Diagnòstic molecular de la sèpsia

Ferran NavarroLucrecia Carrara

Servei de Microbiologia

19 d’Abril de 2012

Índice

1. Concepto de Theranostic

2. Diagnóstico de sepsis / bacteriemia

3. Puntos clave de la biología molecular

4. Evaluación Magicplex sepsis

a) Objetivosb) Metodologíac) Resultadosd) Conclusión

5. Reflexión de futuro

Concepto de Theranostics

2 ó más de los siguientes criterios:

- Temperatura: > 38°C ó

< 36°C

- Frecuencia cardiaca: > 90 lat/min

- Frecuencia respiratoria: > 20 resp/min ó

PaCO2: < 32 mmHg

- Recuento de glóbulos blancos: > 12.000 cel/mm3 ó

< 4000 cel/mm3 ó

> 10 % de formes inmaduras

(en banda)

Síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS)

Dia

gnos

tico

de s

epsi

s / b

acte

riem

ia

Causas de SRISD

iagn

ostic

o de

sep

sis

/ bac

terie

mia

Causas de SRIS

Traumatismos

Dia

gnos

tico

de s

epsi

s / b

acte

riem

ia

Causas de SRIS

Traumatismos

Pancreatitis

Dia

gnos

tico

de s

epsi

s / b

acte

riem

ia

Causas de SRIS

Traumatismos

Pancreatitis

Quemaduras

Dia

gnos

tico

de s

epsi

s / b

acte

riem

ia

Causas de SRIS

Isquemia

Hemorragias

Cirugías complicadas

Embolismo pulmonar

Traumatismos

Pancreatitis

Quemaduras

Dia

gnos

tico

de s

epsi

s / b

acte

riem

ia

Causas de SRIS

Traumatismos

Quemaduras

Pancreatitis

Isquemia

Hemorragias

Cirugías complicadas

Embolismo pulmonar

INFECCIÓN

Dia

gnos

tico

de s

epsi

s / b

acte

riem

ia

Causas de SRIS

Traumatismos

Quemaduras

Pancreatitis

Isquemia

Hemorragias

Cirugías complicadas

Embolismo pulmonar

INFECCIÓN

Cuando el SIRS es producido por una infección: SEPSIS

Dia

gnos

tico

de s

epsi

s / b

acte

riem

ia

Dia

gnos

tico

de s

epsi

s / b

acte

riem

iaSepsis

Una de las 10 causas principales de mortalidad

600 muertes diarias en EEUU

Tratamiento inadecuado- Duplica la mortalidad.

- Incrementa 7% la mortalidad cada hora de retraso.

Disminución de la mortalidad- Baja un 17% si se informa el Gram en < 1h de positividad por el sistema

- La detección rápida de MRSA en UCI reduce la mortalidad de 48 a 9%.

Técnica de referencia. HemocultivoD

iagn

ostic

o de

sep

sis

/ bac

terie

mia

Ventajas- Necesidad de aislar el microorganismo para:

a. Identificación definitiva e identificación infraespecie (serotipo, patogrupo, serogrupo…)

b. Estudios de sensibilidad

c. Estudios de epidemiología molecular

Desventajas- Falsos negativos en enfermos tratados con ATB

- Lento o nulo crecimiento de microorganismos exigentes

- Resultados a las 24-48 horas

Dia

gnos

tico

de s

epsi

s / b

acte

riem

iaTécnicas alternativasA partir de hemocultivo positivo:- Detección de antígeno

- Detección de ácidos nucleicosa. PNA-FISH (Hibridació in situ con sondas fluorescentes dirigidas al rRNA)b. RT-PCR (GeneXpert)c. Arrays con nanopartículas (Verigene, Nanosphere)

- Espectrometría de masas. a. PCR/ESI-MS: Espectrometría de masas de ionización por electrospray. Calcula el ratio masa/carga de un producto de amplificación. (Abbott PLEX-ID)b. MALDI-TOF. (Sepsityper system; Bruker Daltonics)

- Pirosecuenciación: Secuenciación de DNA basado en la monitorización a tiempo real de la síntesis de DNA

