extracciÓn y caracterizaciÓn de polisacÁridos con

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE CIENCIAS MARINAS

EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE POLISACÁRIDOS CON ACTIVIDAD

ANTICOAGULANTE A PARTIR DE ALGAS COLECTADAS EN BAJA CALIFORNIA SUR,

MÉXICO.

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS

EN MANEJO DE RECURSOS MARINOS

PRESENTA

MAURICIO MUÑOZ OCHOA

LA PAZ, B. C. S., MÉXICO. AGOSTO DE 2006

srP.14.

INSTITUTO POLITECNICO NACIONALSEcRETAnÍn oe tNvEsncectóH y poscRADo

ACTA DE REVISION DE IES/S

En la Ciudad de La Paz, B.C.S., siendo las 12:00 horas del día 21 del mes deAgosto del 2006 se reunieron los miembros de la Comisión Revisorade Tesis designada

CICIMARpor el Colegio de Profesores de Estudios de Posgrado e Investigación depara examinar la tesis de grado titulada:

..EXTRACCIÓN Y CARACTCNIZRCIÓI,¡ DE POLISAcÁRIoos coN ACTIVIDAD ANTICoAGULANTEA pARTIR DE ALGAS coLEcTADAS EN BAJA cALIFoRNtA suR. MÉxtco"

Presentada por el alumno:uuñoz OCHOA MAURICIO

Apellido paterno

Aspirante al grado de:Con registro

MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN MANEJO DE RECURSOS MARINOS

Después de intercambiar opiniones los miembros de la Comisión manifestaron s:l ApRoBAcroNDE LA rEs/s, en virtud de que satisface los requisitos señalados por las disposicionesreglamentarias vigentes.

LA COMISION

PRESIDENTE

aa.--DR. EVGUENI CHOUMILINE NIKOLAYEVICH

B 0 4 1 1 9 I

SECRETARIO

DR. RAFAEL CERV

I NSTITUTO POLITECN ICO NACIONALSEcREIA nia oe NVESTIGAcIÓv Y PosGRADo

aARTA ceslóru DE DEREcHos

En la Ciudad de '.Lj".P"?1..8_,-G.S., etdía 21 del mes Ag"p"":tp del año29-08 ........ , el (la) que suscribe MAuRrcro Muñoz ocHoA alumno(a) delPrograma decon número de registro 8041198 adscrito al cENTRo rNTERDtsctpLtNARto DE clENctAs MARINAsmanifiesta que es autor (a) intelectual del presente trabajo de tesis, bajo la dirección de:

on -.1 qs ús vnru ¡yr""u n1¡¡-o- Á¡v-an gz . y cede los derechos del trabajo titulado:

::"EXI"RAgc"lÓl! LqáRA"grEnlznclót¡ oe pousrcÁRrDos coN AclvtDAD ANIcoAGULANTE

.A-p""ABIlB'p"g.A1:"_c-A9-..goLEcrADAS EN BAJA cALtFoRNtA sun, ¡ilÉxlco"al Instituto Politécnico Nacional, para su difusión con fines académicos y de investigación.

Los usuarios de la información no deben reproducir el contenido textual, gráficas o datos del trabajosin el permiso expreso del autor y/o director del trabajo. Este puede ser obtenido escribiendo a lasiguiente dirección: AMg;g@lpISi el permiso se otorga, el usuario deberá dar el agradecimiento correspondiente ymismo.

nombre y firma

citar la fuente del

ii

Agradecimientos Quiero agradecer a mi director de tesis Dr. Jesús Iván Murillo Álvarez, por su

ardua labor, paciencia (¡vaya que si es paciente!), por su apoyo y sobre todo por su

amistad, que fue fundamental para el desarrollo de este trabajo de tesis. Agradezco

al comité revisor; Dra. Silvie Dumas, Dr. Jesús Iván Murillo Álvarez, Dr. Gustavo

Hernández Carmona, Dr. Evgueni Choumiline, Dr. Rafael Riosmena Rodríguez y Dr.

Benjamín Ánguas Vélez por el extraordinario trabajo de revisión y edición de este

manuscrito. Agradezco al Grupo de Química de Macroalgas de la Planta Piloto de

Producción de Alginatos, especialmente a la M. en C. Elizabeth Rodríguez

Montesinos, a la M. en C. Dora Luz Arvizu Higuera y al Dr. Gustavo Hernández

Carmona, por el apoyo prestado en todo momento. Los agradecimientos son

extensivos a la M. en C. Gloria Margot Parada Sánchez por habernos proporcionado

el alga Eisenia arborea para este trabajo, al Ing. Raciel Palma Romero por su apoyo

en la puesta en marcha de los ensayos de actividad anticoagulante, a la Dra. Luz

Elena Mateo Cid y a la Biol. Catalina Mendoza González por la identificación

taxonómica del material algal estudiado. También agradezco a la Dra. Rosalba

Encarnación Dimayuga por permitirnos el acceso al espectrómetro de infrarrojo.

Agradezco al Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas del Instituto

Politécnico Nacional y a su plantilla de profesores. Al Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnología, por la beca de manutención no. de registro 188736. Agradezco también

a las instituciones que financiaron esta tesis a través de los proyectos: “Búsqueda de

nuevos quimiotipos antibacterianos en algas colectadas en las costas de Baja

California Sur (SEP-2004-47942/A-1)” y “Estudio de dos algas pardas, Eisenia

arborea y Colpomenia sp., como fuente de polisacáridos sulfatados con actividad

anticoagulante (IPN-CGPI 20050324)”.

Agradezco especialmente a mi familia; Laura, Angelito, Benjamín, Luly, Juan

Gabriel y Liduvina, ya que sin su respaldo me hubiese sido muy difícil continuar con

mi trabajo. Por último agradezco a todos aquellos que directa o indirectamente

contribuyeron o me brindaron su apoyo.

iii

ÍNDICE

Página

LISTA DE TABLAS v

LISTA DE FIGURAS vi

GLOSARIO ix

Resumen xi

Abstract xiii

1. INTRODUCCIÓN ……………………………………………………………… 1

2. ANTECEDENTES …………………………………………………………….. 4

2.1. Características de los polisacáridos sulfatados algales ……………. 4

2.2. Actividad biológica de los polisacáridos sulfatados …………………. 8

2.3. Los mecanismos de la coagulación sanguínea y la actividad

anticoagulante de los polisacáridos sulfatados de origen algal ………….

9

3. PLANTEAMIENTO Y JUSTIFICACIÓN …………………………………….. 18

4. OBJETIVOS ……………………................................................................. 20

5. MATERIAL Y MÉTODOS …………………………………………………….. 21

5.1. Estudio del potencial algal encontrado en Baja California Sur como

fuente de compuestos con actividad anticoagulante ……………………..

21

5.1.1. Recolección e identificación taxonómica de algas ………….. 21

5.1.2. Obtención de los extractos crudos ……………………………. 21

5.1.3. Ensayos de actividad anticoagulante ………………………… 21

5.1.4. Análisis de los datos de actividad anticoagulante …………... 23

5.2. Aislamiento y caracterización de la fracción con actividad

anticoagulante, a partir del alga seleccionada (Eisenia arborea) de la

librería de extractos acuosos, como la más activa ………………………..

23

5.2.1. Obtención de extractos a partir de Eisenia arborea ………… 24

5.2.2. Fraccionamiento del extracto MM049F1 de Eisenia arborea. 24

5.2.3. Caracterización parcial de las fracciones polisacáridas

obtenidas a partir de Eisenia arborea ………………………………...

26

iv

6. RESULTADOS 29

6.1. Sobre el potencial del recurso algal de Baja California Sur como

fuente de polisacáridos anticoagulantes …………………………………...

29

6.2. Sobre el aislamiento y caracterización de la fracción con actividad

anticoagulante, a partir de Eisenia arborea ………………………………..

34

7. DISCUSIÓN 40

7.1. Sobre el potencial del recurso algal de Baja California Sur como

fuente de polisacáridos anticoagulantes …………………………………...

40

7.2. Sobre la caracterización y actividad anticoagulante de las

fracciones obtenidas a partir de Eisenia arborea ………………………….

42

8. CONCLUSIONES 51

9. RECOMENDACIONES PARA TRABAJOS FUTUROS 52

10. LITERATURA CITADA 53

ANEXO A. Tabla de actividad anticoagulante de los 41 extractos acuosos

determinada según los ensayos de tiempo de protrombina y tiempo de

tromboplastina parcial activada …………………………………………………

63

v

LISTA DE TABLAS

Página

Tabla 1. Nombre y función biológica de las proteínas plasmáticas que

actúan como factores de la coagulación ………………………..

12

Tabla 2. Listado de algunas algas con actividad anticoagulante ………. 16

Tabla 3. Lista de algas colectadas para este estudio …………………… 30

Tabla 4. Porcentaje de los extractos activos en los ensayos de tiempo

de protrombina y tiempo de tromboplastina parcial activada …

33

Tabla 5. Rendimiento y actividad anticoagulante de los extractos

obtenidos por precipitación fraccionada a partir de Eisenia

arborea ……………………………………………………………..

34

Tabla 6. Composición química de las fracciones CC2F1, CC2F2 y

CC2F3 obtenidas a partir de Eisenia arborea ………………….

37

Tabla 7. Resultado del análisis de varianza para tiempo de

tromboplastina parcial activada ………………………………….

63

Tabla 8. Resultado de la prueba de Tukey para tiempo de

tromboplastina parcial activada ………………………………….

63

Tabla 9. Resultado del análisis de varianza para tiempo de

protrombina ………………………………………………………...

64

Tabla 10. Resultado de la prueba de Tukey para tiempo de protrombina 64

vi

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1. Modelo estructural del fucoidan extraído a partir de Fucus

vesiculosus propuesto por : a) Percival y McDowell (1967); b)

Patankar et al. (1993) ……………………………………………

2

Figura 2. Estructura de dos glucosaminoglucanos comunes. a)

Heparina: 2-sulfato de D-glucuronato α(1→4) 6-sulfato de N-

sulfo-D-glucosamina α(1→4); b) Condroitin sulfato: D-

glucuronato β(1→3) N-acetil-D-glucosamina β(1→4) …………

4

Figura 3. Estructura de la agarosa [R1 = R2 =R3 = H] y de la

agaropectina [R1 = H, R2 = SO32-, R3 = H, SO3

2-] ………………

5

Figura 4. Estructura básica de algunos carragenanos. a) ι−carragena-

no, b) κ−carragenano, c) λ−carragenano ……………………….

6

Figura 5. Representación esquemática de los reacciones en cascada

que conducen a la formación de fibrina (Reproducido de:

Quintana-González, 2002) ……………………………………….

11

Figura 6. Ubicación de las localidades en donde se recolectó el

material algal estudiado: 1. Isla Natividad, 2. Punta Eugenia,

3. Laguna de San Ignacio, 4. San Juan de la Costa, 5. Playa

La Concha, 6. Isla La Gaviota, 7. Playa Balandra ……………..

22

Figura 7. Esquema que muestra el proceso de obtención de extractos a

partir de Eisenia arborea ………………………………………….

25

Figura 8. Esquema que muestra el fraccionamiento del extracto

MM049F1 obtenido a partir de Eisenia arborea ………………..

27

Figura 9. Muestra el efecto de cada extracto crudo obtenido a 25°C con

respecto al tiempo control de protrombina. Los extractos

activos se indican con barras sólidas …………………………..

31


respecto al tiempo control de protrombina. Los extractos

vii

activos se indican con barras sólidas …………………………… 31


respecto al tiempo control de tromboplastina parcial activada.

Los extractos activos se indican con barras sólidas …………..

32

Figura 12. Muestra el efecto de cada extracto crudo obtenidos a 80°C

con respecto al tiempo control de tromboplastina parcial

activada. Los extractos activos se indican con barras sólidas .

32

Figura 13. Gráfico que muestra la relación entre la concentración y el

efecto anticoagulante del extracto MM049F de Eisenia

arborea en el ensayo de tiempo de protrombina ……………...

33

Figura 14. Gráfico que muestra el patrón de elusión y fraccionamiento

del extracto MM049F1 de Eisenia arborea ……………………..

35

Figura 15. Gráfico que muestra la relación entre la concentración de las

fracciones obtenidas de MM049F1 y su efecto sobre el tiempo

normal de coagulación según en el ensayo de TP …………..

36

Figura 16. Gráfico que muestra la relación entre la concentración de las

fracciones obtenidas de MM049F1 y su efecto sobre el tiempo

normal de coagulación según el ensayo de TTPA …………….

36

Figura 17. Cromatograma del producto de hidrólisis de las fracciones

CC2F1 y CC2F2. 1) L-fucosa, 2) hidrolizado de CC2F1, 3)

hidrolizado de CC2F2, 4) D-galactosa, 5) ácido D-

galacturónico. Fase móvil: propanol: NH4OH: H2O (6:2:1) ……

38

Figura 18. Modelo estructural parcial propuesto para el fucano

anticoagulante CC2F2 extraído a partir de Eisenia arborea ….

39

Figura 19. Muestra el espectro de infrarrojo de la fracción CC2F1

obtenida a partir del extracto MM049F1 ………………………...

43

Figura 20. Muestra los espectros de infrarrojo de la fracción CC2F1

obtenida a partir del extracto MM049F1 (A), y del alginato de

sodio (B) obtenido de Eisenia arborea ………………………….

44

Figura 21. Muestra el espectro de resonancia magnética nuclear de 13C

de la fracción CC2F1 ……………………………………………...

45

viii

Figura 22. Muestra el espectro de infrarrojo de la fracción CC2F2

obtenida del extracto MM049F1 de Eisenia arborea …………..

47

Figura 23. Muestra el espectro de resonancia magnética nuclear de 1H

de la fracción CC2F2 obtenida del extracto MM049F1 de

Eisenia arborea …………………………………………………….

48

ix

GLOSARIO

Absorbancia: Medida de la fracción de luz que es absorbida por una

muestra.

Acetilo: Forma orgánica de presentación del ácido acético.

Almidón: Polisacárido compuesto fundamentalmente por glucosa el cual

se puede separar en amilosa y amilopectina.

Anticoagulante: En medicina y farmacia, una sustancia endógena o exógena

que interfiere o inhibe la coagulación de la sangre.

Antiangiogénica: En medicina y farmacia es una sustancia endógena o

exógena que interfiere o inhibe formación de vasos

sanguíneos nuevos a partir de los vasos preexistentes.

Arteriolas: Pequeñas ramas que salen de las arterias.

Calicreína: Proteína pequeña, sintetizada en diversos tejidos como

glándulas salivales, sistema nervioso central y aparato

cardiovascular.

Caolín: Arcillas en las que predomina el mineral caolinita.

