobina, bilirrubina/ pigmentos biliares, urobilinógeno/ urobilina, nitritos

- Microscópico => estudio de estructuras cristalinas/cristales y de formas amorfas

en suspensión, estudio citológico, estudio bacteriológico.

- Microbiológico => urinocultivo, identificación del germen (pruebas bioquímicas), ATB

(antibiograma).

- Parasitológico => técnicas especificas de visualización macroscópica de parásitos;

estudio microscópico de parásitos en la muestra de orina: parásitos enteros o parte de ellos,

huevos, formas de resistencia (quistes).

El orden cronológico de un análisis general=> características físicas macroscópica -

sedimentación (a 1500 rpm durante 10-15 minutos) - pruebas bioquímicas (tiras reactivas);

la muestra sobrante se debe guardar hasta que la analítica haya concluido; hay que revisar

los resultados del sedimento concuerdan con las pruebas químicas y comprobar

las anomalías detectadas han sido confirmadas.

Examen físico - macroscópico Es orientativo => para diagnosticar una patología, hay que confirmar con

otros análisis complementarios; hay que tener en cuenta

situaciones fisiológicas (menstruación, grado de hidratación, etc.) que pueden alterar

las características de la muestra;

1)- Cantidad / diuresis normal 1200-2000 ml/24H; alteración => oliguria/inferior,

poliuria/superior, anuria/falta de eliminación (<300 ml/24H)

2)- Aspecto / turbidez; recién emitida: clara y transparente; almacenada: sedimento

blanco/fosfatos y carbonatos, sedimento rojizo (uratos desaparecer al calentar la orina a

60ºC);

3)- Color amarillo / ámbar (en función de la concentración)

4)- Olor aromático, ligeramente amoniacal

5)- Densidad 1.010-1.030 (se determina mediante tiras reactivas);

6)- pH normal 5,5-6 (ligeramente ácida); pH alcalino => posible contenido de gérmenes con

ureasa.

Pruebas bioquímicas cuantitativas

Proteínas - en condiciones normales las proteínas se encuentran 130-150

mg/día en función del volumen de orina eliminado; en recién nacidos 2-8 mg/100

ml;cantidad de proteína (con peso molecular menor)=> (a) albumina 1/3 del total

(fisiológica); (b) globulinas; (c) proteína de Tamm-Horsfall (T-H) es muco-proteína viscosa

que no se encuentra en el plasma - se forma en el tubulo contorneado distal, constituye la

matriz de los cilindros; (d) transferrina; (e) IgA.

Proteinuria => eliminación de proteina en orina superando los VN

80/168

- intensa (>4 g/día) indica un daño renal grave; se dan en síndrome nefrótico,

glomerulonefritis (aguda y crónica), congestión venosa renal;

- moderada (de 0,5 - 4g/día) indica un daño renal menos graves; se dan en pielonefritis

con hipertensión, nefropatía diabética, mieloma multiple.

- leve (<0,5 g/día) se dan en riñones poliquísticos, lesiones renales incipientes.

- de patrón glomerular => pierde su selectividad en la filtración.

- de patrón tubular => cuando hay lesión tubular

- de forma intermitente o transitoria => puede ser fisiológica (hay que comprobarlo)

- de forma persistente => suele cursar con hematuria y su pronostico es peor.

Glucosa - la orina normal carece casi por completo de glucosa (filtrado y absorbido);

normoglucemia => 6-120 mg/dl; umbral renal 160 mg/dl; glucosuria => aumento de

la concentración de glucosa en orina por encima de los VN, causada por (1) aumento de la

glucemia por encima de umbral renal (2) alteración renal (tubulopatía)

Cuerpos cetónicos (compuesto por acido acetilacetico/diacetico, acido beta-hidroxibutirico,

acetona) - en personas sanas, los CC se sintetizan en el hígado y se metabolizan por

completo, de forma que en la orina aparecen en

concentraciones mínimas (indetectables); cetonuria=> aparición de

cuerpos cetónicos detectables en orina; la presencia de cetonuria y el aumento de cetonemia

implica que no se realiza correctamente el catabolismo oxidativo de los ácidos grasos; las

causas de cetonuria:

- sobrecarga de lipidos en la dieta

- diabetes mellitus (coma diabetico)

- vómitos (en niños y embarazadas)

- bajo consumo de hidratos de carbono o alteración en su metabolismo

- ayuno prolongado

Hemoglobina - no aparece en orinas normales; hemoglobinuria => presencia de Hb en

orina (si la cantidad es alta, se puede ver a simple vista); causas => enfermedad renal

de vías altas, anemias hemolíticas, reacciones transfusionales, infecciones (malaria,

paludismo)

Pigmentos biliares (bilirrubina y biliverdina) - se forman en bazo, higado y MO

por degradación fisiológica de Hb; 2 tipos => BB-Albumina / indirecta y BB-Glucurónico

/directa; aparece BB en orina, siempre que aumente la BB directa en sangre por causas =>

enfermedad obstructiva (ictericia obstructiva/ acumulación en

sangre), lesiones hepáticas(hepatitis, hepato-toxicidad).

Urobilinógeno - BB directa con la bilis, pasa al intestino delgado donde por acción de la

flora bacteriana se transforma en urobilinógeno o estercobilinógeno (se elimina

en mayoría con las heces y la orina en menor concentración); la cantidad de urobilinógeno

aumenta en la orina en las hepatitis y las anemias hemolíticas; la determinación de

urobilinógeno debe realizarse rápidamente en orina, ya que se transforma en urobilina +

O2(falso negativo).

Nitritos - su aparición en la orina indica crecimiento bacteriano (bacteriuria), de germenes

capaces de reducir los nitratos ingeridos con la dieta, hasta nitritos (entero-bacterias); un

resultado negativo de la prueba de los nitritos, no indica ausencia de microorganismos, ya

que puede haber bacterias que no son productores de nitritos o ausencia de nitratos

ingeridos en la dieta.

81/168

Examen microscópico de orina - sedimento urinario - estudio de elementos o estructuras

de origen y composicion variados que aparecen suspendidos en la orina que proporciona

ayuda para el diagnostico y evolución de las enfermedades renales; la muestra debe

examinarse antes de transcurridas 3-4 horas desde su recogida (algunas estructuras

como celulas y cilindros se lisan fácilmente; obtención del sedimento: homogeneizar bien

la muestra, verter 10 ml en un tubo de centrifuga (fondo cónico), centrifugar a 1500 rpm

durante 10 minutos; decantar el sobrenadante (quedando solo 1 ml), re-suspender el

sedimento residual, montar un fresco (una gota entre porta y cubreobjetos, evitando

la formación de burbujas), observar al microscopio a 40x, intensidad lumínica media y

condensador a media altura; también se puede observar a 10x en el perímetro de cubre si

hay los cilindros hialinos.

Estructuras organizadas - Hematíes: pueden proceder de cualquier parte del sistema renal; en gran

numeroindica infección, traumatismos, neoplasias y litiasis renal; presencia normal de 1-

2/campo o como una contaminación menstrual; pueden confundirse con levaduras y cristal

de oxalato cálcico monohidratado; con tinción Gram se diferenciar => los hematíes son

teñidos de rojo, levaduras de violeta y cristales incoloros; es importante distinguir

entre macro-hematuria (se ve en el sedimento de color rojizo) y micro-

hematuria (únicamente se detecta al microscopio), también si el color rojo

observado macroscópicamente procede de hematíes o Hb (al centrifugar el sedimento, el

color rojizo de Hb permanece).

- Leucocitos (neutrófilos): pueden proceder de cualquier parte del sistema renal; >50% de

ellos se lisan al permanecer mas de 2-3 horas a temperatura ambiente; presencia normal de

1-2/campo (varón) y 1-3/campo (mujer); cifra superior de normal en el sedimento => piuria

(>5 leucocitos/campo indica => infección renal en cualquier nivel);

- Espermatozoides: formados por 2 partes cabeza y cola; frecuente en un sedimento

del varón (eyaculaciones recientes, poluciones nocturnas, etc.), y en mujer después de haber

mantenido relaciones sexuales.

- Bacterias: la composicion de orina es un excelente medio de cultivo para los

microorganismos; la mayoría de ocasiones son fruto de una contaminación de la flora

82/168

saprofita alojada en zonas próximas al meato urinario => anal, perineal, vaginal (sobre todo

en mujeres); su presencia en el sedimento, no debe ser tenida en cuenta salvo que vaya

acompañada de piuria (aumento de leucocitos).

- Levaduras: su presencia en la gran mayoría debido por una contaminación, salvo

acompañada de una piuria; en personas diabéticas, debido a la glucosuria, parecen facilitar

el crecimiento micótico; su identificación es sencilla, por su forma ovoidea, frecuentemente

con presencia de celulas en gemación; su tamaño es ligeramente mayor que

los hematíes (pueden confundirse); su aumento en la orina se trata de vaginitis causada por

Candida albicans.

- Parásitos: (1) Protozoos: normalmente se trata de Trichomonas vaginalis (frecuente en

sedimentos de mujeres con vaginitis que puede ser asintomático y mas raro en los de

hombres); aspecto piriforme de mayor tamaño que los leucocitos y una gran motilidad (por

sus flagelos); su identificación es mas complicada cuando la motilidad esta mermada (al ser

de un tamaño semejante al de los leucocitos); la piuria que le acompaña puede hacer pensar

(erróneamente) en una infección bacteriana y se descarta esta posibilidad al obtener

urocultivos negativos;

(2) otros parásitos: su aparición es siempre el resultado de una contaminación de la muestra

de orina con materia fecal;

Celulas epiteliales: el árbol urinario esta revestido por 3 tipos de epitelio => (1)columnar

/tubular /renales /cuboideo (capsula de Bowman, túbulos distal, proximal y

colector) (2) transicional o urotelio (pelvis renal, uréteres, vejiga y uretra) y (3) escamoso

(uretra y vejiga); una escasa descamación es normal, pero se puede aumentar por causas =>

microorganismos, productos químicos, cuerpos extraños, procesos degenerativos, procesos

invasivos-destructivos.

- Celulas tubulares /renales /cuboideas: son de tamaño 1/3 mayores que los leucocitos; su

forma normal es redonda con núcleo grande y céntrico; un sedimento normal 0-1/campo;

aumentado en pielonefritis y glomerulonefritis.

83/168

- Celulas de transición (segunda capa de vejiga): el epitelio transicional

espluriestratificado (3 capas => basal, intermedia y superficial); las celulas son de

tamaño 2-4 veces mayor que leucocitos; su forma es redondeada, piriforme o raqueta con

un núcleo pequeño; un sedimento normal 0-2/campo; su aumento exige un

estudio citológico mas completo (p.ej. tinción de Papanicolau), por posibilidad de un

carcinoma en cualquier punto entre la pelvis renal y la vejiga.

- Celulas del epitelio escamoso: son planas y tienen abundante citoplasma con nucleo

centrico y pequeño; a veces sus bordes aparecen doblados, replegados; un sedimento normal

0-1/campo.

Cilindros: se forma en túbulos colectores y distales; es un resultado de la consolidación de

las proteínas en los túbulos de las nefronas; es normal encontrarse algunos (sobre todo

hialinos) en el sedimento; se desintegra en la orina a pH alcalino y en presencia de bacterias

(con ureasa); la matriz de todos ellos es una muco-proteína (Tamm-Horsfall) segregada en

la orina; causantes de su formación => (1) disminución del pH de la orina, (2) aumento de

la densidad o concentración de solutos, (3) un grado de estancamiento de la orina

(disminución del filtrado glomerular); el lugar de la nefrona en que se forman, determina su

tamaño y forma => cilindros estrechos (contorneados) proceden de los túbulos distales y

cilindros anchos se originan en los túbulos colectores.

- Cilindros hialinos: se pueden encontrar en grandes cantidades en orinas normales

(deshidratación y estrés físico) y también en nefropatías; su aparición en el sedimento no

tiene significación clínica (1-2/campo); para visualizar su escasa refringencia, hay que

84/168

evitar un exceso de iluminación; normalmente sus contornos se aprecian con suficiente

nitidez y uno de sus extremos es romo (un dedo de guante); existe también cilindros

granulo-hialinos, muy semejante a los hialinos, pero con algunas incrustaciones en su

estructura (sin significación clínica);

- Cilindros granulosos: predomina la estructura granular y desaparece el aspecto hialino;2

tipos => cilindros granulosos finos (semejante a los hialinos en tamaño y forma; tienen

mayor refringencia debido a la masiva pequeños gránulos de inclusión) y cilindros

granulososgruesos (estructura totalmente diferente a los hialinos; son de mayor tamaño,

aspecto rígido y mayor refringencia; sus borden son contrastados y angulados; en

orinanormal 0-1/campo; el aumento de su presencia indica una nefropatía.

- Cilindros celulares: la presencia de ellos en la orina nunca es normal; tipos:

(1) Epiteliales - la matriz del cilindro engloba celulas epiteliales que se han desprendido de

la luz tubular; gran variedad de nefropatías, lesiones del epitelio tubular (debidas

adiversos tóxicos industriales, medicamentos y virus) puede causar la formación de este

cilindros.

(2) Hemáticos (eritrocitarios) - aparecen en sedimentos con hematuria; es un signo

de lesión a nivel del parénquima renal (vasculares o pielonefritis); la cantidad de estos

cilindros suele ser escasa y dificulta su localización.

(3) Leucocitarios - fácil de reconocer porque los leucocitos presentes en su matriz se

conservan estables durante el trayecto por los túbulos; su presencia normalmente

acompañada por piuria intensa e indica infección localizada en

el parénquima renal(pielonefritis) o lesiones de tipo inflamatorio (glomerulonefritis aguda).

(4) Bacterianos - se parecen a los granulosos toscos; generalmente unidos a piuria y muy

probablemente se trate de una pielonefritis.

85/168

- Cilindros grasos: cilindros granulosos o celulares con pequeñas

inclusiones lipídico (gotitas de grasa); muy refringentes y tonalidad amarillenta donde se

localizan dichas inclusiones; indica una nefropatía todavía no manifestada.

- Cilindros céreos: son muy refringentes, rígidos, de apariencia dura, superficie rugosa y

brillante (como la cera de las velas), los extremos angulados y generalmente de gran

tamaño; su presencia es un síntoma claro de una alteración renal importante; suelen estar

inmersos en una cilindruria (presencia de la mayoría de los diversos tipos de cilindros).

86/168

Estructuras no organizadas

Cristales: en general son productos finales del metabolismo que adoptan formas

cristalinas según la condiciones físico-químicas de la orina (la pH sobretodo, densidad,

temperatura, etc.) y se excretan a nivel urinario; se diferencian en 3 grupos:

(1) Cristales endogénos normales - no corresponden a alteraciones metabólicas ni

funcionales, muy frecuente en el sedimento y pueden aparecer en orinas recién emitidas.

(2) Cristales endogénos patológicos - reflejan trastornos metabólicos o afectación grave

de algún órgano o sistema y muy raras veces aparecen en orina.

(3) Cristales exógenos - aparecen en la orina tras la introducción en el

organismo (vía enteral o parenteral) diversas sustancias (contrastes radiológicos/ contraste

radiopaco vía endovenosa y medicamentos p.ej. sulfonamidas, etc.)

- Cristales de acido úrico: en orinas ácidas; son birrefringentes; de formas variadas (p.ej.

agujas); color entre marrón rojizo, el amarillo e incluso incoloros; indica

una situación patológica o concentraciones elevadas de acido úrico; un sedimento normal 0-

2/campo.

- Cristales de oxalato cálcico mono-hidrato y di hidratado: en orinas ácidas y ligeramente

neutras; menos frecuente; de forma prismas incoloros -casi nunca aislados-unidos por un

punto intermedio (pesas de gimnasia), la mas frecuente es de forma sobre; también los hay

87/168

de forma redondeados, finamente estriados, incoloros y con una depresión central (radios de

bicicleta); un sedimento normal 0-2/campo.

- Uratos amorfos: en orinas ácidas; se presentan como un precipitado amorfo, coloreado

debido a la presencia de pigmentos urinarios de color amarillo-naranja (color ladrillo); no

tiene mucha importancia clínica.

- Cistina: en orinas ácidas; tiene significación clínica por si solos => aparecen

comoconsecuencia de cistinuria; aspecto incoloro con forma de

placas hexagonales, regulares finasy transparentes; es imprescindible una vez observados en

el sedimento, confirmar la concentración de cistina en la orina.

- Leucina y tirosina: en orinas ácidas; raramente se observan; son productos finales

del metabolismo proteico y suelen aparecer juntos en

situaciones clínicas graves=> destrucción o necrosis tisular importante,

fundamentalmente de tejido hepático (hepatitis, cirrosis, etc.); los cristales de tirosina

forman manojos de agujas finas y los de leucina son

como gránulos esféricos de estrías radiales y concéntricas, de aspecto oleoso o graso y muy

refringentes; ambas son de color amarillo o marrón.

88/168

- Cristales de bilirrubina: en orinas ácidas; de pacientes con bilirrubinemia (bilirrubina alta

en sangre); de forma agujas con color marrón-rojizo (flecha verde).

- Uratos amoniacos: en orinas muy alcalinas; de color amarillo/marrón muy intensa;

predomina la forma esférica de distinto tamaño; no tienen mucha importancia clínica,

peropueden estar asociados a infecciones del tracto urinario, por bacterias con ureasa+.

- Carbonato cálcico: en orinas alcalinas o neutras; no es frecuente y no tiene mucha

importancia clínica (procedencia de ingesta vegetales); de forma amorfo o granular, en

ocasiones como pequeños lazos y raramente como pequeñas esferas incoloras;

89/168

- Fosfato cálcico (hipurato cálcico): en orina alcalina o neutra; no es frecuente; de

forma prismas largos y afilados (agujas), en ocasiones se agrupan formando rosetas o

estrellas, también como placas granulares, amorfas e incoloras (similares a acido úrico); no

tiene mucha importancia clínica, pero puede ser ligada a hipertrofia de próstata o algunas

infecciones urinarias crónicas; cálculos urinarios contienen fosfato cálcico.

- Fosfato triple (amónico-magnesico-cálcico): frecuente en orinas alcalinas o neutras;

de forma tapa de ataúd, aunque también puede verse como octaedros (muy variable); no

tiene mucha importancia clínica.

- Cristales de creatina: raramente encontrados en orinas de adultas, pero es frecuente en

orinas de niños y niñas antes de la pubertad; es un metabolito de

la degradación endógena del tejido muscular (su aumento => distrofias musculares,

poliomielitis, etc.); de forma pseudo-hexagonal característica.

- Fosfato amorfo: en orinas alcalinas; de semejante forma a uratos amorfos, pero de color

blanquecino.

90/168

Informe del sedimento urinario 1. debe preceder por el estudio de "anormales" en orina (tiras reactivas => pH, densidad

y características patológicas)

2. deben observarse al microscopio optico (40x) al menos 10 campos.

3. debe proporcionar una visión del valor medio de cada elemento o estructura, obtenido en

todos los campos observados.

4. debe ser "escueto" y "conciso" (solo hay que poner lo verdaderamente importante)

5. debe seguirse un orden => hay que informar primero el examen realizado de citológico,

segundo el de químico y por ultimo el de microbiológico.

Examen citológico:

- celulas hematológicas => se redactan con números y abreviaturas (p.ej. 6-8 L/C =

no.leucocitos por campo); se informa si existe piuria y hematuria y si se forma acúmulos.

- celulas epiteliales => se redactan con adjetivos: escasas (algunas 1-3) - moderada (3-4) -

abundante (6-8) - intensa (muy abundante 10-12); las importantes son las renales y las

de transición; las celulas escamosas (de las vías bajas), se informan cuando son abundantes.

- cilindros: se redactan al igual que las celulas; es importante identificarlos e indicar en el

informe el tipo de cilindro.

Examen químico (en un sedimento de orina normales, es frecuente no incluirlos en el

informe):

- cristales => se redactan con adjetivos; cuando son muy abundante, se habla de "diatesis".

- compuestos amorfos => se redactan con adjetivos

Examen microbiológico:

- bacterias => se redactan con adjetivos; es necesario especificar el tipo de m.o. y su

movilidad

- levaduras => se informa con adjetivos.

Examen microbiológico de una muestra de orina - en condiciones normales carecen

totalmente de flora bacteriana; la infección del tracto urinario es frecuente y la mayoría de

m.o. patógenos proceden de la flora intestina => Bacilos Gram- (E.coli, Proteus spp,

Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae); Cocos Gram+ (Streptococcus grupo D y

Staphylococcus); Levaduras (Candida spp.); la toma de muestra debe ser obtenida en

condiciones asépticas en un recipiente estéril, evitando en todo momento la contaminación;

91/168

el paciente debe ser instruido de la forma mas adecuada.

Análisis de microbiológico (urinocultivo)

1. Preparación de un "inoculo"

2. Sembrar en medio Cled (la ausencia de electrolitos, impide la invasión por

proteus);McConkey (un medio selectivo y diferencia para m.o. Gram-); agar Cetrimide

(eficaz para la búsqueda de pseudomonas)

3. Incubar a la temperatura optima de crecimiento de los m.o. buscados (generalmente a

37ºC)

4. Realizar el recuento tras la incubación (presumible-mente han crecido los causantes de

la infección) => menos de 10.000 mo/ml de orina es negativo; mas de 100.000 mo/ml

hay infección urinaria; entre 10.000 y 100.000 mo/ml el diagnostico es incierto; puede

haberse infección no detectada por causas => un tratamiento ATB instaurado,

una obstrucción a nivel de las vías renales o la muestra recogida por una punción supra-

púbica (sin pasar por la uretra, donde esta la infección).

5. Una vez determinada la infección, hay que resembrar en medios selectivos, para proceder

la identificación (tipación) del germen causal de la misma.

92/168

93/168

94/168

Tema 17 - Cocos aerobios y anaerobios facultativos

(patología e identificación)

Gram+ => Micrococaceae (Staphylococcus - Micrococcus - Stomatococcus -

Planococus); Streptocococeae (Streptococcus - Pediococcus - Gemella -

Aerococcus);Peptococaceae

Gram- => Neisseriaceae (Neisseria - Branhamella - Moraxella)

Staphylococcus => cocos Gram+ inmóviles, aerobios y anaerobios facultativos, tamaño +/-

1 um; en forma de racimos, catalasa+, gelatinasa+, nitratasa+, fermentadores de muchas

azucares (via EMP); no capsulados y resiste al calor; crecen en medios generales y medios

con alto contenido de NaCl (halófilo); resistentes a agentes externos, distribuidas

ampliamente en la naturaleza, flora normal de las mucosas y la piel, causante de la

intoxicaciones alimentarias, heridas, etc.

Especies importantes (existe >25 especies y varios sub-especies/ cepas)

(1) S. aureus (saprofito de >40% de fosas nasales y 10% de vaginas) => estafilococo

dorado (pigmento amarillo); coagulasa+; fermenta el manitol; sensible a la novobiacina.

- 30 Ags (propiedades antifagocitarias y producen estructuras piógenas/ características en

las lesiones: polisacárido A es el mas importantes - inducen la formacion de

Acs; proteína A - un potente agente antigénico) => se subdividen en tipos según sus

95/168

caracteres antigénicos;

- Produce toxinas (hemolisinas - lisan eritrocitos y leucocitos; t.exfoliativa/ exotoxina -

causa eritemas en la piel; leucopidinas - destruyen pmn y macrófagos; enterotoxina - anula

la acción del jugo gástrico y actúa en el centro del vomito, nauseas y diarreas);

- Fermentos/enzimas (coagulasas - activa la protrombina; fibrinolisinas o estafiloquinasas-

activador del plasminógeno; penicilinasas o beta-lactamasa - romper el anillo b-lactamico

de las penicilinas creando resistencia);

- Hemolisinas alfa - provoca hemólisis beta en AS; hemolisina beta -

provoca hemólisis alfa en AS;

- Enterotoxinas tipo A, B (causan intoxicaciones alimentaria) y D causa enterocolitis;

La acción patogena directa => procesos inflamatorios, forunculos, supurativos y de

necrosación (en heridas y quemaduras); indirecta => afecta al tubo digestivo por la entero-

toxina (gastroenteritis con nauseas, vómitos y diarreas, duración 1-2 días, se trata con

sueros orales o anti-diarreicos); la bacteria no llega al intestino (solo su toxina), por eso no

se encuentra en las heces; crece muy bien con la temperatura veraniega y en las

cremas; infección generalizada (septicemia) => formación de coágulos o trombos

intravenosos, artritis, pleuritis, endocarditis, osteomielitis o meningitis en los debilitados

(periodo de incubación 1-6 horas).

(2) S.epidermidis y (3) S.saprophyticus son estafilococos oportunistas; distribuidas en el

medio ambiente, la piel y mucosas; son patógenas en debilidad; S.saprophyticus puede tener

pigmento dorado y puede fermentar Manitol; S.epidermidis sensible a la novobiocina (lo

que le diferencia a S.saprophyticus).

Aislamiento de los estafilococos:

- Muestra procede de las heces => medios selectivos Chapman, ricos

en NaCl(carácter halófilo), contiene manitol (diferencia S. aureus del resto de

Staphylococcus); Otros tipos de muestras => medio AS (observar características de las

colonias - color, hemólisis, etc).

Pruebas bioquímicas:

- Los estafilococos degradan muchas azucares (glucosa, sacarosa, fructosa, manosa, etc.);

produce gelatinasa+, catalasa+, nitratasa+, crecen muy bien a 37ºC, hemolisina alfa y beta,

coagulasa+ (S.aureus).

