estudio del mecanismo de activación de la quinasa dependiente de … · 2018. 9. 28. ·...

dianas | Vol 6 Num 2 | septiembre 2017 | e20170901 - 1

Estudio del mecanismo de activación de la quinasa dependiente de adenosín monofosfato por capsaicina en células de hepatocarcinoma HepG2.

Elena Spínola Lassoa, Alicia Bort Bueno, Elena Pintos Sánchez, Belén Sánchez Gómez, Nieves Rodríguez-Henche, Inés Díaz-Laviada Marturet

Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. [email protected]

Palabras clave: carcinoma hepatocelular; fitoquímicos; capsaicina; TRPV1; calcio; AMPK

Resumen

Debido a la necesidad de encontrar tratamientos efectivos contra el hepatocarcinoma celular y dado el interés que han tomado hoy en día los compuestos naturales, nos centramos en el estudio de la capsaicina, fitoquímico responsable del sabor picante de los pimientos. La actividad antitumoral de la capsaicina ha sido descrita en distintos tipos de cáncer, entre ellos el de hígado. En este trabajo estudiamos el mecanismo de acción de la capsaicina sobre AMPK. Los resultados muestran que la capsaicina produce muerte celular a través de la activación de AMPK y que esta activación es dependiente de calcio/CaMKK e independiente de TRPV1. Además, se describe la posible implicación de ROS en el mecanismo de acción de la capsaicina.

Cita: Spínola Lasso, Elena; Bort Bueno, Alicia; Pintos Sánchez, Elena; Sánchez Gómez, Belén; Rodríguez-Henche, Nieves; Díaz-Laviada Marturet, Inés (2017) Estudio del mecanismo de activación de la quinasa dependiente de adenosín monofosfato por capsaicina en células de hepatocarcinoma HepG2. dianas 6 (2): e20170901. ISSN 1886-8746 journal.dianas.e20170901. URI http://hdl.handle.net/10017/15181

Copyright: © Spínola-Lasso E, Bort-Bueno A, Pintos-Sánchez E, Sánchez-Gómez B, Rodríguez-Henche N, Díaz-Laviada-Marturet I. Algunos derechos reservados. Este es un artículo open-access distribuido bajo los términos de una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

Introducción

El carcinoma hepatocelular o hepatocarcinoma (HCC) es el principal tipo de cáncer primario de hígado y

supone la tercera causa de muerte por cáncer, provocando 662.000 víctimas al año [1-3]. La infección por

el virus de la hepatitis B o C y las enfermedades crónicas hepáticas, especialmente la cirrosis, son

importantes factores de riesgo para sufrir la enfermedad y por tanto, la incidencia de HCC en estos

pacientes aumenta de forma considerable [3-4].

Este tipo de cáncer es asintomático en los primeros estadios, lo cual supone un problema para su

diagnóstico y en consecuencia para su tratamiento, ya que suele detectarse en fases avanzadas de la

enfermedad cuando las terapias son menos efectivos. Actualmente, la resección quirúrgica es la mejor

opción de tratamiento, sin embargo, solo es efectiva en etapas iniciales del cáncer. Por ello, es necesaria

la búsqueda de nuevos agentes químicos que puedan frenar el avance de la enfermedad en estadios más

avanzados. Los fitoquímicos, compuestos bioactivos presentes en las plantas, están teniendo un creciente

interés como antitumorales debido a su alta disponibilidad, bajo precio, y a su capacidad para ejercer

otros efectos beneficiosos[5].

Capsaicina

En este trabajo nos centramos en el estudio de un fitoquímico concreto, la capsaicina (CAP). La

capsaicina (trans-8-metil-N-vanilil-6-nonenamida) es un alcaloide lipofílico, responsable del sabor

picante de los pimientos. Forma parte del grupo de los capsinoides, que son los compuestos que se

encuentran de forma mayoritaria en los pimientos picantes, pertenecientes al género Capsicum. En cuanto

a su estructura química, podemos diferenciar tres regiones en la molécula: un anillo aromático, un grupo

amida y una cola hidrofóbica[6-8].