Celulosa: Polisacárido compuesto de glucosa constituyente de la pared

celular de los vegetales.

Coágulo: Sangre solidificada por agregación plaquetaria y fibrina.

Vaso constricción: Estrechamiento de los vasos sanguíneos.

Cromatografía: Conjunto de técnicas analíticas basadas en la separación de

los componentes de una mezcla y su posterior detección.

Diálisis: En química, proceso por el cual las sales minerales son

retiradas de un fluido a través de una membrana

semipermeable por difusión pasiva.

Endotelio: Capa de células que cubre el interior de los vasos

sanguíneos, como una epidermis que facilita el

desplazamiento de la sangre.

Enzima: Proteína capaz de catalizar una reacción química.

x

Espectroscopia: Técnica analítica experimental que se basa en detectar la

absorción de la radiación electromagnética, y relacionarla con

los niveles de energía implicados en la transición cuántica.

Hemólisis: Ruptura o descomposición de eritrocitos.

Hidrocoloide: Sistema físico compuesto por dos fases: una continua,

normalmente fluida, y otra dispersa en forma de partículas.

Heparinoide: Sustancia similar a la heparina.

Inhibidor: Sustancia química que evita que un proceso se detenga o se

lleve a cabo.

Intercambio iónico: Es la sustitución de iones de una disolución por otros iones

con la misma carga.

Liofilización: Consiste en sacarle el agua a una sustancia congelada

saltándonos el paso por el estado líquido.

Mucopolisacárido: Refiérase a glucosaminoglucanos o glucoproteínas.

Polisacárido: Son polímeros formados por monosacáridos, que se unen

mediante enlaces glucosídicos.

Proteasa: Enzimas que rompen los enlaces peptídicos.

Priones: Son partículas acelulares patógenas y transmisibles que se

caracterizan por producir enfermedades que afectan al

sistema nervioso central.

Policarboxilato: Sustancia que contiene varios grupos de ácido carboxílico

desprotonado formando aniones carboxilato.

Quininógeno: Proteína plasmática.

Singulete En espectroscopia de resonancia magnética nuclear, termino

que se refiere a una señal sin multiplicidad.

Trombo: Coágulo sanguíneo que se forma en un vaso.

Trombocitopenia: Trastorno en el cual se presenta un número de plaquetas

insuficiente.

Zimógeno: Forma inactiva de una enzima.

xi

EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE POLISACÁRIDOS CON ACTIVIDAD ANTICOAGULANTE A PARTIR DE ALGAS COLECTADAS EN BAJA CALIFORNIA SUR, MÉXICO. RESUMEN

Se realizó una evaluación preliminar de macroalgas de Baja California Sur (México)

en búsqueda de nuevas fuentes de polisacáridos con propiedades moduladoras de la

coagulación sanguínea. Se colectaron veintiún especies algales en diferentes

localidades de Baja California Sur. Cada especie fue sucesivamente extraída con

agua destilada a 25 y 80°C. Los extractos fueron sometidos a los ensayos de tiempo

de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA). De los 41

extractos ensayados, 9 (22%) mostraron actividad en el ensayo de TP, y 29 (70%)

fueron activas en el ensayo de TTPA. El extracto obtenido a 25°C a partir de Eisenia

arborea fue el más activo, incrementando el TP y TTPA control a más de 300 s a una

concentración de 322.3 μg mL-1. El extracto de Eisenia arborea se seleccionó para

ser sometido a análisis adicional hasta caracterizar la estructura y actividad de la

fracción anticoagulante.

En la segunda parte de este estudio, 100 g de Eisenia arborea seca y molida

fueron extraídos con agua a 25°C. El extracto se precipitó diferencialmente con

etanol, y se obtuvieron 3 fracciones (MM049F1, MM049F2 y MM049F3). El tejido

algal residual se sometió a dos pasos adicionales de extracción con agua a 80°C

dando las fracciones MM049C1 y MM049C2. De las 5 fracciones obtenidas a partir

de Eisenia arborea, MM049F1 se seleccionó para fraccionamiento. 1.85 g de

MM049F1 fueron disueltos en 20 mL de agua destilada y precipitados con etanol

para dar 1.237 g. De ellos, 1.022 g se fraccionaron por cromatografía de intercambio

iónico sobre DEAE-celulosa. La muestra se eluyó con soluciones acuosas de cloruro

de sodio (0.5, 1.0 y 2.0 M). El patrón de fraccionamiento se monitoreo por medio de

la reacción del fenol-H2SO4. Se obtuvieron 3 fracciones (CC2F1, CC2F2 y CC2F3).

La fracción CC2F2 eluída con cloruro de sodio 1 M fue la más activa, mostrando un

TP y TTPA >300 s. El espectro de infrarrojo de la fracción CC2F2 mostró bandas de

xii

absorción a 3470, 1730, 1640, 1245, 1035, 840 y 820 cm-1 las cuales son típicas de

fucanos sulfatados. El análisis químico mostró que CC2F2 contenía 56% de

azúcares totales (31.6% fucosa y 1.3% ácidos urónicos) y 45% de sulfatos totales.

En conclusión, de los 41 extractos ensayados, el obtenido a partir de Eisenia arborea

a 25°C fue el más activo en los ensayos de TP y TTPA. El fraccionamiento de

MM049F1 nos condujo al aislamiento de 3 fracciones. La fracción más activa se

identificó como un heterofucano sulfatado caracterizado por fucosa unida por enlaces

(1→3) y una alta proporción de grupos éster sulfato en posición axial al C-4 y/o

grupos acetato.

xiii

EXTRACTION AND CHARACTERIZATION OF POLYSACCHARIDES WITH ANTICOAGULANT ACTIVITY FROM SEAWEEDS COLLECTED FROM BAJA CALIFORNIA SUR, MEXICO.

ABSTRACT

A preliminary assessment of macroalgae from Baja California Sur (Mexico)

was conducted in search for new sources of polysaccharides with blood clotting

properties. Twenty one algal species were collected at different localities from Baja

California Sur. Each species was successively extracted with distilled water at 25 and

80°C. Extracts were subjected to the protrombin time (PT) and activated partial

tromboplastin time (APTT) assays. From the 41 extracts tested, 9 (22%) shown

activity on the PT, and 29 (70%) on the APTT. The extract obtained at 25°C from

Eisenia arborea was the most active, increasing the control PT and APTT to more

than 300 s at 322.3 μg mL-1. The Eisenia arborea extract was selected for further

analysis in order to characterize the structure and activity of the anticoagulant

fraction.

In the second part of this study, 100 g of dry and milled Eisenia arborea were

extracted with water at 25°C. The extract was differentially precipitated with ethanol,

and 3 fractions were obtained (MM049F1, MM049F2 and MM049F3). The residual

algal tissue was subjected to additional extraction steps with water at 80°C giving the

fractions MM049C1 and MM049C2. From the 5 fractions obtained from Eisenia

arborea, MM049F1 was selected for further fractionation. 1.85 g of MM049F1 were

dissolved in 20 mL of distilled water and precipitated with ethanol to give 1.237 g.

From which, 1.022 g were fractionated by ion exchange chromatography on DEAE-

cellulose. Sample was eluted with aqueous solutions of sodium chloride (0.5, 1.0 and

2.0 M). The fractionation pattern was monitored by the reaction of the phenol-H2SO4.

Three fractions were obtained (CC2F1, CC2F2 and CC2F3). Fraction CC2F2 eluted

with 1.0 M sodium chloride was the most active one, showing a PT and APTT >300 s.

The spectrum of infrared of the fraction CC2F2 showed bands of absorption at 3470,

1730, 1640, 1245, 1035, 840 and 820 cm-1 which are typical for sulfated fucans. The

xiv

chemical analysis showed that CC2F2 contained 56% of total sugars (31.6% fucose,

1.3% uronic acids), and 45% of total sulfates. In conclusion, from the 41 extracts

tested, the extract at 25°C from Eisenia arborea was the most active in the PT and

APTT assays. The fractionation of MM049F1 leads us to the isolation of 3 fractions.

The most active fraction was identified as a sulfated heterofucan, characterized by

fucose linked by bonds (1→3), and a high proportion of esther sulfate groups in axial

position to the C-4 and/or acetates groups.

1

1. INTRODUCCIÓN

En el área de las ciencias químico-biológicas, el estudio de los polisacáridos

representa una nueva frontera en la elucidación de procesos biológicos

fundamentales y en la identificación de nuevas sustancias de interés farmacéutico

(Jelinek y Kolusheva, 2004). Además de los polisacáridos de reserva (almidón y

glucógeno) y estructurales (celulosa y quitina), existe otra clase de polisacáridos

comúnmente sulfatados, que se encuentran ampliamente distribuidos en la

naturaleza. Estos polisacáridos sulfatados poseen una variedad de funciones

biológicas (Toida et al., 2003). Entre ellos, el fucoidan ha sido uno de los más

estudiados en las últimas dos décadas debido a sus numerosas actividades

biológicas: anticoagulante, antitrombótica, anti-inflamatoria, antitumoral y antiviral,

por nombrar algunas (Chevolot et al., 1999; Chizhov et al., 1999; Shanmugam y

Mody, 2000). Fucoidan es el término dado a una familia de polisacáridos ricos en

L-fucosa que pueden contener pequeñas cantidades de otros azúcares como

galactosa, xilosa, manosa y ácidos urónicos. Los fucoidanos solo se encuentran en

las algas cafés (Chevolot et al., 1999) y en algunos invertebrados marinos (Hirohashi

et al., 2002; Albuquerque et al., 2004). En bacterias, se han encontrado polisacáridos

con cantidades significativas de fucosa, pero no son considerados propiamente como

fucoidanos (Guetta et al., 2003).

Debido a la alta heterogeneidad natural de los fucoidanos, cada vez que se

extraen a partir de cualquier alga, estos deben ser tratados como una nueva entidad,

puesto que su composición varía con la especie, la parte del alga, el método de

extracción, la estación de cosecha y las condiciones climáticas (Silva et al., 2005). Es

decir, el fucoidan no tiene una estructura única. El primer modelo estructural para el

fucoidan extraído de Fucus vesiculosus proponía que se encontraba constituido por

L-fucosa con uniones α(1→2) y grupos éster sulfato en los carbonos 3 y 4 de la

fucosa (Percival y McDowell, 1967). Años después se revisó el modelo propuesto y

se concluyó que el fucoidan de Fucus vesiculosus estaba constituido por L-fucosa

con uniones α(1→3) con sustitución de grupos éster sulfato en C4 (Figura 1)

(Patankar et al., 1993). Posteriormente se ha reportado que los grupos éster sulfato

2

estaban unidos, principalmente, a la posición 4 de la L-fucosa con algunas

sustituciones en los carbonos 2 o 3. (Chevolot et al., 1999).

Figura 1. Modelo estructural del fucoidan extraído a partir de Fucus vesiculosus propuesto por: a) Percival y McDowell (1967); b) Patankar et al. (1993).

La actividad anticoagulante del fucoidan es semejante a la de la heparina.

Esto ha estimulado el estudio de los fucoidanos, como alternativa en la terapia

anticoagulante y antitrombótica. Sin embargo, la gran heterogeneidad estructural del

fucoidan complica su caracterización química. Por ello, no ha sido fácil establecer

detalladamente las relaciones existentes entre la estructura del fucoidan y su

actividad anticoagulante (Chizhov et al., 1999; Pereira et al., 2002).

En nuestro país, los estudios acerca de los polisacáridos sulfatados algales y

su actividad anticoagulante son escasos. Debido a la poca información existente en

esta área, se consideró de interés explorar el potencial del recurso algal de Baja

California Sur como una fuente de polisacáridos sulfatados con propiedades

anticoagulantes. La primera parte de este trabajo consistió en el estudio de la

→2)-α-L-Fuc-(1→2)-α-L-Fuc-(1→2)-α-L-Fuc-(1→

α-L-Fuc-4(SO3)1→

3


SO3

4

→- SO3

4

→- SO3

4

→-

SO3

4

→ - SO3

4

→-

a)

b)

-


α-L-Fuc-4(SO3)1→

3


SO3

4

→- SO3

4

→- SO3

4

→-

SO3

4

→ - SO3

4

→-

a)

b)


α-L-Fuc-4(SO3)1→

3


SO3

4

→- SO3

4

→- SO3

4

→-

SO3

4

→ - SO3

4

→-


α-L-Fuc-4(SO3)1→

3

α-L-Fuc-4(SO3)1→

3


SO3

4

→-SO3

4

→- SO3

4

→-SO3

4

→- SO3

4

→-SO3

4

→-

SO3

4

→ -SO3

4

→ - SO3

4

→-SO3

4

→-

a)

b)

-

3

actividad anticoagulante de un grupo de extractos algales. La actividad se midió por

medio de los ensayos de tiempo de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina

parcial activada (TTPA). Los extractos estudiados se obtuvieron a partir de 21 algas

(9 rodofitas, 7 feofitas y 5 clorofitas) recolectadas en diferentes localidades de Baja

California Sur. La segunda parte del trabajo se llevó a cabo con base en el estudio de

actividad anticoagulante. Para ello, se seleccionó el extracto algal más activo según

los ensayos de TP y TTPA, con la idea de aislar y caracterizar la fracción

polisacárida más activa. En este sentido, el extracto acuoso obtenido a 25°C a partir

del alga café Eisenia arborea se fraccionó por medio de cromatografía de

intercambio iónico. La actividad de las fracciones obtenidas se midió por medio de

los ensayos de TP y TTPA. La caracterización estructural se realizó por medio de

análisis químico y espectroscópico.

4

2. ANTECEDENTES 2.1. Características de los polisacáridos sulfatados algales

En general, los polisacáridos sulfatados son polímeros que contienen en su

estructura una cantidad de grupos sulfatos esterificados con los azúcares. Estos se

encuentran principalmente en algas, animales y bacterias (Shanmugam y Mody,

2000; Giroldo y Vieira, 2002). Los animales sintetizan glucosaminoglucanos

(= mucopolisacáridos) constituidos por amino-azúcares y ácidos urónicos (Figura 2).

Entre ellos se encuentran la heparina, el condroitin sulfato, el keratan sulfato y el

hialuronan sulfato (Yalpani, 1988; Toida et al., 2003). En las bacterias, la variedad

estructural de los polisacáridos sulfatados y sus propiedades es muy amplia.

Generalmente, se encuentran involucrados en los procesos de reconocimiento

celular (Yalpani, 1988).

Figura 2. Estructura de dos glucosaminoglucanos comunes. a) Heparina: 2-sulfato de D-glucuronato α(1→4) 6-sulfato de N-sulfo-D-glucosamina α(1→4). b) Condroitin sulfato: D-glucuronato β(1→3) N-acetil-D-glucosamina β(1→4).

