UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

TESIS DOCTORAL

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

PRESENTADA POR

Joaquín González Revaldería

Madrid, 2015

© Joaquín González Revaldería, 1988

Excrección urinaria de tromboxano B2 (TxB2) como

marcador de rechazo en transplante renal humano

Departamento de Bioquímica

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

Facultad de Ciencias Qufmicas

Departamento de Bioquimica

1111111111111 * 5309873002*

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE

-·-

EXCRECCION URINARIA DE TROMBOXANO 8 2

(TxB2) COMO MARCADOR DE RECHAZO EN TRANSPLANTE RENAL HUMANO

Colecci6n Tesis Doctorales. N.R 37/88

© Joaquin Gonzalez Revalderia

Edita e imprime Ia Editorial de Ia Universidad Complutense de Madrid. Servicio de Reprografia Noviciado, 3 - 28015 Madrid Madrid, 1988 Ricoh 3700 Deposito Legal: M-2155-1988

A QUIENES TANTO DEBO

II

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. D. Joaquin Ortuiio Mirete por su supervisi6n y jui­

cios cr1ticos, sin cuya ayuda hubiese sido imposible la consecu­

ci6n de ~ste trabajo.

A ca. Carmen Revalder1a por su inquebrantable apoyo dura~

te la realizaci6n del trabajo y por su labor mecanogr!fica en la

preparaci6n del original.

Al Dr. D. Jos~ Luis Teruel Briones por s·u amabilidad y

paciencia.

A los· facul tativos del Servicio de Nefrolog!a y, en gene­

ra~, a todo el personal del Hospital Ram6n y Cajal per su compafi!

rismo y porque cualquiera puede enseiiar algo a quien est~ dispue!

to a aprender.

A todo~ aqu~llos que con sus· consejos y opiniones han co­

laborado en la forma final del presente trabajo.

III

INDICE

1.- INTRODUCCION 1

1.1.- BIOOUIMICA DE LAS PROSTAGLANDINAS Y TROMBOXANOS 1

1.2.- TRANSPLANTE RENAL Y RECHAZO 11

1.3.- INDICADORES DE RECHAZO EN TRANSPLANTE RENAL 15

2.- OBJETIVOS 19

3.- DETERMINACION DE LOS NIVELES URINARIOS DE TxB2 20

3.1.- ELECCION DEL M£TODO. ANTECEDENTES 20

3.2.- MATERIAL Y M£Tooos 21

3.2.1.- RECOLECCION DE LAS MUESTRAS URINARIAS 21

3.2.2.- OIALISIS 22

3.2.3.- EXTRACCION 22

3.2.4.- CROMATOGRAFIA LIOUIDA DE ALTA EFICACIA 23

3.2.5.- RADIOINMUNOENSAYO 24

3.2.6.~ PROCEDIMIENTOS ESTADISTICOS 30

3 .• 3.- RESULTADOS 31

3.3.1.- PURIFICACION DE LAS MUESTRAS 31

3.3.1.1.- DIALISIS 31

3.3.1.2.- EXTRACCION ORGANICA 33

3.3.1.3.- CROMATOGRAFIA L!QUIDA DE ALTA

EFICACIA EN FASE REVERSA. 33

3.3.2.- INFLUENCIA DEL pK URINARIO 37

3.3.3.- PRECAUCIONES EN LA MANIPULACION Y ALMA-

CENAMIENTO DE LAS MUESTRAS 37

IV

3.3.4.- TRATAMIENTO DE LOS BLANCOS

3.3.5.- CALCULO DE RESULTADOS

3.3.6.- FIABILIDAD DE LA T£CNICA

3.3.6.1.- PARALELISMO

3.3.6.2.- PRECISION

3.3.6.3.- EXACTITUD

3.3.6.4.- ESPECIFICIDAD E INTERFERENCIAS

MEDICAMENTOSAS.

3.3.6.5.- SENSIBILIDAD

3.3.7.- INFLUENCIA DE LOS TIEMPOS DE INCUBACION

3.3.8.- PRESENCIA URINARIA DE CSLULAS SANGUINEAS

3.3.9.- VALORES NORMALES

3.3.10.- INFLUENCIA DE LA CIRUGtA

3.4.- DISCUSION

~.- TxB2·EN TRANSPLANT£ RENAL HUMANO 4.1.- PACIENTES Y M£TODOS

4.1.1.- ENFERMOS

4.1.2.- INMUNOSUPRESION

4.1.3.- DIAGNOSTICO DE NECROSIS TUBULAR AGUDA

4.1.4.- DIAGNOSTICO DE RECHAZO

4.1.5.~ RECOLECCION DE MUESTRAS

4 .1. 6 • - Ml::TODOS ANAL!TICOS

4.1.6.1.- DETERMINACION DE TxB 2

4.1.6.2.- DETERMINACION DE NIVELES DE

40

42

44

46

46

49

51

51

53

53

56

sa

60

67

67

67

67

68

69

72

73

73

CREATININA 73

4.1.6.3.- DETERMINACION DE SODIO Y POTASIO 73

v

4.1.7.- PROCEDIMIENTOS ESTAD!STICOS

4 • 2 • - RESULTADOS

4.2.1.- GRUPO A: TRANSPLANTE NO COMPLICADO

4 • 2. 2.- GRUPO B: RECHAZO SOBRE INJERTO PREVIAMENTE

74

74

75

FUNCIONANTE 77

4.2.3.- GRUPO C: NECROSIS TUBULAR AGUDA SIN RECHAZO 83

4.2.4.- GRUP9 0: RECHAZO SOBRE NECROSIS TUBULAR

AGUDA PREVIA

4.2.5.- SIGNIFICACION DE LAS DETERMINACIONES DE

TxB.2 Y TxB2/Cr

4.3.- DISCUSION

5.- CONCLUSIONES

6.- BIBLIOGRAFIA

7.- APENDICES

7 .1.- C.!U.CULO DE LAS CONCENTRACIONES DE TxB2 MEDIANTE UN

CALCULAOOR PROGRAMABLE HP-9 7

7.1.1.- MANEJO

7.1.2.- LI'STADO

7.2.- ANALISIS DE LA VARIANZA Y DE REGRESION

7.2.1.- MANEJO

7.2.2.- LISTADO

83

87

91

96

98

117

117

117

118

119

119

121

VI

ABREVIATURAS

PG Prostaglandina (PGA2, PGB2 , PGE2 , PGI 2)

Tx Tromboxano (~xA2 , TxB2 >

PLA Fosfolipasa (PLAf, PLA2 )

EDTA

CLAE-FR

Ag

* Ag

Ac

%B/B0

X

OS

cv

EfNa

cr5,cr

0

NTA

ECO

6-MP

HD

Acido etilendiamintetrac~tico.

Cromatograf!a l!quida de alta eficacia en fase reversa.

Ant1geno

Ant!geno marcado radiactivamente.

Anticuerpo

~laxima cantidad de ant1:geno que puede unirse a una canti­

dad determinada de anticuerpo en las condiciones de analisis.

Fracci6n de ant1qeno marcado unido respecto del m~imo de

uni6n.

Media.

Desviaci6n t1:pica

Coeficiente de variabilidad

Excrecci6n fraccional de sodio.

Concentraci6n plasmaticajurinaria de creatinina.

Necros·is tubular aguda.

Ecograf!a

6-metil prednisolona

Hemodialis·is-.

-1-

1.- INTRODUCCION

1.1.- B!OQU!MICA DE LAS. PROS'l'AGLANDINAS Y TROMBOXANOS

Las prostaglandina~, tromboxanos y leucotrienos constitu­

yen una familia de compuestos conocida generalmente como eicos.!

noides o productos ~e la "cascada del 4cido araquid6nico". Su

importancia fisiol6gica se ha puesto de relieve durante la tilt!_

ma d~cada y son considerados hoy dta como un grupo de mol~culas

mediadoras cuy~s dianas se encuentran muy cerca del sitio de

s1ntesis.

Las pros·taqlandi:nas muestran una gran variedad de efectos

fisiol6gicos, algunos· de los cuales son completamente opuestos.

As1, la prostaglandina E2 (PGE2l, que quiz! haya sido lamas am

pliamente estud:tada, es capaz de inducir fiebre, vasodilataci6n,

aumento de la permeabiltdad vascular (lo que oriqina la formaci6n

de edemas), contracci6n del m~sculo liso del titero, etc ..•• El

tromboxano A2 (TxA2 l produce agregaci6n plaquetaria y broncocon~

tricci6n, mientras· que la prostaciclina (PGI2) es el mas eficaz

agente antiagregante plaquetario de origen natural conocido (2) •

Se ha comprobado, adem4s·, que en la diabetes el TxA2 est4 aume_!!

tado y la PGI 2 disminufda (3, 4}. Tambi6n est4 aumentado el TxA2

en el shock endot6x±co (5}, hidronefrosis {6, 7}, nefropat1as.

obstructivas (8}, enfermedades coronarias isqubicas (9, 10),

lupus eritematoso Clll, s1ndrome hepatorrenal (12, 13) e isque­

mia cerebral (141, entre otros muchos.

-2-

Las prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos derivan

enzimaticamente de los 4cidos grasos insaturados de 20 4tomos

de carbona, siendo su principal precursor el 4cido araquid6n!

co (4cido cis-5, 8, 11, 14-eicosatetraenoico), el cual provi~

ne del ~cido graso esencial linoleico (15) • Este da lugar a

las prostaglandinas de la serie "2", mientras que las formadas

a partir del 4cido dihomo-Y- linoleico y del eicosapentanoico

o .timn6dico orig:i.:nan, respect:i.:vamente, las prostaglandinas de

las series "1" y· "3". Estes indices hacen referencia al nGmero

de instauraciones que conservan las prostaglandinas en su mole

cula y que son dos menos que las que posee el 4cido graso pre­

cursor. Es·te nt:irnero es el que se escribe como sub1ndice cuando

se las nombra.

Una vez inger~do en la d:i.:eta, el ~cido linoleico sufre

primero una deshidrogenac:i.:6n catali:zada por la ~ 6-desaturasa

la cual forma un doble enlace c:i.:s dando lugar al 4cido Y-lino­

leico. Posteriormente la mol~cula aumenta su longitud en dos

~tomes de carbona dando lugar al 4cido dihomo- r-linoleico y,

por fin, actua una ~2desaturasa r±ndiendo 4cido araquid6nico

ll&l, lFigura,ll.

El 4cido araquid6nico esterifica la posici6n fC6 2) de

los fosfol!pidos (.en especial del fosfatidilinositol y de la

fosfatidilcolinal, como es norma general en los 4cidos grasos

poliinsaturados· (Fig. 2). Sin embargo, para la formaci6n de los

eicosanoides ha de estar libre. La enzima que hidroliza la

uni6n del araquid6nico al esqueleto carbonado del glicerol es

-3-

0

~5-CoA llnoloii-CoA

1 ~S-CoA

0

1 S-CoA

0

1 0

S-CoA

aracauldonll -CoA

FIGURA 1.- Etapas de formaci6n del araquidonil-CoA a partir del acido

llnoleico.

(ex)

PLC PLO

(oc) H2c-o\® \ •

FIGURA 2.- Representacion esquematica de una molecula de fosfol!pido

y de los puntos de ataque en.zilllatico de 1& fosfolipasa.

R' , R: residues de acidos grasos; P: fosfato1 B: colina, etanolamina, inositol o serina.

-4-

la fosfolipasa A2 tPLA2l y~en menor porporci6n,las fosfolipasas

c y o. El paso hidrolttico es el limitante en la velocidad de

producci6n de los eieosanoides. Esta enzima se activa por una

qran cantidad de estfmulos tanto mec!nicos como f1sicos, hormo­

nales, inmunol6qicos, etc ••• (17). La fosfolipasa A2 est! fo~

da por un qrupo heter6loqo de enzimas ampliamente distribu1das

en las· c'lulas- eucariotas-. Este tipo de enz:Lmas se suele divi­

dir en dos qrupos:

- Formas unidas a la membrana, las cuales requieren calcio

y pH neutro para una activ~dad catal1tica 6ptfma, siendo accesi­

bles desde el exterior celular, y

- Formas- solubles, las cuales no requieren calcio y su pH

6pt~o es 4cido.

Tanto la PLA1 como la PLA2 se inhiben por un cierto nt'lme­

ro de compues-tos, s-iendo los mis conoc.tdos los- qlucocorticoides.

Estos actflan sobre el n11cleo eelular induciendo la s-tntesis de

la prote!na maeroeortina (181 y/o de lipomodulina (19) que son

los verdaderos fnhibi:dores de la fosfolipasa. Otros compuestos

inhiben las fosfolipasas por interacci6n con los fosfol1pidos,

impidiendo el ataque enzim4tico a estes. Entre ellos se encuen­

tran los compuestos- cati6nicos- del tipo de la mepacrina y la

clorpromacina y los poliam1nicos como la putrescina y la esper­

midina. Otro tipo de inhibidores, como el 4cido etilendiaminte­

trac,tico (EDTAl, aetGan interfiriendo la uni6n del ca2+, que

es necesaria para mantener la conformaci6n estructural de la en

zima Cl7l.

Una vez liberado, el 4cido araquid6nico es- atacado, bien

-s-

por la ciclooxigenasa para dar lugar a las prostaglandinas y

tromboxanos, bien por la lipooxigenasa para originar los leuco­

trienos (Figuras 3 y 4) •

La ciclooxigenasa o prostaglandina endoper6xido sintetasa

(EC 1.14.99.1) presenta dos tipos de actividad enzim&tica. En

primer lugar actQa la actividad oxigenasa introduciendo dos at~

mos de oxigeno en las posiciones 9 y 11 de la mol~cula de !cido

araquid6nico, dando lugar a un producto intermedio, el hidrope­

roxiendoper6xido PGG2 , que posee una vida media de 5 minutes en

medio acuoso y a pH fisiol6gico. Inmediatamente actQa sobre PGG2

la actividad peroxid!sica liberando el hidroxiendoper6xido PGH2 junto con especies oxtdadas de estructura no conocida (20). Esta

enzima es una glicoprotetna que contiene 12 moles de manosa y 5

de N-acetilglucosamina por mol de enztma. Su peso molecular es

de 126.000 siendo el de la cadena polipept!dica de 69.000 (21).

Para la primera actividad la enzima prectsa del grupo hemo, el

cual esta muy debilmente unido y de tript6fano u otro agente re­

ductor para proteger a la enzima de la acci6n peroxid!sica. Este

agente se consume estequiometrtcamente al reducir el qrupo hidro

perOxide intermediario (22) •

La ciclooxigenasa es una enzima muy ampliamente distribu1-

da de la que se ha secuenciado su extremo amino terminal (23) •

Es inhibida irreversiblemente por la aspirina mediante la aceti­

laci6n de una serina del centro activo, que se encuentra en el

extremo amino terminal y, reversiblemente, por los antiinflamato

rios no estero!dicos del tipo de la indometacina (24), que actuan

sobre dos sitios: el centro activo, lo que determina la potencia de

~ .. ~

PtoStaddina

l

L Hfi. I

OH

6-om-PGF\oe.

110.

~M HO' . :

OH

-6-

.................

l ~COOH ·~

p~

FIGURA 3.- Formacion de prostaglandinas y tromboxanos a partir del acido

araquid6nico {via de la ciclooxigenasa).

~ 1 ~ Acldo o•lflttld6AICO

~ 1 Achlo 1!41droporoal• '_

-1- eiCQI&enaonolco ·

~· l .f, Leucaulano A4

HO

I I I I J,

E•p••••• oci4Uias (I. T a4• ,,,,..,.~

-7-

rrou ••••"'""••

HO

+----------

FIGURA 4.- Formaci6n de leucotrienos a partir del &cido araquid6nico (vta de la lipoaxi9enaaa>.

1: 5-llpoax19•n&N 2 a Leucotrieno A.t epSxido hidrolasa 3: Glutation tranaferaaa 4' Y'- Glutaail•transpeptidasa 5: Ciateini1-91icina dipept.tdasa 6: Cicloaxi9enaaa 7: Glutatioa pezooxidasa

-8-

la acci6n de es·tos· compuestos, y el sitio suplementario, con el

cual debe existir tambi~n una interacci6n para una adecuada efi

cacia inhibidora(25} •

A partir de los endoper6xidos c1clicos se forman las dis­

tintas prostaglandinas y· tromboxanos. Para el TxA2 y la PGI 2 se

han identificado s·intetasas· pero para las restantes prostaglan­

dinas no se sabe con seguridad si su formaci6n est~ catalizada

enzimaticamente (20), aunque se ha llegado a aislar una enzima

con actividad s·intetasa de PGE2 (26} •

Existen distintos tipos de prostaglandinas·; asl, las de

la serie E son f-hidroxiacetonas; las de la F, dioles 1,3; las

de la A, cetonas ~ ,p-insaturadas, el TxA2 , un hemiacetal 1!­

bil, etc ••• En cada c~lula, al activarse la cascada del acido ara

quid6nico se forma una mezcla de prostaglandinas predominando

unas· sobre otras· dependiendo de la c~lula, tej ido o especie de

que se trate.

La tromboxano srntetasa es una enzima que ha sido solubili­

zada y separada de la ciclooxigenasa (27, 28), la cual actfia iso­

merizando la PGH2 a TxA2 y, en las plaquetas.,. que es· d6nde princ!_

palmente se s·intetiza el TxA2 ,. se localiza en el sistema tubular

denso. Esta enzfma es inhibida especrficamente por el imidazol

(291.

El TxA2 (Figura 31 posee en su mol!cula un anillo oxano y

un grupo hidroxilo hemiacetalico. Fue identificado por vez prime­

ra por Samuelsson .(30} al estudiar el metabolismo de los 4cidos

grasos· en las plaquetas. Este COlllpuesto result6 ser el responsa-

-9-

ble de la constricci6n de la aorta de conejo que se habia detec-

tado anteriormente por bioensayo (31). Recientemente se ha sinte

tizado quimicamente, a partir de TxB 2 , un compuesto con la ex­

tructura asignada por Samuelsson al TxA2, comprob!ndose que po­

see las mismas propiedades fisiol6gicas que 6ste, por lo que se

considera correcta la pr~era estructura propuesta para el com-

puesto fisiologicamente activo (32) •

El TxA2 en med~o acuoso y a pH fisiol6gico es inestable,

teniendo una vida media de 32 s. Este compuesto se transforma en

TxB 2, que es el !cido 8 - (l-hidroxi-3-oxopropil)- 9,12 L-dihi­

droxi- 5,10 - heptadecadienoico, por medic de un ataque nucleofi

lico del aqua. El TxB 2 es estable perc posee poca actividad bio­

l6gica.

Las prostaglandinas, en general, se degradan por medic de

oxidaciones que conducen a una marcada p6rdida de actividad bio-

16gica. En la Figura 5 se muestra la ruta de degradaci6n m!s ha-

bitual de las prostaglandinas, existiendo tambi6n, procesos de

)3Y UJ-oxidaci6n (20). El paso limitante es la conversi6n catali

zada por la 15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa. Esta enzima

y la A13-prostaglandina reductasa utilizan NAD+ como cofactor

(33), aunque la segunda puede utilizar tambi6n NADP+, dependie~

do del tipo de c6lula en que se encuentre (34).

El TxB 2, producto de degradaci6n del TxA2, puede sufrir

posteriores modificaciones en su mol6cula, habiendose identifica

do hasta 20 metabolites urinarios ·{35-38), siendo los principa­

les el 2,3-dinor-TxB2 y el 2, 3, 4, S-tetranor-TxB2 (Figura 6),

-10-

~COOH H~

PGEz

1 ,S-hidfOJ<IPrG&I&91&ndl ....

d•staldtov•nasa

0

~COOH ~~

HO 8 \5-0Xo-PGE 2

1 A 'I:!. prouaolandlou

reduct at.•

~H HO 0

13,14-dihidro- \5-oxo-PGE2

1 15-o•oprosug;latodl~

reduccua

0

~H HO H "oH

\3, t4-dihidro-PGE2

FIGURA 5.- Catabolismo de los productos formados en la via de la ciclooxiqenasa.