Se ha demostrado que la capsaicina interacciona con un canal catiónico no selectivo denominado TRPV1,

perteneciente a la superfamilia de los receptores TRP (transient receptor potencial). TRPV1 es una

proteína tetramérica integral de membrana cuyos extremos amino y carboxilo terminal están localizados

en la cara intracelular. La capsaicina es capaz de unirse al canal y estimular en minutos la entrada a la

célula de cationes, principalmente de calcio y sodio. Este aumento de cationes intracelulares produce la

despolarización de neuronas nociceptivas, produciendo la sensación del picante [9,10]. El aumento de la

http://www3.uah.es/dianas?s=e20170901

http://hdl.handle.net/10017/15181

http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

Activación de AMPK por capsaicina


concentración de calcio intracelular tiene un gran impacto sobre la viabilidad celular debido a la

importancia de este ion en las funciones celulares esenciales.

Numerosos estudios han demostrado que la capsaicina tiene efecto anticancerígeno por su capacidad para

inducir la apoptosis, producir parada del ciclo celular, por sus propiedades antiangiogénicas y por la

actividad antiinvasiva y antimigratoria que tiene dicho compuesto sobre las células tumorales[8].

Recientemente se ha demostrado que las células tumorales modifican su metabolismo como mecanismo

de supervivencia y adaptación al elevado ritmo de crecimiento. Algunos estudios demuestran que el

consumo de capsaicina está relacionado con un aumento de la tasa metabólica y una regulación del

apetito. Por ello, sería interesante estudiar el efecto de la capsaicina sobre el metabolismo de las células

tumorales.

AMPK

La quinasa dependiente de adenosín monofosfato (AMPK) es un regulador metabólico y sensor del estado

energético de la célula. Se trata de una serín-treonín quinasa, que tiene un papel fundamental en el

crecimiento, metabolismo y diferenciación celular. En mamíferos, AMPK es un heterotrímero formado

por una subunidad catalítica () y dos subunidades reguladoras ( y ). Existen distintas formas de

activación de esta quinasa; una de ellas es la fosforilación directa en T172 de la subunidad por LKB1,

(liver kinase B1), que es un supresor tumoral alterado en algunos tipos de cáncer. Además, puede

producirse una activación alostérica por unión de AMP a la subunidad , lo cual produce un cambio

conformacional que aumenta la actividad de AMPK. Esto se da en situaciones de estrés celular (durante el

ejercicio, en situaciones de deprivación de glucosa, en isquemia o por la exposición a fármacos) en los

que la relación AMP/ATP aumenta. Por otra parte, se ha visto que en algunos tipos celulares la activación

de AMPK se produce a través de la CaMKK (quinasa de la quinasa dependiente del complejo

calcio/calmodulina) en respuesta a un aumento de calcio intracelular, o por miembros de la familia

MAPKKK. Cuando AMPK se activa, promueve rutas catabólicas que generan ATP e inhibe vías

anabólicas que lo consumen. Por esta razón, AMPK es esencial en la homeostasis y regulación del

metabolismo celular. Su papel como regulador metabólico, la ha llevado a convertirse en una importante

diana terapéutica en cáncer y otras enfermedades [11-14].

Objetivo

El objetivo de este trabajo es estudiar el efecto de la capsaicina sobre AMPK en células de

hepatocarcinoma HepG2. Se estudiará el mecanismo molecular por el cual actúa la capsaicina además de

su efecto sobre la viabilidad celular.

Materiales y métodos

Se utilizó capsaicina, BAPTA, capsazepina (CPZ) y dorsomorfina dihidrocloruro de TOCRIS (Bristol,

UK); STO-609 y N-acetil cisteína (NAC) de Sigma (St. Louis, MO, USA);. Los anticuerpos primarios

utilizados fueron AMPK, p-AMPK, ACC y p-ACC de Cell Signaling Technology (MA, USA); TRPV1,

CaMKKα y CaMKKβ de Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) y β-tubulina de

Sigma (St. Louis, MO, USA). Los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa empleados fueron

IgG anti-rabbit (Cell Signaling Technology, MA, USA) e IgG anti-mouse (Sigma, St. Louis, MO, USA).

