validació de la pepck-c hepàtica com a diana en la teràpia...

Programa de Doctorat de BIOMEDICINA Bienni 2000-2002

Validació de la PEPCK-C hepàtica com a diana en la teràpia de la diabetis

Aquesta tesi ha estat realitzada sota la direcció del Dr. José Carlos Perales Losa a la Unitat de Biofísica del

Departament de Ciències Fisiològiques II de la Universitat de Barcelona

Alícia García Gómez-Valadés José Carlos Perales Losa

Memòria presesentada per Alícia García Gómez-Valadés per a optar a grau de Doctora per la Universitat de Barcelona

L’Hospitalet de Llobregat, maig de 2008

No tenía miedo a las dificultades. Lo que le asustaba era la obligación

de tener que escoger un camino.

Escoger un camino significaba abandonar otros.

El Alquimista Paulo Coelho

There’s no place like home.

The wizard of Oz L. Frank Baum

Gràcies.... Durant aquest temps que he dedicat a la tesi (i no ha estat poc) no només he après coses relacionades amb ciència, sinó que, per a mi el més important, he crescut molt com a persona. I tot gràcies a una pila de persones del més variat i plenes de matisos amb les que he tingut la sort de conviure durant aquests anys a la particular “Casa de la pradera” que és “Wellbeach” on, fins i tot en els seus capítols més “gore” ha resultat molt fàcil sentir-se com a casa i fer-me meves les coses. Per això m’agradaria enviar el més sincer agraïment a totes aquelles persones amb qui he conviscut aquests anys. Vull dir-vos GRÀCIES a tots, per aconseguir que en senti estimada, perquè aquest és el motor que ens mou a tots, no?... Voldria destacar a algunes persones i personetes que, d’una manera o altra, han estat especialment importants per a mi i per a la arribada a bon port d’aquest meu projecte de tesi. And the winner is...: El meu més sincer agraïment per al José Carlos. Per la teva infinita paciència, per demostrar-me per activa i per passiva la teva confiança en mi (més que jo mateixa, moltes vegades), per ensenyar-me cada dia una pila de coses: no només a fer ciència de la bona, sinó a ser persona. Gràcies pels teus consells sincers, per ser una font inesgotable de coneixement, per contagiar-me el teu entusiasme per la ciència, per donar-me llibertat en tot moment, per donar-me ales. Treballar colze a colze amb tu ha estat genial. Gràcies per ser el millor “jefe”. Ja ho diuen: “al costat de tot gran home, hi ha una gran dona”, oi Maria?. Gràcies a tu també, per tot l’ajut que em vas oferir durant el temps que vam estar juntes al lab., per la teva dolçor i serenitat. Si estiro del fil dels temps cap a enrere, la primera persona que va confiar en mi per a posar els peus dins del seu laboratori va ser la Dra. Anna Mª Gómez-Foix. Gràcies Anna, a tu i a tots els Adenos per acollir-me com una més. Josepi, per ensenyar-me els misteris de “Güetenbló” i per acollir-me a Boston. Carles, per aquelles tardes a la campana de virus i per la optimitzada ruta “memorials”. Laia i Sandra, pels moments divertits i els concerts compartits. Vull agrair al Dr. Ramón Bartrons que confiés en mi i em fes un forat en el seu laboratori. Gràcies Ramon pels consells i lliçons, per ensenyar-me a llegir entre línies. També als meus companys i amics de Departament:

Primer de tot, els “Peralets”: Anna, gràcies perquè treballar amb tu ha estat un plaer, no hi ha una companya millor. Gràcies per estar sempre quan et necessitava. Al Francesc X. Blasco, per ensenyar-me tantes i tantes coses, sort de tu amb els problemes informàtics. A la “colombiana mala”, que no lo es tanto; por esos ratitos de cháchara y por darme un empujoncito cuando lo necesité. También a las nuevas incorporaciones: Andy, gracias por echarme una mano en la reta final y contagiarme con tu entusiasmo renovado. Jana good luck in your spanish venture. També als companys-veïns “Biofísics”: Jordi Bermúdez i Teresa, Roser Jordi Boada i Edu Cuesta. Gràcies per la plàcida convivència. Als “Bartronets”: Tot i que va arribar el moment d’emigrar, sempre m’hi he sentit com a casa a Can Bartrons. Joanet, la nostra cadernera, el nostre poeta, la nostra vedette..., no canviïs mai. Marta, por esas cervecitas y tapitas a la que nos ayudaban a las dos para desahogar las penas. Mercè, gràcies per la bona ona que em transmets, per la teva sinceritat, espero no perdre mai la teva amistat. Gracias también a ti, Esther, porque has estado cuando te he necesitado, dentro y fuera del lab. Per suposat, a l’Àurea, el meu clon “number one” (posteriorment la colònia s’ha anat propagant, però això és una altra història). A tu t’he d’agrair una pila de coses, des dels teus ajuts als inicis de la meva tesi amb els clonatges a les vuit de la tarde, passant per aquelles memòries que em tocava fer sense tenir ni idea de per on començar, i fins a donar-me l’oportunitat de fer de clon-clon, sense ni un polimorfisme. També a l’Ana Manzano, per adoptar-me els meus primers dies a Wellbeach i posar-me les piles. A la Nieves, simplemente, por ser así de auténtica. También a los recién llegados: Miguel i Laura; ánimos!! Als “Venturinis”: Allí, al fondo a la izquierda hay un reducto de buen rollo donde siempre me he sentido como en casa, donde siempre he encontrado un alma caritativa que quiera ir a la “Pisu” a comer o abrir las orejas “de bat a bat” para escuchar mis dilemas vitales “volando voy, volando vengo…”. Pues eso, als meus coleguis venturinis, des el propi Francesc Ventura, passant pel meu “carinyet” Francesc Vinyals i la resta de “deixebles”. Ay! Que me lío de idioma, es que estaba pensando en mi Antonio. También a Bea, Cris Lacasa (per fer–me un foradet al “office” de l’IRO), a l’Arnau i al Pol. Molt especialment a les meves nenes: Cris Gamell, Roser i MªJosé, por todo lo compartido y por compartir fuera del lab. Per ser tal i com sou. Als “Gilians” Aquests estan al fons a la dreta, amb ells m’hi sento com a casa. A tots, Dani, Llorenç, Antonio, Mercè, Anna Mª, Diana, Camila. Gràcies, en lo científic, pel vostre “préstec” immunològic (em refereixo als mils de vegades que m’heu passat anticossos), i en lo personal, per ser tant macos. Als que ja no hi són: Montse i

Clara; i als nous: Alba, gràcies per aquella fondue de xocolata!!! Com no, al patró: Joan, per tenir r un grup tant maco. Pero sobretodo a ti, Antonio, gracias por todo, menos por los anticuerpos ;-). Por los cines y cervezas, las lecciones de escalada y no sé cuantas cosas más. També als Fisiòlegs i Biòlegs Moleculars: Jordi Llorens, Pere, José Luis, Ouadah, Edu, Fabiola.... A l’Esther i el Benja, per la vostra inestimable ajuda amb els “chismes” dels SCT. Al meus nous companys de Palau Pharma. Especialment a la secció “familia Telerín” Cristina (la mami), Jordi (el tete) i Maria (la nena), i al “patriarca”, Luís. Per la vostra paciència i ànims en el tram final. Como no, a mis “coleguis”, científicos o no. A mi niña Rakel, gracias por esas interminables charlas psicoterapéuticas. To my friends beyond the ocean: Richard, Parvin, Kaushik, Alexandra, and the Steiner House family. Gracias a Cris, Olga y Judit, por prohibirme hablar de ciencia fuera del laboratorio. A los “Corretja”: Greta, Jose, Abril y Nina, por los buenos ratos pasados, el buen rollo, las canciones matutinas de la “familia Trapp”. Al Jaume Atomb, per aquell cap de setmana a La Fosca que mai oblidaré. A Ramón y Eli, por todo lo compartido y por escucharme hasta la saciedad mis líos mentales. También a Mamen (alias huevo Kinder) y Víctor, el Ferran Adrià del Baix Llobregat. A “les nenes”, per aquelles tardes/nits que hem passat i pasarem. També a tots els col·leguis de la saleta del cafè. Per res del món em deixaria de portar tàper, només per dinar amb vosaltres, riure i parlar de “parxes”, “anillos”... Uf, si les parets parlessin.... Gracias a Dsignum, por la parte gráfica de este manuscrito. El apoyo de mi familia ha sido fundamental en todo momento. No hay palabras que expresen mi agradecimiento. A mis padres, porque soys los pilares de mi existencia. Gracias por vuestro apoyo incondicional en todos los proyectos de mi vida, porque siempre habéis estado ahí, porque siempre estaréis. Nada habría sido posible sin vosotros. También a mis hermanos, Ana, Esteban y Jesús. Gracias, tete, por intentar entender los misterios del genoma, no te preocupes, yo tampoco los entiendo. Casi me olvido! A mis sobrinos Rubén, Sofía y Jesús, por hacerme viajar en el tiempo a mi infancia. Finalmente, gracias a la persona que ha vivido más de cera el “lado oscuro” de esta tesis. Gracias, Edu por mimarme y cuidarme, por capear el temporal hasta llegar a buen puerto, por tu paciencia en mis momentos de crispación, por compartir conmigo los subidones cuando obtenía un buen resultado y animarme en los momentos de bajón. Prueba superada.

ABREVIATURES

AAT Alanina aminotransferasa AcAc Acetoacetat ACC Acetil-CoA carboxilasa Ad5 Adenovirus del serotip 5 ADP Adenosina 5’-difosfat AGL Àcids grassos lliures

��-KG Alfa-cetoglutarat

AMP Adenosina 5’-monofosfat AMPK Proteïna quinasa activada per AMP ATP Adenosina 5’-trifosfat

�-HBA Àcid beta-hidroxibutirat

cAMP AMP cíclic C/EBP CAAT enhancer binding proteinChREBP Carbohydrate response element binding proteinCoA Coenzim A COX Citocrom c oxidasa CPT-1 Carnitina palmitoil transferasa-1 CREBP cAMP response element binding protein DAG Diacilcligerol DTE 1,4-Ditioeritriol FAS Sintasa d’àcids grassos FBP Fructosa-1,6-bisfosfatasa FCCP Carbonil cianida p-trifluorometoxifenil-hidrazona) FOXA2 Forkhead box A2 FOXO1 Forkhead box O1 GAPDH Gliceraldehid-3-fosfat deshidrogenasa GC Glucocorticoids GDP Guanosina 5’-difosfat GFP Green fluorescent proteinGK Glucoquinasa Gli-K Glicerol quinasa

Glut Transportador de glucosa GNG Gluconeogènesi GPT Glutamat-piruvat transaminasa G6Pasa Glucosa-6-fosfatasa GSK3 Glicogen sintasa quinasa 3 GTP Guanosina 5’-triosfat HDL High density lipoprotein HK Hexoquinasa

HNF4-�� Hepatic nuclear factor 4-�

HPLC Cromatografía líquida d’alta resolució IDDM Insulin dependent diabetes mellitus (diabetis tipus I) IFN Interferó IGF1 Insulin-like growth factor 1 IPGPT Test intraperitonial de producció de glucosa IPGTT Test intraperitonial de tolerància a la glucosa IPITT Test intraperitonial de tolerància a la insulina IRS Insulin receptor substrateLDH Lactat deshidrogenasa LDL Low density lipoprotein L-PK Piruvat quinasa hepàtica MDH Malat deshidrogenasa miRNA Micro RNA 3-MPA Àcid 3-mercaptopicolínic NAD+ Nicotin adenin dinucleòtid, estat oxidat NADH Nicotin adenin dinucleòtid, estat reduït NIDDM Non-insulin dependent diabetes mellitus (diabites tipus II) OAA Oxalacetat PC Piruvat carboxilasa PDH Piruvat deshidrogenasa PEP Fosfoenolpiruvat PEPCK- C Fosfoenolpiruvat carboxiquinasa citosòlica PEPCK- M Fosfoenolpiruvat carboxiquinasa mitocondrial PFK1 Fosfofructoquinasa-1

PFK2 Fosfofructoquinasa-2

PGC-1�� PPAR gamma coactivator 1 alpha

PHG Producció hepàtica de glucosa PI3K Fosfatidilinositol 3 quinasa PK Piruvat quinasa PKA Proteïna quinasa A PKC Proteïna quinasa C PKR Proteïna quinasa R PPAR Peroxisome proliferator activated receptorRCR Relació de control de la respiració RCRP Relació de control de la fosforilació respiratòria RISC RNA induced silencng complexRNAi RNA d’interferència ROS Espècies reactives d’oxigenSDC1 Estearoill-CoA desaturasa 1 siRNA Small interferference RNA SREBP-1c Sterol regulatoryelement binding protein 1c STZ Estreptozotocina TAB Teixit adipós blanc TAG Triacilglicèrids TZD Tiazolidinediones Poly(dI:dC) Poli(deoxiinosina:deoxicitosina) UCR Relació de control desacoblat VDAC Voltage dependent anion channel VLDL Very low density lipoprotein

ÍNDEX DE CONTINGUTS

INTRODUCCIÓ DIABETIS MELLITUS

Etiopatogènesi i patofisiologia de la diabetis tipus I................................................................ - 3 - Etiopatogènesi i patofisiologia de la diabetis tipus II............................................................... - 4 - Mecanismes cel·lulars d’inducció de resistència a insulina per lípids................................... - 10 - Malonil-CoA i AMPK, un duet regulador del metabolisme energètic: implicacions en la resistència a insulina............................................................................................................. - 13 - Dianes terapèutiques i fàrmacs antidiabètics........................................................................ - 15 -

REGULACIÓ DE L’HOMEÒSTASI ENERGÈTICA AL FETGE

Acció de la insulina sobre el fetge per al manteniment de l’homeòstasi de la glucosa......... - 19 - Gluconeogènesi hepàtica ..................................................................................................... - 22 - Zonació metabòlica del fetge ................................................................................................ - 25 - Fosfoenolpiruvat carboxiquinasa (PEPCK)........................................................................... - 27 -

TRANSFERÈNCIA GÈNICA COM A EINA TERAPÈUTICA

Sistemes de transferència gènica......................................................................................... - 38 - Productes de teràpia gènica al mercat.................................................................................. - 41 - Aproximacions de teràpia gènica per la diabetis................................................................... - 41 -

RNA D’INTERFERÈNCIA

Mecanisme d’acció del RNA d’interferència: del dsRNA al siRNA ....................................... - 47 - RNAi en mamífers: funcions biològiques i aplicació: siRNA i miRNA ................................... - 48 - Molècules efectores de RNAi en mamífers: siRNA vs shRNA.............................................. - 51 - Disseny de seqüències efectores de siRNA ......................................................................... - 53 - Efectes deleteris que poden associar-se a l’ús de RNAi en mamífers ................................. - 55 - RNAi in vivo .......................................................................................................................... - 57 - Aplicacions terapèutiques basades en RNA d’interferència ................................................. - 60 -

OBJECTIUS................................................................................................................................. - 63 -

RESULTATS CAPÍTOL 1: Disseny de seqüències de shrna i estudi de l’efecte sobre l’homeòstasi de la glucosa de la silenciació de PEPCK-C al fetge de ratolins diabètics en absència d’insulinaINTRODUCCIÓ................................................................................................................................- 71 - RESULTATS ...................................................................................................................................- 72 -

Disseny i generació de vectors d’expressió de shRNA dirigits contra PEPCK-C ................. - 72 - Silenciament de la PEPCK-C mitjançant shRNA in vitro ...................................................... - 74 -

Avaluació de la funcionalitat dels vectors pSHAGs in vivo transduïts mitjançant la tècnica de transferència gènica hidrodinàmica ...................................................................................... - 75 - Silenciament específic de PEPCK-C endògena en animals sans ........................................ - 81 - Silenciament de PEPCK en el fetge de ratolins diabètics..................................................... - 84 -