QH

. ~/~COOH

HO~ OH

2,3-dinor~TxB2

OH OH ~ ..... ......._....,cooH

HO~ OH

o~" OH

2,3.4.5 -tetranor-Tx 82 11 -dehidro-TxB2

FIGURA 6.- Princtpales productos de degradacion del. TxB2

-11-

los cuales son productos de ~- oxidaci6n ( 39) • El siquiente ca­

tabolite en importancia resulta de la deshidroqenaci6n del al-

cohol hemicet~lico lo que da luqar al ll-dehidro-TxB2 • Este com

puesto puede sufrir posteriormente una deshidroqenaci6n de alco

hol del carbono 15 y reducci6n de los dobles enlaces AS y ~ 13

Un qrupo minoritario de metabolites excretados son compuestos

no c!clicos con qrupos hidroxilo en C-11 y c-12.

1.2.-TRANSPLANTE RENAL Y' RECHAZO.

El transplante renal es· un tratamiento habitual, casi ru-

tinario, de la insufic:tencia renal cr6nica. Sin embargo, aunque

cada d!a se obtienen mejores· res-ultados, el rechazo del injerto

constituye el principal problema del transplante, ocasionando

del75% al 80% de las· causas de p~rdida del riii6n {40).

En la actual:tdad el diaqn6s·tico de rechazo se realiza ba­

s4ndose en el siquiente conjunto de par!metros.

* Siqnos y s1ntomas cl.tn:tcos:

- P:tebre

.... Aparic~:6n de edemas

-. Hipertensi6n arterial

- Dolor sobre el injerto

-. Malestar. qeneral, as·tenta,

- Dism:i:nuc:t6n de la diurests·

-12-

* Par~etros anal.tticos·:

- Aumento de urea y creatinina plasm4tica

o disminuci6n acusada de su ritmo de

descenso.

Disminuci6n de la excrecci6n urinaria de

Na+

Proteinuria

* Ecoqraf!a:

- Aumento del tamafio de la silueta renal

- Hipertrofia de las pir~ides renales

Disminuci6n de los ecos del seno renal

Este procedimiento detecta la presencia

de masas en la pelvis: linfocele, hematoma

o urinoma. As1mismo, la ecoqraf!a se utili

za para detectar procesos obstructivos.

* Histoloq!a:

Presencia de infiltrados intersticiales

y perivasculares de cEHulas mononucleadas.

- Edema intersticial

-· Extravasaci6n eri:trocitaria

* Procedi~iento~ isot6picos:

Los e~tudfos· con 99Tc y plaquetas marcadas

con Indio suministran informaci6n sobre la

vas~ularizaci6n del 6rqano transplantado.

Una pobre vascularizaci6n del injerto pue-

de estar presente en procesos de rechazo.

-13-

* Arteriograf!a:

- Oetecci6n de lesiones· en las principales

arterias·.

Ninguno de es·tos datos es espec!fico de rechazo, lo que

implica serias dificultades diaqn6s·ticas y decisiones terapet1t!

cas err6neas. Por otro lado, muchos de ellos -y en concreto los

m~s fiables- son datos o par&metros funcionales, cuya siqnifi­

caciOn y utilidad disminuye o se anula completamente si el ri•

fi6n, antes del rechazo, no funcionaba por otro motivo (necrosis

tubular isqu'mica} • Por ~ltimo, las alteraciones sugestivas de

rechazo son tard!as·: se manif:i:estan cuando la lesi6n histol6gi­

ca de rechazo est~ ya evolucionada.

Por tanto la bt1squeda de un marcador de rechazo precoz,

espec1fico, fiable, de senc:i:lla determinac:i:6n y econ6mico es de

fundamental importanc:i:a para el mejor manejo del enfermo trans­

plantado ya que permittr1a ins·taurar precozmente la terapia ade

cuada.

Aunque el mecani$mo de rechazo no se comprende totalmente,

cada vez es mayor el conoci~iento que se va loqrando de este fe

n6meno {41-531. En la Pigura 7 se muestra un esquema de lares­

puesta inmune no •od~ftcada que t±ene lugar ante la presencia

de anttgenos· extraiios·.

Mediante procedim±entos h.tstol6g:i:cos· se ha demostrado que

las· prilneras c~lulas· que invaden los· injertos renales· son linfo­

c~tos y monoc:ttos- (541 extst.tendo un nt:lmero relativamente pequ~

no de c~lulas·B pero con una respuesta proliferativa muy acusa­

da.

-14-

8 • • • • Antrno l

(;'\ - - +-:-\ V, -- --,. ~ \;-! ---. ... _· .... ~/] \ 8 '>< \ ~ Anticuerpos

!:\ Q r::::\ 8. Comp~emento v ~ v ADCC

FIGURA 7.- Esquema de !a requ1aci6n de la respuesta i~une en el rechazo.

CPA: TH: Ts: 8:

Tc= M ~: NK: ADCC: ---il' : __ ...,.:

Celula presentadora de antiqeno (dendritica, macrofaqo) Linfocito T colaborador Linfocito T. supresor Linfocito B Linfocito T citotoxico Macrofaqo Celulas asesinas Citotoxicidad celular mediada por anticuerpos Estimulacion Inhibicion

-15-

Las plaquetas tambi~n es·t~n intimamente ligadas al recha­

zo. En los injertos rechazado& existe una r~pida agreqaci6n pl~

quetaria (55) que casi coincide temporalmente con el aumento de

la inflamaci6n. Tanto en la activaci6n plaquetaria l30# 56) co­

mo en la de los otros· tipos celulares que intervienen en los pr~

cesos de rechazo se sintetizan y secretan metabolitos del ~cido

araquid6nico. As!, los macr6fagos· esti1nulados· sintetizan y seer~

tan tromboxano s 2 dufante la fagocitosis (.571 y en respuesta a

los 11ltimos componentes del complemento (.58}. De igual manera

los linfocitos hwnanos en s·uspens·iones libres de plaquetas son

capaces de sintetizar TxB 2 (591 al igual que los leucocitos pol!

morfonucleares· (601. Por su parte, el TxA2 es· capaz de estimular

tanto la prol:i:£eraci6n como la toxic:i:dad de los· linfocitos l61-

631 •

1.3.- INDICADORES DE RECHAZO EN TRANSPLANT£ RENAL

En la b'llsqueda de un diagn6st.i:co precoz y fiable del recha

zo se han propuesto distintos marcadores. Entre ellos se encuen­

tra la determinac.t6n de diversas enzi111as s~ricas y urinarias·.

As 1, la N-acetil- (l -D-qlucosam.i:nidasa urinari:a (.69) presenta una

elevaci6n aproxiuadamente 1~5 dtas antes del diagn6stico cl!nico

de rechazo en el 70% de los casos. Sin eJQbarqo no parece ser es­

pec!fica de este proceso ya que la oliqoanuria, hipotensi6n, es­

tenosis de la arteria renal y la adminis·traci6n de qentamicina

tambiefi la elevan, tardando en normalizarse de S a 6 d!as tras

-16-

la desaparici6n de las causas. As!mismo se ha estudiado la de­

terminaci6n de la lisozima s~rica y urinaria (65). Esta ha re­

sultado ser un eficaz marcador de dafio tubular pero no es esp~

c1fica del rechazo. La adenilato quinasa urinaria (66) ha mos­

trado su utilidad en el diagn6s·tico del rechazo, al menos en

los 6 primeros d1as postransplante, pero no se eleva precozme~

te y se propone mas bien para el seguimiento de la eficacia

del tratamiento anti-rechazo.

Otras enzimas estudi:adas· han sido las qlicos·idasas liso­

somales, la adenosin desaminasa, la muramidasa, 14ctico deshi­

drogenasa, fosfatasas· !cida y alcalina, f1 -glucuronidasa, r -gl~ tamil transpeptidasa, leucina aminopeptidasa y m4lico deshidr£

(67-70) • Ninguno de ellos posee gran utilidad en el diaqn6stico

de rechazo.

Se han investigado otras· proteinas como posibles marcado­

res (71) prestando especial atenci6n a la proteina C reactiva

(72-74) la cual presenta un bajo namero de falsos positivos y

neqativos. Su mayor inconveni:ente es· que no posee valor predic­

tivo alquno. Mucha inter~s se ha puesto en la determinaci6n de

~2-microglobulina (75, 76} pero este par&metro resulta tambi~n

alterado por la necrosis tubular aguda y sus niveles no se modi

fican precozmente respecto del dtagn6s·tico cU:nico.

El es·tudio de par4metros- :tlllllunol6gi·cos corqo la formaci6n

de rosetas E (.77}, la no respuesta a ntit6genos· {.781, los ensa­

yos· de c6lulas- T funci:onales [791, anticuerpos-monoclonales

(.801 o el an4lisi:s· de inmunoqlobulinas y fraccione& del comple..-

-17-

mento (81) no han sido eficaces, principalmente debido a su

falta de valor predictivo, no siendo tampoco concluyentes los

ensayos realizados con pro&taciclina, plaquetas marcadas radiac

tivamente y estudios con coloi.des de 99nl.rc Sn (82-84) •

Debido a los cambios· his-tol6qicos que tienen lugar duran­

te los procesos de rechazo, ultimamente se ha propuesto la rea­

lizaci6n de biopsias rutinar:tas· con aquja fina (85, 86) para

controlar la evoluci6n del injerto. Tambi~n.se ha propuesto que

el an!lis·is de la activaci6n celular que tiene lugar durante e~

tos procesos· (87, 88) puede-resultar efectivo en el diagn6stico

de rechazo. Sin embargo, las prillleras suponen un procedimiento

agresivo para el paciente, aunctue este hecho s-e vea reducido

por el empleo de la t~cnica con aguja fina, y los segundos pre­

cisan de una tecnologta muy softs·ttcada.

La determinaci6n de los productos formados durante los

procesos de activaci6n celular no es, en general, tan agresiva

como las anteriores y pueden ser tanto 0 mas espec!ficas que

aqu~llas. Como el TxA2 se sintetiza en maltiples tipos celula­

res que son activados durante el proceso del rechazo y, a su

vez, es capaz de estimular distintos aspectos de la respuesta

inmune, su evaluaci6n a trav~s de su metabolito estable, el

TxB2, puede constituir un marcador atil del rechazo frente a la

creatinina s~rica y los par&metros cl1nicos habitualmente utili

zados. La determinac16n de los niveles urinarios de Txs2 repre­

senta, por otra parte, un procedtmiento no invasive, lo cual es

un requisite esencial para un indicador adecuado de diagn6stico.

-18-

Apoyando esta hip6tes·is s-e encuentra el hecho de que durante el

proceso de rechazo se ha encontrado un aumento en la s!ntesis

de TxB 2 en perros (891 y en ratas· (90). Foeqh y cols. han reali­

zado un estudio en 12 enfermos transplantados (.91, 92) mostran­

do resultados prometedores- en es·te sentido. As!mismo, se ha ev!_

denciado en un modelo experimental en ratas (93) que el trata­

miento de estas con inhibidores de la s!ntesis de TxB 2 prolonga

significativamente l_a s·upervivencia del injerto antes de la ap~

rici6n de rechazo.

-19-

2.- OBJETIVOS

El presente trabajo pretende:

1.- Desarrollar una t~cn~ca dt11 para la deter.minac16n de TxB 2 en orina.

2.- Estud1ar su ~ en el diaqn6sttco de rechazo y compa­

rarla con la de los indtcadores habituales.

3.- Aclarar la influencia del acto quirdrgico,de la necrosis

tubular aquda post-transplante y de otros factores en los

niveles de TxB2 urinarto.

-20-

3.- DETERMINACION ··DE LOS NIVELES · URINARIOS DE TxB2

3 .1.- ELECCION DEL. MtfODO. ANTECEDENTES •

Historicamente, y dejando aparte los bioensayos (94-96),

los pr~eros m4todos utilizados en el an,lisis de los derivados

del !cido araquid6nico fueron la espectrofotometr!a y la croma­

tograf!a gas-l.f.quido (97}. Estos ensayos se caracterizan por ~

seer una especificidad relativamente elevada pero son poco sen­

sibles ya que requieren de a•2 a 20 JUg, de muestra como m!nimo.

En la d~cada de los setenta se utilizaron t~cnicas de ere

matograf!a de gases acoplada a espectrometr!a de masas (98, 99)

que son muy espec1.ficas pero requieren un equipo care y comple­

jo, consumen bastante tiempo y necesitan cantidades de muestra

elevadas, lo que conlleva largos procesos de purificaci6n.

Posteriormente se introdujeron las t~cnicas de radioirunu­

noensayo (100}. Estos m~todos poseen una gran sensibilidad, no

necesitan de un equipamiento caro y/o complejo y poseen una al­

ta especificidad, ya que, debido a su estructura, las prostagla~

dinas y tromboxanos son ant.f.genos a partir de los cuales pueden

obtenerse anticuerpos de elevada especificidad. Estes metodos

peoniten, adem!s, la realizaci6n si~ult!nea de un elevado n~e­

ro de determdnaciones (101] •

-21-

Estes hechos hacen que pueda considerarse el radioinmuno­

ensayo como la t~cnica de elecci6n para la determinaci6n de los

niveles urinarios de TxB2 • No obstante, hay que observar que

ciertos productos de deqradaci6n de este metabolite, al poseer

estructw:::as anulares id€mticas a la suya, pueden reacciol•ar en

mayor o menor extensi6n con el anticuerpo. As!, en el caso del

TxB2, el 2,3-dinor-T~2 (Fiqura 6) es capaz de reaccionar bas­

ta en un 40% con el anticuerpo anti TxB 2• Este hecho hace que

cuando se hable de niveles de TxB2 determinados por radioinmu­

noensayo haya que pensar en un conjunto.de entidades con estru~

turas qutmicas muy semejantes y con un mismo oriqen (la trans­

formaci6n catab61ica del TxB2) (38). A este conjunto se le sue­

le denominar "TxB2 inmunorreactivo• o •sustancias del tipo del

Txa2•.

3. 2.- MATERIAL Y ~DOS.

3 • 2 .1.- RECOLECCrON DE LAS MUESTRAS URINARIAS

Se recoqieron orinas de 24 horas de los sujetos es

tudiados, en recipientes de poliprolipropileno sobre 40 mg de i~

dometacina a una concentraci6n final de 5.10-5 M, suficiente pa­

ra inhibir la posible qeneraci6n de TXB2 por parte de las c61u­

las que pueden aparecer ocasionalmente en la orina de 6stos pa­

cientes (60). Una vez terminada la recolecci6n, se centrifuq6

una alicuota de 10 ~ de cada orina a 4°C y 1000 q durante 10

-22-

minutos, conserv,ndose alicuotas de la misma de 3 ml en tubos

de prolipropileno a·-80°C hasta su· procesamiento.

3. 2.2 • .- DD\LUIS

Se inve~tiq6 la posible presencia de sustancias in

terfirientes mediante un expertmento de di4lisis. Estos interfi

rientes podr!an ser capaces de alterar el ~librio ant!qeno­

anticuerpo y/o de adsorberse sobre las part1culas de carb6n re­

vestidas de dextrano con mayor afinidad que los ant!qenos libres

~pidiendo, de ~ste modo, su separaci6n del medio de reacci6n.

Se dializaron 5 orinas (al!cuotas de 2 ml ) con una membra­

na de 4'8 nm. de tamafio medio de poro Cltmite de exclusiOn mole­

cular de 12.0001 durante 15 h. frente a 1.000 voldmenes de aqua

a 4°C con un intercambio en la octava bora. Al finalizar el pro­

ceso, se anadi6 TxB2 a las distintas muestras para obtener dis­

tintas concentraciones del metabolito.

3.2.3.- EXTRACCION

Las mueetras urinari:as (1 ml 1 fueron acidificadas

a pH 3'5 con 4cido fOrmico 2M (Merckl, midiendo el pH con un po­

tenci6metro {~RrSoN, pH/mVmeter diqit 5011 y con tiras reactivas

de alta sensibilidad {Spezialindikator-papier y Urines indikator-

-23-

papier, Merckl. Posteriormente fueron extratdas, una vez, con un

voldmen doole de cloroformo o acetado de etilo (Merkl, los cua­

les se muestran apropiados para la extracciOn de prostaglandi­

nas y tromboxanos (102).

Tras agitar cada tubo durante 30 s. y centrifugarlos duran­

te 5 minutes a 1.000 g y temperatura ambiente, se tomaron 1,8 ml

de la fase org4nica (superior en las extracciones con acetato de

etilo e inferior en las· extracciones con cloroformo), evapor~nd~

se estas a sequedad en atmOsfera de nitrOgeno a temperatura am­

biente. Despu~s se resuspendi6 el extracto en el mismo volGmen

de~n fosfato {muestras para radioinmunoensayo) o fase m6vil

inicial (muestras para cromatograf.ta liquida de alta eficacia en

fase reversa;CLAE-FR) •

Para determinar la efectividad de la extracciOn se adicio­

nO 3H-TxB2 a 10 muestras de orina, cont4ndose su radiactividad

tras la extracci6n. As!mismo se extrajeron por duplicado con ca­

da extractante distintas soluciones acuosas de TxB2 de concentr~

ciOn conocida estudi4ndose la linearidad de ambas curvas.

3.2.4.- CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICACIA

Las muestras urinarias fueron extra!das previamen­

te a ser sometidas al proceso cromatogr!fico, el cual se llev6 a

cabo con un equipo Waters compuesto por dos bombas de doble cabe

za con pist6n alternante M-510, un inyector de voldmen variable

-24-

de hasta 2 m1 de capacidad U6K, un detector u1travioleta Lambda

Max M-841, un proqramador de qradientes M-680 y un reqistrador­

inteqrador M-730. La columna uti1izada fue una ;u-Bondapak c18

de compresi6n radial (8 x 100 mm) de 10 )UM de tamano de partt­

cula. En todos los cases se utiliz6 una lonqitud de onda de 210

~y un flujo de 2 ml/min.

Los disolventes orqAnicos utilizados fueron de pureza cro­

matoqrAfica (Merck, Scharlau} prefiltrados a trav~s de un fi1tro

de 0,45 ..,...um y desqasificados con ultrasonidos (Brandsonic-12) d~

rante 15 minutes previamente a su utilizaci6n. El aqua utilizada

fue bidesti1ada, prefi1trada a trav~s de un filtro de 0,2 )Um y

desgasificada a vacto con agitaci6n continua durante 20 minutos.

Se ensayaron e1uciones tanto isocr4ticas como con qradien­

tes (lineales, c6ncavos y convexos), para consequir el pico mAs

extrecho y sim~trico en las muestras cromatoqrafladas.

Las fracciones elutdas se recoqieron en un colector LKB-2112

REDIRAC a distintos tiempos, para ser sometidas posteriormente a

radioinmunoensayo o contaje de radiactividad.

3.2.5.- RAOIOINMUNOENSAYO

Para la determinaci6n de los niveles de TxB2 en

orina por radioinmunoensayo se han utilizado los componentes de

un equipo comercial fabricado por la firma New Enqland Nuclear

(Drieich, RFA) para determinaciones plasm4ticas.

-25-

El ~rincipio del ensayo es la inhibiciOn competitiva de la

uniOn del ant1geno marcado radiactivamente <.3H-TxB 2 en ~ste ca­

so) a un anticuerpo espectfico (Ac) par parte del ant1geno sin

marcar (.TxB2). Este equilibria se rige por la ley de acciOn de

masas {10 3} •

El ant1geno marcado utilizado posee una actividad de 50~i/

nmol (1.860 kBq/nmol) y se obtiene enzimaticamente a partir del

&cido (.5, 6, a, 9, 1,1, 12, 14, 15-3H8

) -araquidOnico. El anticuer

po se obtiene por inmunizaciOn de conejos con un conjugado de

TxB2 y albdmina bovina. El ensayo se realiza en un media tamp6n

fosfato SO mM (pH=7 1 3l con 0'1% de gelatina (utilizada para re­

vestir las paredes de los tubas de grupos polares y evitar ast

la adsorci6n sabre ellos de las inmunoglobulinas) y 0'01% de ti

merosal como conservante.

En cada an!lisis se determin6 la uniOn inespec1fica (tubas

en los que s6lo hay tamp6n y 3H-TxB2) y el m&ximo de uni6n (tu­

bas en los que hay 3H-TxB 2 y Ac, pero no TxB2), el cual es nece­

sario para calcular el porcentaje de uniOn de los ant1genos de

patrones y problemas. Tambi~n se incluyeron tubos para la medida

de la actividad del 3H-TxB 2 que se adiciona a todos los tubas

("totales"), los cuales s6lo !levan ant!geno marcado dilutdo con

tamp6n al vol~en final de todas las muestras; su radiactividad

se mide directamente, sin someterlos al proceso de separaciOn.