Además, se hizo uso de RNA de interferencia específico para CaMKKα (sense:

5’GAAUGAGCCCGUGGUGUUU; antisense: 5’AAACACCACGGGCUCAUUC), CaMKKβ (sense:

5’GCUCCUAUGGUGUCGUCAA; antisense: 5’UUGACGACACCAUAGGAGC) de Sigma (St. Louis,

MO, USA) y para TRPV1 (sense: 5’GCCGUUUCAUGUUUGUCUA ; antisense:

5’UAGACAAACAUGAAACGGC) de Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA), así

como los respectivos RNA de interferencia inespecíficos de cada casa comercial.

Cultivos celulares

Se utilizó la línea celular HepG2 procedente de un hepatocarcinoma humano obtenida de American Type

Culture Collection (ATCC Nº BH-8065, Rockville, MD, USA). Para el mantenimiento de las células se

empleó medio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) de Lonza Group Ldt (Basilea, Suiza),

suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) de Sigma (St. Louis, MO, USA) y un 1% de una

solución de diferentes antibióticos (penicilina G 100 UI/ml, sulfato de estreptomicina 100 g/ml y

anfotericina B 0,25 g/ml), de Sigma (St. Louis, MO, USA). Además, se empleó medio EMEM (Eagle’s

Minimum Essential Medium) suplementado con 1% de solución de antibióticos de Sigma (St. Louis, MO,

USA).



Transfección celular con RNA de interferencia (siRNA)

Las células se sembraron a una densidad de 30.000 células/cm2 en medio sin antibiótico. Para vehiculizar

los RNA de interferencia al interior de la célula se utilizó lipofectamina de Invitrogen (Paisley, UK),

utilizando Optimen (Gibco BRL, Escocia, Reino Unido) como medio de transfección.

Pruebas de viabilidad celular: MTT

Las células se sembraron a una densidad de 37.500 células/cm2. La viabilidad celular se midió con un

método colorimétrico basado en la reducción de MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-

difeniltetrazol, Sigma, St. Louis, MO, USA) a formazán, por acción de deshidrogenasas mitocondriales en

células vivas.

Obtención y cuantificación de proteínas

Para la extracción de proteínas, las células se lisaron en 300 μl de tampón de homogeneización (Tris-HCl

50 mM, pH= 7,4; tritón x100; Na3VO4 1 mM; β-glicerofosfato 10mM; NaF 5mM; leupeptina 2 μg/ml;

aprotinina 10 μg/ml; PMSF 0,1 mM). Posteriormente se incubaron 15 minutos y seguidamente se

centrifugaron a 16.060 x g, 10 minutos, a 4ºC. A continuación, se recogió el sobrenadante y se realizó una

cuantificación de las proteínas por el método Bradford [15]. Para ello se hizo uso de un reactivo

comercial de BioRad (Richmond, CA, USA) y de una curva estándar de BSA de Sigma (St. Louis, MO,

USA).

Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) e inmunodetección de proteínas

A las muestras con las proteínas problema, se les añadió SBL (Tris 0,06 M, pH= 6,8; SDS 2%; glicerol

10%; β-mercaptoetanol 5%; azul de bromofenol 0,001%) y se sometieron a desnaturalización por calor.

