extraccionydeterminaciondepropiedadesdesaponinasobtenidasapa

que como requisito parcial para optar por

el ttulo profesional de

UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN NICOLAS DE HIDALGO

FACULTAD DE BIOLOGA

Extraccin y determinacin de propiedades de saponinas obtenidas a partir del fruto de Enterolobium cyclocarpum

(Jacq.) Griseb (parota).

TESIS

Director de Tesis: Ing. Martn J. Meja. Morelia, Mich. Noviembre, 2006.

BILOGO

presenta

MNICA GARCA ALMANZA

CONTENIDO.

Pg.

1.- INTRODUCCION. 1

2.- OBJETIVOS. 3

3.- ANTECEDENTES. 4

4.- CLASIFICACION TAXONOMICA 10

5.- DESCRIPCION BOTNICA 10

5.1.- Distribucin geogrfica. 13

5.2.- Hbitat. 14

5.3.- Ciclo de vida. 15

6.- DESCRIPCIN DEL REA DE ESTUDIO 16

6.1.- Localizacin y superficie 16

6.2.- Fisiografa 17

6.3.- Hidrografa 17

6.4.- Clima 17

6.5.- Tipo de suelos y caractersticas 17

6.6.- Recursos naturales 18

6.6.1.- Flora y fauna 18

6.6.2.- Recursos forestales 18

6.7.- Minera 18

6.8.- Actividades econmicas 18

6.8.1.- Agricultura 18

6.8.2.- Ganadera 19

6.8.3.- Comercio 19

7.- MARCO TERICO 20

7.1.- Descripcin general de los glicsidos 20

7.2.- Caractersticas generales de las saponinas 20

7.3.- Terpenos 22

7.4.- Esteroides 23

7.5.- Saponinas triterpnicas 24

7.6.- Saponinas esteroidales 26

7.7.- Aislamiento de las saponinas 27

7.8.- Importancia de las saponinas 28

7.9.- Hemlisis 30

8.- MATERIALES Y METODOS 31

8.1.- Trabajo de gabinete 31

8.2.- Trabajo de campo 31

8.3.- Trabajo de laboratorio 31

8.3.1.- Proceso de separacin en seco 32

8.3.2.- Prueba de la espuma 32

8.3.3.- Tcnica de obtencin del crudo de saponinas 32

8.3.4.- Prueba de Liebermann-Burchard 33

8.3.5.- Prueba de hemlisis 34

8.3.6.- Prueba de toxicidad 35

9.- RESULTADOS Y DISCUSION 37

9.1.- Prueba de la espuma 37

9.2.- Obtencin del crudo de saponinas 39

9.3.- Prueba de Liebermann-Burchard 43

9.4.- Prueba de hemlisis 43

9.5.- Prueba de toxicidad 52

10.- CONCLUSIONES 57

11.- LITERATURA CITADA 59

NDICE DE CUADROS Y FIGURAS.

Tablas y figuras. Pg.

Figura 1.- Haz de la hoja del rbol Enterolobium cyclocarpum. 11

Figura 2.- Envs de las hojas del rbol de Enterolobium cyclocarpum. 11

Figura 3.- Fruto verde del rbol de Enterolobium cyclocarpum. 12

Figura 4.-. Fruto seco de Enterolobium cyclocarpum, con semillas 12

Figura 5.- Semillas del fruto de Enterolobium cyclocarpum 13

Figura 6.- Distribucin de Enterolobium cyclocarpum en Mxico y

Amrica Central y del Sur.

14

Figura 7.- Ubicacin del Municipio de Chinicuila, Estado de Mich.,

Mxico.

16

Cuadro 1.- Estructuras de algunas saponinas triterpenoides ms

conocidas que se han establecido recientemente.

25

Cuadro 2.- Algunos tipos de saponinas esteroidales presentes en

algunas plantas.

27

Cuadro 3.- Concentraciones de saponinas, buffer isotnico y porcentaje

de hemlisis.

34

Figura 8.- Mecanismo del efecto limpiador de jabones y detergentes. 38

Figura 9.- Prueba de la espuma. 38

Figura 10.- Extraccin con equipo Soxhlet. 39

Figura 11.- Extraccin del crudo de saponinas del fruto E. cyclocarpum. 41

Cuadro 4.- Extracciones realizadas y crudo de saponinas obtenido del

fruto de Enterolobium cyclocarpum.

42

Cuadro 5.- Porcentaje de hemlisis en los eritrocitos. 44

Figura 12.- Muestra de eritrocitos con crudos de saponinas, hemlisis

100%. 100X.

45

Figura 13.- Eritrocitos con 92-90% de hemlisis 40X. 47



Figura 16.- Eritrocitos con 50-45% de hemsis 100X. 55

Figura 17.- Eritrocitos sin hemolizar 100X. 50

Figura 18.- Eritrocitos sin hemolizar 40X. 50

Figura 19.- Eritrocitos crenados 40X. 51

Figura 20.- Agua y alimento con el crudo de saponinas administrado a

los animales tratados.

52

Cuadro 6.- Pesos corporales de rata y ratn tratados con extractos de

crudos de saponinas y administrados en e alimento.

53

Figura 21.- Ratn tratado con crudo de saponinas en el alimento. 54

Figura 22.- Rata tratada con crudo de saponinas en el agua. 55

Figura 23.- Ratn tratado con crudo de saponinas en el agua. 55

Cuadro 7.- Pesos corporales de rata y ratn tratados con extractos de

crudos de saponinas y administrados en el agua.

56

Facultad de Biologa U.M.S.N.H.

RESUMEN.

En esta investigacin se pretende extraer y determinar las propiedades de saponinas obtenidas a partir del fruto de Enterolobium cyclocarpum (parota);

para lo cual se procedi a la utilizacin de un mtodo de extraccin agua-

alcohol en un equipo Soxhlet. Se tomaron tres muestras del fruto de

Enterolobium cyclocarpum (cscara, pulpa, fibra); a una de stas se les

someti a un tratamiento mecnico previo como lo fue la molienda y el

tamizado; a la segunda slo se moli pero no se tamiz y a la tercera muestra

no se moli ni tamiz. De estas tres muestras se procedi a extraer el crudo de

saponinas presentes en el fruto de Enterolobium cyclocarpum. Para la

determinacin de las propiedades del crudo de saponinas obtenido del fruto de

la parota se procedi a someterlo a ciertos mtodos y pruebas como lo fue, la

prueba de la espuma, prueba de Liebermann- Burchard, prueba de hemlisis y

prueba de toxicidad en roedores.

La colecta del fruto de Enterolobium cyclocarpum (parota) fue realizada

en el municipio de Chinicuila, Michoacn. La colecta se realiz de forma

manual y no se colect muestra botnica, solo se colect como uso exclusivo

en el laboratorio y para los objetivos planteados en esta investigacin.


1

1.- INTRODUCCION.

La vida del hombre siempre ha estado ligada de manera muy importante a

las plantas, sta le ha proporcionado alimento, vestido, materiales de

construccin, salud e incluso muerte. Una prueba de esta realidad, es la especie

vegetal Enterolobium cyclocarpum conocida parota, la cual ha sido de mucha

utilidad para el hombre, ya que cuenta con caractersticas que le permiten ser un

rbol enteramente maderable, debido a que su madera es de textura gruesa, fcil

de trabajar y resistente a plagas; es ampliamente utilizada para la elaboracin de

muebles y embarcaciones; el follaje as como el fruto son utilizados como forraje

para el ganado vacuno y bovino. Otros usos menores incluyen el jabn hecho de

la pulpa, las semillas cocinadas como verdura para consumo humano y los

taninos extrados de las vainas y la corteza. Las flores se valoran en muchas

reas para produccin de miel (Zamora et al, 2001). No obstante esta especie

puede ofrecer grandes beneficios, el uso ms importante que se le da es el de

proporcionar sombra y las vainas como alimento para vacas y caballos.

El propsito de este trabajo es extraer las sustancias fitoqumicas llamadas

saponinas, las cuales tienen la caracterstica de estar constituidas por grandes

molculas orgnicas, como esteroides o triterpenos, unidas a una o varias de

azcares, por lo que contienen los elementos necesarios para emulsionar la grasa,

una caracterstica que puede ser aprovechable para la elaboracin de distintos

productos en beneficio de la salud, por ejemplo: extractos para el tratamiento de

enfermedades del corazn (Hernndez, 1996), reducen la colestoromia y son

antiinflamatorios (Palencia, 2003), entre otros muchos beneficios, dndole as a la

especie Enterolobium cyclocarpum un uso alternativo y viable, adems del

maderable, como una fuente de aprovechamiento industrial pero principalmente

como fuente teraputica y medicinal, ya que de acuerdo a la bibliografa

consultada, presenta ciertas macromolculas orgnicas. As tambin, se pretende

estudiar los efectos txicos de las saponinas extradas de Enterolobium

cyclocarpum, ya que una caracterstica de tales sustancias es la de producir

efectos adversos sobre la funcin hematolgica, principalmente hemlisis.


2

Otro propsito es darle un uso alternativo no solamente como especie

maderable, a esta importante especie vegetal, por lo que ayudara en la

conservacin y restauracin del ecosistema de las selvas medianas

subcaducifolias, ya que al lograr el inters de las personas y vean que pueden

tener un beneficio econmico, se integren a la conservacin de la especie, dando

como resultado un desarrollo sustentable de beneficio para la gente y la especie.