DISCUSSIÓ .................................................................................................................................... - 95 - CAPÍTOL 2: Validació de PEPCK-C com a diana terapèutica: estudi de l’impacte metabòlic de la silenciació de PEPCK-C hepàtica en el context de la diabetis tipus IIINTRODUCCIÓ............................................................................................................................. - 101 - RESULTATS .................................................................................................................................- 102 -

Silenciació gènica de PEPCK-C al fetge de ratolins diabètics db/db mediada per un vector adenoviral codificant per un shRNA específic..................................................................... - 102 - La transducció del fetge amb vectors adenovirals de shRNA no comporta toxicitat associada al vehicle ni a les seqüències de shRNA................................................................................ - 103 - La reducció del contingut de PEPCK-C hepàtica millora l’homeòstasi de la glucosa. ........ - 108 - Regulació coordinada de la gluconeogènesi hepàtica........................................................ - 111 - La reducció del contingut de PEPCK-C hepàtica millora la sensibilitat perifèrica a la glucosa i a la insulina ............................................................................................................................ - 113 - Conseqüències de la silenciació hepàtica de PEPCK-C sobre el metabolisme lipídic ....... - 118 - Dissociació entre lipidosi hepatica i resistència a insulina .................................................. - 119 - Paper integrador de PEPCK-C en el metabolisme energètic ............................................. - 121 - Mecanisme proposat........................................................................................................... - 128 -

DISCUSSIÓ ...................................................................................................................................- 136 - DISCUSSIÓ GENERAL................................................................................................................ - 151 - CONCLUSIONS ........................................................................................................................... - 163 - BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................................ - 217 - PUBLICACIONS........................................................................................................................... - 243 - ADDENDUM:

TRANSFERÈNCIA GÈNICA NO VÍRICA MEDIADA PER RECEPTOR..................................- 267 -

INTRODUCCIÓ

Introducció

DIABETIS MELLITUS

La diabetis mellitus és una malaltia d’etiologia múltiple caracteritzada per la incapacitat de l’organisme de mantenir l’homeòstasi de la glucosa com a conseqüència, bé de la incapacitat del pàncreas per a secretar insulina (diabetis tipus I), bé de la incapacitat dels teixits perifèrics (múscul, fetge i teixit adipós) de respondre a la hormona (diabetis tipus II). La hiperglucèmia és el desordre més important associat a la diabetis, essent el responsable últim de les conseqüències patològiques de la malaltia. Totes les formes de diabetis es caracteritzen pel desenvolupament de complicacions secundàries, que van des de patologia microvascular a la retina i el ronyó, fins a complicacions neurològiques a nivell perifèric, passant per un risc incrementat de patir arteriosclerosi o malaltia cerebro-vascular i vascular perifèrica i infart de miocardi. Actualment, entre un 3 i un 5% de la població dels països desenvolupats pateix aquesta malaltia i es preveu que la xifra s’hagi doblat el 2025, en part, degut al dramàtic increment en la incidència de la obesitat, factor que correlaciona amb el desenvolupament de resistència a insulina i diabetis tipus II (1; 2). Etiopatogènesi i patofisiologia de la diabetis tipus I La diabetis tipus I (IDDM) es manifesta generalment abans dels 30 anys d’edat, freqüentment durant l’adolescència, i afecta entre el 5 i el 10% de la població diabètica. Es manifesta en hiperglucèmia i cetoacidosi secundàries a la manca d’insulina. La incapacitat dels teixits perifèrics per a captar i metabolitzar la glucosa, sumat a l’increment de la glicogenòlisi i gluconeogènesi hepàtica, contribueixen a la hiperglucèmia. Al teixit adipós la lipòlisi no està inhibida, fet que fa incrementar els nivells d’àcids grassos circulants. Aquests són captats i oxidats al fetge per a generar cossos cetònics, donant lloc a la cetoacidosi característica de la malaltia. Aquests cossos cetònics són utilitzats com a substrat energètic alternatiu a la glucosa pels teixits perifèrics (múscul, cervell,etc). En la patogènia de la diabetis tipus I hi ha implicats tant factors ambientals com factors genètics. Una predisposició genètica fa als individus susceptibles de generar una resposta autoimmune contra antígens de la pròpia cèl·lula ß (3). Hi ha una infiltració de macròfags i limfòcits T autoagresius als illots de Langerhans (insulinitis) que destrueix les cèl·lules ß pancreàtiques, suprimint-ne la producció d’insulina i, en conseqüència, la capacitat dels teixits perifèrics de metabolitzar la glucosa. Estudis genètics han associat aquesta predisposició amb determinats loci del complex major d’histocompatibilitat (HLA), referits col·lectivament com IDDM1. Alguns dels factors ambientals que

- 3 -

Diabetis Mellitus

s’han associat a la malatia inclouen infeccions, substàncies químiques, o nutrients. Els símptomes de la malaltia apareixen quan quasi la totalitat de les cèl·lules � de l’illot de Langerhans estan destruides.

Les cèl·lules �, productores de glucago, les �, productores de somatostatina i les PP, productores de

polipèptid pancreàtic, es preserven. Etiopatogènesi i patofisiologia de la diabetis tipus II La diabetis tipus II (NIDDM) és la forma de diabetis més comú, amb una incidència del 90 al 95% en la població diabètica. Es manifesta en individus adults, generalment majors de 40 anys. Es caracteritza per la incapacitat dels teixits perifèrics per a respondre normalment a la insulina (resistència a la insulina), dificultant: a) la captació de glucosa, principalment al múscul i al fetge, b) la inhibició de la producció de glucosa al teixit hepàtic i c) la captació i reesterificació d’àcids grassos pel teixit adipós comportant, en últim terme, uns nivells anormalment elevats de glucosa en sang (hiperglucèmia). Com a efecte compensatori, per a mantenir la senyalització d’insulina en els teixits

perifèrics, les cèl·lules � del pàncreas incrementen la secreció d’insulina fins que, finalment, el procès

acaba amb la disfunció dels illots de Langerhans i diabetis oberta (4). Estudis epidemiològics indiquen que hi ha una component genètica que predisposa al desenvolupament de resistència a insulina i diabetis tipus II, tot i que la complexitat genètica de la malaltia ha dificultat la identificacó d’al·lels lligats al desenvolupament de la resistència a insulina. El gruix de les investigacions es concentren en disseccionar la contribució a la patologia diabètica de diferents al·lels a través de l’ús de models murins genosuprimits o transgènics amb alteracions monogèniques que afecten diferents punts de la via de transducció de senyal de la insulina. Els estudis de ratolins genosuprimits per al receptor de la insulin (Insr) i per als substrat d’insulina (Irs1 iIrs2) han fet palesa la naturalesa poligènica i heterogènia de la malaltia: mentre que els heterozigots Irs1+/- son normals, els heterozigots dobles mutants Insr/Irs1+/-, així com els Insr/Irs2+/- mostren la simptomatologia diabètica (5; 6), podent variar en un 80% la prevalència de la patologia, en funió del fons genètic de la soca murina emprada en els creuaments per a obtenir el doble heterozigot (7).A més dels factors genètics, factors ambientals també s’han relacionat amb el desenvolupament de resistència a insulina i diabetis tipus II, entre els que s’inclouen la dieta, obesitat i manca d’exercici. Tot i que els factors pimaris desencadenants de la malaltia es desconeixen, el que sí està clar és que la resistència a insulina té un paper fonamental en el seu desenvolupament. Les causes moleculars

- 4 -

Introducció

desencadenants de la resistència a la insulina en els teixits perifèrics són diverses i només es coneixen parcialment. És difícil determinar quins defectes són primaris i quins conseqüències secundàries. L’alteració en el número de receptors, mutacions puntuals que afectin a la afinitat de la hormona pel receptor, alteracions de la via de transducció de la senyal d’insulina o dels mecanismes de captació i utilitzacó de la glucosa són possibles factors determinants de la resistència a insulina. S’han associat diversos factors a la resistència a insulina en individus diabètics i obesos, com la hiperinsulinèmia, hiperglucèmia, nivells elevats d’àcids grassos plasmàtics, adipoquines o citoquines. Als individus diabètics, els principals òrgans afectats per la resistència a insulina són el teixit adipós, el múscul i el fetge; tot i que la contribució específica de cada òrgan a la hiperglucèmia no està clara. L’ús de models animals genosuprimits amb alteracions específiques de teixit ha permès disseccionar les contribucions individuals dels òrgans sensibles a insulina en la patogènia diabètica.

Resistència a insulina al teixit adipós La diabetis tipus II està molt freqüentment associada a la obesitat. Tot i que el teixit adipós contribueix només en un 5% aproximadament a l’aclarament de glucosa postpandrial, aquest teixit juga un paper molt important en el manteniment de l’homeòstasi de la glucosa i en la patofisiologia de la resistència a insulina. Aquest concepte l’evidencia l’estudi de ratolins knock-out pel transportador de glucosa Glut4 al teixit adipós (8), el qual demostrà que la incapacitat del teixit adipós per captar glucosa repercuteix negativament en la sensibilitat a insulina als teixits perifèrics (fetge i múscul) a través de mecanismes encara no dilucidats. El teixit adipós contribueix a la patogènia diabètica de diferents maneres:

1. Als adipòcits, la resistència a insulina provoca un increment en l’activitat de la lipasa sensible a hormones (LSH), resultant en un increment de la taxa de lipòlisi. Com a conseqüència, s’eleva la concentració en la circulació d’àcids grassos (factor associat a la resistència a insulina tant al múscul com al fetge) i glicerol (substrat gluconeogènic pel fetge).

2. El teixit adipós actua com a un teixit endocrí i exerceix un paper integrador del metabolisme

a través de la secreció de pèptids bioactius, anomenats adipoquines (leptina, adiponectina,

resistina, TNF�, IL6, etc), implicades en la regulació de l’homeòstasi energètica als teixits

perifèrics i en estats d’inflamació. Una desregulació en la secreció d’aquestes adipoquines

- 5 -

Diabetis Mellitus

podria exercir efectes importants sobre l’acció de la insulina al fetge i al múscul. Aquestes adipoquines són:

La leptina és una proteïna de 16 kDa secretada pel teixit adipós de forma proporcional a la seva massa. El receptor de la leptina es troba a l’hipotàlam, des d’on exerceix els seus efectes sobre els teixits perifèrics a través de les vies simpàtiques. La seva funció no és només regular l’aport d’energia, aportant sensació de sacietat, sinó que també fa una funció integrativa del metabolisme energètic. La leptina incrementa la sensibilitat del fetge a la insulina i l’oxidacó d’àcids grassos al múscul. Els individus obesos, tot i tenir els nivells de leptina circulants incrementats, presenten resistència a la acció de la hormona. Diferents models animals de diabetis tipus II es basen en mutacions monogèniques espontànies en el gen de la leptina (ratolí ob/ob), o del seu receptor (ratolí db/db). Aquests animals, ja sigui pel dèficit de la hormona (ob/ob) o la manca de la transducció de la seva senyal (db/db), desenvolupen hiperfàgia, reducció de la despesa energètica, obesitat i resistència a insulina als teixits perifèrics. L’adiponectina és una hormona secretada pels adipòcits. A més de tenir un efecte antiinflamatori, millora la sensibilitat a la insulina al fetge i al múscul esquelètic, estimula l’oxidació d’àcids grassos i disminueix la gluconeogènesi. En pacients diabètics tipus II o obesos, els nivells plasmàtics d’adiponectina disminueixen i correlacionen negativament amb la resistència hepàtica a la insulina. La resistina és una hormona secretades pels pre-adipòcits en diferenciació a adipòcits madurs. Exerceix un efecte de desensibilització a la insulina, especialment sobre el fetge, estimulant la glicogenòlisi i la gluconeogènesi. És, a més, un potent agent pro-inflamatori. En pacients diabètics tipus II, els nivells de resistina estan incrementats i correlacionen amb la resistència a insulina al fetge.

El factor de necrosi tumoral alfa (TNF�) és una citoquina derivada dels adipòcits que té un efecte

bloquejant de la senyalització de la insulina a través de la fosforilació de IRS1 en residus de serina.

El TNF� és un agent pro-inflamatori. Els nivells circulants de TNF� estan incrementats en individus

obesos i en diabètics. En la resistència a insulina, per tant, hi ha una component d’inflamació sub-clínica.

- 6 -

Introducció

La interleuquina 6 (IL-6) és una citoquina pro-inflamatòria produïda, sobretot, pel texit adipós visceral. Nivells incrementats de IL-6 estan associats a resistència a insulina en pacients diabètics. En la resistència a insulina, per tant, hi ha una component d’inflamació sub-clínica.

Resistència a insulina al múscul El múscul és responsable de la captació de fins al 75% de la glucosa circulant en estat postabsortiu. En estats de resistència a insulina, la captació de glucosa post-pandrial per part del múscul esquelètic es veu compromesa, ja que el transport (mediat pel transportador de glucosa Glut4) i fosforilació de glucosa al múscul (reacció catalitzada per la hexoquinasa, HK) són mecanismes depenents d’insulina. La importància relativa de la senyalització de la insulina al múscul ha estat també valorada en models de ratolins knock out. Els ratolins genosuprimits per al receptor de la insulina al múscul (MIRKO, muscle insulin receptor knock out) no presenten alteracions en l’homeòstasi de la glucosa (9). En canvi, la seva deleció al múscul i teixit adipós provoca certa hiperinsulinèmia, resistència a insulina i intolerància a glucosa, però sense arribar a desenvolupar el fenotip diabètic (10). S’ha suggerit que efectes compensatoris en la captació de glucosa per part del teixit adipós (11) o un bypass de la senyalització de la insulina a través del receptor de IGF1 (insulin-like growth factor 1), amb el qual el receptor de la insulina comparteix gran homologia (12), podrien explicar l’absència de fenotip diabètic als ratolins MIRKO. Aquests resultats no posen en dubte la importància de la captació de glucosa postpandrial pel múscul en el manteniment de l’homeòstasi de la glucosa, sinó que fan palès el paper essencial del teixit adipós en la resistència a insulina. La resistència a insulina al múscul i teixit adipós precedeix l’inici de la diabetis oberta. Els mecanismes cel·lulars d’inducció de la resistència a insulina al múscul es descriuran més endavant.

Resistència a insulina al fetge La resistència a insulina al fetge té dues conseqüències: a) desregulació de la producció de glucosa hepàtica i, b) esteatosi hepàtica.

Desregulació de la producció de glucosa hepàticaL’homeòstasi de la glucosa al fetge està regulada de forma coordinada per senyals hormonals, nutricionals i neuronals, tal i com es descriurà a l’apartat Regulació de l’homeòstasi energètica al

- 7 -

Diabetis Mellitus

fetge. En la diabetis, aquest control es veu truncat, desembocant en una situació patològica. S’ha vist que els ratolins genosuprimits per al receptor de la insulina al fetge (LIRKO, liver insulin receptorknock out) pateixen una profunda resistència a la insulina a nivell perifèric i hepàtic (incapacitat de supressió de la producció de glucosa) i intolerància a la glucosa (13). Aquests estudis demostren la importància del fetge com a òrgan central en el control de l’homeòstasi de la glucosa. La captació d’àcids grassos pel fetge és un procés no regulat i, per tant, proporcional a la concentració en sang dels mateixos. L’increment de la taxa de lipòlisi i alliberació d’àcids grassos a la circulació, secundària a la resistència a insulina al teixit adipós, té conseqüències directes sobre el fetge: a) pèrdua de sensibilitat a la insulina (els mecanismes es descriuran més endavant) i b) increment de la taxa de producció de glucosa. S’han proposat mecanismes directes (independents de la regulació hormonal sobre la gluconeogènesi hepàtica) i indirectes (a través de la secreció i senyalització d’insulina):

1. La metabolització d’àcids grassos és una font de substrat (acetil-CoA), energia (ATP) i poder reductor (NADH) que pot activar directament la via gluconeogènica.

2. Els àcids grassos poden estimular la transcripció dels gens gluconeogènics (PGC-1�

PEPCK-C i G6Pasa) a través de mecanismes moleculars que impliquen p38 MAPK (3). 3. La desensibilització del fetge a la insulina, impedeix el seu efecte regulador negatiu sobre

la gluconeogènesi a través de la via de FOXO1 (Figura 3).