A partir del contaje de estos tubas y del mAximo de uni6n, se

puede calcular el porcentaje de uni6n del ant1geno al anticuerpo

mediante la expresi6n:

-26-

M-B X 100

T B

M Media de las cuentas del rn!ximo de uni6n.

B Media de las cuentas del blanco.

T Media de las cuentas del total.

Las soluciones patr6n de trabajo se obtuvieron mediante

diluciones seriadas,, realizadas en cada ensayo, a partir de una

soluci6n de 100 ng/ml {227' 2 nmol/ll de TxB 2 (_soluci6n P) seg6n

el siguiente esquema:

a) 200 .,..ul soluci6n p + 1'8 ml tarnp6n

bl 2'0 ml soluci6n a + 2'0 ml " 5'0 ng/ml

c) 2'0 ml soluci6n b + 2'0 ml 2 1 5 ng/ml

d) 2'0 ml soluci6n c + 3'0 ml •• 1'0 ng/ml

e) 2 1 0 ml soluci6n d + 2'0 ml o•s ng/ml

f) 2'0 ml soluci6n e + 2'0 ml 0 1 25 ng/rnl

g) 2'0 ml soluci6n f + J'O ml 0 1 10 ng/ml

h} 2'0 ml soluci6n 9' + 2'0 ml " 0'05 ng/rnl

Cuanto mayor es la concentraci6n de TxB2 {de patrones o

problemas}, me nos mol~culas de 3H-TxB 2 estar4n unidas al Ac con

lo cual la radiactividad de esta fr.acci6n ser4 menor, aumentan-

do la que contenga a los ant!genos libres (1041.

Las muestras urinarias y los patrones tras la extracci.6n

y/o cromatografta se sometieron al esquema de trabajo mostrado

en la Tabla I.

TABLA I.- VARIABILIDAD DE LA TSCNICA DE RADIOINMUNOENSAYO PARA LA DETERMINACION DE LOS

NIVELES URINARIOS DE TxB 2 •

VOLOMEN/TUBO (u1)*

ACTIVIDAD "CERO" DE UNION •PATRONES 0 INESPECIFICA TOTAL muON INESPEC!FICA PROBLEMAS DE PROBLEMAS

----I

IV TAMPON FOSFATO 900 300 400 200 300 o,J

I

PATRON 0 PROBLEMA - - - 100 100 3H-TxB 2 100 100 100 100 100

ANTICUERPO - 100 - 100

* Todos los ensayos se realizaron por dup1icado

-28-

Despu~s de agitar los tubos tras la adici6n de cada react!

vo, se incubaron estos 20 horas a 4°C. Posterior.mente, se mant~

vieron durante 10 minutos a 0°C en bano de hielo y se anadieron

500 pl de una suspensi6n al 0 • 5% de carb6n neutro Norit A y <>'5%

de Dextran T-70 en ~ fosfato 10 mM, agitando inmediatamente

los tubos. Al cabo de 15 minutos de incubaci6n en el bano de

hielo, se centrifugaron estos en una centr1fuga refrigerada

IEC PR-6.000 durante 10 minutos a 1.000 g y 4°C con lo que en

el sobrenadante quedaron los complejos TxB2-Ac y 3H-TxB2-Ac y

en el precipitado, los ant1genos libres (T.xB2 y 3a-TxB2) (Fig~

ra 8). Se tomaron 0 1 7 ml de sobrenadante y se transfirieron a

viales de vidrio de 20 ml de capacidad, anadiente 10 ml de 11-

quido de centelleo ATOMLIGHT {New England Nuclear}, cont4ndose

su radiactividad en un contador de centelleo para emisores beta,

(Mark II Nuclear Chicago, Searle), a 4°C, con una eficiencia de

contaje para tritio del 60%.

Una vez conocida la actividad de cada muestra, se constru-

y6 una curva de calibrado representando enabscisas la concentra­

ci6n de ant!geno {o una funci6n de la misma} y en ordenadas una

funci6n del porcentaje de uni6n de la fracci6n libre o de la uni

da, respecto del m!xtmo de uni6n. Por interpolaci6n en estas cur

vas se obtiene la concentraci6n de ant!geno de los problemas.

El material empleado en todo momenta en la manipulaci6n de

las muestras (contenedores, tubos, puntas de pipetas, etc ••• )

fue de pol1propileno.

Se estud16 la fiabilidad general de la t~cnica en los aspe£

tos de:

• • Ag ~ Ag-Ac Ag-Ac .~ Ag-Ac + Ac + Ag + Ag ~ · • Contajo radiactividad

~ Ag-Ac I Ag• N Ag+AQ \0 I

lncubac:lon Sepa rac:ton

FIGURA 8.- Esquema de un proceso de radiOinmunoensayo.

paralelismo

precisiOn

- exactitud

-30-

- especificidad e interferencias medicamentosas

- sensibilidad

as1 como las condiciones mas adecuadas para su desarrollo:

- pH 6ptimo de la extracci6n org4nica

material de m.anipulaci6n de las mues-tras y reactivos

- condiciones de almacenamiento de las muestras

- tratamiento de los blancos

- influencia de los tiempos de incubaci6n.

Tambi~n se determin6 el range de normalidad de los niveles

de TxB 2 en orina y la influencia que sabre estes ejercen la pr~

sencia de c~lulas sanguineas y la cirugia (.laparotomia explor~

toria) •

3.2.6.- PROCEDIMIENTOS ESTAD!STICOS

Los resultados del proceso de radioinmunoensayo se

analtzaron utilizando la curva de dosis~respuesta que mejor se

ajust6 matematicamente a la distribuci6n experimental de los p~

trones. El estudio de las curvas de calibrado en coordenadas lo

git-log (105) y de los coeficientes de variabilidad se llev6 a

cabo mediante un programa escrito para una calculadora progr~

ble HP-97, el cual, adem4s de proporcionar las concentraciones

interpoladas de los problemas, suministra la ecuaci6n de la rec

-31-

ta de calibrado y su coeficiente de correlaci6n. Todos los re­

sultados se expresan como media±. desviaci6n tipica (.x .±.OS),

excepto los valores normales de TxB2 urinario que se expresan

como x + 2DS.

3.3.- RESULTADOS

3.3.1.- PURIFICACION DE LAS MUESTRAS

3.3.1.1.- orJU.·rsrs

La realizaci6n directa del radioinmunoensayo sa­

bre las muestras urinarias centrifugadas, tanto en orinas de s~

jetos sanos como de transplantados, adic~onando o no TxB 2 ex6g~

no, conduce a contajes de radiactividad superiores a los del m4

ximo de uni6n (o sea, valores de la fracci6n de ant!geno marca­

do ligado superiores al 100%). En todos los casas el pH de las

disoluciones de cada tuba en d6nde se 1levaron a cabo los ensa­

yos fue el mismo del tatllp6n fosfato utilizado (7'3).

El an41is·is por radioinmunoensayo de las muestras dializa

das aparece en la Figura 9 en d6nde se puede observar que el pr£

ceso de di~lisis elimina en gran medida las interferencias, pas!

bi1itando el an41isis de las mismas. Sin embargo, este proceso

es lento y no plenamente eficaz por lo que se impone la utiliza­

ci6n de un m6todo alternative de purificaci6n (102, 106 .... 113) •

95

90

80

so

20

to

5

.os .1

-32-

.25 .5 1.0 25

Tx82 (ng/ml)

5.0

FIGURA 9.- Representacion de una curva de calibrado (e) y de las mismas

concentraciones de TxB2

analizadas en orinas dializadas (•).

-33-

3.3.1.2.- EXTRACCION ORG.l\NrCA

Se extrajeron 10 muestras de orina a las que se ad!

cionaron 1.400 cprn de 3a-TxB2 segan el esquema expuesto en el

apartado 3.2.3., tanto con cloroformo como con acetato de etilo.

La extracci6n con cloroformo resulta ser ligerarnente mas efect!

va {90%.!. 2'9%) que la realizada con acetato de etilo (83.!. 3'1%),

presentando el prirne~o la ventaja de una mas f~cil evaporaci6n.

As!mismo, se extrajeron soluciones de TxB 2 de concentraci6n co­

nocida con ambos disolventes, obteniendo una rnejor correlaci6n

con cloroforrno (r = 0'9963) que con acetato de etilo (r=0'9817).

3.3.1.3.- CROMATOGRAF!A LlQUIDA DE ALTA EFICACIA EN

FASE REVERSA (CLAE-F·R).

Las condiciones mas adecuadas de eluci6n del TxB 2

se determinaron inyectando en el cromat6grafo muestras acuosas

de concentraci6n conocida una vez extra!das y reconstitu!das en

la fase m6vil. En la Figura 10 se muestra el cromatograma obte­

nido al eluir 5 }19 de TxB 2 en condiciones isocr4ticas de aceto

nitrilo-agua-4cido trifluoroac~tico (26: 74: 0'02, vol/vol/vol,

pH = 3) que son simi1ares a las que se han utilizado en el an4-

lisis general de prostaglandinas (111, 114-117). E1 pico apare­

ce a un tiempo de retenci6n de 32 minutos, siendo ancho y lige­

ramente asim~trico. Para disminuir e1 tiernpo durante el cual

e1uye el TxB2

, se ensayaron gradientes tanto lineales como c6n

-34-

..::.:. b s.

0 5 25 30 35

tiempo (min.)

~GURA 10.- Cromatoqrama obtenido a1 ana1izar una muestra acuosa de TxB2

•

Condiciones: e1uci6n isocratica con ca3

-CN: a2o (23: 76) a pH=3

F1ujo: 2 m1/min.

VolGmen de inyeccion: 25 1

u1.

Lonqitud de onda: 210 nrn.

-35-

cavos y convexos. En la Figura 11 se muestra con 11nea continua

el pico obtenido tras eluir una muestra isocr4ticamente durante

30 minutos con acetonitrilo-aqua-4. trifluoroac~tico (20: 80:

0'02) sequido de un qradiente liqeramente c6ncavo {linea 8 del

proqramador) durante 10 minutos hasta unas condiciones finales

de acetonitriloaqua-4. trifluoroac~tico (40: 60: 0'02). Tras c~

da an4lisis se l~pi6 la columna durante 15 minutos con acetoni

trilo al 100%. De es~a manera, se consique un pico de absorci6n

sim~trico y estrecho cuyo tiempo de retenci6n es de 39'1 + 0'04

min. (n=lO) y que eluye en, aproximadamente, 1 minuto. En la Fi­

gura 11 se representa en l!nea de puntos el radiocromatoqrama

obtenido tras inyectar 5.300 cpm de 3H-TxB 2 y recoqer fraccio­

nes cada minuto. La recuperaci6n de la radiactividad resulta

ser del 79~ ± 3% (n=9), siendo el coeficiente de variabilidad

intram~todo del 9% (n=lO} y d1a a d1a, del 13% (n=lO). En la Fi

gura 12 se muestra el cromatoqrama que se obtiene tras extraer

una muestra urinaria a la que se hab!an afiadido 10 }lq/ml de

TxB2• El pico del metabolito muestra un coeficiente de resolu­

ci6n, Rs, de 0'9, siendo la eficacia de la columna, N, de 11.000

platos te6ricos. La mtn~a cantidad de TxB2 detectable es de 25

nq/ml.

El an4lisis por radioinmunoensayo de las fracciones eluidas

tras afiadir 10, 20, 50, 100 y 200 nq de TxB 2 por mililitro de

orina, muestran una recuperaci6n media del 76% ± 7% (n=5), exis­

tiendo una relaci6n lineal entre los valores de TxB2 determina­

dos tras extracci6n y cromatoqraf!a y los obtenidos tras extrac­

ci6n unicamente (f-0'51 + 1'19 x; r = 0'8993, n=20).

. .. c .

A . A

<

-36-

30

3

35 40 45

tiempo (min,)

FIGURA 11.- Cromatograma de una diso1uci6n acuosa de TXB2 y radiocromatograma

de 3H-TxB 2. E1uci6n isocratica con CH3-CN: H2o (20: 80) durante

30 min. Posterior gradiente concavo durante 10 min. hasta CH3..CN:

... u c .. .0

0 .. A

<

H2o (40: 60). Demas condiciones igua1 que en FIGURA 10 •

tlempo (min.)

FIGURA 12.- Cromatograma de una muestra urinaria a'1a que se afiadio TxB2

~ogenamante tras eKtracci6n con cloroformo, evaporaci6n y resus-_...., __ .: :::: ......... - ..~: ___ -~~-.:'.. ~ -:-! ...

-37-

3 • 3. 2 • • INFLUENCI'A DEL ·pH URINARIO

Se estud16 la variac16n de los niveles urinarios

medidos, para tres concentraciones distintas de TxB2 (n=lO en

cada nivel) al extraer las muestras a 5 pHs distintos. En la

Tabla II se muestran los resultados encontrados. En ella se

puede apreciar que no existe una variaci6n significativa en la

cantidad de TxB 2 detectada en el rango de pH comprendido en­

tre 3 y 4. Este hecho hace que el pH pueda ser ajustado tan­

to con potenci6metro como con tiras reactivas de suficiente

precisi6n.

3 • 3. 3.- PRECAUCIONES EN LA MANIPULACION Y ALMACENAMIENTO

DE LAS MUESTRAS.

Tanto el TxA2 como el TxB2 poseen la propiedad de

adherirse inespec!ficamente a las superficies de los recipien­

tes que contienen sus disoluciones (118). Para tratar de mini­

mizar este efecto se estudiaron 10 muestras de orina recogidas

en probetas de polipropileno de las cuales se almacenaron al!­

cuotas a -80°C durante 24 h en tubos de vidrio, polietileno y

polipropileno, que son los m~s empleados habitualmente en los

la.boratorios. Posteriormente, se analizaron las muestras por

radioinmunoensayo tras extracci6n, utilizando en todo momento

material de polipropileno para manejar (puntas de pipetas) y

contener (tubos de ensayo) las muestras. En la Figura 13 se

TABLA II.- INFLUENCIA DE LAS VARIACIONES DEL pH

NIVEL pH .[T_x. ~2J.(_ng/rnl)

3'00 0'43

} 3 1 25 0 1 44

BAJO 3'50 0 1 42 c.v. a:: 7%

I I

3 1 75 0'36 w C)

I 4 1.00 . ...... 0. 1.41.

3'00 1 1 00

J 3'25 0 1 97

3'50 1'06 c.v. := 4% ~ ( VARIABILIDAD MEDIO INTRAENSAYO 3'75 1 1 00

4 1 00 0'96

3'00 3'20

} c.v. = 5%

3.'25 3'10

ALTO 3'50 3 1 30

3'75 3'30

4'00 2'90

-39-

PERDIDAS POR EL MATERIAL

• OJ0 perdida

100

% 50

"OLII'RO,.ILENO VIOIIIO ,.OLIETIUNO

0

FIGURA 13.- Porcentaje de disminucion en los niveles de TxB2 medidos

tras a~cenar 10 muestras urinarias en contenedores de

vidrio y polietileno durante 24 horas a -aooc respecto de

los encontrados tras almacenar las muestras en polipropi­

leno.

-40-

puede observar el porcentaje de p~rdidas encontradas al almace

nar las muestras con los distintos materiales.

Asimismo se ha investigado la influencia del tiempo de al

macenamiento, tanto de las muestras como de los extractos recons

tituidos en tamp6n fosfato, sobre los niveles de TxB 2 que se mi

den. Para ella se han analizado 10 muestras de orina y sus ex­

tractos, tanto en el dia de su recogida como a los 3, 15, 30,

90 y 120 dtas de a~acenamiento a -80°C en tubas de polipropil~

no. La Figura 14 muestra que en los extractos existen p~rdidas

significativas ya a los 15 dias de almacenamiento, llegando a

ser del 40% a los 4 meses. Sin embargo, en las muestras urina­

rias sin extraer no se detectan p~rdidas hasta despu~s de seis

meses de almacenamiento.

3.3.4.- TRATAMIENTO DE LOS BLANCOS

Debido a que la introducci6n de un proceso previa

de purificaci6n podr1a originar algun tipo de interferencias,

se sometieron al proceso extractive a 10 alicuotas de 1 ml de

tamp6n fosfato con concentraciones conocidas de TxB2, las cua­

les se ensayaron par radioinmunoensayo al igual que las mismas

muestras sin extraer y que los blancos correspondientes a cada

punta de la curva de calibrado. Todas ellas mostraron contajes

de radiactividad similares· que nunca representaron mas de un 5%

del valor del m~~o de uni6n. Las muestras urinarias estudia­

das se ensayaron as1mismo con su blanco correspondiente, no en

-41-

PEROIDAS POR ALMACENAMIENTO DEL EXTRACTO ( - 80 ·c )

10

%

50 3 15 2 3 4

Basal dias diu mes meses meses meses

~ •f. PERDIDA ( x de 10 determin.tc1ones)

FIGURA 14.- Porcentaje de disminucion en los niveles de TxB2

medidos tras

almacenar el extracto reconstitu!do en tamp6n fosfato SO mM,

pH 7'3, en contenedores de polipropileno durante distintos pe­

r!odos de tiempo.

-42-

~ontrando en estos, contajes de blanco superiores al 6% del m~­

.::imo de uni6n.

3 • 3. 5.- CALCULO DR RESULTADOS

En la Figura 15 se muestra la curva de calibrado

~ue se obtiene al representar la fracci6n de ant!geno marcado

~igado respecto de la actividad total {%(B/BT)), o bien respec­

~o del m~ximo de uni6n {% (B/B0)l, frente ala concentraci6n de

·.!:xB2 en papel milimetrico. El valor de % (B/B0) se calculo me-

-~iante la expresi6n:

p - B. ----------X 100, d6nde

M- B

Media de las cuentas del problema o patr6n.

Media de las cuentas del blanco

!1 Media de las cuentas del m!ximo de uni6n.

~a curva que resulta es de dif!cil trazado, mostrando una pen­

~iente muy elevada en la zona de concentraciones. bajas que difi­

~ulta la interpolaci6n en esa zona.

En la Figura 16 se representa la misma curva pero tomando

en abscisas una escala logar1tmica. Resulta as! una curva sigma!

de que es ampliamente utilizada pero cuyo trazado puede ser bas­

~ante azaroso, no permitiendo, adem4s, una sencilla comparaci6n

entre distintas curvas de calibrado. Sin embargo, los puntos de

la curva de calibrado se ajustan bien· .. a una recta en el rango de

-43-

9 /e., Bf9a •100 •\00

60 Mlt.IMETRICO

100

80 40

60

20 40

-5 2

FIGURA 15.- Radioinmunoensayo de TxB2 . eurva de calibracion representada. en escala mil~etrica.

lOO SEMI· LOG

60

60

.os ·1 -25 -5 1 2-5 5

[TxB~(ng /ml)

FIGURA 16.- Radioinmunoensayo de TxB2 . Curva de calibracion representada en la escala semiloqar!tmica.

-44-

o•s a 5 ng/ml (0'14- 11'36 nmol/1} si se utiliza una represen­

t:.aci6n logit-log (Figura 17}. En ella, en ordenadas se represe.!!_

t:.a el logit de B/80 , que se calcula mediante la siguiente ecua­

ci6n:

Logit (B/B0) Ln (% B/B

0)

100 - (%B/B0}

y en abscisas el logaritmo de la concentraci6n de ant!geno. En

la misma Figura se muestran los l!mites de confianza del 95% in

-:.raensayo.

El trazado de esta curva puede realizarse de manera sencilla

~ediante ajuste por m!nimos cuadrados. Para ello se escribi6 un

~rograma adaptado a una calculadora programable Hewlett-Packard,

;aP-97, q~e tambi~n puede desarrollarse en los modelos HP-67 y

3P-41. Este programa, a partir de los valores del % B/B0 de los

~atrones, suministra la ecuaci6n de la recta en escala logit-log

:· su coeficiente de correlaci6n, permitiendo realizar en ella,

~e manera autom~tica, interpolaciones de los valores de la frac­

=i6n de ant!geno marcado ligado para obtener directamente sus

~oncentraciones; o bien, calcular el valor del % B/B0

correspon­

~iente a una determinada concentraci6n de ant!geno. En la Sec­

=i6n 7 se muestra el listado del programa y la manera de utili­

..zarlo.