Se realizó una electroforesis de tipo vertical en gel de poliacrilamida-SDS aplicando 20 μg de proteína

por pocillo, en un sistema de BioRad (Richmond, CA, USA) durante 120 minutos, a temperatura

ambiente. Se utilizaron marcadores de bajo peso molecular de Lonza Group Ldt (Basilea, Suiza). Tras la

separación electroforética de las proteínas, se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno

(PVDF) de BioRad (Richmond, CA, USA) mediante la aplicación de un campo eléctrico a 100V durante

120 minutos, a 4ºC. Posteriormente se realizó la detección de proteínas. Para ello, se incubaron las

membranas con el anticuerpo primario, toda la noche a 4ºC y después se hizo una incubación de una hora

a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa. Tras esto, se realizaron

tres lavados de 10 minutos a temperatura ambiente con TBS-Tween al 0,1% y, finalmente se añadió ECL

(ácido p-cumárico 90 mM; luminol 250 mM; tris-HCl 1,5 M, pH 8,5) y peróxido de hidrógeno. La

detección de luz se hizo por exposición a películas fotográficas HyperfilmTM ECL de AGFA (México

D.F., México).

Medida de especies reactivas de oxígeno (ROS)

Las células se sembraron a una densidad de 31.000 células/cm2 en medio DMEM completo. Para medir

niveles de ROS las células, previamente tratadas con distintos compuestos, fueron incubadas con la sonda

2’,7’-diclorofluoresceína diacetato (λ= 504/524 nm) de Sigma (St. Louis, MO, USA) durante media hora

a 37ºC, 5% CO2. La medición de la fluorescencia emitida se realizó en un citómetro de flujo FASCalibur

(Becton Dickinson Labware, New Yersey, USA), en el canal FL1.

Análisis estadístico

El análisis de las bandas obtenidas en las placas fotográficas tras el Western Blot, se realizó por

densitometrado haciendo uso del programa Scion Image (Scion Corporation, Maryland, USA). El análisis

estadístico de los datos se realizó con el programa Office Excel. Los valores dados corresponden con la

media de los valores obtenidos ± desviación estándar. Para comparar valores entre los que solo varía un

parámetro se realizó la t de Student. Los valores entre los que varían dos o más parámetros se analizaron

aplicando ANOVA y el test de Tukey. El resultado se consideró significativo cuando p<0,05.

Resultados

Activación de AMPK por capsaicina en células de hepatocarcinoma

Para estudiar el efecto de la capsaicina sobre la viabilidad de HepG2, se incubaron las células con

concentraciones crecientes de dicho compuesto durante 24 horas y se observó que la capsaicina produce

muerte celular con un efecto dependiente de la dosis (Figura 1). Para determinar si AMPK interviene en

el mecanismo por el que se produce la muerte de estas células, se utilizó dorsomorfina dihidrocloruro que

es un inhibidor farmacológico de AMPK. En la Figura 1 observamos que la dorsomorfina es capaz de

revertir el efecto que produce la capsaicina sobre la viabilidad celular.



0

40

80

120

160

C CAP20μM CAP50μM CAP100μMCAP150μMCAP200μM

Viabilidad

celular(%

resp

ectoalc

ontrol)

Control

Dorsomorfina

*

*

*

*

*

###

Figura 1. Porcentaje de viabilidad de células de

hepatocarcinoma HepG2, respecto al control, tras

la incubación con dorsomorfina dihidrocloruro 5

M y concentraciones crecientes de capsaicina

durante 24 horas. * Diferencias significativas

respecto al control (p<0,05); #Diferencias

significativas respecto a células incubadas con

CAP (p<0,05).

Teniendo en cuenta estos resultados, se procedió a analizar el efecto que tiene la capsaicina sobre la

activación AMPK. Para ello, las células fueron incubadas durante una hora con dicho fitoquímico a una

concentración de 200 M. Posteriormente se analizaron los niveles de fosforilación de AMPK en el

residuo T172 y de uno de sus sustratos directos, ACC (Acetil-CoA carboxilasa). En la Figura 2 se

observa que la capsaicina aumenta de forma significativa los niveles de la forma fosforilada de AMPK.

Además, también se produce un aumento de fosforilación de ACC lo cual indica que el aumento de p-

AMPK producido por capsaicina corresponde a una activación de la quinasa.