La informacin sobre Enterolobium cyclocarpum est limitada y se

encuentra concentrada en pases de Centro y Sudamrica. En lo que concierne a

Michoacn, la informacin es escasa y no se ha hecho ningn estudio sobre el

uso no maderable de la parota, por lo que esta investigacin se considera de

mayor importancia porque contribuir a su conocimiento y aprovechamiento.


3

2.- OBJETIVOS. 2.1. Objetivo general. Extraer y determinar las propiedades de saponinas presentes en el fruto de Enterolobium cyclocarpum (parota), as como su posible toxicidad.

2.2. Objetivos particulares. 1.- Obtener saponinas a partir del fruto de Enterolobium cyclocarpum (parota),

utilizando el mtodo fitoqumico de extraccin agua-alcohol.

2.- Determinar las propiedades de las saponinas obtenidas del fruto de

Enterolobium cyclocarpum (parota).

3.- Administrar el crudo de saponinas obtenido del fruto de Enterolobium

cyclocarpum (parota) en roedores, para determinar su posible toxicidad.


4

3.- ANTECEDENTES.

Para su empleo como agente hipocolesteromizante, se procedi a la

obtencin de crudos de saponinas a partir de la cascarilla de granos de

Chenopodium quinoa Wild (quina), mediante reflujo con etanol al 80%. Los

diferentes lotes de saponinas brutas obtenidas presentarn un rendimiento

promedio de 37.12%, sobre la base total de cascarilla (8.03% de la mas de

granos) y de 2.98% sobre la base total de granos. Estos productos no

reaccionaron fuertemente en las pruebas de Liebermann- Burchard y Selivoflo, y

su potencia hemoltica se enmarc en un recorrido de 42.6 hasta 28.4. Seis

muestras de crudos fueron sometidas a saponificacin sin que se observaran

cambios notables en la potencia hemoltica de los productos saponificados. Este

hecho, unido a que el total de los crudos obtenidos manifestaron una reaccin

negativa en las pruebas de Fehling y Molish. Sugieren que los productos

obtenidos se encuentran en forma de sapogeninas u otros derivados "no

saponificables (Hernndez, 1996).

En un estudio efectuado en el trpico seco, se encontr que la

suplementacin con concentrado a un nivel de 30% de gallinaza, parota o la

mezcla de ambas pueden usarse en la alimentacin de ovejas Pelibuey, sin

disminucin de su productividad ya que no hubo diferencias significativas, en

ninguno de los tres tratamientos cuanto a la ganancia diaria de peso, conversin

y eficiencia alimenticia. En forma prctica la recomendacin del uso de esos

ingredientes depender de su disponibilidad y costo (lvarez, 1999).

Se determinaron los efectos txicos de la asociacin fruto de parota

(Enterolobioum cyclocarpum) con estrella de frica (Cynodon plectostachyus) en

ovinos. Se concluy que, bajo las condiciones de este estudio, no existen efectos

txicos en ovinos alimentados con vaina y fruto de parota y estrella de frica, por

lo que resulta ser una alternativa en la alimentacin animal dado su valor

nutritivo, la facilidad de obtencin y bajo costo (Torres, 1999).


5

Es interesante destacar el alto rendimiento observado para Enterolobium

cyclocarpum (36.10g/espcimen / semana) y su viscosidad intrnseca (100ml/g),

en comparacin con la alta solubilidad en agua (50 g/ml) exhibida por la goma de

Anacardium occidentale. Los datos analticos estudiados sugieren la importancia

del cultivo de estas especies y la aplicacin de estas gomas en diversas

industrias nacionales (Rincn et al., 1999).

Las especies Enterolobium cyclocarpum, Samanea samn, Acacia

glomerosa y Anacardium occidentale producen goma con alto rendimiento. Las

propiedades fisicoqumicas estudiadas en los polmeros, provenientes de estas

especies, les confieren potencial aplicacin industrial (Rincn et al., 1999).

Realizaron un estudio sobre los efectos adversos de extractos de

saponinas obtenidas de Ilex paraguariensis y de una nueva especie de hierba

mate, Ilex dumosa var. reiss. Ante las evidencias de que las infusiones de Ilex

dumosa var. reiss podran ofrecer acciones diferentes a las infusiones de Ilex

paraguariensis, principalmente un bajo o nulo contenido en cafena y xantinas,

las cuales seran desde el punto de vista industrial potencialmente convenientes,

se propuso llevar a cabo la realizacin de investigaciones farmacolgicas bsicas

para profundizar en el conocimiento de las acciones de los extractos de Ilex

dumosa en animales de laboratorio, principalmente en el rea hematolgica

(Kochol et al., 2000),

Se realiz la extraccin de saponina del escarificado de quinoa

(Chenopodium quinoa). A lo largo de sta investigacin, se realizaron una serie

de experimentos para determinar el proceso ptimo de extraccin de la saponina

presente en la cscara de la quinua. Se determin que el mejor sistema de

extraccin es el de batch clsico con agitacin, porque tiene la ventaja de

recuperar el 30.4% de los slidos, si bien tiene la desventaja de presentar mayor

dificultad en la etapa de filtracin. El mtodo propuesto de extraccin batch bao

mara, slo recupera el 7.5% de los slidos, por lo que no es recomendable

(Campos, 2002).


6

La madera es muy apreciada para la lea y carbn, para la fabricacin de

canoas y embarcaciones ligeras por ser sumamente resistentes al agua, utilizadas

en carpintera y ebanistera en general. Los frutos verdes son astringentes y se

utilizan en medicina casera en casos de diarrea, el tronco exuda un lquido que se

emplea como remedio para bronquitis. En algunos lugares se cultiva como planta

de sombra y ornato particularmente en los potreros y a lo largo de los caminos, la

corteza contiene taninos y se utiliza para curtir pieles. El fruto contiene saponina y

se utiliza originalmente como sustituto de jabn. Los frutos maduros contienen un

jugo gomoso- resinoso que mezclado con la pulpa del mismo previamente

macerada sirve para fabricar aglomerados de carbn (Zamora et al., 2001).

Acacia glomerosa, Acacia tortuosa, Acacia macracantha, Samanea samn

y Enterolobium cyclocarpum, especies Mimosaceae venezolanas, tiene la

capacidad de exudar goma, despus de un estmulo apropiado. Datos de estas

gomas, determinados por mtodos analticos clsicos, son muy interesantes. Las

gomas de Acacia tortuosa y Acacia macracantha son muy solubles en agua; las

gomas de Enterolobium cyclocarpum y Samanea samn mostraron alto valor de la

viscosidad intrnseca. La composicin de azcares de las gomas estudiadas

demostr contener galactosa, arabinosa, ramnosa, cido glucuronico y su 4-0-

methyl derivado. Los datos obtenidos mostraron algunas similitudes con los

reportados para la goma de Acacia senegal, la cual tiene amplia aplicacin

industrial; por lo tanto, seria muy interesante ensayar el comportamiento de esas

gomas en la industria alimentara y en otras aplicaciones industriales.

(Abed, 2002).

La inclusin del 20% de la harina del fruto de la parota como sustituto de

grano y pasta proteica en la racin de ovinos estabulados, permiti mantener su

desarrollo con una disminucin significativa de los costos de produccin. La

viabilidad econmica de la utilizacin de la parota en la alimentacin de

rumiantes, refuerza la necesidad de orientar los estudios hacia el

aprovechamiento racional de los recursos forrajeros arbreos no convencionales


7

en la produccin animal (Peralta et al., 2003).

La incorporacin de Enterolobium cyclocarpum permiti mantener la

ganancia diaria y total de peso, as como el consumo de la materia seca sin

diferencia estadstica entre tratamientos, con una disminucin significativa en el

costo de la racin (Peralta et al, 2003).

La inclusin del 20% de harina del fruto de la parota como sustituto de

grano y pasta proteica en la racin de ovinos estabulados, permiti mantener su

desarrollo con una disminucin significativa de los costos de produccin.

La viabilidad econmica de la utilizacin de la parota en la alimentacin de

rumiantes, refuerza la necesidad de orientar los estudios hacia el

aprovechamiento racional de los recursos forrajeros arbreos no convencionales,

en la produccin animal (Peralta et al, 2003).

La cintica de la degradacin ruminal "in situ" del nitrgeno tiene un

comportamiento similar en los rboles de Enterolobium cyclocarpum y Brosimum

alicastrum en las primeras horas de incubacin en rumen, situacin que pudiera

estar relacionada con el alto contenido de prolaminas y/o glutelinas de estos

rboles (Febles. et al., 2003).

Se realiz la comparacin de los efectos de tres especies de rboles

frutales ricos en saponinas sobre la fermentacin del rumen. Las dietas contenan

100 mg/g de Sapindus saponaria (120 mg/g de crudos de saponinas), 200 mg/g de

Enterolobium cyclocarpum (19 mg/g de crudo de saponinas) o Pithecellobium

saman (17 mg/g de crudos de saponinas). Los resultados confirmaron el fruto de

Sapindus saponaria tiene efectos antiprotozoarios, lo cual indica que tiene el

potencial de reducir la produccin de metano en la fermentacin ruminal. Los

frutos de Enterolobium cyclocarpum y Pithecellobium saman, en las proporciones

usadas en este estudio, parecen tener un bajo valor en la reduccin del total del

rumen y el metano producido por los protozoarios. Los resultados tambin

muestran que la combinacin entre Sapindus saponaria y Enterolobium


8

cyclocarpum pueden ser particularmente promisorias como estrategias para

suprimir las emisiones de metano (Hess et al., 2003).