Lipidosi hepàticaEls àcids grassos captats pel fetge són metabolitzats a través de: a) oxidació per a generar ATP o, b) esterificació per a generar triglicèrids. L’alteració d’una, o de les dues vies condueix, en el context d’un excès de lípids plasmàtics (dislipidèmia), a esteatosi hepàtica. En la patologia diabètica, tal i com s’il·lustra a la figura 1, una sèrie d’alteracions fisiològiques i moleculars conflueixen en

l’acumulació de triglicèrids al fetge. La major disponibilitat d’àcids grassos incrementa la taxa de �-

oxidació hepàtica, que es reflexa en un increment de cossos cetònics plasmàtics (acetoacetat; AcAc i

�-hidroxibutirat; �-HBA). D’altra banda, al fetge, malgrat la incapacitat de la insulina per a suprimir-ne

la gluconeogènesi (Figura 3) es manté la sensibilitat a insulina en la via lipogènica a través de SREBP-1c (sterol regulatory element binding protein 1c). Tanmateix, FOXA2 (forkhead box A2; factor de transcripció que és bloquejat per insulina i està implicat en l’activació de gens del metabolisme lipídic i cetogènic) manté la seva sensibilitat a la insulina al fetge insulino–resistent, de manera que

- 8 -

Introducció

els seus gens diana no s’activen al fetge diabètic, col·laborant a l’acumulació de lípids al fetge (14; 15). Aquest és un exemple del que s’anomena resistència a insulina selectiva (16).

� Insulina

� Glucosa

� ChREBP

�SREBP-1c

Citrat

AcetilCoA

MalonilCoA

� AcilCoA

�TAGApoB

VLDL

CPT-1

ACL

ACC

FAS

L-PK

SCD1

CK

Piruvat

�-oxidació

Mitocondri

Fetge

Plasma

Teixit adipós

LSH� AGL TAG

LXR�

FOXA2

cetogènesi

�-HBAAcAc

Figura 1. Alteracions metabòliques resultants en l’acumulació hepàtica de triglicèrids en estats de resistència a insulina. La síntesi de novo d’àcids grassos al fetge es regula de forma sinèrgica per insulina i glucosa a través dels factors de transcripció SREBP-1c i ChREBP (carbohydrate response element bindingprotein), que activen la transcripció de gens lipogènicss (ACC, FAS) (17). A la vegada, la transcripció

de ChREBP i SREBP-1c està regulada per LXR�, factor que s’activa per glucosa (18; 19). La

hiperinsulinèmia, fins i tot en estats de resistència a insulina, activa la transcripció de SREBP-1c. Addicionalment, conseqüència de la hiperglucèmia, i de forma secundària a la metabolització de glucosa, ChREBP s’activa per fosforilació. Conseqüentment, hi ha un increment de la via lipogènica i de la concentració de malonil-CoA, inhibidor al·lostèric de la CPT-1 (carnitina palmitoil transferasa-1),

pas limitant de la �-oxidació mitocondrial d’àcids grassos. Per tant, en una situació d’hiperglucèmia i

- 9 -

Diabetis Mellitus

resistència a insulina, els àcids grassos de la circulació captats pel fetge seran preferentement esterificats i acumulats en forma de triglicèrids, contribuint a la hipertrigliceridèmia associada a la patologia. L’excés de triglicèrids són secretats en forma de VLDL (very low density lipoprotein), incrementant els triglicèrids en plasma (Figura 1). Tanmateix, la inhibició que exerceix el malonilCoA sobre la CPT1 pot ser sobrepassada per nivells intracel·lulars d’acilCoA per sobre d’un llindar (20), de manera que en una situació de diabetis oberta estan incrementades tant la síntesi de novo i l’esterificació d’àcids grassos, com la seva oxidació, encara que l’acció de la insulina sobre FOXA2 limiti, en cert grau, la capacitat oxidativa hepàtica. Tot plegat, la sobreproducció simultània de glucosa i àcids grassos al fetge estimula encara més la síntesi d’insulina al pàncreas, i la resistència a insulina a teixits perifèrics. Mecanismes cel·lulars d’inducció de resistència a insulina per lípids Tot i que els factors primaris desencadenants de la patologia es desconeixen, hi ha una correlació entre els nivells circulants d’àcids gassos i el desenvolupament de resistència a insulina. Dos possibles mecanismes d’inducció de resistència a insulina pels àcids grassos circulants són: a) el cicle de la glucosa-àcids grassos i b) la inhibició del receptor de la insulina (IRS) per fosforilació en residus de serina.

Cicle de la glucosa-àcids grassos Els nivells incrementats d’àcids grassos lliures (AGL) i triglicèrids en sang repercuteixen en la reducció de la captació i oxidació de glucosa en resposta a insulina a múscul. Randle i col·laboradors (21) postularen el 1963 un mecanisme pel qual la glucosa i els àcids grassos competeixen per la seva utilització en cèl·lules musculars, que s’anomenà cicle de la glucosa-àcids grassos (Figura 2). Invivo, aquest cicle podria oferir una explicació a la menor captació de glucosa al múscul en una situació de resistència a insulina, quan els nivells i d’àcids grassos circulants estan incrementats. Segons Randle, en presència d’àcids grassos, aquests són oxidats en detriment de la captació i oxidació de glucosa. L’oxidació d’àcids grassos comportaria l’increment de la concentració intramitocondrial d’acetil-CoA, citrat i NADH, que mediarien els efectes inhibitoris sobre el catabolisme de la glucosa. En primer lloc, l’increment d’acetil-CoA i NADH intramitocondrial medarien la inhibició del complex piruvat deshidrogenasa (PDH). L’increment de citrat bloquejaria la fosfofructoquinasa-1 (PFK1), que resultaria en un increment intracel·lular de gluosa-6-fosfat, la

- 10 -

Introducció

inhibició per producte de la hexoquinasa (HK) i el bloqueig de la captació i oxidació de glucosa. No obstant, estudis en humans suggereixen l’existència d’altres mecanismes per a explicar la reducció de l’oxidació de glucosa en resposta a nivells incrementats d’àcids grassos.

AGL Acil-CoA�Acetil-CoA

�Citrat

�NADH/NAD+

Glucosa Glucosa

�Glucosa 6-P

Piruvat

PDH

HKGlicogen

�

PFK �

�

Mitocondria

Figura 2. Cicle de la glucosa-àcids grassos al múscul.

Inhibició d’IRS per fosforilació en residus de serina L’increment d’àcids grassos circulants i de la seva captació desemboca en una deposició intracel·lular de lípids als teixits sensibles a insulina (múscul i fetge), comportant una lipotoxicitat Estudis realitzats per Shulmann i col·laboradors (22) han suscitat la proposta d’un segon mecanisme de resistència a insulina, mediat pels àcids grassos i/o espècies lipídiques derivades de la metabolització intracel·lular d’aquests, que implica el bloqueig de la senyalització de la insulina a nivell del IRS. Aquestes espècies lipídiques poden induir l’activació de determinades isoformes de la protein quinasa C (PKC), tant al múscul com al fetge, que fosforilen IRS en residus de serina. En aquestes circumstàncies, la via de senyalització de la insulina, que s’inicia per reaccions de fosforilació en residus de tirosina, es veuria bloquejada (Figura 3). El bloqueig de la transducció de la senyal d’insulina al múscul comporta el bloqueig del transport de glucosa i de la síntesi de glicogen.

- 11 -

Diabetis Mellitus

Al fetge, incapacita la inhibició de la gluconeogènesi hepàtica i la síntesi de glicogen en alimentació. Ambues conseqüències contribueixen significativament a la hiperglucèmia diabètica.

FOXO1

PP

AGL � Acil-CoA

Glc GlucosaGlut4HK

�DAG

IRS1 PI3K

PKC�

�Glc 6-P

MÚSCUL

AGL �Acil-CoA

Glc GlucosaGlut2

�DAG

IRS1/2 PI3K

PKC�

FETGE

�Glicogen

PGSK3

�Glicogen

PGSK3FOXO1

PEPCKG6Pasa

�GNGAKT

PAKT

InsIns

Figura 3. Interacció de les espècies lipídiques amb la senyalització d’insulina.

Una qüestió important que és objecte d’intens estudi és la naturalesa de les espècies lipídiques responsables de la inducció de resistència a insulina per aquest mecanisme. Tot i que l’acumulació intracel·lular de triglicèrids (TAG) n’és un factor associat, tant a fetge com a múscul, els triglicèrids són considerats “inherts” en la inducció d’aquesta via, a diferència d’altres espècies lipídiques com els acil-CoA, diacilglicerol (DAG) o les ceramides, que sí s’han associat a la inducció d’aquesta via en diferents estudis. Al múscul, s’ha vist un increment de l’activitat PKC� en resposta al DAG (23). Al fetge PKC� sembla ser la isoforma mediadora de la inducció de resistència a insulina per espècies lipídiques (24), presumiblement DAG, en detriment dels TAG i acil-CoA (25; 26). Alternativament, l’acumulació d’acilCoA intracel·lulars podria venir donada per una reducció de la ß-oxidació mitocondrial, deguda a una disfunció mitocondrial o una pèrdua de mitocondris. Recentment s’ha proposat que l’orígen d’espècies lipotòxiques estaria en una oxidació mitocondrial incompleta degut a que la taxa de ß-oxidació exedeix el flux a través del cicle de Krebs i la cadena de transport d’electrons, conduint a l’acumulació intramitocondrial de metabòlits, estrés oxidatiu i resistència a insulina a través de senyals no descrites fins al moment (27). Per tant, en base a aquestes hipòtesi, una alternativa terapèutica es basaria en incrementar la capacitat del cicle de Krebs.

- 12 -

Introducció

Malonil-CoA i AMPK, un duet regulador del metabolisme energètic: implicacions en la resistència a insulina

Malonil-CoA Dennis Mc Garry i Danny Foster (28) descriviren el 1977 el mecanisme a través del qual, en presència d’insulina i glucosa, l’oxidació d’àcids grassos és inhibida per malonil-CoA, tant al múscul com al fetge (29). El malonil-CoA és, a la vegada, substrat de la síntesi d’àcids grassos i inhibidor al·lostèric de la carnitina palmitoil transferasa (CPT-1), enzim limitant de la ß-oxidació d’àcids grassos (Figura 1). Quan els nivells de malonil-CoA incrementen, la capatació i oxidació mitocondrial d’àcids grassos es suprimeixen (per l’acció inhibitòria del malonil-CoA sobre la CPT-1) i el pool de malonil-CoA es deriva cap a la síntesi d’àcids grassos i la seva posterior esterificació. Així, l’acumulació de malonil-CoA estaria lligada a la resistència a insulina i al redireccionament del metabolisme cap a la síntesi de novo i esterificació d’àcids grassos. Per tant, la inhibició d’ACC i l’increment de la capacitat oxidativa d’àcids grassos s’ha associat amb la millora de la sensibilitat a insulina (30; 31).

La quinasa depenent d’AMP (AMPK) La quinasa depenent d’AMP (AMPK) és un a serina/treonina kinasa heterotrimèrica composta per

una subunitat � catalítica i unes subunitats � i � reguladores. Increments en la relació AMP:ATP

intracel·lular fan la AMPK susceptile a les quinases LKB1 i protein-quinasa depenent de calmodulina

alfa (CaMKK�), que fosforilen AMPK en residus de Thr172 i l’activen. AMPK actua com a sensor de

l’estat energètic cel·lular: de forma general, s’activa en situacions d’estrès metabòlic en les que s’inhibeix la producció d’ATP (com hipòxia o hipoglucèmia) o n’hi ha un elevat consum (com durant la contracció muscular) i actua activant les vies de catabòliques (com l’oxidació d’àcids grassos) i inactivant les anabòliques (com la síntesi proteica, glicogenogènesi, lipogènesi, colesterogènesi i gluconeogènesi). AMPK exerceix el seu control metabòlic amb efectes a curt termini, fosforilant i modulant l’activitat d’enzims (ACC, HMGCoA reductasa, glicogen sintasa, PFK2, i altres) i amb efectes a llarg termini, regulant l’expressió gènica a través de la fosforilació de factors de transcripció

(entre els que s’inclouen TORC2, HNF4-�, PGC-1�, ChREBP i SREBP-1c) (32). A les cèl·lules

musculars, l’activació d’AMPK (per exemple, durant la contracció muscular) promou la captació i oxidació de glucosa a través de Glut4, l’oxidació d’àcids grassos i la biosíntesi mitocondrial. Al fetge,

- 13 -

Diabetis Mellitus

l’activació d’AMPK activa vies de producció d’ATP (ß-oxidació) i inhibeix aquelles que en consumeixen (gluconeogènesi, lipogènesi). En situacions d’elevades concentracions d’àcids grassos plasmàtics, la captació i activació dels àcids grassos a acil-CoA intracel·lulars provoca un increment de la relació AMP:ATP, que té com a conseqüència l’activació d’AMPK i proporciona un mecanisme pel qual els àcids grassos suprimeixen l’oxidació de glucosa: AMPK fosforila i inhibeix ACC, disminuint el contingut intracel·lular de malonil-CoA. Així, afavoreix el transport mediat per CPT-1 i la subseqüent oxidació mitocondrial dels acil-CoA (Figura 1). Addicionalment, AMPK podria exercir un efecte protector sobre l’esteatosi a través de la regulació de factors de transcripció com SREBP-1c i ChREBP que, de forma indirecta, resulta en la supressió dels enzims lipogènics ACC i FAS (33; 34). Aquestes accions d’AMPK, prevenen l’esteatosi i contrarresten la resistència a insulina tant a al fetge com al múscul (Figura 4).

AMPK-P�AMP:ATP

LKB1 CaMKK�

TORC2-P ACC1-P ACC2-P

�Malonil-CoA

CPT1

ß-oxidació lipogènesi

Normoglucèmia�Sensibilitat a insulina

�Esteatosi

Pck1G6pc

GNG

Metformina

Figura 4. Efectes de l’activació d’AMPK en un fetge diabètic

L’activacció d’AMPK podria, doncs, ser una fita farmacològica per a una aproximació terapèutica per la diabetis (35; 36). De fet, algunes de les teràpies actualment utilitzades per a la diabetis tipus II

- 14 -

Introducció

(metformina, restricció calòrica i exercici) activen AMPK a fetge i múscul i en redueixen la concentració intracel·lular de malonil-CoA. Dianes terapèutiques i fàrmacs antidiabètics La teràpia substitutòria d’insulina, actualment la única a l’abast dels pacients amb diabetis tipus I, pot arribar a controlar de forma global la hiperglucèmia i retardar l’aparició de les complicacions secundàries associades. No obstant, no resulta sempre satisfactòria degut a l’estricte règim i continu control al qual els pacients han de sotmetre’s per tal d’assegurar l’euglucèmia. El principal problema que aquesta teràpia presenta és la manca de regulació fisiològica de l’alliberació de la insulina injectada, desembocant en freqüents hipoglucèmies i donant lloc a una morbiditat significativa i, fins i tot, mortalitat. Per tant, el control efectiu i permanent de la glucèmia en aquests pacients requereix del desenvolupament d’un sistema endogen de producció d’insulina, regulat fisiològicament, que aconsegueixi un control estricte de la glucèmia. Per al tractament de la diabetis tipus II existeixen diversos fàrmacs que actuen sobre els òrgans implicats, en major o menor mesura, en la resistència a insulina i la hiperglucèmia característiques de la malaltia (37) (Figura 5).

HIPERGLUCÈMIA

Biguadines

TZD

�TZD� Biguadines

TZDInhibidors

�-glucosidasa

�Sulfonilureas

� Produccióhepàtica de glucosa

� Secreció d’insulina

� Captació de glucosa

Resistència a insulina � Captació d’àcids grassos� Alliberació àcids grassos

Absorció decarbohidrats

Intestí

Pàncreas

Teixit adipós

Fetge Múscul

Figura 5. Òrgans i diana dels fàrmacs hipoglicemiants orals.