Diagnóstico bacteriológico:

- Toma muestra con torunda estéril o por punción según los casos en total

asepsia; tinción Gram; aislamiento en medio Chapman/manitol salado y AS, tras

la incubación observar las colonias; pruebas bioquímicas - coagulasa (S.aureus),

fermentación de glucosa, catalasa, gelatinasa, hemolisinas alfa y beta (cepas patógenas),

96/168

fibrinolisinas, fermentación del manitol (S.aureus); estudio de la sensibilidad a

la novobiocina(diferenciar S.epidermidis de S.saprophyticus)

- Diferenciacion del genero Staphylococcus y Micrococcus (en principio no es patogeno)

=> Staphylococcus sensible a bacitracina y eritromicina; Micrococcus a veces pueden

daroxidasa+.

- Estafilococos coagulasa- es un grupo heterogéneo (+ importante

son S.epidermidis yS.saprophyticus) 80% en el pasado no causan infecciones importantes,

pero cada vez esta tomando mas importancia; ademas muestra resistencia a varios ATB

alternativa de penicilina (meticilina y cloxacilina); pueden producir infecciones urinarias,

bacteriemias (por la implantación de cateteres i.v.) y endocarditis.

Streptococcus => cocos Gram+, tamaño pequeño, capsulados, anaerobios facultativos, se

agrupan en cadenas, fermentador de glucosa, son saprofitos, oportunistas y

algunos patógenos; poseen Ags (polisacárido C - según sus características, se clasifican

engrupos A-V de Lancefield; proteína M antifagocitarias, la posee el grupo A)

Clasificacion A. según el tipo de hemolisis (capacidad de romper hematíes - produce hemólisis alrededor

de sus colonias en AS) => gamma hemolítico,

alfa hemolíticos/ hemólisis parcial (decoloración parda verdosa -

S.viridans);beta hemolíticos/ hemólisis total (halos de transparencia grandes entorno a su

colonia) -grupos A, B, C, D (enterococo) G y F; estreptococo NO Beta-hemolíticos - grupo

D, S.viridansy S.pneumoniae (alfa y gamma)

B. según sus caracteres bioquímicos (sensibilidad a bacitracina, optoquina, tolerancia a

NaCl, degradación de bilis esculina y factor CAMP):

- Sensible a bacitracina (grupo A)

- Crecimiento en NaCl 6,5% (grupo D enterococos)

- Factor CAMP => potenciar la acción hemolítica de S.aureus (lo produce grupo B)

- Pruebas de bilis esculina - hidrolisan este compuesto (grupo D enterococos)

- Sensible a optoquina (S.pneumoniae /neumococo)

- Hidrólisis de hipurato sódico (grupo B)

C. según los caracteres antigénicos (a traves de reacciones serologícas especificas

=> aglutinación, precipitación, inmunofluorescencia, etc.) => los Ags en la pared celular

(péptido glicano - toxica y facilita la unión de ellos a las células epiteliales

invadidas; polisacárido C - distintas características que confiere la agrupación de los

estreptococos (grupos de Lancefield);

- Grupo A (la + importantes) => la mayoría son Beta-hemolíticos y patogenos al

hombre; proteína M se presenta como pelos en el perímetro de la pared celular (anti-

97/168

fagocitarías).

- En las capsulas del grupos A y C se encuentra enzima hialuronidasa(características anti-

fagocitarías)

Acción patógena e Interés clínico:

(1) Streptococcus del grupo A (S.pyogenes) => causan 90% de las infecciones

estreptocócicas; muy sensibles a los agentes externos; son floras de la mucosa nasal

y faríngea; poseen polisacárido C (proporciona la especificidad de grupo)

y proteína M(facilita la adherencia a las células invadidas y protección a la fagocitosis); son

Beta-hemolíticas, sensibles a la bacitracina y variable a optoquina

- Poseen hemolisinas estreptocócicas/ estreptolisinas (O y S); estreptolisina

S(poco antigénico) => holoproteína toxica responsable de hemólisis en medio

AS;estreptolisina O (muy antigénico) => hetero-proteína exotóxica muy activa de

efecto hemolítico frente a glóbulos rojos y leucocitos (pmn y macrófagos => alterando la

estructura celular); induce a la formación de Acs ASLO.

- Produce toxina eritrogénica responsable del exantema de la fiebre escarlatina;

- Enzimas estreptoquinasas (activador de plasminógeno => plasmina en fibrinolisis);

induce a la formación Acs; se utiliza en el hospital en procesos trombo-génicos.

- Enzima desoxirribonucleasa estreptocócica (despolimeriza ADN); son antigénicas y se

distingue en 4 grupos (A-B-C-D).

- Enzima Hialuronidasa (hidroliza el acido hialurónico del tejido conjuntivo); facilita

su invasión.

- Proteinasa estreptocócica (origina procesos inflamatorios y necrosación)

Patogenicidad de S.pyogenes (grupo A) => Infecciones en la piel o mucosas (+frecuentes -

anginas/faringitis sobre todo a niños/contacto directo, otitis y sinusitis) 95% de infecciones

naso-faringeas son producidas por estreptococos del grupo A; infecciones NO

supuradas/ inmunológica => fiebres reumáticas (complicaciones de tto no adecuados),

glomerulonefritis, endocarditis, meningitis, sepsis.

(2) Streptococcus del grupo B (S.agalactiae) => saprofito del hombre en rino-faringe, uro-

genital, vaginal e intestinal; produce infecciones oportunistas; hipurato+(degrada el

hipurato sódico) es lo que le diferencia del grupo A; posee factor CAMP (potenciar

la acción hemolítica de S.aureus); puede origina meningitis e infecciones pulmonares en el

neonato, infecciones del tracto respiratorio, mucosas, piel, etc; son Beta-hemoliticos,

resistente a la bacitracina;

98/168

(3) Streptococcus del grupo C => es el mas proximo al grupo A;

sonBeta hemolíticos (también alfa y gamma) y muy sensible a los agentes externos;

resistente a la bacitracina; crecen en medios salinos (NaCl 6,5%); posee enzima

hialuronidasa; saprofito del hombre en la rinofaringe; puede producir mastitis en vacas,

muermo en caballos y sepsis ??? en el hombre.

(4) Streptococcus del grupo D => son alfa, beta y gamma hemolíticos; resistentes a agentes

externos y ATB;

- los enterococos => S.faecalis y S.faecium; son saprofitos del intestino del hombre; crecen

bien en NaCl 6,5% (a diferencia de los NO enterococos); hidrolizan la bilis esculina;

son alfa-beta-gamma hemolíticos; resistente a la bacitracina; puede

producir infección urinaria e herida.

- los No enterococos => S.bovis, S.equinus y S.anginosos (afecta vacas y

caballos);hidrolizan la bilis esculina; resistente a la bacitracina;

(5) Streptococcus del grupo G, F y E => saprofitos de la rinofaringe, vias genitales e

intestino en el hombre; pueden producir infecciones en vias urinarias, heridas; resistente a la

bacitracina; son alfa y beta-hemolíticos; crecen variable en medios salinos (NaCl 6,5%)

(6) Streptococcus Alfa hemoliticos (S.viridans) => no son capsulados; producen alfa y

gamma hemolisis; saprofitos de la orofaringe, mucosa bucal, placa dental (caries); resistente

a la optoquina;

(7) Streptococcus pneumoniae (neumococo) => es un grupo a parte; diplococos, Gram+

y son capsulados; muy sensibles a medios externos; son alfa y gamma hemolíticos;sensibles

a optoquina; crecen variable en medios salinos (NaCl 6,5%); saprofito en aparato

respiratorio; puede producir neumonias, inflamaciones sinusitis, otitis y meningitis (mas

frecuente en adultos);

99/168

Aislamiento:

- toma de muestra con total asepsia de la rino-faringe con hisopo estéril, una muestra del

pus (si hubiera); se analiza de inmediato (estreptococos son sensibles a medios externos);

- un frotis para la tinción de Gram; si se sospecha S.pneumoniae se realiza

una tinción negativa con tinta china y prueba de "Quellung" (determinar Ags de la capsula);

se produce una reacción de Quellung cuando un Acs tipo específico se une al polisacárido

capsular del neumococo y causa un cambio en el índice refractivo de la cápsula haciéndola

aparecer “hinchada” y más visible.

- la siembra en AS-CNA (posibles hemólisis - estreptococos son resistentes a nalidixico que

inhibe el crecimiento de otros gérmenes); realizar hemocultivos si se sospecha endocarditis

o sepsis; las colonias son grisaceos, redondos de bordes lisos y pequeños; medios selectivo

y diferencial con NaCl 6,5% => permite el crecimiento de enterococos del grupo D.

Pruebas bioquímicas:

- pruebas de catalasa-, hemolisis en AS, sensibilidad o no de optoquina y bacitracina;

hidrolisis de hipurato (positivo en el grupo B), utilización de bilis esculina.

- identificar los grupos antigénicos según el tipo

de sustancia polisacárido C (clasificación de Lancefield) por metodo serológicos => prueba

de látex (romper la capsula para sacar la sustancia; reacción inmuno-complejo Ag-Ac).

- los Gram+ en general son sensibles a la vancomicina excepto algunos cocos Gram+,

catalasa- que no son estreptococos (Pediococcus es resistente a la vancomicina).

Pruebas serologícas / inmunologicas:

- la búsqueda en el suero (dilución seriadas) del paciente de Acs frente a toxinas y enzimas

de estreptococos (sobre todo grupo A) => títulos de Acs antiestreptolisinas O (ASLO); para

saber si la infección es aguda o creciendo; en caso de fiebres reumáticas con títulos de

ASLO negativos, se determinan los títulos de Acs

antiestreptoquinasas (ASK), antihialuronidasas(ASH); pruebas de hinchamiento

capsular con suero antineumococico polivalente (prueba de Quellung) muy utilizado para

determinar S.pneumonia => se añaden Acs contra Ags capsulados, si hay aglutinación es

signo de que esta estreptococo.

Neisseria => cocos Gram-; en forma de diplococos (granos de café), aerobios;

son saprofitos de mucosas (genitales, faringe, fosas nasales) y cavidades del hombre y los

animales;citocromo-oxidasa y catalasa+; utilizan azucares con metabolismo oxidativa y

fermentativa; producen pigmentos carotenoides; nutricional-mente exigentes; sensibles a

medios externos.

Especies mas importantes - 4 géneros => Neisseria, Branhamella (B.catharralis),

Acinetobacter y Moraxella.

(1) Neisseria meningitidis (meningococo) => es una especie patógena para el hombre;

son parásitos obligados del hombre (no se encuentran libre en la naturaleza); es difícil de

100/168

cultivar si hay competición (acompañadas por otros gérmenes); son capsulados;

utiliza glucosa y maltosa; posee fimbrias (facilita su adherencia) y capsulas

(contiene polisacáridos con comportamientos serológicos diferentes A,B,C, etc.); crecen a

35-37ºC; son muy sensibles a medios externos; producen meningitis epidémico (contagio

por gotas de flugge en contacto íntimos); otros causantes de meningitis => Haemophyllus

influenzae, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Pseudomona aeroginosa,

Micobacteria, Neisseria meningitidis, Cryptococcus neoformans y otros.

(2) Neisseria gonorrhoeae (gonococo) => idénticas características que meningococo;

utiliza glucosa como fuente de carbono; requieren medios enriquecidos con CO2 5-

10% para potenciar su crecimiento a 35-37ºC; son muy sensibles a medios externos y

son parásitos estrictos del hombre y produce gonorrea (no se encuentra libre en la

naturaleza);

(3) Neisseria saprofitas => saprofitos de la rino-faringe y genitales; son poco exigentes y

crecen a 22-35ºC en medios generales; resistentes a medios externos y no

son patógenos para el hombre.

Acción patógena e interés clínico Neisseria meningitidis (meningococo) => diplococos /granos de café; coloniza las mucosas

y vías respiratorias (sobre todo superiores); 5-30% son portadores sanos en rino-faríngeo;

afectan a niños de 6 meses hasta 5 años (causas mas importantes de mortalidad

infantil); también afectan niños mayores y adultos jóvenes de 6 hasta 25

años;estructura antigénica => componentes de su capsula (polisacárido),

las fimbrias (facilitar la adherencia y la invasión) y proteínas de la membrana (toxica sobre

las celulas invadidas);

Cuadro clínico - comienza con una rino-faringitis de sintomatología leve (sobre todo en

niños - en adultos se forman Acs anti meningococo) evoluciona a forma severa, se complica

con bronquitis; si el meningococo pasa a la sangre, originara micro-focos en la piel

conerupciones petequiales (1-2mm) en el tronco e extremidades inferiores, cefaleas, fiebres

altas, artralgias; puede pasar a LCR con fiebres muy altas, cefaleas fuertes, rigidez de

nuca, vómitos, diarreas, etc.; se agravan hasta la muerte sin tto efectivo y rápido; el

examenLCR es turbio, purulento con abundantes meningococos (debido a acumulación de

pmn con meningococo dentro (celulas CLUE); tto con penicilina (G) - el tto del portador

es rifampicina.

Neisseria gonorrhoea (gonococo) => idénticas características que el meningococo; su

afinidad particular es sobre las mucosas uro-genitales, con fimbrias (adherencia a las celulas

epiteliales dificultando la fagocitosis); posee endo-toxina que inactiva Acs próximos;

produce gonorrea en hombres y mujeres (ETS);

Cuadro clínico - tras un contacto sexual, los gonococos se adhieren a la superficie de la

mucosa gracias a las fimbrias y proteínas de la membrana; posteriormente se penetran a

101/168

tejidos sub-epiteliales y empiezan a multiplicarse, liberando endo-toxina con efecto toxico a

la uretra, cuello del útero, ano (donde colonicen), produce la destrucción de celulas del

epitelio y supuración (secreción purulenta) y dolor a la micción; en las mujeres puede ir

acompañada por uretritis, vaginitis y 20% salpingitis de las trompas (produce esterilidad en

mujeres); 50% de los casos son asintomáticos con lo que la ausencia de tratamiento conduce

a la cronificación; puede provocar bacteriémia dando artritis supurativos; tto => penicilina o

sus derivados; en neonatos provoca gonococia ocular que conduce a la ceguera - se

previene instilando gotas de nitrato de plata - método de "Crede" y (contra Chlamydia es

mas efectivo) eritromicina???

Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico N.meningitidis - toma de muestra de LCR (punción lumbar), sangre y/o exudado faringeo;

se deben examinar de lo antes posible (sensibilidad al medio externo); se transporta en un

medio de Thayer-Martin modificado a 37ºC (en caliente); si la muestra de LCR es turbio o

purulento, se divide en 2-3 tubos; 1er tubo se centrifuga y sobre el sedimento se realizan

frotis Gram; 2nd tubo se utiliza para la siembra en AS, agar chocolate, Mueller Hinton y

Thayer-Martin; 3er tubo se realiza un hemocultivo y recuento celular; meningococo crecen

dando colonias transparentes diminutas y no hemolíticas; las placas se incuban a 37ºC

enambiente de CO2 5-10%.

- Pruebas bioquímicas => catalasa+, oxidasa+, prueba de la utilización de glucosa y maltosa

por oxidación (aerobio), lactosa-, nitratasa-.

- Estudios serológicos => inmunofluorescencia directa del LCR o el suero, contrainmuno-

electroforesis y técnica ELISA.

- Existe sistema de multi-prueba para Neisseria y Haemophylus.

N.gonorrhoeae - toma de muestra a partir de la uretra (hombre), recto en homosexuales y

uretra, cuello de útero y recto (mujer), se realizan en el laboratorio (sensibilidad a medio

externo), por la mañana antes de la primera micción (al ser posible); se procede de

inmediato al estudio directo y la siembra en medios específicos o se transporta en medio

TM modificado.

- se realiza la tinción (Gram- en forma de granos de café); en el frotis se ven los pmn con

diplococos dentro; la siembra se hará en AS, agar chocolate, Thayer-Martin (con factores de

crecimiento y ATB vancomicina, anfotericina, colistina y trimetropin que inhibe el

crecimiento de otros gérmenes); en TM los gonococo son colonias pequeñas de color gris

y los meningococo son blanquecinas se incuba a 35-37ºC y atmósfera enriquecida de CO2

5-10%;

- Pruebas bioquímicas => utilización de azucares por vía oxidación (glucosa+, lactosa,

maltosa+ para meningococo, y sacarosa); oxidasa y catalasa son positivos, nitratasa-.

- Pruebas serologícas => hemo-aglutinación, inmunofluorescencia indirecta, ELISA (mas

utilizadas)

- Sistema de identificación multiprueba para Neisseria y Haemophylus.

102/168

Neisseria saprofitos (Neisseriaceas) - normalmente son flora de oro-faringe/ naso-faringe;

son especies de bajo patogenicidad, aunque a veces implicadas en meningitis y otros; no

requieren medios especiales para su crecimiento.

- Branhamella catharralis / Moraxella catharralis => hoy en día la clasificación es

confusa (la tendencia - dentro de la familia moraxellacea), otros autores tienden a

diferenciarla y la clasifican como familia Branhamellaceae; es Gram-, oxidasa+, catalasa+,

nitratasa+ (reducen nitratos a nitritos), no fermentan azucares, crecen bien en medios

generales (AS, agar chocolate y Thayer Martin), son aerobias o 5% de CO2; flora normal de

naso-faringe, pero a veces se aísla como agente causal en septicemias

e infecciones otorrinolaringológicas (sinusitis, otitis).

- Acinetobacter => anteriormente clasificada dentro de la familia Gram- no fermentadoras

(pero oxidasa- => bacteria inerte) junto con Pseudomonas; actualmente esta incluido dentro

de la familia Moraxellaceae; son microorganismos que pueblan fundamentalmente suelos y

aguas y presentes en medios hospitalarios (infección nosocomial); la especie mas

importante => A.calcoaceticus (causan neumonías, infecciones urinarias y sepsis); crecen

en Mac, AS y otros; en AS producen colonias grises con halos de hemólisis, oxidasa-,

catalasa+, son cocobacilos Gram- (se pueden confundir con Neisserias por su tamaño).

- Moraxella => coco-bacilo, Gram-, no fermentador, inmóvil, oxidasa+, catalasa+, difícil de

distinguir con Neisseria; en general los no fermentadores son muy difíciles de distinguir y

requiere numerosas pruebas bioquímicas para etiquetarlos.

Tema 18 - Entero-bacterias y vibrios

(patología e identificación)

Entero-bacterias - bacilos o coco-bacilos Gram-, aerobios y anaerobios

facultativos, móviles (flagelación perítrica) o inmóviles, fermentadoras de glucosa (con o

sin producción de CO2), oxidasa-, catalasa+; algunos usan metabolismo fermentativo y

otros usan metabolismo oxidativo; la mayoría son nitratasa+; algunos son sulfuhidratasa+

(Proteus y Salmonella), indol+ (E.coli); son saprofitas/ flora del tracto gastrointestinal del

hombre y de los animales; también se encuentra en el agua y en el suelo; resistentes a

medios externos; son potencialmente patógenos en individuos debilitados y produce

infecciones oportunistas; algunos son patógenos siempre donde sea se encuentra, otras

depende de la muestra donde se aísla y el resto se cuestiona su papel.

Características antigénicas:

- Ag somático / Ag O => es lipo-polisacárido, termo-estables, se encuentra en la pared

bacteriana, es una endo-toxina (la parte polisacárido es muy antigénico y la parte lipídica es

inactiva bioquímica-mente).

103/168

- Ag capsular / Ag K => se encuentra en la capsula bacteriana, es polisacárido, es anti-

fagocitarías (relacionado con la virulencia de ciertas especies como E.coli K-1 y Salmonella

thyphi).

- Ag flagelar /Ag H => es característico de las cepas móviles, es proteico y responsable de

la acción patógena de la bacteria.

Clasificación según su capacidad para fermentar la lactosa:

- Fermentadoras rápidas de lactosa (coliformes) => Escherichia, Enterobacter y

Klebsiella(tardía a veces)

- Fermentadoras lentas de lactosa / ONPG+ (coliformes) => Citrobacter, Serratia, Hafnia,

Yersinia (patógeno) y Shigella sonnei.

- NO fermentadoras de lactosa (no coliformes) => Salmonella, Shigella, Proteus,

Morganella, Providencia y Edwardsiella.

Salmonella - entero-bacterias no coliformes, móviles con flagelación perítrica; bacilos

Gram-; en general provocan infecciones entérico febriles (gastroenteritis, entero-colitis o

fiebres tifoideas o para-tifoideas).

Especies importantes - S.typhi, S.choleraesuis, S.enteritidis, S.paratyphi A,B y C,

S.arizonae.

Acción patógena e interés clínico - Ag somático O, Ag flagelar H y Ag capsular VI (en S.typhi - Ag termolábil con

poderprotector frente a los ácidos /ácida gástrica, resistencia y anti-fagocitarías)

- endo-toxina y enterotoxina (efecto irritante y citotóxico sobre el tracto intestinal)

Cuadros clínicos 1. Infecciones entéricas (S.typhi - fiebres tifoideas o S.paratyphi A,B o C - para-

tifoideas); Las fiebres tifoideas son transmitidas al hombre vía oral (alimentos crudos, poco

hechos, mal conservados y aguas contaminadas), llega al estomago, resiste la

acidez gástrica,pasa al intestino delgado (íleon), penetra por endocitosis destruyendo parte

de las celulas de la mucosa intestinal; una vez dentro las salmonellas

son fagocitadas por macrófagos ytransportadas por diferentes vías y provoca bacteriémia =>

todo sucede en el periodo de incubación (8-15 días); comienzo brusco de signos y sintomas

=> los macrófagos les transportan hacia el bazo, higado y MO,

produciendo multiplicación de nuevas salmonellas, volver al intestino generando placas

ulceradas, necrosación de placas de Peyer y en casos mas graves originar perforación y

hemorragias.

Las fiebres para-tifoideas son mucho mas leve con un periodo de incubación de entre 7-10

dias con bacteriémia y estado febril que dura varias semanas; no

hay perforación intestinal ni hemorragias ni invasión de salmonellas a

otros órganos; cuadros clínicos => dolores de cabeza, fiebres altas, anorexia,

astenia/ cansancio; preciso un tratamiento que dura 9-10 días.

2. Infecciones gastrointestinales y enterocolitis (S.enteritidis - la mas

frecuente,S.choleraesuis, S.typhimurium y otras); periodo de incubación 12-36 horas; se

transmite por alimentos contaminados con una concentración de salmonellas de 10 millones

a mil millones/ml, depende de tipo de la cepa; el alimento les facilita su llegada a pasar el

estomago y llegar al intestino delgado colonizando el íleon y el ciego, se penetran por

fagocitosis al epitelio y se multiplican originando una inflamación que genera cuadros

diarreicos con dolor abdominal (perdidas de electrolitos y agua), fiebres altas,

104/168

nauseas, vómitos; re quiere untratamiento de re-hidratación que dura 6 días - las floras se

encargan de eliminarlas.

Aislamiento - pruebas bioquímicas - diagnostico de Salmonella Salmonelosis => toma muestra de las heces (coprocultivo), análisis del alimento

sospechoso; medios de cultivo SS, McConkey, caldo selenito; pruebas bioquímicas: ONPG-

, TDA-, Citrato+ (S.cholera-suis y S.enteritidis, tambien son CO2+ y Ornitina

descarboxilasa+), SH2+, fermentacion de azucares: Glucosa+, Trehalosa+

(S.typhi yS.enteritidis), etc.

Fiebres tifoideas y para-tifoideas => toma muestra de diferentes localización según la

fase de enfermedad; en la fase de incubación se busca en heces (coprocultivos), en

orina(urocultivo), sangre (hemocultivo); en la fase inicial de la enfermedad / periodo febril,

se realiza hemocultivo; en el periodo posteriores o finales se busca en heces (coprocultivo);

medios adecuados; se realiza las pruebas bioquímicas, reacciones

de aglutinación cuantitativa (títulos) de Ags O, H y VI a traves de

sueros específicos monovalentes y polivalentes, especialmente para Ag VI

(pruebas inmunológicas).

Mucaptest => prueba inmunológica utilizando suero polivalente (Acs anti O y anti H), un

resultado positivo dara unas colonias fluorescentes (posible Salmonella).

105/168

Shigella - bacilo Gram- inmóvil, no fermentador de lactosa (excepto S.sonnei) ;

son patógenas para el hombre, provoca afecciones graves y contagiosas sobre el tracto

gastrointestinal (disentería bacilar) especialmente en ambientes de salubridad baja.

Acción patógena e interés clínico - se debe a la producción de sustancias toxicas, Ags O y

K, plásmidos (facilita la invasión), adhesinas (adherencia a las celulas que

invaden),exotoxina con propiedades cito-toxicas (tipo A - origina necrosis celular, ulceras,

hemorragias y perforación), neuro-toxicas y entero-invasivas (tipo B - adherencia a las

celulas del epitelio gastrointestinal); al llegar al intestino del hombre vía oral (puede resistir

el acido gástrico, por la alta cantidad ingerido y también protegido por los alimentos), ejerce

su acción toxica, pasar al colon originando necrosis con signos y

sintomas características (las toxinas deS.disenteriae no suelen pasar a la sangre); cuadros

diarreicos van acompañados dedolor cólico, nausea, vómitos, malestar general y fiebres

muy altas con deposiciones sanguinolentas con moco y pus.

Aislamiento - pruebas bioquímicas, diagnostico de Shigella Toma muestras de heces recién emitidas en los primeros días de la enfermedad (hay mayor

numero de shigellas), eligiendo restos de moco y sangre si los hubiera; el estudio

riguroso(teniendo en cuenta que Shigella se destruye en medios ácidos y a temperaturas

<4ºC; medios de cultivos SS, McConkey, Hektoen, Yersinia CIN, Campylosel,

TCBS;pruebas bioquímicas TDA, KIA (K/A para Shigella y A/A para S.sonnei), ONPG

(positivo para S.sonnei), fresco, ureasa-, VP-, nitratasa+, manitol

(positivo para Shigella y negativopara S.disenteriae); pruebas de aglutinación cuantitativa

(titulo) para demostrar Acs en el suero del paciente a traves de sueros específicos mono y

polivalentes.