En este estudio fue probada la actividad antiprotozoa del follaje

Enterolobium cyclocarpum en el rumen de las ovejas. Los resultados del presente

estudio mostraron que la implementacin del follaje de E. cyclocarpum en la dieta

diaria de las ovejas claramente muestran una significante reduccin en la

poblacin de los protozoarios en el rumen, el perodo de aplicacin fue de 41 das.

En este estudio se concluye que la actividad antiprotozoa de E. cyclocarpum es

pasajera, con un corto perodo en donde efectivamente se reduce la poblacin de

protozoarios (arriba de 12-14 das), y solo cuando los animales son alimentados

por primera vez con tal dieta, ya que despus ste tiempo la poblacin se

restablece (Ivan et al., 2004).

Se estudiaron los efectos de remover el ganado y la aplicacin de

herbicidas sobre la sobrevivencia y crecimiento de tres especies plantadas dentro

de una regin tropical- seca de Panam, la cual est deforestada. La investigacin

se bas en demostrar si la utilizacin de ciertas plantas son herramientas viables

para la regeneracin natural de un rea expuesta a la reforestacin. Tres especies

econmicamente valiosas fueron escogidas para tal estudio; Cedrella odorata L.,

Enterolobium cyclocarpum (Jaq.) Griseb y Copaifera aromatica. Al inicio del

desarrollo de las plntulas, las semillas de C.odorata presentaron el mas grande

crecimiento con la aplicacin de ciertos rangos de herbicidas mientras que las

semillas de Enterolobium cyclocarpum tuvieron un crecimiento mayor con la

exclusin del ganado. La combinacin de estos dos factores, la aplicacin de

herbicidas y exclusin del ganado, ayudaron para un mejor crecimiento de ambas

especies. Adems, con la presencia del ganado, C. odorata creci

significativamente mejor que Enterolobium cyclocarpum. Para acelerar la sucesin

forestal, el herbicida debe ser aplicado al inicio y el ganado debe ser excluido

antes de fertilizar las plantas (Griscom et al., 2005),


9

En este estudio fue evaluado el valor de cuatro rboles tropicales de

leguminosas como fuentes de nitrgeno, Albizia lebbekoides, Enterolobium

cyclocarpum y Leucacena leucocephala, se utiliz la comparacin de la

produccin de gas in Vitro con otros mtodos para determinar la degradacin del

nitrgeno. La relacin entre la produccin de gas y amoniaco in Vitro es un

procedimiento til y barato para estimar la degradacin de nitrgeno de los rboles

tropicales utilizados. Albizia lebbekoides tuvo la mas alta produccin de gas,

asociado con una moderada degradacin del nitrgeno, indicando que es un

alimento potencialmente nutritivo para los rumiantes en el trpico (Mota et al.,

2005).


10

4.- CLASIFICACION TAXONOMICA. Reino: Plantae

Divisin: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida (Dicotiledneas)

Orden: Fabales (Leguminosae)

Familia: Mimosaceae

Gnero: Enterolobium

Especie: Enterolobium cyclocarpum (Jacq.) Griseb.

Tomado de: Sarukhn, 1998.

5.- DESCRIPCION BOTANICA.

Forma: rbol grande, llamativo, caducifolio, de 20 a 30 m (hasta 45 m de

altura), con dimetro normal hasta de 3 m.

Copa y hojas: Copa hemisfrica. El follaje es abundante, dando a la amplia

copa una forma mas ancha que alta. Libre de competencia por luz y puede

alcanzar grandes dimetros. Hojas bipinnadas con 4-15 pares de pinnas opuestas,

miden de 15 a 45 cm de largo; foliolos numerosos (15 a 30 pares por pinna) de

color verde brillante que se pliegan durante la noche.

(a)


11

(b)

Figura 1.- Haz de la hoja del rbol Enterolobium cyclocarpum.

(a)

(b)

Figura 2.-Envs de las hojas del rbol de Enterolobium cyclocarpum.

Tronco y ramas: Tronco recto y a veces con pequeos contrafuertes en la

base. Ramas ascendentes.

Corteza: Corteza externa lisa rugosa y a veces ligeramente fisulada, gris

clara a gris pardusca, con abundantes lenticelas alargadas, suberificadas,

dispuestas longitudinalmente. Corteza interna de color crema rosado, granulosa

con exudado pegajoso y dulce. Grosor de 2 a 3 cm.

Flores: En pequeas cabezuelas pedunculadas axilares, de 1.5 a 2 cm de

dimetro, sobre pednculos de 1.5 a 3.5 cm. de largo. Flores actinomrficas, cliz

verde y tubular; corola verde y clara, de 5 a 6 mm de largo.

Fruto: Caracterstico de la especie (fruto seco). Consiste en una vaina

circular indehiscente, de 7 a 15 cm de dimetro, aplanada y enroscada, leosa,


12

moreno oscura, brillante de sabor dulce. Contiene de 5 a 20 semillas.

Figura 3.- Fruto verde del rbol de Enterolobium cyclocarpum.

(a)

(b)

Figura 4.- Fruto seco de Enterolobium cyclocarpum, con semillas.

Semillas: Grandes, ovoides y aplanadas, de 2.3 por 1.5 cm, morenas y

brillantes con una lnea plida con la forma del contorno de la semilla, rodeadas

por una pulpa fibrosa y esponjosa de olor y sabor dulce.

Presentan una testa extremadamente dura que impide la germinacin hasta que

una modificacin estructural permite la hidratacin del embrin.


13

Figura 5.- Semillas del fruto de Enterolobium cyclocarpum.

Raz: Sistema radical extenso y profundo.

Sexualidad: Hermafrodita.

Numero cromosmico: 2n = 26

Tomado de: Sarukhn, 1998.

5.1.- Distribucin geogrfica.

Originaria de Amrica Tropical, se extiende desde el Oeste hasta el Sur de

Mxico (23 N), a travs de Centroamrica hasta el Norte de Sudamrica:

Colombia, Venezuela, Trinidad, Guyana y el extremo Norte de Brasil, (Quesada, et

al., 1997).

En Mxico se encuentra ampliamente distribuida en la vertiente del Golfo de

Mxico desde el Sur de Tamaulipas hasta la Pennsula de Yucatn y en la

vertiente del Pacfico desde Sinaloa hasta Chiapas, en altitud de 0 a 800 m.

Estados: Campeche, Colima, Guerrero, Jalisco, Chiapas, Michoacn,

Morelos, Nayarit, Oaxaca, Puebla, Quertaro, Quintana Roo, San Luis Potos,

Sinaloa, Sonora, Tamaulipas, Veracruz y Yucatn.


14

Figura 6.- Distribucin natural de Enterolobium cyclocarpum (parota) en Mxico y

Amrica Central y del Sur. Tomado de: Sarukhn, 1998.

5.2.- Hbitat.

Se desarrolla en regiones costeras del pas y a lo largo de ros y arroyos.

Su hbitat propicio es de baja elevacin (abajo de 500 msnm) presenta su mejor

desarrollo en los suelos conocidos como vertisol plico y vertisol gleyco (FAO).

Suelos arenoso- arcilloso, arenoso, negro.

Es componente frecuente de la vegetacin perturbada de las zonas

tropicales hmedas y subhmedas de baja altitud en Mxico y Centroamrica. Es

difcil relacionar esta especie con algn tipo de vegetacin primaria,

aparentemente se encuentra en asociaciones primarias de selvas medianas

caducifolias y subcaducifolias. Crece en zonas perturbadas de selvas altas y

medianas.


15

5.3.- Ciclo de vida.

Es una especie de crecimiento rpido (en condiciones de alta luminosidad).

Presenta follaje caducifolio, los rboles pierden sus hojas cuando fructifican.

Polinizacin: Entomfila. La polinizacin es llevada a cabo por palomillas y

abejorros pequeos de actividad nocturna.

Desarrollo de las Plntulas: La germinacin de la parota comienza casi

inmediatamente despus de la penetracin de agua a la semilla. Muchas plntulas

brotan del suelo al cuarto da despus de la siembra. La germinacin es epigea.

La siembra se puede efectuar en bandejas, semilleros, bolsas de vivero o

directamente en el campo. El presionar las semillas en turba hmeda o cubrirlas

con una capa de suelo hmedo de 1 2 cm, es adecuado para la germinacin.

Las plntulas se desarrollan con rapidez, no necesitan de sombra y son

resistentes a la sequa. Por lo general se puede obtener una buena supervivencia

usando plntulas en contenedores y el plantado de cepas o tocones (Bauer,

1982).

La regeneracin natural es poco frecuente, debido a varias causas: Las

semillas se esparcen principalmente a travs de los animales de pastoreo y

despus de germinar y crecer un poco, son casi siempre consumidas por los

mismos animales.


16

6.- DESCRIPCIN DEL REA DE ESTUDIO

6.1.- Localizacin y superficie.