- 15 -

Diabetis Mellitus

Les sulfonilureas van ser els primers fàrmacs antidiabètics del mercat. Actuen sobre el receptor de sulfonilureas de les cèl·lules ß, promovent la secreció d’insulina. Aquest increment d’insulina en sang és suficient per a compensar la resistència dels teixits perifèrics a la hormona, incrementant la captació de glucosa pel múscul i reduint la PHG (38). Malauradament, en la majoria dels casos la pèrdua progressiva de l’eficàcia del control de la glucèmia, possiblement degut al defalliment de les cèl·lules ß pancreàtiques (39), fa necessari recórrer a la complementació de la teràpia amb insulina. Els efectes adversos del fàrmac inclouen possibles episodis d’hipogluèmia i increment de pes.

Els inhibidors d’��-glucosidasa actuen com a inhibidors competitius dels enzims de la paret apical

dels enteròcits, que degraden els disacàrids a monosacàrids assimilables, reduint d’aquesta manera la taxa d’absorció de carbohidrats. La seva administració és adequada en pacients amb una diabetis incipient, o com a teràpia combinada en aquells pacients en que el tractament amb altres fàrmacs no aconsegueix un bon control de la glucèmia. Els efectes secundaris inclouen flatulències, dolor abdominal i diarrees. Les tiazolidinediones (TZD), entre les quals trobem la rosiglitazona i la pioglitazona, actuen com a

lligands selectius del receptor nuclear PPAR-�, expressat principalment al teixit adipós i implicat en el

control de l’adipogènesi (40). PPAR-� està implicat en el control de la transcripció de PEPCK-C i

glicerol quinasa, incrementant la gliceroneogènesi i la reesterificació d’àcids grassos al teixit adipós i

reduint-ne l’alliberació a sang (41; 42). Així, l’activació de PPAR-� al teixit adipós incrementa la

capacitat de redirigir l’excés de greixos de la circulació, disminuint la concentració d’àcids grassos lliures en sang, amb la conseqüent sensibilització a insulina als teixits perifèrics i la reducció de gluconeogènesis en fetge (43; 44). Els efectes deleteris directes inclouen un increment dels nivells de colesterol LDL i una idiosincràtica hepatotoxicitat associada amb la primera forma comercial (troglitazona), ja retirada del mercat (45-47). La metformina és la biguadina que constitueix el fàrmac de primera elecció per als malalts de diabetis tipus II. El seu mecanisme molecular és actualment objecte d’intens estudi. La seva diana molecular és el complex I de la cadena de transport d’electrons, el qual bloqueja, cosa que comporta una baixada dels nivells intracel·lulars d’ATP (48). Aquesta és una senyal activadora del sensor metabòlic i energètic cel·lular AMPK, mediador dels efectes de metformina (49; 50). Després de l’administració oral de metformina, l’activació d’AMPK al fetge, principal òrgan diana, activa vies de

producció d’ATP (captació i utilització de glucosa, i �-oxidació) i inhibeix aquelles que en

- 16 -

Introducció

consumeixen (gluconeogènesi, lipogènesi) (Figura 4). L’administració oral de metformina, en menor mesura, també activa la captació i utilització de glucosa pel múscul (51-54). Entre els efectes adversos, el més freqüent és la diarrea, que afecta en un 30% de forma dosi-depenent; el més greu, tot i que molt poc freqüent és l’acidosi làctica (54; 55). Els tractaments farmacològics actualment en ús per a la diabetis tipus II no resulten totalment satisfactoris. L’eficàcia de la monoteràpia minva amb el temps, fent necessari recórrer a la teràpia

combinada (sulfonilurea+metformina; inhibidor de �-glucosidasa+metformina; glitazona+metformina,

etc.) amb la finalitat d’aprofitar un efecte sinèrgic dels mecanismes d’acció dels fàrmacs. Tot i així, no s’aconsegueix un control total de la glucèmia ni de l’homeòstasi de lípids, per tant, no s’eviten els episodis d’hipoglucèmia, ni l’aparició de les complicacions secundàries a llarg termini associades a la malaltia.

- 17 -

Regulació de l’homeòstasi energètica al fetge

REGULACIÓ DE L’HOMEÒSTASI ENERGÈTICA AL FETGE

La necessitat de mantenir els nivells de glucèmia dins un estret rang fisiològic (entre 4 i 7 mM) respon a la dependència quasi absoluta del cervell per la glucosa com a substrat energètic i als efectes deleteris de la glucosilació de proteïnes resultants de nivells de glucosa sostingudament elevats. És, per tant, necessari un sofisticat sistema per a mantenir l’homeòstasi de la glucosa independentment de l’estat nutricional. Per aconseguir tal fita l’organisme disposa d’un sistema de senyalització hormonal i nutricional al sistema nerviós central, pàncreas (insulina i glucagó) i teixit adipós (àcids grassos i adipoquines) que actua tant sobre el fetge com sobre el múscul i el teixit adipós.

ALIMENTACIÓ

DEJUNI

Insulina � síntesi glucosa� captació glucosa

Síntesi glicogen Síntesi lípids

MÚSCULFETGE

FETGETEIXIT ADIPÓS

GlucagóGlucocorticoidsAdrenalina

� captació de glucosa�alliberació de glucosa

Glucogenòlisi Gluconeogènesi

MÚSCULFETGE

FETGE

ALIMENTACIÓ

DEJUNI

Insulina � síntesi glucosa� captació glucosa

Síntesi glicogen Síntesi lípids

MÚSCULFETGE

FETGETEIXIT ADIPÓS

GlucagóGlucocorticoidsAdrenalina

� captació de glucosa�alliberació de glucosa

Glucogenòlisi Gluconeogènesi

MÚSCULFETGE

FETGE

Figura 6. Sistema de manteniment de la glucèmia en rangs fisiològics independentment de l’estat nutricional. La insulina és la principal hormona moduladora de l’homeòstasi de la glucosa. En situacions d’alimentació, en que l’aport de glucosa és molt important, la insulina senyalitza sobre els teixits que en són sensibles per a permetre l’absorció de glucosa i la seva acumulació als reservoris, en forma de glicogen al múscul i al fetge (glicogènesi), o d’àcids grassos al teixit adipós i al fetge (lipogènesi). En situacions de dejuni, en que no hi ha aportació de glucosa de la dieta, la senyalització a través d’hormones com el glucagó aconsegueix mantenir els nivells de glucosa circulant gràcies a l’alliberació de glucosa dels reservoris anteriorment citats (glicogenòlisi) i a l’estimulació de la síntesi

- 18 -

Introducció

de novo de glucosa (gluconeogènesi) (Figura 6). La disrupció d’aquest sistema de control de l’homeòstasi de la glucosa per manca d’insulina o de la seva via de senyalització esdevenen en la patogènia diabètica descrita a l’apartat anterior. Acció de la insulina sobre el fetge per al manteniment de l’homeòstasi de la glucosa L’habilitat del fetge per a produir glucosa és essencial per a la supervivència en estats de dejuni. El balanç insulina/glucagó és el principal regulador de la producció hepàtica de glucosa (PHG), quedant en un segon pla l’adrenalina i els glucocorticoids, que tenen importància en situacions d’estrès (Figura 6). La insulina regula el metabolisme hepàtic a través de mecanismes directes (que impliquen la transducció de la via de senyalització de la hormona al fetge) i indirectes (que són independents de la senyalització de la hormona al fetge) .

Mecanismes directes de la insulina sobre el metabolisme hepàtic Els mecanismes directes pels quals la insulina regula al fetge la utilització i emmagatzematge de glucosa en forma de lípids i glicogen i la producció de glucosa de novo comprenen tant efectes immediats, com a llarg termini. Els efectes immediats impliquen la modulació de l’activitat d’enzims mitjançant modificacions post-transcripcionals com, per exemple, la inhibició de la glicogenòlisi per fosforilació de la GSK3ß. Els efectes a llarg termini impliquen la regulació de l’expressió d’enzims i factors de transcripció. Aquests efectes són, principalment, la regulació negativa de la transcripció la fosfoenolpiruvat carboxiquinasa citosòlica (PEPCK-C) i la glucosa-6-fosfatasa (G6Pasa), i l’increment de la transcripció de factors de transcripció, com SREBP-1c que regulen la transcripció de gens glucolítics, com la glucoquinasa (GK) i lipogènics, com la sintasa d’àcids grassos (FAS) i l’acil-CoA carboxilasa (ACC) (Figura 7).

Mecanismes indirectes de la insulina sobre el metabolisme hepàtic Els mecanismes indirectes de la insulina sobre la regulació de la producció hepàtica de glucosa inclouen:

a) Supressió de la lipòlisi al teixit adipós, limitant l’activació de la gluconeogènsi induïda per àcids grassos.

b) Inhibició de la secreció de glucagó.

- 19 -


c) Activació de les vies hipotalàmiques de control de l’homeòstasi de la glucosa.

Glucosa

Glucosa

Glucosa-6-P

GK

Glut2

Glicogen

G6Pasa

Piruvat

FBP PEPCK

PFK PK

Citrat

Acetil-CoA

Malonil-CoA

Acil-CoA

Citrat liasa

ACC

FAS

SREBP1c HNF4-�

FOXO1

PGC1

+ -

GSK3�GSK3�

Gluconeogènesi

Glucòlisi

Insulina

IR

PEPCK-CG6Pasa

Figura 7. Regulació directa de la insulina sobre la PHG. La insulina activa coordinadament enzims i factors de transcripció glucolítics i lipogènics (encerclats en vermell) i inhibeix l’expressió de gens gluconeogènics (encerclats en verd). Encerclats en taronja, els enzims inhibits per la insulina de forma directa per fosforilació. Hi ha una gran controvèrsia sobre la rellevència dels efectes directes versus els efectes indirectes de la insulina sobre la producció hepàtica de glucosa (PHG). L’ús de models de ratolins genèticament modificats en els quals el receptor de la insulina ha estat deleccionat de forma específica al fetge (LIRKO, liver insulin receptor knock out) ha ajudat a conéixer millor els mecanismes de regulació de la PHG per la insulina. Els ratolins LIRKO perden la capacitat de la insulina per a suprimir la PHG i desenvolupen resistència a insulina i diabetis (13), suggerint la primacia de la senyalització directa de la insulina sobre fetge en el control de la PHG a llarg termini. No obstant, estudis més recents han demostrat que la depleció aguda del receptor d’insulina al fetge mitjançant oligonucleòtids antisenstit no compromet la capacitat de la insulina per a suprimir la PHG (56), apuntant cap a l’existència de mecanismes indirectes d’actuació de la insulina a teixits extrahepàtics que contribueixen al control de la PHG a curt termini. Addicionalment, la restitució de la senyalització hepàtica d’insulina als animals

- 20 -

Introducció

knock out per al receptor d’insulina no és suficient per a restituir el control de la insulina sobre la producció hepàtica de glucosa i prevenir eficientment el desenvolupament de diabetis (57), és a dir, que aquests fetges continuen presentant resistència a la insulina tot i preservar la via de senyalització de la hormona. En conjunt, aquests estudis suggereixen que per a mediar els efectes crònics de la insulina sobre la PHG es requereix la trasducció de la senyal de la hormona al propi fetge, però que aquesta senyalització no és suficient per a mediar els efectes aguts de la insulina sobre la PHG.

K ATP

Insulina

PEP

Glc-6PPEPCK

GlcG6Pasa

Glc

Glicogen

Afe

rent

Eferent

Circuits neuronalsnervi vague

Figura 8. Esquema del circuit neuronal entre el fetge i el sistema nerviós central a través del nervi vague. �hipotàlam. En aquest sentit, recentment, Rossetti i col·laboradors han fet palesa l’existència de circuits neuronals que regulen de forma indirecta la producció hepàtica de glucosa a través del nervi vague. Aquests circuits actuarien com a sensors centrals de l’estat nutricional (58; 59). Senyals nutricionals (p.ex. nivell d’oxidació lipídica) i/o la senyalització d’insulina a les neurones hipotalàmiques activarien canals de potassi dependents d’ATP, senyal que, conduïda a través de les vies eferents del nervi vague cap al fetge, desemboca en la supressió de la gluconeogènesi hepàtica (60) per mecanismes moleculars desconeguts (Figura 8). Addicionalment, altres grups han descrit la intercomunicació entre el fetge i els òrgans perifèrics (p.ex. teixit adipós), a través de les vies aferents del nervi vague

- 21 -


(61; 62). Aquests resultats suggereixen l’existència d’un sistema centralitzat per al control de l’homeòstasi energètica, a través de la ramificació hepàtica del nervi vague, en el que el sistema nerviós central integra la informació rebuda dels teixits perifèrics en forma de senyals humorals i neuronals.

Gluconeogènesi hepàtica

Dos fluxos metabòlics determinen la producció hepàtica de glucosa neta: d’una banda la gluconeogènesi i de l’altra la glicogenòlisi. La gluconeogènesi és la formació de glucosa a partir de piruvat amb la següent estequiometria:

2 Piruvat + 4 ATP + 2 GTP +2 NADH + 2 H+ + 4 H2O � 1 glucosa + 4 ADP + 2 GDP + 6 Pi + 2 NAD+

La generació de piruvat o lactat a partir de glucosa es duu a terme a través de la via glucolítica. En el sentit contrari, la producció de glucosa lliure a partir d’àcids tricarboxílics (com piruvat o lactat) s’anomena gluconeogènesi. La síntesi de glicogen (glicogenogènesi) es pot aconseguir per dues vies: a partir de glucosa lliure (via directa), o a partir d’àcids tricarboxílics (via indirecta). La degradació del glicogen per a obtenir glucosa s’anomena glicogenòlisi (Figura 9). Donat que la via gluconeogènica (piruvat � glucosa) és el camí invers de la glucòlisi (glucosa � piruvat), les reaccions bidireccionals de la via en són comunes. Només aquelles reaccions unidireccionals i irreversibles són catalitzades per enzims diferents en ambdues vies. Quatre són els enzims exclusivament gluconeogènics: piruvat carboxilasa (PC), fosfoenolpiruvat carboxiquinasa (PEPCK); fructosa-1,6-bisfosfatasa (FBP) i glucosa-6-fosfatasa (G6Pasa). Aquests enzims formen part de tres cicles de substrats o cicles fútils, conjuntament amb els enzims de la via glucolítica que catalitzen la reacció inversa. Aquests cicles fútils consumeixen ATP, sense generar cap producte, i permeten una fina regulació del flux de la via cap a una o altra direcció. El primer cicle el conformen la PK, la PC i la PEPCK, el segon la PFK i la FBP i el tercer la G6Pasa i la GK (Figura 9). Els gens gluconeogènics són regulats exclusivament a nivell transcripcional, amb l’excepció de la FBP, que és inhibida al·lostèricament per la fructosa-2,6-bifosfat i la PC, que és activada al·lostèricament per acetil-CoA.

- 22 -

Introducció

Glucosa

Glucosa-6-P

Fructosa-6-P

Fructosa-1,6-P2

PEP

Piruvat Cicle de Krebs

OAA

Lactat

Glucosa-1-P

Glicogen

Glic

ogen

òlis

i Glicogènesi

(via directa)G

luco

neog

ènes

i

Glucòlisi

Glic

ogèn

esi

(via

indi

rect

a)

Alanina

PEPCK

G6-Pasa

FBP

LDH

GK

PFK

PK

AAT

PC

Figura 9. Principals fluxos de glucosa al fetge.