En las algas marinas, la estructura primaria de los polisacáridos sulfatados

varía en composición y secuencia monomérica, peso molecular, configuración

anomérica, posición del enlace glucosídico y densidad de cargas. Estas variaciones

estructurales dependen del tipo de alga que los produce y de la manera en que ellas

responden al medio ambiente (Yalpani, 1988).

a b

OSO3

OOOC

OH

O

O

O3SO

NHSO3

OH

O

O

NHCOCH3

O3SO

OO

OOC

O

OSO3

O

OH

O

HO

n n

5

La diversidad estructural de los polisacáridos sulfatados explica su amplio

rango de propiedades físicas, químicas y biológicas, algunas de las cuales han

encontrado uso en múltiples aplicaciones.

Las algas rojas contienen principalmente galactanos; agar y carragenanos. De

entre ellas, las algas pertenecientes a los géneros Gracilaria, Gelidium, Gelidiela y

Gracilariopsis, entre otras, sintetizan agar. El agar está constituido por dos fracciones

polisacáridas; la agarosa y la agaropectina (Figura 3). La agarosa es el componente

principal, y presenta alrededor del 70% del total. Tanto la agarosa como la

agaropectina tienen la misma estructura básica constituida por unidades alternas de

galactosa y 3,6-anhidrogalactosa, ambas en forma piranosa. Las unidades se

enlazan por uniones αL(1→3) y βD(1→4), también en forma alternada (Yalpani,

1988). A diferencia de la agarosa, la agaropectina posee alto contenido de sulfato y

piruvato (Lahaye et al., 1985; Armisen y Galatas, 1987).

Figura 3. Estructura de la agarosa [R1= R2= R3= H] y de la agaropectina [R1= H, R2= SO3

2-, R3= H, SO32-].

Las algas pertenecientes a los géneros, Gigartina, Kappaphycus y Euchema

contienen carragenanos, los cuales están formados por unidades de galactosa y/o

3,6-anhidrogalactosa, con o sin grupos sulfatos, unidas por enlaces alternos

αD(1→3) y βD(1→4). Dependiendo del grado y patrón de sulfatación y de la

presencia de 3,6-anhidrogalactosa se distinguen varios tipos de carragenano. Cada

O

O

O

O

O

OH

R2O

O

OR3

OR1

n

6

tipo de carragenano tiene propiedades hidrocoloidales únicas. Existen alrededor de

una docena de carragenanos. La Figura 4 muestra la estructura del kappa (κ), iota (ι)

y lambda (λ) carragenano (Yalpani, 1988).

Figura 4. Estructura básica de algunos carragenanos. a) ι−carragenano, b) κ−carragenano, c) λ−carragenano.

O

O

O

O

O

OH

HO

O

OSO3

OSO3

OSO3

OSO3

HO

OH

O

O

O

O

O

OH

O3SO

OSO3

OH

O

HO

OH

O

O

O

O

O

n

n

n

7

Es interesante notar que algunas algas rojas contienen polisacáridos

estructuralmente híbridos. Por ejemplo, a partir de Digenea simplex se aisló un

polisacárido constituido por unidades de agarobiosa (4-O-β-D-galactopiranosil-3,6-

anhidro-L-galactosa) y carragenobiosa (4-O-β-D-galactopiranosil-3,6-anhidro-D-

galactosa), lo que sugiere una estructura alterna entre agar y carragenano (Takano

et al., 2003). Otro ejemplo es el de las algas Corallina pilulifera y Georgiella confluens

de donde se han obtenido xilogalactanos denominados agaranos (Usov et al., 1997;

Kolender y Matulewicz, 2002).

En las clorofitas se han encontrado polisacáridos sulfatados con estructura y

composición monomérica diversa, por ejemplo algunas especies del género Codium

producen arabinanos sulfatados que son polímeros de arabinosa con uniones

α(1→5). En algas de este género también se han encontrado arabinogalactanos

sulfatados y en algas del género Monostroma se han obtenido ramnanos sulfatados

(Shanmugam y Mody, 2000).

Las algas cafés producen polisacáridos sulfatados compuestos por fucosa,

grupos sulfato y cantidades menores de otros azúcares como xilosa, galactosa y

ácidos urónicos. Estos polisacáridos son denominados comúnmente como fucanos.

La estructura de los fucanos es muy variada por lo que debe ser estudiada como un

compuesto nuevo cada vez que se aísla de una fuente nueva (Chevolot et al., 1999).

Los fucanos, también llamados fucoidanos o fucoides, se encuentran principalmente

en algas cafés, aunque también se encuentran en algunos equinodermos como los

erizos y los pepinos de mar (Nardella et al., 1996). Existe diferencia estructural entre

los fucanos aislados de los equinodermos y los obtenidos a partir de las feofitas. A

diferencia de los fucanos algales, los encontrados en los equinodermos, son

polímeros de estructura lineales y con un patrón de sulfatación regular. Mientras que,

como ya se ha mencionado antes, los fucanos de origen algal pueden presentar

pequeñas ramificaciones y un patrón de sustitución diverso, lo cual complica su

análisis. Debido a esta razón, en la mayoría de los casos solo se obtiene información

parcial de su estructura (Bilan et al., 2004). Los fucanos se agrupan en dos tipos;

homofucanos y heterofucanos. Los primeros se caracterizan por estar constituidos

por L-fucosa (>95%), mientras que los heterofucanos poseen una proporción menor

8

de ésta (Duarte et al., 2001). La composición de los fucanos varía de especie a

especie, por lo que no son una estructura única, sino un grupo de entidades

estructurales diversas, que incluye al ascophyllan, sargassan, glucuronofucoglucano

y el fucoidan (Rupérez et al., 2002; Fitton, 2005).

2.2. Actividad biológica de los polisacáridos sulfatados Debido a su alta heterogeneidad estructural, los polisacáridos sulfatados

presentan una amplia gama de actividades en diversos sistemas biológicos. Por

ejemplo, una fracción polisacárida compuesta principalmente de L-galactosa, D-

galactosa y sulfatos, obtenida a partir de Gracilaria corticata, mostró actividad

inhibitoria contra los virus Herpex simplex tipo HVS-1 y HVS-2 a concentraciones de

0.19 y 0.24 μg mL-1 (Mazumder et al., 2002). Anteriormente, se probaron varios

polisacáridos sulfatados en formulaciones vaginales, las cuales mostraron inhibir, in

vivo, el desarrollo del virus HVS-2 en ratones infectados (Zacharopoulos y Phillips,

1997). También los fucanos obtenidos a partir de los extractos acuosos de

Sargassum horneri exhibieron actividad inhibitoria contra la replicación del virus

Herpex simplex HVS-1 (Preeprame et al., 2001). Esos no fueron hallazgos aislados,

otros polisacáridos sulfatados de origen algal y semi-sintéticos han demostrado ser

activos contra una amplia variedad de virus encapsulados, tales como el VIH, el virus

de la influenza tipo A, el virus sincicial respiratorio, el virus de inmunodeficiencia en

simios, el virus de la estomatitis vesicular y el citomegalovirus humano, entre otros

(Baba et al., 1988; Bourgougnon et al., 1993; Witvrouw y De Clercq, 1997; Schaeffer

y Krylov, 2000).

Por otro lado, los galactanos sulfatados provenientes de Codium cylindricum

mostraron propiedades antiangiogénicas, estos galactanos, relacionados

estructuralmente con los carragenanos, inhibieron la formación de microvasos

sanguíneos en ratas, lo cual podría tener implicaciones en el tratamiento de tumores

sólidos (Matsubara et al., 2003). Los carragenanos, también poseen potente

actividad antiangiogénica (Käsbauer et al., 2001).

En otros casos de estudio, los polisacáridos extraídos de algas pardas han

mostrado actividad antioxidante, como los obtenidos a partir de Laminaria japonica.

9

Estos presentaron actividad en dos sistemas de oxidación de lipoproteína de baja

densidad (Xue et al., 2001). En el mismo sentido, el fucoidan extraído de Fucus

vesiculosus mostró actividad antioxidante en el ensayo de reducción férrica/poder

antioxidante (Rupérez et al., 2002). Casi paralelamente, se reportó que los

polisacáridos sulfatados extraídos de Porphyra haitanesis mostraron fuerte actividad

secuestrante sobre los radicales hidroxilo y superóxido, e inhibición significativa de

lipoperoxidación y hemólisis de eritrocitos de rata (Zhang et al., 2003).

Otras propiedades biológicas se han detectado en diversos tipos de

polisacáridos. Ese es el caso de los fucanos obtenidos de Spatoglossum schröederi,

los cuales mostraron inhibición de la adhesión celular (Rocha et al., 2001). En un

estudio realizado con ratones, los polisacáridos obtenidos de Ulva pertusa redujeron

significativamente los niveles de colesterol total, triglicéridos y del colesterol asociado

a lipoproteínas de baja densidad, al mismo tiempo que incrementaron los niveles del

colesterol asociado a lipoproteínas de alta densidad en el plasma de ratones,

demostrando interesantes propiedades antihiperlipidémicas (Yu et al., 2003).

Las propiedades biológicas de los polisacáridos, mencionadas anteriormente

(antiviral, antiangiogénica, antihiperlipidémica y antioxidante) no son las únicas que

han sido reportadas en la literatura. Además existen reportes de actividad

antitumoral, antimutagénica, inmunomoduladora, anticancerígena, anti-inflamatoria y

anticoagulante (Shanmugam y Mody, 2000). Esta última es particularmente de

nuestro interés.

2.3. Los mecanismos de la coagulación sanguínea y la actividad anticoagulante de los polisacáridos sulfatados de origen algal.

En el resto de este documento, continuamente nos referiremos al efecto

anticoagulante de extractos y polisacáridos algales. Por ello, resulta necesario

comprender los mecanismos a través de los cuales la sangre se coagula.

Se conoce con el nombre de “cascada de coagulación” a la secuencia de

eventos fisiológicos y bioquímicos que conducen a la formación de un coagulo

sanguíneo (Figura 5). El daño de tejidos, vasos sanguíneos o el contacto de la

sangre con el colágeno u otra superficie cargada negativamente, produce la

10

activación de dos vías de coagulación; la vía extrínseca y la vía intrínseca. Se trata

de la cadena de reacciones que sufren unas proteínas plasmáticas conocidas como

factores de la coagulación, y que finalizan con la formación de la trombina. La vía

extrínseca se activa debido a lesiones de algún tejido diferente al del sistema

vascular, cuyo daño libera tromboplastina tisular (Factor III) y fosfolípidos. La vía

intrínseca se inicia con una lesión en el sistema vascular quedando el colágeno

expuesto y en contacto con la sangre, lo cual activa al factor Hageman (Factor XII).

La Tabla 1 muestra una lista de los diferentes factores de coagulación y sus

funciones.

Cuando se rompe un vaso sanguíneo o existe una lesión tisular, se libera el

factor tisular (FT), también llamado tromboplastina. El factor tisular y el factor VIIa

forman el complejo FT/FVIIa, lo que activa los factores X y IX. El FX forma un

complejo con el Factor V y activan a la protrombina para formar trombina (IIa). La

producción de trombina es frenada por la liberación del Inhibidor de la vía del factor

tisular (IVFT), por lo que resulta necesaria una vía alterna de la hemostasia para

producir cantidades suficientes de trombina. Esta enzima se encarga de la formación

del coágulo de fibrina. Para la producción de grandes cantidades de trombina, se

requiere la participación del Factor VIII y Factor IX. El Factor IX es activado por el

complejo FT/FVIIa y por el factor XIa que a su vez fue activado por trombina.

Mientras que en la fase de iniciación se producen cantidades pequeñas de trombina

por la presencia del IVFT, en la fase de propagación o amplificación, en donde

participan el factor XI, VIII y IX, se producen cantidades altas de trombina (Díaz-

Concepción y Almagro-Vázquez, 2001). En el laboratorio, es posible analizar los

factores de coagulación que intervienen en la vía intrínseca y extrínseca a través de

ensayos in vitro muy simples. La prueba de elección para el análisis del mecanismo

intrínseco, por su sensibilidad para detectar alteraciones de los factores de esta vía,

es el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA).

11

Figura 5. Representación esquemática de los reacciones en cascada que conducen a la formación de fibrina (Reproducido de: Quintana-González, 2002).

En el laboratorio se simula la cascada de coagulación por la vía intrínseca

adicionando a la muestra en estudio, sustancias activadoras de la misma como

fosfolípidos, caolín o ácido elágico, entre otros.

El TTPA mide el tiempo que tarda en coagular el plasma en presencia de una

tromboplastina parcial que actúa como sustituto plaquetario. Se utiliza un activador

TP

FXa

Protrombina

Fibrina

Trombina

Fibrinógeno

Vía extrínseca

FT

FVII FVIIa

Ca2+

FX

Ca2+

Fosfolípidos FV

Vía intrínseca

FXII FXIIa

FXI FXIa

FIX FIXa

FX

Ca2+

Fosfolípidos FVIII

FXIII

FXIIIa

Polimerización de la fibrina

Calicreina

TTPA

12

de los factores de contacto como caolín o ácido elágico para desencadenar la

coagulación. El valor normal del TTPA en humanos sanos es entre 35 y 38 s.

Tabla 1. Nombre y función biológica de las proteínas plasmáticas que actúan como factores de la coagulación. Nombre común Nombre alternativo Función

Factor tisular Tromboplastina Iniciador, cofactor de VIIa en activación de IX y X

Factor XII Factor de Hageman Zimógeno de proteasa

Factor XI Zimógeno de proteasa

Factor X Zimógeno de proteasa

Factor IX Zimógeno de proteasa

Factor VIII Factor antihemofílico Cofactor de los factores IXa y en activación de X

Factor VII Zimógeno de proteasa

Factor V Cofactor de Xa en activación de II

Protrombina Factor II Zimógeno de proteasa

Fibrinógeno Factor I Precursor de fibrina

Factor XIII Fibrinoligasa Zimógeno de transglutaminasa

Trombomodulina Cofactor de trombina en la activación de proteína C

Proteina C Zimógeno de proteasa

Proteina S Cofactor de la proteína C en la inactivación de Va y

VIIa

Antitrombina III Antitrombina Inhibidor de proteasas

Ca2+ Factor IV

Modificada a partir de: Martínez-Murillo, 2003.

La vía extrínseca se evalúa a través de la formación del "activador de la

protrombina" en el cual se utiliza como fuente de factor tisular (FT), la tromboplastina

y un activador, el calcio. El tiempo que transcurre entre la formación del quelato de

calcio y la formación de fibrina, se conoce como tiempo de protrombina (TP). El TP

representa el tiempo necesario para que ocurran las reacciones que generan el

activador del factor X, el activador de la protrombina, la generación de trombina y la

transformación de fibrinógeno en fibrina. Esto depende de la cantidad y capacidad

13

funcional de los factores II, V, VII, X y el fibrinógeno. El tiempo de coagulación de

este sistema es inversamente proporcional a la actividad funcional (coagulante) del

factor presente en el plasma en estudio. El valor normal del TP en humanos sanos es

de 12 s en promedio.