El Municipio de Chinicuila se localiza al Suroeste del Estado de Michoacn,

en las coordenadas 1845' de latitud Norte y 10322' de longitud Oeste, con altitud

de 680 m. Limita al Norte con el Estado de Jalisco, al Este con Coalcomn, al Sur

con Aquila y al Oeste con Coahuayana y el Estado de Colima (INEGI, 1985). La

superficie es de 928.64 km y representa 1.35 % de la superficie de Michoacn.

Figura 7.- Ubicacin del Municipio de Chinicuila, Estado de Michoacn, Mxico


17

6.2.- Fisiografa.

Es de relieve escarpado por La Sierra Madre del Sur o Sierra de

Coalcomn. Los cerros ms importantes son: Silleta, El Cascarn, El Puerto del

Aire, Agua Colorada, Caimn y Naranjillo (INEGI, 1985). 6.3.- Hidrografa.

El sistema hidrogrfico lo constituyen los ros La Minita, Villa Victoria y

Huizontla, as como los arroyos Salitre de Coapala, El Bejuco y El Maicillo (INEGI,

1985).

6.4.- Clima.

El clima es Aw1 (w); tropical con lluvias en verano, la precipitacin pluvial

anual es de 1,183.8 mm las temperaturas varan de 21.3 a 32.4 C. (INEGI,

1985).

6.5.- Tipo de suelos.

Los suelos del municipio datan de la Era Mesozoica y del perodo Cretcico

inferior. Predominan los feozem, regosol utrico y litosoles con textura media (Hh

+Re + I/2). Le siguen las resinas y luvisol clcico, con textura fina (E + I + Lk/3).

Finalmente se encuentran los de tipo vertisol plico, con textura fina (Vp/3). Su

uso es primordialmente ganadero y forestal. Se registra como una zona de suelos

no aptos para la agricultura (INEGI, 1985).


18

6.6.- Recursos naturales. 6.6.1.- Flora y fauna.

En el Municipio predominan los siguientes bosques: tropical subcaducifolio,

con parota, cueramo, ceiba, chico zapote; mixto, con pino, encino y cedro. La

fauna la conforman el coyote, cacomixtle, tlacuache, conejo, zorrillo, ocelote,

nutria, comadreja, ardilla, venado, puma, paloma, cerceta, trtola, pato, carpa y

mojarra (INEGI, 1985).

6.6.2.- Recursos forestales.

La superficie forestal maderable corresponde al bosque de pino-encino y el

bosque tropical subcaducifolio.

(http://mapserver.inegi.gob.mx/geografia/espanol/estados/mich/tsuelosagr.cfm)

6.7.- Minera.

Existen yacimientos de hierro y un yacimiento de manganeso.

(http://mapserver.inegi.gob.mx/geografia/espanol/estados/mich/tsuelosagr.cfm)

6.8.- Actividades econmicas.

6.8.1.- Agricultura.

Es la segunda actividad en importancia y se cultiva maz y frjol de temporal,

adems del cultivo de arroz (INEGI, 1988).


19

6.8.2.- Ganadera.

Es la primera actividad econmica en importancia con 17,733 cabezas de

ganado vacuno (INEGI, 1988).

6.8.3.- Comercio.

Cuenta con tiendas de abarrotes, farmacias, fruteras y venta de alimentos

(INEGI, 1988).


20

7.- MARCO TEORICO. 7.1.- Descripcin general de los glicsidos.

El trmino glicsido es un trmino general para los acetales o cetales,

formados por una reaccin de un azcar con un alcohol o un fenol. Los glicsidos

derivados de la glucosa, son llamados glucsidos.

Todos los glicsidos se nombran de acuerdo con el azcar particular del

cual derivan (monsidos, fructsidos, ribsidos, etc.). Los alcoholes o fenoles

naturales, a menudo se combinan en las clulas con algn azcar (normalmente

glucosa) formando un glucsido. Los mltiples grupos oxhidrilo presentes en la

porcin de azcar del glicsido, ayudan a solubilizar los compuestos que de otra

manera seran insolubles en el protoplasma celular. Mltiples pigmentos de

plantas, sustancias que dan sabor, esteroides, etc., se encuentran en la

naturaleza como glicsidos (Hart et al., 1980).

7.2.- Caractersticas generales de las saponinas. Las saponinas son un grupo de glucsidos (sustancias orgnicas donde la

funcin carbohidrato est formada de una o ms molculas de monosacridos;

estn combinados con ms grupos no azucarados, son fcilmente hidrolizables

por la accin de enzimas cidos) que se disuelven en agua y disminuyen la

tensin superficial de sta; por lo tanto, tienen la propiedad de producir espuma

abundante, y relativamente estable. Por hidrlisis de las saponinas se obtienen

carbohidratos y una aglicona, llamada generalmente sapogenina, la cual puede

tener un esqueleto esteroidal o de triterpeno (Domnguez, 1979).

Entre las plantas que contienen saponinas, se encuentran la espinaca,

betabel (remolacha), esprrago, alfalfa, soya, etc., tambin se encuentran en el

veneno de las serpientes y en el de las estrellas de mar (Oakenful, 1981, de

acuerdo con Palencia, 2003).


21

Las saponinas estn constituidas por grandes molculas orgnicas,

esteroides y triterpenos, unidas a una o varias molculas, por lo que contienen

los elementos necesarios para emulsionar la grasa: Una parte lipoflica, que es el

esteroide o el triterpeno, por medio del cual se unir la grasa y una parte

hidroflica, que es el azcar (pentosas, hexosas cidos urnicos) por medio del

cual se unir al agua. Se conocen ms de 200 saponinas esteroidales,

localizadas en las monocotiledneas principalmente, en las familias de las

liliceas, amarilidceas y dioscoreceas y las saponinas triterpenoides se han

aislado principalmente en dicotiledneas (Hernndez, 1996).

Los dos tipos de saponinas presentan ciertas propiedades distintivas que

sirven de base para su identificacin rpida: a) sabor amargo, b) produccin de

espuma al ser agitadas en soluciones acuosas, c) produccin de hemlisis de los

glbulos rojos, d) toxicidad en animales de sangre fra, en especial los peces

(sapotoxinas), a los cuales les provocan parlisis de las agallas, e) la mayora de

las saponinas son solubles en diferente grado en soluciones de alcohol-agua,

propiedad que se emplea en diversas tcnicas para su extraccin y purificacin,

f) produccin de una reaccin positiva en la prueba de Lieberman- Burchard. Por

lo general, las saponinas esteroidales en esta prueba, manifiestan colores que

varan desde el azul hasta el verde y las triterpnicas, rosado, rojo o violeta

(Hernndez, 1996).

Antes de describir los dos tipos de saponinas, se dar una introduccin a

los componentes bsicos que forman a estas sustancias, los cuales son:

terpenos y esteroides.

Los terpenos y los esteroides son un conjunto heterogneo de molculas,

con las siguientes propiedades: Estn presentes en las clulas, se extraen con

solventes orgnicos, se derivan estructural y metablicamente del isopreno. El

isopreno a 2-metil-1,3-butadieno es un hidrocarburo de 5 carbonos.


22

Las sustancias asociadas a los lpidos, son mltiplos del isopreno y dan

lugar a estructuras lineales o acclicas, los terpenos y los esteroides,

respectivamente.

7.3.- Terpenos.

Estn constituidos por unidades mltiples del hidrocarburo de cinco

tomos de carbono isopreno. Los terpenos que contienen dos unidades de

isopreno se llaman monoterpenos, los cuales contienen tres unidades que se

denominan sesquiterpenos y los que contienen cuatro, seis y ocho unidades

reciben el nombre de diterpenos, triterpenos y tetraterpenos, respectivamente.

Los terpenos pueden ser molculas lineales o cclicas y algunos de ellos

contienen estructuras de ambos tipos (Lenhinger, 1995).

En los vegetales se han identificado un nmero muy grande de terpenos,

muchos de los cuales poseen olores o sabores caractersticos y son

componentes principales de los aceites esenciales, obtenidos de las plantas. De

este modo los monoterpenos geraniol, limoneno, mentol, pineno, alcanfor y

carvona, son componentes principales del aceite de geranio, de menta, de

trementina, de alcanfor y de alcaravea, respectivamente. Entre los triterpenos

figura el escualeno, precursor importante en la biosntesis del colesterol. Entre

otros terpenos superiores se incluyen los carotenoides, que son una clase de

CH3

C CH2

H2C CH

ISOPRENO


23

hidrocarburos tetraterpnicos; un carotenoide importante es el -caroteno, hidrocarburo precursor de la vitamina A. Entre los terpenos ms importantes hay

tres miembros del grupo de las vitaminas liposolubles; son las vitaminas A, E, y

K, aunque de estas sustancias, solamente se requieren cantidades mnimas en la

dieta de los mamferos.

Otra clase importante de terpenos, es la representada por los poliprenoles,

compuestos poliisoprenoides lineales de cadena larga, con un grupo alcohol

primario terminal.

7.4.- Esteroides.