0,00

1,00

2,00

3,00

Nivelesde

proteína(%re

spec

toal

control)

p-AMPK/AMPK

p-ACC/ACC

p-AMPK

p-ACC

AMPK

ACC

β-tubulina

[CAP]200μM +-

*

*

0,00

1,00

2,00

Niveles

deproteína(%res

pectoal

control)

p-LKB1/LKB1

p-LKB1

LKB1

β-tubulina

[CAP]200μM +-

Figura 2. Niveles de las formas totales y fosforiladas

de AMPK y ACC en células de hepatocarcinoma

HepG2 incubadas con capsaicina 200 M durante 1

hora. Los niveles de -tubulina se muestran como

control de carga. *Diferencias significativas respecto

al control (p<0,05). Los resultados son medias S.D.

de cuatro experimentos diferentes.

Figura 3. Niveles de las formas totales y fosforiladas de

LKB1 en células de hepatocarcinoma HepG2 incubadas

con capsaicina 200 M durante 1 hora. Los niveles de

-tubulina se muestran como control de carga.

*Diferencias significativas respecto al control (p<0,05).

Los resultados son medias S.D. de tres experimentos

diferentes.

Mecanismo de activación de AMPK por capsaicina: LKB1

La activación de AMPK puede producirse a través de distintas vías, por ello se procedió a analizar el

mecanismo por el que podría actuar la capsaicina. Tras la incubación de las células con CAP 200 M

durante una hora, se midieron los niveles de la forma total y fosforilada de LKB1. En la Figura 3 se

observa que los niveles de fosforilación no varían respecto al control, por lo que descartamos que la

capsaicina actúe a través de LKB1.



0,00

2,00

4,00

Nivelesdeproteína(%

resp

ectoal

control)

p-AMPK/AMPK

p-ACC/ACC

p-AMPK

p-ACC

AMPK

ACC

β-tubulina

*

*

*

**

[CAP]200μM + - +-[STO-609]40μM +-- +

#

Figura 4. Niveles de las formas totales y fosforiladas

de AMPK y ACC en células de hepatocarcinoma

HepG2 incubadas con STO-609 10 M y capsaicina

200 M durante 1 hora. Los niveles de -tubulina se

muestran como control de carga. *Diferencias

significativas respecto al control (p<0,05); #

Diferencias significativas respecto a las células

incubadas con CAP (p<0,05). Los resultados son

medias S.D. de tres experimentos diferentes.

Mecanismo de activación de AMPK por capsaicina: CaMKK

Pasamos a estudiar la posible implicación de CaMKK en la activación de AMPK promovida por CAP.

Para ello incubamos las células una hora con STO-609 10 M, un inhibidor farmacológico de las formas

y de CaMKK. STO-609 revierte el aumento de p-AMPK producido por CAP. En el caso de p-ACC

se producen cambios en el mismo sentido aunque no llegan a ser significativos (Figura 4). Estos datos

indican que la CaMKK está implicada en el mecanismo por el que CAP activa AMPK. Hay que tener en

cuenta que este compuesto también disminuye los niveles de p-AMPK y p-ACC respecto a la situación

control, por lo que es posible que en estas células CaMKK esté activando a AMPK de forma basal.

Para corroborar estos resultados, procedimos a silenciar la expresión de CaMKK y de CaMKK

mediante transfección con siRNA selectivo para estas proteínas. La Figura 5A muestra que al silenciar

CaMKK no se modifica la fosforilación de AMPK inducida por CAP. Lo mismo ocurre con p-ACC

cuyos niveles de fosforilación no se ven modificados al silenciar CaMKK. Hay que tener en cuenta que

el silenciamiento de CaMKK es tan solo de un 28% y por tanto para confirmar estos resultados sería

necesario realizar una transfección del siRNA más efectiva. Por otro lado, en la Figura 5B se aprecia que

las células con CaMKK silenciada y tratadas con CAP tienen niveles de p-AMPK menores que las

células no silenciadas (siCtrl) tratadas con CAP. Esto apoya la hipótesis de que CAP activa AMPK a

través de CaMKK en células HepG2.