Escherichia - entero-bacterias bacilar o coco-bacilar Gram- móviles, fermentadoras de

glucosa y lactosa, produce CO2, aguantan temperaturas altas (la diferencia de otros

coliformes), resistente a medios externos, fácil de encontrar en el agua,

alimentos (indicativo de contaminación fecal reciente); saprofito de flora aerobia y

106/168

anaerobia facultativa del tubo digestivo; puede provocar trastornos gastrointestinales de

diarrea, infecciones urinarias, meningitis en neonatos y excepcionalmente bacteriémia; la

especie mas importante para el hombre es E.coli (según la cepa puede tener Ag somático O,

capsular K y flagelar H, fermentos y endo-toxinas).

Acción patógena e interés clínico - los cuadros clínicos son variables según el tipo de

toxina que originen; algunas cepas de E.coli forman Ag O y K anti-fagocitarías y resistencia

a bactericidas y ATB (alto poder invasivo); otras cepas forman endo-toxinas, causante de

cuadros febriles y diarreicos; otras cepas tienen un mecanismo de acción análogo al de

Shigella con menor gravedad; a veces la entero-toxina que producen es parecida a la

deVibrio cholerae que causa perdida masiva de agua y electrolitos.

- si la cepa de E.coli forma una entero-toxina citotóxica parecida a Shigella => cuadros

diarreicos en brotes epidémicos que afectan a niños y lactantes (E.coli entero-patógena)

- si forma una entero-toxina semejante a Vibrio cholerae => procesos diarreicos en niños,

adultos, originándose esporádica-mente brotes epidémicos (diarrea del viajero -

E.colientero-toxígena)

- si forma una entero-toxina citotóxica similar a S.disenteriae => procesos diarreicos graves,

hemorragico esporádicamente en brotes (E.coli entero-hemorragica)

- si presenta ciertos plásmidos que incrementan su capacidad de invasión => cuadros

diarreicos graves que afectan a niños, adultos con brotes epidémicos en casos aislados

(E.colientero-invasiva)

Las cepas de E.coli se distingue con sueros antigénicos; E.coli también puede provocar

infecciones urinarias (cistitis, pielonefritis, etc), infecciones biliares, heridas, meninges

(meningitis en neonatos).

Aislamiento, pruebas bioquímicas - diagnostico Toma de muestra representativa de alimento, agua, heces, exudado; frotis de Gram; medios

de cultivo Mc, Levine; pruebas bioquímicas => lactosa+, indol+, citrato-, sensible a la

Colistina.

Yersinia - entero-bacterias muy patógenas para el hombre (Y.pestis - causante la

peste bubónica); son coco-bacilos Gram-, móviles a

25ºCcon flagelación perítrica e inmóviles a 37ºC, fermentadores de glucosa (ONPG

variable),capsuladas (Y.pestis) y oxidasa-.

Especies mas importantes - Y.pestis (agente etiológico de la peste bubónica en el hombre)

trasmitida a traves de ratas y pulgas, originando enfermedad grave febril, epidémico de alta

mortalidad; Y.pseudotuberculosis afecta animales y excepcionalmente al

hombre; Y.enterocolitica (sacarosa+ en medio TSI); los 2 últimos afectan mas a animales

que al hombre (niños) => originando estados febriles y diarreicos.

107/168

Acción patógena e interés clínico de Y.pestis => cuadros agudos y febriles con

alta inflamación de los ganglios linfáticos, hemorragias internas, petequias difusas en la

piel, en ocasiones septicemia y neumónia; es muy contagiosa, se origina en lugares de

salubridad baja; la muerte se produce por shock séptico (fracaso multi sistémico) o

por neumónia; factores de virulencia:

- La toxina murina (liberada al medio cuando muera la bacteria) => proteína que bloquea

la utilización de O2 por parte de las celulas.

- Endo-toxinas (liberadas en el transcurso de la enfermedad) => origina el proceso febril

- Ag V con propiedades anti-fagocitarías

- Coagulasas y fibrinolisinas

Y.pestis llega al hombre a traves de la picadura de pulga (infectada por ratas con

peste),atraviesa los vasos linfáticos, pasa a los ganglios donde se multiplica originando

bubones,pasa a la sangre y se disemina por el bazo, higado, pulmones, piel, mucosas, se

multiplica provocando lesiones piógenas (toxina murina), hemorrágicas, necrótica y

edematosa; en casos graves aparece coagulacion intravascular diseminada (CID) (por

la acción de lascoagulasas) o diátesis hemorragica (por la acción de las fibrinolisinas),

colapso circulatorio, toxemía generalizada y muerte; formas clínicas:

1. Peste bubónica (la mas frecuente); tras el periodo de incubación de 3-7 días después de

la picadura, aparecen signos y sintomas con escalofríos, vómitos, formación de bubones en

las ingles axilas y/o zonas submaxilares (los tejidos circundantes aparecen inflamados); sin

tratamiento se agrava hasta la muerte.

2. Peste pulmonar (es la complicación de peste bubónica); se produce afección pulmonar

grave con insuficiencia respiratoria, cianosis; es altamente mortal.

3. Peste septicémica es estadios últimos de la peste en cual quiera de sus formas y es

generalmente mortal.

Aislamiento - pruebas bioquímicas - diagnostico Toma de muestra de exudados purulentos del bubón (por aspiración), de sangre, LCR,

tejido pulmonar, nódulos linfáticos o esputo, heces, según los casos; la tinción Gram-,

nigrosina (visualización de capsulas); medios de cultivo => Mc, Yersinia CIN (colonias

muy pequeñas); pruebas bioquímicas => móvil a 22ºC y inmóvil a 37ºC, Lactosa-

, ONPG+,ureasa+, indol y TDA-, oxidasa-, nitratasa+; a

veces Y.pestis y Y.pseudotuberculosis son ONPG variable; Y.enterocolitica es sacarosa+.

Entero-bacterias oportunistas - bacilos Gram- aerobios y anaerobios facultativos, poco

exigentes nutricional-mente, ampliamente distribuidos en el medio ambiente; son saprofitos

de la flora gastrointestinal, resistente a medios externos y ATB; no son patógenos al no ser

si el huésped es debilitados, pueden provocar infecciones hospitalario; en la mayoría son

lactosa+, bacilos Gram- coliformes;

108/168

Principales especies de coliformes/ lactosa+ (Escherichia, Enterobacter, Citrobacter,

Serratia, Klebsiella y Hafnia) y no coliformes /lactosa- (Proteus, Morganella y

Providencia).

1. Escherichia => Gram- aerobias y anaerobias facultativas, fermentadoras rápidas de

lactosa y glucosa, produce CO2, indol+, citrato-, sensible a Colistina, móviles.

2. Enterobacter => fermentadora rápida de lactosa, produce CO2, produce acetoína de la

glucosa (VP+), citrato+, móvil, ornitina-descarboxilasa+, son comensales de flora intestinal;

puede provocar a individuos debilitados diarreas, infecciones del tracto respiratorio, heridas,

etc; especies importantes: E.aerogenes y E.cloacae.

3. Serratia => fermentadora lenta de lactosa (ONPG+) y la

glucosa,produce acetoína (VP+), móviles, citrato+, ADNasa+, ornitina-

descarboxilasa+, saprofitas del hombre y también en el medio ambiente (agua y

otros líquidos), resistentes a ATB y desinfectantes; provoca infecciones urinarias y sepsis a

personas debilitadas.

4. Citrobacter (huelen a peste) => fermentadora lenta de lactosa (ONPG+), móvil,

fermenta la glucosa y VP- RM+, citrato+; son comensales del tubo digestivo del hombre y

puede provocar infecciones urinaria, respiratoria, sepsis, bacteriémias, meningitis a los

individuos debilitados; especies importante => C.freundii.

5. Klebsiella => inmóviles, fermentadoras tardía de lactosa, utiliza glucosa

yproduce acetoína (VP+), citrato+, ureasa+; son comensales del tracto gastrointestinal

y vías respiratorias superiores; puede provocar neumonías, rinitis, infecciones urinarias;

especies importante => K.pneumoniae (sub especies VP+ y VP-) y K.oxytoca (indol+).

6. Hafnia => móviles a 22ºC y inmóviles a 37ºC, fermentadora lenta de lactosa

(ONPG+),citrato+, utiliza glucosa y produce acetoína (VP+); provoca infecciones

hospitalarias.

7. Proteus, Morganella y Providencia => NO fermentan la lactosa, pero si glucosa y

produce CO2, RM+; móviles, TDA+ (diferenciar del resto entero-bacterias), pueblan aguas

residuales, el suelo, materia orgánica y son comensales en la flora intestinal del hombre;

pueden provocar infecciones hospitalarias; especies importantes:

- Proteus mirabilis (indol-, ureasa+, TDA+, SH2+), P.vulgaris (indol+, ureasa+, TDA+)

- M.morganii (ureasa+, indol+, TDA+)

- Providencia rettgeri (ureasa-, indol+, TDA+)

P.mirabilis puede provocar infección urinaria, descompone la urea de la

orina quegenera precipitación de

sales cálcicas => formación de cálculos renales; también puede provocar infecciones

gastrointestinales, toxinfecciones alimentarias, heridas, etc.

109/168

Acción patógena e interés clínico - si el huésped se encuentra debilitado (postoperatorio,

tratamiento inmunosupresores) los saprofitos podrían ser patógenos; las infecciones mas

frecuentes =>

- tipo urinario (40% de las infecciones hospitalarias - pacientes sondados, encamados,

intervencionados quirúrgica-mente) provocado por E.coli, P.mirabilis, P.vulgaris, Klebsiella

y Enterobacter, provocando cistitis (de las vías bajas) y pielonefritis (de las vías altas); son

infecciones agudas con fiebre, dolor lumbar, polaquiuria o anuria y disuria; es frecuente en

los análisis de orina piuria, bacteriuria y proteinuria;

- tipo abdominal son poco frecuente => abscesos y peritonitis debido

a perforación intestinal.

- tipo respiratorio (20% de las infecciones hospitalarias) afectando vías respiratorias

altas, neumonías y bronco-neumonías (pacientes con afecciones crónicas)

Aislamiento - pruebas bioquímicas - diagnostico - Toma de muestra según las afecciones o procesos patológicos en condiciones de total

asepsia

- Examen directo (fresco y tinción Gram)

- Aislamiento en medios específicos/ selectivos (Hektoen, Mac) que inhiben los Gram+

- Pruebas bioquímicas e inmunológicas

110/168

Familia Vibrionaceae - Genero Vibrio, Aeromonas y Pleisomonas (los patogenos) Especie mas importante y patógeno del genero Vibrio - V.cholerae => bacilos Gram-

anaerobios facultativos de morfología curva (pleomórficos), móviles (flagelación lofótrica),

crecen bien en medios generales y pH alcalino (sensibles al medios ácidos), oxidasa+ (la

diferencia de la enterobacteriaceae), halófilo, catalasa+, afectan al tracto gastrointestinal del

hombre; es el agente causal del cólera => provoca diarreas graves hasta llegar a

la deshidratación (diarreas masivas), shock hipovolémico, coma y

muertepor deshidratación (puede perder hasta 10-15 lt/día de agua y electrolitos); se

diferencia dePseudomonas por la diferencia en el patrón de fermentacion de azucares.

Acción patógena e interés clínico:

- Ag somático O (polisacáridos) se utiliza para su tipación

- Ag flagelar H (no tiene valor para su tipación - común a todas las cepas)

- Exotoxina / entero-toxina proteica (el principal efecto patógeno del cólera - provoca

diarrea masiva)

- Adhesina (proteína que tiene afinidad por los azucares) que permite adherirse a la pared

intestinal

Para formar cuadros graves es necesario su penetración por vía oral (agua o alimentos

contaminados con el bacilo, p.ej. productos marinos crudos), eludir el medio acido del

estomago (sucede cuando se ingieren >100 millones de gérmenes - en el caso de epidemias

donde se encuentra 1 millón/ ml de agua).

Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico - Toma de muestra a partir de las heces diarreicas, vómitos, procediéndose de inmediato a

su identificación (sensible a medios externos); medio de transporte Cary-Blair.

- Aislamiento en medios de cultivo específicos TCBS que impide el crecimiento de gran

111/168

parte de microorganismos => produce colonias amarillas por la fermentacion de la

sacarosa sobre el medio verde y también se siembre en el Mc.

- Pruebas bioquímicas => oxidasa+, catalasa+, sacarosa+ (produce un tipo de

acido débiles que no bajara mucho el pH)

- Pruebas serologícas para determinar el titulo de Acs.

Aeromonas - bacilo Gram- no fermentadoras de la misma familia; el especie mas

importante Aeromonas hydrophila; catalasa+ y oxidasa+, VP+, lactosa-, ureasa-, indol+,

SH2-, móviles; no son halófilo (a diferencia de Vibrio) implicadas en procesos diarreicos.

Plesiomonas - tiene las mismas características bioquímicas que Aeromonas (excepto en

pruebas de VP y ornitina descarboxilasa); el especie mas importante Plesiomonas

shigelloides(se propone a incluirla a la familia enterobacterias); hay que hacer API para

distinguirla de Aeromonas (Plesiomonas - ornitina descarboxilasa+)

Tema 19 - Bacilos y cocobacilos aerobios y anaerobios

facultativos (patología e identificación)

Pseudomonas - bacilos pequeño (coco-bacilo) Gram-, móviles (flagelación), en

generalaerobios estrictos, catalasa y citocromo oxidasa positivos, en

generalmetabolismo glucídico oxidativo; ampliamente distribuidos en el agua y suelo,

pasando de aquí a los animales y al hombre; son oportunistas en el ambiente hospitalario

(pacientes inmunodeprimidos), en ocasiones resultan muy graves (resistente a muchos ATB

- hay que combinar varios).

Los especies mas importantes:

- P. aeroginosa => presenta pigmentos fluorescentes, saprofita en la piel, tubo digestivo??,

puede provocar cuadros graves en individuos debilitados y es mortal si se produjese

septicemia;

- P. maltophilia (ahora se llama Stenotrophomonas maltophilia) se llama así, porqueoxida

maltosa (no oxida la glucosa); cogen cada vez mas importancia; oxidasa variable.

Acción patógena e interés clínico - Pseudomonas aeroginosa - Ag somático O (polisacáridos), Ag flagelar H (proteico), Ag mucoide M (produce

exotoxinas => enterotoxina responsables de cuadros diarreicos y toxina eritrodérmica).

-

112/168

Sustancia => (1) piocina (pigmento azulado de acción bactericida), (2) fluoresceina(pigmen

to verde amarillo) y (3) pigmento melánico (tiñe de color marrón los cultivos).

- Cuadros graves o muy graves (de carácter oportunista) => sinusitis crónicas, infecciones

del aparato respiratorio (neumonías, faringitis, bronco-neumonías); puede

producir endocarditis en drogadictos y paciente con SIDA; enterocolitis, pielonefritis

y meningitis en neonatos; en grandes quemaduras, agravando la lesión o

provoca infección de heridas quirúrgicas; en casos mas graves puede originar bacteriémia

(quemaduras graves).

Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnóstico bacteriológico - Toma de muestra de cualquier producto patológico, especialmente de carácter purulento

en total asepsia.

- Examen directo (tinción Gram); si el pus es azulado se sospechara de P.aeroginosa.

- Aislamiento en medios generales (el bacilo piociánico es fácil de cultivar) a temperatura

37ºC; es importante estudiar la presencia de pigmentos que se difunden en el medio;

lapiocianina es un pigmento responsable de la coloración azul verdosa que puede adquirir el

medio y el olor a jabón de las colonias son las características de P.aeroginosa.

- Pruebas bioquímicas de citocromo oxidasa+, catalasa+, gelatinasa+, utilización de la

glucosa vía oxidativa (aerobio).

- Pruebas serologícas para buscar Acs anti Pseudomonas.

Brucella - bacilos pequeños (coco-bacilos) Gram- inmóviles, aerobios estrictos, algunas

crecen mejor en atmósferas ricas en CO2 (5-10%), su crecimiento es lento, catalasa+,

oxidasa+, nitratasa+, ureasa+, sensibles a medios ácidos y se destruyen fácilmente a

temperatura de pasteurización.

Especies mas importantes (en función del huésped en el que anidan):

- Brucella melitensis afecta a cabras y ovejas; afecta al hombre a traves de sus leches no

esterilizada, quesos frescos, carne cruda o poco hecha.

- Brucella abortus afecta a bóvidos (la mayoría de los casos de brucelosis en España - en

menor proporción B.melitensis)

113/168

Acción patógena e interés clínico - depende de su estructura antigénica; Brucella es capaz

de mantenerse latente en el interior de la celulas que la han fagocitado y posteriormente,

empezar a multiplicarse con la consiguiente producción de endo-toxina;penetran en el

hombre a traves de heridas y vía digestiva (alimentos procedentes de animales infectados

(leche no esterilizada, quesos frescos, carne cruda o poco hecha); posteriormente,pasaran a

los ganglios linfáticos, donde serán fagocitadas por neutrófilos (en la sangre)

y macrófagos (en los tejidos) y se distribuyen por todo el organismo, volver a pasar al

torrente circulatorio originando bacteriémia (brucelosis aguda o fiebres de Malta); se

caracteriza por artralgias difusas (dolores de articulaciones), sudoración abundante,

esplenomegalia y otras distintas formas clínicas dependientes de la localización de Brucella

(orquitis, neumónia brucelar, etc); las fiebres son ondulantes con tendencia a las

recidivas(frecuente entre los 3 y 6 meses subsiguientes a la infección por Brucella);

Bordetella - bacilos o coco-bacilos Gram- aerobios estrictos, inmóviles (algunas

son móviles), capsulados; son parásitos estrictos (no se encuentran libres en la

naturaleza); se transmite por las gotitas de flugge o contacto directo.

Especies mas importantes:

- Bordetella pertussis (bacilo Bordet y Gengou) => la mas patógena y es

elagente etiológico de la tosferina

- B.parapertussis => aislada en casos benignos de tosferina y no es estrictamente patógena

- B.bronchiseptica => afecta mas a animales que al hombre; aislada en el hombre

excepcionalmente en casos benignos de tosferina.

Acción patógena e interés clínico (Bordetella pertussis) - se infectan a traves de gotitas

(flugge) que se producen al hablar; tras periodo de incubación de 1-2 semanas, empiezan a

multiplicarse en la superficie de las celulas epiteliales ciliadas de la traquea, bronquios y

bronquiolos, originando inflamación en estas zonas, paralización de sus cilios y

consiguiente necrosación; presenta una fuerte acción tusígena (tos seca) que puede llegar a

agotar debido a la acción de la toxina proteica y incremento de las mucosidades

queobstruyen los bronquios (bronco-constricción) lo que facilita un déficit en

la ventilación pulmonar; puede originar cianosis, taquicardia y vómitos alimenticios; es

altamente contagiosa, pero ya existe vacunas de la tosferina.

114/168

Haemophilus - bacilos muy pequeños Gram- aerobios y anaerobios

facultativos, inmóviles y patógenos para el hombre y muchos animales; sensibles a medios

externos, desecación, el calor y muchos antisépticos; necesita medio de cultivo especifico

con sangre como AS o agar chocolate (contiene factores X/hemina o ferroprotoporfirina

y factor V/NAD o nicotinamida-adenina-dinucleotido necesarios para el proceso

de respiración).

Especies mas importantes (clasificadas en función de los factores que necesitan):

- Haemophilus influenzae (bacilo de Pfeiffer) es el agente etiológico de 10-15% de

lasmeningitis en niños de corte edad en España y de neumonías en ancianos; requiere

ambosfactores V y X.

- H.parainfluenzae es agente causales en ciertas meningitis, afecciones respiratorias y

septicemias; también son saprofitos en fosas nasales y boca; requiere solo factor V.

- H.ducreyi es agente etiológico del chancro blando (enfermedad venérea /ETS); requiere

solo factor X.

Acción patógena e interés clínico (Haemophilus influenzae):

- Es capsulada (su capsula esta formada por polisacáridos distintos de A-F) en España es

mas frecuente la del tipo B.

- Posee endo-toxina que es responsable de lesiones en la traquea y bronquios en procesos

neumónicos

- Suelen afectar a las vías respiratorias originando neumonías, bronquitis aguda en ancianos

y adultos debilitados.

- Puede producir meningitis en niños de corta edad; se transmite por vía aérea y mas

frecuente en invierno y primavera; comienza como infección de las vías respiratorias altas

yposteriormente se extiende via sangre hasta el sistema nervioso produciendo meningitis

purulenta con mortalidad alta sin tratamiento a tiempo.

- Existe vacuna para H.influenzae tipo B.

Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico de Haemophilus:

- Toma de muestra a partir del exudado faríngeo, esputo o líquidos purulentos (en caso

de infección de vías respiratorias), LCR por punción lumbar (en caso de

sospecharmeningitis).

- Examen directo (tinción Gram, tinción negativa)

- Se cultiva en agar chocolate o AS de conejo/caballo, se añaden discos que contengan

factores V y X, ATB como la bacitracina que inhibe a otros gérmenes; se formaran

satelitismo según sus necesidades de los factores; incubar en la atmósfera rica en CO2.

- Pruebas bioquímicas => indol+, ureasa+, nitratasa+, oxidasa variable (según la

cepa),fermentacion de glucosa positiva, ONPG-.

115/168

- Técnicas inmunológicas => determinar el Ags capsular (se realizan por la urgencia del

diagnostico)

Legionella - la especie mas importante para el ser humano, es Legionella pneumophila(el

agente etiológico de la legionelosis / neumónia atípica por Legionella); un coco-bacilo o

bacilo Gram-, aerobio estricto, requiere medios muy específicos para crecer (agar

legionella),catalasa+, oxidasa+, en ocasiones puede presentarse de forma filamentosa; en

general son móviles, pero algunas cepas son inmóviles.

Acción patógena e interés clínico - se transmite vía aérea a partir de aerosoles procedentes

de aguas contaminadas o sistemas de aire acondicionado o humidificadores

contaminados con Legionella; tras el periodo de incubación (+/- 1 semana) se produce

fiebres altas, astenia, malestar generalizado, tos, anorexia, dolor pleural agudo, disnea (un

cuadro típico de una neumónia atípica); se conoce como la enfermedad de los legionarios;

el pronostico sera mas severo en ancianos o adultos debilitados aunque con el tratamiento

preciso suele remitir sin problema.

Bacillus - de la familia Bacillaceae; el genero Bacillus son bacilos esporulados aerobios o

anaerobios facultativos con tamaño entre 1-7 micras Gram+ y en su mayoría móviles; otro

genero de la misma familia es Clostridium son bacilos esporulados y anaerobios estrictos,

que origina en su mayoría potentes exotoxinas responsables de cuadros clínicos graves.

Especies mas importantes de Bacillus:

- Bacillus anthracis (agente etiológico del ántrax o carbunco)

- Bacillus cereus (responsable en muchas ocasiones de trastornos gastrointestinales)

- otros bacilos son comensales para el hombre o saprofitos del suelo, agua, etc., y que

depende del estado inmunitario, puede producir diferentes cuadros clínicos (p.ej. Bacillus

subtillis).

Acción patógena e interés clínico de Bacillus anthracis:

116/168

- Es un bacilo grande, habitualmente se presenta en forma de cadenas cortas o en parejas,

formando fácilmente esporas sobre todo en los cultivos viejos; es inmóvil, presenta

capsulas(los patógenos) y exotoxina proteica que proporcionan propiedades anti-

fagocitarías.

- En general, el cuadro clínico que produce es el carbunco animal o humano; en el humano

tiene lugar tras un primer contacto a partir de animales infectados que tras periodo

de incubación de 2-3 días surge una pústula maligna (color negro en la mano) en el punto de

contagio (las manos y cabeza); comienza con una pápula eritematosa que se complica

a vesícula pruriginosa que se convierte en ulcera o escara, que sin tratamiento puede

necrosarse y extenderse en superficie y profundidad; los casos no tratados, podrían ser

graves, ya que existe el riesgo de septicemia intensa que en pocas horas podría originar la

muerte; lo mas habitual son las formas benignas que curan con facilitad tras un tratamiento.

- En casos excepcionales pueden aparecer formas internas como el carbunco pulmonar ante

la inhalación de polvo contaminado con esporas de Bacillus anthracis que da lugar

a neumonías graves; también puede producirse carbunco intestinal por la ingestión de

alimentos contaminados con las mismas esporas y originara diarreas, vómitos, dolor

tipo cólico, fiebre, etc.

Acinetobacter - (también esta descrito en genero de Moraxella/ Neisseriaceas) este genero

engloba especies que pueblan la flora de suelos y agua, al igual que Pseudomonas,

son bacilos Gram- no fermentadoras, capsuladas y presentes en ambiente hospitalarios

donde afectan a pacientes inmunodeprimidos; la especie mas frecuente es Acinetobacter

calcoaceticus que produce infección urinaria, neumonías y sepsis; crecen bien en Mc y AS

que da colonias grises y B-hemolíticas; se diferencian de Pseudomonas en

que Acinetobacter es oxidasa-; son fácilmente confundible con Neisserias porque es bacilo

muy pequeño (coco-bacilo); también es muy resistente a los ATB.