Los esteroides son importantes molculas derivadas del hidrocarburo

tetracclico saturado perhidrociclopentanofenantreno. De fuentes naturales se

han aislado muchos esteroides diferentes, cada uno de los cuales posee una

funcin o actividad caracterstica. Los esteroides difieren en el nmero y en la

posicin de sus dobles enlaces, en el tipo, localizacin y nmero de los grupos

funcionales sustituyentes en la configuracin y de los enlaces, entre sus grupos sustituyentes y el ncleo y en la configuracin que adoptan los anillos

entre s, ya que el hidrocarburo originario posee seis centros de asimetra. Todos

los esteroides se originan a parir del escualeno, triterpeno lineal que se cicla con

facilidad. El primer producto esteroide importante de esta ciclacin es el

lanosterol, que es el precursor del colesterol en los tejidos animales. El colesterol

y el lanosterol son miembros de un gran subgrupo de esteroides, llamados

esteroles. El colesterol funde a los 150C y es insoluble en el agua, pero se

extrae fcilmente de los tejidos con cloroformo, ter, benceno o alcohol caliente.

El colesterol se encuentra en las membranas plsticas de muchas clulas

animales y en las lipo-protenas del plasma sanguneo.

En los tejidos animales, el colesterol es el precursor de otros muchos

esteroides; se incluyen entre ellos los cidos biliares, compuestos con carcter


24

detergente que ayudan a la emulsin de los lpidos y a su absorcin intestinal; los

andrgenos u hormonas sexuales masculinas; la progesterona, que es una

hormona progestgena y las hormonas adrenocorticales.

7.5.- Saponinas triterpnicas.

Las saponinas triterpnicas, por lo general tienen un anillo oleano y ms

raramente ursano o damarano. Muchos son cidos, debido a la presencia de uno

o dos grupos carboxilo en la aglicona y/o la mitad de azcar y se encuentran

unidos en la posicin 3. Los grupos de carbohidratos usualmente contenidos son

unidades de 1-6 monosacridos, siendo los ms comnes la glucosa, galactosa,

ramnosa, arabinosa, fucosa, xilosa, cido galacturnico y cido glucurnico

(Domnguez, 1979).

Las saponinas triteprnicas son raras en las monocotiledneas, abundan

en muchas familias de las dicotiledneas, especialmente en Caryophillaceae,

Sapindaceae, Polygalaceae y Sapotaceae, Compositae, Cucurbitaceae,

Linaceae.

Las saponinas triterpenoides se han clasificado en tres grupos,

representados por -amirina, -amirina y lupeol (esterol unido a una cadena corta de uno o ms azcares). Los cidos triterpenoides relacionados, se forman por

sustitucin de un grupo metilo por un grupo carbonilo en las posiciones 4, 17 20

de las sustancias anteriormente citadas (Domnguez, 1979).

Las plantas contienen frecuentemente cantidades considerables de

saponinas triterpnicas, la raz de prmula contiene alrededor de 5-10%; la raz

de regaliz entre 2-12%, la corteza de quilaya contiene hasta 10% de la mezcla

conocida por el nombre de saponina comercial y las semillas de castao de

Indias, hasta el 13% (Palencia, 2003).


25

Cuadro 1.- Estructuras de algunas saponinas triterpenoides ms conocidas que

se han establecido recientemente.

Saponina Genina Componentes glucosdicos

Fuentes

Aescina Aescigenina 2-glucosa, 1 cido glucurnico, 1 cido tglico

Aesculus hippocastanum

Aralina Aralidina 2 arabinosas, 1 cido glucurnico

Aralia japonica

Calndula- saponina A

cido oleanlico 2 glucosas, 1 galactosa 1 cido glucurnico

Calendula officinalis

cido glicirrcico cido glicirretnico 2 cido glucurnicos

Gilicirriza spp.

Gualanina cido noroleanlico

1 ramnosa, 1 glucosa, 1 arabinosa

Guaiacum spp.

Gipsfila Gipsogenina 1 galactosa, 1 xilosa, 1 arabinosa, 1 fucosa, 1 ramnosa

Gipsophila spp.

Hederacsido A (hederina)

Hederagenina 1 glucosa, 1 arabinosa

Hedera helix

Prmula- saponina Primulgenina 1 ramniosa, 1 glucosa, 1 falactosa, 1 cido glucurnico

Primula spp.

Quilaya-saponina cido quilyco 1 cido glucurnico, 6 azcares y restos acilo

Quillaia saponaria

Salko-saponina A Saikogenina 1 glucosa, 1 fructosa

Bupleurum spp.


26

Todas las saponinas triterpnicas poseen actividad hemoltica, la cual

puede ser dbil a fuerte dependiendo del tipo de sustituyentes (Domnguez,

1979).

La mayora de las saponinas en alimentos son del tipo triterpenoide como

las presentes en la soya (Oakenful, 1981, de acuerdo con Palencia, 2003).

Las saponinas triterpenoides desempean diversas funciones biolgicas

en animales. Por ejemplo, algunas provocan la formacin de espuma en el

intestino, lo cual causa indigestin gaseosa (timpanitis) en el ganado que come

plantas jvenes de alfalfa. Sin embargo, estas saponinas no repelen el ganado,

por el contrario, ste prefiere tales plantas que las maduras, con mucho menor

contenido de saponinas (Salisbury et al., 1994).

7.6.- Saponinas esteroidales.

Las sapogeninas de las saponinas esteroidales, son principalmente

derivados de espirostanol y furostanol, que son normalmente convertidas en

espirostanoles durante el aislamiento. Estas sapogeninas no tienen grupos

carboxilo, no muchas unidades de azcar como las triterpnicas; la mayora de

los compuestos de este grupo, estn presentes en las plantas como glucsidos.

Las uniones glucosdicas estn usualmente unidas a C-1, C-8 y C-6 y los

glucsidos estn presentes en forma de antrona: los glicsidos encontrados

glucosa, ramnosa y apiosa (Domnguez, 1979).

Estn menos distribuidas en la naturaleza que las saponinas

triterpenoides. Los estudios fitoqumicos han demostrado su presencia en

muchas familias de las monocotiledneas, especialmente en Dioscoreaceae y

Liliaceae. Entre las dicotiledneas, en Leguminosae y Solanaceae.


27

Cuadro 2.- Algunos tipos de saponinas esteroidales presentes en algunas plantas.

Saponinas Componentes glucosdicos

Localizacin

Sarsaponina 2 glucosas, 1 ramnosa Smilax spp. Digitonina 2 glucosas, 2 galactosas

1 xilosa Digitalis purpurea

Gitonina 1 glucosa, 2 galactosas, 1 xilosa

Digitalis purpurea

Dioscina 1 glucosa, 2 ramnosas Dioscorea spp.

Las saponinas esteroidales son de gran inters e importancia por su

relacin con compuestos como las hormonas sexuales, cortisona, esteroides

diurticos, vitamina D y hetersidos cardacos. Algunas son utilizadas como

material de partida para la sntesis de estos compuestos (Palencia, 2003).

Aunque algunas saponinas esteroidales han mostrado diversas actividades

biolgicas (antimicrobiana, citotxica, antitumoral, ictiotxica, molusquicida,

insecticida, antihelmntica, expectorante, diurtica, cardiovascular, antiinflamatoria,

anti-lcera, espermicida, analgsica, antipirtica, sedante, antifertilidad,

antihepatotxica, etc.), fundamentalmente se han constituido desde hace bastante

tiempo, como precursores nicos de muchos medicamentos esteroides tales como

hormonas sexuales, corticoides, contraceptivos orales y diurticos a

partir de esteroides naturales. La produccin industrial de estas sustancias

requiere una serie de procesos microbiolgicos de fermentacin y una serie de

conversiones qumicas relativamente complejas y en su gran mayora patentadas

por los grandes laboratorios farmacuticos (Martnez, 1999).

7.7.- Aislamiento de las saponinas.

Las saponinas son sustancias muy polares y es posible extraerlas en

caliente o en fro, con agua o alcoholes de bajo peso molcular. Los materiales


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lipoides presentes en estos extractos, se separan con benceno. Por hidrlisis de

las saponinas se obtienen carbohidratos y una aglicona, llamada genricamente

sapogenina, la cual puede tener un esqueleto esteroidal o de triterpeno. Las

saponinas se pueden hidrolizar con cido clorhdrico cido sulfrico.

7.8.- Importancia de las saponinas.

Antes de que el hombre creara la industria del jabn, se usaban jabones

naturales, conocidos por los mexicanos como amole entre los cuales se incluyen

a las saponinas. Los pueblos prehispnicos del centro de Mxico, llamaban

amole a las plantas que tiene la propiedad de hacer espuma con el agua, como

es el caso de la parota, por lo que se han utilizado desde la antigedad para

lavar ropa. An en la actualidad en muchas comunidades rurales se emplea el

amole tanto para lavar ropa fina, como para evitar que se deteriore, ya que es un

detergente neutro perfectamente degradable (Hernndez, 1996).

Como ya se mencion, las saponinas son altamente txicas a peces y a

otros animales acuticos de sangre fra o que respiran por branquias, sin

embargo, su efecto daino en animales superiores es variable. En la actualidad

se ha realizado un notable incremento en el conocimiento de este tipo de

compuestos, porque aparte de que manifiestan ciertas propiedades txicas,

tambin se les han reconocido otras cualidades tecnolgicas y medicinales (Birk

and Peri, 1980; Oakenful, 1981, de acuerdo con Palencia, 2003).