A partir de la muestra (directo de sangre)Detección de ácidos nucleicos

- PCR/ESI-MS Espectrometría de masas de ionización por electrospray Calcula el ratio masa/carga de un producto de amplificación. (Abbott PLEX-ID)

- RT-PCR (SeptiFast, Magicplex)

- PCR-secuencición

Dia

gnos

tico

de s

epsi

s / b

acte

riem

iaTécnicas alternativas

1. Conocimiento de la genómica (dianas a detectar):- Conocimiento del genoma completo de muchos microorganismos

- Variaciones genómicas infraespecíficas. Secuenciación del genoma completo de varias cepas

- Desarrollo de la bioinformática: Genómica comparativa, genómica funcional

- Detección de dianas para la identificación pero también de mecanismos moleculares de resistencia

Puntos clave de la Biología MolecularPu

ntos

cla

ve d

e la

Bio

logí

a M

olec

ular

2. Sistemas de extracción de ácidos nucleicos rápidos, sencillos y eficientes:- Lisis de la pared microbiana:

Extracción de ácidos nucleicos (DNA/RNA) de una gran variedad de microorganismos y por tanto capacidad de lisis de una gran variedad de paredes (Ej: micobacterias)

- Nucleasas:

Protección de los ácidos nucleicos extraídos y eliminación de los inhibidores de la muestra

- Automatización:

Los extractores automatizados aseguran una mayor reproducibilidad de los resultados obtenidos.

Puntos clave de la Biología MolecularPu

ntos

cla

ve d

e la

Bio

logí

a M

olec

ular

La extracción de los ácidos nucleicos es probablemente el paso más crítico de cualquier

reacción de amplificación.

4. Control de calidad del procesoContaminación por amplicones

Antiguamente zonas separadas (Pre y Post PCR)

PCR a tiempo real: amplificación y revelado en sistema cerrado

Actualmente se incluye así mismo la extracción

Control de amplificación

Antiguamente: controles positivos y negativos

Actualmente:

control interno (amplificación simultánea de otra diana)

control automatizado de reactivos

Puntos clave de la Biología MolecularPu

ntos

cla

ve d

e la

Bio

logí

a M

olec

ular

Objetivos del estudioEv

alua

ción

Mag

icPl

ex /

obje

tivos

Determinar el rol clínico-microbiológico del sistemaSeegene Magicplex™ Sepsis Real-time Test

en el diagnóstico molecular de sepsis.

Criterios de inclusión

Paciente mayor de 18 años.

Con indicación clínica de recogida de hemocultivo.

Proveniente de los siguientes servicios:

Unidad de Cuidados Intensivos (UCI)Semicríticos (SC)Hematología (hospitalizados)Urgencias.

Eval

uaci

ón M

agic

Plex

/ M

etod

olog

ía

Casos / Muestras

Recolección de muestras:Abril del 2011 a Septiembre 2011. De domingos a viernes

10-20ml para Hemocultivos

1 ml para PCR (EDTA) guardada a 2-8ºC (< 24 h.)

Recolección de información clínica:Prospectiva

Parámetros clínicos de infección:

Constantes vitales, marcadores de inflamación y de disfunción de órganos, maniobras invasivas y origen de la infección

Antibióticos administrados

Eval

uaci

ón M

agic

Plex

/ M

etod

olog

ía

Extracción de ácidos nucleicosEv

alua

ción

Mag

icPl

ex /

Met

odol

ogía

Eval

uaci

ón M

agic

Plex

/ M

etod

olog

ía

La tecnología de Magicplex sepsis se basa en:- DPO

- READ

- Software CFX96™ Real-time PCR (Seegene)

Base molecular de Magicplex Sepsis Test

La tecnología de Magicplex sepsis se basa en:- DPO

- READ

- Software CFX96™ Real-time PCR (Seegene)

Eval

uaci

ón M

agic

Plex

/ M

etod

olog

íaBASE MOLECULAR DE MAGICPLEX SEPSIS

105

104103

102101

100101/2

5 10 15 20

5

10

15

Cycles

RFU

(103

)

NTC

• Amplificación, detección e identificación.