Substrats gluconeogènics Quantitativament, el piruvat no és el substrat més abundant de la via gluconeogènica. Altres substrats gluconeogènics d’origen extrahepàtic, com el lactat (substrat més abundant) o l’alanina, poden ser convertits a piruvat al fetge com a pas previ a la via gluconeogènica. El lactat produït en la glucòlisi anaeròbica de teixits perifèrics, com el múscul o els eritròcits, és convertit a piruvat per acció de la lactat deshidrogenasa (LDH) (Cicle de Cori). L’alanina, provinent de proteòlisi muscular, és desaminada per l’alanina aminotransferasa (AAT) a piruvat, transferint el residu amina del glutamat

(Glu) al �-cetoglutarat (�-KG). Altres aminoàcids (com la glutamina), poden incorporar-se, prèvia

desaminacó, al cicle de Krebs, per a ser convertits OAA i entrar a la via gluconeogènica. El glicerol alliberat per la lipòlisi de teixit adipós és fosforilat a glicerol-3-fosfat per la glicerol quinasa (Gli-K), entrant en la via gluconeogènica sense passar per piruvat (Figura 10).

- 23 -


AlaninaAAT

Piruvat LactatLDH

Proteòlisi(múscul)

Glucòlisi(múscul, eritròcits...)

GNG

�KG Glu NADH + H+ NAD

ADP + Pi

Glicerol

Lipòlisi(teixit adipós)

Gli-K

Glicerol 3-P

ATP

ADP + Pi

Glicerol

Lipòlisi(teixit adipós)

Gli-K

Glicerol 3-P

ATP

Figura 10. Substrats gluconeogènics del fetge.

Localització intracel·lullar de les reaccions de la via gluconeogènica Dins del fetge, les diferents reaccions de la gluconeogènesi es duen a terme en diferents compartiments subcel·lulars. L’obtenció de piruvat a partir dels diferents substrats gluconeogènics es duu a terme al citosol. Un cop al mitocondri, el piruvat és convertit a oxalacetat, ja sigui a través de la reacció catalitzada per la PC (reacció anapleròtica essencial per a reposar oxalacetat al cicle de Krebs), o a través del cicle de Krebs mateix. La conversió d’oxalaceat (OAA) a fosfoenolpiruvat, catalitzada per la PEPCK, es pot dur a terme al citosol (PEPCK-C) o a la matriu mitocondrial (PEPCK-M). La membrana mitocondrial és impermeable a l’oxalacetat, per tant, el transport de OAA mitocondrial cap al ciptoplasma es fa mitjançant llançadores d’àcids dicarboxílics, que impliquen

malat o �-cetoglutarat (�-KG) (Figura 11). Quina de les dues llançadores és la font primària d’OAA

citosòlic per a la gluconeogènesi depèn dels gradients de substrats entre citosol i mitocondri i del requeriment de poder reductor del citosol. En principi, el gradient de malat mitocondri-citoplasma n’afavoreix la sortida del mitocondri quan la conversió de malat a OAA al citosol és ràpida i el NADH

- 24 -

Introducció

citoplasmàtic és oxidat a la via gluconeogènica. Si altres enzims, com la lactat deshidrogenasa (LDH), competeixen pel NAD+ citosòlic, el gradient de malat es perd i la llançadora d’oxalacetat-aspartat pren rellevància. Finalment, la desfosforilació de la glucosa prèvia a la sortida de la cèl·lula és una reacció que es dóna al reticle endoplasmàtic, orgànul al que la G6Pasa es troba associada.

OAA Malat

NADH + H+ NAD+

MalatOAA

NAD+NADH + H+

Llançadora OAA/Malat Llançadora OAA/Aspartat

OAA Aspartat

Glutamat �-KG

Glutamat �-KG

OAA Aspartat

mMDH

cMDH

cAAT

mAAT

Citosol

m.m.i.

Matriumitocondrial

Figura 11. Llançadores d’oxalacetat per a la formació de PEP citosòlic. mMDH; malat deshidrogenasa mitocondrial, cMDH; malat deshidrogenasa citosòlica, mAAT; aspartat aminotransferasa mitocondrial, cAAT; aspartat aminotransferasa citosòlica, m.m.i.; membrana mitocondrial interna. Zonació metabòlica del fetge El fetge és un òrgan heterogeni a nivell histoquímic. La sang rica en nutrients i oxigen entra a l’acinus hepàtic per la vena porta/artèria hepàtica i en surt per la vena hepàtica (Figura 12 A). La concentració de substrats i oxigen al llarg de l’eix periportal-perivenós determina un patró d’expressió gènica diferencial entre els hepatòcits periportals i els perivenosos, generant una zonació funcional i metabòlica dels hepatòcits dins de l’acinus hepàtic (63; 64). Segons aquest model, en estat absortiu, la glucosa és captada majoritàriament pels hepatòcits perivenosos, els qual sintetitzen glicogen per la via directa, mentre que els hepatòcits periportals serien els responsables de la síntesi de glicogen per la via indirecta a partir de substrats com alanina, lactat o glicerol provinents de la circulació. En estat postabsortiu, els hepatòcits periportals produirien glucosa a partir dels reservoris de glicogen i de la gluconeogènesi indirecta (Figura 12 B). L’activitat gluoneogènica a l’acinus hepàtic es concentra, per

- 25 -


tant, a la zona periportal, coincidint amb el patró d’expressió de l’enzim fosfoenolpiruvat carboxiquinasa citosòlic (PEPCK-C), tal i com es mostra al panell inferior de la figura 12 C.

G6Pasa

Glicogen

PP PV

PP PV

AH

VP VC

Periportal Perivenós

Flux

O2, hormones, nutrients

AlaninaGlucosa

Piruvat

Glucosa

PEPCK

Lactat

GKG6P G6P

Piruvat

Glicogen

GlucosaG6Pasa

Glicogen

AlaninaGlucosa

Piruvat

Glucosa

PEPCK

Lactat

G6P G6P

Piruvat

Glicogen

Glucosa

Estat absortiu

Estat postabsortiu

PK

A

B

C

GK

Periportal Perivenós

Figura 12. Zonació hepàtica. A: Esquema de l’eix porto-central. AH; artèria hepàtica, VC; vena cava, VP; vena porta. B: Esquema de la heterogeneïtat en el metabolisme de la glucosa entre els hepatòcits periportals i perivenosos. C: Detecció inmunohistoquímica de PEPCK en talls de fetge. PP; periportal, PV; perivenós.

- 26 -

Introducció

Fosfoenolpiruvat carboxiquinasa (PEPCK) La fosfoenolpiruvat carboxiquinasa (E.C.4.1.1.32; PEPCK) catalitza la conversió d’oxalacetat a fosfoenolpiruvat de forma depenent de GTP (Figura 13). La reacció és reversible en condicions fisiològiques. S’ha proposat com el principal enzim regulador del flux de la via gluconeogènica (65).

OAA

Figura 13. Reacció catalitzada per la PEPCK. OAA; oxalacetat, PEP; fosfoenolpiruvat.

Existeixen dues isoformes de PEPCK, una de (PEPCK-C), aïllada per primer cop el 1963 a partir de fetge de rata (66), i una de mitocondrial (PEPCK-M), aïllada a partir de fetge de pollastre el 1953 (67). Ambdues isoformes estan codificades per diferents gens nuclears (Pck1 i Pck2 respectivament), però catalitzen la mateixa reacció; amb propietats cinètiques similars, però amb un patró d’expressió, regulació i localització subcel·lular diferent. Al fetge, l’inici de l’expressió de la PEPCK-C és perinatal, coincidint amb la iniciació de la capacitat gluconeogènica, fet essencial per al manteniment de la glucèmia en el període perinatal. En canvi, la PEPCK-M s’expressa al fetge ja abans del naixement. D’altra banda, la distribució intracel·lular de les isoformes de PEPCK al fetge és variable en funció de l’espècie (68) (Taula 1).

PEPCK-C PEPCK-M % activitat Humà 50 50

Cobaia 50 50 Gos 50 50 Gat 50 50

Rata 90 10 Ratolí 95 5 Conill 10 90

Pollastre 0 100

OAA

Taula 1. Distribució intracel·lular de les isoformes de PEPCK en diferents espècies determinades en assajos d’activitat enzimàtica sobre la fracció citosòlica o mitocondrial de fetge.

- 27 -


Regulació de l’activitat PEPCK-C La regulació dels gens Pck1 i Pck2 és completament diferent: mentre que Pck2 s’expressa de manera constitutiva, el gen Pck1 es regula a través de la modulació de la taxa de transcripció i de l’estabilitat de el mRNA. El mRNA de la PEPCK-C té una vida mitja de 30 minuts i la proteïna de 6 hores. Aquest ràpid reciclatge del mRNA, conjuntament amb la regulació a nivell de transcripció i estabilitat de el mRNA permeten una ràpida resposta en la modulació de l’activitat enzimàtica en front a l’estat nutricional i hormonal.

Regió promotora del gen Pck1Nombrosos estudis han delimitat la regió promotora del gen Pck1 i han descrit els factors s’hi uneixen, dividint-la fonamentalment en quatre regions regulatòries (Figura 14). Regió 1: conté una TATA box essencial per a la transcripció basal. També conté un element de resposta a cAMP (CRE) al que s’hi pot unir CREB (cAMP response element binding protein), mediador dels potents efectes transactivadors d’aquest segon missatger. A través d’aquest mateix lloc d’unió CRE, i competint per la seva unió amb CREB, exerceix el seu potent efecte inhibidor de la transcripció el factor ATF3 (activating transcription factor 3), possiblement, estabilitzant la unió del factor nuclear 1 (NF1) al seu lloc d’unió i potenciant-ne l’efecte negatiu sobre la transcripció del gen. Regió 2: ha estat suggerida com a crítica en la regulació específica de teixit. Aquesta regió conté els elements d’unió a HNF-1 (hepatic nuclear factor 1), essencials per a la transcripció renal del gen, i el

lloc P3(I), a través del qual els factors de transcripció C/EBP��i�� en controlen la transcripció al fetge

i al teixit adipós. En aquesta regió també s’ha descrit una zona d’unió a SREBP-1c (sterol regulatoryelement binding protein 1), factor que exerceix un potent efecte negatiu (69). Regió 3: consisteix en una unitat de resposta a glucocorticoids (GRU) i unes unitats de resposta a

glucosa. També conté una regió AF1 a la qual es poden unir els factors HNF4-� (hepatic nuclear

factor 4-�), RXR (retinoic X receptor) i PPAR�-��peroxisome proliferator activated receptor). PGC-

1� (PPAR ��co-activator-1�) actua sobre aquesta regió del promotor coactivant HNF4-�. També s’hi

ha descrit un possible lloc d’unió de SREBP-1c.

Regió 4: conté dos llocs d’unió de PPAR�-2 (PPARE), necessaris per a l’expressió específica a teixit

adipós.

- 28 -

Introducció

Regió 1Regió 2Regió 3Regió 4

Figura 14. Regió promotora de Pck1. Adaptat de Chakravarty, K. (2004) Journal of Biological Chemistry.

Regulació de l’expressió de PEPCK-C al fetgeEn la regulació transcripcional de Pck1 estan implicats factors hormonals i nutricionals (Figura 15). Les senyals hormonals i nuctricionals que modulen l’expressió del gen Pck1 al fetge són: Senyals hormonalsEl principal eix regulador és la relació insulina:glucagó, però altres hormones, com els glucocorticoids i les hormones tiroides, en modulen els efectes (70). En dejuni, l’AMPc hepàtic (segon missatger i mediador dels efectes del glucagó) és responsable de l’estimulació de les vies que desemboquen en

la transcripció del mRNA de PEPCK-C a través de PGC-1� i CREB-Pi en la seva estabilització a

través dels llocs d’inestabilitat localitats a la regió 3’UTR (71). PGC-1��s’ha mostrat en els últims

anys com a coactivador crític per a la transcripció de PEPCK-C i la regulació de la gluconeogènesi

hepàtica, cetogènesi i ß-oxidació. L’acció estimuladora de PGC-1� sobre la gluconeogènesi hepàtica

(no així sobre la ß -oxidació ni cetogènesi) requereix la coactivació de HNF4-� (72). En dejuni i

diabetis, els nivells de PGC-1� estan incrementats i la coactivació de HNF4-� aconsegueix la plena

activació trancripcional de PEPCK-C (73). En alimentació, la via de senyalització d’insulina reprimeix la transcripció de PEPCK-C actuant sobre FOXO1 (Forkhead box O1). FOXO1 pertany a la família de factors de transcripció forkhead box, i s’expressa abundantment al fetge i a les cèl·lules ß pancreàtiques. FOXO1 interacciona amb PGC-

1�,�essent aquesta interacció necessària per a la transcripció dels gens gluconeogènics G6Pasa i

PEPCK-C (74). En absència d’insulina, FOXO1 es troba directament unit als elements de resposta a insulina (IRE) (75). En resposta a insulina, la fosforilació de FOXO1 per AKT, comporta la seva

- 29 -


translocació al citoplasma, inactivació, ubiquitinització i degradació, amb la conseqüent pèrdua de l’activitat transcripcional (76; 77). Per tant, FOXO1 juga un paper essencial en la inhibició de la gluconeogènesi hepàtica en resposta a insulina i (75; 78; 79).

GlucagóReceptor de glucagó

InsulinaReceptor d’insulina

cAMP

PKA

PGC-1�

PEPCK-C

HNF4-�HNF4-�

CREB-P

CREB-PCREB-P

Gs

Adenilatciclasa

PI3K

AKT-P

PHPTP

IRS1/2/3

FOXO1

PiruvatNAD+

Sirt1

FOXO1

DEJUNI ALIMENTACIÓ

FFA

FFA

p38

�-oxidació

ROS

Figura 15. Regulació transcripcional de Pck1 a fetge. Senyalització hormonal de l’eix insulina-glucagó i senyalització nutricional mediada per Sirt1. Senyals nutricionals

En dejuni, una senyal nutricional mediada per NAD+ activa la Sirt1, que deacetila PGC-1�, estimulant

la interacció amb HNF4-� i activant la seva activitat transcripcional sobre els gens gluconeogènics

(80). Sirt1 també deacetila FOXO1, retenint-lo al nucli i promovent la seva activitat transcripcional independentment de la senyalització d’insulina (81-83). D’altra banda, en dejuni i diabetis, la lipòlisi al teixit adipós suposa un increment dels nivells

plasmàtics d’àcids grassos, que són captats i �-oxidats al fetge, generant un exès de espècies

reactives d’oxigen (ROS) que activen la p38 MAPK. S’ha vist que en resposta a àcids grassos

- 30 -

Introducció

l’activació de p38 als hepatòcits indueix la fosforilació de CREB (3) i C/EBP� (84), incrementant la

transcripció de PEPCK-C.

Regulació específica de teixitL’expressió específica de teixit de Pck1 respon a l’existència d’elements reguladors al promotor, als que s’uneixen factors de transcripció específics de teixit (70). La regulació de Pck1 a teixits extrahepàtics no ha estat estudiada en profunditat, però en general respon als mateixos factors que al fetge, amb l’excepció de: a) el ronyó, on l’acidosi metabòlica (p.ex. durant l’exercici perllongat o diabetis) constitueix una senyal positiva (mediada per HNF-1) i l’alcalosi una de negativa (mediada per NF1), per la transcripció de PEPCK-C; i b) el teixit adipós, on els glucocorticoids (que actuen a

través dels factors de transcripció de la família de C/EBP� i �) reprimeixen la transcripció de

PEPCK-C, al contrari del que passa al fetge. Aquesta discrepància serà comentada més

extensament al subapartat Gliceroneogènesi. El factor de transcripció PPAR�-2, d’expressió quasi

exclusiva en teixit adipós controla l’expressió de PEPCK-C en aquest teixit a través del lloc d’unió PPARE del promotor.

Funció fisiològica de PEPCK La isoforma mitocondrial, PEPCK-M ha estat poc estudiada. Estudis de la dècada dels vuitanta en pollastre van confirmar la seva importància en la gluconeogènesis hepàtica i renal en aquesta espècie, tot i que la sev expressió és força ubíqua. S’ha proposat que la PEPCK-M podria exercir un paper important en la gluconeogènesi a partir de lactat, ja que la producció de PEP intramitocondrial obviaria la llançadora d’oxalacetat, mantenint els nivells de NADH citosòlic. Als teixits no gluconeogènics, amb una baixa activitat piruvat carboxilasa, com el múscul esquelètic, la capacitat de la PEPCK-M per a generar oxalacetat intramitocondrial pot ser essencial per al manteniment del flux del cicle de Krebs. Pel que fa a la isoforma citosòlica (PEPCK-C), tot i ser considerada un enzim eminentment gluconeogènic, també s’ha detectat a teixits no gluconeogènics, com ara teixit adipós blanc i marró, múscul, cervell, intestí prim, pulmó, glàndula mamària, glàndules suprarenals i testicles (85), suggerint que, a més de participar en la gluconeogènesi, PEPCK-C pot tenir un paper essencial en altres processos metabòlics (Taula2).