Las saponinas se encuentran altamente distribuidas en el reino vegetal,

donde se pueden encontrar en hojas, races, tallos y flores. Dentro de las plantas

comestibles que contienen este tipo de sustancias, se encuentran las siguientes:

soya, alfalfa, espinacas, esprragos, avena y garbanzo; tambin se encuentran

presentes en el veneno de las serpientes y en el de las estrellas marinas. La

mayora de las saponinas son del tipo triterpenoide como las presentes en la

soya. (Oakenful, 1981; Hegsted and Linkswiler, 1980, de acuerdo con Palencia,


29

2003).

Entre las saponinas de naturaleza esteroidal, son muy importantes los

glicsidos cardiacos, como el obtenido de la dedalera (Digitalis purpurea). El

extracto obtenido de las semillas contienen una mezcla de saponinas y es muy

til en el tratamiento de enfermedades del corazn (Hernndez, 1996).

Debido a que las saponinas slo son absorbidas en cantidades nfimas por

el intestino, actan especialmente en la luz del tracto gastrointestinal. Se les

atribuye un efecto protector del cncer de estmago e intestino. Las saponinas

presentes en las legumbres ejercen, as mismo, una influencia sobre diversos

factores inmunitarios, actan sobre determinados tipos de clula haciendo que se

produzcan ms anticuerpos. Las saponinas son capaces de captar y combinarse

con el colesterol alimentario en el intestino, e impedir as que pueda llegar a la

sangre. Adems, pueden captar tambin cidos biliares primarios y facilitar su

eliminacin del cuerpo (Palencia, 2003).

Las saponinas son irritantes celulares, aprovechndose en dosis

medicinales como expectorantes diurticos, por va oral, en dosis altas irritan la

mucosa bucofarngea y digestiva, produciendo un aumento de la secrecin de

todas las glndulas, lo cual aclara el mucus denso facilitando su expulsin y

consigue que el nuevo mucus que se forme fluya fcilmente, lo cual tambin se

refleja en los bronquios.

Las saponinas se producen de forma comercial y tienen mltiples usos:

agente emulsionante de grasas y aceites, protector de sustancias coloidales,

dentfrico, emulsificador de la industria fotogrfica. Se agrega a las bebidas para

la espuma y en extinguidores de incendios (Tocal y Rosende, 1986).


30

7.9.- Hemlisis. Una caracterstica muy importante que presentan las saponinas, es la

capacidad de provocar hemlisis en los eritrocitos, caracterstica que merece una

mencin especial; a continuacin se explica ste importante fenmeno.

En general, las membranas celulares son permeables al agua y a algunos

solutos e impermeables a otros, pero en equilibrio las concentraciones, y por

tanto, las presiones osmticas de un lado y otro de la membrana, son iguales.

Una situacin fisiolgica dada, se define en relacin con la concentracin de

soluciones en ambos lados de una membrana, si la presin osmtica es igual a

un lado y otro de la membrana, se habla de soluciones isosmticas o isotnicas;

si la solucin tiene menor presin se denomina hipotnica. Un ejemplo es el de

los glbulos rojos, suspendidos en soluciones de distinta concentracin; cuando

se colocan en agua o en soluciones salinas con menos de 320 miliosmoles

(equivalentes a 0.9 g de NaCl por 100 mL de agua), los glbulos rojos se hinchan

y se rompen debido a la tendencia de igualar la concentracin de solutos en el

interior del glbulo y en su exterior; las protenas no pueden salir del eritrocito y la

velocidad de entrada del agua supera con mucho a la velocidad de salida de los

solutos de pequeo tamao molecular; la pared del glbulo rojo no resiste esa

presin: el fenmeno de ruptura de los glbulos rojos se denomina hemlisis.

Cuando los glbulos rojos se colocan en soluciones con ms de 320 miiosmoles,

entra y sale la misma cantidad de agua y los glbulos estn en una solucin

isotnica. La isotonicidad entre todas las clulas y los compartimentos lquidos

debe de mantenerse constante; cualquier alteracin implica su correccin

inmediata para regresar al equilibrio. Por ejemplo, si se bebe mucha agua y la

sangre se diluye, la presin osmtica de la sangre baja y pasa ms agua, de la

sangre a los tejidos, el organismo tiende a restablecer el equilibrio eliminando

agua por va renal, mientras la concentracin de agua en los tejidos no vuelve al

estado normal.


31

8.- MATERIALES Y METODOS.

8.1.- Trabajo de gabinete. Esta parte consisti en una investigacin bibliogrfica continua, que

permiti reunir la informacin necesaria que fue bsica para la elaboracin del

marco terico del protocolo de la tesis, as como apoyo en el desarrollo de esta

investigacin y la discusin de los resultados obtenidos.

8.2.- Trabajo de campo. Colecta del fruto.

El rbol de Enterolobium cyclocarpum, se localiza en zonas subtropicales

y tropicales, en Michoacn se localiza en Tierra Caliente y la Costa Michoacana,

por lo que se consider necesario desplazarse al Municipio de Chinicuila,

Michoacn y recolectar los frutos en el periodo comprendido entre marzo y mayo.

La semilla se recolect de forma manual, puesto que en las fechas de la

colecta el rbol suelta los frutos y son recogidos directamente del suelo (antes

de que el ganado los consuma), para luego proceder a colocarlos en sacos de

yute para ser transportados al laboratorio. Los frutos colectados fueron usados

exclusivamente como muestras de laboratorio para analizar sus propiedades.

8.3.- Trabajo de laboratorio. El presente trabajo se realiz en el Laboratorio de Qumica de la Facultad

de Biologa de la Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo y su

desarrollo contempl las siguientes etapas:


32

8.3.1.- Proceso de separacin en seco.

Antes de comenzar con la extraccin del crudo de saponinas a partir del

fruto de Enterolobium cyclocarpum, se procedi a la separacin de las partes del

fruto de la siguiente manera:

- La primera parte fue separar la capa externa del fruto, en donde se encuentran

concentrados los azcares que forman la pulpa, misma que al encontrarse el

fruto seco se fue desprendiendo. Este procedimiento fue de forma manual.

- La segunda parte fue separar la fibra, que al encontrarse el fruto seco se fue

desprendiendo manualmente.

- La ltima parte fue la obtencin de la semilla, la cual tambin se separ

manualmente.

8.3.2.- Prueba de la espuma. Se colocaron en un matraz erlenmeyer 10g de muestra del fruto de Enterolobium cyclocarpum (pulpa, cscara, fibra) con 75 mL de agua destilada a

40 C aprox., inmediatamente se agit vigorosamente por cinco minutos. La

prueba se considera positiva si la espuma perdura por ms de 5 minutos. Esta

prueba fue realizada con el fin de determinar la presencia de saponinas.

8.3.3.- Tcnica de obtencin del crudo de saponinas. Se utiliz la cscara (epicarpio), la pulpa y la fibra (mesocarpio) del fruto

de Enterolobium ciclocarpum para la obtencin de crudos de saponina, los cuales

se molieron en un molino manual y se tamizaron.

La obtencin del crudo de saponinas, se realiz siguiendo la tcnica de

extraccin con etanol segn el proceder descrito por Domnguez (1979) mediante

el cual, el crudo de saponinas fue extrado con 300 mL de etanol acuoso al 80%


33

y 50g de muestra seca, haciendo el reflujo durante dos horas en un equipo

Soxhlet. El extracto se concentr por sequedad en Bao Mara para la

eliminacin del etanol. El extracto se disolvi en etanol acuoso al 50%, se le

aadi igual volumen de benceno saturado con etanol al 50% y se agit

vigorosamente.

Se repiti varias veces el proceso de extraccin y se elimin en cada paso

la fase bencnica con las grasas y colorantes vegetales. La fase hidroalcohlica

se evapor hasta la sequedad y se obtuvo un material de color pardo oscuro, que

es el crudo de saponinas. Se realizaron tres extracciones de la siguiente manera:

La primera extraccin se realiz a partir de la molienda y tamizado de 50g

de muestra seca (cscara, pulpa, semilla).

La segunda extraccin se realiz a partir de 50g de muestra seca, pero

solamente molida, sin tamizar.

Por ltimo, la tercera extraccin se realiz a partir de 40g de muestra seca,

pero sin moler ni tamizar.

8.3.4.- Prueba de Liebermann-Burchard.

La prueba de Liebermann-Burchard fue utilizada como una herramienta de

identificacin del tipo de saponinas presentes en el fruto de Enterolobium

cyclocarpum.

Se tomaron algunos mg del crudo de saponinas obtenido con 1 mL de

anhdrido actico y uno de cloroformo, se enfriaron a 0 C y se les aadi una

gota de cido sulfrico concentrado. Si hay formacin de colores azul, verde,

rojo, anaranjado, los que cambian con el tiempo, la prueba es positiva.


34

8.3.5.- Prueba de hemlisis.

Se procedi a la realizacin de la prueba de hemlisis con el fin de

comprobar que las saponinas presentes en el fruto de Enterolobium cyclocarpum

son capaces de producir hemlisis en las clulas sanguneas, la cual es una

caracterstica importante que presentan las saponinas

Se determin el porcentaje de hemlisis de las saponinas (obtenidas del

fruto de Enterolobium cyclocarpum) en eritrocitos. Se utiliz sangre humana, la

cual se puso directamente en contacto con las muestras del crudo de saponinas a

diferentes concentraciones.

A continuacin se muestra el cuadro en donde se presentaron y registraron

los resultados obtenidos. La primera columna muestra la concentracin del crudo

de saponinas, en la segunda columna se muestra la cantidad de buffer isotnico y

en la ltima columna el porcentaje de hemlisis en la sangre.