117/168

Tema 20 - Corinebacterium (patología e identificación)

Genero Corinebacterium - pequeños bacilos inmóviles a temperatura corporal, se

comportan como Gram+, suelen agruparse en formas geométricas parecidas a letras chinas

o abecedario (empalizadas); presenta granulaciones metacromáticas, catalasa+, anaerobios

facultativos y pueden dar lugar a un velo superficial en medios líquidos; presentan ciertos

rasgos comunes con Mycobacterium en su pared bacteriana que es muy rica

en ácidos micólicos, arabinosa y galactosa, aunque la tinción de BAAR (Zhiel-Nielssen)

paraCorinebacterium resulta negativa; la especie mas importante es Corinebacterium

diphteriae.

Acción patógena e interés clínico de Corinebacterium diphteriae - el bacilo diftérico llega

al hombre por vía respiratoria a traves de gotitas de saliva (pflugge) u objetos recientemente

contaminados invadiendo la oro-faringe y las amígdalas; desde aquí se extiende, liberando

toxinas y enzimas inhibiendo la síntesis proteica celular, originando necrosis en las celulas

epiteliales que invade; este epitelio necrosado junto con leucocitos y fibrina formara una

pseudomembrana que cubre las amígdalas, que puede llegar a provocar

una obstrucción respiratoria si se extiende por la naso-faringe y laringe; tal

pseudomembrana se encuentra fuertemente adherida a las mucosas, de forma que si se

intenta arrancar, originaria al paciente una fuerte hemorragia; en general los signos y

sintomas de la difteria suelen ser de tipo respiratorio; en casos excepcionales,

por vía linfática podría pasar a la sangre difundiéndose al resto del organismo.

Tema 21 - Mycobacterium y Nocardia

(patología e identificación)

La familia Mycobacteriaceae engloba un solo genero Mycobacterium; son pequeños

118/168

bacilos finos rectos y a veces incurvados, excepcionalmente pueden encontrarse algo

filamentosos; son inmóviles con una pared típica y característica no encontrada en ninguna

otra familia excepto Nocardia (altamente enriquecida con ácidos micólicos y

componentes céreos que se tiñe muy difícilmente - responde a Gram+), se necesitan

colorantes con alta capacidad tintorial para su penetración; una vez teñidos son

altamenteresistentes a la decoloración ácida (AAR+ o acido alcohol resistencia positivo) lo

que les diferencia del resto de microorganismos; son muy distribuidos en la naturaleza,

pueden sersaprofitos del agua y suelo y puede provocar infecciones graves al hombre y en

ocasiones crónicas como la lepra; necesita gran cantidad de oxigeno para sobrevivir

(aerobias estrictas).

Las especies mas importantes del genero Mycobacterium (3 importantes grupos):

(1) Bacilos de Mycobacterium cultivables en medios artificiales, de crecimiento

lento(>1semana hasta 3 semanas); en función de los cuadros clínicos se subdividen en 2

grupos:

a. especies que producen tuberculosis al hombre y a los animales (Mycobacterium

tuberculosis y Mycobacterium bovis).

b. especies de micobacterias atípicas de crecimiento lento, podrían presentar un

poder patógeno para el hombre distinto al de la tuberculosis y la lepra (Mycobacterium

avium y Mycobacterium marinum).

(2) Micobacterias de crecimiento rápido (<1semana); no tiene interés clínico (no

son patógenos) para el hombre.

(3) Bacilos de Mycobacterium no cultivables sobre medios artificiales y patógenos para el

hombre (Mycobacterium leprae) y ciertos roedores (Mycobacterium lepraemurium)

Los micobacterias también se pueden clasificar en función de la producción de pigmentos,

de las morfologías de las colonias y de la velocidad del crecimiento.

Acción patógena e interés clínico Mycobacterium tuberculosis - responsables de tuberculosis en el hombre

Muy rica en componentes lipídicos en su pared celular dotándole un carácter tintorial

especifico AAR+ que servirá para su identificación y clasificación; contiene proteínas que

provocan la formacion de Acs (reacción de la tuberculina /test de Mantoux); es capaz

decrecer en el interior de las celulas que constituyen el sistema retículo endotelial, se

multiplican dentro de ellas sin ser destruida; en el frotis de baciloscopia se puede

observar forma cordones microscópicos.

Llega al hombre por inhalación (excepcionalmente por ingestión de alimentos

contaminados con Mycobacterium o a traves de las heridas de la piel); produce

una lesión primaria en el pulmón y mas concretamente a nivel de los alvéolos pulmonares,

provocando unaintensa reacción inflamatoria que da lugar a exudación; estos bacilos

pueden llegar hasta los vasos linfáticos y de aquí a los ganglios, retornando a

la circulación venosa y originandofocos metástasis en distintos órganos; sin tratamiento se

va desarrollando evolucionando hacia una necrosis "caseosa" (parecida a queso de

119/168

caverna); después de 6 semanas o mas va evolucionando hacia

una destrucción y desintegración de las celulas pulmonares con la formación de una masa

solida, homogénea, parecida al queso (caverna tuberculosa); provocara fiebres mas o menos

variables, sudoración por la tarde, adelgazamiento progresivo, tos débil o intensa (a veces

con esputos muco-purulentos) y en fases mas avanzada,hemoptisis; en general cualquier

parte del organismo podría verse afectada a causa de diseminación (gastrointestinales,

genito-urinarias, pericárdicas, etc.)

Mycobacterium leprae - productoras de la lepra en el hombre

Se multiplica con extraordinaria lentitud y su clínica es bastante insidiosa y no ha podido

ser cultivado en ningún medio in vitro, por lo que se conocen poco

sus características microbiológicas; su único reservorio es el hombre con

autentica predilección por las terminaciones nerviosas; es un bacilo inmóvil, rectilíneo, se

tiñe con Zhiel-Nielssen (AAR+); suelen encontrarse en la mucosa nasal, en la dermis y en

biopsias de lesiones en individuos con lepra;

La vía de entrada es a traves de lesiones en la piel, se propagan a los nervios

superficiales próximos, concretamente a las celulas de Schwam; de aquí propagarse

via linfática al sistema venoso y disemina a otros órganos (lepra lepromatosa); se multiplica

mejor en las partes mas frías del organismo (la cara, extremidades) invadiendo los nervios

mas superficiales; el bacilo se multiplica en el interior de los macrófagos de la piel y las

celulas de Schwam, originando inflamación y perdida de sensibilidad; en estado

grave también aparece en órganos mas profundos y su pronostico es mas complicado; su

periodo de incubación es muy difícil de determinar, puede durar muchos años; su periodo

de invasión es muy insidioso, sintomas raros y no asociables a lepra (picor, hormigueo y

perdida de sensibilidad en las manos/pies; a partir de aquí, de forma lenta y progresiva

aparecen lesiones cutáneas (maculas prominentes en extremidades y cara); su periodo

durara toda la vida y su evolución mas o menos grave dependerá del grado de inmunidad

del huésped; tto => ATB sistemico.

Micobacterias atípicas - producido por Mycobacterium avium y Mycobacterium marinum

Las micobacterias atípicas son m.o. patógeno para el hombre, frecuentemente

de carácter pulmonar, a veces confundido con Mycobacterium tuberculosis ya que

la sintomatología es similar => tras una invasión, se

producen formación de tubérculos y consiguiente necrosis caseosa con formación de

cavernas, diseminación y cuadros de fibrosis pulmonar con rara aparición de focos extra-

pulmonares; la gravedad de lesiones depende del estado inmunológico del paciente;

los gérmenes invadirá especialmente individuos inmunodeprimidos; la vía de entrada es

muy variable (respiratoria o mucosas).

120/168

Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico

a)- Aislamiento de Mycobacterium tuberculosis - Muestras puede proceder de esputo, aspirado bronquial, aspirado gástrica; LCR e orina; la

muestra de esputo han de someterse a

una descontaminación, homogenización y concentración (mediante centrifuga) previa al

cultivo; LCR, orina, etc. se puede sembrar directamente, pero lo mejor seria centrifugar-

lo antes.

- Se realizara un examen microscópico del frotis previa tinción de Zhiel-Nielssen

(AAR); también se pueden utilizar tinciones fluorescentes (auramina, rojo de tiacina,

naranja de acridina), cuando se sospecha que hay pocos bacilos (todo se trabaja bajo la

campana de flujo laminar).

- Para aislar el bacilo de Koch de muestras estériles (LCR, orina) se

utilizaramedios líquidos como Proskauer-Beck; si pretendemos hacerlos crecer en

medios sólidos (esputo), existe medios específicos como Lowenstein-Jensen o Coletsos, que

contienen huevo, aminoácidos, sales minerales y verde malaquita (inhibe

los gérmenes contaminantes) cuyo crecimiento es lento (2-4 semanas); también existe agar

Middlebrook que se suele emplear junto con el anterior para completar su identificación;

Micobacterias son muy exigentes en su crecimiento => incubar a 37ºC, en la oscuridad, en

el ambiente con CO2 de 5-10% (en 1ª semana) y en atmósfera normal a partir de la 2ª

semana; los tubos desenroscados hasta que se evaporen el agua (sin secar el medio);

la mayoría tardan entre 3-6 semanas en crecer (algunos aun mas); si hay crecimiento,

se hará la identificación de su morfología mediante tinción de Zhiel-Nielssen y pigmentos.

- Pruebas bioquímicas => la mas importante es la prueba de la niacina+ (todas las

micobacterias producen ácido nicotínico durante su crecimiento; M.tuberculosis no

metabolizan el ácido nicotínico y por ello lo acumulan y es excretada al medio, sobre todo

en medios con base de huevo, del cual puede ser extraída y detectada); es nitratasa+ y

catalasa+(solo algunas cepas de Mycobacterium tuberculosis no tienen la catalasa; en

general tienencatalasa termolábil (a temperatura alta no tienen catalasa).

- Pruebas serologícas => la mas utilizada es la técnica ELISA; actualmente

la identificación se hace con el PCR, posteriormente se realiza la hibridación con las

sondas genéticas (ADN) de M.tuberculosis marcadas.

- Pruebas de alergia /la prueba de la tuberculina (Mantoux); tuberculina es un extracto

proteico de bacilo tuberculoso; es solo toxico para individuos que han estado en contacto

con dicho germen, originando una reacción intradérmica en la cara anterior del brazo

intensa; este eritema endurado (pápula de >10mm es positivo) se debe leer hacia 48-72

horas (se mide la pápula no la zona roja); después de las 4-6 semanas posteriores al

contacto, la prueba del Mantoux dará de por vida positiva.

b)- Aislamiento de Mycobacterium leprae - Muestras a partir de heridas sospechosas en piel y otras localizaciones.

- Se realiza una tinción de Zhiel-Nielssen o AAR, que deberá dar positiva

- No podrá ser cultivada en medios de cultivo

- Se realizara un diagnostico serológico (un estudio de la inmunidad celular y humoral del

individuo)

121/168

- Pruebas cutáneas: (depende del resultado, se hace los 3 pruebas o solo algunos).

1. reacción de la lepromina => para conocer el tipo de lepra que posee ese individuo (prueba

de intra-dermorreacción /Ag de bacterias inactivadas); Las personas que no tienen lepra

tendrán poca o ninguna reacción de la piel al Ag. Los pacientes con un tipo particular de

lepra, llamado lepra lepromatosa, no tendrán ninguna reacción de la piel al Ag; una reacción

positiva de la piel se puede observar en pacientes con lepra tuberculoide y lepra dimorfa

tuberculoide.

2. test de pilocarpina => para buscar la ausencia de sudoración de la piel

lesionada después de una inyección de clorhidrato de pilocarpina.

3. test de la histamina => inyectar histamina de tal forma que en una piel sana aparecerá una

reaccion alérgica característica, mientras que en las lesiones lepromatosas esto no sucede

debido a que los nervios periféricos están lesionados y

no aparecerá ninguna reacción alérgica.

c)- Aislamiento de Micobacterias atípicas - Recogida de muestra de los lugares sospechosos en total asepsia

- Tinción de Zhiel-Nielssen (positiva); tinción fluorescencia con auramina, rojo de tiacina,

naranja de acridina.

- Cultivos en medios Lowenstein-Jensen, Coletsos o caldo Middlebrook, donde se puede

observar el aspecto de las colonias, su velocidad de crecimiento y la presencia de

pigmentos.

- Pruebas bioquímicos: niacina- (la diferencia de Mycobacterium tuberculosis), catalasa+,

nitratasa+.

- Pruebas serologícas de ELISA

Actualmente en grandes laboratorios, se utilizan medios de cultivos radiométrico (Bactec

TB)de deteccion mas rapida que contiene liquido de soporte (agar Middlebrook) con

ATB para inhibir los demas gérmenes y el sustrato marcado con un isótopo del carbono

C14; las micobacterias al crecer metabolizan el sustrato y liberan gas CO2

marcado radioactivamente que es detectada automáticamente por el Bactec y una vez que se

ha detectado crecimiento en alguno de los medios, se realiza la tinción de Ziehl-Neelsen

para ver si lo que ha crecido son BAAR o no.

Baciloscopias - las extensiones para baciloscopias se deben hacer previamente a

la descontaminación (CHNa 2-4%) de las muestras y homogenización (N-acetil cisteina) ,

posteriormente su concentración por centrifugación; la preparación del frotis del esputo ha

de hacerse seleccionando la parte mas purulenta que es donde hay mas micobacterias;

cuando se lleva acabo la tinción de los frotis, se debe evitar el contacto físico entre las

portas para evitar contaminación cruzada; es importante cuantificar el numero de bacilos

encontrados ya que esta directamente relacionado con el grado de contagiosidad del

paciente y con la gravedad de la infección.

122/168

El genero Nocardia - corresponde a actinomicetos aerobios que forman micelio

vegetativoque tiende a fragmentarse originando estructuras bacilares o coco-bacilares;

Gram+ inmovil,aerobios estrictos y

AAR+ (tiene características análogas al Mycobacterium) poseen gran cantidad de acidos

micolicos de cadena larga en su pared bacteriana; poseen ademas glicolípidos y fosfolípidos

que sirve para su identificacion y diferenciación; algunas especies son patógenas para el

hombre.

Acción patógena e interés clínico Gran parte de nocardiosis son infecciones de carácter oportunista; no produce toxinas, pero

contiene en su pared bacteriana alta proporción de lípidos que le confiere una resistencia a

los sistemas de defensa (macrófagos, linfocitos, etc.); tiene capacidad de crecer y

multiplicarse en el interior de los tejidos (macrófagos) como parásito intracelular y solo

crece cuando las defensas del individuo se encuentran bajas; las

manifestaciones clínicas mas frecuentes son:

A. Nocardiosis pulmonar - causada sobretodo por Nocardia asteroides que produce lesiones

pulmonares con abscesos, inflamación diseminada semejante a la tuberculosis; pueden

surgir áreas de necrosis y diseminarse por sangre a otros órganos provocando septicemia.

B. Micetomas (lesiones granulomatosas) de carácter crónico originadas en

eltejido subcutáneo donde se producen tumefacción, abscesos y pústulas y/o nódulos que al

abrirse presentan exudados sero-sanguinolentos; generalmente causados por Nocardia

brasiliensis y es frecuente en las extremidades inferiores y superiores; presenta periodos

de remisión y es característico de climas tropicales;

123/168

Tema 22 - Bacterias anaerobias

(patología e identificación)

Anaerobias - todas aquellas bacterias incapaces de crecer y/o mantenerse en contacto con

O2 a la presion atmosférica; presentan un metabolismo anoxibiótico => incapaz de utilizar

O2 de la atmósfera como aceptor final de electrones; en su lugar utilizan

sustratos orgánicos como aceptores finales de

electrones(respiración anaeróbica /fermentacion); la presencia de O2 puede

ser (1) bactericida /toxica /letal directa o bacteriostático (crecerán de nuevo cuando las

condiciones son favorables); (2) inhibir ciertos sistemas enzimáticos o la función reguladora

primordial del metabolismo celular; (3) generan producto tóxicos al interaccionar sus

componentes propios con O2; los anaerobios son las bacterias predominantes en la

flora normal humana y en algunas partes p.ej. boca o intestino están en proporción de

1000:1 con respecto a la flora aerobia, por tanto, la mayoría de la infección que provoca

los anaerobios son endógenas; dentro de los anaerobios se distingue => anaerobios

estrictos y anaerobios aero-tolerantes/microaerofílicos (puede crecer a 2-8% de O2).

Genero Clostridium - bacterias anaerobias esporuladas; son bacilos Gram+, anaerobios

estrictos, forman esporas a nivel terminal o subterminal,

presentan flagelación perítrica, móviles, no presentan capsulas excepto Clostridium

perfringes; ampliamente distribuidas en el suelo, agua, etc. y altamente resistente a medios

externos; responsable de infecciones e intoxicaciones muy graves (tétanos, botulismo,

gangrena gaseosa, etc.); las especies mas patógenos actúan mediante la formación de toxina

con poder toxico sobre el huésped; algunos podrían formar parte de la flora normal del

hombre y animales.

Las especies mas importantes A. Clostridium que originan toxinas cuyo mecanismo de acción es neuro-

toxico =>Clostridium tetanii - el agente etiológico de tétanos y Clostridium botulinum -

agente etiológico del botulismo.

124/168

B. Clostridium que originan toxinas que actúan sobre tejidos provocando histo-

toxicidad =>Clostridium perfringes - agente etiológico de la gangrena gaseosa; para

su penetración en el organismo se requieren lesiones previas.

C. Clostridium que originan toxinas que actúan sobre el tracto digestivo (clostridios entero-

toxicos) => Clostridium difficile - responsable de trastornos gastrointestinales no graves.

D. Clostridium responsables de cuadros purulentos (clostridios piógenos) => Clostridium

perfringes; es frecuente la presencia ademas, de otras bacterias anaerobias.

Acción patógena e interés clínico A. Clostridium que ejercen acción neuro-toxica sobre las personas (C.tetanii y C.botulinum)

Clostridium tetanii - es un bacilo Gram+ pequeño, formadora de esporas (aspecto de

tambor o cerilla), habitan la tierra y el intestino del hombre y animales; produce 3 toxinas

responsables del cuadro típico del tétanos que son transportadas vía sanguínea o humoral

hasta SNC bloqueando la liberación de neurotransmisores, originan hiperactividad de las

neuronas motoras que da lugar a convulsiones y parálisis espástica o espasmo muscular a

nivel periférico; se ve alterado el sistema muscular variando el ciclo de contracción-

relajación de forma que este entra en fase de contracción y no se recupera (rigidez tetánica /

epistótonos).

Para que se produzca el tétanos es necesario una serie de condiciones tales como que el

microorganismo germine (condiciones adecuadas de anaerobiosis); tras una herida profunda

(cortante, punzante, mordeduras, arañazos, partos, abortos, quemaduras, ulceras por

decubito) o herida superficiales (rozaduras) se pueden infectar y formar costra que facilita

la infección anaerobia; en las condiciones favorables de anaerobiosis, las esporas

deClostridium tetanii en el ambiente pasan a la herida, germinan y tras un periodo

de incubación (5-7 días), se origina su acción patógena; es rara que se produzca de forma

local en la zona de entrada; la forma generalizada es mas habitual y mas grave; es

importante la detección precoz y medidas profilácticas (vacunación se renueva cada 10

años).

Clostridium botulinum - bacilos Gram+ anaerobios estrictos, grandes, móviles por

su flagelación y presentan esporas; es capaz de formar neuro-toxinas peligrosas y potentes

sobre las personas que originan parálisis o debilidad muscular; las esporas son distribuidas

ampliamente en el aire, suelo, ciertos alimentos (conservas, pescados, etc.); si las

condiciones en el ambiente son de anaerobiosis, germinaran; su accion patógena sobre el

organismo seraneuro-paralizante y con una dosis de 10 elevado a -8 (10 nanogramos) de su

toxina es suficiente para causar la muerte (es el veneno mas potentes hasta ahora), que solo

se producen en condiciones adecuadas de anaerobiosis, temperatura en torno a 30ºC, pH

neutro o ligeramente acido y permiten que germine la espora; sus toxinas son

de carácter proteico y termolábiles (se destruyen a temperatura 100ºC durante 5 minutos o

70ºC de 30-60 minutos).

125/168

El mecanismo de acción de las toxinas botulínicas => a traves de los alimentos

contaminadosllega esta neuro-toxina al tubo digestivo del hombre y producirá toxinfección

alimentariainicialmente; de aquí via sanguínea y linfática llega hasta sistema

nervioso periférico donde actúa en las terminaciones nerviosas, originando parálisis en el

musculo esquelético y otras manifestaciones neurológicas como visión borrosa, fotofobia,

sequedad de boca, lengua y faringe, disfagia, disartria (dificultad al hablar), debilidad de los

musculos (flacidez) incluyendo los respiratorios que puede llegar mortal por fallo

respiratorio y arritmias cardíacas (depende de la cantidad de toxina o del germen);

su periodo de incubación en torno 18-36 horas después de la ingestión del alimento

contaminado y los cuadros mas graves se originan en un periodo de incubación inferior a 24

horas.

B. Clostridium que ejercen acción histo-toxica en múltiples tejidos

Clostridium perfringes - ejercen un efecto toxico importante pero no actúan sobre SNC;

son Gram+, anaerobia estricta, la única especie capsuladas, ampliamente distribuida en el

suelo; de aquí a traves de heridas profundas, puede pasar al hombre produciendo gangrena

gaseosa; también puede encontrarse en la flora intestinal; capaz de formar toxinas

que actúan sobre los tejidos, entero-toxina, hemolisina, neuroaminidasa.

El mecanismo de acción => tras la vía de entrada (heridas) en condición anaerobiosis

adecuadas, germinan las esporas y proliferan; es frecuente que se contaminen con otro tipo

de bacterias aerobias que consiguen agotar el oxigeno aumentando las condiciones de

anaerobiosis, se disminuye el pH aumentando el acido láctico y facilitando la liberación de

las enzimas proteolíticas y sustancias toxicas; se producirán los efectos lesivos y graves

sobre los tejidos extendiéndose a los vecinos, se romperán las estructuras celulares a nivel

de sus membranas, se destruirán las celulas hemáticas, las celulas endoteliales, las

membranas de las celulas musculares originando procesos de dermo-necrosis con daño

tisular (gangrena).

Ademas de provocar la gangrena gaseosa a traves de heridas infectadas, C.perfringes

es también el agente etiológico de una toxo-infección alimentaria producida por

la ingestión de carne contaminada provocando cuadros diarreicos y dolor abdominal leve;

existen otros casos mas excepcionales y graves que da lugar a cuadros diarreicos muy

acuosos y sanguinolentos, vómitos y estado de shock producido por C.difficile.

Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico - Toma de muestra representativa, adecuada y estéril en medios específicos de transporte

anaerobiosis con sustancias reductoras (bolsas generadoras de CO2) que

crean atmósferas sin O2 o en una jeringa sin aire (tapando la aguja).

- Se hará un examen directo (tinción de Gram) donde se pueden apreciar las formas de

esporas (palillos de tambor); también se puede realizar tinción de esporas.

- Se cultivaran en medios de cultivos específicos como ASA (agar sangre

126/168

anaerobio); incubación a 37ºC en 48 horas en condición anaerobisis, utilizando unacampana

con un sobre generador de gas CO2, da lugar a la liberación de H y CO2; el O2 que existe

en el anterior de la campana, se une al H, forman H2O que se depositan en forma de gotitas

en las paredes, también hay que introducir un indicador de anaerobiosis (una tira reactiva).

- Pruebas bioquímicas => cuando existe crecimiento en el medio anaerobio, se monta

directamente el API en un recipiente/ una caja, también anaerobio.

Bacterias anaerobias no formadoras de esporas - crecen en ambientes de bajo potencial

oxido reductor o ambientes microaerófilos; son ampliamente distribuidos en la naturaleza y

muy pocas capaces de producir cuadros patógenos graves al hombre; gran parte de ellos

forman parte de la flora gastrointestinal, vaginal o bucal del hombre, no ejerciendo

efecto patógeno alguno.

Las especies mas importantes A. Bacilos Gram+ no esporulados:

- Lactobacillus => microaerófilos, crecen mejor en anaerobiosis; son flora habitual de

laboca, vagina e intestino del hombre; son de gran utilidad a nivel industrial (produce

acido láctico para los yogures); no intervienen en ningún proceso patógeno para el hombre.

- Propionibacterium => son anaerobios, pueden crecer en ambientes microaerófilos;

forman parte de la flora normal intestinal, tracto urinario y piel.

- Bifidobacterium => es flora intestinal del hombre y no son patógenos.

B. Bacilos Gram- no esporulados:

- Bacteroides => son flora intestinal, vaginal y bucal del hombre y se ha asociado en

ocasiones a procesos gastrointestinales, especialmente Bacteroides

fragilis que actúa comooportunista.

- Fusobacterium => solo la especie Fusobacterium nucleatum se asocia a

algunosprocesos patógenos en el aparato respiratorio y tracto genital femenino,

de carácter oportunista.

C. Cocos Gram+ no esporulados:

- Ciertos Streptococcus anaerobios que se encuentran frecuentemente en la

floragastrointestinal y bucal; no son patógenos.

- Peptococcus => no produce efecto patógeno sobre el hombre

D. Cocos Gram- no esporulados:

- Veillonella => forma parte de la flora intestinal y bucal y no son patógenos para el

hombre.

Acción patógena e interés clínico Salvo excepciones, no son relacionados con procesos patógenos y la patogenicidad que

pudiera desencadenar alguno de ellos depende sobre todo de las circunstancias

del huésped (oportunistas); pueden producir infecciones post-quirúrgicas, complicaciones

127/168

de escaras o ulceras por decubito, complicaciones de herida en general.

Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico

- Toma de muestra en condiciones adecuada (anaerobiosis)

- Examen directo (tinción de Gram)

- Se aislaran en medios anaerobiosis (ASA/ANA - agar sangre anaerobio)

- Pruebas bioquímicas se realiza con API en condición anaerobia

Tema 23 - Espiroquetas (Treponema, Borella y

Leptospira); patología e identificación

La familia Espiroquetaceas (con interés clínico para el hombre) - Treponema, Borrelia y

Leptospira; corresponden a especies bacterianas cuya morfología es filamentosa, helicoidal

o espiral con filamentos axiales relacionados con su movilidad; presenta una pared celular

fina y flexible de lipo-polisacárido y lipo-proteica donde se encuentran la mayoría de

Ags específicos de estas; son Gram- (difícilmente se tiñe), también se pueden visualizar por

el microscopio de contraste de fases; presentan un metabolismo oxidativo y/o

fermentativo(aerobias o anaerobias facultativas); difundidas en las aguas, el suelo y como

agentescomensales en las mucosas del hombre y animales.

La familia Espiroquetaceae se divide en 5 generos:

- Genero Espiroqueta => espiroquetas mas grandes y no existen especies patógenas para el

hombre.

- Genero Cristispira => son de tamaño algo menor que el Espiroqueta y no es patógeno para

el hombre.

- Genero Treponema => son espiroquetas muy helicoidales, muy finas, pequeñas y móviles;

son microaerofílicas y presentan un metabolismo fermentativo; existen

especies patógenas para el hombre - Treponema pallidum (el agente etiológico de la sífilis).

- Genero Borrelia => son espiroquetas mas grandes que Treponema; son microaerofílicas y

presentan pocas espiras que son amplias e irregulares; su metabolismo es fermentativo y

son difíciles de cultivar en medios artificiales; pueden provocar fiebres recurrentes al

hombre transmitido por artrópodos.

- Genero Leptospira => son espiroquetas largas, muy finas y con numerosas espiras,

profundas y regulares; es difícil su visualización aunque se suele utilizar microscopia de

contraste de fases; son aerobias con un metabolismo oxidativo; se cultivan con facilidad en

medios artificiales; ampliamente distribuidas en la naturaleza, especialmente en las aguas;

pueden parasitar al hombre provocando leptospirosis.

Genero Treponema - son espiroquetas pequeñas, finas con un numero de espiras entre 5-

128/168

20 distribuidas de forma regular, con gran movilidad; se tiñe difícilmente con Gram y se

tiñe mejor con Giemsa o tincion de plata y se visualiza con la microscopia de campo oscuro

y de contraste de fases; no crece en medios de cultivo in vitro y requiere un medio de

cultivo in vivo para crecer (testículo de conejo); crece bien en situaciones de bajo potencial

oxido-reductor (microaerofila), presentando en ocasiones una respiración anaerobia y un

metabolismo fermentativo; el especie patógena para el hombre es Treponema pallidum que

transmite la sífilis por contacto directo; existen dentro del genero Treponema especies

comensales de las mucosas, tracto urinario, vaginal, tubo digestivo, etc. que no

son patógenos para el hombre y se pueden cultivar.

Treponema pallidum es la especie mas importante por su difusión cosmopolitana; es el

agente causal de sífilis; no son capaces de vivir fuera del organismo humano, ya que

mueren por desecación; su transmisión es por contacto directo (vía sexual) y si no se detecta

a tiempopuede durar toda la vida; mecanismo de acción:

- Periodo primario de la sífilis => comienza tras un primer contacto con lesiones ricas en

treponemas presentes en las mucosas; periodo de incubación 10-90 días (termino medio

de 21 días) aparece en la zona genital un chancro primario con abundantes treponemas, se

van diseminando vía hemática y linfática a otras localizaciones convirtiendo-se en

unaenfermedad sistémica; es frecuente su multiplicación en ganglios próximos a la zona

genital originando pequeñas tumoraciones (adenopatias); transcurrido un tiempo corto de 2-

6 semanas estos signos desaparecen espontáneamente y entra en una fase silente.

- Periodo secundario o sífilis florida => surge después de un tiempo entre 2 meses y 2

años de la fase silente; de forma súbita se produce una espiroquetemia en general muy

florida por las manchas en la piel y en las mucosas, muy ricas en treponemas y altamente

infecciosas; también puede surgir excepcionalmente una forma eruptiva como lesiones en

otros órganos, fiebre en ocasiones, pústulas o pápulas muy ricas en treponemas; este

cuadro clínico de carácter sistémico remite a las pocas semanas (2-6 semanas), volviendo a

entrar en una nueva fase de latencia.

- Periodo terciario o sífilis terciaria => surge tras la fase de latencia entre 3-30 años, una

forma muy grave con mal pronostico; el numero de treponemas en sangre es muy escaso y

muy abundante en ganglios, bazo, huesos, sistema nervioso (neuro-sífilis) y aparato

cardiovascular; es frecuente la formación de granulomas, necrosis, gomas, parálisis general

progresiva, aneurisma aórtico, etc.

Resumen de la evolución de sífilis => Incubación 10-90 días (termino medio 21 días) -

Periodo primario (2-6 semanas) - fase silente (2 meses - 2 años) - Periodo

secundario/ sífilis florida (2-6 semanas) - fase latente (3-30 años) - Periodo terciario/ Neuro-

sífilis forma muy grave con mal pronostico.

Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico del genero Treponema pallidum

- Treponema pallidum se aísla muy difícilmente, no crece en medios in vitro, solo lo hace

en medios in vivo (testículos de conejo) y el diagnostico de la infección se establece durante

los periodos primario y secundario mediante muestras de exudados, condilomas, etc.

- Examen directo al microscopio de campo oscuro o microscopio de contraste de fases o

microscopio de fluorescencia de una tinción de Giemsa o tinción Nitrato de plata (sales de

plata; es una técnica difícil de efectuar, reservada a los laboratorios especializados, útil en la

detección de Pneumocytis carinii, Legionella, Treponema, hongos, Rickettsias).

- Pruebas serologícas => se realiza la prueba de la presencia de Acs anti Treponema

pallidum en el suero del paciente con Ags específicos de Treponema pallidum que

presentan una sensibilidad y fiabilidad del 100%; los resultados dependen del periodo

de sífilis en el que se encuentre; también se incluyen las inmunofluorescencia

129/168

indirecta, así como las de hemo-aglutinación pasiva partiendo de hematíes tratados con

Treponema pallidum que es muy sensible y económica.

Diagnostico serológico de las sífilis - existe 2 tipos de pruebas (no treponémicas y

treponémicas)

a) No treponémicas => son de gran sensibilidad y fácil de hacer; se usa para prueba de

screening y si resulta (+), hay que confirmar con pruebas treponémicas; también se utiliza

como un seguimiento de la enfermedad; se le llama también prueba de WASSERMANN;

consiste en enfrentar el suero del paciente con sustancia lipídica "cardiolipina" que no es

Ags treponémicos; si existen Acs anti Tp en el suero, reaccionaran con la cardiolipina (+);

pero al no ser la cardiolipina un Ags treponémicos, puede dar lugar falsos positivo con otras

enfermedades; 2 tipos de pruebas => VDRL (Venereal Disease Research Laboratory)

y RPR (reagina plasmática rápida) son pruebas

de aglutinación con partículas de carbón (darán grumitos grises).

b) Treponémicas => se utilizan como prueba confirmativas con

varias técnicas: (1) FTA(técnica fluorescencia de Acs anti Tp) enfrentando Ags de Tp con

posibles Acs anti Tp en el suero del paciente; (2) FTA abs donde previamente se absorben

posibles Acs naturales anti Tp saprofitos; (3) TPHA (Tp Haemagglutination Assay) que

tiene como base hemaglutinación y sencillo de realizar (no se necesita microscopio

fluorescencia); (4) también se puede utilizar pruebas de ELISA para detectar IgM y IgG;

todas son pruebas muy especificas; no se utilizan para el seguimiento, porque sera siempre

resulta (+).

Genero Borrelia - son espiroquetas de mayor tamaño con espiras mas amplias e irregulares

con extremos afilados y son móviles; las especies patógenas para el hombre y los

animales,originan fiebres recurrentes endémicas y epidémicas; es microaerofílica con

un metabolismo fermentativo; se tiñen con facilidad de Gram- y se puede cultivar in vitro,

pero requiere medios muy específicos; las especies mas importantes del genero Borrelia, se

transmiten por piojos y por garrapatas.

Acción patógena e interés clínico - las fiebres recurrentes son una enfermedad muy

cosmopolita, en ocasiones endémica a condiciones de salubridad muy baja; tras la picadura

del vector, ya sea garrapata o piojo, pasan las borrelias a la sangre del huésped, ayudadas

por el rascado que provoca el aplastamiento del piojo /garrapata, que dará lugar a micro-

traumas en la piel y facilitan el paso de dichas borrelias; después de

unos7 días de incubación se originan fiebres, dolores musculares, cefalea,

etc; clínica que dura unos 10 días y luego desaparecer, produciendo posteriormente

recurrencias; no es una enfermedad grave y es fácil de tratar, especialmente con

tetraciclinas.

130/168

Genero Leptospira - son espiroquetas muy finas con espiras regulares, muy numerosas y

apretadas, con sus extremos ligeramente incurvados y móviles; se tiñen débilmente con

Gram, también se pueden teñir con Giemsa; su metabolismo es

oxidativo (crecimientoaerobio); existe en la naturaleza leptospiras saprofitas y parásitas;

puede originar de forma casual leptospirosis en el hombre con cuadros febriles; el

reservorio son animales, consideradas como zoonosis.

Tema 24 - Rickettsias, Chlamydias y Micoplasmas

(patología e identificación)

Genero Rickettsia - son parásitos celulares estrictos (porque su dotación enzimática es muy

escasa) de los artrópodos (crecen muy bien en el citoplasma); son coco-bacilos Gram-;

producen en el hombre enfermedades transmitidas por piojos, garrapatas, pulgas y ácaros.

Especies mas importantes de la familia Rickettsiaceae - hay 3 géneros importantes

=>Rickettsia, Rochalimaea y Coxiella (Coxiella burnetti es coco-bacilo Gram+ que origina

la fiebre Q).

Acción patógena e interés clínico:

(1) Tifus exantemático epidémico - producido por R.prowazekii; mediante la picadura de

piojo; tras el periodo de incubación de 1-2 semanas, aparecen escalofríos, fiebres altas

(40ºC), cefaleas, dolores generalizados, nódulos inflamatorio de los capilares, arteriolas,

vénulas, la piel y musculos (dificulta la corriente sanguínea y en casos graves puede

provocar gangrena en las extremidades); es frecuente la formación de maculas rosadas y

posteriormente pápulas y petequiales.

(2) Tifus murino o endémico - producido por R.typhi mediante la picadura de la pulga,

garrapatas y ácaros; tras el periodo de incubación de 4-15 días, se produce fiebres altas,

cefaleas, artralgias y mialgias generalizadas con un cuadro clínico leve sin complicaciones

ni recidivas como el tifus exantemático.

(3) Fiebres manchadas de las montañas rocosas - producida por R.rickettsiitrasmitidas por

las garrapatas; tras el periodo de incubación de 3-6 días, aparecen fiebres altas, mialgias

generalizadas y una mancha negra en la zona de la picadura; en España la especie mas

extendidas es R.conorii, el agente de la fiebre botonosa o exantemática mediterránea,

transmitida al hombre por la garrapata (sobre todo del perro); tras el periodo

de incubación de 2-6 días provoca una mancha negra a modo de botón en el lugar de la

picadura, fiebre, artralgias, mialgias generalizada y manchas maculo-papulosas; no se

131/168

suelen complicar y responden bien al tratamiento.

(4) Fiebre Q - producida por Coxiella burnetii mediante inhalación de esta u

otras(presencia de artrópodos), la vía de entrada no se conocen hasta la fecha; tras el

periodo de incubación de 3 semanas, se produce un estado febril con mialgias generalizadas

ycuadro clínico leve.

Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico del genero Rickettsia

Se toma 2 muestras de sangre en estadios febriles (cuando hay mas Rickettsia):

- La 1ª se centrifuga para obtener un sedimento sanguíneo (concentración alta de

Rickettsia); se usa para realizar varias tinciones p.ej. May-Grunwald-Giemsa (las

rickettsias aparecen de color purpura), tinción Gram (resulta negativo para Rickettsia y

positiva para Coxiella burnetii), tinción inmunofluorescencia y estudios de

microscopia electrónica (para observar); el sedimento también se usa para sembrar en

medios de cultivo celular o embriones.

- De la 2ª se obtiene sueros para pruebas serologícas (buscando títulos de Acs), con tecnicas

inmunofluorescencia, seroaglutinación o ELISA.

Genero Chlamydia - se consideran mas próximos a virus que a bacterias;

son parásitos intracelulares estrictos (carecen de mecanismo biosintético auto-suficiente) del

hombre y animales; son cocos pequeños de Gram-, inmóviles; poseen ADN y ARN y

su multiplicación es por división binaria (a diferencia de virus); es capaz de vivir en medios

intracelulares durante mucho tiempo sin presentar una sintomatología clara lo que facilita

la cronificación de procesos infecciosos.

Especies mas importantes - dentro de la familia Chlamydiaceae:

- Chlamydia psittaci => parásito intracelular de animales y excepcionalmente del

hombre(tras la inhalación de heces de pájaros infectados),

provocando brotes neumónicos de distinta gravedad.

- Chlamydia trachomatis => parásito intracelular del hombre,

provocandoinfecciones sistémicas o locales de distinta gravedad y afectando especialmente

a los genitales y a los ojos.

Acción patógena e interés clínico - se multiplican en el citoplasma de

132/168

la célula que parásita, presentando un ciclo con 2 tipos celulares diferentes:

- En 1er periodo formara una célula densa o corpúsculo elemental con gran resistencia a la

sequedad, lo que permitirá la dispersión de Chlamydia; es la forma infectiva.

- En 2nd periodo formara una célula mas grande de menor densidad

o corpúsculo reticulado, que es responsable de la división binaria y por tanto de crecimiento

clamidias.

El proceso del ciclo => la forma infectiva (corpúsculo elemental) penetra en la célula que va

a parasitar ayudado por los Ags específicos, se produce infección celular, se forma

una vesícula citoplasmática que bloqueara los mecanismos de defensa de la propia célula; a

partir de aquí este corpúsculo elemental aumenta su tamaño, su pared se hace mas fina y

permeable permitiendo el paso de complejos enzimáticos, ATP y otras sustancias que van a

necesitar de la célula que parasitan; el citoplasma de la clamidia se hace mas denso y

esponjoso y aparece la segunda forma, donde comienza a multiplicarse por división binaria.

Cuadros clínicos de Chlamydia trachomatis:

- Tracoma => tras un contacto directo se produce una infección crónica en el epitelio

conjuntival y corneal, siendo frecuentes las recaídas y sobre infecciones con evolución lenta

hacia la ceguera; frecuente en edades infantiles.

- Conjuntivitis neonatal => aparece entre la primera y la segunda semana después del

nacimiento; surge una conjuntivitis purulenta al neonato, asociada a infecciones genitales

por clamidias en la madre; puede evolucionar positivamente o hacia

lesiones análogas al Tracoma.

- Linfogranuloma venéreo => es una infección que se trasmite por contacto venéreo.

Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico del genero Chlamydia

Debido al elevado riesgo de infección en el laboratorio al manipular clamidias se suelen

utilizar metodos indirectos (serológicos) a veces tambien se realiza examenes citologicos en

cultivos específicos.

- Se toman muestras de secreciones oculares y/o genitales

- Se realiza un examen directo que incluyen una tinción de Giemsa y de Gram.

- Se realizan técnicas citológicas

- Se realizaran exámenes indirectos mediante técnicas serologícas (la mas frecuente ELISA)

que son mas seguras y fiables; existe un kit para buscar clamidias.

Genero Micoplasma - es uno de los microorganismos mas pequeños existentes

en bacteriología y se caracteriza por no contener pared celular => sensible a

133/168

la presión omotica del medio (se lisan facilmente),

su morfología es pleomorfismo y resistente a ciertos antibióticos cuya mecanismo

de acción se establece en la pared bacteriana; se dividen por división binaria y vivir de

forma independiente y crece bien in vitro a partir de medios artificiales enriquecidos; se

encuentra extendidos en la naturaleza; son comensales de la mucosa del hombre; existe

especies patógenas como Micoplasma pneumoniae que afecta al aparato respiratorio.

Especies mas importantes - dentro de la

familiaMicoplasmataceae están los géneros Micoplasma y Ureaplasma; solo unas 10

especies pueden producir algún efecto patógeno en las membranas celulares de las mucosas

oro-faríngeas y uro-genitales; la mas importante para el hombre es Micoplasma

pneumoniae(produce neumonías); el Ureaplasma urealyticum es otra especie patógeno que

se asocia a ETS junto con el Micoplasma hominis.

Acción patógena e interés clínico - Su infectividad se relaciona con su adherencia (debido a una glicoproteína especifica) a

los epitelios de las mucosas; su pleomorfismo puede adoptar formas filamentosas y

alargadas que aumenta la superficie de contacto a las estructuras epiteliales a las que se une;

una vez adherida, los cilios de las celulas epiteliales que tapizan la mucosa se paralizan y

provoca alteraciones metabólicas en dichas celulas epiteliales.

- Cuadros clínicos => cuadro pulmonares y mas raramente cuadros genitales o uro-

genitales, siendo Micoplasma pneumonia es mas importante como el agente causal mas

frecuente de las neumonías atípicas.

- En casos excepcionales se han podido aislar Micoplasma hominis y Ureaplasma

urealyticum en procesos uretrales y genitales como salpingitis, vaginitis, prostatitis,

cervicitis, etc. (son casos muy raros)

Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico - Se toman muestras de la mucosa faríngea, secreciones uretrales, exudados, muestras de

esputo, de sangre, etc según la patología.

- Se realiza un frotis de la muestra que se puede observar en campo oscuro con nigrosina, al

microscopio de contraste de fases o con la tinción de Giemsa (se tiñe débilmente).

- Se siembra en medios específicos y con un alto grado de humedad para evitar

la desecación.

- Se realiza pruebas bioquímicas => fermentacion de glucosa, prueba de arginina, ureasa,

etc.; existe un kit de la detección micoplasmas.

- Metodos serológicos son mas rápidos, mas fiables y mas utilizados en la actualidad

(inmunofluorescencia y ELISA).

134/168

Genero Campylobacter - son bacilos Gram- cortos con forma de coma, espiral o alas de

gaviota (en cultivos jóvenes); son microaerofílicos, móviles por un único flagelo polar; no

fermentan los carbohidratos, oxidasa+ y catalasa+; habitan el tracto gastrointestinal de

muchos animales; en el hombre se asocian a infecciones gastrointestinales (via de entrada

oral/ digestiva), fundamentalmente, y cada vez en mayor grado a infecciones extra-

intestinales (meningitis, endocarditis, artritis séptica), especialmente en pacientes con

SIDA.

Especies clínicamente importantes para el hombre - C.jejuni, C.coli y C.

laridis sonagentes etiológicos de diarrea; C.fetus subsp. fetus produce septicemia en

pacientes inmuno-suprimidos.

Aislamiento a partir de "heces" - la siembra inmediata en medios selectivos a la toma de

muestra; si se tiene que posponer, se utilizaran medios de transporte especiales (Cary-Blair

o Campy-Thio) donde se mantiene viables; el cultivo de campylobacter tiene que cumplir 3

requisitos =>

(1) empleo de medios selectivos p.ej. "Campylosel" contiene sangre de cordero con ATB

y antifúngico o "Skirrow" contiene sangre de caballo con ATB

(2) uso de atmósfera reducida de O2/ microaerofílica se consigue mediante sistema

de evacuación-reemplazo hasta lograr 5% de O2, 10% de CO2 y 85% de N2 o campanas

anaerobios con sobres comerciales que generan la atmósfera deseada.

(3) temperatura de 42ºC en aislamiento inicial entre 24-48 horas (para inhibir la flora fecal

acompañante), después pasa a 37ºC el 3º día; las placas han de incubar hasta 72 horas antes

de descartarse como negativas; a esta temperatura se consigue el máximo aislamiento

deC.jejuni y C.coli.

Si pretende aislar otras especies de campylobacter distintas a C.coli y C.jejuni => ha de

emplear medios selectivos sin cefalosporinas, incubación a 37ºC, atmósfera microaerofílica,

incubación de 7 días.

Identificación - los campylobacter termofílicos dan lugar a colonias grises, incoloras,

mucosa y no hemolíticas; se les hace una tinción Gram (bacilos Gram- con forma de S en

cultivo joven y en cultivo viejo pueden dar formas cocoideas); se monta un fresco para

observar la movilidad; son oxidasa y catalasa positivos; para diferenciar entre las

especies se puede montar un API o se realizan varias pruebas => (1) crecimiento a distintas

temperaturas, (2) sensibilidad al acido nalidixico y a la cefalotina (3) hidrólisis del hipurato

(se introduce una tableta dentro de un tubo inoculado, dará + si cambia a color amarillo).

Campylobacter jejuni => crecimiento a 42ºC, hipurato+, sensibilidad a Nalidixico y

resistente a Cefalotina

Campylobacter coli => crecimiento a 42ºC, hipurato-, sensibilidad a Nalidixico y resistente

a Cefalotina

Campylobacter fetus => no crecen a 42ºC, hipurato-, resistente a Nalidixico y sensible a

Cefalotina

Campylobacter laridis => crecimiento a 42ºC, hipurato-, resistente a ambos Nalidixico y

135/168

Cefalotina

Patogenia y patologia - C.jejuni es la especie con mayor frecuencia se asocia a infeccion

en el hombre (gastroenteritis con eliminación de sangre en heces), se adquiere por via oral

(comida y bebidas contaminadas) o por contacto con animales infectados; sensible a

pH gástrico (debe ingerirse una concentración elevada de ellos para que se produzca

infeccion); se multiplica en el intestino delgado, invade el epitelio y produce inflamación;

en ocasiones puede pasar al torrente circulatorio y desarrollarse un cuadro de

fiebre entérica; la diarrea acompañada de dolor abdominal agudo, dolor de cabeza y

fiebre; la infección es autolimitada resolviendose en una semana sin necesidad de ATB; los

casos graves se trata con eritromicina.

Helicobacter Pylori - se aislaron por 1ª vez (1982) del estomago de pacientes con

lesiones gástricas y ulcera péptica; son bacilos curvados Gram- con forma de espiral y gran

actividad ureasa; se les denomino Campylobacter pyloridis, posteriormente se rectifico a

Campylobacter pylori y cuando demostraron que difería morfologicamente del genero

Campylobacter, se propuso la creación de un nuevo genero Helicobacter que se incluyo la

especie de Helicobacter pylori; se trata de una especie de reciente descubrimiento,

implicada en procesos de infección gástrica.

Metodos de detección de H.pylori

- Metodos directos => las muestras mas idóneas para el aislamiento de H.pylori son las

biopsias de las zonas pliegues de la mucosa gástrica del antro, cuerpo y fundos;

se remitirán directamente al laboratorio para proceder a su cultivo inmediato en

medios específicos para H.pylori; una porción de la biopsia se invertirá en la realización de

un frotis para la tinción Gram o Giemsa.

- Incubación => las placas deben incubarse en condiciones reducidas de O2 (5%), de 10%

CO2 y 85% N2. Se consigue mediante sistema de evacuación-reemplazo o usando jarras de

anaerobios con sobres comerciales que generan dicha atmósfera; la temperatura optima es

de 37ºC (no se desarrolla a 25ºC, 30ºC ni 42ºC); en aislamiento primario, es conveniente

incubar las placas hasta 7 días; Las colonias son de 1-2 mm de diámetro, translucidas y

poco hemolíticas.

- Identificación => son oxidasa+, catalasa+, ureasa+, hipurato- (algunas cepas son capaces

de virar la urea de Christensen en minutos); es sensible a la cefalotina y resistente al

nalidixico (algunas cepas pueden ser sensibles); no son fermentadora de carbohidrato; crece

a 37ºC.

Metodos indirectos:

- Prueba de la urea rápida (de Christensen) => un trozo de biopsia se inocula en un medio

con alta concentración de urea y un indicador de pH.

- Prueba de la urea respiratoria => el paciente ingiere urea marcada y tras un periodo de

136/168

tiempo se mide el nivel de CO2 espirado; se puede emplear urea marcada con C13, que se

detecta con un espectrofotómetro de masas y urea marcada con C14 detectada con un

contador de centelleo (un método diagnostico rápido y no invasivo, pero requiere un equipo

especial par al lectura).

- Prueba serología => para detectar Acs utilizando la técnica de ELISA.

Patología - existen pruebas claras de que H.pylori esta implicado en

diversas patologías gástricas, pero se cuestiona como la causa de dichas infección; parece

claro que es agente etiológico de gastritis aguda; se piensa que también pueda tener un

papel en la gastritis crónica activa; en las ulceras pépticas se aísla 100% de pacientes con

ulcera duodenal y 77% de ulcera gástrica; parece ser que su presencia no es suficiente para

desarrollar la ulcera; no esta claro el papel que desempeña en la dispepsia no ulcerosa, en el

reflujo gastro-esofágico y en el carcinoma gástrico; hasta 50% de la población adulta de

>60 años es portadora de este microorganismo; se desconoce su modo de transmisión; se ha

propuesto una posible adquisición del mismo por contacto con animales, región periodontal

y transmisión persona-persona (ninguno están demostrados)

Sensibilidad antibiótica - H.pylori es sensible in vitro a un gran numero de ATB, pero, el

tratamiento in vivo es difícil; nunca se emplea mono-terapia porque no es eficaz, suelen

administrarse varios fármacos juntos y aun así no se consigue erradicar al m.o. por lo que

son frecuentes las recaídas tras la supresión de la terapia.