- 31 -


Funció fisiològica Teixit Definició

Gluconeogènesi Fetge Còrtex renal

Producció de novo de glucosa a patir de precursors no glucídics

Gliceroneogènesi Fetge Teixit adipós blanc

Producció de novo de glicerol-3-P a partir de precursors no glucídics per a la reesterificació

d’àcids grassos

Anaplerosi Fetge Múscul esquelètic Aport d’intermediaris del cicle de Krebs

Cataplerosi Fetge

Còrtex renal Intestí prim

Eliminació d’intermediaris del cicle de Krebs

Taula 2. Paper fisiològic proposat per PEPCK en diferents teixits.

En els últims anys, estudis amb diferents models de knock-out i l’ús de tècniques de marcatge isotòpic, anàlisis bioquímic i ressonància magnètica nuclear han permès l’estudi del rol metabòlic que PEPCK-C en els diferents teixits. Aquests estudis han posat de manifest la funció integradora de PEPCK-C, no només en l’homeòstasi de la glucosa a través de la GNG hepàtica, sinó també en el metabolisme lipídic (gliceroneogènesi al fetge i al teixit adipós) i energètic (cataplerosi i anaplerosi). Seguidament es descriuen alguns d’aquests estudis, emfatitzant els aspectes més importants que fan referència a la funció fisiològica de la PEPCK com a integrador de diferents vies metabòliques.

GliceroneogènesiLa gliceroneogènesi és una versió abreviada de la gluconeogènesi que proporciona glicerol-3-fosfat necessari per a la reesterificació d’àcids grassos lliures. La gliceroneogènesi és especialment important en estats de dejuni i afecta al metabolisme lipídic en sentit contrari al teixit adipós i al fetge (86). Al teixit adipós la gliceroneogènesi potencia la deposició d’una part dels àcids grassos lliures generats en la lipòlisi, esterificant-los en forma de triglicèrids. Al fetge, la gliceroneogènesi potencia tant la deposició intracel·lular de TAG com l’alliberació de VLDL a partir dels àcids grassos captats de la circulació. Aquest reciclatge d’àcids grassos entre el teixit adipós i el fetge forma part del cicle dels triglicèrids/àcids grassos, la funció fisiològica del qual està encara per determinar (Figura 16). La deleció de l’element PPARE del promotor de PEPCK-C en suprimeix l’expressió i la gliceroneogènesi al teixit adipós blanc, amb una incidència significativa de lipodistròfia (87). Contràriament, la sobreexpressió de PEPCK-C al teixit adipós indueix obesitat (88) per l’acumulació de triglicèrids a teixit adipós i predisposa a desenvolupar resistència a insulina (89). Aquests estudis

- 32 -

Introducció

confirmen la importància de la gliceroneogènesi en el control del reciclatge dels AGL i el control que PEPCK-C exerceix sobre el flux de la via al teixit adipós.

TAG

Àcids grassos lliuresGlicerol-3-P GlicerolLSH

OAA

PEP

PEPCKGTP

GDPCO2

DHA-3-P

Àcids grassos lliuresGlicerol-3-P

OAA

PEP

PEPCKGTP

GDPCO2

DHA-3-P

TAGFETGE

TEIXIT ADIPÓS

VLDL

Piruvat

Piruvat

Glucosa

�-oxidació

PPAR�C/EBP�

TZDGC

C/EBP� GC

C/EBP� GCC/EBP� GC

Figura 16. Gliceroneogènesi en teixit adipós i fetge a partir de piruvat: cicle dels triglicèrids/àcids grassos.

Al contrari que al teixit adipós, al fetge i al ronyó els glucocorticoids estimulen la transcripció de PEPCK-C. L’efecte diferencial dels glucocorticoids sobre la regulació de PEPCK-C és un exemple de la importància de la regulació específica de teixit i aporta un sentit fisiològic a aquesta divergència: en resposta a glucocorticoids l’increment de PEPCK-C hepàtica incrementa la producció hepàtica de glucosa per la via gluconeogènica i incrementa l’alliberació d’àcids grassos (en forma de VLDL) a través de la gliceroneogènesi, mentre que la reducció de PEPCK-C en teixit adipós limita la reesterificació dels àcids grassos alliberats per la lipòlisi, permetent la seva disponibilitat sistèmica. Tanmateix, nivells alts d’àcids grassos i glucosa en sang són característics de la diabetis, podent

- 33 -


radicar aquí una possible explicació mecanística del paper dels glucocorticoids en diabetis. Els mecanismes moleculars d’aquesta regulació inversa no són coneguts, però sembla evident que implica la interacció dels glucocorticoids amb factors de transcripció específics de teixit. Per exemple,

el factor C/EBP� sembla estar implicat en la regulació negativa de PEPCK-C en resposta a

glucocorticoids a teixit adipós (90), i la seva delecció redueix l’adipositat i protegeix enfront a la obesitat induïda per dieta (91), així com de la diabetis (92).

Cataplerosi, metabolisme energètic i metabolisme lipídicLa funció catapleròtica de PEPCK-C és especialment important al fetge durant processos biosintètics com la gluconeogènesi o la lipogènesi, quan el malat o el citrat surten del mitocondri per a generar glucosa o àcids grassos, respectivament. Al ronyó, la gluconeogènesi és un procés catapleròtic, que

pren importància en situacions d’acidosi metabòlica, ja que elimina l’�-cetoglutarat generat en

l’extracció de glutamina, evitant així l’acumulació d’intermediaris del cicle de Krebs, i mantenint l’activitat d’eliminació de H+ acoblada al metabolisme de la glutamina. A l’intestí prim PEPCK-C podria exercir un paper en la gluconeogènesi a partir de lactat per aportar glucosa al propi teixit, o també un paper catapleròtic en la metabolització d’aminoàcids de la dieta, com glutamina i aspartat. Els recents estudis de genosupressió de PEPCK-C desenvolupats als grups del Dr. Mark A. Magnuson i el Dr. Richard W Hanson han demostrat que la PEPCK-C és quelcom més que un enzim exclusivament gluconeogènic: PEPCK-C és enzim essencial per a la vida i exerceix un important paper integrador del metabolisme energètic al fetge. Els efectes de la deleció sistèmica de PEPCK-C sobre l’homeòstasi de la glucosa són clars, ja que causa una severa hipoglucèmia i la mort dins dels dos primers dies de vida del ratolí (93; 94). En canvi, la delecció de PEPCK-C exclusivament al fetge no només no resulta letal, sinó que els ratolins es mantenen euglicèmics fins i tot en dejunis perllongats (95), qüestionant la contribució de l’activitat PEPCK-C en el control de la glucèmia en dejuni. No obstant, tot i que la delecció de PEPCK-C en fetge en compromet clarament la gluconeogènesi hepàtica a partir de precursors gluoneogènics (lactat, piruvat, alanina, però no glicerol) no es poden descartar mecanismes compensatoris intra- i extrahepàtics per al manteniment de l’euglucèmia, que podrien incloure un efecte combinat de reducció de la utilització de la glucosa a nivell sistèmic i un increment de la producció de glucosa extrahepàtica (96). Addicionalment, el flux d’activitat PEPCK és necessari per al manteniment del cicle de Krebs i la producció de poder reductor, necessari per a la subseqüent producció d’ATP. L’absència d’activitat PEPCK-C hepàtica té un efecte directe sobre el metabolisme energètic mitjançant el boqueig del cicle de Krebs (93). Les

- 34 -

Introducció

conseqüències sobre l’homeòstasi energètica al fetge que se’n deriven són un consum d’oxigen

menor, increment de l’estat red-ox mitocondrial i esteatosi hepàtica secundària a un bloqueig en la��-

oxidació d’àcids grassos (Figura 63) (97). Aquests resultats, obtinguts en laboratoris independents, suggereixen que l’activitat PEPCK-C al fetge no només controla el flux gluconeogènic sinó que, sobretot, permet el flux del cicle de Krebs (94), amb implicacions diverses en la integració del metabolisme energètic i lipídic del fetge.

AnaplerosiLa implicació de PEPCK-C en anaplerosi ha estat recentment demostrada mitjançant la sobreexpresió al múscul esquelètic (98). Aquests ratolins transgènics mostraren un ostensible increment en l’activitat física i eren molt més resistents a l’exercici físic. Això és, en part, degut a l’increment en el número de mitocondris i a l’acúmul de reserves en forma de triglicèrids al múscul esquelètic. A més, aquests animals ténen un contingut corporal de greix deu vegades inferior i una esperança de vida molt superior en comparació amb els ratolis control. Tot i que encara queda per dilucidar els mecanismes, els autors proposen que, d’una banda la relació directa entre l’activitat PEPCK-C i el cicle de Krebs a través del seu paper en l’anaplerosi al múscul ajuden a explicar la major capacitat d’aqests animals per a oxidar els substrats lipídics durant l’exercici; de l’altra la implicació de l’enzim en la gliceroneogènesi explica la deposició de triglicèrids.

PEPCK-C en diabetis

Tot i que la contribució relativa de la glicogenòlisi i gluconeogènesi a la producció hepàtica de glucosa en estats no patològics és controvertida, sí que hi ha evidències de la relació entre un increment de l’activitat gluconeogènica hepàtica (99), lligat a un increment patològic de PEPCK-C i la hipergicèmia diabètica (100). La importància de la PEPCK-C en el desenvolupament de la diabetis és clara i ha estat demostrada en múltiples models animals de resistència a insulina i/o hiperglucèmia concomitant a una sobreexpressió de la PEPCK-C. Valera et al. (101) demostrà que la sobreexpressió PEPCK-C (fins a set vegades per sobre dels nivells normals) en ratolins transgènics es reflexa en un increment de la PHG acompanyada d’hiperglucèmia i hiperinsulinèmia en dejú i intolerància a la glucosa, entre altres signes característics de la diabetis tipus II. Resultats similars van ser descrits posteriorment per Rossella et al. (65) en un model de rata transgènica condicional per al gen Pck1. Posteriorment, Sun et al. (102) demostraren que un increment moderat de PEPCK-C

- 35 -


en fetge (de dues vegades) és suficient per a induir un increment en la producció hepàtica de glucosa i resistència a insulina al fetge. Més evidències de qla relació directa entre PEPCK-C hepàtica i l’etiologia de la diabetis han estat recentment aportades amb la descripció de SNP (single nucleotide polimorfisms) en la zona promotora del gen Pck1 d’elevada incidència a la població diabètica tipus II (103). Aquests SNP es caracteritzen per augmentar l’expressió basal del gen Pck1 in vitro i fan que la insulina sigui incapaç de bloquejar-ne l’expressió. La desregulació del la gliceroneogènesi al teixit adipós i al fetge podria ser un factor determinant en el desenvolupament d’obesitat i diabetis (44), en el que l’activitat PEPCK-C podria tenir una incidència important, tal i com sha descrit en els paràgrafs anteriors. Finalment, s´han trobat associacions entre polimorfismes del gen Pck1 i el contingut de triglicèrids i HDL circulants (104).

- 36 -

Introducció

TRANSFERÈNCIA GÈNICA COM A EINA TERAPÈUTICA

En les últimes dues dècades hem estat testimonis del naixement i els primers passos de la teràpia gènica. Entenem com a teràpia gènica aquelles intervencions en les que, mitjançant la transferència o modificació directa de gens o dels seus productes, es prevé o cura una malaltia. L’ús del material genètic com a eina terapèutica obre una finestra d’esperança en aquelles enfermetats per a les quals, fins al moment, hi ha poques expectatives de cura amb la teràpia farmacològica tradicional basada en small molecules. La teràpia gènica aporta, per primera vegada, la possibilitat de tractar, no només els símptomes, sinó també de curar l’enfermetat definitivament actuant de forma específica sobre el gen causant de la patologia en el teixit afectat. Tot i que l’aplicació més obvia, i en la que les primeres aproximacions de teràpia gènica es centraren, és en el context de malalties monogèniques d’origen congènit (fibrosi quística, distròfia muscular de Duchenne, hemofílies, immunodeficiències combinades severes com la SCID o la X-SCID, hipercolesterolèmia familiar, etc.) la teràpia gènica és aplicable a totes aquelles malalties amb una component genètica, com ara algunes patologies poligèniques (càncer, Alzheimer, Parkinson, diabetis, etc.) o fins i tot malalties infeccioses (SIDA, hepatitis B, etc.). A més a més, en el cas que es disposi de diagnòstic prematur, la teràpia gènica podria permetre una actuació de profilaxi in utero. Les intervencions de la teràpia gènica poden ser a diferents nivells:

� Addició gènica: transferència d’un gen o cDNA, el dèficit del qual és la causa de la patologia. Aquesta és l’aproximació més comú en malalties congènites monogèniques.

� Silenciació gènica: transferència d’una seqüència d’àcid nucleic (oligonucleòtids antisentit, quimeroplastes, RNA d’interferència, ribozims, etc.) que permeten, mitjançant l’acoblament homòleg amb un mRNA o DNA diana, la reducció de l’expressió gènica d’un gen involucrat en l’etiologia o el desenvolupament de la malaltia.

En funció del tipus cel·lular diana, la teràpia gènica es pot dividir en dos tipus:

� Teràpia gènica somàtica: implica la manipulació genètica de les cèl·lules somàtiques afectades per una malaltia. No sense certa polèmica, està en fase d’experimentació clínica des de fa més de quinze anys.

� Teràpia gènica germinal: on les cèl·lules diana són germinals o embrionàries. Potencialment, permetria la prevenció de l’aparició de la malaltia. Està sotmesa a una gran

- 37 -

Transferència gènica com a eina terapèutica

controvèrsia, no només per motius mèdics (risc intrínsec de genotoxicitat), sinó també per motius ètics (implica la manipulació d’embrions i la transmissió de la modificació genètica introduïda a la descendència). Per tant, actualment ni tan sols es contempla la possibilitat d’un assaig clínic de teràpia gènica germinal, per considerar-se èticament inacceptable.

Hi ha dues vies d’introducció del material genètic a les cèl·lules diana del pacient:

� In vivo: on el material genètic s’injecta, amb o sense vector, de forma local o sistèmica (Figura 17). Per tant, els requisits essencials per al disseny d’un fàrmac de teràpia gènica invivo són la seva estabilitat en fluids fisiològics, biodisponibilitat a la cèl·lula diana la possibilitat de readministració sense efectes tòxics o immunològics.

� Ex vivo: on la manipulació genètica es fa in vitro sobre cèl·lules en cultiu primari obtingudes d’un explant del pacient. Introduir gens en aquestes cèl·lules és una fita bastant més fàcil, minimitza la toxicitat del vector, permet la verificació i control post-transfecció abans de la reintroducció al pacient i maximitza l’eficiència de transducció.

Figura 17. Recull d’algunes vies d’administració in vivo del material genètic. Niindome, T. (2002) Gene Therapy

Sistemes de transferència gènica El principal front de batalla en el desenvolupament d’un assaig de teràpia gènica és el delivery. L’èxit d’una estratègia de teràpia gènica depèn de la capacitat del sistema de dirigir de forma eficient,

- 38 -

Introducció

segura i selectiva el material genètic al teixit diana desitjat. En el disseny de l’estratègia de transferència gènica per a un protocol de teràpia gènica cal tenir en compte quatre factors crítics:

a) Eficiència de transferència del material genètic (delivery). b) Especificitat sobre el teixit o cèl·lula diana. c) Persistència i regulació de l’expressió gènica. d) Toxicitat.