Papel del calcio y del receptor TRPV1 en el mecanismo de acción de la capsaicina

Como se ha comentado anteriormente, TRPV1 es un canal que actúa como receptor de la capsaicina

produciendo la entrada en la célula de cationes, principalmente de Ca2+ que está implicado en la

activación de la CaMKK. Para determinar si el calcio y TRPV1 están implicados en el proceso de

activación de AMPK promovido por CAP, las células fueron pretratadas durante media hora con BAPTA

40 M, un quelante de calcio intracelular, y con capsazepina (CPZ) 20 M, un antagonista competitivo de

TRPV1. Posteriormente, las células se incubaron con CAP 200 M durante una hora. En la Figura 6A se

aprecia que BAPTA revierte la acción de la capsaicina sobre la fosforilación de AMPK. En el caso de p-

ACC se producen cambios en el mismo sentido aunque no son significativos. BAPTA también produce

un descenso en los niveles de p-AMPK respecto al control, por lo que de nuevo pensamos en una posible

activación basal de AMPK en la que estaría implicada el calcio. Posteriormente se utilizó el antagonista

de TRPV1, capsazepina (CPZ). En la Figura 6B se observa que aunque CPZ parece revertir el aumento

de p-AMPK producido por CAP, los cambios producidos en los niveles de la proteína no son

significativos. Además, CPZ no modifica de manera significativa la fosforilación de ACC.



0,00

1,00

2,00

Niveles

deproteína(%res

pectoal

control)

p-AMPK/AMPK

p-ACC/ACC

0,00

1,00

2,00Nivelesde

pro

teína(%resp

ectoa

l

control)S iCaMK K β

0,00

2,00

4,00

Nivelesde

proteína(%

resp

ectoal

control)

p-AMPK/AMPK

p-ACC/ACC

0,00

1,00

2,00

Nivelesdepr

ote

ína

(%re

spec

toa

l

cont

rol)

CaMK K α

p-AMPK

p-ACC

AMPK

ACC

SiCtrl SiCaMKKβ

β-tubulina

CaMKKβ

[CAP]200μM + - +-

*

*

*

**

p-AMPK

p-ACC

CaMKKα

AMPK

ACC

SiCtrl SiCaMKKα

β-tubulina

[CAP]200μM + - +-

*

* *

A B

Figura 5. Niveles de las formas y de CaMKK y de las formas totales y fosforiladas de AMPK y ACC en células

de hepatocarcinoma HepG2 incubadas con capsaicina 200 M durante 1 hora. La expresión de CaMKK y fue

previamente silenciada mediante transfección de siRNA. Los niveles de -tubulina se muestran como control de

carga. * Diferencias significativas respecto al control (p<0,05); #Diferencias significativas respecto a las células

incubadas con CAP (p<0,05). Los resultados son medias S.D. de tres experimentos diferentes.

Para confirmar los resultados obtenidos por western blot sobre la implicación de TRPV1 en el mecanismo

de acción de CAP, procedimos a realizar el silenciamiento de TRPV1 mediante transfección con siRNA.

En la Figura 7 se observa que la capsaicina aumenta los niveles de las formas fosforiladas de AMPK y

ACC tanto en las células control como en aquellas en las que TRPV1 está silenciado. Esto parece indicar

que la capsaicina activa AMPK de forma independiente a TRPV1. Sin embargo, estos resultados son

preliminares ya que obedecen a un único experimento.

La Figura 8 representa el efecto del silenciamiento de TRPV1 sobre la viabilidad celular. En las células

silenciadas se produce una disminución de la viabilidad celular significativa respecto a la situación

control tanto en presencia como en ausencia de CAP. Esto podría atribuirse a las propias condiciones del

experimento, que son agresivas. Otra posibilidad es que en células de hepatocarcinoma HepG2, TRPV1

sea una proteína esencial para la supervivencia. Es necesario seguir estudiándolo para llegar a una

conclusión.