Cuadro 3.- Concentraciones de saponinas, buffer isotnico y porcentaje de

hemlisis.

(1) Muestra de saponinas

(mg/ mL)

(2) Buffer isotnico (mL)

(3) Porcentaje de hemlisis

en los eritrocitos.

10 0

8 2

6 4

4 6

2.0 8.0

1.8 8.2

1.6 8.4

1.4 8.6

1.2 8.8

1.0 9.0


35

(1) Muestras de saponinas: Se prepararon diluciones de los crudos de

saponinas en buffer isotnico. La primera dilucin fue solamente con 10

mL de crudo de saponinas, sin buffer isotnico. La segunda dilucin fue con

8 mL de crudo de saponinas diluido en 2 mL de buffer isotnico. La tercera

dilucin fue con 6 mL en 4 mL de buffer isotnico, y as sucesivamente

hasta lograr que el porcentaje de hemlisis causado por el crudo de

saponinas sea el menor posible.

(2) Buffer isotnico: Se disolvieron 3.95g de HNa2PO4.2H2O: 0.76g de H2 KPO4 y 7.20g de NaCl para 1 L de solucin a pH 7.4.

(3) Porcentaje de hemlisis: El porcentaje se midi a partir de la observacin

directa de los eritrocitos en el microscopio a 40X y 100X. Se puso en

contacto una gota de sangre con el crudo de saponinas a diferentes

diluciones en buffer isotnico y se observ al microscopio. Se observ a

qu nivel el crudo de saponinas disminuye o deja de producir hemlisis en

los eritrocitos, esto se manej de manera porcentual.

8.3.6.- Prueba de toxicidad.

Esta prueba fue realizada en el bioterio del Instituto de Investigaciones

Qumico-Biolgicas de la Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo.

Se utilizaron 2 ratones blancos y 2 ratas blancas. Fueron escogidos al azar

y colocados individualmente en jaulas.

A un ratn y a una rata se les administr el crudo de saponinas por medio

del alimento normal que consumen diariamente, mientras que a los otros

animales, una rata y un ratn, se les administr el crudo de saponinas por medio

del agua en sus bebederos, con una concentracin inicial de 50/50 mg/ mL con

una administracin diaria de 25 mL en ratn y 50 mL en rata.

El perodo experimental fue de dos meses, en el cual todos los roedores

fueron alimentados por la maana. Al trmino de cada semana se les pes y


36

diariamente se observ la excreta de los roedores; as tambin se les pes al

inicio y final del experimento.


37

9.- RESULTADOS Y DISCUSION. 9.1.- Prueba de la espuma. Se realiz una primera prueba de la espuma para determinar si haba o no la presencia de saponinas en el fruto de Enterolobium cyclocarpum. Por lo

que, se procedi a tomar una muestra de tal fruto (corteza, pulpa, fibra)

agregando agua destilada y agitndola para as, formar una espuma abundante.

Esta prueba result positiva, ya que al momento de agregar el agua destilada en la muestra y comenzar a agitar, comenz a formarse una espuma

abundante, la cual perdur por ms de cinco minutos, tiempo suficiente para

comprobar cualitativamente la presencia de saponinas en el fruto de

Enterolobium cyclocarpum. Los responsables de formar tal espuma son los

glicsidos que forman a las saponinas, los cuales se disuelven en agua y

disminuyen la tensin superficial de sta, de ese modo se aumenta la capacidad

de penetracin del agua y se facilita la formacin de pequeas gotas; por lo tanto

al momento de sacudir o agitar la solucin, se forma una espuma abundante, y

relativamente estable. Tal espuma formada es un sistema coloidal en el cual se

encuentran burbujas gaseosas dispersas en un lquido.

La presencia de espuma en el fruto de Enterolobium cyclocarpum, tambin

confirma su efecto limpiador, razn por la cual se ha utilizado desde la

antigedad para lavar ropa; as el fruto de parota ha sido utilizado como jabn

"natural".

El efecto limpiador de jabones y detergentes se debe en parte a su

accin como agentes emulsionantes para mantener las gotas de grasa

suspendidas en el agua, ya que en su molcula presenta una parte lipoflica

por medio de la cual se unen a la grasa o aceite, mientras que la otra parte de

la molcula es hidroflica, por lo que tiene afinidad con el agua as, el jabn

toma la grasa y la lleva al agua formando un conjunto soluble en agua, una

vez que el jabn es soluble en agua, sus molculas rodean las manchas o


38

grasa de cualquier tejido, formando un anillo alrededor denominado micela.

Tal como se muestra en la Figura 8.

Figura 8.- Mecanismo del efecto limpiador de jabones y detergentes.

En la figura 9 se puede observar la espuma formada en la muestra del

fruto de Enterolobium cyclocarpum al momento de agregarle el agua destilada y

se observa perfectamente el sistema coloidal que se forma.

Figura 9.- Prueba de la espuma


39

9.2.- Obtencin del crudo de saponinas. La obtencin del crudo de saponinas se realiz por medio de una

extraccin slido-lquido, en un equipo Soxhlet, tal como se muestra en la figura

10. En el extractor Soxhlet, el crudo de saponinas que se extrae est contenido

en un material slido (fruto de Enterolobium cyclocarpum), junto con otros

componentes, los cuales son celulosas, semi-celulosas y fibra, estos

componentes son prcticamente insolubles en el disolvente utilizado en la

extraccin. Como disolvente se utiliz el etanol acuoso al 80% debido a que es

un material voltil lo que facilita la obtencin del producto deseado.

Figura 10.- Extraccin con equipo Soxhlet.


40

A partir del fruto procesado (cscara, pulpa y fibra) de Enterolobium

cyclocarpum se procedi a extraer el crudo de saponinas. En la figura 11 se

puede observar el momento en que se extrae el crudo de saponinas a partir del

fruto de Enterolobium cyclocarpum en un equipo Soxhlet:

a)


41

b)

Figura 11.- Extraccin del crudo de saponinas a partir del fruto de Enterolobium

cyclocarpum.

Los crudos de saponinas obtenidos mediante tres extracciones con etanol

acuoso al 80% en un equipo Soxhlet, tienen la apariencia de una miel de color

pardo oscuro, que al enfriarse se solidifica, pero conserva su alta viscosidad

debido a la presencia de una gran cantidad de azcares, conservando un olor

fresco, hmedo y dulce, caracterstico del fruto, pero con un sabor demasiado

amargo.

Estas caractersticas se mantuvieron iguales en las tres extracciones, slo

difiriendo en la cantidad obtenida del crudo de saponinas, como se muestra en el

cuadro 4:


42

Cuadro 4.- Extracciones realizadas y crudo de saponinas obtenido del fruto

de Enterolobium cyclocarpum.

Extraccin etanol-

agua.

Muestra seca en

gramos.

Crudo de

saponinas

obtenido en

gramos.

Porcentaje

aprovechable del

crudo de

saponinas.

Primera

extraccin

50 g. (muestra

molida y

tamizada)

22.92 g 45.84%

Segunda

extraccin

50 g. (molida y

sin tamizar)

22.68 g 45.36%

Tercera

extraccin

50 g. (sin moler y

sin tamizar)

21.87 g 43.74%

La cantidad extrada de crudo de saponinas es considerablemente alta

como se puede observar en los resultados registrados en la tabla anterior. As

tambin, se comprob que el efecto de moler y tamizar la muestra no es

determinante al momento de obtener mayor o menor cantidad de crudo, porque

al concentrar ms la muestra no genera un extracto ms rico en crudo, esto es

debido a la alta solubilidad de las saponinas. Aunque para favorecer la extraccin

siempre es conveniente dar un tratamiento fsico previo, como lo es la molienda y

el tamizado, ya que si el tamao de la partcula es muy grande no se pone en

contacto con el solvente adecuadamente, pero si es muy pequeo, puede que se

apelmacen e impidan el movimiento del solvente. Se necesita que el slido tenga

una estructura porosa y abierta, o bien como en este caso, preparados en

tamao y forma que proporcionen mayor superficie de contacto y el disolvente se

mueva libremente.


43

9.3.- Prueba de Liebermann-Burchard. Para la identificacin del tipo de saponinas contenidas en el fruto de Enterolobium cyclocarpum se procedi a la utilizacin de un mtodo colorimtrico

cualitativo debido a que las saponinas dan coloraciones con diferente intensidad

al someterlas en contacto con varios reactivos cidos.

Los crudos de saponinas obtenidos a partir de la extraccin con etanol-

agua, resultaron positivos a la prueba de Liebermann- Burchard, ya que al

ponerse en contacto la muestra del crudo de saponinas con el reactivo (anhdrido

actico, cloroformo y cido sulfrico), hubo formacin de un color rojo oscuro, lo

cual es sugerente de saponinas triterpnicas. Esta prueba de identificacin del

tipo de saponinas presentes en el fruto de Enterolobium cyclocarpum es

netamente cualitativa. Sin embargo existen tcnicas de anlisis como la

cromatografa de lquidos o de gases para una identificacin exacta de los

compuestos, las cuales no fueron realizadas en esta investigacin debido a las

limitaciones con las que cuenta el laboratorio de Qumica.

9.4.- Prueba de hemlisis.