Tema 25 -

VIROLOGÍA CLÍNICA (características generales de

los virus)

Introducción - virus es un parásito intracelular estricto que requiere infestar una célula para

sintetizar sus componentes y ensamblar nuevos viriones; son de muy pequeños tamaños

(filtrables) y se caracteriza por su mecanismo de replicación, organización y

composicion; virología clínica se remonta al siglo XX y la composicion de un virus fue

determinada por Schlesinger en 1933; en los últimos años se han descubierto otros agentes

infecciosos mas simples como los viroides y los priones;

- los viroides => moleculas circulares de ARN de bajo Pm sin cubierta proteica que causan

enfermedades a las plantas, infectar a los hombres y animales;

- los priones => son proteínas que parecen estar codificadas por genes celulares

y actúan como señales reguladoras en las celulas que invaden, resistentes a los

procesos físico-químicos que inactivan a los virus y no producen respuesta inmune o

inflamatoria en el huésped; provocan prurigo lumbar de las ovejas y cabras

(scrapie), encefalopatía espongiforme en las vacas y enfermedades neuro-

degenerativastransmisibles en el hombre (p.ej. Creutzfeldt-

Jacob /encefalopatía espongiforme progresiva y síndrome de Gerstman-Straussler-

137/168

Streinker y el kuru); la patogenia (de todas) se caracterizan por desordenes progresivos

como ataxia (dificultad motórica), demencia, deterioro cognitivo y motor; tras un periodo

de incubación largo (meses o años), aparecerá los sintomas clínicos; el tropismo de la

infectividad es SNC, seguido por el bazo y nódulos linfáticos; en el cerebro se

detecta acumulación anormal de proteína-prion en el genoma del huésped; los priones son

resistentes a las proteasas e induce una degeneración neuronal.

Concepto de virus - es un bloque de material genético (ADN o ARN) rodeado de una

cubierta proteína (cápside) que le sirve como vehículo para su transmisión; algunos presenta

membrana lipídica (envuelta) que se adquieren de la membrana citoplasmática de

la célula infectada durante el proceso de salida; los virus envueltos tienen un matriz proteica

que sirve como puente entre la nucleocápside y la envoltura; carecen de organelas

citoplasmáticas para crecer y multiplicarse, por lo que necesitan la maquinaria de

una célula huésped, pero si poseen algunos enzimas (nucleasas, transcriptasas,

etc.); viriónes la partícula viral completa (genoma + nucleocápside); se clasifican por el tipo

de huésped que parasitan (virus animales, vegetales, bacteriófagos)

Estructura y morfología de los virus - son de tamaño entre 20-25 nm hasta 200-300

nm; su observación requiere un microscopio electrónico.

- Estructura del genoma => ADN o ARN mono-catenario o bicatenario; la mayoría de

138/168

virus ARN tienen genomas mono-catenaria excepto los reovirus/rotavirus (bicatenario); los

virus ADN suelen ser bicatenario, excepto parvovirus (mono-catenario); los genomas (core

o núcleo) pueden ser moleculas lineales o circulares únicas o segmentadas en varios

fragmentos.

- Estructura de la cápside => su función es de proteger el genoma del medio extracelular y

facilitar la entrada al interior de la célula; están compuestas de subunidades proteicas

repetidas (capsómeros) que a su vez están compuestas de moleculas proteicas

(protómeros); según la disposición que adopten los capsómeros /la cápside, se clasifican en

virus de simetría helicoidal (normalmente son virus ARN), icosaedrica (20 caras

triangulares y 12 vértices) y compleja.

- Estructura de la envoltura => los lípidos de la envoltura es lipoprotéica y procede de la

membrana célula infectada, pero las proteínas suelen ser virales desplazados a

las proteínas celulares originales; en algunos casos, las proteínas incluyen una matriz

(proteína M) que contacta/ engancha con la nucleocápside; los virus envueltos tienen

estructuras glucoprotéicas (espículas) importantes para los procesos

de adsorción y penetración al interior de la célula.

Ciclo vital de los virus - las estrategias de replicación varían dependiendo de la estructura

del virus y de su material genómico, pero en general conlleva pasos de => adsorción/

adherirse - penetración - decapsidación - replicación - ensamblaje - liberación.

- Adsorción => la unión de la partícula viral a la superficie de la célula; no

requiere energía y no depende de la temperatura; intervienen moleculas proteicas de la

superficie del virión (proteínas de unión) y proteínas de la superficie de la membrana de

139/168

la célula diana (proteínas receptoras); en los virus envueltos, la proteína de adherencia viral

son las espículas de la capa externa de la envoltura.

- Penetración => tras ser adherido, se penetra el virión completo o solo el genoma y las

polimerasas entran en el citoplasma celular, esto se lleva a cabo por 3

mecanismos: penetración directa, endocitosis o fusión; penetración directa => la membrana

solo permite la entrada del genoma viral (ocurre en virus sin envuelta p.ej.

fagos); endocitosis=> los viriones adsorbidos, quedan rodeados por la

membrana citoplasmática de

la célula huésped formándose una vesícula endosómica (mecanismo mas utilizados de

losvirus sin envuelta); fusión => utilizado por los virus envueltos; existen 2 maneras

de fusión: en los paramyxovirus, su envuelta se fusiona con la

membrana citoplasmática directamente y la nucleocápside se libera al interior del

citoplasma; en el resto de virus envueltos, la envoltura viral se fusiona con la membrana

celular formándose una vesícula endosómica que posteriormente libera la partícula viral

hacia el citoplasma.

- Decapsidación => se degrada la cápside viral para que el genoma viral pueda liberarse e

iniciar la transcripción y la traducción; en la mayoría la penetración y la decapsidación se

produce a la vez.

- Replicación => es la fase donde se produce la síntesis de todas las macro-moleculas

virales; la célula huésped debe proporcionar la energía y los medios suficientes que a veces

puede afectar su propio metabolismo celular, pero en otros casos apenas se alteran; es

esencial que los ARNm transcriban la información viral y la replicación de

la información genética y que posteriormente mediante los componentes celulares se

traducen para fabricar proteínas que se necesitan.

a. Replicación de virus ADN bicatenario => tras la adsorción y la penetración, el ADN

viral es liberado y penetra en el núcleo + ARN polimerasas celulares => ARNm transcrito y

traducido para la síntesis ADN viral; para el proceso de traducción => ARNm emigra al

citoplasma celular y es traducido para formar las proteínas de la cápside => que

posteriormente son transportadas al núcleo para ensamblar el virión completo

que serán liberados por lisis celular; la excepción dará al virus ADN poxvirus (grande y

de simetría compleja) que realiza el proceso de transcripción y traducción en el citoplasma

celular utilizando su propia ARN polimerasa dependiente del ADN viral, ya que no pueden

utilizar ARN de la célula huésped que se localiza en el núcleo.

b. Replicación de virus ADN mono-catenario (fagos, parvovirus) => necesitan un

intermediario replicativo para formar ADN bicatenario que puede transcriben el ARNm

(ARN polimerasa celular necesita como plantilla una ADN bicatenario); como resumen:

ADN mono-catenario + ADN polimerasas de la célula huésped => produce ADN

140/168

bicatenario + ARN polimerasas celulares => forma ARNm

c. Replicación de virus ARN mono-catenario de polaridad (+) => ARN viralpenetrado en

el citoplasma de la célula huésped es reconocida de inmediato como ARNm por los

ribosomas, los cuales la captan e inician su traducción a proteínas virales y también un

enzima RNA polimerasa (transcriptasa); RNA polimerasa producida + ARN viral (se utiliza

como molde) => replicación del ARN viral (todo ocurre en el citoplasma independientes del

ADN del huésped).

d. Replicación de virus ARN mono-catenario de polaridad (-) => su ARN de polaridad (-)

complementa el ARNm que es de polaridad (+); mediante su propio ARN polimerasas

sintetizara el ARNm que después le servirá de molde para la síntesis de nuevo ARN de

polaridad (-) y también para la traducción de sus proteínas utilizando la maquinaria celular.

e. Un caso especial de Retrovirus => virus ARN mono-catenario de polaridad (+)

queposeen un enzima transcriptasa de reversión (transcriptasa inversa / retro-transcriptasa);

su genoma ARN + retro-transciptasa => produce ADN de polaridad (-) + (la misma)

retrotranscriptasa => origina ADN bicatenario que se integran al ADN celular y permanece

alli durante tiempo prolongado; En un momento dado el ADN integrado se reactiva y es

transcrito a ARNm vírico por la polimerasa del huésped y entonces, se completa el ciclo

replicativo.

- Ensamblaje y liberación => se puede producir tanto en el núcleo como en el citoplasma,

tras la replicación del genoma viral y la transcripción de las proteínas virales, los viriones se

ensambla y se libera de la célula huésped; consiste en la unión ordenada del acido nucleico

y de las proteínas para formar la nucleocápside, dando lugar a

un virión viable; la liberación de los virus sin envuelta (desnudos) se produce por lisis

celular; en caso de virus envueltos, salen al exterior por gemación de una zona de la

membrana nuclear o citoplasmática (depende si son virus ADN o ARN); la zona de la

membrana por donde se producirá la gemación, adquiere primero las espículas y

las proteína de la matriz (codificadas por el virus), que atrae a

la nucleocápside, fusionándose a la membrana, formándose la envuelta

y liberándose el virión al exterior; en caso de poxvirus(mas grandes y complejos),

estos pueden sintetizar sus propias envueltas; en caso deretrovirus, el virus no se libera de

la célula sino que se integra en su genoma y permanecer así largo tiempo o de por vida; el

proceso de ensamblaje y liberación es a veces ineficaz, formándose partículas no infectivas.

141/168

Taxonomía vírica - los virus se dividen en familias, genero, especie o tipo y según su

forma del genoma, tamaño, forma, estructura, sintomatología clínica que producen,

tropismo celular, etc; según el tipo de genoma que contienen y su estructura => se clasifica

en virus ARN y virus ADN.

Virus ARN 1. De simetría cubica o icosaedrica sin envuelta - mono-catenario de polaridad (+)

que utiliza su propio ARN como mensajero (pueden ser inmediatamente traducidos por la

célula huésped ya que no se necesita transcribir ARNm) con

la excepción de Reoviridae(bicatenarios) que utilizan su propia ARN polimerasa para

transcribir ARNm; todos se ensamblan en el citoplasma de la célula huésped y

son resistentes al éter.

- Familia Reo-viridae => tamaño intermedio (60-80 nm de diámetro),

los únicos bicatenarios; el mas importante para el hombre es el Rotavirus (provoca

problemas diarreicos), tiene forma redonda.

142/168

- Familia Calici-viridae => son pequeños (35-39 nm), tienen poca importancia en

microbiología clínica; el mas importante /patógeno para el hombre es el virus de

Norwalk(productor de gastroenteritis) y el virus de Hepatitis E (su inclusión no es

definitiva)

- Familia Picorna-viridae => son pequeños (20-30 nm); los géneros mas importantes son

losEnterovirus (>70 enterovirus que incluyen el Poliovirus, Echovirus, Cosxackievirus y el

virus de la hepatitis A) y los Rhinovirus (>100 rhinovirus).

2. De simetría cubica o icosaedrica con envuelta - mono-catenario de polaridad (+), todos

se ensamblan en el citoplasma de la célula huésped y son sensibles al éter.

- Familia Retro-viridae => son grandes +/- 100nm, de elevado Pm, contienen trazas de

ADN y poseen transcriptasa inversa (retro-transcriptasa) en su dotación; adquieren su

envoltura en la membrana citoplasmática de la célula huésped; se engloban todos los virus

ARN tumorales; se divide 3 subfamilias: Oncoviridae (causan tumores y

canceres), Spumaviride yLentiviridae (dentro de esta estaría VIH).

- Familia Toga-viridae => son de 40-70 nm y adquieren su envoltura en la

membrana citoplasmática; se incluyen la mayoría de los arbovirus (transmitidos

por artrópodos - los arbovirus pertenecen a numerosas familias como Togaviridae,

Flaviviridae, Arenaviridae, Reoviridae); se incluyen también los no

arbovirus: Alphaviruscon virus Sindbis su principal tipo, Pestivirus con el virus de la

diarrea mucosa como su principal tipo y Rubivirus con rubeolavirus su principal tipo.

- Familia Flavi-viridae => son de 40-50 nm y adquieren su envoltura en las membranas

143/168

intra-citoplasmáticas (antes se incluyen dentro de la familia Togaviridae y los han separado

por su menor tamaño y por el lugar de su ensamblaje que ocurre en el retículo endo-

plasmático); incluyen 2 géneros de importancia clínica: (1) Flavivirus (antes llamados

arbovirus del grupo B) que destaca el virus de la fiebre amarilla y del dengue; (2) virus de

la Hepatitis C; actualmente se incluye de manera no definitiva al virus de la hepatitis G.

3. De simetría helicoidal - todos son envueltos, mono-catenario de polaridad (-) que utiliza

su propia transcriptasa (ARN polimerasa) para transcribir ARNmensajero; se ensamblan en

el citoplasma y son sensibles al éter.

- Familia Rhabdo-viridae => de forma bala o bastón; el diámetro del cilindro +/- 70nm con

longitud de 175nm; adquieren su envuelta en la membrana citoplasmática; el genero mas

importante es virus de la rabia.

- Familia Paramyxo-viridae => de tamaño 150-300nm,

son pleomórficos predominandoformas esféricas rugosas y filamentosas; adquieren su

envuelta en la membrana citoplasmático; se incluyen 3 géneros: Paramyxovirus (virus de

la parotiditis/paperas, parainfluenza tipos 1,2,3,4A,4B...), los Morbilivirus (virus

del sarampión, entre otros) y losPneumovirus (virus sincitial respiratorio - causan

bronquiolitis en niños pequeños).

- Familia Orthomyxo-viridae => morfológicamente semejante a la familia

Paramyxoviridaepero mas pequeños 80-120nm, parecidos también a la familia

Rhabdoviridae (los 3 proceden de un ancestro común); adquieren su envoltura en la

membrana citoplasmática; se incluyen2 géneros: los virus de la influenza o de la gripe tipos

A, B y C.

- Familia Arena-viridae => de tamaño 50-300nm, adquieren su envoltura de la

144/168

membrana citoplasmática; algunos producen infecciones virales "lentas"; el mas importante

es virus de la fiebre de Lassa (en Africa).

- Familia Bunya-viridae => de tamaño 80-100nm, de forma esférica, adquieren su envoltura

en el aparato de Golgi; la mayoría de los géneros son arbovirus.

- Familia Corona-viridae => de tamaño 80-130nm, morfológicamente se parecen a

Orthomyxovirus, pero sus proyecciones en la superficie a modo de pétalos o "corona solar";

adquieren su envoltura en las membranas intra-citoplasmáticas; la mayoría de

los géneros son virus respiratorios de vías altas.

Virus ADN

a. De simetría cubica o icosaedrica sin envuelta - su genoma es ADN bicatenario

con excepción de Parvo-viridae (mono-catenario); todos se ensamblan en el núcleo y

sonresistentes al éter

- Familia Adeno-viridae => de tamaño mediano 70-90nm; se conocen 34 tipos que afectan

al hombre y mucho de ellos afectan el tracto respiratorio.

145/168

- Familia Parvo-viridae => de tamaño muy pequeño 18-26nm con genoma ADN mono-

catenario; la mayoría no tienen importancia clínica, excepto parvovirus B19, pertenece al

genero Parvovirus que causa eritema infeccioso.

- Familia Papova-viridae => son de tamaño pequeños 45-55nm con ADN de tira circular; el

genero mas importante es el Papilomavirus o virus de las verrugas con 66 tipos

depapilomavirus humanos (PVH); los Papovavirus en general producen enfermedades

latentes y crónicas y algunos son oncogénicos.

b. De simetría cubica o icosaedrica con envuelta - son bicatenarios y todos se ensamblan

en el núcleo con excepción de Irido-viridae que se ensamblan en el citoplasma.

- Familia Herpes-viridae => de tamaño medio +/-100nm, adquieren su envoltura en la

membrana nuclear y son sensibles al eter; de los 80 virus que existen, solo 8

tienen interés clínico para el hombre y se divide en 3 subfamilias:

(1) Alphaherpesviridaecon géneros importantes el virus Herpes simples tipo 1 y 2 y el

virus Varicella-zoster; (2)Betaherpesviridae con géneros Citomegalovirus al

citomegalovirus humano (Herpesvirus humano tipo 5) y al Herpesvirus humano tipo6, y al

genero Roseolovirus con elherpesvirus humano tipo 7; (3) Gammaherpesvirus que

incluyen virus de Epstein-Barr(herpesvirus humano tipo 4) que provoca enfermedad de

Beso, pertenece al generoLimphocriptovirus.

- Familia Hepadna-viridae => de tamaño 40-50nm, adquieren su envoltura en el citoplasma,

son resistentes al éter y poseen un genoma ADN parcialmente bicatenario; el mas

importante es el virus de la hepatitis B.

146/168

- Familia Irido-viridae => de tamaño grande 130-300nm, sensibles al éter, adquieren su

envoltura en la membrana citoplasmática y también se ensamblan en el citoplasma (a

diferencia de otros); no tienen importancia clínica para el hombre, pero si en

veterinariacomo el virus de la fiebre porcina africana.

c. De simetría compleja - Familia Pox-viridae => son virus animales mas grandes 230x400nm de forma ladrillo o

ovoide; se caracteriza como la única familia de virus ADN que se replica y ensambla en el

citoplasma, pues contienen una RNA polimerasa ADN dependiente (no necesita la maquina

nuclear), de hecho su replicación es posible en celulas a-nucleadas (sin núcleo);

sonresistentes al éter y poseen una doble envuelta (una la adquieren en el aparato Golgi y la

otra en la membrana citoplasmática; los mas importante son virus de la viruela, virus de la

vacuna o vaccinia y virus del molluscum contagiosum.

Principales familias de virus de interés clínico

1. Virus ARN (mono-catenario) 1.1. Familia Reo-viridae (tamaño mediano 60-80nm - icosaedrico - sin envuelta - se

ensamblan en el citoplasma) - contiene 6 géneros, únicamente cabe destacar Rotavirus)

147/168

Rotavirus (forma de rueda - el único bicatenario) => descubiertos en 1973 en niños con

gastroenteritis; el único con importancia clínica (agente causal

degastroenteritis esporádica y epidémica en lactantes y niños; la infección suele

ser asintomática en neonatos; afecta principalmente a niños entre 6-24 meses; la

prevalencia máxima en invierno y raramente en verano; periodo de incubación 1-3 días,

precediendo los vómitos a la diarrea que suele mantenerse de 4-5 días; el virus se detecta en

heces (dura bastante horas fuera del huésped)

1.2. Familia Calici-viridae (pequeños 35-40 nm - icosaedrica - sin envuelta - de

polaridad+) - se ensamblan en el citoplasma) => tiene poca importancia en clínica, posibles

agentes causales de gastroenteritis en cualquier día del año y a cualquier edad; es el agente

Norwalk (virus que causan gastroenteritis en EEUU) que ahora esta dentro de Parvovirus -

Parvoviridae; se incluye de forma no definitiva el virus de Hepatitis E.

1.3. Familia Picorna-viridae (virus muy pequeños 20-30nm - icosaedrica - sin envuelta -

de polaridad+) - es una familia importante y una de las que mayor numero de virus presenta,

destacando 2 géneros Enterovirus y Rhinovirus.

Enterovirus - se asocian con distintos síndromes clínicos como parálisis,

meningitis aséptica, encefalitis, miocarditis, pericarditis, pleurodinia, herpangina,

infecciones agudas del tracto respiratorio y fiebre aftosa; son habitantes transitorios del

tracto digestivo humano; existen >70 sero-tipos, siendo el tipo 72 es el virus de la Hepatitis

A; todos se diseminan por vía fecal-oral y la mayoría son asintomáticas; los mas

importantes sonPoliovirus, Echovirus y Coxsackievirus;

- Los virus de poliomielitis /Poliovirus son tres (tipos 1,2 y 3), mas temidos normalmente

por la parálisis flácida (de cintura para-bajo) y deformidades aunque

son complicación infrecuente; la vacuna es de Sabin (virus atenuados), también Salk (virus

inactivados); la vacuna de poliomielitis se administra a los niños de 2-4-6-18 meses.

- Los virus Echo y Coxsackie tienen distintas manifestaciones (muy ubicuo/ de todo tipo).

Para el diagnostico debe recurrirse al cultivo; el aislamiento de un enterovirus de heces o de

faringe no indica necesariamente una relacion causal con el cuadro clínico, y deben

descartarse otras causas; por el contrario si se trata de LCR.

Rhinovirus - agentes etiológicos mas frecuentes del resfriado común (rinitis agudas);

existen >100 tipos

1.4. Familia Toga-viridae y Familia Flavi-viridae (toga=envuelta - icosaedrica - de

polaridad+ - se ensamblan en el citoplasma); ambos son de forma icosaedrico, virus de

RNA mono-catenario con envuelta; se incluyen la mayoría de los arbovirus;

losv.Togaviridae (pequeño 40-70 nm, adquiere su envuelto en la

148/168

membrana citoplasmática de la célula mientras los v.Flaviviridae (40-50 nm, lo adquieren

de retículo endo-plasmático; dentro de Togaviridae están los arbovirus y los géneros no

arbovirus como Alphavirus(sindbis), Pestivirus y Rubivirus (rubeola) dentro de Flaviviridae

esta el virus Hepatitis C y otros que producen enfermedades como fiebre amarilla, dengue,

de genero flavivirus que pertenecen a los arbovirus tipo B (transmitidos por artrópodos).

Virus de la Rubeola del genero Rubivirus (no es un arbovirus) - descrito hace >200 años;

consta la importancia como agente causal de malformaciones congénitas desde la epidemia

de 1940 en Australia (un oftalmólogo australiano constato un elevado numero

decataratas congénitas y ceguera asociados a esta enfermedad); la infección suele

ser benigna y auto-limitada; sintomas => procesos respiratorios superiores

leves, erupción eritematosa y linfadenopatía sub-occipital y retro-auriculares; en adultos se

puede complicar con artritis transitoria o artralgias; rara vez produce encefalitis o

purpura trombocitopénica; muy importante la infección en gestantes por

posibles aparición de sordera neuro-sensitiva, alteraciones cardíacas, cataratas, retraso del

crecimiento y sintomas encefalíticos; la incubación dura 14-

21 días; diagnosticopor método serológico (técnica de ELISA) para detectar IgG y sobre

todo IgM en las embarazadas y un resultado positivo indica inmunización frente al virus;

actualmente es poco frecuente debido a la vacuna obligatoria que se incluye en

latriple vírica (paperas, sarampión y rubeola) que se pone a los niños de15 meses (suele dar

inmunidad permanente) y una dosis de recuerdo a los 6 años (solo las niñas); a los 11 años

solo se dan vacuna de varicela.

Clínica de Rubeola => empieza con eritema en la cara y se extiende hacia abajo (es un

eritema maculo papuloso); es menos llamativo que de la sarampión; dura +/- 3 días y puede

haber enantema palatino.

1.5. Familia Retro-viridae (de tamaño grande +/- 100nm - icosaedrica - con envuelta - de

polaridad+ - se ensamblan en el citoplasma) => poseen enzima transcriptasa inversa / retro-

transcriptasa; a esta familia pertenece el virus de la inmuno-deficiencia humana VIHque se

estudia aparte.

1.6. Familia Orthomyxo-viridae (de tamaño 80-120nm - helicoidal - envuelta - de

polaridad (-) y se ensamblan en el citoplasma) - en1918 tras la Guerra Mundial, mato mas

personas que la propia guerra; esta compuesta por los distintos tipos de virus influenza/

Gripe (tipo A, B y C).

Virus Influenza /la gripe española (empezó en España) - causan

gripe, infección respiratoria aguda epidémica normalmente durante mes de noviembre-abril;

la vía de transmisión es aérea, periodo de incubación 1-4 días, seguido de clínicas tipo

respiratorias superior, mas grave en los ancianos; se realizan campañas de vacunación todos

149/168

los años (sobre todo a los ancianos y pacientes bronco-pulmonares), ya que presentan gran

variabilidad antigénica segun el serotipo que causa la epidemia (tiene gran

poder mutagénico); existe 3 tipos => A, B y C (A y B causan epidemias de importancia);

los influenza A se subdividen según la diferente composicion antigénica (en la envoltura) de

la hemaglutinina y la neuraminidasa; el diagnostico es clínico; recientemente se introduce

metodos de diagnostico de muestras clínicas de antígenos virales; el de mayor

importancia clínica es virus respiratorio sincitial (VRS); para el diagnostico rápido se usa la

inmuno-fluerescencia directa en aspirados naso-faringeos, esputos o biopsia

de pulmón;existe un kit con Ags virales para detectarlos.

1.7. Familia Paramyxo-viridae (de tamaño grande 150-300nm - helicoidal - envuelta - de

polaridad (-) y se ensamblan en el citoplasma) => morfológicamente parecida al de anterior/

Orthomyxoviridae; todos ellos son causas importantes de enfermedad respiratoria en los

niños; se incluyen 3 géneros Paramyxovirus (virus de la parotiditis/paperas y

parainfluenza), Morbilivirus (virus del sarampión), Pneumovirus (virus sincitial

respiratorio)

Virus Parainfluenzae (VPI) del genero Paramyxovirus - los 5 tipos de VPI producen

infecciones del tracto respiratorio, siendo el 1 y el 2 los principales causantes de laringo-

traqueobronquitis, el 3 de bronquiolitis y neumónia en niños (segundo agente después del

VRS), el 4 y el 5 causan infecciones mas suaves; el diagnostico es clínico.