3.3.6.- FIABILIDAD DE LA T£CNICA

olOO

50

40

30

20

10

x':Lnx

y'= log it y = Ln y

100-Y

-45-

LOG IT· LOG

Y•-1.061 -2.214 x

r• -.9998

Log it

3

2

0

·1

·2

3~--------~-----------------------~----------------~-----------~----------------~ .14 .27 .68 1.36 2.72 6.81 11.36

(rxa2] (n mol/1>

.OS .1 .25 .5 1.0 2.5 5.0

[TxB2] (ng jml)

FIGURA 17.- Radioinmunoensayo de TxB2• Curva de calibracion representada en escala

logit-log, mostrando los niveles de confianza del 95\ intraensayo.

-46-

3 • 3 • 6 .1.- ?1\RALELl:SMO

La realizaci6n de una prueba de paralelis­

mo es un procedtmiento dtil en el estudio de la presencia de efe~

~os inespec1f1cos en un radioinmunoensayo y m's si las muestras

nan sido sometidas a un proceso previo de purificaci6n, concentra

=i6n, etc ••• (98). Se sometieron tres muestras de orina con vale­

res altos de TxB 2 a d~luciones seriadas al 1/2, 1/4, 1/8 y 1/16.

Eri la Fiqura 18 se muestra una t1p1ca curva de diluci6n (b) y

una de calibrado la), siendo sus ecuaciones:

Curva de calibrado: y

Curva de diluci6n: y

-1'82 -2'07x; r

-1 1 22 -2'14x; r

-0'9984_

-0'9965

La realizaci6n de una prueba de comparaci6n entre pendien­

t:es muestra que no existe diferencia siqnificativa (p > 0 '95} en­

tre ellas.

3.3.6.2.- PRECISION

Se estudi6 1a precisiOn del m~todo a tres

niveles distintos de concentraci6n urinaria de TxB2, tanto intr~

ensayo como d!a a d!a. En ambos casos los resultados se expresan

en forma de coeficiente de variabilidad (CV) (Tabla III}, seqdn

~a expresi6n:

DS 'cv = X 100, d6nde

-47-

90

B I 8 0

.100

70

50

30

10

.1 .25

1/16 118

.s

DILUCIONES

1/4 112

1.0 2.5 [r x s2] ( ng 1 ml )

111

SD

FIGURA 18.- Paralelismo entre los valores de TxB2 inmunorreactivo contenido

en sucesivas diluciones urinarias (b) y una curva de calibrado (a).

TABLA III.- VARIABILIDAD DE LA TgCNICA DE RADIOINMUNOENSAYO PARA LA DETERMINACION

DE LOS NlVELES URINARIOS DE TXB 2 •

n i (ng/m1) DS {ng/m1) c.v. (%) --- ----.

20 0'20 0'014 7'0

INTRAME:TODO 20 0'70 0'032 4'6 I

i ~

20 2'15 0'118 5'5 CD I

15 0'30 0'038 12'7

D!A A D!A 16 0'85 0'087 10'2

14 2'04 0'230 11'3

-49-

como antes x representa la media de los valores obtenidos a ca­

da nivel y DS su desviaci6n t!pica.

Todas las muestras se ensayaron por duplicado. La realiz~

ci6n del ensayo por triplicado no mejora la reproductibilidad

en mas del 0'5% a cualquier nivel.

3.3.6.3.'C"' EXACTITUD

Se estudi6 la exactitud adicionando a una muestra

de orina cantidades conocidas y crecientes de TxB 2 tanto en el

rango fisio16gico como a niveles superiores e inferiores. En

la Figura 19 se representan los valores medidos frente a los

calculados teoricamente. El valor de la ordenada en el or!gen

de la recta obtenida coincide con el valor end6geno de TxB2 de

la muestra urinaria.

As1mismo, debido a que en ocasiones pueden encontrarse va­

lores muy elevados de TxB 2 en las muestras a ensayar, y sea ne­

cesario realizar diluciones de ~stas, se estudi6 el efecto de

las diluciones sobre el extracto reconstitu!do, encontrando que

para tres niveles distintos de concentraci6n de TxB 2, los resu!

tados obtenidos son proporcionales a las diluciones realizadas

(Figura 20) •

-so-

i .... 5.0 .. ~

0 ~

:; • E C'f

CD ac 2.5 1-

t.O

1.0 25 5.0

TxB2 te6rlco (ng/ml)

-=~ 19.- Exactitud del analisis de Tx82 realizado mediante el ensayo de muestras urinarias a las cuales se adicionaron cantidades conocidas y crecientes de TxB2 •

e -Cit c

OILUCION&S

-=GURA 20.- Proporcionalidad entre concentraciones de TxB medidas en sucesivas diluciones de los extractoa reconstitu!dos a ~ niveles distintos de concentraci6n del metahollto.

-51-

3. 3. 6. 4.- ESPECIFICIDAD' E INTERFERENCIAS MEDICAMEN-

·~.

La especificidad del anticuerpo utilizado, calcula­

da a partir de la cantidad de compuesto necesaria para provocar

un 50% de desplazamiento del ant1geno marcado, aparece en la Ta­

bla IV. Para los compuestos de PGA2, PGB2 y !cidos linoleico,

oleico, palm!tico y a~aquid6nico, el porcentaje de reacci6n cru­

zada es inferior a 0 1 001 (=50 pg de compuesto) •

Se estudi6 la posible interferencia de diversos farmacos ad

ministrados habitualmente a sujetos transplantados. El ensayo de

disoluciones acuosas de furosemida, 6-metil-prednisolona, predn!

sana, azatioprina y tobramicina a las concentraciones urinarias

teoricamente mas elevadas posibles, no muestran interferencias

con el ensayo. Del mismo modo sucede con la indometacina a las

concentraciones utilizadas en la recogida de las orinas.

3.3.6.5.- SENSrB~.

Generalmente se suelen utilizar dos definiciones di~

tintas para la sensibilidad: una la describe en t~r.minos de la

pendiente de la curva de dosis-respuesta; esto es, el cambia en

la respuesta para un cambia dado en la dosis; la otra, se refiere

a la menor cantidad de sustancia (ant!geno sin marcar) que puede

distinguirse de la ausencia de ant!geno con precisi6n aceptable

{m!n~o detectable). En el analisis de prostaglandinas, ~sta dlti

-52-

TABLA IV.- ESPECIFICIDAD DEL ANTICUERPO UTILIZADO EN LA

DETERMINACION DE NIVELES URINARIOS DE TxB2 •

COMPUES'l'O

TxB2

PGD2

PGE2

PGF2

6-ceto-PGFl

PGA2

%. DE REACTIVIDAD CRUZADA

100

2'0

0'1

O'l

0'08

0'005

-53-

ma es la acepci6n mas empleada (100, 119). En la practic~ se con­

sidera que esta cantidad de ant1geno es la que provoca un 10\ de

desplazamiento del m!xtmo de uni6n; la cual, en el radioinmunoen­

sayo utilizado, ha resultado ser de SO pg/ml (0'14 nmol/1) de

La avidez del anticuerpo es de 3.109 M-l y la capacidad me­

dia de uniOn del ant1geno al anticuerpo del 45% ~ 2\ (n=20),

siendo la cantidad de·TxB 2 capaz de provocar un 50\ de desplaza­

miento del ant1geno marcado, de 0'52 ng/ml (1'41 nmol/1).

3.3.7.- INFLUENCIA DE LOS TIEMPOS DE INCUBACION.

El per1odo de incubaci6n con el anticuerpo no resul­

t6 ser determinante de los resultados obtenidos entre 18 y 24 ho

ras (Figura 21).

En la Tabla V se muestra la influencia del tiempo de incuba­

ci6n de los tubos con la suspensiOn de carbOn y dextrano. Este

tiempo influye mucho mas sobre los resultados finales obtenidos

que el de la incubaci6n de la mezcla de reacci6n.

3 • 3 • 8 • - PRESENCIA URINA:RIA DE Cl:LULAS SANGUINEAS.

Debido a que la hematuria es relativamente frecuente

en el postransplante inmediato, se investig6 la influencia de c6-

90

70

50

30

tO

-54-

INFLUENCIA DEL TIEMPO DE INCUBAC ION

• i

•: 16 horas

4! 18 .. a: 22 .. •: 24 ..

.os .1

• I

.25

• D •

.s

• I

• I •

2l

1.0 2.5 5.0

[rxe2J (ng/ml)

~IGURA 21.- Puntas de las curvas de calihrado obtenidas a distintos tieapos de

incubacion de la mezcla de reaccion.

-ss-

TABLA V.- INFLUENCIA DEL TIEMPO DE INCUBACION DE LA MEZCLA DE - --REACCION CON LA SUSPENSION DE CARBON Y DEXTRANO SO-

BRE LOS NIVELES DE·. TxBr

TIEMPO DE INCUBACION (.mi.nutos)

5

10

15

20

25

DISMINUCION DE LA RAOIOACTIVIDAD DE LA FRACCION UN IDA . ( \)

35

8

10

28

-56-

_ulas sanguineas bien conservadas (hematies, leucocitos y plaque-

~as) y de estas mismas pero lisadas (hemolizado) sobre la determi

~ac16n en orina de los niveles de TxB2 • Para ello se adicionaron

~istintas cantidades de c~lulas y de hemolizado a muestras urina­

=ias que conten1an 0'23 nq/ml (0'62 nmol/1) de TxB2 end6geno. Una

~l!cuota de cada qrupo se extrajo tras incubarla 24 horas con las

~~lulas en presencia de indometacina 5.10-S M y otra en ausencia

~e esta, a 22°C. El porcentaje de incremento en los niveles de

'!'xB2 respecto de los basales se determin6 mediante la expresi6n:

x-c % de incremento ~ ------ X 100, d6nde

c

x es la concentrac16n final de TxB 2 encontrada en las orinas y

_ la concentraci6n end6qena inicial de las mismas.

La extracc16n y ensayo de las orinas tras 24 horas de incub~

~i6n con las c~lulas o hemolizado sin indometacina conduce a una

elevac16n en las concentraciones de TxB 2 que es mucho mas importa~

teen el caso de las c6lulas no lisadas (Tabla VI}. Sin embarqo,

la 1ncubac16n en presencia de indometacina reduce dr!sticamente

la qenerac16n ex6qena de TxB2 (Tabla VII) •

J. 3. 9 • - VALORES NORMALES

Con el .fin de establecer un intervale de referencia de los

valores urinarios de TxB2, se estudiaron sus niveles en la orina

de 24 horas de 12 sujetos (9 varones y 3 mujeres) de edades com­

prendidas entre 16 y 40 anos, recogidas segdn el m~todo expuesto

-57-

TABLA VI.- EFECTO DE LA PRESENCIA DE C£LULAS LISADAS Y NO

LISADAS TRAS 24 HORAS DE INCUBACION CON LAS ORINAS

SIN INDOMETACINA.

C£LULAS LISADAS

% EN ORINA

0'8

1'0 1'7 8'3

12'5

0'8

1'0

C£LULAS NO LISADAS 1'7 8'3

12'5

% ELEVACION

39

78

378

156

572

2.488

TABLA VII.- EFECTOS DE LAS C£LULAS LISADAS Y NO LISADAS TRAS 24

HORAS DE INCUBACION CON LAS ORINAS EN PRESENCIA DE

INDOMETACINA 5.10-5 M.

' EN ORINA ' ELEVACION

2'5 21 CELULAS LISADAS 12'5 21

25 21

2'5 29 CELULAS NO LISADAS 12'5 31

25 43

-sa-

en 3.2.1. Ninquno de estos sujetos tom6 inhibidores de la cic1o­

oxiqenasa durante, al menos, una semana antes de 1a recolecci6n

de las orinas. Los valores encontrados fueron:

X

DS

0'47

0'120

ng/ml (1'27 nmo1/1)

" x + 2DS 0'23-0'71 ng/m1 (0'62-1'92 nmol/1)

Ranqo: 0'32-0'74 (0'87-2'01 nmol/1)

Tambi!n se estudiaron los valores normales del cociente

TxB2/Cr urinarios encontrando en 1a misma muestra de indiv!duos

los siguientes resultados:

0'35 nq/mg

DS 0'130

X + 2DS 0'19 - 0 1 71 " Rango: 0'21 - 0'64

3.3.10.- ~NFLUENCIA DE LA CIRUG!A

Todos los sujetos transplantados son sometidos a un

proceso quirdrgico que conlleva una activaci6n de la coagulaci6n

sangu!nea y un aumento en la s!ntesis de TxA2• Por ello se estu­

diaron los niveles urinarios de TxB2 durante los tres primeros

d!as de evoluci6n postquirdrgica en 5 sujetos sometidos a cirug!a

(laparotom!a exploratoria) no complicada, encontrando una eleva­

ci6n significativa en el d!a 2 desde valores de 0'61 ± 0'50 ng/ml

~59-

a 1'05 + 0'44 ng/ml (p<O'OS, prueba de Wilcoxon de la escalade

clasificaci6n con signo), retornando posteriormente los niveles

de TxB2 a valores basales (0'41 + 0'21 ng/ml).

-60-

3.4.- OISCUSION

El radioinmunoensayo es un m6todo adecuado para la deter­

minaci6n seriada de los niveles urinarios de TxB 2 cuando es neces~

rio realizar un elevado ndmero de determinaciones en un per1odo r~

lativamente corto de tiempo y con fiabilidad. El radioinmunoensayo

proporciona un m6todo r!pido, de costo no excesivo (ya que no nee~

sita un equipamiento caro o complejo) y que al mdsmo tiempo es sen

sible y espectfico. Por otra parte, la utilizaci6n de muestras uri

narias hace que el m~todo no sea en absoluto agresivo.

En nues·tra experiencia, no es posible realizar el an~li­

sis directamente sobre las muestras de orina debido a la presencia

de interferencias inespec!ficas de bajo peso molecular, las cuales

afectan a la adsorc16n del exceso de anttgeno marcado sobre el ca!

b6n reves·tido de dextrano. Este hecho puede estar acompaiiado, en

menor proporci6n, de la uni6n de las substancias interferientes a

los sitios espec!ficos para el ant1geno que posee el anticuerpo,

con lo que quedar1a adn m4s ant!geno libre marcado en la mezcla de

reacci6n sin poderse unir al carb6n. Por ello se hace necesario un

proceso previo de purificaci6n, que ha de ser eficaz, sencillo, de

r&pida realizaci6n para disminuir los tiempos de an!lisis y que

afecte lo menos posible a la fiabilidad global del proceso. De es­

ta manera se estudiaron la extraccr6n con disolventes org&nicos y

la extracci6n sequida de cromatograf!a l!quida de alta eficacia en

fas-e reversa.

En la extracci6n org4nica, el cloroformo resulta m!s efe£

tivo que el acetato de etilo, proporcionando una mayor reproducib!

-61-

lidad en el proceso. Debido a que las muestras utilizadas son

de orina, no se hace necesario realizar una extracci6n previa

con hexano a pH=7 para eliminar los l!pidos neutros, lo que es

necesario llevar a cabo con la mayor!a de las muestras. plasma­

ticas (102) • As!, se evita la manipulaci6n excesiva de las

muestras con la consiquiente posibilidad de introducir facto­

res que afecten a la deter.minaci6n anal!tica de TxB 2• Se han

utilizado al!cuotas.de l ml. de orina ya que de esta manera se

ha podido realizar la extracci6n en tubos de polipropileno de

10 ml. voldmenes menores que hubieran dificultado el manejo de

las muestras y habr!an podido ser causa de errores. Por el co~

trario, el empleo de vol11menes mayores.no hubiese permitido

utilizar este manterial ni el aparato de evaporaci6n simult~nea

de extractos- con capacidad para 12 muestras. De esta manera el

an41isis s-er!a considerablemente m!s lento y tedioso.

El proceso de extracci6n no alarqa siqnificativamente el

tiempo de an4lisis, ya que cada orina se agita durante 30 s. con

el cloroformo y la evaporaci6n no consume mas de 15-20 minutos a

temperatura ambiene. Esta velocidad puede incrementarse introdu­

ciendo los tubos en un bafio de agua a 35-37°C en caso de ser ne­

cesario. Tanto las mues·tras· como los patrones fueron sometidos

al proceso extractivo en medio ~cido y todos ellos mostraron po­

seer el mismo pH (7'3) al ser reconstitu!das con el tamp6n fosf~

to, por lo que no fu~ neces·ario lavar los extractos para neutra­

lizar el pH.

La extracci6n de las orinas con cloroformo no ha presen­

tado problemas de formaci6n de emulsiones salvo en alqunos casos

de orinas muy hemat(iricas. En es·tas, la emulsi6n se ha eliminado

-62-

removi~ndola lentamente con una punta de pipeta de polipropileno

y centrifugando posteriormente.

Para asequrar la mtxima recuperaci6n en la extracci6n

es necesario acidificar las muestras de manera que no existan

carqas sobre la mol4cula de TxB2 .. Esta acidificaci6n puede con­

trolarse con una simple tira de papel reactivo de suficiente

precisi6n, situando e~ pH entre 3 y 4. Por encima de pH=4, ~a

recuperaci~n t~ende'a disminuir por la no completa extracci6n

del metabolite, mientras que por debajo de pH=3 empiezan a te­

ner luqar fen6menos de hidr6liais ..

La uti1izaci6n de un qradiente 1iqeramente c6ncavo en

1a cromatoqraffa 1fquida de alta eficacia en fase reversa permi

te realizar la eluci6n del Txa2 de manera r4pida y completa, 02

teni~ndose un pico s~trico. Habitualmente, e1 TxB2 es el pro­

ducto derivado de ~a ciclooxtqenasa que peor e1uye, presentando

unos picos anchos y no siempre sim6tricos (109, 111-115). Con

el qradiente uti1izado, la eluci6n se rea1iza en un pico estre­

cho y s~trico con lo que es m!s sencillo aislar la fracci6n

en que se encuentra y se cometen menos errores en su evaluaci6n

directa por medio de un inteqrador. Sin embargo, esto no es su­

ficiente para poder detectar los niveles urinarios habituales

que presenta el metabolito. El proceso de concentraci6n que es

necesario realizar (aprox:tmadamente x 100 6 1000) hace que au­

mente excesivamente e1 tiempo de an4lisis por muestra. Como t~£

nica purificativa, 1a CLAE-FR no incide de manera determinante

sobre la fiabilidad del an411s·is y bace la t~cnica m4s· lenta.

-63-

Un aspecto que habitualmente no es considerado es el ma

terial que se utiliza en la manipulaci6n de muestras y reactivos.

El TxB 2 tiende a adherirse inespec!ficamente a las superficies

de los recipientes que contienen sus disoluciones. Esta tenden­

cia es mayor en el vidrio, y, sobre todo, en el polietileno res

pecto del polipropileno. Por ello, tanto los recipientes de re­

cogida de muestras como las puntas de pipetas y tubos de almace

namiento, extracci6n y radioinmunoensayo fueron de polipropile­

no. Los fen6menos de adsorci6n, degradaci6n, o ambo~ que tienen

lugar en los extractos almacenados, hicieron que estos se ensa­

yasen siempre dentro de las 24 horas siguientes a su extracci6n.

Durante ese per!odo no se observaron disminuciones significati­

vas de los niveles de TxB2 medidos. Este hecho no se observ6,

sin embargo, durante el almacenamiento de las muestras urina­

rias centrifugadas-, qui.z4 por un efecto de "revestimiento~ de.

las paredes de los tubos- por parte de otros metabolites presen­

tes en la orina.

Tanto las- muestras como las disoluciones empleadas en

la construcci6n de la curva de calibrado mostraron valores de

los blancos bajos, constantes y reproducibles, siendo siempre

menores que el l!mtte pr4ct:tco de utilizaci6n del m~todo (nin­

gdn blanco represent6 m4s del 10% del m4ximo de uni6n). Durante

la extracci6n, la eliminaci6n de interferencias es eficaz como

lo muestran los ensayos de paralelismo y exactitud. La reprodu-.

cibilidad del m~todo, tanto intraensayo como d!a a d!a se en­

cuentra en el rango habitual de las t~cnicas de radioi:nmunoen­

sayo. El anticuerpo utilizado es espec!fico y los f4rmacos en-

-64-

sayados no interfieren con el proceso anal!tico. Estos son los

que se administran tanto durante la terapia inmunosupresora b~

sal como en las crisis de rechazo o en presencia de infecci6n.