> Primera amplificación: PCR convencional (System 9700; Applied Biosystems).

- Gram-positivos, mecA, vanA y vanB

- Gram-negativos y hongos

> Screening: se realizan tres amplificaciones por RT-PCR (SmartCycle; Cepheid):

• Gram-positivos

• mecA, vanA y vanB

• Gram-negativos y hongos.

> Identificación: las especies identificables cubren a más del 90% de los principales patógenos responsables de Sepsis.

Eval

uaci

ón M

agic

Plex

/ M

etod

olog

íaAmplificación

Eval

uaci

ón M

agic

Plex

/ M

etod

olog

ía Amplificación / detección

Amplificación 2.5 h.Amplicon Bank 1. Gram (+) bacteria / DR

73 Gram (+) bacteria3 Drug resistance markers

Amplicon Bank 2. Gram (-) bacteria / Fungi

12 Gram (-) bacteria6 Fungi

Screening 30 min.Gram (+) bacteria Screening

Streptococcus spp.Enterococcus spp.

Staphylococcus spp.

Drug Resistance (DR) Screening

vanA vanB mecA

Gram (-) bacteria / Fungi Screening

Gram (-) bacteria-AGram (-) bacteria-B

Fungi

Identificación 30 min.ID 1 . Streptococcus spp.

ID 2 . Enterococcus spp.

S. agalactiaeS. pyogenes

S. pneumoniae

E. faecalisE. gallinarumE. faecium

ID 3 . Staphylococcus spp.S. epidermidis

S. haemolyticusS. aureus

ID 4 . Gram (-) bacteria-A

ID 5 . Gram (-) bacteria-A

P. aeruginosa A. baumanniiS. maltophilia

S. marcescensB. fragilisS. typhi

ID 6 . Gram (-) bacteria- B

ID 7 . Gram (-) bacteria- B

K. pneumoniaeK. oxytocaP. mirabilis

E. coliE. cloacaeE. aerogenes

ID 8 . Fungi ID 9 . Fungi

C. albicansC. tropicalisC. parapsilosis

C. glabrataC. krusei

A. fumigatus

Características clínicas de los pacientes.Ev

alua

ción

Mag

icPl

ex /

Met

odol

ogía

267muestras213 pacientes

179 SRIS 88 No SRIS

52 Positivos(Probable Sepsis) 127 Negativos 11 Positivos

(Bacteriemia) 77 Negativos

63 EPISODIOS POSITIVOS DE

INFECCIÓN

Correlación entre ambas técnicas Hemocultivo / PCR

Eval

uaci

ón M

agic

Plex

/ re

sulta

dos

Hemocultivos positivos

Hemocultivos negativos

Hemocultivoscontaminados Total

PCR positivas 23 15 3 41PCR

negativas 22 169 18 209

PCR contaminadas 0 14 3 17

Total 45 198 24 267

Concordancia73% (con Contaminaciones)

83% (sin Contaminaciones)

6%

9%

Especies identificadasEv

alua

ción

Mag

icPl

ex /

resu

ltado

s

Especies TotalDetectado

Detectadaspor PCR

Detectadas por HC Coincidencias

Staphylococcus sp.S.C.N. 43 21 30 8MRSA 2 1 2 1MSSA 3 3 3 3

Bacilos Gram-negativosE. coli 20 14 10 4

K. pneumoniae 11 10 5 4K. oxytoca 1 0 1 0P. mirabilis 1 1 1 1E. cloacae 2 2 0 0

P. aeruginosa 5 1 4 0Streptococcus sp.

S. pneumoniae 4 3 2 1Enterococcus sp.

E. faecalis 2 2* 2 1Hongos

Candida sp. 1 0 1 0No incluídos en el panel de identificación

Bacillus sp. 1 0 1 0Lactobacillus sp. 1 0 1

S. viridans 1 0 1 0Corynebacterium sp. 4 0 4 0

Anaerobios 4 0 4 0S. dysgalactiae 3 1* 3 1

Al repetir PCR sobre subcultivo:P. aeruginosa.