Virus respiratorio sincitial (VRS) del genero Pneumovirus - es la causa mas importante

de neumónia y bronquiolitis en niños y recién nacidos; produce un amplio espectro de

infecciones, siendo la mas frecuente es el resfriado común con abundante rinorrea; VRS

esmuy contagioso y se manifiesta en forma de brotes invernales; la inmunidad no es

completapor lo que se dan las re-infecciones (mas suaves); Es importante que

la excreción de virus se mantenga durante 2 o 3 semanas (mas tiempo para los

inmunodeprimidos), por lo que al ingresar un niño en el hospital durante 1 o 2 semanas,

puede ser contagioso todavía (es el agente mas frecuente de infección nosocomial

en pediatría); las infecciones graves se trata con la ribavirina (inhibe la síntesis del ARN

viral); el diagnostico rápido es la inmunofluorescencia en secreciones respiratorias.

Virus del Sarampión - causa una enfermedad aguda, febril, exantemática, de gravedad

variable que afecta a niños de 5-9 años, se contagia por vía respiratoria y

conjuntival;sintomas clínico => los primeros días como un catarro naso-oculo-faringo-

laringeo, luego aparece fiebre, cara rubicunda, congestión de mucosa y a los 3-

4 días aparece "manchas Koplik" (manchas blanquecinas diminutas delante del 1º y 2º

molar) dura un par de días; empieza aparecer exantema, primero retro-auricularmente,

despues se extiende a todo el cuerpo, las palmas y las plantas de los pies mas tenue en zonas

distales, sube a la fiebre y el exantema tenue se hace muy eritematoso; tras 2-3 días mejora

bruscamente y desapareciendo los signos en el orden del aparecimiento (dará inmunidad

permanente); el diagnostico es por metodos serológicos.

150/168

Virus de la parotiditis - es una enfermedad endémica con incidencia todo el año; es rara en

niños < 1 año, gracias a la inmunidad de la madre; afecta a niños de 5-14 años, se transmite

por vía aérea y por objetos introducidos a la boca (dará inmunidad permanente); clínica =>

tras 24horas de clínica inespecifica, aparecerán dolor y tumefacción de retro-parotidia

y oído, aumento de fiebre, puede haber afectación de nervio facial leve y

bilateral; complicación => meningitis, orquitis, pancreatitis o artritis; diagnostico es

por vía serológico; el diagnostico es por metodos serológicos.

1.8. Familia Rhabdo-viridae (de tamaño grande en forma de bastón, diámetro 70nm y

longitud 175nm - helicoidal - con envuelta - de polaridad (-) y se ensamblan en el

citoplasma) => característica típica de su morfología es forma de "bala"; el mas importante

es el causante de la rabia o hidrofobia (se atraganta con el agua).

Virus de la rabia - causa enfermedad infecciosa aguda del SNC, de gran

importancia histórica por los trabajos de Pasteur; existe la obligación de vacunar todos los

años a perros y gatos, ya que es una zoonosis en la que el hombre es un eslabón irrelevante;

existen 2 formas epidemiológicas => urbana (lo adquieren perros y gatos no inmunizados)

y salvática (los zorros); normalmente el virus esta presente en la saliva de animales

rabiosos, transmitiéndose por mordeduras (son fuentes de infección humana); el

diagnostico solía realizarse postmortem, mediante la observación de los cuerpos de Negri

(cerebro); también se pueden cultivar en laboratorio; clínica de animales => cambian

de carácter, se vuelven caprichosos, pierden apetito, ingerir objetos no engullibles autllan

con ronca, irritabilidad creciente y muerden a personas y animales; mueren en 2

semanas; clínica de humanos => la incubación 1-3 meses depende del lugar de la

mordedura; el virus se propaga por los nervios a una velocidad 1mm/hora; comienza con

la alteración del sueño, dolor de la mordedura, también parestesias/ hormigueos de la zona,

trastornos respiratorios (en la voz), posteriormente aparece espasmos faríngeos tras

la ingestión de líquidos o solo de verlo (hidrofobia), salivación espumosa y espasmos en las

extremidades (basta con pequeños estímulos de luz o ruidos, para provocar lo); las personas

suelen morir por parálisis en pocas horas tras la afectación de bulbo-raquídeo; el cuadro

normal es de 3-6 días, después mueren.

151/168

1.9. Familia Corona-viridae (de tamaño 80-130nm - helicoidal - envuelta - de polaridad (-)

y se ensamblan en el citoplasma) => adquieren su envoltura (con proyecciones a modo

de pétalos/ corona solar) en las membranas intra-citoplasmáticas; escasa

importanciaen patología, únicamente causan el resfriado común y pueden estar involucrados

en cuadros de gastroenteritis.

2. VIRUS ADN (bicatenario) 2.1. Familia Parvo-ridae (de tamaño muy pequeño 18-26nm - icosaedrico - sin envuelta -

se ensamblan en el núcleo - resistentes al eter) => son de tamaño muy pequeño y

sonlos únicos que presentan ADN de una sola hebra (mono-catenario); algunos tienen

importancia en veterinaria y solo destaca uno como patógeno humano (Parvovirus B19).

Parvovirus B19 (estaban incluidos en virus Norwalk) - fue vinculado al eritema

infecciosoen 1983; es benigna y afecta niños en edad escolar; presentan

una erupción eritematosa en las mejillas (cara enbofetada) y un exantema en extremidades y

tronco (respeta a las palmas, las plantas y los labios); los adultos son propensos a artropatía

asociada, que se resuelve en 2-4 semanas; diagnostico por método serológico y metodos de

ELISA.

2.2. Familia Papova-viridae (de tamaño pequeño 45-55nm - ADN de tira circular -

icosaedrico - sin envuelta - se ensamblan en el núcleo - resistente al éter) => son

unos viruses oncogénicos (efecto cancerígeno), producen enfermedades latentes

y crónicas, causantes verrugas genitales o condilomas (se asocian a carcinoma de cérvix)

y papilomas(Papilomavirus/ virus Papiloma humano); el diagnostico es de

tipo clínico y serológico; prevención => se vacunan a las niñas de < 14 años.

2.3. Familia Adeno-viridae (de tamaño mediano 70-90nm - icosaedrico - sin envuelta - se

ensamblan en el núcleo - resistente al éter) => producen principalmente patología al tracto

respiratorio, ocular y gastroenteritis; las infecciones respiratorias solo son significativas en

niños <6 años; el diagnostico se realiza mediante clínicas y técnicas serologícas.

2.4. Familia Hepadna-viridae (de tamaño pequeño 40-50nm - ADN parcialmente

bicatenario - icosaedrico - envueltos - se ensamblan en el núcleo - resistentes al éter) => su

envuelta se adquiere en la membrana citoplasmática y se ensamblan en el núcleo; en esta

familia se encuentra virus hepatitis B que se estudiara a parte.

152/168

2.5. Familia Herpes-viridae (de tamaño medio +/-100nm - icosaedrico - envueltos - se

ensamblan en el núcleo - sensibles al éter) => adquiere su envuelta de la membrana nuclear

y se ensamblan en el núcleo; destaca 3 subfamilias => Alphaherpesviridae (VHS 1y2, virus

Varicella-Zooster), Betaherpesviridae (CMV y Roseolovirus), Gammaherpesvirus

(VEB/Limphocriptovirus); todos los virus producen infecciones latentes, capaces de

reactivarse.

Virus Herpes Simple (VHS) - producen infecciones latentes que se reactivan con o sin

lesiones que sirven de fuente de infección para individuos susceptibles (los virus de Herpes

no se cura, solo se acantona y se puede reactivar); existen 2 tipos => VHS-1 (tropismo por

lesiones por encima de la cintura y suele ser leve) y VHS-2 (se encuentra principalmente en

los genitales, transmitiéndose por vía venérea); cada individuo tiene un tropismo

estable;suele ser bucal, comienza con hormigueo y luego aparecen vesículas, costra y

desaparece en +/- 1 semana; VHS-1 se transmite por secreción oral, infección a nivel peri-

oral, también otras zonas como los ojos; VHS-2 normalmente daran infección genital y se

contrae por vía sexual; en EEUU en ciertas capas sociales, es la enfermedad venérea mas

frecuente; en mujer gestante se puede transmitir al bebe vía placenta o canal de parto o en

los primeros días de vida; en general estos virus tienen capacidad oncogénicos como VEB

(virus Epstein-Barr), puede producir cáncer cervical; el diagnostico se realiza

mediante la tinción de Giemsa de celulas raspadas de lesiones herpéticas, para observar

las características de las celulas gigantes multi-nucleadas; también se cultivan en SHELL-

VIAL.

Citomegalovirus (CMV) - producen infección asintomática, pero con gran importancia

en huéspedes inmuno-comprometidos; las infecciones se pueden clasificar

en congénitas, peri-natales o pos-natales (antes o después del parto); es la causa mas

frecuente de infección congénita; el CMV se ha detectado en saliva, orina, leche materna,

semen, por lo que su transmisión es variada; también se transmite por transfusiones

o trasplantes; en pacientes inmuno-competentes, normalmente son asintomática, si

da clínica va a ser semejante a mononucleosis infecciosa (virus Epstein-Barr), comofiebre,

adenopatias, hepatomegalia; en paciente inmunodeprimidos es diferente, en

general dará fiebre, neumonitis, colitis, esofagitis, hepatitis, infección congénita y perinatal,

puede dar retraso mental, ictericia y sordera; el diagnostico => por serología buscando Acs

anti CMV (metodos ELISA), cultivo en SHELL-VIAL (artificial) ya que no se pueden

cultivar en celulas vivas.

Virus Varicela-Zóster (VVZ) - la varicela y el herpes zóster representan diferentes

manifestaciones clínicas de un mismo virus; la varicela es mas frecuente en niños y se

caracteriza por fiebre y exantema vesicular generalizado; es una infección primaria mientras

su re-activación producirá el herpes zóster, aparece normalmente en adultos (cuando hay

una disminución de la inmunidad) que consiste en una erupción dolorosa circunscrita de

lesiones vesiculares, acompañada de inflamación de las raíces dorsales de los

153/168

nervios raquídeos o de los ganglios sensitivos craneales; los estadios son => macula -

pápula - vesícula - umbilicación - costra; característicamente existe estados evolutivos

todos mezclado a la vez y prurito sobre todo en el tronco y cara (menos en las

extremidades); el diagnostico sera tipo clínico y también por los distintos metodos en

laboratorio => examen directo previa tinción Giemsa por microscopio electrónica,

por serología (ELISA) y por cultivo celular.

Virus de Epstein-Barr (VEB) - es uno de los virus humanos mas ubicuos, linfotrópico y

oncogénico; la infección primaria suele pasar en la infancia, aumentando su sero-

prevalencia 60-70% en jóvenes y 80-90% en adultos; el síndrome clínico mas frecuente es

lamononucleosis infecciosa (enfermedad de beso) que presenta fiebre, adenopatias,

faringitis y linfocitosis con linfocitos atípicos; VEB también se ha asociado a carcinoma

naso-faríngeo y al linfoma de Burkitt; diagnostico => la prueba de Paul Bunnell es

la detección de Acs heterofilos y también por método de ELISA.

Herpesvirus Humano 6 (HHV-6) - es un virus de muy reciente aparición, se ha aislado

en síndromes linfo-proliferativos y se ha vinculado al exantema súbito (elevación brusca de

la temperatura hasta 40ºC de 2-4 días, seguida de un descenso rápido que coincide con

la aparición de un exantema maculo-papular que persiste 1-2 días; el diagnostico

sera clínico y serológico.

Herpesvirus Humano 7 - se descubrió en 1989 (reciente); tiene tropismo por los linfocitos

T, provocando exantema súbito; se investiga si tiene relacion con síndrome de

fatiga crónica (que lo padecen sobre todo mujeres mayores).

2.6. Familia Pox-viridae (ADN bicatenario - doble membrana) - son de tamaño grande

230-400nm, con forma de ladrillo, se replica en citoplasma y se ensamblan en el

citoplasma;el mas importante es el virus de la viruela, virus de Moluscum Contagiosum y

virus de la Vaccinia;

- Viruela se contagia por inhalación y tras 15 días aparece fiebre, mialgias

154/168

y erupción pápula vesicular dura y luego evoluciona a pústulas y a la curación; a veces

puede provocar muerte por exantema hemorragica o una sobre infección bacteriana.

- Virus de la Vaccinia es muy próximo al virus de la viruela; en individuos

inmunodeprimidos puede provocar complicaciones, pero en los inmuno-competentes

es auto-limitado; es importante en los principios de la vacunación (Jennen); últimamente se

investiga su utilización como vector para actuar como vacuna contra virus de Hepatitis B,

Herpes simple y VIH, ya que su genoma es susceptible de poder insertarle secuencias de

genes que codifiquen proteínas de otros virus y que se expresarían posteriormente cuando el

virus se replique, con lo cual tendríamos Acs contra estos virus.

- Virus de Moluscum Contagiosum - provoca enfermedad cutánea benigna,

contagiosa que pueda adquirir por compartir objetos o contacto sexual; aparece en

epidermis lesiones nodulares blancas de aspecto nacarado de 2-10 mm que son indoloras;

cualquier traumatismo provoca su contagio; desaparece entre 2 meses y 1 año.

Esquema de Virus Respiratorio

155/168

HEPATITIS VIRAL - es una enfermedad sistémica que afecta fundamentalmente el

Hígado; se conocen 7 virus de la hepatitis, denominados A,B,C,D,E,F y G que pertenecen

cada uno a familias y géneros distintos, pero que tienen todos un tropismo hepático (no

tienen relación taxonómica); existen además otros virus que producen hepatitis,

comoCitomegalo virus y el virus de Epstein-Barr; se pueden clasificar según la

principal vía de transmisión y la tendencia a la cronicidad en 2 grandes

grupos(1) transmisión fecal-oral y no cronifican: VHA, VHE y

VHF (2) transmisión parenteral y pueden cronificar: VHB, VHC, VHD y VHG.

Virus de la Hepatitis A (VHA) - aislado en 1973, pero se sospechó mucho antes; virus

ARN de la familia Picornaviridae (de pequeño tamaño 20-30nm, icosaédrica, sin envuelta,

polaridad+) dentro del género Enterovirus, el tipo 72; la mayoría de infecciones son aguda

sin cronificarse (<1% fulminante); se encuentra en las heces durante el periodo de

incubación(hasta 2 semanas).

Transmisión - se disemina por la ruta fecal-oral (estrecho contacto persona-persona) con la

implicación de agua y alimentos que pueden causar brotes epidémicos; la mayor excreción

del virus en heces se da en las semanas previas a la aparición de la ictericia, sobre todo en la

fase tardía de la incubación; otras vías de transmisión del virus son posibles pero poco

probables; existe casos durante todo el año, con un pico en otoño.

Sintomatología clínica – suele ser menos grave que la hepatitis B; en general, la infección

es asintomática y la gravedad aumenta con la edad; el periodo de incubación 20-45 días, a

continuación suele aparecer fiebre, mialgias, fatiga, ictericia, anorexia, dolor de cabeza o

dolor en epigastrio y aumento de las transaminasas (GPT, GOT) y hepatomegalia.

Diagnostico – requiere la confirmación del laboratorio; se observó el virus por la primera

vez por Feinstone en 1973 y es cultivable, pero se utiliza la serología basada en la respuesta

inmunitaria; el método más utilizado es ELISA detectando Acs IgMVHA en su fase aguda;

también se pueden detectar Ags virales en heces (detectar Acs total de IgG y IgM no tiene

utilidad clínicamente); IgM suele durar 6 meses; IgG confiere inmunidad y la mayor parte

de nuestra población de >40 años los tienen; hasta la fecha no se han descrito casos de

cronicidad.

156/168

Prevención – las medidas más importantes son la higiene personal, lavado y desinfección

de manos y objetos contaminados; no es necesario el estricto aislamiento del paciente

mientras se mantiene las medidas de desinfección-esterilización, cloración y nivel

higiénico-sanitarias; inmunización pasiva => se dispone una inmunoglobulina eficaz tanto

paraprofilaxis pre-exposición (se estudia la relación coste-eficacia antes de utilizarla/ solo si

viajan a zonas endémicas) como post-exposición; inmunización activa => existe

una vacuna con buenos resultados (virus inactivados) que se pone al mes, 6 meses y al

año (3x).

Virus de la Hepatitis B (VHB) – es un virus ADN de la familia Hepadnaviridae (ADN

parcialmente bicatenario, icosaédrica con envuelta, resistentes al éter), de gran importancia

socio-sanitaria y distribución mundial (250 millones portadores asintomático – 1%

desarrollan cirrosis hepática o carcinoma hepato-celular que son complicaciones más

importantes); primeros casos se describieron en 1833 en Bremen (Alemania), por la

administración de la vacuna de la viruela que contiene suero humano, pero hasta los años

40-50 no se distinguió de la hepatitis A; en 1965 Blumberg descubrió el Ag Australia y se

identificó el virus.

Estructura – se distinguen una serie de estructura del virus que dan lugar a los marcadores

serológicos:

-Ag de superficie => HBsAg o Ag Australia (marcador de infecciosidad, codificado por el

gen S) que induce a la formación de HBsAc o anti-HBs que confiere inmunidad.

-Ag del core o nucleo-cápside => HBcAg codificado por el gen C que no se detecta en

sangre pero si su HBcAc (marcador epidemiológico que se mantiene de por vida); IgM-

HBcAc se detecta como marcador más fiable de hepatitis B aguda.

-Ag soluble => HBeAg que induce al HBeAc (HBeAg es el marcador de pronóstico de la

enfermedad, ya que se correlacionan con el nivel de replicación del virus; HBeAc es

unmarcador de buena evolución).

-Además se distinguen su genoma ADN y una polimerasa.

- El virión completo se denomina partícula de Dane, ya que existen formas incompletas en

sangre (como p.ej. HBsAg).

Infección por VHB – la mayoría son sub-clínicas/ asintomática (50-80%) y solo se detectan

en controles serológicos; la mayoría de las infecciones sintomáticas son auto limitadas y se

resuelven en menos de 6 meses (Hep.aguda); la lesión hepática puede ser nula o leve o

llegar a casos de hepatitis fulminante (> de 6 meses se pueden cronificar); lasintomatología

clínica es similar a la de Hepatitis A; un periodo de incubación es de 1-6 meses; entre 5-

10% de las infecciones se hacen persistentes y se mantiene de por vida (como portador

asintomático o sintomático); en la mayoría de ocasiones la función hepática y la histología

son normales, pero en otras ocasiones dan lugar a síndromes hepatitis crónica persistentes

157/168

(HCP) y hepatitis crónica activa (HCA); HCP es menos progresiva que HCA (puede ser

más grave y desembocar en cirrosis).

Epidemiologia – existen áreas hiper-endémicas, endemia media y baja (España está en

baja); el único reservorio importante es el hombre que transmite el virus por contacto íntimo

(vía sexual, parenteral y vertical-perinatal) y mediante objetos personales o materiales de

hospitales (familiares y personal sanitario corre un mayor riesgo); la existencia de HCP

presenta un reservorio estable para el virus y asegura su supervivencia indefinida que se

detecta en líquidos corporales (sangre, heces, orina, bilis, lagrimas, semen, leche materna,

sudor, secreciones vaginales, LCR, liquido sinovial y sangre de cordón);

Marcadores en la infección aguda auto-limitada (en el orden de aparición): -HBsAg (aparece antes del 1º mes y desaparece antes de 6º mes)

-HBeAg (aparece el 1º mes y desaparece antes del 3º mes)

-DNA viral (aparece después del 1º mes y desaparece al 3º mes)

-Anti HBc (aparece entre 1º-2º mes; Anti-HBc IgM desaparece antes del 5º mes =>

Hepatitis aguda)

-Anti HBe (aparece al 3º mes)

-Anti HBs (aparece antes del 7º mes)

Prevención – es la medida más eficaz para combatir la infección; es un virus muy

contagioso cuando hay exposición parenteral; existe inmunización pasiva (gammaglobulina

hiper-inmune eficaz en situaciones de pre y post-exposición )

y inmunización activa (vacuna de HBsAg que se administra universalmente a 0-1-6 meses

que produce respuesta inmunitaria de 90-95%).

158/168

Virus de la Hepatitis D (VHD) – descubierto en 1977; es un virus ARN

incompleto /defectivo que requiere HBsAg para su replicación (adquieren su envuelta del

virus B y si no hay infección de por VHB no la hay por VHD).

Tipos de infección:

1-Coinfección => infección simultáneamente por ambos virus (VHB y VHD); el curso

natural de VHB no se modifica; al resolverse la infección de VHB, re resuelve también la

de VHD; clínicamente la hepatitis es más grave y la tasa de hepatitis fulminantes es mayor

(hasta 20%).

2-Sobreinfección => cuando el VHD sobre infecta a portadores crónicos de VHB; aquí si se

modifica el curso natural de VHB y la mayoría de las sobreinfecciones (70%) desembocan

en hepatitis crónica y acaban en cirrosis entre 15-20 años.

El pronóstico de VHD depende de marcadores de replicación del virus (anti-HBe) => puede

acabar en hepatitis crónica o cirrosis; cuando no hay marcadores de replicación => puede

evolucionar a la curación.

Virus de la Hepatitis C (VHC) – es de reciente descubierto (1988 - aunque se sospechó

desde hace mucho tiempo) del que quedan aún muchos interrogantes por resolver; en

actualidad se sabe que VHC es responsable del 80-90% de los casos de hepatitis post-

transfusional y del 20-50% de los hepatitis esporádica; es un virus del tamaño medio dentro

de la familia Flaviviridae (virus ARN icosaédrica pequeño de tamaño 40-50nm con

envuelta, de polaridad+ y sensibles al éter); se distingue regiones para la envoltura (E), el

core (C) y otras no estructurales (NS).

Infección por VHC – se diseminan fundamentalmente por la vía parenteral; es la causa más

frecuente de hepatitis post-transfusional, hepatitis esporádica y ampliamente distribuido

entre ADVP (adicto a la droga de vía parenteral), pacientes en diálisis y hemofílicos; se

puede transmitir por contacto sexual o convivencia con portadores (menor importancia que

Hep.B);la clínica es similar a la de la hepatitis B; 25% cursan con ictericia y la tasa de

mortalidad es <1%; el curso es indolente y prolongado; el inicio no es muy brusco, es

frecuente las recurrencias, 50-70% tienden a cronificar y 20-25% acaban desarrollando

cirrosis.

Prevención – tratar todo tipo liquido corporal como potencialmente infeccioso; todavía no

se dispone inmuno-profilaxis; un paciente con VHC negativa no significa que no lo padece,

porque la sensibilidad de las técnicas más utilizadas no es 100% fiable; si se sufre un

accidente en el laboratorio o en la práctica clínica con sangre anti-VHC+, se debe realizar

un protocolo de seguimiento serológico de la persona; existen evidencias de que VHC

puede estar implicada en cáncer hepático.

159/168

Virus de la Hepatitis E (VHE) – se descubrió en 1983 y es responsable de la epidemias

por transmisión fecal-oral en India, Paquistán, África del Norte y Méjico (países de baja

salubridad); el curso es corto y parece ser que se puede transmitir parenteralmente, pero no

transfusional-mente; el virus todavía no está catalogado, se parece más a los calcivirus da

lafamilia Calciviridae (virus ARN icosaédrica de tamaño pequeño 35-40nm sin envuelta, de

polaridad+); clínica => aunque no se cronifica al igual que VHA, tiene un

pronóstico peor (la mortalidad 1-2%), más grave en gestantes del 3º trimestre del embarazo

(mortalidad de 20%); la habitual vía de transmisión es a través del agua de bebida.

Virus de la Hepatitis G (VHG) – se transmite por vía parenteral; esta relacionado con

virus de la familia Flaviviridae (virus ARN icosaédrica de tamaño pequeño 40-50nm, con

envuelta de polaridad+); provoca aisladamente un cuadro benigno, pero puede dar una

coinfección con el VHB y VHC con mayor tendencia a la cronicidad.

Virus de la Hepatitis F (VHF) – se transmite por vía entérica (fecal-oral)

SEROLOGIA DE LAS HEPATITIS VIRICAS (1993)

Marcadores serológicos para el diagnóstico de la hepatitis A – la mayoría de infecciones

son aguda sin cronificarse (<1% se fulmina); se encuentra en las heces durante el periodo de

incubación (hasta 2 semanas); su detección con fines diagnósticos no se emplea

rutinariamente.

-Ac Anti-VHA IgM => siempre es positivo en el inicio de la sintomatología clínica (hasta

3-6 meses); se usa como marcador de infección aguda; en Ag viral es detectado solamente

en el hígado y no se utiliza para el diagnóstico.

-Ac Anti-VHA IgG => su presencia demuestra un contacto previo con el virus (se mantiene

durante largos periodos de tiempo).

Marcadores serológicos para el diagnóstico de la hepatitis B – la evolución clínica es

variable (desde asintomática y anictérica hasta una enfermedad aguda que se puede

160/168

complicar hacia la cronicidad, la cirrosis o forma fulminante fatal); es evidente su relación

con el carcinoma hepato-celular; la determinación cualitativa y cuantitativa de ciertas

proteínas virales (Ags) y de los Acs nos sirve para evaluar la situación actual y pronosticar

el futuro de la infección.