El procedimiento anal!tico presenta una elevada sensibilidad,

tanto en el sentido de poseer un bajo de m!nimo detectable

(0'05 ng/mll como en el de pendiente de la curva de dosis-res-

puesta que es tal, que en el intervalo de concentraciones de

0,25 a 1 ng/ml es capaz de detectar diferencias de 0.02 ng/ml

estando en esta zona el rango de los valores encontrados· en

las orinas de 24 horas de los sujetos sanos. As!mismo, los ex­

tractos pueden diluirse, encontrando resultados· proporcionales

a la diluci6n realizada en un amplio ranqo de concentraciones.

Para realizar el c4lculo de resultados se eligi6 la re

presentaci6n loqit-log no ponderada (120) la cual, evita los

inconvenientes de ·la utilizaci6n de las· representaciones en p~

pel milim~trico (dificultad de interpolaci6n a valores altos

de% B/B0) o semilogaritmico (trazado arbitrario}. Con el m~to

do utilizado, cuando un punto se desvi6 muy significativamente

de los dem&s, no fu~ introducido en el c&lculo de regresi6n.

Sin embargo, pequefias o moderadas desviaciones· de algW\ punto

no condujeron a la obtenci6n de resultados sustancialmente di!_

tintos de concentraci6n de TxB2 o del valor de la pendiente de

la recta. El empleo de un calculador progrcunable hace que se

evite la introducc16n de juicios subjetivos, tanto en el traza

do de la curva patr6n, como en el de las interpolaciones reali

zadas sobre ella. El m~todo utilizado ha sido comparado con

otros m4s complejos que neces·itan un soporte material mucho

-65-

m4s sofisticado para su realizaci6n, no encontrado diferencias

Dnportantes respecto de ellos (121).

El tiempo de incubaci6n de los ant!qenos con el anti­

cuerpo no es determdnante de los resultados obtenidos en un maE

gen de ~ 2 horas alrededor de las 20 de incubaci6n. Sin embargo,

tiempos menores conllevan un alejamiento de las condiciones de

equilibrio del sistema con la consiguiente disminuci6n en la

reproductibilidad de los resultados. Esta incubaci6n se realiz6

a 4°C con el f!n de aumentar la enerq!a de la reacci6n ant!ge­

no-anticuerpo, disminuir la actividad de posibles enzimas degr~

dantes y aumentar la sens·ib:i:lidad del ensayo.

MAs determinante es el tiempo de incubaci6n con la sus­

pensi6n de carb6n y dextrano. Pequenas variaciones por debajo

de los 15 minutos implican una no completa adsorci6n de los an­

t.!genos libres sobre el carb6n, mientras que, a tiempos superi~

res, empieza a absorberse el ant!geno de los complejos, lo cual

origina una alteraci6n del equilibrio ant!geno-anticuerpo y, por

tanto, un falseamiento de los resultados·. Por ello, es importan­

te que el tiempo que permanece la s·uspensi6n en todos los tubos

sea esencialmente el mismo y de 15 minutos. En la pr4ctica esto

se consique facilmente no ens~ m4s de 100 tubos simultanea­

mente.

La presenc:ta de c~lulas· sanquineas en la orina, durante

el tiempo de recoqida de las muestras hace que se encuentren V!

lores de TxB2 muy elevados· en las· mismas, que aumentan con la

cantidad de aqu,llas· o, en menor proporci6n,. de hemolizad_o. Por

el1o, es impreseindtble realizar la recoqida de las orinas sobre

-66-

indometacina a la concentraci6n de 5.10-S M mostr!ndose ~sta

atil para prevenir la generaci6n ex6gena de TxB2• De esta mane­

ra, disminuye la influencia de la hematuria, en el postoperato­

rio inmediato, sobre los niveles medidos del metabolite.

Un factor que es necesario tambi~n tener en cuenta en

las primeras horas del postransplante es la elevaci6n de los n!

veles de TxB2 como consecuencia del proceso quirarqico. En nue!

tra experiencia, existe un aumento significativo de ~stos el

d!a 2 de evoluci6n tras ciruq!a exploratoria. Este aumento se

debe presumiblemente a TxB2 de oriqen extrarrenal que se ha foE

mado durante la activaci6n plaquetaria y de otras c'lulas en

los procesos de coagulaci6n post-quir6rqicos.

En res6men, la t~cnica estudiada para la determinaci6n

de los niveles urinarios del TxB2 es de sencilla ejecuci6n, con

un proceso previo de purificaci6n mediante extracc16n orq!nica

que no alarqa considerablemente el tiempo de an~isis, fiable y

suficientemente sensible para permitir el seguimiento d!a a d!a

de 4ste metabolite en sujetos transplantados, teniendo en cuen­

ta la necesidad de una correcta recolecci6n de las muestras y

la influencia del propio proceso quir6rqico.

4.- TxB2 EN TRANSPLANTE RENAL HUMANO

4.1.- PACIENTES Y MiTODOS

4 .1.1.- ENFERHJS

Se es·tudiaron 45 enfermos transplantados, 43 de

cad~ver y 2 de donante vivo, 35 varones y 10 mujeres, con e~a­

des comprendidas entre 14 y 56 aiios (35,8 :t 9,9). El per!odo

evolutivo estudiado comprende desde el d!a del transp1ante

hasta el alta del Hos·pita1, nefrectom!a o exitus, con un pro­

medio de 21,7! 10,9 d!as y un rango de 3-G5 d!as.

4 .1 • 2 • - INMUNOSUPRESI'ON

En todos los casos se realiz6 inmunosupresi6n

convencional con esteroides (prednisona y 6-metil prednisolona)

y a%atioprina.

Durante las primeras 48-72 horas se administr6

6-metil prednisolona intravenos·a (40 mg/12 horas). Una vez lo­

grada la tolerancia digest:t.va, se comenz6 con prednisona oral

a l~ dosis de 80 mg/d!a en 2 tomas. En los enfermos sin episo­

dios cl!nicos de rechazo agudo, la prednisona oral se redujo has

-68-

ta alcanzar los 20 mg/d!a al finalizar el tercer m~s y la dos~

de manten~iento de 10 mg/d!a al comienzo del segundo ano.

La dosis de azatioprina oscil6 entre 100 y 150 mg/d!a

seqdn peso y tolerancia hematol6gica. Esta dosis se mantuvo de

manera continua excepto en.los casos de aparici6n de efectos

secundarios (principalmente leucopenia).

Los episodios de rechazo aqudo fueron tratados con 6-

metil prednisolona intravenosa (250 mg diaries hasta alcanzar

una dosis de 2-4 g. por episodic de rechazo agudo), manteni6n­

dose la dosis previa de prednisona oral hasta que la funci6n ~

nal se estabiliz6. Ninguno de los sujetos recibi6 irradiaci6n

local del injerto.

4 .1. 3.- DIAGNOSTrCO DE NECROSIS "TUBUlAR AGUDA (NTA)

Esta situaci6n es definida como funci6n renal in-

mediata insuficiente, con ascenso postoperatorio de los produc-

tos nitrogenados· en sangre y necesidad de di4lisis, exclusi6n de

otras causas, patr6n bioqu1mico urinaria sugestivo (principalme~

te concentraci6n urinaria de Na+ superior a 20-25 mEq/1 (20-25

mmol/l))y cociente de osmolalidades entre orina y plasma de 1,2

6 menor y evoluci6n espontanea hacia la recuperaci6n funcional.

-69-

4 .1. 4. DrAGNOST:tCO DE RECHAZO

Se han estudiado 34 episodios de rechazo agudo

con determinaciones seriadas de TxB2 en orina, habi~ndose con­

firmado el diagn6stico de rechazo en el an§lisis retrospectivo

realizado. Todos los casos disponen de registro adecuado de

s!ntomas, peso, temperatura y tensi6n arterial. El estudio ana

l!tico incluy6, entre otras, las determinaciones diarias de

creatinina, urea, sodio en orina, excrecci6n fraccional de so­

dio, proteinuria y hematuria. Todos los casos excepto uno di!

ponen de estudio ecosonogr4fico seriado; 15 casos de renogra­

ma con 99 Tc-DTPA y s6lo en uno se hizo arteriografta. (Figuras

22 y 23). En el an4lisis retrospectivo se ha valorado la evo­

luci6n cl!nica y, especialmente, la respuesta al tratamiento

anti-rechazo. As!, 28 de 34 crisis de rechazo respondieron al

intensificar la inmunosupresi6n y en los 6 restantes se dispo­

ne de confirmaci6n histol6gica.

Para analizar los res-ultados se han distinguido cuatro

situaciones cl!nicas diferentes:

GRUPO A.- Transplante no complicado, sin NTA ni rechazo.

Est4 constitu!do por 10 sujetos con buena funci6n re­

nal inmediata y persistente que no recibieron trata­

miento anti-rechazo. La creatinina s~rica en el momen

to del alta era de 1,5 + 0,36 mg/dl (132'6 + 31'82

1umol/l).

-70-

OIAGNOSTICO DE RECHAZO SOBRE RINON FUNCIONANTE

100

N• 25

.. , .. D EXPLORAOO

50 ~ POSITI\Q

0

FIGURA 22.- Porcentaje de parametres explorados y de enfermos en que se alteran estos en el diaqn6stico de rechazo sobre injerto funcionante. EfNa: Excreccion fraccional de sodio. ECO: Ecoqrafia.

DIAGNOSTICO DE RECHAZO SOBRE NTA

100

N•9

% 0 EXPLORADO

50 ~ POSITIVO

0

FIGURA 23.- Porcentaje de parametres explorados y de enferMos en que se alteran estos en el diagnostioo de rechazo sobre NTA.

-71-

GRUPO B.- Rechazo sobre injeL·to funcionante.

Este grupo estS. constitu!do por 25 observaciones. Co

mo promedio el rechazo apareci6 el d!a 9,4 ~ 8,7 de

evoluci6n pos·transplante. S6lo 4 casos· no respondie­

ron al tratamdento anti-rechazo y en todos ellos el

diagn6stico se confirm6 histol6gicamente. La creati­

nina al alta de los casos con buena evoluci6n fu~ de

1,6 ~ 0,46 mq/dl {141'4 ~ 40,66 1umol 1}.

GRUPO c.- NTA postoperatoria s·in rechazo.

Se ha observado en 5 ocasiones. Cuatro casos cursa­

ron con oliguria. La creatinina s~rica alcanzada al

superar la NTA fue de 1,73 ~ 0,33 mq/dl (152'9 ~

29 I 17 /U1J.Dl/ 1) •

GRUPO o.- Rechazo sobre NTA.

El diaqn6s·tico de rechazo se estableci6 el d!a 5 ~ 2

de postoperatorio con un ranqo de 2-8 dtas. Respon­

dieron al tratamiento anti-rechazo 7 de los 9 casos~

en los otros do~ el diaqn6stico se confirm6 histol6-

gicamente. La creatinina al alta de los que respon­

dieron fu~ de 1,6! 0,60 mg/dl (141'4! 53'04 1umo1/1).

Un enfermo sufri6 2 eptsodios de rechazo aqudo sobre ri­

n6n funcionante. Otros 3 enfermos, que cursaron con NTA inicial,

padecieron rechazo una vez recuperada la funci6n. Por ello, se

analizaron un total de 49 situaciones o circuns·tancias cU.nicas

en 45 enfermos.

En resOmen, un 31\ de los enfermos padecieron NTA, la

-72-

incidencia de rechazo durante el per!odo estudiado fu~ de 0,75

crisis/enf~rmo (80% de los enfermos con riii6n funcionante y

64\ de los que tuvieron NTA) y el 82\ de las· crisis de rechazo

respondieron al intens·ificar la inmunosupresi6n.

4.1.5.~ RECOLECCrON DE MUESTRAS

Las muestras sanguineas se recoqieron en tubos

heparinizados, centrifugados posteriormente a 1000 g. durante

10 minutos a temperatura ambiente, utiliz~dose el plasma as1

obtenido para determinar las concentraciones de sodio, potasio,

urea, creatinina y otros par!metros complementarios (calcio,

f6sforo, ~cido Grice, glucosa, osmolalidad} •

Las muestras urinarias se recoqieron durante per!odos

de 24 horas sobre indometacina (5.10-S M) a temperatura ambien

te. Tras medir su volGmen se centrifugaron al!cuotas de 10 ml

a 1000 g. durante 10 minutes y temperatura ambiente. Con el s~

brenadante se realizaron determinaciones de tromboxano s 2 , so­

die, potasio, urea, creatinina, f6sforo, calcic y glucosa. Se

comprob6 la ausencia de interferencias de la indometacina a

concentraciones de hasta 25 mM con los m~todos ana11ticos uti-

lizados en el an~lisis de los dem~s par&metros bioqu1micos. Pa

ra analizar el sedimento urinario se utilizaron muestras de

orina pertenecientes a una micci6n reciente. Diez mili1itros

de esta mues·tra se centrifuqaron a 400 q. durante 10 minutes· a

temperatura ambiente. Tras dt:!sech.ar el sobrenadante, se some­

ti6 al precipitado a an~1isis microsc6pico sin utilizar ninq1in

m6todo de tinci6n.

-73-

4.1.6.~ MSTODOS ANAL!TICOS

4.1.6.1.• DETERMINACION DE TxB 2

La concentraci6n urinaria de TxB 2 se determin6 por rad.ioinmunoensayo tras extracci6n de las ori­

nas con disolventes orq!nicos seqG.n se expuso en la Secci6n 3.

4.1.6.2.~ DETERMINACION DE NIVELES DE CREATININA

Los niveles de este uetabolito se de

terminaron espectrofotom6tricamente seqG.n el m6todo de Jaf£6

modificado (122), en un Autoanalizador ASTRA 8 (Beckman}, mi­

diendo con 4cido p1cr.tco en medio b!s·ico. Esta reacci6n tiene

una constante de velocidad de primer orden que es funci6n de

la concentraci6n de NaOH presente en el medio.

El ranqo normal de los valores de 6ste par&metro es de

l'O + 0'10 mg/dl (85'7 ± 8'84 1umol/l) para hombres y de 0'7 !

·0'10 mq/dl {61'9 ~ 8'84 ;umol/1) para mujeres.

4.1.6.3.~ DETERMINACION DE SODIO Y POTASIO

Los niveles de Na+ y K+ en plasma y

orina se midieron potenciometricamente en un Autoanalizador

ASTRA 8 por medio de electrodes selectivos para estos iones. El

ranqo·de normalidad para·Na+ es de 141 ~ 3'0 mEq/1 (141! 3'0

mmol/1) y de 4 + 0 '3 mEq/1 (4 ~ 0' 3 mmol/1) para K+ (123).

-74-

4.1.7.- PROCEDIMIENTOS ESTADISTICOS

El estudio de los valores de los par~metros ut!

lizados y la comparaci6n entre los distintos grupos se realiz6

mediante an4lisis de la varianza, y pruebas de Wilcoxon en el

caso de muestras de pequeno tamano m~lS). El an~lisis de la v~

rianza y de regresi6n se llev6 a cabo con un calculador progra­

mable HP-97 (124) y ?n programa escrito en Pascal para un mini­

ordenador Digital (125).

El an4lisis de la utilidad diagn6stica de los valores

de TxB2 y de TxB2/Cr, cuando se utilizan junto con los par~e­

tros diagn6sticos habituales de rechazo y necrosis tubular agu­

da, se realiz6 mediante la aplicaci6n iterativa del teorema de

Bayes (126).

4 • 2.- RESULTADOS

Se estud16 la evcluci6n post~-trans·plante de los valores

de la concentraci6n de TxB 2 y del cociente de TxB2/cr urinarios

junto con los dem4s parbletros· utilizados en el seguimiento del

enfermo transplantado, entre los cuales, adem.1s de los utiliza­

dos en el diagn6stico de rechazo, se encuentran hematocrito,

concentraci6n de hemoglobina, recuento de leucocitos y plaquetas,

pruebas de funci6n hep4tica, estudios virol6gicos y anticuerpos

citot6xicos.

Lo~ valorea de la excrecci6n urinaria de TxB2 (cantidad

de TxB2 excretada en orina par unidad de tiempo-24 horas-) mos-

-75-

traron poseer una elevada correlaci6n con los de la correspon­

diente concentraci6n de TxB2 (r=O q606, p .(. 0 • 001; n=60ll • Sin

embargo, en diures·is· inferiores a 500 ml/24 horas desaparece

esta correlaci6n (r=0~0325; n=l04).

No se encontr6 correlaci6n entre los valores de pH y

concentraci6n de TxB2 (z=0'2104) o entre pH y excrecci6n de

TxB 2 (r=0'2108). As!mismo nos-e encontr6 correlaci6n entre vo­

ldmen y concentraci6n de TxB2 urinarios (r=0'2368).

4.2.1.- GR.UPO A: TRANSPLANTE NO COMPLICADO

Los· sujetos de ~ste grupo evolucionaron hacia

una r!pida normalizaci6n de la funci6n renal reflejada por la

disminuci6n de los niveles de creatinina plasm!tica seqdn se

muestra en la Fiqura 24 en la cual s-e representa el comporta­

miento global de la diuresis y de los niveles de creatinina,

TxB2 y TxB2/Cr. Estos· dos altimos s-e mantienen uniformemente

bajos y estables durante la evoluci:6n postransplante, al tiem­

po que se mantienen elevadas diuresis.

En los dos primeros d!as de evoluci6n se observa una

ligera elevaci6ri de TxB2 y TxB2/cr, la cual se asocia a la in­

fluencia de la cirugia y revierte rapidamente normaliz4ndose

ambos parAmetros a partir del tercer d!a de postoperatorio

(p <O 'OS).

En dos enfermo~ se aprecia una elevaci6n del TxB2 no

atribu!ble a rechazo. El primero de ellos present6 una eleva­

ci6n leve, unieamente del cociente, los d!as 9 y 10 de post-

(Tx Bz]o x 100 (Cr)o

{ng/mg)

(TxBzJo

(ng/ml),

{mg/df)

12.0

100

80

60

40

20

0

o•a 0'6

0'4

0'2.

0

"10

a

.f3 4

2

-76-

Tx 82 EN TR NO COMPLICADO

., .. ,

N • 10

......... . ·-·..._. __ --·-·---·.--•-·.-·-·

Q;-~-----------------------------------6

0 5 I

1J 4 R E :3 s I 2 s

f/2.4horas

0~~~--------~------------~-------------5 10 15

DIAS

TIGURA 24.- Evoluci6n media de TxB2/Cr y TxB2 urinarios, creatinina serica y

. vo:J,.\imen de diuresis en transplante renal no cauplicad.o.

-77-

operatorio sin otro dato cl!nico que febricula; la evoluci6n

fu~ excelente sin tratamiento antirrechazo ni empleo de anti­

bi6ticos •.

El otro enfermo present6 un cuadro agudo en el inme­

diato postoperatorio, de hipotensi6n y· anemia intensa: median

te ecosonograf1a se detect6 un gran hematoma perirrenal. La

reintervenci6n demostr6 un escape a nivel de la sutura arte­

rial. Durante una s·emana se obtuvo drenaje ham4tico de la cel­

da y present6 hematuria con coagulos. El cociente TxB2/cr se

mantuvo elevado durante las 2 primeras semanas de evoluci6n;

la concentraci6n de TxB 2 solo se elev6 los dtas 12 y 13. Par

tanto, se trata de un falso positive par hematoma perirrenal

y hematuria macrosc6pica.

4. 2. 2.- GRUPO B: RECHAZO SOBRE INJERTO PREVIAMENTE

FUNCIONANTE.

