FOTOCOLORIMETRIA

ANDRES FELIPE CANABAL GONZALEZ

RODRIGO DAVID DURANGO SEVERICHE

JOSE DAVID VILLARREAL RODRIGUEZ

Msc: RAMON LOZADA

SEMESTRE V

FACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIA

PROGRAMA DE BIOLOGIA

SINCELEJO – SUCRE

02 - 09 – 2012

OBJETIVOS

Analizar los principios generales de la técnica de fotocolorimetria.

Manejar adecuadamente el fotocolorímetro.

Determinar el espectro de absorción de un compuesto y seleccionar su longitud de onda óptima o de máxima absorción.

MARCO TEORICO

La fotocolorimetría es la medida de la luz absorbida por una solución mediante un aparato que es llamado fotocolorímetro. El equipo consta de una fuente de luz artificial, un monocromador que separa exclusivamente luz de una sola longitud de onda (la que sea preferente para la medida), un recipiente o tubo de vidrio (que alberga la solución a medir), una célula fotoeléctrica que transforma la luz trasmitida en corriente eléctrica y una unidad de medida de la corriente eléctrica o galvanómetro.

La calificación de colorímetro o espectrofotómetro depende del monocromador, sí éste es un filtro tendremos un fotocolorímetro, pero si es un prisma, o cualquier aditamento que proporcione luz de diversas longitudes de onda tendremos un espectrofotómetro.

Los fotocolorímetros y los espectrofotómetros reportan sus resultados bajo dos formas: absorbancia o luz absorbida por las partícula de la solución y transmitancia a o luz transmitida luego de atravesar el tubo con la solución. La transmitancia se expresa en valores numéricos entre 0 y 100%, es decir que una solución que no tiene particular trasmitirá el 100% y una perfectamente opaca el 0%.La absorbancia, también llamada densidad óptica DO, se expresa en valores semilogarítmicos entre 0 y 2 correspondiendo el 0 a aquella solución que no tiene partículas y por lo tanto no absorbe la luz.

Para encontrar la concentración de una solución problema, debemos comparar su lectura frente a un blanco – agua destilada o reactivos sin modificarse – con la lectura de un patrón o solución estándar bajo las mismas condiciones. Una solución estándar es generalmente una que contiene el problema con una concentración perfectamente medida en el laboratorio.

La ley de Beer-Lambert relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad saliente después de que en dicho medio se produzca absorción. La relación entre ambas intensidades puede expresarse a través de las siguientes relaciones:

Para líquidos:

Para gases:

Dónde:

, son las intensidades saliente y entrante respectivamente.

, es la absorbancia, que puede calcularse también como:

es la longitud atravesada por la luz en el medio,

es la concentración del absorbente en el medio.

es el coeficiente de absorción,

es el coeficiente de absorción:

es la longitud de onda de la luz absorbida.

es el coeficiente de extinción.

La ley explica que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una sustancia y la concentración de la sustancia, así como también entre la transmisión y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. Si conocemos y α, la concentración de la sustancia puede ser deducida a partir de la cantidad de luz transmitida.

Las unidades de c y α dependen del modo en que se exprese la concentración de la sustancia absorbente. Si la sustancia es líquida, se suele expresar como una fracción molar. Las unidades de α son la inversa de la longitud (por ejemplo cm-1).

El valor del coeficiente de absorción α varía según los materiales absorbentes y con la longitud de onda para cada material en particular. Se suele determinar experimentalmente. La ley tiende a no ser válida para concentraciones muy elevadas, especialmente si el material dispersa mucho la luz. La relación de la ley

entre concentración y absorción de luz está basada en el uso de espectroscopia para identificar sustancias.

PROCEDIMIENTO

DATOS

2 beaker

Solución #1

Solución #2

4ml biuret + 1,5 solución salina 0,9% + 0,5ml de

albumina

4ml biuret + solución salina 0,9%

Cubetas de cuarzo

Fotocolorímetro

datos

Después de realizar cada uno de los procedimientos se obtuvieron los siguientes datos

Longitud de onda absorbancia

420 0,055425 0,047430 0,042435 0,039440 0,038445 0,038450 0,041455 0,044460 0,048465 0,053470 0,059475 0,066480 0,074485 0,081490 0,09495 0,098500 0,107505 0,115510 0,123515 0,129

520 0,136525 0,141530 0,144535 0,147540 0,149545 0,149550 0,149555 0,147560 0,145565 0,142570 0,138575 0,135580 0,131585 0,121590 0,113595 0,121600 0,113605 0,1610 0,093615 0,085620 0,078

RESULTADOS

400 450 500 550 600 6500

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

longitud de onda vs absorvancia

absorvancia

ANÁLISIS DE RESULTADOS

En la gráfica se puede observar que hay un punto máximo, este corresponde a la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm, la cual presento una absorbancia de 0,149. Para lo anterior se utilizo una soluciones alcalina en el compuesto proteico con reactivo de biuret, ya que esta cumplen un papel importante para retiran los protones que se encuentran en dicha solución y así los electrones queden libres para que se unan con el Cu+2 del reactivo de biuret.