Mecanismo de activación de AMPK por capsaicina: aumento de ROS

Para continuar con el estudio del mecanismo de activación de AMPK inducido por la capsaicina en

células HepG2, analizamos la posibilidad de que CAP promoviera un aumento de AMP y de esta manera,

la activación alostérica de la quinasa. Como se ha comentado con anterioridad, el estrés celular aumenta

la relación AMP/ATP, lo que puede inducir la activación de AMPK. El estrés oxidativo es una forma de

estrés celular inducida por un aumento en los radicales libres de oxígeno. Para comprobar si CAP induce

estrés oxidativo en las células HepG2, se incubaron con la sonda DCFDA que mide la concentración

intracelular de especies reactivas de oxígeno, ROS. En la Figura 9 vemos que la capsaicina aumenta de



forma muy notable el porcentaje de ROS. Este aumento es contrarrestado cuando se añade NAC, un

antioxidante, o cuando se añade el quelante de calcio BAPTA. Estos resultados indican que la capsaicina

induce de manera notable la formación de especies reactivas de oxígeno en HepG2, que por estrés

oxidativo podría aumentar la relación AMP/ATP produciendo la activación de AMPK; y que el calcio

está implicado en este proceso.

Figura 6. Niveles de las formas totales y fosforiladas de AMPK y ACC en células de hepatocarcinoma HepG2

incubadas con BAPTA 40 M (A), CPZ 20 M (B) y capsaicina 200 M, 1 hora. Los niveles de -tubulina se

muestran como control de carga. * Diferencias significativas respecto al control (p<0,05); #Diferencias significativas

respecto a las células incubadas con CAP (p<0,05). Los resultados son medias S.D. de tres experimentos diferentes.

0,00

2,00

4,00

6,00

Niveles

deproteína(%

resp

ectoal

control)

p-ACC

p-AMPK

0,00

1,00

2,00

Nivelesde

proteína(%

res

pectoal

control)

TRPV1

AMPK

ACC

TRPV1

p-AMPK

p-ACC

SiCtrl SiTRPV1

[CAP]200μM + - +-

β-tubulina

[CAP]200μM + - +-

SiCtrl SiTRPV1

Figura 7. Niveles de TRPV1 y de las formas totales y fosforiladas de AMPK y ACC en células de hepatocarcinoma

HepG2 incubadas con capsaicina 200 M, 1 hora. La expresión se las TRPV1 fue previamente silenciada mediante

transfección con siRNA. Los niveles de -tubulina se muestran como control de carga. *Diferencias significativas

respecto al control (p<0,05); #Diferencias significativas respecto a las células incubadas con CAP (p<0,05). Los

resultados son medias de un experimento.



0

20

40

60

80

100

120

C CAP100μM

Viabilidad

celular(%

res

pectoalco

ntrol)

S iCtrl

SiTRPV1

#*

*

*

0

250

500

750

1000

C CAP200μM

%FluorescenciaDCFDA

Control

NAC

BAPTA

Figura 8. Porcentaje de viabilidad de células de

hepatocarcinoma HepG2, respecto al control, tras la

incubación con capsaicina 100 M durante 24 horas.

La expresión de TRPV1 fue previamente silenciada

mediante transfección con siRNA. *Diferencias

significativas respecto al control (p<0,05);

#Diferencias significativas respecto a las células

incubadas con CAP (p<0,05). Los resultados son

medias S.D. de dos experimentos diferentes.

Figura 9. Porcentaje de fluorescencia de la sonda

DCFDA (indicativa de niveles de ROS) de células de

hepatocarcinoma HepG2, tras la incubación con NAC

10 M, BAPTA 20 M y CAP 200 M durante 1 hora.

Los resultados son medias S.D. de dos experimentos

diferentes.