El TTPA y el TP aumentan anormalmente no sólo por el descenso o alteración

funcional de los factores de la coagulación, sino también por la presencia de

inhibidores que neutralizan específicamente la actividad de un factor en particular o

interfieren en distintas etapas del mecanismo de la coagulación (antifosfolípidos,

heparina, heparinoides, entre otros).

Muchos polisacáridos de origen algal tienen actividad anticoagulante. Los más

activos suelen ser aquellos aislados a partir de algas rojas y cafés, aunque existen

ejemplos interesantes en las algas verdes. Los primeros reportes de actividad

anticoagulante en algas se realizaron en los años 30´s. En ese entonces, se

demostró que las algas rojas Iridaea laminaroides y Delesseria sanguinea contenían

sustancias que podían inhibir la coagulación sanguínea (Chargaff et al., 1936;

Elsener, 1938; citado por Shanmugam y Mody, 2000).

Más recientemente, el estudio de Ecklonia kurume indicó que contenía 4

fracciones polisacáridas con propiedades anticoagulantes. El análisis de las

fracciones reveló que 2 de ellas estaban compuestas de fucosa, galactosa, manosa,

xilosa, ácido glucurónico y grupos sulfato. Las otras 2 fracciones no contenían

manosa o xilosa. La actividad anticoagulante de las 4 fracciones se evaluó por medio

del ensayo de TTPA, resultando ser 24, 19, 81 y 85% del TTPA que se obtuvo con la

misma concentración de heparina (Nishino et al., 1989). En 1996, se reportó la

actividad anticoagulante de fucanos de bajo peso molecular preparados por

degradación de fucanos obtenidos a partir de Ascophyllum nodosum. Las fracciones

separadas por cromatografía de intercambio iónico exhibieron actividad

anticoagulante similar a la heparina (Nardella et al., 1996). Ya para entonces, esta

era un área de investigación muy prolífica, pero seguían apareciendo reporte

interesantes, como el de un xilofucoglucuronano aislado a partir de Spatoglossum

schröederi, el cual mostró baja actividad anticoagulante, pero resultó ser un poderoso

estimulante de la síntesis de heparan sulfato (Leite et al., 1998). Poco después, se

14

publicó un estudio en donde se comparaba la actividad anticoagulante de los fucanos

obtenidos a partir de 3 algas café (Fucus vesiculosus, Ascophyllum nodosum y

Laminaria brasiliensis) contra la de los fucanos extraídos de 3 equinodermos

(Ludwegothurea grises, Arbacia lixula y Lytechinus variegatus). El ensayo de TTPA

indicó que todos los extractos crudos tuvieron actividad anticoagulante y que ésta

actividad se incrementaba durante el proceso de purificación de los fucanos. La

comparación de los polisacáridos de las tres especies de algas mostraron potencia

anticoagulante similar entre F. vesiculosus y A. nodosum, mientras que L. brasiliensis

mostró una actividad significativamente mayor (Pereira et al., 1999).

A partir de Codium pugniformis, se extrajo un glucano altamente sulfatado,

que contenía pequeñas cantidades de galactosa y arabinosa. Este polisacárido

mostró actividad similar a la heparina en los ensayos de TTPA y TT (tiempo de

trombina), pero no tuvo efecto en el ensayo de TP, lo que sugiere que inhibía uno o

más de los factores de la coagulación de la vía intrínseca, pero no tenía efecto sobre

los factores de la vía extrínseca (Matsubara et al., 2000).

En experimentos in vitro con plasma deficiente de plaquetas obtenido a partir

de humanos sanos, se probó el efecto del fucoidan de Fucus evanescens sobre las

propiedades anticoagulantes de la trombina en una mezcla de trombina-fibrinógeno.

En estos experimentos se estimaron los parámetros de coagulación como el TTPA,

TP y TT, los cuales fueron comparados contra la heparina, mostrando actividad

similar. En esta misma serie de experimentos, se probó el efecto in vivo del fucoidan,

inyectando ratones por vía intraperitoneal. Quince minutos después de la inyección

los tiempos de coagulación, evaluados por medio del TTPA y TT, se incrementaron

3.3 y 4.7 veces sobre los niveles normales, respectivamente (Kuznetsova et al.,

2003). Esos resultados sugieren un interesante potencial de utilización de estas

sustancias en aplicaciones biomédicas. Algunos estudios orientados hacia la

comprensión del modo de acción de los fucoides y otros polisacáridos polianiónicos,

indican que estos ejercen su efecto anticoagulante a través de un mecanismo que

involucra al cofactor II de la heparina potenciando su actividad directamente sobre la

trombina (Church et al., 1989; Rossi et al., 1999). El peso molecular, el contenido de

sulfatos, su patrón de sustitución, y el contenido y tipo de monómeros presente en

15

los polisacáridos son factores importantes para el efecto anticoagulante. Aunque

algunos autores consideran que la interacción entre el polisacárido, el factor de

coagulación y la enzima involucrada, no depende de la densidad de cargas ni del

contenido de sulfatos, si no de una relación estereoespecífica (Pereira et al., 2002).

Otros consideran que el tamaño de la cadena polisacárida es el factor limitante con

respecto al efecto anticoagulante (Pomin et al., 2005). Sin embargo, estudios

realizados en fucanos con diferente grado de sustitución han demostrado que la

actividad anticoagulante aumenta conforme el contenido de sulfatos se incrementa

(Nishino y Nagumo, 1992).

Hasta aquí, hemos mencionado algunas algas que han sido reportadas por

contener polisacáridos sulfatados con actividad anticoagulante. Pero muchas otras

han presentado esta actividad (Tabla 2). Según un artículo de revisión publicado en

el año 2000, hasta entonces se habían reportado más de 40 especies de rodofitas,

más de 60 feofitas y algunas 10 clorofitas con actividad anticoagulante (Shanmugam

y Mody, 2000).

En México, los trabajos publicados en esta área son muy escasos, solo

tuvimos conocimientos de un reporte relacionado con el tema. En el, se menciona

que los extractos acuosos provenientes de 32 especies de algas recolectadas en las

costas de Oaxaca, Guerrero, Tamaulipas y Quintana Roo fueron sometidos a

ensayos de actividad anticoagulante. De los 32 extractos probados, 3 (Codium

giraffa, Halimeda discoidea y Sargassum hystrix) mostraron actividad con tiempos

de coagulación mayor a 10 minutos (De Lara-Isassi y Álvarez-Hernández, 1994).

Localmente se realizó un trabajo preliminar con el alga roja Gracilaria veleroae

(Murillo-Álvarez, comunicación personal) en el cual, el extracto crudo obtenido de

esta alga mostró moderada actividad anticoagulante. Ese trabajo preliminar, sentó

las bases para la realización del presente estudio.

16

Tabla 2. Listado de algunas algas con actividad anticoagulante. Especie Referencia bibliográfica

Acantophora spicifera Shanmugan y Mody, 2000 Ascophyllum nodosum Shanmugan y Mody, 2000 Botryocladia occidentales Farias et al., 2000 Calliblepharis jubata Deacon-Smith et al., 1985 Chondrus crispus Deacon-Smith et al., 1985 Chorda filum Deacon-Smith et al., 1985 Codium dwarkense Shanmugan y Mody, 2000 Codium fragile ssp. atlanticum Shanmugan y Mody, 2000 Codium fragile ssp. tomentosoides Shanmugan y Mody, 2000 Codium geppi Shanmugan et al., 2002 Codium indicum Shanmugan et al., 2002 Codium jirafa De Lara-Issasi y Álvarez-Hernández, 1994 Codium latum Uehara et al., 1992 Codium pugniformis Matsubara et al., 2000

Codium tomentosum Shanmugan y Mody, 2000 Corallina rubens Shanmugan y Mody, 2000 Cystoseira bacata Deacon-Smith et al., 1985 Dictyota dichotoma Deacon-Smith et al., 1985 Dictyota menstrualis Albuquerque et al., 2004 Ecklonia kurome Shanmugan y Mody, 2000 Eisenia bicyclis Shanmugan y Mody, 2000 Euchema cottoni Shanmugan y Mody, 2000 Euchema espinosum Shanmugan y Mody, 2000 Fucus evanescens Kuznetsova et al., 2003 Fucus serratus Deacon-Smith et al., 1985 Fucus spiralis Deacon-Smith et al., 1985 Fucus vesiculosus Deacon-Smith et al., 1985 Gelidium crinale Pereira et al., 2005 Gigartina acicularis Shanmugan y Mody, 2000 Gigartina stellata Deacon-Smith et al., 1985 Grateloupia dichotoma Shanmugan y Mody, 2000 Grateloupia filicina Shanmugan y Mody, 2000 Grateloupia turuturu Shanmugan y Mody, 2000 Grateloupia indica Shanmugan y Mody, 2000 Halidrys siliquosa Deacon-Smith et al., 1985 Halimeda discoidea De Lara-Issasi y Álvarez-Hernández, 1994 Hizikia fusiforme Shanmugan y Mody, 2000 Iridaea spp. Shanmugan y Mody, 2000 Laminaria angustata Shanmugan y Mody, 2000 Laminaria digitata Deacon-Smith et al., 1985 Laminaria hyperborea Deacon-Smith et al., 1985 Laminaria religiosa Shanmugan y Mody, 2000 Laminaria saccharina Deacon-Smith et al., 1985 Monostroma nitidum Shanmugam y Mody, 2000 Padina gymnospora Silva et al., 2005 Padina pavonica Shanmugam y Mody, 2000 Padina tetrastromatica Shanmugam y Mody, 2000 Pelvetia caniculata Shanmugam y Mody, 2000 Pelvetia wrightii Shanmugam y Mody, 2000 Phyllophora brodiaei Deacon-Smith et al., 1985 Pterocladia capillaceae Shanmugam y Mody, 2000 Continúa la Tabla 2…

17

Especie Referencia bibliográfica

Sargassum cinctum Shanmugam y Mody, 2000 Sargassum Hystrix De Lara-Issasi y Álvarez-Hernández, 1994 Scytisiphon lomentaria Deacon-Smith et al., 1985 Spatoglossum schroederi Deacon-Smith et al., 1985 Stenogramme interrupta Shanmugam y Mody, 2000 Stictyosiphon tortilis Deacon-Smith et al., 1985 Undaria pinnatifida Shanmugam y Mody, 2000

18

3. PLANTEAMIENTO Y JUSTIFICACIÓN

De acuerdo con los reportes de la Organización Mundial de la Salud, las

enfermedades vasculares causan 1.2 millones de muertes cada año en todo el

mundo (anónimo, 2004a). En los Estados Unidos y otros países industrializados,

causan la mitad de la mortalidad total. En nuestro país, los reportes de la Secretaría

de Salud y del Instituto Mexicano del Seguro Social indican que, hasta el 2003, había

en México alrededor de 3.5 millones de personas con alguna enfermedad vascular

(anónimo, 2003a; anónimo, 2004b). En términos de mortalidad general, solo las

enfermedades cerebrovasculares representaron el 5.8 % de la mortalidad total

(anónimo, 2003b). Lo que ocasiona un problema socioeconómico de gran

trascendencia debido a la pérdida económica generada por incapacidad laboral, ya

que un alto porcentaje de las personas enfermas aún están en edad productiva.

La heparina es un fármaco comúnmente usado en el tratamiento de las

enfermedades tromboembólicas y otros desordenes vasculares. Aunque su eficacia

es incuestionable, la heparina depende de la antitrombina III para ejercer su efecto

anticoagulante. Adicionalmente, el uso prolongado de la heparina se ha relacionado

con algunos efectos colaterales, como: hemorragias, trombocitopenia, osteoporosis y

otros desórdenes relacionados con la deficiencia de calcio. Probablemente, el mayor

problema relacionado con el uso clínico de la heparina sea su inconsistencia en el

efecto anticoagulante (Gunnarsson y Desai, 2002; Chong, 2003; Desai, 2004). Esto

significa, que la dosis debe de ser ajustada para cada paciente y para cada lote de

heparina. Aunado a las limitaciones terapéuticas de la heparina, su uso implica otros

riesgos, por ejemplo el de ser infectado con virus o priones (anónimo, 2005). Esto es

posible porque la heparina es obtenida a partir de mucosas de animales,

principalmente de pulmones bovinos y cerdos o de intestinos de pavos (Nardella et

al., 1996).

La alta incidencia de las enfermedades vasculares, las limitaciones

terapéuticas de la heparina y los riesgos de contaminación por virus, son el motor

que impulsa la búsqueda de sustancias con actividad anticoagulante similar a la de la

heparina, pero con efectos colaterales reducidos. En este sentido, los polisacáridos

19

de origen algal, se consideran una fuente prometedora para el desarrollo de un

nuevo fármaco anticoagulante. Tomando en cuenta todo lo mencionado hasta aquí, y

siguiendo nuestro interés por contribuir al descubrimiento de nuevas sustancias

anticoagulantes, realizamos este estudio basados en las siguientes consideraciones:

a) Después de una revisión en numerosas bases de datos del área químico-

biológica, a través de los proveedores DialogWeb® y SciFinder®, no se encontraron

reportes de estudios locales o regionales dirigidos al descubrimiento y

caracterización de polisacáridos sulfatados con propiedades anticoagulantes. Lo que

nos hizo suponer que esta área de estudio no ha sido abordada regionalmente,

dándonos la oportunidad de explorar el potencial farmacológico de las algas marinas

con que cuenta el estado.

b) México es particularmente rico en especies de las principales familias de

algas. Se encuentran alrededor de 210 especies de feofitas y 1350 especies de

rodofitas identificadas en las costas del Océano Pacífico y el Golfo de México

(Robledo, 1998). Tan solo en el Golfo de California existen al menos 55 especies de

algas potencialmente explotables (Pacheco y Zertuche, 1996). En ese sentido, el

recurso algal alrededor de las costas de Baja California Sur representa una gran

posibilidad de estudio.

c) Este proyecto daría inicio a una nueva línea de investigación dedicada al

estudio de los polisacáridos bioactivos de origen algal, dentro del ya existente grupo

de química de algas de este Centro.

20

4. OBJETIVOS

Evaluar de manera preliminar, el potencial del recurso algal encontrado en

Baja California Sur como fuente de compuestos con actividad anticoagulante.

a. Construir una librería de extractos acuosos, a partir de un grupo de

algas marinas recolectadas en diversas localidades de las costas de

Baja California Sur.

b. Evaluar la actividad anticoagulante de cada extracto por medio de los

ensayos de tiempo de protrombina y tiempo de tromboplastina parcial

activada.