(11) ( 5) (10) (4)

1 Atopobium rimae.1 Odoribacter splanchnicus

1 Veillonella sp.

Utilidad de la PCREv

alua

ción

Mag

icPl

ex /

resu

ltado

s

Resultados de la PCR.

Episodios clínicos

Episodios Positivos Episodios Negativos Totales

Positiva 41 17 58

Negativa 22 187 209

Totales 63 204 267

Prevalencia: 24%

VPP: 71%VPN: 89%

Especificidad: 92% Sensibilidad: 65%

Utilidad del HemocultivoEv

alua

ción

Mag

icPl

ex /

resu

ltado

s

Resultados del HC.

Episodios clínicos.

Episodios positivos: Episodios negativos: Totales:

Positivos: 45 24 69

Negativos: 18 180 198

Totales: 63 204 267

Prevalencia: 24%

VPP: 65%VPN: 91%

Especificidad: 88% Sensibilidad: 71%

Staphylococcus spp.Ev

alua

ción

Mag

icPl

ex /

resu

ltado

s

CtId/mecA Resultado PCR Resultado Hemocultivo

13.09/13.19 Negativa/mecA NEG

14.36/13.84 Negativa/mecA NEG

10.02/Neg Staphylococcus sp. S. aureus OXA R

Eval

uaci

ón M

agic

Plex

/ re

sulta

dos

267 muestras

134 Sin ATB 101 Con ATB

23 Magicplex + 20 Hemocultivos + 17 Magicplex + 23 Hemocultivo +

14 contaminaciones

13 contaminados

3 contaminaciones

9 contaminados

32 Sin datos disponibles

Efecto de los ATB.

17% 15% 17% 23%

Alternativas MolecularesEv

alua

ción

Mag

icPl

ex /

resu

ltado

s

Test Desarrollado por:

Principio Límite de detección(UFC/ml)

Tiempo de respuesta

Sensibilidad/

Especificidad

SeptiTest

Molzyme, Bremen,Alemania

Broad-range PCRSecuenciación 20-40 para

S. aureus 8-12h >300 especies

87%/

85%

SeptiFast

Roche Molecular Systems,

USA.

Multiplex PCR sondas

de fluorescencia (FRET)

y secuenciación

3-30 6h

>90% de los principales patógenos

causantes de Sepsis.

70%/

99%

VYOO/LOOXSTER

SIRS-lab, Jena,

Alemania.

Multiplex PCR con gel de

electroforesis3-10 8h

>90% de los principales patógenos

causantes de Sepsis.+ 5 ATBR

?

Magicplex Seegene, Seul, Korea

Multiplex PCR sondas

de fluorescencia (FRET)

y secuenciación

30 para S. aureus, S

penumoniaeP aeruginosaCandida sp.

6h

>90% de los principales patógenos

causantes de Sepsis.

65%/

92%

PLEX-ID BAC Abbott/Ibis

Multiples PCRDetermina la

composicion de nucleótidos por MS

? 4-6h >300 especies 61%/

83%

CONCLUSIÓNEv

alua

ción

Mag

icPl

ex /

conc

lusi

ón

Magicplex Sepsis puede ser un complemento al hemocultivo aunque debido a la complejidad de la técnica sólo será útil en situaciones concretas dependiendo de la infraestructura del servicio.

•Sensibilidad (65-71%) especificidad; (92-88%); VPP (71-65%)y VPN (89-91%) muy similar al hemocultivo.•El porcentaje de contaminaciones es similar al hemocultivo(5-8%).•El uso de ATB previos afecta por igual ambas técnicas.•El punto de corte para estafilococos debería revisarse.•La detección de Enterobacterias es mayor para Magicplexque para el Hemocultivo.•La detección de P. aeruginosa es mayor para el Hemocultivoque para Magicplex.

Reflexión de FuturoEv

alua

ción

Mag

icPl

ex /

Futu

ro

Drug dicovery today 2002;7:1092

AgradecimientosPere Coll

Roser PericasMiquel Turbau

Motse SeresIndalecio MoranIsabel Quintana

Rodrigo Martino

IZASA, S.A.Seegene, Inc

http://www.santpau.es/santpau/activitats/inicioMicrobiologia.htm