Con respecto a lo anterior se puede analizar que como el reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina. La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos.

El color violeta que es el que presenta menor longitud de onda con respecto a los demás colores (de 380 a 435 nm), rango aproximado al medido (340 nm) que representa el pico más alto en la gráfica de albúmina. Dado a que el espectrómetro usado no mide a λ de 380 no se observa un pico en la gráfica a esta λ, pero podemos tomar esta λ para calcular la concentración aproximada de albúmina en la solución la cual es proporcional a la absorbancia medida por el fotocolorímetro

CONCLUSIONES

En síntesis se puede decir que La fotocolorimetría consiste en medir la absorción de luz que produce una determinada sustancia al paso de un color determinado. Para ello, se utiliza un aparato llamado fotocolorímetro que utilizamos en el laboratorio y nos permitió medir la absorción de la luz.

La solución alcalina cumple un papel importante para retiran los protones que se encuentran en la solución de biuret y albumina, para que así los electrones queden libres para que se unan con el Cu+2 del reactivo de biuret.

Para que haya absorbancia de luz por parte de una solución, esta tiene que estar coloreada.

CUESTIONARIO

1. ¿Por qué la región visible emite radiaciones observadas por el ojo humano?

Porque la luz visible es la pequeña porción de radiación que el ojo humano puede detectar, con una longitud de onda (para los humanos) entre los 400 y 700 nm.

Como todos sabemos el sol emite radiaciones electromagnéticas en una amplia banda de frecuencia que va desde los Rayos Gamma hasta las Ondas de Radio. La frecuencia de estas radiaciones se mide en nanómetros (nm), y aquella que está entre los 400 nm y los 760 nm es la radiación visible por el ojo humano. Según su longitud de onda, estos rayos son distinguidos por nuestros ojos en diferentes colores, por ej. Una onda de alta frecuencia de 400 - 450 nm será vista de color azul, y una de baja frecuencia alrededor de los750 nm será vista de color rojo.Por debajo de los 400 nm, se encuentran los Rayos Ultra-Violetas (R U-V) cuyo espectro abarca desde los 400 hasta los 100 nm y por supuesto no la podemos ver.

2. ¿Cuál es el fundamento fisicoquímico de la transición de los electrones que se localizan en un orbital determinado?

Los electrones que se encuentran en los orbitales n, π o σ absorben la luz visible y se excitan a orbitales de mayor energía, π* σ* en los orbitales, con lo que permiten la absorción de energía y liberación de la misma, es decir, un electrón asciende o desciende a diferentes niveles en los orbitales atómicos.

3. ¿Por qué razón un compuesto químico absorbe o emite energía?

Pasa que en los átomos de compuestos, cuando absorben energía, se produce en ellos una excitación en sus electrones los cuales "saltan" de un orbital a otro dentro del mismo átomo, desde los niveles inferiores a los niveles superiores; pero cuando los electrones regresan a su estado original liberan toda esa la energía la cual se manifiesta en energía luminosa (fotón).

4. ¿Cuáles son las posibles transiciones electrónicas que pueden suceder en un compuesto químico y ordénelas en forma creciente de λ?

λ <150 nmTransiciones : Este tipo de transiciones se dan sobre todo en hidrocarburos que únicamente poseen enlaces C-H o C-C. La energía requerida

para que tenga lugar esta transición es relativamente grande, perteneciente a la región espectral denominada ultravioleta de vacío.

λ Entre 150-200 nmTransiciones n : Correspondientes a hidrocarburos que poseen átomos con pares de electrones no compartidos (electrones de no enlace). La energía necesaria para que se produzca esta transición sigue siendo alta (aunque menor que en las ) perteneciendo éstas a la región espectral UV Lejano.

λ Entre 200-700 nmTransiciones n y : La mayoría de las aplicaciones de espectroscopia UV-Visible están basadas en transiciones que ocurren en esta zona. Se requiere que las especies participantes aporten un sistema de electrones

(grupos cromóforos: compuestos con instauraciones, sistemas aromáticos multicíclicos, etc.). Las energías de excitación en las transiciones son medianamente altas, correspondiendo a la región UV Lejano y Próximo, mientras que las n son considerablemente menores, correspondiendo a la región visible del espectro.

En espectroscopia UV-Vis se irradia con luz de energía conocida suficiente como para provocar transiciones electrónicas, es decir promover un electrón desde un orbital de baja energía a uno vacante de alta energía.

Transiciones electrónicas posibles entre orbitales n

Las transiciones más favorecidas son entre el orbital ocupado de energía más alta (HOMO) y el orbital desocupado de energía más baja (LUMO)

El espectrómetro UV-Vis registra las longitudes de onda donde se registra absorción y cuantifica la absorción.

El espectro se registra como absorbancia (A) Vs. longitud de onda (Å), las bandas del espectro UV son anchas por que incluyen la estructura fina de transiciones vibracionales y rotacionales de menor energía.

5. ¿Qué reactivos químicos utilizan para preparar el biuret y por qué?

Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O6·4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.