Aislar y caracterizar la fracción polisacárida con actividad anticoagulante, a

partir de un alga seleccionada de la librería de extractos acuosos, como la más

activa.

c. Seleccionar de la librería de extractos para estudio posterior, aquella

alga que de acuerdo a los ensayos de tiempo de protrombina y tiempo

de tromboplastina parcial activada, haya mostrado la mayor actividad

anticoagulante.

d. Fraccionar el extracto acuoso seleccionado por medio de cromatografía

de intercambio iónico usando como guía los ensayos de tiempo de

protrombina y tiempo de tromboplastina parcial activada.

e. Caracterizar la naturaleza estructural de las fracciones obtenidas del

extracto seleccionado por medios químicos y espectroscópicos.

21

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1. Estudio del potencial del recurso algal encontrado en Baja California Sur como fuente de compuestos con actividad anticoagulante 5.1.1. Recolección e identificación taxonómica de algas

Las algas sometidas a este estudio se recolectaron en la zona intermareal y

submareal de diferentes localidades de las costas de Baja California Sur (Figura 6).

Los sitios de recolecta se eligieron con base en trabajos florísticos previamente

reportados (Aguilar et al., 1990; Cruz-Ayala et al., 2001).

Las algas recolectadas (21 especies) fueron lavadas con agua corriente para

eliminar los epífitos y los restos de sedimento. Posteriormente se secaron al sol, se

molieron y tamizaron. Algunos individuos de cada especie se conservaron en una

solución de formaldehído al 4% como referencia. La identificación taxonómica se

realizó en el Laboratorio de Ficología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

del Instituto Politécnico Nacional, por Luz Elena Mateo Cid y Catalina Mendoza

González.

5.1.2. Obtención de los extractos crudos

Diez gramos de cada alga seca y molida fueron extraídos individualmente con

200 mL de agua destilada con agitación continua por 4 h a 25°C. El tejido algal se

removió por filtración simple, para ser utilizado a un segundo paso de extracción con

agua destilada a 80°C y agitación continua por 2 h. Ambos extractos acuosos se

centrifugaron individualmente hasta obtener soluciones clarificadas. Cada extracto

se precipitó por adición de 3 volúmenes de etanol. El precipitado se recuperó por

centrifugación y se secó en una estufa eléctrica a 50°C.

5.1.3. Ensayos de actividad anticoagulante

La actividad anticoagulante de los extractos algales se evaluó por medio de

los ensayos de tiempo de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial

activada (TTPA), utilizando plasma sanguíneo obtenido de humanos sanos.

22

Figura 6. Ubicación de las localidades en donde se recolectó el material algal estudiado: 1. Isla Natividad, 2. Punta Eugenia, 3. Laguna de San Ignacio, 4. San Juan de la Costa, 5. Playa La Concha, 6. Isla La Gaviota, 7. Playa Balandra.

El plasma sanguíneo se obtuvo a partir de humanos sanos. La sangre

obtenida por venopunción se mezcló con una solución de citrato de sodio al 3.5% en

proporción de 9 a 1 (v/v). El paquete celular se removió por centrifugación (1700 × g),

y el plasma recuperado se almacenó a -18°C hasta el momento de su utilización.

114 W 112 W 110

24 N

26 N

N

S

1 2

3

4

56

7

23

El ensayo de tiempo de protrombina (TP), se realizó de acuerdo a las

instrucciones del fabricante. Brevemente, 100 μL de plasma humano citrado se

mezclaron con 10 μL de una solución del extracto de prueba (10 mg mL-1) y se

incubó a 37°C por 1 min. Después del tiempo de incubación, se agregaron 200 μL del

reactivo de TP (Biopool® by Trinity Biotech, plc) preincubado por 10 min. a 37°C. A

partir de ese momento se midió el tiempo de formación del coagulo.

El ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA), se realizó de

acuerdo a las instrucciones del fabricante. Brevemente, 100 μL de plasma humano

citrado, se mezclaron con 10 μL de una solución del extracto crudo de prueba (10 mg

mL-1) y se incubó a 37°C por 1 min. Después del tiempo de incubación, se agregaron

100 μL del reactivo de TTPA (Biopool® by Trinity Biotech, plc), se incubó por 3 min. a

37°C y se agregaron 100 μL de CaCl2 al 0.25%. A partir de ese momento se midió el

tiempo de formación del coagulo.

En todos los casos, la formación del coagulo se inspeccionó visualmente.

Todos los extractos fueron ensayados por duplicado. Con los datos se calculó el

tiempo de coagulación promedio y la desviación estándar.

5.1.4. Análisis de los datos de actividad anticoagulante

El resultado de los ensayos de actividad anticoagulante (TP y TTPA) fue

tratado estadísticamente por medio de un análisis de varianza multifactorial. La

prueba de Tukey fue utilizada para determinar diferencias significativas entre el TP y

el TTPA de los extractos incluyendo al control como un caso más del análisis

estadístico para determinar cuales extractos mostraron diferencia con respeto al

control, en cada uno de los ensayos.

5.2. Aislamiento y caracterización de la fracción con actividad anticoagulante, a partir del alga seleccionada (Eisenia arborea) de la librería de extractos acuosos, como la más activa

Con base en el resultado obtenido a partir de la propuesta experimental

descrita en la sección 5.1. se determinó que el extracto acuoso, obtenido a 25°C de

Eisenia arborea (Areschoug, 1876), mostró la mayor actividad en los ensayos de TP

24

y TTPA. Por ello, esta alga se seleccionó para ser estudiada con la idea de ofrecer

una explicación molecular de su actividad anticoagulante.

5.2.1. Obtención de extractos a partir de Eisenia arborea

Cien gramos de Eisenia arborea seca y molida se extrajeron con 1 L de agua

destilada a 25°C con agitación continua durante 4 h (Figura 7). La mezcla obtenida

se filtró para separar el tejido algal y el extracto acuoso. El tejido extraído se sometió

a un segundo y tercer paso de extracción con agua destilada a 80°C, y agitación

continua por 2 h. Todos los extractos líquidos (25 y 80°C) se filtraron individualmente

a través de tierra de diatomeas para obtener soluciones clarificadas. La solución

obtenida a 25°C se precipitó en forma fraccionada. El primer paso de precipitación se

completo agregando 1 volumen de etanol (~0.9 L), mientras que para la segunda y

tercera precipitación se adicionaron 2 (1.8 L) y 3 (2.7 L) volúmenes, respectivamente.

Los precipitados se recuperaron por centrifugación y se secaron en una estufa

eléctrica a 50°C. Las soluciones obtenidas a 80°C, se precipitaron directamente con

3 volúmenes de etanol (~2.5 L) y los precipitados se secaron a 50°C. En total, se

obtuvieron a partir de Eisenia arborea 5 extractos, de los cuales 3 de ellos

(MM049F1, MM049F2 y MM049F3) se obtuvieron a 25°C, y otros 2 (MM049CF1 y

MM049CF2) a 80°C. Los 5 extractos se sometieron a los ensayos de actividad

anticoagulante.

5.2.2. Fraccionamiento del extracto MM049F1 de Eisenia arborea Las condiciones del fraccionamiento se determinaron experimentalmente, partiendo

de lo reportado en estudios previos (Nardella et al., 1996; Usov et al., 1997). Así, 80

mg del extracto MM049F1 se fraccionaron por cromatografía de intercambio iónico

sobre DEAE-celulosa. La columna cromatográfica se eluyó con cloruro de sodio

(NaCl) acuoso en gradiente de concentración (0.5, 1.0 y 2.0 M). De este ensayo

preliminar, se obtuvieron tres fracciones claramente diferenciadas por el ensayo del

fenol/ácido sulfúrico (Dubois et al., 1956). Con ese antecedente, se escaló el

fraccionamiento. Para ello, 1.85 g del extracto MM049F1 se disolvieron en 200 mL de

agua destilada con agitación continua por 2 h. La solución se centrifugó (15 min.,

25

Figura 7. Esquema que muestra el proceso de obtención de extractos a partir de Eisenia arborea.

Eisenia arborea

Extracción 25°C

Filtración

Tejido Filtrado

Centrifugación

Sobrenadante Insoluble Precipitación, Centrifugación

Precipitado 1 Sobrenadante

Precipitación, Centrifugación

Precipitado 2 Sobrenadante Precipitación, Centrifugación

Precipitado 3 Sobrenadante

(MM049F2)

(MM049F3)

(MM049F1)

2

Tejido

2

Sobrenadante

Precipitación Centrifugación

Tejido

Extracción 80°C

Filtración

Tejido Filtrado

Centrifugación

Sobrenadante

Precipitado 4 (MM049C1)

Insoluble

Extracción a 80°C

Filtración

Filtrado

Centrifugación

Insoluble

Precipitado 5 (MM049C2)

Sobrenadante Precipitación Centrifugación

Sobrenadante

26

1700 × g) para separar la materia insoluble. El sobrenadante se precipitado con 600

mL de etanol. La mezcla resultante se centrifugó (15 min., 1700 × g) y el precipitado

recuperado se secó a 55°C obteniéndose 1.237 g. Una parte de este precipitado

(1.022 g) se dispersó en 20 mL de agua destilada con ayuda de ultrasonido durante

2.5 h. La dispersión se fraccionó por cromatografía de intercambio iónico en una

columna (diámetro = 2.2 cm, altura = 19 cm) empacada con 40 g de DEAE-celulosa

suspendida en Tris-HCl a pH 8.3 y equilibrada con tres volúmenes del mismo

amortiguador. La muestra se aplicó en la columna y se eluyó utilizando NaCl en

gradiente de concentración molar (250 mL a 0.5 M, 250 mL a 1.0 M y 200 mL a 2.0

M). La separación se monitoreo midiendo la concentración relativa de azúcares

totales en cada eluato por el método del fenol-ácido sulfúrico (Dubois et al., 1956).

Las 3 fracciones resultantes (CC2F1, CCF2 y CC2F3. Figura 8) se dializaron

extensivamente contra agua destilada (membranas de celulosa, MW cutoff 12000

uma). El agua de las fracciones se eliminó por destilación a presión reducida y

liofilización. Las 3 fracciones se sometieron a los ensayos de actividad

anticoagulante.

5.2.3. Caracterización parcial de las fracciones polisacáridas obtenidas a partir de Eisenia arborea.

Las fracciones obtenidas a partir del extracto MM049F1 de Eisenia arborea se

caracterizaron estructuralmente por medios espectroscópicos y químicos.

Los espectros de infrarrojo (IR) se obtuvieron en un espectrómetro Perkin

Elmer modelo Paragon 500, utilizando bromuro de potasio como soporte. Cada

espectro se obtuvo por adición de 124 repeticiones a una resolución de 4 cm-1 en el

rango espectral de 400-4000 cm-1.

Los espectros de resonancia magnética nuclear de 1H y 13C se adquirieron en

un espectrómetro Varian Unity a 300 y 100 MHz, respectivamente. Se utilizaron las

secuencias de pulsos programadas por el fabricante. Las muestras se disolvieron en

agua deuterada (ca. 30 mg mL-1). Se usó tetrametilsilano como referencia interna.

27

Figura 8. Esquema que muestra el fraccionamiento del extracto MM049F1 obtenido a partir de Eisenia arborea.

La composición monomérica de las fracciones se determinó en el producto de

hidrólisis ácida. La hidrólisis se realizó con ácido trifluoroacético (TFA) 6 N a 100°C

por 12 h. Los monómeros se determinaron por comparación directa contra L-fucosa

(Fluka) y D-galactosa (Baker Analyzed) en cromatografía de capa fina. Se usaron

placas cromatográficas de sílica gel (Whatman K6F, 250 μm de espesor). Las placas

cromatográficas se eluyeron con una mezcla de propanol, hidróxido de amonio

concentrado y agua (6:2:1 v/v). El revelado de las placas se realizó rociándolas con

una mezcla preparada con 5 partes de solución alcohólica de anilina al 4%, 5 partes

de solución alcohólica de difenilamina al 4% y 1 parte de ácido fosfórico al 85%.

El contenido de sulfatos se determinó por medio de espectroscopia de

infrarrojo. Del espectro de infrarrojo se calculó el cociente A1250/1040 (absorbancia de

Sobrenadante

Insoluble

MM049F1 1.85g

Centrifugación

Sobrenadante Precipitación Centrifugación

Precipitado 1.237g

(MM049F1P)

Fraccionamiento en columna

Liofilización Liofilización Liofilización

Sol. NaCl 1.0 M Sol. NaCl 2.0 M Sol. NaCl 0.5 M

Diálisis

Concentración

CC2F1 0.340 g

CC2F2 0.350 g

CC2F3 0.005 g

Diálisis Diálisis

Concentración Concentración

28

la banda en 1250 cm-1/absorbancia de la banda en 1040 cm-1). El valor se sustituyó

en la ecuación: % SO42- = (A1250/1040) 0.027 + 0.36, de acuerdo con lo reportado

previamente (Lijour et al., 1994).

La concentración de fucosa se determinó por colorimetría (Dische, 1955).

Brevemente, 1 mL de muestra disuelta en agua (100 μg mL-1) se colocó en un tubo

de ensayo enfriado en agua con hielo. Se agregaron 4.5 mL de una solución de ácido

sulfúrico preparada con 100 mL de agua destilada y 600 mL de ácido sulfúrico

concentrado. Se dejó enfriar por 1 min. y se transfirió a un baño de agua a 100°C por

10 min., exactamente. Después de ese tiempo, se dejó enfriar a temperatura

ambiente. Se agregaron 100 μL de una solución de cisteína al 3%, se mezcló bien y

se dejó en reposo por 30 min. Se midió la absorbancia a 396 y 427 nm. La

absorbancia atribuida a la fucosa se calculó con la ecuación: Afucosa = A396nm – A427nm.

La concentración de fucosa se determinó interpolando la absorbancia en una curva

estándar construida con L-fucosa (Fluka). Todas las determinaciones se realizaron

por duplicado, se calculó el promedio y la desviación estándar.

La concentración de ácidos urónicos se determinó por colorimetría

(Blumenkrantz y Asboe, 1963). Un mililitro de muestra (100 μg mL-1) se enfrió

durante 30 s en agua con hielo. Se adicionaron 6 mL de una solución de borato de

sodio 0.0125 M en ácido sulfúrico concentrado. Se dejó enfriar por 1 min. en agua

con hielo. Después de este tiempo, la mezcla se transfirió a un baño de agua a

100°C por 5 min. Al término de este lapso, la mezcla se enfrió en hielo por 1 min. Se

adicionaron 100 μL de 3-fenilfenol al 0.15% en hidróxido de sodio al 0.5%. Se

determinó la absorbancia a 520 nm en un intervalo no mayor a 5 min. La

concentración de ácidos urónicos se determinó por interpolación de la absorbancia

en una curva estándar construida con ácido galacturónico (Sigma). Todas las

determinaciones se realizaron por duplicado. Se calculó el promedio y la desviación

estándar.