Diecinueve de los 25 episodios (76%) cursa­

ron con elevaci6n del TxB2 , que fu~ previa al diagn6stico cl£

nico del rechazo y al incremento de la creatinina, con una

antelaci6n promedio de 48 horas (p < 0' 01, Figura 25) . El co­

ciente TxB2/Cr se afect6 m~s precozmente que la concentraci6n

de TxB 2 , elevAndose significativamente (p < 0'021 cuatro dias

antes del diagn6stico. El tratamiento del rechazo con 6-metil

prednisolona intravenosa normaliz6 inmediatamente la concentra­

ci6n de TxB2 pero se apreciaron ligeras elevaciones del cocie~

te TxB2/Cr algunos d!as· durante los 10 primeros de evoluci6n

100

80

60

40

20

-78-

Tx 82 EN RECHAZO SOBRE INJERTO FUNCIONANTE

N • 25

0~--------------~------------------------------------1'0

0'8

0 16

0'4

0'2

o;----------------+--------------------------------------6·

5

4•

3·

2·

.\ ·-'· ·-·-· ............. -·-·- .......... .......... __ _ '·---·---........ _ ...... ,

o~--~,r-----------4------------~,----------~------------~~~

6

4

A er,

eng/ell

0

....

-5 0 5 10 15

OtAS

N •25

•\. RECHAZO SOBRE INJEitTO FUNCIONANTE VARJACIOM Cr5

\ \ -·-·-·--•" .............. ·-· "'·----T -5 -:s -1 0 I 3 5

OIAS 7 9 II · 13

-:...:m.A 25.- Evolucion media de TxB2/Cr y TxB2 urinarios, creatinina seri.ca e increm~

to de creatinina en rechazo sobre transplante funcionante. El dia 0 re­

presenta el d!a del diaqn6stico cl!nico del rechazo; la barra horizontal,

el tratamiento iJDunosupresor.

-79-

del rechazo. Con el control de la crisis ambos par!metros se

normalizan de manera persistente. La suspensi6n de las dosis

de los valores de 6-metilprednisolona ocasiona en 5 casas

una elevaci6n de los valores de TxB2 y TxB 2/Cr (fen6meno de

rebate} s·in paralelismo en los niveles sericos de creatinina.

La Figura 26 muestra la evoluci6n t!pica de un sujeto

de este grupo. En este caso, los niveles de TxB 2 se elevan 72

y 24 horas antes del diagn6stico clinico del rechazo, mientras

que los· valores de TxB2/Cr siguen una evoluci6n similar aun­

que continuamente elevados. En este momenta evolutivo, la

creatinina estaba disminuyendo y la diuresis se normalizaba

tras la fase poliGrica inicial. La resoluci6n del proceso de

rechazo exigi6 la administraci6n de 8 dosis intravenosas de

6-metilprednisolona. Al comenzar este tratamiento los valores

de TxB2 y TxB2/cr se normalizaron rapidamente, mejorando paul~

tinamente la funci6n renal. La suspensi6n de la terapia aste­

roidea ocasiona un ligero efecto rebate que no tuvo repercusi6n

cl!nica.

En 6 crisis de rechazo (24%) el TxB2 urinario no se ele

v6 (falsos negatives}. En 5 ocasiones se trat6 de rechazos le-

ves que en ningun momenta supusieron elevaciones de los valores

de creatinina plasm4tica de m&s de 1 mg/dl (88,4;umol/l}; en el

otro case, la elevaci6n de este par4metro fue de 3,7 mg/dl

(327 1umol/l} • Todos fueron tratados· y respondieron con facili­

dad y rapidez (m4xima dosis· de 6~metilprednisolona empleada:

4.250 mg)..

-so-

6-MP

[TX62). 8

[er]. 6

(ng/mg) ., __ / : .... , ...... ,

(Tx82]. 5

4 (ng/ml)

3'

2 •

(cr ls 10

(mg/dl"} 8

6

2 \ ·-· . / '· ' /. ...... ·--·-· '•'--·-----·--

0 I 4 u R E 5 I 5

( l!dia) .1 5 10 15

dias post -transplante

FIGURA 26.- Evoluci6n t!pica de un sujeto con rechazo sobre transplante funcio­nante. Se observa la elevacion de TXB2 y TxB2/Cr previa al diagn6s­tico clinioo de rechazo,marcada por el inicio del tratamiento con terapia inmunosupresora de choque, y un ligero efecto de rebote en ambos parmaetros al cesar esta. 6-HP: 6-meti]pl::~solona.

-81-

En 4 ocas·i:ones· la evoluci6n fu~ mala, abocando a la ne

frectom!a (2 cases} o al exitus ( 2 casos). En el primer caso,

el paciente falleci6 por candidiasis sist~rnica, sin coloniza­

ci6n del injerto, el d!a 20 de evoluci6n. Hab!a presentado cr!

sis de rechazo, confirmado por biopsia, con mejor!a funcional

transitoria bajo tratamiento y con empeoramiento preterminal.

La necropsia demostr6 la persistencia de signos histol6gicos

de rechazo. Los valores de TxB 2 permanecieron elevados, aunque

de manera inconstante durante los 20 d!as de evoluci6n.

En el segundo caso se trat6 de una crisis rnuy severa

de rechazo, instaurado el d!a 8 de evoluci6n, con rotura del

injerto y nefrectom!a el d!a 9. El TxB 2, previamente normal, se

elev6 coincidiendo con el diagn6stico de rechazo.

El tercer caso falleci6 por encefalitis herp~tica ful­

rninante el d!a 18. El enfermo hab!a recibido tratamiento anti­

rechazo los d!a 6 al 9 de postoperatorio, con respuesta funcio­

nal y norrnalizaci6n del TxB2 urinario (Figura 27) • En las 48

horas previas al exitus se detect6 elevaci6n de la creatinina

y del TxB2 • La necropsia evidenci6 la persistencia de rechazo.

El cuarto case termin6 en nefrectom!a el d!a 47 de evo

luci6n tras dernostrar la biops-ia un severo rechazo vascular.

Durante el tratamiento del rechazo, la concentraci6n de TxB 2 fu~ normal pero el cociente TxB2/cr se elev6 algunos d!as de

rnanera irregular. Simultaneamente, la enferma present6 una in­

fecci6n por ci tomegalovirus·.

HO

6-MP

(Tx82].

[er]. (ngJmg)

18·~,. 4

6

4·

2

. 5· (Tx~].

4 (ng/ml)

3

[cr ], (mg/dl)

D I u R E s I s

( lldia)

2· 1-

10-

8-

6·

4-

2-

4-

3·

2

1-

-82-

vv v

~

1

\ \A-

5

~ i I ............

I .. ......

10 15 dias post -transplante

YIGURA 27.- Transplante renal con rechazo refractario. TxB2 y TxB2/Cr se normali­zan por el tratamiento inmunosupresor pero se elevan al suspenderse este. HD:. flemodiil.isia. '

-83-

4.2.3.- GRUPO C: NECROSIS TUBULAR AGUDA SIN RECHAZO.

El comportamiento global de este qrupo es an~­

logo al del transplante no complicado: normalizaci6n de ambos

par.:t.metros a partir del tercer d.! a (p < 0 • 05 para TxB 2 y p < 0 • 01

para TxB2/Cr; Figura 28) •

4.2.4.- GRUPO D: RECHAZO SOBRE NECROSIS TUBULAR AGUDA

PREVIA.

En ~sta situaci6n se observan las elevaciones

m!s intensas y sostenidas, tanto de la concentraci6n de TxB 2

(Figura 29 como del cociente TxB 2/Cr (Figura 30), con un pa­

tr6n claramente diferenciado de la necrosis tubular sin recha­

zo. As!,se observan diferencias s·ignificativas en los valores

de TxB2 en los d!as 2 a 5 post..,.transplante entre estos grupos

(p<O'OS) y entre los d!as 3 (p<O'Ol), 4 y 5 (p<.0'05) para

el cociente TxB2/Cr.

Estos enfermos evolucionaron qeneralizadamente con oli

guria y valores muy elevados de creatinina plasm~tica que hi­

cieron que necesitasen tratamiento s·ustitutivo con di4lisis.

As!, en el caso mostrado en la Figura 31 fueron necesarias 6

sesiones de hemodi4lisis entre las cuales la creatinina plasm~

tica lleg6 a niveles de 12'1 mg/dl (1.070 1umol/l).

10

4

e ....... Cl 3 c ,_.o

"' m f5.

L..J

2

I 5 DIAS

-84-

Tx 82 EN NTA N•5

0 80 E

....... tJ' c -Q

60 )(

0 r-1 0 t\11"1

Q] '-

~ (.)

L.J L.J

40

10 5 DIAS

10

FIGURA 28.- Evolucion ind!vidualizada de los valores de TxB2 y TxB2/cr en pacientes con necrosis tubular aguda.

e :~ 1%

r! CD 10 ~ '-'

8

G

4

z

0

Tx Ba EN NTA + RECHAZO N•t

0

5 10

DIAS

-85-

15

1 ~ ~

g .. .I no .. ,..., m .. e8

"300

220

110

140

100

10

20

Tx Bt /Cr EN NTA + RECHAZO

N•t

10

DIAS 15

FIGURAS 29 y 30.- Evolucion individualizada de los valores de TxB2 y TxB2/Cr urina­

rios en necrosis tubular aguda con rechazo asociado.

HD

6-MP

[TxB2J. 8·

[cr]. 6

(ng/mg) 4

2·

5 [rx~].

4 (ng/mt)

J•

2·

1·

[cr ls 10~

(mg/dl) 8-

6-

4-

2-

0 l 4-u R J· E s 2-I s 1 ~

( l/dia)

-86-

v vv v v v

/ ,l.t \ • 66

• . ~_./\ ._,....

., t

I 1~ 18

I ....... '......_,.....-

• ~-*...;~ .. -·;;: i ............... _..,..\ J Vv\ .

'· \ ·-·,·-·-·

!L--r-1 5 10 15 20

dias post -transplante

FIGURA 31.- EvoluciOn t!pica de un paciente con rechazo sobre necrosis tubular

ayud&.

-87-

4.2.5.-: SIGNIFICAC!ON DE LAS DETERMINACIONES DE

TxB2~2/Cr.

Para conocer la significaci6n diagn6stica de

una determinaci6n ais·lada de TxB 2 , se ha calculado el porcen­

taje de resultados anormalmente elevados en las diferentes

circunstancias cl!nicas.

En ausencia de necrosis tubular aguda y de rechazo

{Figura 32) s6lo hay un 4% de falsos positives. En los-3 d!as

previos al diagn6s·tico cl!nico de rechazo {prerrechazo), un

36% de las determinaciones son altas·, porcentaje que disminu-.

ye al ll% durante el tratamiento antirrechazo: despu~s de su~

pender el tratamiento {rechazo clinicamente controlado) un 8%

de las determinaciones· son falsos posi tivos.

Cuando el rechazo incide sabre necrosis tubular, el

100% de las determinaciones realizadas durante los 3 d!as pre­

vias al diagn6s·tico de rechazo son al tas. Considerando globa!_

mente todas las crisis de rechazo (tanto si la situaci6n pre­

via es normal como si incide sobre necrosis tubular) se apre­

cian un 7% de falsos positives y un 38% de falsos negatives.

El cociente TxB2/cr (Figura 33) presenta una elevaci6n

previa al diagn6stico cl!nico de rechazo en el 70% de los ca­

ses en el grupo de evoluci6n inicial satisfactoria y en un 91%

de los caso& que cursan con necrosis tubular aguda. La sensib!

lidad global de ~ste par&metro es mayor (77%) que la del TxB2

pero a expensas de un mayor n6mero de falsos positives (18%).

100 (I) <(

~ <(

(I) 11.1 z 0

!l 50 z :E a: 11.1 1-11.1 a .,.

n

N

10 25 25 2Z

107 36.213 120

-88-

( Tx 82. J o EN RECHAZO

5 9 9 7

88 25 46 59

100

15 34 34 29

195 61 259 179

7IGURA 32.- Utilidad de las deteDninaciones de TxB2 urinario en el diagnostico de rechazo y rechazo sobre necrosis tubular aguda. El termino "pre-recha­zo" se refiere a los 3 d!as previos al diagnostico cl!nico. T 0

: trata­miento-rechazo. n: niimero de casos; N: nGmero de determinaciones ana­liticas.

(Tx 82. Jo EN RECHAZO [Cr]o

n 10 25 25 22 5 9 9 7 15 34 34 29 N 88 40 194 105 67 22 44 51 155 62 238156

100 II

0 <(

n 70

!:i "' r3 z 0 u c:c z :i a: 11.1

t.i a .,.

0

-89-

La aplicaci6n del teorema de Bayes sobre el conjunto

de signos· y s·!ntomas habitualmente utilizados en el diagn6stico

de rechazo (Tabla VI"II") , proporciona las probabilidades diagn6~

ticas que se muestran en la Tabla IX, columna ~· en el diagn6s­

tico diferenc.ial de necros-is tubular y rechazo (asociado o no a

necrosis tubular}.

Los valores de la probabilidad "a priori" de encontrar

el proceso considerado, se basan en los datos de frecuencia de

esos diagn6sticos· en la poblaci6n estudiada. Se observa, que no

se puede distinguir entre procesos de rechazo o de necrosis tu­

bular ya que ambos muestran un conjunto de signos y s!ntomas

muy similar. As!, los par!metros cl!nicos y bioqu!micos habi­

tualmente considerados como sugestivos de rechazo se observan

en ausencia de ~1. De cada 100 casos· sugestivos, 44 se deber.Sn

a rechazo sobre injerto funcionante, 42 a necrosis tubular y

14 a rechazo moSs necrosis tubular.

Sin embargo, la adici6n de TxB2 (Tabla IX, £ ) o del

TxB2/cr (Tabla rx,· ~) hace que se obtenga una mayor especific!

dad para el diagn6stico de rechazo. Si se utilizan simultanea­

mente TxB2 y TxB2/Cr, se obtiene un conjunto de par!metros que

distingue de una manera practicamente absoluta los procesos de

rechazo frente a los de necrosis tubular sin rechazo (Tabla IX,

TABLA VIII.- UTILIOAD DE ~S PARAHEfROS CL!NICOS MAS HABITuALMENTE EMPLEADOS EN EL DIAGNOSTICO DIFERENCIAL DE RECHAZO

Y NU:ROSIS TUBULAR AGUDA.

PARAHETROS DIAGNOSTICOS CL,SICOS 0 HABlTUALES

PROBABILIDAD FIEBRE t TENSION SIGNOS PROTEI- HEMATU- ECO-DIAGt()STIOO A PRIORI '>' J8•c t PESO 4- DIURESIS ARTERIAL LOCALES +EfNa NURIA RIA + cr GRAFU TxB2 TxB/Cr

RECHAZO (R) 0'51 0'82 0'91 0'81 0'32 . 0'18 0'70 0'50 • 0'10 1'00 0'62 o• s2 0'80

lfl'A 0'10 0'60 0'80 1'00 0'20 0 1 20 0'60 1'00 0'80 1'00 0'40 O'lOj R + lfl'A 0'18 0'89 1'00 1'00 O'll 0'56 0'56 0'25 0'11 1'00 0'78 1'00 1'00

BUENA 0'21 0'10 0'10 0'10 0'10 0'10 0'20 0'10 0'10 0'10 0'10 0'20 0'40 EVOLUCION

---·-·-··------- --------------~-

TABLA IX.- DISTRIBUCION PORCENTUAL DE PAMMETROS ALTERAOOS EN DIVERSAS SITUACIONES CL!NICAS

_!_ ~ ...£.._ d

DIAGOOSTICO SIGNOS CLASICOS a + TxB2

a + TXB/Cr a + Txa2

+Txa2;cr

RECHAZO 44 57 62 56

NTA 42 10 14

RECHAZO + tll'A 14 33 24 41

BUENA EVOLUCION 1'11'0 NO ,VO N 0

i

I \0 0 I

-91-

4.3 ..... DI:SCUS:tON

Los resultados' encontrados confirman que las crisis

de rechazo agudo se acompanan de elevaci6n del TxB2 urinario

(82% de los· cases) y que la ausencia de elevaci6n (falsos ne­

gatives) se aprecia fundamentalmente en cases de rechazo leve

con escaso deterioro funcional y facil control al intensifi­

car la inmunosupresi6n (5 de 6 cases).

El aumento del TxB 2 urinario no se debe a la agre­

si6n quirtirgica, cuyo efecto queda limitado a las primeras 48

horas, co~o se hab!a observado en cirug!a experimental (93) •

Por otra parte, se produce. pese a los efectos potenciales de

la prednisona-inhibidor de la fosfolipasa A2 (17)- y de la

azatioprina -inhibidor de la tromboxano sintetasa, al poseer

un grupo imidazol (127)-.

En la utilidad del TxB 2 como marcador precoz y fiable

del rechazo en transplante renal cabe diferenciar entre dos

circunstancias cl!nicas en funci6n de la diferente dificultad

diagn6stica que conllevan: rechazo sobre el rin6n previamente

funcionante y rechazo sabre necrosis tubular aguda. En el case

de buena funci6n previa del injerto, la determinaci6n del TxB 2 urinario permite confirmar el 76% de las crisis. S6lo se han

observado 2 elevaciones del TxB 2 no atribu!bles a rechazo: en

una ocas·i6n se asoci6 a febr!cula y no puede descartarse un r~

chazo subcl!nico de evoluci6n favorable con la inmunosupresi6n

basal; la otra observaci6n corres·ponde a un gran hematoma per!_

-92-

renal en el inmediato postoperatorio; dada la facilidad con que

la ecosonograf!a permite en la actualidad detectar las coleccio

nes l!quidcsperirrenales, esta situaci6n no plantea especiales

dificultades diagn6sticas. No se ha observado ningdn caso de

trombos·is venos-a profunda, circuns·tancia en la que tambien se

aprecia un marcado aumento del TxB2 urinario (91). Este aumento

no se produce por infecci6n urinaria ni por infecci6n sistemica

sin rechazo, lo que pace del TxB2 urinario un par~etro m4s es­

pec!fico que la beta-2-microglobulina (66).

Aparte de su contribuci6n en la confirmaci6n no invasi­

va del rechazo, con un nftmero aceptable de falsos positivos y

negativos, el TxB2 urinario aumenta unas 48 horas de promedio

antes de que el diagn6stico cl!nico de rechazo sea posible. Sin

negar que esta precocidad permite una sospecha de rechazo inmi­

nente, podr!a ser aventurado iniciar el tratamiento antirrecha­

zo bas ado exclus·ivamente en el aumento aislado del TxB2, en au

senyia de deterioro funcional y de otros datos cl!nicos, por

lo ~e la aportaci6n adicional del TxB 2 no parece de importan­

cia relevante para el diagn6stico de rechazo sobre rifi6n funcio

nan\e.

La administraci6n intravenosa de 6-metil-prednisolona

co~ tratamiento del rechazo disminuye inmediatamente el TxB2 urinario, independientemente de que el rechazo sea corticosen­

sible o corticorre~istente. En general, llega a normalizarse

en los caso~ con buena evoluci6n, aunque una cuarta parte de

ellos· experimenta un fen6meno de rebote pasajero al suspender

-93-

el tratamiento. Por el contrario, cuando el rechazo es refract!

rio, el descenso del TxB2 no es completo y constituye un par4m~

tro de cierto valor p~on6stico.

cuando el rechazo incide sobre necrosis tubular aquda

previa, el hallazgo fundamental es que no hay falsos negatives:

todos los casos cursaron con elevaci6n del TxB2 urinario. La d!

ficultad del diaqn6stico en ~sta situaci6n resalta la importan­

cia de ~ste hecho, &unque, al mismo tiempo, obliqa a extremar

la cautela. En nuestro caso, consideramos que los diagn6sticos

de rechazo sobreaiiadidos a necrosis· tubular aquda son fiables

dada la conjunci6n de datos cl!nicos y exploraciones en que se

bas6 y al meticuloso an4lis·is retrospective realizado; en ~ste

sentido, es significative que se diaqnosticaran 0'64 crisis/e~

fermo con necros-is tubular y 0 '75 crisis/enfermo con riii6n fun

cionante1 que 7 de 9 casos evolucionaron favorablemente con tra

tamiento antirrechazo; y que los 2 casos corticorresistentes es

t!n confirmados histol6gicamente.