El sistema de transferència gènica (vector, via d’administració, etc) d’elecció per a satisfer tots els requisits dependrà de les característiques intrínseques de la malaltia a tractar i del teixit diana. El ventall de sistemes de transferència gènica que s’han desenvolupat fins al moment es poden classificar en dos grups: mètodes virals i mètodes no virals. Cada vector té els seus peculiars avantatges i inconvenients, que el fan apropiat per a una determinada finestra d’aplicacions.

Mètodes virals Els virus s’han especialitzat durant milions d’anys d’evolució en la transducció del seu material genètic al nucli de cèl·lules eucariotes, fent-los potents eines per a la transferència gènica al nucli de la cèl·lula diana, raó per la qual la majoria d’assajos clínics es basen en vectors virals. Malauradament, han mostrat greus problemàtiques entre les que es compten la limitació en la mida de l’insert, immunogenicitat, potencial mutagènesi insercional i insuficient especificitat infectiva.

Avantatges Inconvenients

Adenovirus (Ad)

Infecta cèl·lules proliferants i quiescents. Facilitat de producció a gran escala.

Tamany de l’insert: (�E1<�E1-E3<gutless) Alts nivells d’expressió.

Inmunogenicitat: (�E1> �E1-E3>gutless).

Expressió de curta durada: (�E1<�E1-E3<gutless).

Possible contaminació per virus helper (gutless).

Adenoassociats (AAV)

Infecta cèl·lules en proliferants i quiescents.

No patogènic i poc inmunogènic. Ampli tropisme.

Als nivells d’expressió.

Limitació de tamany d’insert (4,5 Kb). Efectivitat limitada a la presència

d’anticossos preexistents. Possibilitat d’integració a l’atzar.

Retrovirus (Rv) No hi ha expressió de proteïnes víriques.

Només infecta cèl·lules proliferants. Possibilitat de mutagènesi per inserció.

Límit de l’insert (8Kb). Lentivirus

(Lv) Infecta cèl·lules proliferants i quiescents.

Expressió de llarga durada. Possible toxicitat de les proteïnes

víriques d’empaquetament.

Taula 3. Vectors viral: avantatges i inconvenients.

- 39 -


Mètodes no virals Els problemes de bioseguretat inherents als vectors virals fan dels vector no-virals una alternativa a tenir en compte, ja que presenten clars avantatges en termes de patogenicitat, genotoxicitat, facilitat i cost de producció i no tenen límit en la mida de l’insert. En canvi, de moment, continuen en clar desavantatge en quant a l’eficiència de transducció i estabilitat d’expressió del transgen en aplicacions in vivo. La taula 4 recopil·la els vectors no virals més comuns, els seus avantatges i inconvenients.

Avantatges Inconvenients

DNA nuu Producció fàcil, segura i

econòmica. Administració senzilla.

Susceptibilitat a nucleases plasmàtiques.

Resposta immune humoral i citotòxica en resposta al DNA bacterià.

Ràpid aclarament per monòcits i cèl·lules endotelials hepàtiques

Baixa transducció Gene gun Aplicabilitat en vacunes de DNA. Baixa penetrabilitat del DNA al teixit.

Electroporació Millora la transducció del DNA plasmídic.

Aplicabilitat superficial (pell, múscul, etc) Mètodes

físics Injecció hidrodinàmica

Facilitat d’injecció. No encapsulament del DNA

necessari. Bona eficiència de transducció.

Dany hepàtic transitori. Dificil aplicació en mamífers superiors

i en clínica. Expressió transitòria

Lipoplex Protecció del DNA a nucleases. Facilitat de producció del vector

Bona eficiència in vitro.

Greus limitacions in vivo: Heterogeneïtat de les formulacions i

inestabilitat dels complexos. Baixa eficiència de transfecció.

Pobre especificitat. Toxicitat cel·lular associada al lípid.

Tràfic ineficient del DNA cap al nucli. Mètodes biològics

Poliplex: polietilenimina

(PEI), oligopèptids i poli-L-lisina.

Protecció del DNA a nucleases. Facilitat de producció del vector. Permeten anclar un lligand per a

obtenir transferència gènica mediada per receptor (veure

addendum). Excel·lents transfeccions in vitro.

Greus limitacions in vivo: Agregació en fluids fisiològics.

Toxicitat in vivo associada al PEI. Tràfic ineficient del DNA cap al nucli.

Taula 4. Mètodes de transferència gènica no virals: avantatges i inconvenients.

No obstant, en els últims anys, un renovat interès pels vectors no virals ha sorgit en resposta a la necessitat de mètodes de transfecció per a molècules sintètiques com el RNA d’interferència o els oligonucleòtids antisentit. En tot cas, l’aspecte comú a optimitzar, tant en sistemes virals com no virals, és el delivery selectiu i eficient cap al teixit o cèl·lula diana.

- 40 -

Introducció

Productes de teràpia gènica al mercat Actualment, tot i que hi ha força fàrmacs basats en DNA o RNA en estadis avançats d’assaig clínic, només dos han estat aprovats per les corresponents agències reguladores:

� Vitravene® (fomivirsen, Isis Pharmaceuticals) és la primera droga antisentit del mercat mundial, aprovada per la FDA. La seva seqüència és complementaria al mRNA regió immediata major 2 (IE2 –Immediate Early Region 2) del citomegalovirus humà causant de retinitis. L’eficàcia d'aquest fàrmac, radica en la accessibilitat del teixit diana de manera tòpica.

� Genicidine (p53-Ad, Sibiono) és el primer fàrmac de teràpia gènica contra el càncer i consisteix en un Adenovirus de primera generació que sobreexpressa p53 per induir l’apoptosi a cèl·lules tumorals. Es comercialitza a la Xina des del 2004.

Aproximacions de teràpia gènica per la diabetis

Aproximacions de teràpia gènica per la diabetis tipus I La destrucció autoimmune del pàncreas limita en gran mesura les possibles aproximacions terapèutiques per a la diabetis tipus I. A part de la teràpia substitutòria amb insulina injectada, fins

ara, el trasplantament de pàncreas, cèl·lules � o illots de Langerhans, es la única estratègia que ha

demostrat una certa efectivitat en la restitució de la normoglucèmia a llarg termini (105). És imprescindible, però, un tractament immunosupressor de per vida, per tal d’evitar rebuig i/o atacs

autoimmunes recurrents contra les cèl·lules � trasplantades. A més a més, la limitació de donants i

l’entrada en apoptosi de les cèl·lules durant la manipulació ex vivo, restringeixen l’aplicabilitat del trasplantament. Les alternatives que actualment s’estan explorat en el camp de la teràpia gènica

inclouen la regeneració de cèl·lules � productores d’insulina a partir de cèl·lules mare pancreàtiques

o extrapancreàtiques (106), o la producció d’insulina ectópica, que implica la manipulació genètica d’òrgans (com fetge o múscul) per a que secretin insulina de forma mes o menys fisiològica (107). Fins al moment, però, no existeix cap opció que reemplaci en la clínica a la teràpia substitutòria d’insulina injectada.

- 41 -


Aproximacions de teràpia gènica per la diabetis tipus II La diabetis tipus II és una malaltia multigènica i multifactorial la característica principal de la qual és la resistència a la insulina en els teixits perifèrics. La seva complexitat ve donada per els abundants mecanismes fisiopatològics que la defineixen i suposen un important repte per a la terapèutica. Les aproximacions de teràpia gènica per la diabetis van a coll dels descobriments dels macanismes vies moleculars que modulen les disfuncions de la malaltia als diferents òrgans. Les estratègies de teràpia gènica per aquesta malaltia pateixen, per tant, no només dels problemes inherents a la resta de patologies en quant a la dificultat per a la transferència de gens de manera eficient, selectiva i segura amb els mètodes actualment a l’abast, sinó que, a més a més, es tracta d’una malaltia de la que se’n coneix l’etiologia definida.

cAMP

PKA

PGC-1

CREB-P

Gs

Adenilatciclasa

yyy

PHPTPIRS1/2/3

PHPTPIRS1/2/3 PTP1B

PHPTPIRS1/2/3

Fetge perivenós Fetge periportal

PI3K

AKT-P

FOXO 1CIRCUITS

NEURONALS

?

GLUCONEOGÈNESIPEPCKG6Pasa

PI3K

AKT-PGLUCÒLISI

GK

LXRSREBP1c

ChREBP

Glucosa

LIPOGÈNESIACCSCD1

Figura 18. Possibles dianes de teràpia gènica per a la diabetis tipus II l’òrgan diana de les quals és el fetge.

Donat el paper central del fetge en la regulació de l’homeòstasi de la glucosa, la potenciació de la sensibilitat a la insulina i la supressió de la produccció hepàtica de glucosa són fites comunes en moltes de les diferents estratègies de teràpia gènica de la diabetis tipus II. Amb tal objectiu, s’estan aplicant tecnologies basades en RNA d’interferència, oligonucleòtids antisentit o transgènesi de

- 42 -

Introducció

diferents proteïnes i factors de transcripció de la via de senyalització d’insulina i/o de la regulació de la gluconeogènesi hepàtica, vehiculitzats tant per vectors virals com no virals. Aquests estudis han resultat essencials per a dilucidar els mecanismes de control de l’homeòstasi energètica al fetge i validar-ne possibles dianes terapèutiques (Figura 18). A continuació es fa un recull dels treballs més rellevants, emfatitzant en aquelles en que l’òrgan diana és el fetge.

Sobreexpressió de proteïnes la deficiència de les quals comprometen la patologiaLa sobreexpressió de proteïnes per a incrementar la captació i metabolització de glucosa i/o la sensibilitat a la insulina a fetge, múscul o teixit adipós ha estat una estratègia profusament emprada per a validar dianes en la terapèutica de la diabetis. MúsculEn diabetis, la captació de glucosa pel múscul està disminuïda com a conseqüència de la resistència a insulina a aquest teixit. La seva accessibilitat permet l’us de tècniques de transferència gènica no virals, com l’electroporació, o virals, com injecions intramusculars de virus adenoasociats (AAV1). Existeixen múltiples evidències de que és possible incrementar la capacitat de captació de glucosa a través de la sobreexpressió de glucoquinasa en múscul ja sigui mitjançant electroporació (108) o vectors adenovirals (109), tot i que l’efectivitat de reversió de la simptomatologia diabètica i de l’obesitat varia segons el model animal diabètic emprat (110-112). D’altra banda, la secreció de nivells basals d’insulina en múscul obtinguda per transgènesis resulta en un increment en la captació muscular de glucosa (108), tot i que no és capaç de corregir la hiperglucèmia quan s’indueix diabetis experimental. Anant un pas més enllà, en un intent de generar un sistema “sensor de glucosa”, l’expressió conjunta de nivells basals d’insulina i glucoquinasa en múscul esquelètic, permeté el manteniment de la normoglucèmia en un model de diabetis experimental, tant en alimentació com en dejuni, possiblement degut a un efecte sinèrgic (glucoquinasa en múscul i insulina a nivell sistèmic) composat per un increment de la captació de glucosa a múscul i una disminució de la producció hepàtica de glucosa (113). FetgeTambé ha estat profusament estudiada la potenciació de l’activitat enzimàtica de glucoquinasa hepàtica, ja sigui per mètodes farmacològics o genètics, amb la intenció d’incrementar-ne la captació de glucosa, i obtenir un efecte hipoglucemiant en diabetis. Mentre que els primers resultats

- 43 -


semblaven confirmar aquesta hipòtesi (114; 115), més endavant es posava en dubte la idoneïtat d’aquesta aproximació, ja que la sobreexpressió a llarg termini de glucoquinasa a fetge induïa resistència a insulina i esteatosi hepàtica (116), o també perque els nivells de sobreexpressió necessaris per a obtenir un efecte hipoglucemiant desemboquen en dislipidèmia (117).

Aproximacions basades en oligonucleòtids Antisentit (ASO)Els antisentit són oligonucleòtids d’RNA, DNA o anàlegs d’àcids nucleics sintetitzats químicament, homòlegs al mRNA diana, al qual s’aparella i en bloqueja la traducció i/o estimula la seva degradació. Després d’una injecció intraperitonial d’ASO, aquests s’acumulen en fetge i al teixit adipós, però no en múscul. Així, les aproximacions terapèutiques per a diabetis basades en ASO s’han centrat en el fetge com a òrgan diana. En els últims anys la companyia farmacèutica ISIS Pharmaceuticals Inc. ha realitzat un exhaustiu cribatge per a identificar dianes susceptibles d’una intervenció farmacològica per a la diabetis utilitzant ASO de segona generació, es a dir, amb modificacions químiques 2’-O-(2metoxi)etil (2’-MOE) que confereixen resistència a nucleases i una major afinitat d’unió amb el mRNA complementari. Alguns d’aquests ASO, en concret els dirigits contra FOXO1 i PTP1B han aportat resultats positius en estudis preclínics i clínics: Reducció de la gluconeogènesi hepàticaFOXO1 La implicació de FOXO1 en diabetis ha estat àmpliament demostrada. En fetges d’animals obesos resistents a insulina, l’expressió de FOXO1 està incrementada i la seva localització és predominantment nuclear (118-120), corresponent a una major activitat transcripcional sobre els gens gluconeogènics G6pc i Pck1. Samuel et al. (120) han demostrat recentment que una modesta silenciació de FOXO1 al fetge de ratolins obesos utilitzant oligonucleòtids antisentit (ISIS188764), s’acompanya de la reducció del mRNA de G6Pasa i PEPCK-C i una baixada en la PHG, que repercuteix en la millora de la glucèmia, tolerància a glucosa, insulinèmia i sensibilitat a insulina no només en fetge, sinó també en teixit adipós. Malgrat que la reversió del fenotip diabètic no és total degut a limitacions en la biodistribució i/o eficiència en el delivery i/o activitat antisentit de l’ASO, aquests estudis recolzen la hipòtesi de que una actuació basada en la reducció de la gluconeogènesi hepàtica en teixits sensibles a insulina pot contribuir a la millora de la resposta perifèrica a insulina. Restabliment de la senyalització d’insulina al fetgePTP1B es una proteïna fosfatasa que interacciona i desfosforila el receptor de la insulina, IRS-1 i IRS-2, regulant negativament la cascada de senyalització d’insulina, els nivells de la qual estan

- 44 -

Introducció

incrementats en pacients obesos amb resistència a insulina (41; 121-123). En estudis amb ratolins obesos que patien una marcada resistència a insulina (ob/ob), l’ús d’oligonucleòtids antisentit permeté reduir els nivells de proteïna PTP1B en fetge i teixit adipós a la meitat, igualant-los als nivells de l’animal sa (ob/-). També es reduïren els nivells de glucosa i insulina plasmàtiques en alimentació i millorà la tolerància a glucosa i insulina (124). Aquests resultats demostren que la normalització dels nivells de PTP1B a fetge i teixit adipós és suficient per a millorar la senyalització d’insulina, suggerint que una modulació farmacològica de PTP1B en teixits sensibles a insulina pot ser una bona diana terapèutica en el tractament de la diabetis tipus II. De fet, la silenciació de PTP1B al fetge a través d’oligonucleòtids antisentit (ISIS 113715) està ja en fase II d’investigació clínica per a avaluar la seva capacitat de millorar o restablir la sensibilitat a insulina en pacients amb diabetis tipus II (125). La repercussió de la formulació en l’estabilitat, biodistribució i funcionalitat de la molècula és un factor essencial en el disseny del fàrmac de DNA com ha quedat demostrat recentment en estudis que utilitzen noves modificacions en la seqüència nucleotídica (enllaç 2’-O,4’-etilè; ENA) que reporta major estabilitat i funcionalitat, tant en percentatge de silenciació, com en efecte hipoglucemiant quan es compara amb la mateixa seqüència sense modificacions químques (126). Reducció de la lipidosi hepàticaL’acumulació de lípids al fetge en estats prediabètics està directament lligat al desenvolupament de resistència a insulina i a una producció hepàtica de glucosa incrementada, ambdós elements clau en la patogènesi de la diabetis tipus II. La reducció de la lipidosi hepàtica podria, per tant, ser una altra estratègia terapèutica en aquestes situacions patològiques. En aquesta línia els enzims hepàtics lipogènics podrien resultar una diana terapèutica. L’acetil-CoA carboxilasa (ACC) catalitza la síntesi de malonil-CoA. L’existència de dues isoformes d’ACC (ACC1, que es localitza en teixits lipogènics com fetge i teixit adipós; i ACC2, que es localitza en teixits oxidatius com fetge, cor i múscul esquelètic) suggereix l’existència de dos pools metabòlics de malonil-CoA, un implicat en la regulació de la lipogènesi de novo a fetge i teixit adipós, i l’altre implicat en la regulació de l’oxidació d’àcids grassos a fetge i múscul (127-130). Per a suprimir la lipogènesi hepàtica, pre tant, seria necessària la inhibició d’ambdues isoformes (131). Savage et al. (132) han demostrat recentment que la inhibició d’ACC1 i ACC2 en fetge utilitzant un oligonucleòtid antisentit contra ambdues isoformes, té un efecte sinèrgic en la inducció d’oxidació d’àcids grassos, comparat amb la silenciació de cada una de les isoformes per separat. Això, en models animals de fetge gras induït per dieta, repercuteix en menor lipidosi i producció hepàtica de glucosa i una millora de la sensibilitat hepàtica a insulina.