29

6. RESULTADOS

6.1. Sobre el potencial del recurso algal de Baja California Sur como fuente de polisacáridos anticoagulantes

La colección de algas sujeta a estudio estuvo formada por 9 rodofitas, 5

clorofitas y 7 feofitas. En total se recolectaron 21 especies diferentes. La Tabla 3

muestra una lista de las algas que se estudiaron, así como el lugar y fecha de

recolecta. La librería de extractos acuosos se integró con 41 extractos, de los cuales;

21 se obtuvieron a 25°C y los otros 20 a 80°C. Todos los extractos se sometieron a

los ensayos de TP y TTPA.

Las Figuras 9 y 10 muestran el efecto de cada extracto sobre el tiempo de

coagulación, según el ensayo de TP. Los extractos cuyos tiempos de coagulación

resultaron significativamente diferentes (p < 0.05) con respecto al del control (anexo

A) fueron: los 2 extractos de Dudresnaya colombiana (TP = 44.0 y 50.0 s), el extracto

a 25°C de Eisenia arborea (PT > 300.0 s), el extracto a 80°C de Hydroclathrus

clathratus (TP = 26.0 s), el extracto a 25°C de Cladophora sericea (TP = 48.5 s), los

dos extractos de Codium cuneatum (TP = 35.5 y 72.0 s) y los dos extractos de

Gracilaria subsecundata (TP = 27.5 y 27.0 s).

Las Figuras 11 y 12 muestran el efecto de cada extracto sobre el tiempo de

coagulación normal evaluado por medio del ensayo de TTPA. El resultado de la

prueba de Tukey mostró que de los 41 extractos evaluados, 29 (70%) mostraron

diferencia significativa (p < 0.05) con respecto al TTPA control (anexo A). Dieciocho

de ellos con TTPA > 300.0 s, 2 con un TTPA > 250.0 s pero < 300.0 s, y el resto con

un TTPA < 175.0 s.

En la Tabla 4 se muestran el número y porcentaje de extractos activos en las

pruebas de TP y TTPA. De las Figuras 9 y 11 es claro que el extracto obtenido a

25°C a partir de Eisenia arborea fue el único que prolongó el tiempo de formación del

coagulo por arriba de 300 s en los dos ensayos. En el mejor de nuestro conocimiento

esta es la primera ves que se reporta la actividad anticoagulante de Eisenia arborea.

30

Tabla 3. Lista de algas recolectadas para este estudio.

ORDEN FAMILIA Especie (Autoridad)

Lugar de recolecta

Fecha

BRYOPSIDALES CODIACEAE Codium amplivesiculatum Setchell & Gardner, 1924 San Juan de la Costa junio de 2004 Codium brandegeeii Setchell & Gardner, 1924 San Juan de la Costa junio de 2004 Codium cuneatum. Setchell y Gardner, 1924 Playa La Concha junio de 2004 CERAMIALES CERAMIACEAE Spyridia filamentosa (Wulfen) Harvey in Hooker, 1833 Laguna de San Ignacio septiembre de 2004 RHODOMELACEAE Laurencia johnstonii S. y G, 1924 San Juan de la Costa junio de 2004 CLADOPHORALES CLADOPHORACEAE Cladophora sericea (Hudson) Kützing, 1843 Bahía Concepción agosto de 2004 CRYPTONEMIALES DUMONTIACEAE Dudresnaya colombiana Taylor, 1945 Isla La Gaviota junio de 2004 DICTYOTALES DICTYOTACEAE Padina mexicana Dawson,1944 San Juan de la Costa junio de 2004 FUCALES SARGASSACEAE Sargassum horridum S y G, 1924 San Juan de la Costa junio de 2004 GELIDIALES GELIDIACEAE Gelidium robustum (Gardner) Hollenberg & Abbott, 1965

Isla Natividad octubre de 2004

GIGARTINALES HYPNACEAE Hypnea valentiae (Turner) Montagne, 1841 Balandra junio de 2004 SOLIERIACEAE Sarcodiotheca dichotoma (Howe) Dawson, 1954 Isla La Gaviota junio de 2004 GRACILARIALES GRACILARIACEAE Gracilaria veleroae Dawson, 1944 Isla La Gaviota septiembre de 2004 Gracilaria vermicoluphylla (Ohmi) Papenphuss, 1966 Laguna de San Ignacio septiembre de 2004 Gracilaria subsecundata S y G, 1924 Playa La Concha junio de 2004 LAMINARIALES ALARIACEAE Eisenia arborea Areschoug, 1876 Punta Eugenia febrero de 2004 NEMALIALES LIAGORACEAE Ganonema farinosum (Lamouroux) Fan & Wang, 1974 Playa La Concha junio de 2004 SCYTOSIPHONALES SCYTOSIPHONACEAE Hydroclathrus clatrathus (Bory) Howe, 1920 Balandra junio de 2004 Chnoospora implexa Agardh, 1848 Playa La Concha junio de 2004 Rosenvingea intricata (Agardh) Børgesen, 1914 Playa La Concha junio de 2004 ULVALES ULVACEAE Ulva rigida C. Ag., 1822 Playa La Concha junio de 2004

31

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Codium amplivesiculatumCodium brandegeeii

Codium cuneatumCladophora sericea

Ulva rigida Dudresnaya colombiana

Spyridia filamentosaLaurencia johnstonii

Gelidium robustumHypnea valentiae

Sarcodiotheca dichotomaGracilaria veleroae

Gracilaria vermiculophyllaGracilaria subsecundata

Eisenia arborea Ganonema farinosum

Hydroclathrus clathratusChnoospora implexaRosenvingia intricata

Padina mexicanaSargassum horridum

Control

Tiempo de coagulación (TP en segundos)

0 50 100 150 200 250 300











Control

Tiempo de coagulación (TP en segundos)

Figura 9. Muestra el efecto de cada extracto crudo obtenido a 25°C con respecto al tiempo control de protrombina. Los extractos activos se indican con barras sólidas.

Figura 10. Muestra el efecto de cada extracto crudo obtenido a 80°C con respecto al tiempo control de protrombina. Los extractos activos se indican con barras sólidas.

32

0 50 100 150 200 250 300











Control

Tiempo de coagulación (TTPA en segundos)

0 50 100 150 200 250 300 350











Control

Tiempo de coagulación (TTPA en segundos)

Figura 11. Muestra el efecto de cada extracto crudo obtenido a 25°C con respecto al tiempo control de tromboplastina parcial activada. Los extractos activos se indican con barras sólidas.

Figura 12. Muestra el efecto de cada extracto crudo obtenidos a 80°C con respecto al tiempo control de tromboplastina parcial activada. Los extractos activos se indican con barras sólidas.

33

Tabla 4. Porcentaje de extractos activos en los ensayos de tiempo de protrombina y tiempo de tromboplastina parcial activada.

Número de extractos activos (por ciento) Temperatura de extracción

Número de extractos ensayados Ensayo de TP Ensayo de TTPA

25°C 21 5 (23) 13 (61)

80°C 20 4 (20) 17 (85)

41 9 (21) 29 (70)

Al estudiar la relación existente entre la concentración del extracto obtenido a

25°C a partir de Eisenia arborea y el efecto anticoagulante en el ensayo de PT

(Figura 13), se encontró que la concentración necesaria para duplicar el TP normal

(13 s) era ca. 25 μg mL-1.

Figura 13. Gráfico que muestra la relación entre la concentración y el efecto anticoagulante del extracto MM049F de Eisenia arborea en el ensayo de tiempo de protrombina.

0

50

100

150

200

250

300

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Concentración (μg mL-1)

TP (s

egun

dos)

0

50

100

150

200

250

300

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100


TP (s

egun

dos)

34

Hasta aquí, los resultados sugieren que el extracto crudo obtenido a 25°C a

partir de Eisenia arborea es fuente de sustancias con potente actividad

anticoagulante. Considerando que después de una revisión en numerosas bases de

datos (a través de SciFinder® y DialogWeb®) no se encontraron reportes sobre la

actividad anticoagulante de Eisenia arborea, se decidió someter esta alga a un

proceso de fraccionamiento guiado por bioensayo para determinar cual era el

compuesto responsable de la actividad anticoagulante observada.

6.2. Sobre el aislamiento y caracterización de la fracción con actividad anticoagulante, a partir de Eisenia arborea

Del procedimiento de extracción y precipitación fraccionada de Eisenia

arborea (Figura 7) se obtuvieron un total de 3 extractos a 25°C (MM049F1,

MM049F2, MM049F3) y 2 extractos a 80°C (MM049C1 y MM049C2). En la tabla 5 se

muestra el rendimiento y la actividad anticoagulante de los cinco extractos obtenidos.

Como se puede observar, el extracto MM049F2 mostró la mayor actividad en ambas

pruebas con un tiempo de coagulación > 300 s.

Tabla 5. Rendimiento y actividad anticoagulante de los extractos obtenidos por precipitación fraccionada a partir de Eisenia arborea.

Extracto

% Rendimiento (base seca)

TP (s) n =2 Promedio ± s.d.

TTPA (s) n =2 Promedio ± s.d.

MM049F1 2.50 36.3 ± 4.67 28.5 ± 0.71

MM049F2 1.30 >300 >300

MM049F3 0.62 13.3 ± 0.55 39.0 ± 1.41

MM049C1 6.05 15.0 ± 0.75 40.0 ± 2.83

MM049C2 0.85 20.6 ± 0.35 >300

Concentración neta de extracto en la cubeta de reacción 322.6 μg mL-1

En virtud de que el extracto MM049F1 obtenido a 25°C se obtuvo en mayor

rendimiento, se fraccionó por cromatografía de intercambio iónico (Figura 8). La

separación se monitoreó midiendo la concentración relativa de azúcares totales por

35

el método del fenol-ácido sulfúrico (Dubois et al., 1956). La absorbancia de cada

eluato se graficó según se muestra en la Figura 14, de donde es aparente que del

extracto MM049F1 de Eisenia arborea estaba constituido por 3 fracciones

polisacáridas bien diferenciadas.

Figura 14. Gráfico que muestra el patrón de elusión y fraccionamiento del extracto MM049F1 de Eisenia arborea.

De las 3 fracciones obtenidas por intercambio iónico a partir del extracto

MM049F1, la fracción 2 (CC2F2) resultó ser la más activa, con un TP y TTPA > 300 s

a las concentraciones de 80.6 y 16.1 μg mL-1, respectivamente. Las Figuras 15 y 16

muestran la relación entre la concentración de las fracciones y el efecto

anticoagulante en los ensayos de TP y TTPA, siendo aparente que se requiere ca. 19

μg mL-1 para duplicar el TP control, y ca. 3 μg mL-1 para elevar al doble el TTPA

control. La fracción 3 (CC2F3) mostró actividad marginal a la concentración máxima

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13Eluato

Abs

orba

ncia

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Abs

orba

ncia

Fracción 1Fracción 2

Fracción 3

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13Eluato

Abs

orba

ncia

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Abs

orba

ncia

Fracción 1Fracción 2

Fracción 3

36

Figura 15. Gráfico que muestra la relación entre la concentración de las fracciones obtenidas de MM049F1 y su efecto sobre el tiempo normal de coagulación según el ensayo de TP ( , , ).

Figura 16. Gráfico que muestra la relación entre la concentración de las fracciones obtenidas de MM049F1 y su efecto sobre el tiempo normal de coagulación según el ensayo de TTPA ( , ).

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300 350


TP (s

egun

dos)

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300 350


TP (s

egun

dos)

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300 350Concentración (μg mL-1)

TTPA

(seg

undo

s)

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300 350Concentración (μg mL-1)

TTPA

(seg

undo

s)

CC2F1CC2F1 CC2F2CC2F2 CC2F3CC2F3

CC2F1 CC2F2

37

de 322.6 μg mL-1, mientras que la fracción 1 resultó inactiva en los ensayos de TP,

pero mostró actividad en el ensayo de TTPA (266.0 ±5.6 s) a la misma

concentración.

El análisis químico de la fracción CC2F1 indicó que estaba constituida por

77.2% de azúcares totales, 4.4% de fucosa, 35.4 % de ácidos urónicos y baja

proporción (2.8%) de sulfatos (Tabla 6). Los resultados del análisis químico, y

espectral (discutido más adelante) junto con el orden de elusión cromatográfica

sugieren que CC2F1 es un poliuronato compuesto de ácidos urónicos

principalmente, fucosa sulfatada y trazas de otros azúcares neutros. El análisis

químico de la fracción CC2F2, Tabla 6, mostró una composición de alrededor del

56% de azúcares totales, 36.1% de fucosa, 45% de sulfatos y muy bajo contenido de

ácidos urónicos.

El análisis por cromatografía en placa fina del producto de hidrólisis de las

fracciones CC2F1 y CC2F2 (Figura 17) indicó la presencia de fucosa y galactosa en

el producto de hidrólisis de CC2F2. El espectro de infrarrojo de la fracción CC2F2

(Figura 19) mostró bandas de absorción típicas de un fucano, lo que concuerda con

el resultado del análisis químico de CC2F2. Esta asignación fue confirmada por

medio de resonancia magnética nuclear de 1H (Figura 22), en donde aparecieron

Tabla 6. Composición química de las fracciones CC2F1, CC2F2 y CC2F3 obtenidas a partir de Eisenia arborea.

Composición porcentual en base seca (promedio ±SD, n=2)

Azúcares totales Fucosa Ácidos urónicos *Sulfatos

CC2F1 77.2 ±0.1 4.4 ±0.2 35.4 ±0.2 2.8

CC2F2 56.2 ±0.1 36.1 ±1.2 1.3 ± 0.8 45

CC2F3 8.6 ±0.5 N. D. N. D. 25.9

N. D. = No determinado.

*Resultado de una sola determinación.

38

Figura 17. Cromatograma del producto de hidrólisis de las fracciones CC2F1 y CC2F2. 1) L-fucosa, 2) hidrolizado de CC2F1, 3) hidrolizado de CC2F2, 4) D-galactosa, 5) ácido D-galacturónico. Fase móvil: propanol:NH4OH:H2O (6:2:1).

señales con desplazamiento químico de por lo menos 3 protones anoméricos,

también se observaron señales de protones asignados al metilo de la fucosa y 2

señales que se asignaron a los protones del metilo de grupos acetato.