Las diferencias obs-ervadas en el TxB2 cuando el rechazo

incidi6 sobre necrosis tubular en comparaci6n al rechazo sobre

riii6n funcionante, no son imputables a modificaciones de la in

munosupresi6n, ya que no ex.tsti6. El an~li,sis de los· casos

con necrosis tubular sin rechazo permite tambi~n excluir que el

proceso necrosis-regeneraci6n tubular modifique la excrecci6n

urinaria de TxB2• Es· posible atribuir aqu~llas diferencias a la

mayor seriedad del rechazo en los casos de necrosis tubular. En

~s-te sentido parecen apuntar tanto la pricoz instauraci6n del

/

/

-94-

rechazo (d!a 5 frente a d!a 9 de evoluci6n como promedio), co­

mo el hecho de que 2 de los 9 casos tuvieran que ser nefrecto­

mizados con s·ignos intensos· de rechazo vascular y rotura renal.

Por consiguiente, la determinaci6n de TxB 2 urinario

es de gran utilidad en el diagn6stico de rechazo sobre necrosis

tubular aguda, por cuanto es· un procedimiento no invasivo, con~

tantemente alterado y utilizable en una situaciOn con especia­

les dificultades· diagn6sticas· al no poder disponer de par4me­

tros funcionales.

Para perfilar aun m~s la utilidad de ~ste par~etro se

ha intentado delirnitar el valor diagn6stico de una determina­

ci6n aislada, cuantificando los fasos· positivos y los fasos n~

gativos en las· diferentes si tuaci:ones cl!nicas. Los resultados

corroboran las conclusiones anteriores: en cuanto a la concen­

traci6n urinaria de TxB2, un 11% ~e las dete~naciones en si­

tuaci6n de necrosis tubular aguda son falsos positivos, pero

no hay falsos negativos: es decir, una determinaci6n normal

permitir!a excluir la existencia de rechazo. En cuanto al co­

ciente TxB 2/Cr, parece menos especifico (24% de falsos positi­

vos) y menos sensible (91% de los casos) •

El origen del TxB2 urinario que se mide, no se conoce

de manera precisa. En ausencia de trombosis venosa profunda y

de hematoma perirrenal, parece clara su procedencia intrarre­

nal (91), veros·111lilmente en relaci6n con la parti:cipaci6n de

plaquetas (128}, las cuales son la principal fuente end6gena

de tromboxano conocida. Estas plaquetas son acumuladas con rna-

-95-

yor intenstdad en los procesos de rechazo {83) •

Adem4s de las· plaquetas, existe tambi~n una acumulaci6n

y activaci6n de macr6fagos (129), los· cuales son capaces de si~

tetizar tromboxanos (130); y los linfocitos, adem4s de poder

sintetizar ellos mismos tromboxano (59), son capaces de estim~

lar la producci6n de este por parte de los macr6fagos (131) •

Pero su papel en el fen6meno de rechazo continua siendo una in

c6gnita.

En res·1lmen, los· hallazgos· realizados apoyan algunos

preliminares (91, 92) y permiten cuantificar la utilidad de la

determinaci6n de TxB2 urinarto en el diagn6stico precoz del re

chazo en transplante renal. Hasta ahora no se hab!a diferencia

do entre rifi6n funcionante y necrosis tubular aguda, siendo es

ta nuestra principal aportaci6n por lo necesario que es dife­

renciar entre ambos estados para un mejor tratamiento de cada

uno y un menor riesgo para el enfermo.

-96-

- CONCLUSIONES

1.- La determinaci6n de TxB 2 urinario mediante radioinmunoen­

sayo, con las innovaciones introducidas por nosotros, es

una t~cnica precisa, exacta y sensible. As!mismo, se han

estudiado y controlado la influencia de las condiciones

de recoqida y almacenamiento de las muestras y la interf~

rencia de la ciruq!a, c~lulas sanquineas y fSrmacos emple~

dos en el tratamiento de ~stos enfermos.

2.- Los enfermos transplantados de rin6n con buena evoluci6n

postoperatoria o con necrosis tubular aquda, muestran va­

lores normales de TxB2 y del cociente TxB2/Cr en orina.

3.- El rechazo aqudo provoca una elevaci6n de TxB2 y TxB2/cr

48 horas antes, como promedio~ del diaqn6stico cl!nico.

El TxB2 muestra una especificidad global del 93% y una

sensibilidad del 62%. El TxB2/Cr es ~s sensible (77%)

pero menos espec!fico (82%).

4.- Los valores m4s elevados de TxB 2 y TxB2/cr se observan

cuando el rechazo incide sabre necrosis tubular aquda

previa.

5.- Por eonsiquiente, la determinaci6n de TxB2 urinario

-97-

constituye una aportaci6n sustancial en el manejo correcto del

enfermo transplantado, especialmente para el diagn6stico precoz

de rechazo en presencia de necrosis tubular.

-98-

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7.- APENDICES

7.1.- CALCULO DE CONCENTRACIONES DE TxB 2 MEDIANTE UNA CALCU­

LADORA PROGRAMABLE HP-97.

7.1.1.- MANEJO

Una vez le!da la tarjeta por ambas caras, se

introducen en parejas los valores de la concentraci6n de los pa­

trones por la tecla A y el valor de % B/B0

por la B. Tras ello

se presiona la tecla C obteni~ndose, por ~ste orden:

- Coeficiente de correlaci6n

- Ordenada

- Pendiente

A partir de aqu! se pueden interpolar los valores de

% B/B0

de los problemas introduciendo su valor por la tecla D.

El valor correspondiente de concentraci6n aparece en la impreso­

ra de la m~quina. As!mismo, puede realizarse la interpolaci6n i~

versa: dada la concentraci6n, obtener el valor de% B/Bdmedian­

te la tecla E.

-118-

7.1.2.- LISTADO DEL PROG~.MA

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RTH 866 ? .. , !U Riii 156 STCJ 621 .... 281 ST02

82~ fLBLC 86i RCLi:i 112 •LBLD 157 RCLo 282 RCL4 82.3 DSP4 ~oa h~ 113 STli£ lSS "-'""="

283 RC'-9 n~

824 SPC eo9 ~~L9 il4 l 15S RCL9 2134 82S p;s 878 115 6 168 2135 X2

RCL.; 871 CkS 4f·- t1 lel CHS ezo J•Ci 286 RCL.2 8.27 RCL5 Bi2 F:CL:' !17 RCL£ 162 P.CL7 2Bi ~

928 X iJ?3 1.i~ !G~ 26i STG2 azs RCLS Bi4 RC!.J 119 lo. Jt=.; P.CL1 ZBE- RCL3 63ti ... 875 1.213 ~CLE io5 216 v·x ~31 CHS 376 l/."i 1Zi , .. 1t)o SiOJ 21! RCLZ U2 RCLB IJT? SiG.Z 1~.2 Lk . -~ RCd Z1Z •Co• 8JJ + e?s p.;u 123 STu£ ;58 .; .213 P.Cl.l fJ?S •.•.-:: l ~.· RCL.; j6: 83 .. STC~ .. ~ L'f

214 X 035 RCL4 es.; RCLZ 125 l/X 1<a ~ ... -;.; .215 [i\ 936 xz 881 P' RCL6 i ~l RC:..i Zlci u:< .. o 837 f.Ci.3 &52 FF:r;: 127 RCLE 1 ~.2 ~ Zl7 F:s f!3S ~8J iii !2$ x:r liJ H!Jl Z18 RC:..6 ~!9 ~HS 684 PRiX l.ZS :?4 RCL4 2.!3 X d4ti RCL5 . ~55 r:s lJ~ 1!5 .'1~ E.£0 PRif; £141 086 RCL6 J3i e' "'~ RCL9 Z21 RTH 042 STii~ 88;' FRTX 132 ~TI, li'i ZZ2 K/S tl43 P.CL3 888 RCL4 133 ti5Lo& ;7S CHS

889 PiiTX !J.: - .. c li'9 RCL5 e44 l/X r .. ..,

845 RCLl 899 ~;;, Jj5 RCL4 136

-119-

7.2.- ANALISIS DE LA VARIANZA Y DE REGRESION

Para analizar 1a series de datos se rea1iz6 un programa

en Pascal para un microcomputador Digital Rainbow 100 plus· con un

sistema operative CP/M 86/80 y un compilador de Pascal COMPAS de

Digital Research. As!mismo, se rea1iz6 una versi6n en Basic de es

te mismo programa.

7.2.1.- MANEJO

Tras la introducci6n de los datos solicitados,

el programa exhibe el siguiente MENU:

D Correcci6n de datos

K Prueba de Kolrnogorov-Srnirnov

C ANOVA y prueba de comparaci6n de medias (Scheff~)

L Listar datos

B Prueba de Barlett

M Prueba de medias con heteroscedasticidad

R Nuevo an!lisis

G Transforrnaci6n Loge x

F Transformaci6n ex

U Transformaci6n x112

X Transformaci6n x 2

W Prueba no param~trica de Welch

T An!lisis de regresi6n

E Fin (en la versi6n Pascal)

-120-

El proqrama per.mite comprobar las hip6tesis del an~lisis

de la varianza y realizar transformaciones de los datos en caso

de que no se cumpla alquna de ellas. S6lo se requiere que el

muestreo sea aleatorio. As!mismo, permite realizar el an~lisis

de reqresi6n de dos series con el mismo nGmero de datos y prue­

bas no param6tricas.

Cada opci6n puede ejecutarse independientemente de las

de~s.

-121-

1.2.2.- LISTADO DEL PROGRAMA

PROGRAM ONE_WAY_ANOVA; <* 28 JULY 198G *> CONS!

BELL • e?; !YPE

VAR

B_ARRAY= ARRAY Cl •• lOJ OF INTEGER: V_ARRAY~ ARRAY Cl •• lOJ OF REAL;

N: ARRAY Cl •• lO,l •• 4BJ OF REAL; Q,H,F,S,K,D,W: V_ARRAY; B: B._ARRAY; A,V: INTEGER;

PROCEDURE WAIT; CONST

ENTER = 913; VAR

CHARAC:CHAR; BEGIN

READCKBD,CHARAC>; WHILE CHARAC <> ENTER DO

BEGIN

-~ END;

WRITE<BELL) ;·· READCKBD,CHA,RAC>

END

. PROCEDURE CLEAR_HOHE; CONS!

CLSH•@27'CO;OH'@27'C2J'; BEGIN

WR I'IE < CLSH > END;

PROCEDURE HEADl; BEGIN

CLEAR_HOHE; GOTOXYC0,5>; WRITELN<'************~******************~*' WRITELN<'* •· WRI!ELNC'* ONE-WAY ANOVA ~'

WRI!ELN<'* ~'

WRITELNC'****~*******************A******~*' GOTOXY< 7, 20 > i WRITEC'PRESS ''ENTER'''>;

. WAIT END;

!UNCTION UPPERCCHARAC:CHAR>:CHAR; BEGIN

IF CHARAC IN C 'a 1 ...

1 z' T !HEN UPPER: =CHIU OP.D < C~ARAC > -3'2 > ELSE UPPER:=CHARAC

. END;

FUNCTION CORRECT ANSWER:BOOLEAN; VAR -

CHARAC:CHAR; BEGIN

READ<KBD,CHARAC>; CHARAC:=UP~ERCCHARAC>;

-122-

WHILE NO! <CHARAC IN C'Y','N'J) DO BEGIN

---· ---~RliE<B£1..1..); ··-READ<KBD,CHARAC>; CHARAC:=UPPER~CHARAC>

END;· WRIIE<CHARAC>; CORRECI_ANSWER:= <CHARAC 'Y' >

END;

PROCEDURE ZEROS; VAR

!:INtEGER; BEGIN

FOR I:• 1 IO ~ DO BEGIN

END;

SCIJ:= 0; KCIJ:= o;

·wen:= o; DCIJ:= 0

END

PROCEDURE CALCl; VAR .

I,J:IN'IEGER; BEGIN

v:=o; FOR I:=l tO A DO

BEGIN

END;

FOR Ji=l tO BCIJ DO BEGIN

SCIJ:= SCIJ + NCI,JJ; KC!J:= KCIJ + < NCI,JJ. Nt!,JJ >: DCIJ:= SQRt (( Kt!J - ( SCIJ * S[!J > I BCIJ >

I C BC IJ - 1 » ; W t I l : = W.t I J + 1 ; V:• V + 1

·END; HtiJ:= SCIJ I WCIJ; FCIJ:= < SCIJ * SC!J > I WCIJ

END

<*SI GE'tDAIA.PAS*> <*SI OPIIOND.PAS*> <*SI OPIIONK.PAS*> <*SI OPIIONC.PAS*> <*SI OPIIONL.PAS*> C*SI OPIIONB.PAS*> <*SI OPtiONH.PAS*> <*SI OPIIONSS.PAS*> <*SI OPIIONI.PAS*>

PROCEDURE RESTARt; BEGIN

ZEROS; GEtDAtA; CALCl

'END:

PROCEDURE OPI!ONS; VAR .

OPTION:CHAR;

-123-

PROCEDURE CALL OPTION<OPTION:CHAR): EiEG-IN ___ -·--· ~. -------··· --·--·----CASE OPTION Of

1 D1 !CORRECTION:

END

I K I : .{OUIOGOROV; 1 C':ANOVA_COMP; I L': LISt.; .' B' :BARLETT; 'M':MEAH; 'R':RESTART; I G I: LOG; ' 'F': INV_LOG;· 'U':ROOt'; 'X':INV_ROOT; 'W' :WELCH; '!':REGRESSION; 'E':

END; <* CALL_OPTION *> .. BEGIN

REPEAT' CLEAR_HOME; GOtOXY< 33,2 > ; WRITE< 'HENU' >; GOTOXY<32,3>; WRITE<'======'); GOTOXY<0,5>; WRIIELN<I ':l9,'D WR ITELN ( I , : 19' I K WRITELN<' ': 19, 'C WRITELN( I , :19, 'L WRITELN<' ':19,'B WR ITELN ( , I : 1 CJ t I M WRITELN<' ': 19, 'R WRITELN<' ':19, 1 8 WRITELN< I I: 19, 1 F WRITELN<' 1 !l9,'U WRITELN(' 1 !19,'X WRITELN<' ':19,'W '.JRITELN<' ':19,'! WRITELN<' ':19.''£ WR!IELN; i..Jf<ITE<' ':19,'SELECT BY READ<KBD,OPTIQN); OPTION:=UPPER<OPT!ON>; WHILE NOT

DATA CORREC!ION ') KOLMOGOROV-SM''S TEST '' ANOVA AND MEAN CQMP. !EST'> LIST D~TA ') BARLE!T''S TES! ') MEANS TEST W!:H H£TEROS. '' NEW TEST ' ) LOG. TRANSF. '\ !NV. LOG. TRANSF. I)

ROOT TRANSF. ') !NV. ROOT ') WELCH''S NON ?ARAM. !ES! ') REGRESSION 'l END ')

( 0 pI ION IN ( , D , • I ~( , • ' I c I , I L , • I B I , I !11 • I 1?. ' • I '3 I • I '.J I • , '!: I • I X I ' • w I , • ! ' , BEGIN ' I '£ 1 ))DO

WR IIE (BELL> ; : . READ<KBD,~PT!DN>; OPTION:=UPPER<OPTION>

END; WRIIE<OPTION>; CALt OPTION<OPTION>;

UNtiL OPTION='£'; CLEAR_HOHE

-l2i4-

BEGIN HEADl; GEIDAIA; CALCl;. OPTIONS

END.

PROCEDURE GEIDATA; (* 30 JULY 86 ~~ VAR

I,J,L,H:INTEGER; BEGIN

A: =0.; CLEAR_HOttE; GOTOXY<0,2>; WRITE('INTRODUCE THE NUMBER ~F SERIES !0 AMALIZE '>; READ<A>; rOR I:•l TO A DO

BEGIN H:•O; L:•O; REPEAT CLEAR_HOHE; BCil:=O; GOIOXY<0,2>; WRIIEC'INTRODUCE THE NUMBER OF DAtA OF SERlE ',I,' ·~: READCBtiJ>; . GOIOXY<0,7>; WRITEC'IS THE NUHBER OF DA!A CORREC:?<YIN>: '>; UNTIL CORRECT_ANSWER; SCll:=o; KC Il :=0; WC I.l: aO; Dttl:=o; CLEAR_HOHE; GOtOXY<0,2); WRIIELN<'INTRODUCE THE DAIA OF !HE ~Ei!E '.I.' :''; FOR J:=l TO Btil DO

.BEGIN . H: =H+l: GO!OXYC14*M,L+4>: WRITECJ:3,' ':3>; READ<Nti,Jl>; IF H a 3·THEN

END;

BEGIN H:ao; L:=L+1

END

GOIOXYC7,20>; WRltE<'PRESS ''EN~ER'''>; WAI'E

END END; <* GEtDAtA"*>

-125-

PROCEDURE CORRECTION; <A 30 JULY 1986 *' VAR

R9 E,I:INTEGER; BEGIN

CLEAR_HOHE; GOTOXY<0,2>;

<A OPTIOND ~>

WRITE<'INTRODUCE THE INDEX OF THE SERlE WITH !H£ VALUE TO BE CHANGED REPEAT

READ(R); IF <R<l> OR <R>A) THEN

BEGIN

END

WRITE-< BELL); GOTDXY<G~,2>; WRitE<' ':16>; GOTOXY<63 9 2)

UNTIL <R>=l> AND <R<=A>; GOTOXYC0,4>; WRITELNC'!NTRODUCE THE INDEX OF !HE PLACE OCCU~l!D IN !HE SER!E '.R);. WRITE<'BY THE VALU~·TO BE CHANGED : 'J; READ<E·>; GOtOXY<O,B>; WRlTE<'PRESENt VALUE ',NCR,EJ:8:2>: GOTOXY<O,lO>; WRITEC'INTRODUCE THE NEW VALUE '>; READCNCR,EJ>; ZEROS; GOTOXY(7,20>; WRITE<'WAIT A HOHENT'>; CALCl

END; <A OPTIOND ==> CORRECTION A>

-126-

PROCEDURE KOLHOGOROV; <* 25 JULY 1986 ~~

VAR <* OPTIONK *>

Z,Y,AK,L: ARRAY [1 •• 10,1 .. 48] OF REAL; X: ARRAY [1 •• 2,1 •• 10] OF REAL; U,V~;: V_ARRAY; H,I,J,PI,REH:INTEGER; !Et1P:REAL;

PROCEDURE CORREC!_BH<BH:IN!EGER;VAR VH:REAL): BEGIN .