-Ag de superficie HBs Australia (HBsAg) => se sintetiza en el citoplasma del hepatocito;

debido a que los hepatocitos fabrica un exceso de estos, una parte es liberada a la sangre y

puede ser detectada durante el periodo de incubación (es el 1º marcador que aparece,

incluso 2-6 semanas antes de que aparezca los síntomas, aunque pueda haber de 5-10% de

hepatitis aguda sin este marcador), en la fase aguda de la enfermedad y en el estadio

crónico; si la evolución es favorable desaparecerá a los 3-6 meses de la enfermedad; por el

contrario, si se mantiene más de 6-8 semanas después o si no existe una disminución

significativa de su título, es indicio de mal pronóstico y de evolución a la cronicidad.

-Ac anti-HBs => es el indicador de recuperación de la enfermedad y el ultimo en

aparecer(+/- a los 3 meses de su evolución); persiste durante mucho tiempo neutralizando al

virus y confiriendo protección; en los individuos vacunados es el único marcador presente.

- Ac anti-HBc => Ag HBc pertenece a la cápside y no se detecta serológicamente, ya que no

se encuentra libre, sino en el virus entero; solo se detecta Anti-HBc; es el 1º Ac que aparece

en la enfermedad, detectable con los primeros síntomas de la enfermedad en la fase aguda y

en la crónica (entre 3-5 semanas después de Ag Australia y es el 4º marcador en hacerse

positiva); puede significar una infección pasada o curada dada la larga persistencia de estos

Acs en el suero (su positividad confirmada en solitario no asegura la protección frente a la

enfermedad).

-Ag e (HBeAg) => es parte del Ag core; proteolíticamente degradado y antigénicamente

diferente; es el 2º marcador, detectable en la fase aguda y en algunas formas de enfermedad

crónica en las que histológicamente se corresponde con hepatitis crónica activa (HCA); su

valor clínico se funda en su excelente correlación con la presencia de replicación viral y

viremia; la sangre con HBeAg (+) se debe considerar como infecciosa; su estudio es

obligatorio en todos los sueros de HBsAg (+).

-Ac anti-HBe => es el 5º marcador; su aparición indica buena evolución y una baja

infectividad del paciente; en la mayoría de los casos es detectable poco antes de que

desaparezca HBsAg, pudiendo encontrarlo (+) durante varios años después de la infección.

-DNA viral libre (VHB-DNA) => es el 3º marcador; su detección en el suero mediante la

hibridación no es una técnica de rutina, a pesar de tratarse de un marcador muy sensible

tanto de la presencia del virus como de su actividad replicativa; el VHB-DNA es positivo en

un elevado número de pacientes HBeAg (+).

Marcadores serológicos para el diagnóstico de la hepatitis D 1º- Antígeno delta (HDcAg) => aparece fugazmente en sangre en la primo infección y su

utilizad clínica es muy limitada.

2º- Anticuerpos Anti-Delta (Anti-HD IgM) => es el marcador más importante que aparece

después de la aparición del Ag y se mantiene positivo a bajos títulos a un tiempo limitado si

161/168

la evolución es favorable; persistirá su positividad a títulos altos en casos que evolucionan a

la cronicidad.

3º- Anticuerpos Anti-Delta IgG (Anti-HD IgG) => aparecen más tardía y se mantiene

positivo durante largos periodos de tiempo; su detección indica solamente contacto con el

virus.

Esquema evolutivo:

-Coinfección de VHB y VHD = Ag Australia (+), Anti-HBc IgM (+) y AntiHD IgM (+)

-Sobre infección de VHD en paciente con VHB = Ag Australia (+), Anti-HBc IgM (-) y

Anti-HD IgM (+)

4º- RNA Viral (HD-RNA) => la positividad por técnicas de hibridación o PCR indica

presencia del virus.

Marcadores serológicos para el diagnóstico de la hepatitis C

-Anticuerpos Anti-VHC => se detecta empleando Ags sintéticos o recombinantes; pruebas

confirmatorias de Acs Anti-VHC => se detectan por método Western Blot para ver las

bandas.

-RNA viral (VHC-ARN) => no se suele hacer porque la epidemia es corta.

Marcadores serológicos para el diagnóstico de la hepatitis E – se están comercializando

pruebas que detectan Ag y Acs específicos (IgG y IgM) mediante técnica de ELISA.

DIAGNOSTICO DE LA INFECCION

A-Hepatitis Aguda Marcadores de rutina (los que se suelen pedir al laboratorio):

VHA => anti-VHA IgM

VHB => HBsAg o Ag Australia y HBc IgM

VHC => anti-VHC (totales)

VHD => anti-VHD IgM (en pacientes ADVP)

Criterios generales de interpretación:

-La presencia de anti-VHA IgM => es diagnostica de infección aguda por VHA.

-La presencia de HBsAg y anti-HBc IgM => es diagnostica de infección aguda por VHB;

-La presencia simultánea de anti-VHD IgM y anti-HBc IgM asociada a hepatitis aguda =>

se considera diagnostica de coinfección aguda por ambos VHB y VHD; la presencia de

anti-VHD IgM y HBsAg en ausencia de anti-HBc IgM => indica sobre infección por VHD

en un portador crónico de VHB. En cualquier caso, dada la situación epidemiológica actual

en España, no parece recomendable la búsqueda rutinaria de la infección delta en pacientes

ADVP.

-La seroconversión de anti-VHC es un criterio fiable para un diagnóstico de infección aguda

por VHC (cambio de negativo a positivo); la seroconversión suele retrasarse mas de 3

meses desde el comienzo de los síntomas, por lo que requiere el estudio de muestras de

seguimiento al menos hasta el 6º mes; no se ha demostrado que la detección de anti-HVC

IgM sea de utilidad en el diagnóstico de la hepatitis C aguda.

Criterios de interpretación en pacientes ADVP – las tasas de seropositividad para VHB

(anti-HBc total) y VHC (anti-VHC) en individuos ADVP superan el 80%; entre los ADVP

crónicamente infectados por VHB (positivos para HBsAg), la seropositividad para VHD

(anti-VHD total) se aproxima a dicho porcentaje; es frecuente que los ADVP se hallen

crónicamente infectados por uno o más de dichos agentes en un episodio de hepatitis aguda,

resultando imposible precisar su etiología.

162/168

B-Hepatitis Crónica Marcadores de rutina:

VHB => HBsAg y anti-HBc total (IgM + IgG)

VHD => anti-VHD total (en pacientes ADVP positivos para HBsAg)

VHC => anti-VHC

Criterios de interpretación:

-La presencia de HBsAg y anti-HBc total asociada a hepatitis crónica => es diagnostica de

hepatitis B crónica; la presencia adicional de anti-VHD total => indica una sobre infección

crónica por ambos VHB y VHD.

-La presencia de anti-VHC asociada a hepatitis crónica => es altamente indicativa de

hepatitis C crónica, aunque no es un diagnostico seguro; la detección de ARN viral en suero

mediante PCR ayuda a establecer el diagnostico, pero un resultado negativo aislado no lo

descarta, ya que la viremia es intermitente en muchos casos; dado el alto costo de métodos

de confirmación de anti-VHC, se considera que una re comprobación del resultado positivo

mediante un segundo método de cribado (método screening con técnica de ELISA) que

utilice Ags obtenidos por tecnología diferente, es suficiente para establecer la presencia de

anti-VHC en pacientes con hepatitis crónica.

VIH o SIDA

Descubrimiento del virus – se sospechó desde 1981 en 5 casos de neumonía

porPneumocystis carinii en varones homosexuales previamente sanos y va aumentando el

número de casos y se fue asociando esta inmunodeficiencia adquirida al sarcoma de Kaposi;

en junio de 1982 se contabilizaron 439 casos y en EEUU se emite un informe para definir

los casos de SIDA; en febrero del mismo año Montagnier expone la hipótesis de un

retrovirus linfotropico pudiera ser el agente causante del síndrome; en Mayo de 1983 se

aislo por primera vez el virus por Montagnier en Francia a partir de un ganglio linfático de

un paciente con linfadenopatia persistente (LAV) y Gallo en EEUU de un enfermo de SIDA

(HTLV-III).

El virus – es un virus ARN de la familia Retroviridae, subfamilia Lentiviridae (=incubación

lenta >10 años) con tipos 1 y 2; esta familia de virus se caracteriza por sintetizar ADN a

163/168

partir de ARN viral, mediante una retro-transcriptasa; consta de nucleo-cápside y

envoltura; es muy sensible a los agentes químicos y calor; sus principales genes son:

a) Estructurales:

-Gen GAG (Core) => proteínas 24

-ENV (Envoltura) => glicoproteínas 41, 120 y 160

-POL (Polimerasa) => es importante

b) Reguladores => genes que regulan la replicación viral y el papel de todos ellos no está

completamente dilucidado

Patogenia – en la infección aguda, el virus se une principalmente a receptores CD4 gracias

a gp41 y gp120; por lo tanto, sus células diana fundamentalmente son los linfocitos T4

(aunque también se unirá a los linfocitos B que tiene CD4, a los macrófagos, a las células

cerebral, y a los precursores de hematíes); este episodio se manifiesta como un cuadro

pseudogripal; es importante saber que la respuesta inmunitaria en forma de Acs frente al

virus se puede demorar 6-8 semanas (periodo de ventana +/- 3 semanas); a continuación el

ARN se copia a ADN por acción de la transcriptasa inversa, se pone en circulación y se

integra en el ADN de la célula (periodo de latencia); latencia o crecimiento es clave de la

patogenia de la enfermedad; normalmente la fase de latencia se prolonga durante periodos

largos de tiempo (2-8 años incluso más), pero en un momento dado puede progresar la

enfermedad con un progresivo deterioro de la inmunidad hasta desarrollar el SIDA; el ciclo

biológico se resumen=>

Entrada de virus – transcripción de ARN al ADN – integración en la genoma de T4 –

formación de nuevos viriones tras periodo de latencia (al salir, el virión tomara en su salida

parte de la membrana celular para utilizarla como su envuelta, esto hace que se destruye los

T4, se paraliza el sistema inmunológica y acaba provocando el SIDA.

Epidemiologia – las vías de transmisión del virus => por sangre, sexual y vertical-perinatal;

en España la tasa de transmisión por sangre es importante (el principal grupo afectado

sonlos UDVP/ ADVP y homosexual), a diferencia de Francia o EEUU, donde los mas

afectados son homosexuales; en cuanto a las tasas de transmisión madre-hijo oscilan 15-

50%, cobrando una especial importancia en África; la transmisión al personal sanitario o

similar es 0,2% y requiere contacto con mucosas de la sangre o liquido corporal infeccioso

(o también de líquidos donde se haya cultivado al virus).

164/168

Sintomatología clínica de SIDA – desde que una persona se infecta hasta que se desarrolle

la enfermedad, suele transcurrir 6-10 años; el estudio de la evolución de SIDA puede

realizarse por las manifestaciones clínico que van apareciendo o por marcadores

bioquímicos (el descenso de la cifra de linfocitos T4); a partir del 1996 la determinación de

la cantidad de virus circulante en la sangre de la persona infectada (carga viral) se ha

convertido en principal marcador de la evolución de la enfermedad.

Fases de la enfermedad

(1) fase de la infección aguda => la mayoría de los pacientes experimentan al cabo de unas

3 semanas de haber infectado con el virus una serie de síntomas pseudogripales como

fiebre, cefalea, eritema, adenopatías y sensación de mal estar, desaparecen después de 1-2

semanas; durante esta fase, el VIH se multiplica a gran velocidad; en un primer momento se

produce un descenso de la cifra de linfocitos (total), pero dentro de poco alcanzan las cifras

normales en respuesta de una activación del sistema inmunológico; los individuos son

altamente contagiosos durante esta fase;

(2) fase asintomática que puede durar 10 años o incluso mas; durante este periodo, el virus

continua replicándose, causando destrucción progresiva del sistema inmune; durante esta

fase, el recuento de los linfocitos es normal;

(3) fase sintomática precoz, se suele iniciar el desarrollo del síntoma clínico característica

de la enfermedad; apareciendo infecciones oportunistas de carácter leve p.ej. de tipo viral

=>CMV, Herpes zoster, de tipo bacterianas => Mycobacterium, Legionella, infestación de

parásitos => Pneumocystis carinii, Cryptosporidium, algunos hongos

=> Aspergillus yCándida;

(4) fase avanzada en la que aparecen infecciones y tumores, definitorios del SIDA (sarcoma

de Kaposi) que además, puede complicarse con un cuadro neurológico (demencia del

SIDA)con alteraciones motoras y del área cognitiva, debido a la acción directa del virus

sobre SNC;la supervivencia media de los pacientes con la SIDA ya desarrollado suelen ser

18-125 semanas, dependiendo del tipo de infección que tenga; en ningún caso habrá

supervivencia cuando están en esta fase.

Diagnóstico de laboratorio de la infección por VIH – en España fundamentalmente

serológico, por la importancia y las implicaciones que conlleva; se realiza mediante técnicas

de ELISA en primera instancia (técnica de cribado), aplicando a los positivos, métodos de

confirmación => Western Blot (WB), inmunofluorescencia (IFI) o radioinmuno-

precipitacion (RIPA).

165/168

**) El Western Blot es más utilizado y permite diferenciar los Acs frente a las distintas

proteínas del virus; tiene distintos criterios para la interpretación de los resultados (OMS,

CDC, Cruz Roja) y los resultados se clasifiquen en:

-Positivos => lo más aceptado es que haya bandas de envoltura (g41, gp120 y gp160) y

además bandas del core (p24, p31 y p66) o de la polimerasa o de ambos.

-Indeterminados => se detecta la presencia de alguna banda frente a alguna proteína del

virus (solo algunas proteínas del core en pacientes con lupus y factor reumatoide).

-Negativo => ausencia de banda o que no se corresponde a ninguna del virus (a estas

personas se hace un seguimiento durante 6 meses, para descartar que no sean falsos

negativos).

La técnica de WB consiste básicamente en la incubación de unas tiras de nitrocelulosa en

los que sean transferido las proteínas de los virus, básicamente las estructuras con el suero

del problema durante un tiempo que oscila 2-4 horas hasta los 18 horas; tras cual se revela

la presencia de Acs frente a diferente proteínas del virus mediante diferentes técnicas

inmuno-enzimáticas dependiendo del fabricante; el resultado será la aparición de bandas

coloreadas de mayor o menor intensidad en el lugar de la tira donde están situadas las

proteínas de VIH contra las cuales existen Acs en el suero del problema; la lectura puede

hacerse de manera manual, comparando las bandas con un control (+) o de manera

automatizada por densitometría; recordar en valores absolutos, la cifra de CD4 900-1500

linfocitos/m3 de sangre (en valores relativos 35-45%); las de CD8 600-900 linfocitos/m3 de

sangre; cuando la cifra de CD4 disminuye por debajo de las 200-400 linfocitos/m3 de

sangre, será indicativo de SIDA.

*) Los métodos de cribado (ELISA) son más sensibles y más específicos, siendo lo más

novedoso los de 3ª generación con capacidad de detectar IgG e IgM, acortando el periodo

de ventana.

*) También existen métodos rápidos, aplicables en situación de urgencia como la

aglutinación con partículas de látex o los que utilicen Ags fijados a soportes solidos o

membranas (se llamaDot-Blot).

*) Las técnicas de centros especializados => cultivo y PCR; la PCR es una técnica con

mucho futuro que presenta una enorme sensibilidad y especificidad, pero no están al

alcance de la mayor parte de los laboratorios; una importancia aplicación de estas técnicas

es el diagnostico de hijos y madres portadoras del VIH.

*) Marcadores de monitorización o seguimiento de la enfermedad (detección del Ag p24);

en fases tardías, se puede observar el declinar de los Acs anti p24 que se pueden utilizar con

el mismo fin.

*) De todos modos, el que más se utiliza para un diagnóstico de SIDA es el recuento celular

de los linfocitos CD4 o T4 (o el cociente respecto a los T8).

166/168

MÉTODOS DIAGNÓSTICOS EN VIROLOGÍA CLÍNICA

Objetivo de laboratorio - proporcionar el diagnóstico etiológico y orientar correctamente

el tratamiento en el menor tiempo posible; de manera simultanea se intenta practicar 2 tipos

de diagnostico =>

- Dº directo (visualizar o aislar el germen mediante el cultivo e identificarlo =>

en virología clínica no es posible, por las características físicas y biológicas del virus,

porque se ha de hacer mediante la detección de sus componentes, p.ej. Ags o

ácidos nucleicos).

- Dº indirecto (la identificación de los componentes de la respuesta inmune especifica/ Acs

generados).

Metodos de diagnostico directos:

a) Examen directo de la muestra (macroscópica /a simple vista) => aspecto purulenta (en

una infección viral nunca hay pus), presencia de sangre, moco, etc.

b) Microscópia => con la Microscópia óptica solo se puede identificar los cambios

celulares (efecto citopático) sufrido por las celulas infectadas y con la Microscópia

electrónica se puede visualizar el virus (en laboratorios de experimentación).

c) Cultivo => los virus se multiplican exclusivamente en el interior de las celulas vivas, por

ello debemos preparar previamente un soporte celular que permita su crecimiento in

vitromediante siguientes técnicas:

- cultivo de órganos => las secciones de algunos órganos pueden ser viables varias semanas

y nos permiten cuidadosamente aislar por ej. virus sincitial respiratorio (VRS) mediante

secciones de tejido respiratorio.

- cultivo de tejidos => fragmentos de tejidos en suspensión (cultivar adenovirus en un tejido

adenoideo)

- cultivos celulares => celulas aisladas obtenidas por disociación mecánica y con

enzimas proteolíticas a partir de tejidos; las celulas disociadas y separadas se colocan en un

frasco de cristal o de plástico; las celulas se adhieren a las paredes del frasco y se cubren

con medios nutritivos para mantenerlas viables; en condiciones optimas, las celulas se

multiplican hasta que cubran la pared formando una capa continua de crecimiento sobre las

que se podrán replicar los virus del problema; tipos de cultivos celulares:

*) cultivos primarios => es el primer pase in vitro, tomados directamente de un organismo

vivo; las celulas se siembran en un frasco con medio de crecimiento, conservan el numero

de cromosomas, tienen un periodo de vida corto y permiten el crecimiento de gran variedad

de virus (p.ej. celulas del riñon de conejo y mono, embrión de pollo).

*) lineas diploides => son celulas de un solo tipo (somáticas) que se pueden cultivar

durante un tiempo limitado, conservan el numero de cromosomas (46) y con ventaja de

quese mantiene durante mas tiempo que cultivo primario.

*) lineas celulares continuas => se cultivan in vitro indefinidamente y tiene un cariotipo

heteroploide (numero menor que las celulas somáticas); se originan de tejido maligno o

por mutación de una célula diploide; el cultivo se multiplican de forma indefinida y suelen

presentar aberraciones en el numero de cromosomas; estas celulas se pueden mantener a -

70ºC o -90ºC indefinidamente (p.ej. lineas celulares Hep-2 y Vero).

*) Shell-vial => es una técnica de cultivo celular que se ha desarrollado en los últimos años

y que permite obtener el crecimiento de numerosos virus y ciertas bacterias en un corto

periodo de tiempo (24-48 horas); sobre un vial se coloca una mono capa de celulas con 1ml

de medio de crecimiento, y sobre ello se coloca 0,2 ml de la muestra problema; el método se

basa en la centrifugación (suave) de la muestra sobre la mono capa, y tras un corto periodo

de incubación se pone de manifiesto la expresión de los Ags virales en la mono capa

mediante tinción inmunológica; la ventaja => la rapidez de obtención de resultados en 24-

167/168

48 horas, detectamos los Ags a las pocas horas de iniciarse la infección; tiene una

sensibilidad superior al cultivo celular, porque inoculamos el mismo volumen de muestra en

un área mas pequeña y mas fácil la observación al microscopio de fluorescencia.

Identificación del crecimiento en el cultivo celular - las mas frecuentes y disponibles en

el laboratorio:

1). Efecto citopático - los virus al multiplicarse provocan cambios en la célula donde se

replican que se manifiesta por una modificación en la morfología celular que se pueden

observar (p.ej. inclusiones dentro de las celulas, hinchazón del citoplasma, formación de

celulas gigantes multi-nucleadas) en la célula sin teñir o teñidas (se ve mas detalladas); cada

virus presenta un tipo de efecto citopático característico que puede ser identificado en

menos de 1 semana (p.ej. enterovirus, herpesvirus, adenovirus o poxvirus tienen como

efecto citopático la destrucción o lisis celular en 24-48 horas;

la fusión celular/ formación de sincition son característico de herpes virus, CMV, virus

herpes zóster, etc.)

2). Formación de cuerpos de inclusión - son cambios histológicos que se producen en las

celulas por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares; pueden

localizarse en el núcleo, en el citoplasma o en ambos y se clasifican según su tinción en

eosinófilos o basófilos; cada virus produce unos cuerpos de inclusiones característicos.

3). Hem-adsorción - es la capacidad que adquieren las celulas infectadas por un virus para

adherir a su superficie los hematíes de diversas especies (p.ej.aves, carnero).

4). Hem-aglutinación - la capacidad que adquieren las celulas infectadas por el virus de

aglutinar diversos tipos de hematíes, por la formación en su membrana de este tipo

de proteínas, las hemaglutininas.

5). Detección mediante metodos inmuno-enzimáticos o por inmunofluorescencia, de los

Ags virales mediante Acs específicos para los cuerpos de inclusión celular.

Las muestras para el aislamiento de virus se deben recoger lo antes posible, no después de

los 3-7 primeros días del inicio de la enfermedad; se pueden conservar a 4ºC durante 24

horas y si no, se deben congelar a -70ºC porque muchos virus son lábiles a -20ºC; las

muestras que se utilizan con mayor frecuencia son secreciones nasales, frotis faríngeo,

exudado conjuntival, líquidos vesiculares, raspados de piel, heces, orina, LCR, etc.

d) Detección de los componentes estructurales virales - las técnicas mas usadas que

permiten detectar Ags en suero y líquidos orgánicos (cuando existe una

alta concentración viral, sera fácil detectarlos) son:

- Aglutinación en látex => a las moleculas de látex se les une varias moléculas de Acs

conocidos y cuando se pone en contacto con una solución que contiene el Ag (la muestra

problema) se origina una aglutinación que puede visualizarse; es una técnica sencilla,

sensible, re-producible y barata. Su sensibilidad dependerá de la pureza del Ac utilizado.

- Contra-inmunoelectroforesis => esta basada en el principio de que los Ags virales (o

bacterianos en su caso) suelen tener carga (-) y los Acs (+), en medio alcalino; con este

fundamento se colocan las soluciones de Acs conocidos y del Ag problema en unas

cavidades realizadas en un gel de agarosa de tal manera que puedan difundir libremente; se

colocan unas mechas en los extremos de la capa de agarosa, que conectan con unas cubetas

que contienen un buffer con una composicion diferente dependiendo del sistema Ag-Ac;

cuando se aplica una corriente eléctrica, las moléculas de Ags con carga (-) migran hacia

el ánodo que esta en el extremo opuesto de la placa; los Acs son arrastrados por el buffer

levemente alcalino y, en el punto en que ambas lineas se encuentran, se forma una banda

de precipitación visible; es una técnica de alta sensibilidad pero laboriosa, que precisa una

alta concentración de Ag y Ac.

168/168

- Enzimoinmunoensayo => se basa en la detección de Ags mediante el empleo de un Ac

unido a una enzima, que mantiene la capacidad de canalizar la reacción Ag-Ac; el enzima

utilizado puede ser peoxidasa de rabano, Beta-galactosidasa o fosfatasa alcalina; la

presencia del inmuno-complejo es detectada por una reacción coloreada que se produce al

añadir el sustrato; el empleo de enzimas tiene una serie de ventajas:

*) el enzima se une al Ac pero deja libre los lugares de unión al Ag

*) el enzima no se modifica con la reacción Ag-Ac y queda unido al inmuno-complejo junto

con el sustrato amplificando la reacción y aumentando la posibilidad de detección

*) los conjugados con enzimas son muy estables

*) la lectura de la reacción se realiza en un espectrofotómetro y la cantidad de sustrato

liberado es directamente proporcional a la cantidad de Ag fijado en la reacción

*) la lectura también puede hacerse cualitativamente de forma manual, "de visu".

La reacción tiene lugar en 2 fases => en la 1ª- en unos pocillos sobre los que se ha fijado un

Ac especifico; al agregarle la muestra que puede contener los Ags, se unen formando el

complejo Ag-Ac; posteriormente se hace un lavado para eliminar el resto de Ags no unidos

a los Acs de la placa y otras partículas que pudieran interferir, en la 2ª- se agrega un Ac

marcado con un enzima que se une a los sitios de unión del Ag y al añadirse un sustrato, da

lugar a una reacción coloreada, que procederemos a medir en un espectrofotómetro; es

una técnica que necesita varias horas para su realización.

- Radioinmunoanalisis => tiene el mismo fundamento que el ELISA, pero en vez de unir un

enzima al Ac, se le une un radioisótopo, y lo que se mide en ultima instancia es

la radiactividad que estará en proporción directa a la cantidad de Ag que había en la muestra

problema; es una técnica con la misma sensibilidad que el ELISA, pero es mas costosa y se

necesita trabajar con material radioactivo, lo que plantea problemas en cuanto al personal y

las instalaciones; esta técnica se utilizo por primera vez para detectar el Ag de superficie del

virus de la hepatitis B.

- Inmunofluorescencia directa (IFD) => el Ag unido a una fase solida, en este caso un

portaobjetos, se pone en contacto con el Ac marcado con una sustancia fluorescente (p.ej.

isocianato de fluoresceina, rodamina, europio, etc.); tras un periodo de incubación, se lava

para eliminar el exceso de Acs y se observa al microscopio de luz ultravioleta;

esta técnica nos permite demostrar no solo la reacción Ag-Ac,

sino también la localización exacta donde se produce (superficie celular,

citoplasma, núcleo...).