Adicionalmente, el análisis espectral, discutido más adelante, permitió establecer el

patrón de los sustituyentes y la naturaleza del enlace glucosídico presentes en

CC2F2. La Figura 18 muestra un modelo estructural parcial del fucano CC2F2

constituido por fucosa unida por enlaces α (1→3) principalmente, con sustitución de

grupos sulfato en la posición C4 y sustituciones menores alternadas de grupos

sulfato y acetilo en C2 y C3.

La fracción CC2F3 se obtuvo en cantidad insuficiente para llevar a cabo su

caracterización.

1 2 3 4 5

L-Fucosa

D-Galactosa

Ácido D-galacturónico

39

R = SO3 2-, H1-, CH3CO1-

Figura 18. Modelo estructural parcial propuesto para el fucano anticoagulante CC2F2 extraído a partir de Eisenia arborea.

→3)-α-L-Fuc-(1→3)-α-L-Fuc-(1→2)-α-L-Fuc-(1→ 4 2 3

R R R

2

R R

4 4

R

O

O

OO

O

RO

O

O

H3C

OROR

RORO

ROH3C

H3C

n

40

7. DISCUSIÓN

7.1. Sobre el potencial del recurso algal de Baja California Sur como fuente de polisacáridos anticoagulantes

De las 5 algas clorofitas sometidas a los ensayos de actividad anticoagulante,

Cladophora sericea y las tres especies del género Codium (C. cuneatum, C.

amplivesiculatum y C. brandegeeii) resultaron activas. El extracto obtenido a 25°C de

Cladophora sericea aumentó 4 veces el TP normal y más de 10 veces el TTPA

normal. No se encontraron reportes en la literatura sobre la actividad anticoagulante

de algas del género Cladophora. En el caso de las especies del género Codium, los

extractos (25° y 80°C) de Codium cuneatum dieron actividad anticoagulante en

ambos ensayos, mientras que los extractos de C. amplivesiculatum y C. brandegeeii,

mostraron actividad solo en el ensayo de TTPA. La actividad anticoagulante

encontrada en las algas del género Codium es consistente, en lo general, con lo

reportado en otros estudios en donde se ha demostrado que; C. dwarkense, C.

indicum, C. tomentosum, C. geppi (Shanmugam et al., 2002), C. fragile (Shanmugan

y Mody, 2000), C. pugniformis (Matsubara et al., 2000), C. giraffa (De Lara-Issasi y

Álvarez-Hernández, 1994) y C. latum (Uehara et al., 1992) son fuente de sustancias

con actividad anticoagulante.

De las algas rojas estudiadas, solo los extractos de Dudresnaya colombiana y

de Gracilaria subsecundata (25 y 80°C) mostraron actividad anticoagulante en el

ensayo de TP. Mientras que en el ensayo de TTPA resultaron activos los extractos

de Hypnea valentiae, Gelidium robustum y Sarcodiotheca dichotoma. Es un hecho

bien documentado que las algas pertenecientes a las familias de las Gelidiales,

Gracilariares y Gigartinales contienen proporciones variables de galactanos

sulfatados como el agar y los carragenanos, y se ha mencionado que la actividad

mostrada por algunos extractos provenientes de algas rojas, se debe a la presencia

de estos polisacáridos (Shanmugam y Mody, 2000). Considerando que el método de

obtención de los extractos sometidos a este estudio no es selectivo, es razonable

suponer que los extractos de Gracilaria subsecundata, Hypnea valentiae, Gelidium

41

robustum y Sarcodiotheca dichotoma podrían contener alguna cantidad de agar o

carragenanos, lo cual explicaría la actividad observada. Sin embargo, el estudio de

Gelidium crinale recolectado en las costas de Brasil, demostró que la actividad

anticoagulante era debida a un galactano sulfatado estructuralmente diferente al agar

o a los carragenanos (Pereira et al., 2005). Por otro lado, según nuestro

conocimiento, esta también es la primera vez en que la actividad anticoagulante de

Dudresnaya colombiana es reportada.

De las 7 algas cafés ensayadas, solo el extracto crudo obtenido a 25°C de

Eisenia arborea y el obtenido a 80°C de Hydroclathrus clathratus, mostraron

actividad en el ensayo de TP. El extracto de Eisenia arborea incremento el TP

(control = 13.43 s) más de 22 veces, mientras que el de Hydroclathrus clathratus lo

incrementó al doble. En el ensayo de TTPA, los extractos obtenidos a 25°C de

Rosenvingea intricada, Chnoospora implexa, Ganonema farinosum y Padina

mexicana, mostraron actividad anticoagulante similar, incrementando el TTPA control

en más de 3 veces y los extractos de Eisenia arborea, Hydroclathrus clatlatrus y

Sargassum horridum elevaron el TTPA más de 10 veces. Por otro lado, los obtenidos

a 80°C de todas las algas ensayadas, incrementaron el TTPA en más de 10 veces.

En general, nuestras observaciones muestran que el ensayo del TTPA es más

sensible que el de TP, pudiéndose alterar más fácilmente, aun a bajas

concentraciones de azúcares sulfatados. No se encontraron reportes en la literatura

sobre la actividad anticoagulante de Eisenia arborea o Hydroclathrus clatrathus que

nos permitieran comparar nuestros hallazgos. Sin embargo, sabemos que la notable

actividad anticoagulante de las algas cafés está relacionada directamente con la

presencia de polisacáridos fucoide (Church et al., 1989; Nishino et al., 1989; Nishino

y Nagumo, 1991; Nishino et al., 1991; Nishino y Nagumo, 1992; Nardella et al., 1996;

Chevolot et al., 1999; Pereira et al., 1999; Shanmugam y Mody, 2000; Pereira et al.,

2002; Berteau y Mulloy, 2003; Kuznetsova et al., 2003; Albuquerque et al., 2004;

Rocha et al., 2005; Silva et al., 2005). A pesar de la gran cantidad de información que

soporta tal afirmación, también es cierto que los fucoides son un grupo de

polisacáridos estructuralmente heterogéneo, por lo que aun queda mucho trabajo por

42

realizar, particularmente en lo relativo a la relación entre la estructura y su actividad

anticoagulante.

En términos generales, de los 41 extractos sometidos al ensayo de TP, 9

(22%) de ellos resultaron activos, mientras que de los mismos extractos en el ensayo

de TTPA, 29 (70%) mostraron actividad. Esto parece una proporción de extractos

activos muy alta si se considera que en un estudio similar, realizado con los extractos

de 32 algas recolectadas en las costas de los estados mexicanos de Guerrero,

Oaxaca, Quintana Roo y Tamaulipas, solo los extractos de Codium giraffa, Halimeda

discoidea y Sargassum hystrix resultaron activos, es decir menos del 10% del total

de los extractos ensayados (De Lara-Isassi y Álvarez-Hernández, 1994). Entonces,

¿Cómo se explica la marcada diferencia entre estos dos estudios? La principal razón

parece estar relacionada con aspectos metodológicos, tales como la concentración

del extracto en cada ensayo. En el presente estudio, todos los ensayos se realizaron

tomando 10 μL de una solución stock (10 mg mL-1) de cada extracto algal. Mientras

que el otro estudio, el material algal descongelado se extrajo con solución salina. La

mezcla se centrifugó y una alícuota de 100 μL del sobrenadante se empleó en los

ensayos. Sin duda, el volumen de la alícuota de cada extracto era el mismo, pero en

esas condiciones no era posible saber la concentración neta del extracto algal en

cada ensayo anticoagulante. Por ello, es altamente probable que al reinvestigar esas

32 especies algales en condiciones más estandarizadas, el número de extractos

activos se incrementara notablemente.

7.2. Sobre la caracterización y actividad anticoagulante de las fracciones obtenidas a partir de Eisenia arborea

El espectro de infrarrojo (Figura 19) de la fracción CC2F1 mostró bandas de

absorción a 3406 cm-1 debida a la vibración del enlace O—H. La banda de los 2935

cm-1 corresponde al estiramiento C—H. Las bandas a 1611 y 1417 cm-1 son

atribuidas a las vibraciones de los enlaces del grupo carboxilo. El espectro también

mostró bandas a 1070 y 1040 cm-1 correspondiente a las vibraciones de los enlaces

hemiacetálicos del anillo de azúcar. La señal observada a los 1256 cm-1 es atribuida

43

a la vibración de los enlaces de los grupos éster sulfato en general, mientras que a

los 815 cm-1 aparece una banda que se atribuye a la torsión de los grupos éster

sulfato en posición ecuatorial al anillo del azúcar.

Figura 19. Muestra el espectro de infrarrojo de la fracción CC2F1 obtenida a partir del extracto MM049F1.

Las bandas observadas a 890, 815 y el pequeño hombro a los 950 cm-1 en el

espectro de infrarrojo de CC2F1 concuerdan con las señales reportadas para

poliuronatos (Sartori et al., 1997, Ronghua et al., 2003). La baja intensidad relativa de

la señal a 1256 cm-1 confirma la baja concentración de sulfatos. La comparación

directa del espectro de infrarrojo de CC2F1 con uno de alginato de sodio (Figura 20)

obtenido de Eisenia arborea permite observar similitudes en sus bandas de

absorción que concuerda con las señales de infrarrojo reportadas para ácido

manurónico (Sartori et al., 1997; Tako et al., 2000).

100

815

890

950

1040

1131

12561311

1417

1611

2935

340610

20

30

40

50

60

70

80

90

1000 2000 3000 4000

Número de ondas cm-1

1070

% T

rans

mita

ncia

100

815

890

950

1040

1131

12561311

1417

1611

2935

340610

20

30

40

50

60

70

80

90

1000 2000 3000 4000


1070

100

815

890

950

1040

1131

12561311

1417

1611

2935

340610

20

30

40

50

60

70

80

90

1000 2000 3000 4000


1070

% T

rans

mita

ncia

44

Figura 20. Muestra los espectros de infrarrojo de la fracción CC2F1 obtenida a partir del extracto MM049F1 (A), y del alginato de sodio (B) obtenido de Eisenia arborea.

La presencia del carbonilo del ácido urónico se confirmó con la señal, en el

espectro de resonancia magnética nuclear de 13C (Figura 21), a δ 176.1 ppm. En este

mismo espectro se observó una señal de carbón anomérico (C1) a 100.7 ppm y otra

señal a campo alto a 17.6 ppm asignada a un carbón con hibridación sp3 típica del

metilo de la fucosa (Patankar et al., 1993). El grupo de señales entre las 60 y 80 ppm

corresponden a los carbonos del anillo de azúcar. Estos datos sugieren fuertemente

que la fracción CC2F1 está compuesta principalmente de ácidos urónicos, fucosa

sulfatada y trazas de otros azúcares (señales a 62, 60 ppm), la baja intensidad de las

señales correspondientes a la fucosa concuerda con su baja concentración (4.47%)

en la fracción CC2F1. En cuanto a la actividad anticoagulante, la fracción CC2F1 no

presentó actividad en el ensayo de TP, pero si en el de TTPA. La moderada actividad

de CC2F1 se explica con base en el hecho de que las concentraciones de fucosa y

sulfatos son bajas (Tabla 6) por lo cual es de esperarse una actividad débil, ya que el

contenido y patrón de sustitución de los grupos sulfatos son reconocidos como

factores importantes para el efecto anticoagulante (Nishino y Naguno, 1991a; Nishino

y Naguno, 1992; Chizhov et al., 1999; Shanmugam y Mody, 2000).

0

10

20

30

40

50

60

70

1000 1500 Número de ondas cm-1

% T

rans

mita

ncia

0

10

20

30

40

50

60

70

1000 1500 Número de ondas cm-1

% T

rans

mita

ncia

A

B

45

Figura 21. Muestra el espectro de resonancia magnética nuclear de 13C de la fracción CC2F1

Sin embargo, la fracción CC2F1 fue probada a alta concentración (322.6 μg mL-1) sin

producir un efecto anticoagulante significativo en el ensayo de TP. Esto sugiere que,

para ejercer el efecto anticoagulante por la vía extrínseca es más importante la

composición, el contenido y patrón de sustitución de los grupos sulfatos. La fracción

CC2F1 mostró actividad anticoagulante en el ensayo de TTPA prolongando más de 8

veces el tiempo normal de coagulación (30.02 ± 0.028 s) a la concentración de 322.6

μg mL-1. Esto sugiere que la composición monomérica, contenido y patrón de

sustitución de los grupos sulfatos es menos importante para producir un efecto

anticoagulante por la vía intrínseca. Los ensayos de actividad realizados a diferentes

concentraciones de la fracción CC2F1, mostraron una relación entre la concentración

y el tiempo de retrazo en la formación de coagulo (Figuras 15 y 16). Esta misma

relación permitió determinar que la concentración necesaria para duplicar el TTPA

normal es 86 μg mL-1 en la celda de reacción. Datos reportados sobre la actividad

anticoagulante del fucoidan y otros polisacáridos polianiónicos indican que estos

ejercen su efecto anticoagulante a través de un mecanismo que involucra al cofactor

II de la heparina potenciando su actividad directamente sobre la trombina (Church et

al., 1989; Rossi et al., 1999), es decir, una actividad anti-trombina y sin actividad

176.110 -COOH 100.7 C1

17.66 C6

176.110 -COOH 100.7 C1

17.66 C6

46

sobre ninguna otra proteinasa involucrada en la vía intrínseca, por lo que nosotros

consideramos que la fracción CC2F1 ejerce su efecto de la misma forma que el

fucoidan, aunque estructuralmente es un poliuronato. Es probable que la cantidad de

sulfatos, aunque baja, sea suficiente para potenciar el efecto anti-trombina del CIIH

ya que ésta enzima es potenciada por varios compuestos polianiónicos entre los que

se encuentran los glucosaminoglucanos y los fucanos principalmente, por el

mecanismo de acción alostérica.

El espectro de infrarrojo de la fracción CC2F2 (Figura 22) muestra bandas de

absorción típicas de fucanos. La banda a los 3461 cm-1 es debida a la vibración del

enlace O—H. La banda de los 2938 cm-1 corresponde al estiramiento C—H. La

banda a 1731 cm-1 corresponde a vibraciones del enlace del grupo carboxilo de

ésteres (Silva et al., 2005) y las bandas a los 1643 y 1456 cm-1 son atribuidas a las

vibraciones de los enlaces del grupo carboxilo de ácido (Tako et al., 2000). El

espectro también mostró bandas a 1070 y 1040 cm-1 correspondiente a las

vibraciones de los enlaces hemiacetálicos del anillo de azúcar. A los 848 cm-1

aparece una banda que es atribuida a la torsión de los enlaces de los grupos éster

sulfato en posición axial y un pequeño hombro a los 820 cm-1 que se atribuye a la

torsión de los enlaces del éster sulfato en posición ecuatorial al anillo del azúcar.