Una caracterstica que presentan las saponinas es la capacidad de

producir hemlisis en las clulas sanguneas, por lo que se procedi a realizar tal

prueba. Se tom una gota de sangre humana que se puso en contacto directo

con el crudo de saponinas y se procedi a observar en el microscopio.

El cuadro 5 muestra el porcentaje de hemlisis que presentaron los

eritrocitos al someterlos en contacto con el crudo de saponinas obtenido de la

extraccin etanol-agua del fruto (cscara, pulpa, fibra) de Enterolobium

cyclocarpum.


44

Cuadro 5.- Porcentaje de hemlisis en los eritrocitos.

(1) Muestra de saponinas (mg/mL))

(2) Buffer isotnico (mL.)

(3) Porcentaje de hemlisis en los eritrocitos

10 0 100

8 2 100 6 4 100 4 6 100 2.0 8.0 97 1.8 8.2 92-90 1.6 8.4 87-85 1.4 8.6 50-45 1.2 8.8 No hay hemlisis 1.0 9.0 No hay hemlisis

Como se puede observar en el cuadro anterior, el crudo de saponinas

obtenido presenta un alto porcentaje de hemlisis, el cual mantiene el mismo

margen hasta los 4 mL de muestra disueltos en 6 mL de buffer isotnico, esto

indica que aunque la cantidad de saponinas sea menor que el disolvente, estas

siguen manteniendo su alta potencia de produccin de hemlisis en los glbulos

rojos, caracterstica importante para determinar las propiedades de las

saponinas; as como, su identificacin. En la figura 12 se muestran los eritrocitos

con hemlisis al 100%, donde se observan todas las clulas sanguneas

hemolizadas:


45

a)

b)

Figura 12.- Muestra de eritrocitos con crudo de saponinas, hemlisis 100%. 100X


46

Se observ un cambio mnimo en el porcentaje de hemlisis en la

concentracin de 2 mL de crudo de saponinas disuelto en 8 mL de buffer

isotnico, presentando un porcentaje del 97% de hemlisis; aqu las saponinas

siguen conservando su alta potencia hemoltica, an cuando la muestra de

saponinas es menor que el disolvente. Las saponinas siguieron conservando un

alto porcentaje de hemlisis, entre el 90% y 85%, con las diluciones de 1.8 mL y

1.6 mL de crudo de saponinas disueltos en 8.2 mL y 8.4 mL de buffer isotnico,

respectivamente. La figura 13 y la figura 14 muestran tales porcentajes de

hemlisis:

a)


47

b)

Figura 13.- Eritrocitos con 92-90% de hemlisis.

40X


100 X


48

El porcentaje de hemlisis baj en las concentraciones 1.4 mL de crudo de

saponinas disuelto en 8.6 mL de buffer isotnico, presentando una baja en el

porcentaje de hemlisis del 50-45%. Tal como se muestra en la figura 15 y la

figura16:


40X


49

Figura 16.- Eritrocitos con 50-45% de hemlisis

100X.

El cambio drstico en el porcentaje de hemlisis se present en las

concentraciones 1.2 mL y 1.0 mL de crudo de saponinas diluido en 8.8 mL y 9.0

mL de buffer isotnico, respectivamente; al grado que los eritrocitos no

presentarn ningn efecto, ni de hemlisis ni ningn otro dao o cambio alguno,

los eritrocitos conservaron su forma normal, el porcentaje de hemlisis disminuy

debido a que la concentracin de crudo de saponinas es muy bajo, y en cambio,

la concentracin del disolvente es alta, por lo que la cantidad de saponinas debe

ser mnima para que no afecte a los clulas sanguneas y segn los resultados

obtenidos en esta investigacin la concentracin lmite de crudo de saponinas

para evitar la hemlisis est a parir de los 1.2 mL de crudo de saponinas disuelto

en 8.8 mL de buffer isotnico. Este cambio se puede observar en la figura 17 y la

figura 18:


50

Figura 17.- Eritrocitos sin hemolizar.

100 X

Figura 18.- Eritrocitos sin hemolizar.

40 X


51

Durante esta prueba se observ que no debe pasar mucho tiempo entre el

momento de preparar las concentraciones y el momento de observar el

fenmeno de hemlisis en los eritrocitos; debido a que, con el paso del tiempo la

mezcla entre las saponinas y el buffer comienza a descomponerse o degradarse

y al momento de ponerla en contacto con la sangre, los eritrocitos presentan otro

fenmeno llamado crenacin, el cual consiste en la deshidratacin de las clulas

debido a que la cantidad de sales es mayor en el exterior de las clulas que en el

interior de las mismas. La figura 19 muestra tal fenmeno:

Figura 19.- Eritrocitos crenados.

40 X

Tambin se observ que en las muestras que presentaron un alto

porcentaje de hemlisis de eritrocitos, se detect la presencia de eritrocitos

"fantasma" que son glbulos sin pigmentacin.


52

9.5.- Prueba de toxicidad.

Para probar qu tanta toxicidad, si es que la presenta, contiene el crudo de

saponinas obtenido del fruto de Enterolobium cyclocarpum se procedi a realizar

un experimento en el cual fueron sometidos ratas y ratones a dosis con el crudo

de saponinas disuelto en el agua y en el alimento diario que consumen

normalmente, como se muestra en la figura 20:

Figura 20.- Agua y alimento con el crudo de saponinas administrado a los animales

tratados.

Los animales tratados (rata blanca y ratn) para la prueba de toxicidad del

crudo de saponinas obtenido del fruto de Enterolobium cyclocarpum, presentaron

una aceptacin a la hora de administrarles el crudo, tanto en el alimento como

en el agua. En ningn momento demostraron rechazo al alimento o al agua, al

contrario siguieron consumiendo el alimento de forma normal, en el caso del

agua, los animales mostraron un mayor inters al consumirla, ya que desde el

primer momento en que se les administr empezaron a tomarla, sin mostrar

ningn rechazo.


53

La administracin del crudo de saponinas obtenido del fruto de Enterolobium cyclocarpum, a los roedores (rata blanca y ratn), tanto en el

alimento como en el agua, no demostr alteraciones en el comportamiento, ni en

la excreta de los animales tratados durante el perodo de experimentacin y lo

ms importante, la administracin del crudo de saponinas no produjo mortalidad

en ningn animal. A los animales se les administr la misma dosis a lo largo de

todo el experimento.

En el siguiente cuadro se observa que los animales, tanto el ratn como la

rata, tratados con la misma dosis en el alimento, mostraron un ligero incremento

en el peso corporal total al final del experimento. Sin embargo, este incremento

no es significativo.

Cuadro 6.- Pesos corporales de rata y ratn tratados con extractos de crudos

de saponinas y administrados en el alimento.

Rata Ratn

Peso corporal inicial g. 309 30

Peso final corporal g. 316.27 34.24

Ganancia total corporal

g.

7.27 4.24

La figura 21 se muestra al ratn tratado con el crudo de saponinas en el

alimento que consume diariamente:


54

Figura 21.- Ratn tratado con crudo de saponinas en el alimento.

As tambin, se administr el crudo de saponinas en el agua diaria de los

animales tratados, con una dosis diaria de 25 mL en ratn y 50 mL en rata con

una concentracin inicial de 50/50 mg/ml del crudo de saponinas. En la figura 22

y la figura 23 se muestra a la rata y ratn, tratados con el crudo de saponinas

disuelto en el agua:


55

Figura 22.- Rata tratada con crudo de saponinas en el agua.

Figura 23.- Ratn tratado con crudo de saponinas en el agua.


56

El cuadro 7 muestra los resultados obtenidos, los cuales demostraron un

incremento menor en el peso corporal final de los animales, teniendo una

ganancia mnima que no es significativa.

Cuadro 7.- Pesos corporales de rata y ratn tratados con extractos de crudos de saponinas y administrados en el agua.

Rata Ratn

Peso corporal inicial g. 283 30.5

Peso corporal final g. 294.58 36.72

Ganancia total corporal

g.

11.58 6.22

En ambas tablas se muestran resultados similares, hay ganancia de peso

corporal en los animales tratados, la cual en ambos casos es mnima, ya que

durante los dos meses que dur la experimentacin los animales no mostraron

un incremento significativo en el peso corporal final.


57

10.- CONCLUSIONES.

Del fruto de Enterolobium cyclocarpum (cscara, pulpa y fibra) se

obtuvieron y se extrajeron las siguientes cantidades de crudo de saponinas:

- Primera extraccin (50 g de muestra seca molida y tamizada): 22.92 g.

- Segunda extraccin (50 g muestra seca molida y sin tamizar): 22.68 g.

- Tercera extraccin (50 g muestra seca sin moler ni tamizar): 21.87 g.

Presentando el siguiente porcentaje aprovechable:

- Primera extraccin (50 g de muestra seca molida y tamizada): 45.84%

- Segunda extraccin (50 g muestra seca molida y sin tamizar): 45.36%

- Tercera extraccin (50 g muestra seca sin moler ni tamizar): 43.74%

Los crudos de saponinas obtenidos de las tres extracciones anteriores, as

como el fruto (cscara, pulpa, semilla) presentan las siguientes propiedades:

- Capacidad del fruto de Enterolobium cyclocarpum de formar una espuma

abundante al momento de agregarle agua y agitarlo, la cual perdura por

ms de cinco minutos, caracter

extraccionydeterminaciondepropiedadesdesaponinasobtenidasapa

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