CASE 8H OP 4: VH:= 0.417; 5: VH:= 0.405; G: VH!= 0.3G4; 7: VH:= 0.349; B: VH:= 0.3<31; 9: VH:= 0.311;

10: VH:= 0.294; 11: VH: = 0. 284; 12: VH:= 0.2?5; 13: VH:= 0.2GB; 14: VH:= 0.261; 15: VH:= 0.25'7.";· 1G :· VH := O. 250; 17: VH:= 0.245; 18: VH:= 0.239; 19: VH:= 0.235; 20,21,22,23,24: VH 0.231; 25,26,27,28,29: VH 0.203; 30,31,32,33,34: VH 0.167

END END;

BEGIN <* KOLHOGOROV *> CLEAR_HOHE; GO!OXY<7,20>; WRI!EC'WAIT A HOHENI'>; FOR H:= 1 TO A DO

FOR I:= 1 tO BCHJ DO ZCH,IJ:= C NCH,IJ- MCHJ> I DCHJ:

FOR H:= 1 tO A DO fOR I:= l TO BCHJ - 1 DO

BEGIN PI:= I+l: FOR J:= PI IO BCHJ DO

END;

IF ZCH,IJ > ZCH,JJ THEN BEGIN

!EHP:.= ZCH, IJ; ZCH,IJ:= ZCH,JJ; ZCH,Ji:= TEHP

END r·

~OR H:= 1 tO A DO FOR 1:• 1 !0 BCHl DO

YCH,lJ:= < EXP.< 1.6GS7 * ZCK,lJ >> ! ( 1 + EXP < 1.6657 * ZCH,IJ >>;

FOR H:• l tO A DO FOR t:a ~ tO BCHl DO

-127-

BEGIN REH:= SCHJ; AKCH,Il:= ( ~ I REH ) - YCH,Il: T(H~"lT::.-·yc:A-;-fl- ~-c-·c·r:i -r -,- :ctHj ··;-

END; FOR H:= 1 tO A DO

IF AKCH,lJ > AKCH,2J tHEN XCl,HJ:= AKCH~lJ ELSE

IF AKCH,2l > AKt:H,ll tHEN Xi:l,H1:= •';L:!:H,?"~; FOR H:• 1 TO A DO

FOR I:= 3 TO BCHJ DO IF AKCH,IJ > XCl,HJ tHEN XCl,HJ:= AK[H.!J:

FOR H:= 1 tO A DO IF LCH,ll > LCH,2l tHEN XC2,HJ:= LCH,!J

ELSE . · IF LCH,2l > LCH,lJ tHEN XC2,Hl:= ltH,2l;

FOR H:= 1 TO A DO FOR I:= 3 TO BCHl DO

IF LCH,IJ > Xt2,HJ tHf.N XC2,Hl:= LCH,!l: FOR H:= 1 tO A DO

IF XC1,Hl >= XC2,HJ tHEN UCHJ:= XCl,Hl ELSE IF Xtl,H~ < Xt2,Hl THEN UtHJ:• XC2,Hl;

CLEAR_HOHE; GOIOXY"< 3, 5 > ; WRITE<'HlGHESt D'>; FOR H:= l TO A-oo·

&EGIN . GOTOXY<l4,4+H); WRitELN<UCHJ:7:2>

END; GOTOXY< 7, 20 >; WRITE('PRESS ''ENtER''')• WAit; - , CLEAR_HOHE; FOR H:= l tO A DO

BEGIN IF BCHJ > 34 tHEN

VKCHJ:a 1.031 I BtHJ ELSE CORRECt_BH<&CHl,VKCHJ>; GOTOXYC0,4+H>; IF- UCHJ >= VKCHJ tHEN

END;

WRI!EC'tHE DISTRIBUtiON ',H,' IS HO! GAUSSIAN: P < 0.01', ELSE WRITE< 'THE DIS!RIBU'!ION I~"'' !S GriiJSSIAN')

GOTOXY<7,20>; WRITE<'PRESS ''ENTER'''>; WA !!' .

END; <A OPTIONK ==> KOLHOGOROV A>

-128-·

?ROCEDURE ANOVA_COHP; <* 22 JULY 1~86 *>

VAR <* OPTIONC *>

I,J:INTEGER; FA,Gt,N2,SC,T,T3,TODO:REAL; CT,SST,SSG,SSD,HSE,HSD,ES,TS,NO:~EAL; SA2,VEG,VIG,JO,INA,DX,SAUX:REAL;

BEGIN N2:= o; . GT:= 0; sc:= o; t3:• o; r:= o; TODD:• 0; CLEAR_HOME; FOR I:=l %0 A DO

BEGIN GT:• at + scu·; sc:= sc + KttJ; t3:• !3 + Ftl~; r:• T + we IJ

END; Ct!= GI * GI / T; ss.r:• sc - cr; SSG:= I3 - CI ; . ' SSD:= SST - SSG; HSE:• SSG I < A- 1 >; HSD:= SSD / < I - A >; FS:= HSE I HSD;

· TS:=·saar < :s >; FOR I:= 1 TO A DO

T·ODO:.• TODO + BCIJ; · IODO:• TODD - A;

GOTOXY<0,3>; WRIIELN<'IHE VALUE OF CALCULATED FS IS : ',FS:7:2>; GOtOX'H0,7>; WRITELN<'IF Ecalc. > F table5 2~R ',A-l,' A~r

!000:5:2,' D.f. THAT THERE'>; WRITELN<'IS AN ADDED COMPONENT OF VARIANCE'>: IF A•2 THEN

BEGIN GOtOXY<O, 13>; WRITE<'STUDENT t TEST VALUE ',TS:7:3>

END; GOTOXY<7,20>; WRitE<'PRESS ''ENTER'''>; WAIT; FOR I:• 1 TO A DO

N2:• N2 + < Wtll A Wtll >; NO:= ( 1 I < ~- 1 >> ~ t I-< N2 IT >>; CLEAR_HOHE; GOTOXY<0,3>; WRITE<'AVERAGE SIZE OF tHE SAHPLE: ',N0:7:3>: SA2:• ( KSE - HSD ) I NO; U SA2 < 0 THEN

BEGIN GOTOXY<O,l'5>; WRITE('THERE IS NOT AN ADDED COH~ONENT OF VARIANCE'>•

END; GOTOX'l'< 0, 1 > ;

-129.--

WRI!EC'APPROX. VALUE OF THE ADDED COHPONEN! ',SA2:7:3>: VEG:= SA2 I ( HSD + SA2 >; --vro: • I - -"QEG;------- -··-· -- ...... - .. . GOTOXY (13, 9 >; WRITEC'CORR. COEF. PETWEEN GROUPS ',VEG:?:3~;

GOTOXYC 13,11 >; WRITE<'CORR. COEF. INTRA GROUPS '~V!G:7:3,; GOTOXYC7,20>; WRITEC'PRESS ''ENTER'''>; WAIT; CLEAR_HOHE; GOTOXYC25,3>; WRitEC'ttEAN COMPARISON TEST'>; GOTOXYCO,S>; FOR I:• 1 tO A DO

WRITELN<'HBAN.SERIES ':22,I,' ';MCIJ:?:2.'SD ':24,0Cil:7:2>: GOTOXY<7,20>; . WRltE<'PRESS ''ENTER'''>; WAIT; CLEAR_HOHE; GOTOXY<O,O>; WRITELN<'INTRODUCE tHE ''F'' VALUE ~OR ',A-1.' AND '

t0DO:S:2,' !.d. AND THE'>; WRITEC'LEVEL OF SIGNIFICANCE SELECTED : '>: READ< F-A>; · GOTOXY<0,4>; WRitELN('tHE DIFFERENCE OF MEANS BETWEEN SERIES :'>: FOR I:• 1 TO A DO

FOR J:• ( I + 1 ) TO A DO BEGIN

SAUX:• SORT << A- l > *FA >: JO:• 1 I WCil + 1 I WCJJ~

INA:• SAUX ·*SORt C HSD * JO >: DX:• ABS < HCil - HCJl >; WRITECI:lO,' AND ',J>; IF INA <• DX THEN

Wf( IrELN ( I IS sIGN IF !CAN!, ) ELSE

END; WRITELN;

WRITELN<' IS NOT SIGNIFICANT')!

WRITEC'F~R THE SELECTEO ''P'''>; GOTOXY<7,20>; . WR!tE<'PRESS ''ENTER'''>; WAIT

END; <* OPTIONC ••> ANOVA *>

-130":"'

PROCEDURE LISt; (A 22 JULY 1986 A) (A OPTIONL A>

VAR I,J,K,L:INTEGER;

BEGIN POR I:= 1 ID A DO

BEGIN K:=O; L:=o; CLEAR __ HOME; GOtOXY<0,2>; WRITELN<'DATA 0£ SERlE ',I,' ~·>;

·PDR J:= 1 tO BCIJ DO

END

BEGIN . K:=K+l; GOtOXY<lGAK,4+L>; WRITE<J:3,' ':3,NCI,JJ:7:2); IP K = 3 THEN

END;

BEGlN K:=O; L:=L+l

END

GOTOXYC7,20>; WRITE<'PRESS ''ENTER'''>; WA.I'l .

END; <* OPTIONL ••> LIST A>

,...131-

PROCEDURE BARLETT; C* 24 JULY 1986 *> <* OPTIONB *>

VAR I: INTEGER; S2PP,FU,LS2,INVl,INV2,SPPL,CHI2,CHIA,BUF,COR:REAL;

BEGIN CLEAR_HOHE; GOTQXY<30,3>; WRitE<'BARLET!''S TEST'>; S2PP:=O; LS2:=0; INVl :=o·; INV2:=0; rOR I:= l TO A DO

BEGIN QCIJ:= DCIJ A DCIJ~ 52PP:= S2PP + <C QCIJ * < BCIJ - )) I C V -A >>

END; SPPL:= LN ( S2PP > I LN < ~0 >; FOR I:= 1 TO A DO

BEGIN FU:= LN < QCIJ > I LN < 10 >; LS2:= LS2 + << BC!l - l ) * FU

END; CHI2:= ((( V-A > * SPPL - LS2 > * 2.3026; FOR I:= 1 TO A DO

BEGIN INVl:= INVl + < 1 I < BCil- 1 >>: INV2:= INV2 + < BCIJ ;_ 1 >

END; BUF := INVl - ( 1 I INV2 >·; COR:= 1 + < 1 I ( 3 * < A- 1 ))) * BUf; CHIA:= £HI2 I COR; GO!OXY<O,G>; WRITE<'SQUARED CHI ADJUSTED : ',CHIA:5:2i; GOTOXY<O,S>; WRITEC'FOR ',A-1,' DEGREES OF FREEDOH'>: GOTOXY<O,lO>; WRITELN<'COHPARE WITH SQUARED CHI IN !ALES FOR 0.01;'': WRITELNC'!F CHI2 calc. > CHI2 tab •. !HE !HS~E ! E!ERQCEDAS!!C!!~. A~~· WRITELN<'YQU MUST PERFORM AN APPRO~. !E: ~? ;:~ L RI!Y B£!WEEN ~E~~~ ·~~ GOTOXY <7, 20 > ; WRITE<'PRESS ''ENTER'''>; WAIT

END; <* OPTIONB •=> BARLETT *>

-132-

-:.ROCEDURE MEAN; <* 22 JULY 1996 *> C A ·oPT IONK It>

AR I,NUl: INtEGER; GHE,OH,tCW,SSGP,JE,JOPE,FPR,NU2,WI,WY: REAL; G,E,C: IJ_ARRAY;

·EGIN .·.· wi:• o; WY:•·O; OH:• 0; JE:• o; . CLEAR_KOME; GO'tOXY <18, 2 > ; WRI'IE( 'APPROX.; 'tESt OF SIMILARitY BETWEEN MEANS'>: GOTOX't(l8,4>; WRilE('(for samples ~ith hetero~eneous variances>'>: FOR I:• 1 tO A DO

BEGIN QCIJ:• DtlJ It DCIJ; CtlJ:• BtiJ I QCIJ; ECIJ:• CtiJ It HtiJ

END; POi I:• 1 ~0 A DO

WI:.; WI + CCIJ; FOR I:• 1 tO A DO·

BEGIN GCIJ:a 1 - < CCIJ I WI >; WY:• WY + Etil

END; GME:• W't I WI; FOR I:• 1 tO A DO

OH:• OH + < HtiJ It ECIJ >; tCW:• ( WY * WY > I WI; SSGP:• OK - TCW; POR.I :• 1 tO A DO

JE:• JE + << GCil It GCIJ > I < ~CIJ -1 ~): JOPE:• 1 + (( 2 k C A- 2 ) I ( A It A - l )) * JE >: FPR:• C SSGP I < A~ l )) I JOPE; NUl:• A - 1; NU2:• (A* A- 1 > I < 3 * JE >; GOTOXYC0,'1>; WRITE< 'THE CALCULATED Fs VALUE FOR '.NUl.' ~N[I '.

NU2:6:2,' t1EGREES OF FREEDOM',' IS: ',E'PR:7:2>; GOTOXYCO,lO>; WRI'tELNC'IF F calc.> F tab. FOR 'tHIS d.f. AND !H£ SELECTED ''P''. !H£N WRitEC'SAHPLES &ELONG 'tO DIFFERENT POPULATIONS'); GOIOXYC1,20>; WRitEC'PRESS ''ENTER'''>; WAIT;

-~D; <*·OPtlONK ••> KEAN 6> .

-133-

<* OPTIONS G, F, U, X, W; SUBROUTINE ZEROS! A)

PROCEDURE ZEROSl; VAR

I:INIEGER; BEGIN

ZEROS;

<* 22-JULY 1986 *>

CLEAR_HOHE; GOTOXY<?,?>; WRIIE<'WAIT A HOHEN'I')

END;

PROCEDURE LOG; <* OPT~ONG l> VAR

I,J:INIEGER; BEGIN

ZEROS!; FOR I:= 1 IO A DO

FOR. J:= 1 IO BCIJ DO NCI,JJ:=· LN C NCI,Jl >;

CALCl END; <l OPIIONG ==> LOG *> PROCEDURE INV_LOG; <* OPTIONF *> VAR

I,J:INIEGER; BEGIN .

ZEROSl; FOR I:= 1 TO A DO

FOR J:= 1 IO BCIJ DO NCI,JJ:= EXP (.NCI,JJ >;

CALCl END; <A OPIIONF ==> INV_LOG *> PROCEDURE ROOI; <* OPIIONU l> VAR

I,J:INTEGER; BEGIN

ZEROS!; FOR I:= 1 TO A DO

FOR J:= 1 TO BCIJ DO NCI,JJ:= SORT ( NCI,JJ >:

CALCl SND; <* OPTIONU ==> ROOI *> PROCEDURE INV_ROOT; (l bPTIONX A> VAR

I,J:I!'liEGER; BEGIN

ZEROS!; FOR I:= 1 IO A DO

FOR J:= 1 TO BCIJ DOf NCI,JJ:= Nti,JJ w Ntt,JJ;

CALCl END; <w OPIIONX ==> INV~ROOI w>

PROCEDURE WELCH; <~ OPTIONW ~> VAR

1: IN'IEGER;

-134-

WIW,WIX,XIW,NU11,NU22: REAL; HlXl,HlX2,HIX3,MIX3l,HIX32,HIX33,HIX333,M!X34,MlX5: REAL:

B l!G IN . . . . . . . .. . - . -· . . . . . . . HIX333:• o; HIX3l.:• .. O; HIX32:•'.0; HIX33:•··0; MIX34 :• ·o;. WIW:• o; lUX:• 0; ttiXl:• o.; MIX3:• o; CLEAR_HOME; GOTOXY<22,5>; WRIIE<'WELCH''S NON PAR~MEIRIC !ESI'>; FOR I:• 1 TO A DO

BEGIN WIW:= WIW + BtiJ I DtiJ ~ DtiJ >>; WIX:= lUX+ tl[IJ ~ BtlJ /. < DtiJ *. I•t!J »>

END; XIW:• WIX I WIW; FOR I:= 1 ~0 A DO

HIX.l := HIX1 + << BtiJ I C DtiJ ~ DtiJ >> ~ t M[!J - XIW > 1r. < MtiJ - X!W>>;

MIX2:• HIXl I < A- 1 >; FOR 1:= 1 TO A DO

BEGIN MlX3l:= l- (( BtiJ / < DCIJ 1r. I•CIJ » I WIW >; HIX32:= HIX3l h HIX31; HIX33:= HIX32 1r. < l I ( Btll- 1 >>; HIX333:• MlX333 + HIX33

END; HIX34:• HIX333 * 2 1r. < A- 2 ) I < A* A - l >; HIX3:• H1X3• + l; HIXS:• HIX2 I HlX3; NUll:• A - l; NU22:• HIX333 ~ 3 I ( A~ A- l >; NU22:• l I NU22; GOTOXY<0,9>; WRI!EC'V2 VALUE: ',MIX3:?:2>; GO!OX"H 0, 12 > ; WRITELN<'Comp•~e the F value tor '.NUll:5:2

,' and ',NU22:5:2,' de9rees of fre&~oru • 'and desired ''P''.'>;

WRITE('!! V2 > F, then there is ~difference between the groyps'>: GOTOXYC7',20>; WRITE<'PRESS ''ENTER'''>; \.!Ali

~ND; <* OPTIONW ••> WELCH~*>

-135-

PROCEDURE REGRESSION; <*- 22 JULY 1986 *->

VAR <*- OPTION! k>

J,O:INIEGER; IX,IY,SXY,BUNO,BDOS,SCR,SCA,SCB,SCE,FRl,fR2.FR3,RDOS,P:REAL;

BEG·IN ·, i ...

SXY~•-· Q;. o :·-~o; P:• -~o; ·:-.:: CLEAR_HOME; GOTOXY<29,2>; WRITE( 1 REGRESSIOH ANALYSIS'>; IF C A <> 2 > OR ( BCll <> BC2J > THEN

BEGIN GO!OXY<O,S>; WRITELN('THIS ANALYSIS CAN ONLY BE PERfORMED WITH TWO DATA GROUPS'>: WRITE<'AND THE SA~E NUMBER OF DATA IN EACH ONE'>; GOTOXY<7,20>; • WRItE (,PRESS I I ENtER '!1 , ) ;

-~··WAIT

BND"' ELSE -

BEGIN , ·E'OR ·J:= 1 ·ro Bell DO

SXY!= SXY + < Ntl,JJ k Nt2,JJ >; BDOS:= < SXY- < StlJ k SC2J I BtlJ >l I

< KClJ- < SCll k SClJ I BClJ >>; BUNO:= MC2J - < BOOS k MtlJ >; SCR:= < BUNO A SC2J >: + < BDOS k SXY ) : SCA:= SCR- < SC2J *- SC2J > I SClJ; SCB:= SCR - ( SC2l k SC2J ) I Btl~: SCE:= Kt2J - SCR; FRl:= < BCll - 2 ) I 2 k SCR I SCE; FR2~= < BtlJ - 2 > k SCA I SCE; FR3!= ( Btll - 2 ) k SCB I SCE; RDOS:= SCB I < KC2l - < SC2l I BClJ >); GO!OXY(0y5>; WRITE ( I y = ' 'BUNO: 7:3' , + (I , 81)05: 7: 3, ' ) :-:' ) ; GOIOXY<0,7>; WRITE<'r =',SORT< RDOS >:7:3>: GOIOXY< 0, 10 >; · WRIIELN<'Fl = ',FR1:9:3>; IIIRITELN<'F2 = ',FR2:9:3>; WRITE<'F3 = ',FR3:9:3>; GOTOXY<O,l4>; WRITELN<'IF Fl > F tab. FOR 2, AND '.BtlJ - 2,

'd.!. AND THE DESIRED '>: WRI!ELNC'LEVEL OF SIGNIFICANCE, !HEN A AND B ARE SIMULTANEQU~~y '

'DIFFERENT FROM 0.'>; WRITELN('IF F2 OR F3 > F tab. FOP l AND '.B[lJ - 1,

I d.t. AND THE SELECTED LEVEL'); WRIIELNC'OF SIGN~FICANCE, THEN THE ORD!NA!E OR THE SLOPE ARE '

'DIFFERENT FROM 0'>; GOTOXY<7,20>; WRI!E('PRESS ''ENTER'''>; WAit; CLEAR,.;.HOME; GO'tO~'( < 7, 7);

·-136-

WRitE c ~ oo -rou .wANt ro INtERPOLATE '=' < '! tN > '>; If CORRECT ANSWER THEN .. BEGIN -

REPEAT . ~-Cl..!"Al()ttltiE ~· ..

GOTOX't< 7,10 >; WRIIE<'GIVEN Y PO YOU WANT X, OR VICEVERSA? < l/2 > '» GO'l'OX'l'<7,13>; If 0 • l THEN

BEGIN WRI'l'E( 1 lNT&ODUCE !~t Y VRlU£ •; READ<P>; IX:• f P - ~UNO > I ~DOS; GOTOXY<7,1G>; WRITE< 1 X # ·',IX:7:3!

END, ELSE i

BEG'IN ~R!IEC'INIRODUCE THE X VALUE '); READ<P>; IY:• B~NO + BOOS .;. P; GOtOXY~7,1G>; WRIT£<fY • ',IY:7:3>

END; GOTOX'{(7, 19>; WRIIEC'ANOIHER IN~ERPOLA!IO~ ~ < YIN > '>;

UNTIL <NOt CORREC'l'_ANSWER> END; (-Jt DE INtERPOLAR .;.)

CLEAR~HOKE; GOTOXY < 28, 5) ; . WRltE<'StAtiSIICAL DATA'>; GOTOXY<0,9>; WRIIELN(' '!26,'SUM X ',Stl1:1 3> WRITELNC' ':26,'SUH 'r = ',SC2~:1 3) WRIIELN< I I :26, 'SUM X2 I .·~(lJ: l 3) WRITELN<' ':2G,'SUH Y2 • '.KC2J:l 3) WRITELN<' ':26,'SUH XY ·~sxY:l! ): WRITELN<' ':2G,'N = ',B[lJ:? GOTOXY< 7, 20 > ; WRITE (I PRESS '·'ENTER I I I);

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