La fracción CC2F2 eluida con 1M de NaCl, tuvo un contenido mayor de

sulfatos que la fracción CC2F1, esto concuerda con las bandas de absorción del

espectro de infrarrojo, especialmente, la intensa banda alrededor de los 1250 cm-1

que es atribuida a los grupos sulfato en general (S=O) que es corroborada con la

banda de los 586 cm-1. Los datos de las bandas de absorción de fucanos reportados

en la literatura, indican que la banda alrededor de los 840-845 cm-1 es típica de

grupos sulfato axiales en posición O-4 del residuo de fucosa y un hombro alrededor

de los 830-820 cm-1, correspondiente a grupos sulfato en posición ecuatorial de los

C2 y C3 de los residuos de fucosa (Patankar et al., 1993; Chizhov et al., 1999;

Marais y Joseleau, 2001), lo cual sugiere un patrón de sustitución de fucosa

sulfatada en O-4 principalmente y con sustituciones menores en los carbonos 2 y 3.

Estos resultados son consistentes con los reportados en la literatura para el acetil-

fucoidan extraído de Cladosiphon okamuranus (Tako et al., 2000).

47

Figura 22. Muestra el espectro de infrarrojo de la fracción CC2F2 obtenida del extracto MM049F1 de Eisenia arborea.

El espectro de resonancia magnética nuclear de 1H de la fracción CC2F2

(Figura 23), permitió confirmar la presencia de fucosa por medio de las señales entre

δ 0.9 y 1.6 ppm que son típicas de protones del grupo metilo. Las señales a 1.54,

1.47 y 0.94 ppm forman parte de un grupo de señales que parecen ser dos tripletes

traslapados que sugieren que la fucosa podría estar sustituida en dos diferentes

posiciones (C4 y C2 ó C4 y C3). Los singuletes a 2.45 y 2.10 ppm se asignaron a los

protones de metilos de grupos acetato, la presencia de estas dos señales también

sugiere dos diferentes sustituciones sobre la fucosa. Aunque el traslape de las

señales hace imposible la interpretación completa del espectro, es claro que existen

por lo menos 3 señales a campo bajo entre 4.5 y 5.7 ppm de protones anoméricos.

820848

10401070

1250

1456

1643

17312938

3461

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1000 2000 3000 4000


% d

e Tr

ansm

itanc

ia

820848

10401070

1250

1456

1643

17312938

3461

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1000 2000 3000 4000


% d

e Tr

ansm

itanc

ia

48

Las señales entre 3 y 4.5 ppm corresponden a los protones de los anillos de

azúcares.

Figura 23. Muestra el espectro de resonancia magnética nuclear de 1H de la fracción CC2F2 obtenida del extracto MM049F1 de Eisenia arborea.

Las 2 señales alrededor de los 7.5 ppm son atribuidas a protones aromáticos

principalmente. La presencia de estas dos señales puede ser debida a que las

feofitas contienen una alta proporción de compuestos polifenólicos, por lo que

pueden estar como contaminantes en esta fracción, al no ser completamente

eliminados durante los procesos de extracción y purificación. El análisis químico de la

fracción CC2F2 mostró que contenía una alta concentración de fucosa, lo cual fue

corroborado por el resultado del análisis cromatográfico del hidrolizado de esta

fracción (Figura 17). Además, el cromatograma muestra una mancha de menor

intensidad con el mismo rf de la galactosa, lo que sugiere su presencia en esta

fracción. También se observaron otras manchas que sugieren la presencia de restos

de otros constituyentes. El resultado de todo este análisis es fuerte evidencia que

nos permite suponer que CC2F2 es un heterofucano sulfatado.

49

EL heterofucano CC2F2 mostró actividad anticoagulante potente en los 2

ensayos realizados. A la concentración de 322.6 μg mL-1 la coagulación fue inhibida

por completo incluso durante varias horas. En los ensayos de actividad a diferentes

concentraciones de CC2F2 (Figura 15 y 16) se determinó que la concentración

necesaria para duplicar el tiempo de coagulación en los ensayos de TP y TTPA fue

alrededor de 19 y 3 μg mL-1, respectivamente. En otro estudio se reportó que la

actividad anticoagulante de la heparina a 10 μg mL-1 fue de 125 s en el ensayo de

TTPA (Ronghua et al., 2003). Basados en las curvas de dosis-efecto anticoagulante

(Figuras 15 y 16) construidas para el heterofucano CC2F2 se determinó que la

concentración teórica equivalente para obtener el mismo efecto que la heparina en el

ensayo de TTPA fue 9.1 μg mL-1.

El perfil de actividad anticoagulante del heterofucano CC2F2 sugiere que, éste

modula la coagulación por la vía intrínseca y también por la vía común; es decir es

capaz de acelerar el efecto del cofactor II de la heparina y la vía común a partir del

factor Xa. Se ha reportado que el fucoidan actúa a través de los factores XI, XII y VIII

(factores de la vía intrínseca), pero no actúa sobre la antitrombina III, por lo que no

tiene ningún efecto sobre la vía extrínseca y que su efecto está más relacionado con

el cofactor II de la heparina (Kuznetsova et al., 2003). Por ello, es razonable esperar

que el heterofucano CC2F2 actúe a través del mismo mecanismo.

Con respecto al grado de sulfatación, nuestros resultados indican que el

incremento en el contenido de sulfatos provoca un aumento en la actividad

anticoagulante (TP y TTPA), esto se observa claramente si comparamos las

actividades y el contenido de sulfatos de las fracciones CC2F1 y CC2F2. El

contenido de sulfatos en la fracción CC2F1 (2.8%) es menor en comparación con el

contenido de sulfatos de CC2F2 (45%) y esa misma relación se observó con

respecto a la actividad anticoagulante. Esta observación es consistente con lo

reportado en la literatura donde se establece que la actividad anticoagulante se

incrementaba con el grado de sulfatación en los fucanos obtenidos de Ecklonia

kurome sulfatados sintéticamente. Al mismo tiempo, se reportó que la actividad

anticoagulante llega hasta un máximo y comienza a disminuir cuando la proporción

50

entre la concentración de sulfatos y azúcares totales es 1. También se estableció que

los grupos sulfato son importantes para unir y activar el cofactor II de la heparina

(Nishino y Naguno, 1992). Por otro lado, existe evidencia que sugiere que el patrón

de sustitución de los grupos sulfatos es más importante para el efecto anticoagulante

que la composición monomérica del polisacárido, por ejemplo, un número de

polisacáridos con composición monomérica diversa han sido reportados como

anticoagulantes, entre ellos, se encuentran algunos glucanos, galactanos, alginatos,

heterofucanos y hasta flavonoides sulfatados, entre otros (Hoffman et al., 1982;

Matsubara et al., 2000; Alban y Franz, 2001; Gunnarsson y Desai, 2002; Ronghua et

al., 2003; Albuquerque et al., 2004). Nuestros resultados son consistentes con esta

observación, ya que las fracciones CC2F1 y CC2F2 son diferentes en composición

monomérica y grado de sulfatación.

51

8. CONCLUSIONES

El estudio preliminar del potencial del recurso algal encontrado en Baja

California Sur como fuente de compuestos con actividad anticoagulante, nos mostró

en general que de cada 10 extractos, 7 eran activos en el ensayo de TTPA, mientras

que 2 de ellos eran activos en el ensayo de TP. Según nuestro conocimiento, la

mayor parte de las especies sometidas a este estudio no habían sido investigadas

antes desde este punto de vista. En estas circunstancias, es claro que el recurso

algal encontrado en Baja California Sur representa una “gran reserva” de sustancias

con actividad anticoagulante que debe ser explorada profundamente.

El estudio sobre la caracterización y actividad anticoagulante de las fracciones

polisacáridas obtenidas a partir de Eisenia arborea, nos condujo a la obtención del

heterofucano CC2F2. El análisis estructural de CC2F2 reveló que estaba compuesto

principalmente de fucosa unida por enlaces α(1→3), con sustituciones de grupos

sulfato y/o acetato en el carbón 4 (enlace axial) y sustituciones menores en los

carbonos 2 y 3 (enlace ecuatorial). El heterofucano CC2F2 mostró una actividad

anticoagulante comparable a la de la heparina. Esta evidencia ayuda a soportar la

afirmación enunciada al final del párrafo anterior.

52

9. RECOMENDACIONES PARA TRABAJOS FUTUROS

El estudio del potencial del recurso algal encontrado en Baja California Sur

como fuente de compuestos anticoagulantes nos condujo a la investigación de

Eisenia arborea, que derivó en el aislamiento del heterofucano anticoagulante

CC2F2. Sin embargo, también se identificaron otras especies activas, como

Cladophora sericea, Dudresnaya colombiana e Hydroclathrus clatrathus las cuales

no han sido estudiadas previamente desde este punto vista. Por esa razón, se

recomienda estudiar estas algas para identificar la sustancia responsable de la

actividad anticoagulante.

En virtud de la interesante actividad anticoagulante del heterofucano CC2F2

aislado a partir de Eisenia arborea, se recomienda caracterizar más detalladamente

su estructura. Es decir, establecer inequívocamente la polidispersión, la posición, tipo

de enlaces y patrón de los sustituyentes. Es recomendable establecer un método de

extracción de CC2F2 que garantice un producto con características estándar. Así

mismo se recomienda realizar estudios espacio-temporales para determinar si

existen variaciones en la estructura de CC2F2 por efecto de la temporada o lugar de

colecta de Eisenia arborea.

53

10. LITERATURA CITADA

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63

ANEXO A

Tabla 7. Resultado del análisis de varianza para tiempo de tromboplastina parcial activada.

SS Degr. of MS F p

Intercepto 2528286 1 2528286 44389.79 0.00 Especie 886717 21 42225 741.35 0.00 Temperatura 57623 1 57623 1011.70 0.00 Especie*Temperatura 322130 21 15340 269.32 0.00 Error 2506 44 57

Tabla 8. Resultado de la prueba de Tukey para tiempo de tromboplastina parcial activada.

25ºC 80ºC

Especie TTPA

X ±d.s. n=2

Tukey TTPA

X ±d.s. n=2

Tukey Codium amplivesiculatum

55.0 ±6.3

0.366

85.8 ±1.8

0.000

Codium brandegeeii 51.2 ±0.0 0.710 >300.0 0.000 Codium cuneatum >300.0 0.000 >300.0 0.000 Cladophora sericea >300.0 0.000 ------ ------ Ulva rigida 28.6 ± 0.8 1.000 72.2 ±1.2 0.001 Dudresnaya colombiana >300.0 0.000 >300.0 0.000 Spyridia filamentosa 44.0 ±7.1 0.997 52.5 ±3.5 0.591 Laurencia johnstonii 40.3 ±7.0 0.999 31.9 ±1.6 1.000 Gelidium robustum 176.1 ±9.6 0.000 76.1 ±5.2 0.000 Hypnea valentiae 85.5 ±9.3 0.000 279.7 ±6.7 0.000 Sarcodiotheca dichotoma 44.2 ±5.7 0.997 266.1 ±43.1 0.000 Gracilaria veleroae 44.5 ±1.8 0.996 34.0 ±1.3 1.000 Gracilaria vermiculophylla 27.9 ±0,1 1.000 33.7 ±2.8 1.000 Gracilaria subsecundata >300.0 0.000 >300.0 0.000 Eisenia arborea >300.0 0.000 >300.0 0.000 Ganonema farinosum 112.0 ±4.2 0.000 >300.0 0.000 Hydroclathrus clatrathus >300.0 0.000 >300.0 0.000 Chnoospora implexa 114.8 ±4.7 0.000 >300.0 0.000 Rosenvingia intricata 111.9 ±9.4 0.000 >300.0 0.000 Padina mexicana 100.1 ±7.6 0.000 >300.0 0.000 Sargassum horridum >300.0 0.000 >300.0 0.000 Control 30.0 ±0.0 1.000 30.02 ±0.0 1.000

Los valores menores a 0.05 significan estadísticamente diferente al control.

64

Tabla 9. Resultado del análisis de varianza para tiempo de protrombina.

SS Degr. of MS F p Intercepto 38093.54 1 38093.54 11033.66 0.00 Especie 16730.42 21 796.69 230.76 0.00 Temperatura 92.39 1 92.39 26.76 0.00 Especie*Temperatura 9609.72 21 457.61 132.54 0.00 Error 151.91 44 3.45

Tabla 10. Resultado de la prueba de Tukey para tiempo de protrombina.

25ºC 80ºC

Especie TP

X ±d.s. n=2

Tukey TP

X ±d.s. n=2

Tukey Codium amplivesiculatum

13.6 ±0.2

1.000

13.3 ±0.3

1.000

Codium brandegeeii 11.2 ±0.0 1.000 14.5 ±0.3 1.000 Codium cuneatum 35.5 ±0.7 0.000 72.0 ± 2.8 0.000 Cladophora sericea 48.5 ±0.7 0.000 ---- ------ Ulva rigida 12.6 ±0.0 1.000 12.9 ±0.6 1.000 Dudresnaya colombiana 44.4 ±3.9 0.000 50.4 ±10.7 0.000 Spyridia filamentosa 13.0 ±0.0 1.000 16.0 ±1.4 0.999 Laurencia johnstonii 12.8 ±0.4 1.000 12.9 ±01 1.000 Gelidium robustum 13.5 ±0.3 1.000 13.4 ±0.1 1.000 Hypnea valentiae 12.6 ±0.3 1.000 13.6 ±0.3 1.000 Sarcodiotheca dichotoma 13.3 ±0.0 1.000 15.5 ±1.1 1.000 Gracilaria veleroae 12.8 ±0.0 1.000 12.9 ±0.0 1.000 Gracilaria vermiculophylla 13.4 ±0.2 1.000 13.3 ±0.3 1.000 Gracilaria subsecundata 27.5 ±0.7 0.000 27.0 ±0.0 0.000 Eisenia arborea >300.0 0.000 16.8 ± 1.6 0.998 Ganonema farinosum 17.0 ±0.0 0.995 16.0 ±1.4 0.999 Hydroclathrus clatrathus 16.5 ±1.6 0.999 26.0 ±0.3 0.000 Chnoospora implexa 11.8 ±0.1 1.000 17.0 ±0.1 0.995 Rosenvingia intricata 11.6 ±0.3 1.000 17.5 ±0.6 0.995 Padina mexicana 11.2±0.4 1.000 13.5 ±0.1 1.000 Sargassum horridum 13.9 ±0.1 1.000 13.6 ±0.1 1.000 Control 13.4 ±0.2 1.000 13.4 ±0.2 1.000 Los valores menores a 0.05 significan estadísticamente diferente al control.

extracciÓn y caracterizaciÓn de polisacÁridos con

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