Discusión

En este trabajo nos centramos en el estudio del efecto antiproliferativo del compuesto natural capsaicina

en células de carcinoma hepatocelular. Se ha analizado la activación de AMPK y el mecanismo

implicado. Los experimentos realizados en nuestro laboratorio demuestran que la capsaicina produce la

muerte de células HepG2 de manera dosis dependiente, y que aumenta de forma clara la fosforilación de

AMPK. El aumento de la forma fosforilada de AMPK está relacionado con una activación de dicha

proteína, ya que los niveles de p-ACC también aumentan por efecto de CAP.

Se ha determinado que AMPK puede intervenir en procesos que contribuyen a la patogénesis del cáncer y

actuar como supresor de tumores. Así, niveles bajos de p-AMPK se asocian a malos pronósticos de la

enfermedad [13].

Está descrito que en en situaciones de baja energía, AMPK actúa sobre el metabolismo de las células

inhibiendo el crecimiento y proliferación de las mismas [12]. En los resultados de este trabajo, la

inhibición que produce la dorsomorfina indica que la activación de AMPK está implicada en el efecto

antiproliferativo de CAP. Se ha visto que otros compuestos naturales también inhiben la proliferación

celular en HCC por activación de AMPK [16]. El mecanismo por el cual AMPK produce inhibición del

crecimiento no está del todo claro pero una posibilidad es que AMPK active el proceso de autofagia a

través de la inhibición de mTOR. Por ejemplo en células HepG2 tratadas con cannabinoides, se produce

autofagia y muerte celular a través de la activación de AMPK [17].

A pesar de que LKB1 es la principal responsable de la fosforilación de AMPK, nuestros resultados

muestran que en células de hepatocarcinoma LKB1 no media la activación de AMPK producida por

caspsaicina. Por otra parte, los datos obtenidos al usar inhibidores o siRNA específicos para las dos

formas de la CaMKK y el quelante de calcio, parecen indicar que en la línea celular empleada,

Ca2+/CaMKK interviene en el proceso de activación de AMPK promovido por CAP. Aunque en otros

tipos de cáncer se ha determinado que AMPK puede ser activadada por CaMKK, es la primera vez que

se describe esto en células de HCC.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos al eliminar la función de TRPV1 en células HepG2 ya sea

por antagonismo o por silenciamiento de su expresión, pensamos que (a tiempos cortos) la capsaicina

activa AMPK en este tipo celular de forma independiente a TRPV1.

Por último, los resultados obtenidos al medir especies reactivas de oxígeno por citometría de flujo

muestran que la capsaicina aumenta de forma notable los niveles de ROS en células HepG2. Las especies

reactivas de oxígeno se han relacionado durante mucho tiempo con cáncer, considerándose que el

aumento de sus niveles pueden resultar oncogénicos por producir daño en el DNA, proteínas y lípidos y

por promover la inestabilidad genómica y la tumorogénesis. Sin embargo, hay que tener en cuenta que los

ROS también pueden promover señalización anticancerígena, induciendo muerte de células tumorales por

estrés oxidativo [18]. Nos planteamos la posibilidad de que el aumento de ROS inducido por CAP

aumente la relación AMP/ATP, produciendo así la activación alostérica de AMPK. Por ello se pretende

continuar el estudio determinando los niveles intracelulares de AMP para confirmar esta hipótesis.



En resumen, la capsaicina produce disminución de la viabilidad de células de hepatocarcinoma HepG2 a

través de la activación de AMPK. Dicha activación es promovida por calcio y por la CaMKK pero es

independiente de TRPV1. Además, es posible que CAP produzca estrés oxidativo que aumente la relación

AMP/ATP produciendo la activación alostérica de la quinasa.

De acuerdo con estas conclusiones, actualmente se está llevando a cabo un estudio “in vivo” para

determinar el efecto antitumoral de CAP y estudiar la activación de AMPK en tumores xenógrafos

inducidos en ratones atímicos. Para ello ha sido necesario realizar el correspondiente curso de formación

para obtener la capacitación de experimentación animal, que se ha hecho durante el desarrollo de este

trabajo de fin de máster.

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