- 45 -


Aproximacions basades en RNA d’interferència (RNAi)La tecnologia del RNAi ha sorgit en la última dècada com a alternativa als ASO per a la silenciació de post-transcripcional del mRNA diana, per la seva major potència i versatilitat. En l’apartat RNAd’interferència es descriu en detall la biologia, el mecanisme i lesaplicacions d’aquestes molècules. A continuació es descriuen algunes aproximacions terapètuques basades en el RNAi com a eina: Reducció de la gluconeogènesi hepàtica

PGC-1�� (peroxisome proliferator activated � coactivator-1�). En models murins de diabetis la seva

expressió està incrementada, resultant en una activació constitutiva de la gluconeogènesi hepàtica i

de l’oxidació d’àcids grassos. La silenciació de PGC-1� en ratolins db/db resulta en la reducció del

mRNA dels enzims gluconeogènics (PEPCK-C i G6Pasa), normalització de la glucèmia en dejuni i millora de la tolerància a glucosa i sensibilitat hepàtica a insulina (73) G6Pasa (glucosa-6-fosfatasa) és l’últim enzim en la ruta gluconeogènica, responsable de la síntesi de glucosa a partir de glucosa-6-fosfat. Aquest enzim està regulat a nivell de transcripció per hormones com ara la insulina (regulació negativa), el glucagó i els corticoids (regulació positiva). La inhibició farmacològica de G6Pasa produeix una disminució significativa de la glucèmia i un increment del glicogen hepàtic (133-135). Huang et al. (136) varen demostrar que la silenciació d’aquest gen a fetge mitjançant un adenovirus codificants per shRNA contra G6Pasa aconseguia replicar els canvis sobre l’homeòstasi de la glucosa associats a la genosupressió del gen, demostrant que aquesta estratègia es suficient per induir canvis farmacològicament rellevants en el context d’un animal sà, i per tant, posant les bases per un estudi pre-clínic posterior en models de diabetis. Finalment, s’ha descrit recentment la silenciació específica de ChREBP a fetge, utilitzant un shRNA vehiculitzat per un adenovirus. ChREBP regula, en resposta als nivells de glucosa, i de manera sinèrgica amb SREBP1c, la transcripciód’enzims glucoítics (L-PK) i lipogènics (ACC i FAS), modulant, per tant, la producció de novo d’àcids grassos al fetge. Aquesta estratègia millora la esteatosi hepàtica i la resistència a insulina en models murins d’obesitat i diabetis (137). Aquest conjunt d’estudis posen de mainfest la importància del fetge com a òrgan central en la homeòstasi de la glucosa a nivell sistèmic. La modulació de la GNG hepàtica i la millora de la sensibilitat a insulina al fetge constitueixen, per tant, una fita terapèutica a explorar en profunditat per la teràpia de la diabetis tipus II.

- 46 -

Introducció

RNA D’INTERFERÈNCIA

El fenomen de silenciament gènic post-transcripcional (PTGS) va ser descrit a la dècada dels 80 en plantes. Es va anomenar co-supressió al silenciament de gens tant exogens com endogens observats degut a l’expressió d’un transgen homòleg. Aquest mateix fenomen, observat en fongs (Neurospora crassa) es va batejar com a quelling. No va ser fins el 1998, que es descrigué per primer cop el fenomen de RNA d’interferència (RNAi) (138), quan Andrew Fire i Craig Mello, en estudis de silenciació amb oligonucleòtids antisentit realitzats en Caenorhabditis elegans, observaren que quan les cadenes antisentit i sentit eren anellades (dsRNA) s’obtenia un efecte molt més potent que amb les seqüències antisentit. A més a més, aquest efecte de silenciació de l’expressió gènica era sistèmic i heretable en Caenorhabditis elegans. Aquest descobriment va ser mereixedor del Premi Nobel en Fisiologia i Medicina l’any 2006. Avui sabem que la molècula efectora responsable del silenciament gènic post-transcripcional en plantes i fongs era també RNAi. Mecanisme d’acció del RNA d’interferència: del dsRNA al siRNA El mecanisme d’acció del RNA d’interferència és un camp subjecte a intensa investigació i, tot i que no es coneix encara en profunditat, se’n comença a treure l’entrellat. El model que explica el mecanisme del RNA d’interferència es basa en dues fases (Figura 19):

1. Fase iniciadora El dsRNA és processat al citoplasma pel complex enzimàtic DICER (amb dominis d’unió a RNA, helicassa i RNAsa III) en una reacció depenent d’ATP. Com a resultat, es generen petites molècules de 21 a 23 nucleòtids amb estructura bicatenària, extrems protuberants 5’-fosfat i 3’-hidroxil: els anomenats small interference RNA (siRNA), que són les molècules mediadores del procés de silenciament (139; 140)

2. Fase efectora L’activitat helicasa de DICER separa les cadenes d’RNA. Només una de les dues cadenes serà incorporada al complex RISC (RNA-induced silencing complex) i activada per fosforilació, mentre que l’altra serà degradada. Aquesta cadena s’anomena cadena guia i és la que determina el reconeixement del mRNA diana, el qual serà degradat en la posició 12 del siRNA gràcies a l’activitat endonucleasa depenent d’ATP (141). Recentment s’ha identificat la unitat catalítica del complex,

- 47 -

RNA d’interferència

Argonauta 2. DICER i Argonauta 2 tenen un domini PAZ a través del qual interaccionen els complexos, facilitant el traspàs de la cadena guia del siRNA (142). El reconeixement del mRNA diana està guiat pels 6-8 nt contant a partir del nt 2 de l’extrem 5’ de la cadena guia (regió seed). Desaparellaments a la regió seed aboleixen la funcionalitat del siRNA, mentre que si són fora d’aquesta regió, poden ser tolerats, no sense afectar la funcionalitat del siRNA (143; 144).

DICER

21-23 nt

INICIACIÓ

RISC mRNA

EFECTOR

ATP ADP + Pi

ATP ADP + Pi

siRNA

3’ 5’3’5’

Antisentit (guia)Sentit (acompanyant)

Seed

Figura 19. Model mecanístic del RNAi. Adaptat de Hammond, SM, et al. (2001), Nature Reviews Genetics. RNAi en mamífers: funcions biològiques i aplicació: siRNA i miRNA En mamífers, la resposta a un dsRNA de cadena llarga (>30 nucleòtids) exogen implica l’activació de la via de PKR (proteïna quinasa depenent d’RNA) i/o interferó, bloquejant de forma global i inespecífica la síntesi de proteïnes, i de RNAsaL, degradant de forma inespecífica els mRNA cel·lulars, conduint finalment al suïcidi cel·lular, tal i com es descriu a la Figura 20. La troballa que la interferència de RNA es pot aconseguir en models experimentals de mamífer a través de la introducció dels siRNA sintètics sense inducció d’aquesta resposta inespecífica (140) va obrir les portes a l’aplicació del RNA d’interferència per a l’estudi de la funció dels gens i la validació de dianes

- 48 -

Introducció

terapèutiques, tant en sistemes in vitro basats en cèl·lules de mamífer, com en models animals invivo.

APOPTOSI

dsRNA

PKRinactiva

PKR-P

EIF2�-P

Bloqueig síntesiproteïnes

IFN �/�

RNAasaL

DegradacióRNA

siRNA

Silenciació gènica específica de

seqüència

OAS-2

Ppp(2’p5’A)n

++

++ ++

Figura 20. El dsRNA citoplasmàtic activa vies d’estrès cel·lular en mamífers. Adaptat de McManus, MT etal. (2002), Nature Reviews Genetics. En mamífers, l’RNA d’interferència realitza una funció essencial en la regulació de l’expressió gènica a través dels micro RNA (miRNA) endògens. Els miRNA són una família de RNA de doble cadena no codificants, de petit tamany (~22 nt), expressats endògenament i altament conservats amb una potent funció reguladora a nivell post-transcripcionals (145).

La biogènesi dels miRNA consta de quatre passos (Figura 21): 1. Els miRNA són transcrits per la RNA polimerasa II com a trànscrits primaris de cadena

llarga (pri-miRNA), amb extrems 5’-cap, 3’-poliadenilats i estructura steem-loop. 2. Al nucli, la RNAasa III Drhosa processa els pri-miRNA en molècules precursores d’uns 60-

70 nucleòtids amb estructura de forquilla i aparellament imperfecte (pre-miRNA) que deixa un extrem 5’-fosfat i dos nucleòtids protuberants a l’extrem 3’-OH, característic dels siRNA.

3. Els pre-miRNA són exportats al citoplasma a través del transportador Exportina 5 (Exp 5),un transportador nuclear Ran-GTP depenent.

- 49 -


4. Un cop al citoplasma, el complex DICER processa els pre-miRNA a miRNA madurs de 21-23 nucleòtids, amb els dos extrems 5’-fosfat i dos nucleòtids protuberants a l’extrem 3’-OH; una mena de siRNA d’aparellament imperfecte.

gen miRNA

RNA pol II

(A)n5’cap

pri-miRNA

pre-miRNA

Drosha

DICER

miRNA

ds RNA

siRNA

shRNA

siRNA

mRNAmRNA

Repressió traduccional

Exp 5

RNA pol III

pshRNA

shRNA

NUCLI CITOPLASMA

pre-miRNA

RISC RISC

Figura 21. La biogènesi dels miRNA, siRNA i shRNA convergeix en DICER

- 50 -

Introducció

El mecanisme d’acció dels miRNA és paral·lel al dels siRNA, implicant també al RISC i la seva activitat RNAasa III, quan la homologia entre el miRNA i el mRNA diana és completa, o bloquejant la traducció quan la homologia no és completa (Figura 21). Fins al moment s’han descrit centenars de miRNA en mamífers, que podrien estar regulant fins a un 30% dels gens. Les dianes per a aquests miRNA es troben a les regions 3’UTR (3’ no traduïdes). Alguns miRNA s’han pogut relacionar directament amb la regulació de gens implicats en desenvolupament, diferenciació de precursors neuronals i hematopoiètics, proliferació i apoptosi, posant de manifest la important implicació dels miRNA en càncer. Alguns miRNA s’han relacionat també en regulació del metabolisme d’aminoàcids, lípids i glúcids (146). Molècules efectores de RNAi en mamífers: siRNA vs shRNA La interferència d’RNA in vivo en cèl·lules de mamífer es pot aconseguir tant a través de la introducció de siRNA sintètics, com generats a partir de vectors d’expressió. Alternativament, aprofitant el paral·lelisme en el processament dels siRNA i els miRNA es poden generar vectors d’expressió de shRNA. Els shRNA són molècules precursores dels siRNA, amb estructura de forquilla similar a la dels pre-miRNA (Figura 21). Òbviament, els vectors d’expressió de siRNA i shRNA poden ser tant virals com no virals.

1. siRNA sintètics. A diferència que en C. elegans, en cèl·lules de mamífer no s’ha descrit un mecanisme d’amplificació dels siRNA. Per tant, els siRNA sintètics hi aporten un efecte transitori degut la dilució en les successives divisions cel·lulars. No obstant, tant per la seva facilitat de síntesi, com per la seva inocuitat en l’aplicació sistèmica i la possibilitat de modificar de l’esquelet per tal de millorar la farmacocinètica i la biodistribució, les aplicacions terapèutiques basades en siRNA sintètics són les que es troben més avançades.

2. Vectors d’expressió. L’obtenció de vectors d’expressió de shRNA implica la clonació del shRNA davant d’una seqüència promotora de RNA polimerasa III. Això, permet la generació de múltiples molècules efectores, cosa que aporta un efecte més perllongat i potent que els siRNA sintètics. A més, en aplicacions in vivo, en les que es requereix quantitats superiors de siRNA, l’ús de vectors resulta molt més econòmic. Tot

- 51 -


i que és possible la generació de siRNA a partir de vectors d’expressió basats en promotors en tàndem o bidireccionals, el mètode més emprat per a generar molècules de RNAi a partir de vectors d’expressió són les shRNA (Figura 22). Els shRNA es poden expressar in vivo a partir dels promotors de snRNA, transcrits per la polimerasa III, U6 (147; 148) o H1 (149). Sota el control del promotor es troben les seqüències sentit i antisentit de el mRNA diana (19-29 nucleòtids cada una) unides per un hairpin (6-9 nucleòtids). L’inici de transcripció el marca una guanina, i la finalització, una seqüència de 4 o 5 timidines. Aquesta estructura en forquilla, d’uns 70-80 nucleòtids, similar als pre-miRNA, és reconeguda pel DICER i processada en una molècula del tipus siRNA (149) (Figures 21 i 22). La segona generació de vectors de RNAi es basa en la transcripció de shRNA incorporats en un trànscript quimèric de miRNA sota un promotor de RNA polimerasa II, que són processats per Drosha/DICER (150). Quan la supressió total del producte gènic resulta letal, l’ús de promotors induïbles o específics de teixit resulta crucial.

U6/H1 Sentit TTTT U6/H1 Antisentit TTTT U6/H1 Sentit Antisentit TTTTLlaç

U6/H1 U6/H1

Sentit

Antisentit

siRNA

shRNA

A

B

C

Hibridació DICER

U6/H1 Sentit TTTT U6/H1 Antisentit TTTT U6/H1 Sentit Antisentit TTTTLlaç AntisentitAntisentit TTTTLlaç

U6/H1 U6/H1

Sentit

Antisentit

siRNA

shRNA

A

B

C

Hibridació DICER

Figura 22. Obtenció de siRNA a partir de vectors d’expressió. La inclusió dels casets d’expressió de shRNA en vectors virals permet obtenir eficiències de transducció elevades i especificitat de teixit, ja sigui gràcies al tropisme natural o a través del pseudotipatge dels virus. Els vectors lentivirals (per la capacitat d’infecció de cèl·lules quiescents i d’integració del genoma viral, que assegura un expressió a larg termini), els adenovirals (pel seu tropisme hepàtic i facilitat d’obtenció) i adenoassociats (pel seu tropisme hepàtic i estabilitat) són els

- 52 -

Introducció

més emprats. No obstant, cada soca viral té els seus avantatges i inconvenients, tal i com s’ha descrit anteriorment (Taula 3). Disseny de seqüències efectores de siRNA Els primers estudis de silenciament amb siRNA en cèl·lules de mamífer van evidenciar una gran variabilitat en l’efectivitat de silenciament amb diferents seqüències contra una mateixa diana, de manera que només una fracció dels siRNA dissenyats resultaven eficients (151). Per tant, a part de la complementarietat amb el mRNA diana (que pot ser 3’ UTR, 5’UTR, però sobretot regió codificant), altres factors determinen la funcionalitat dels siRNA. Estudis exhaustius de correlació entre la seqüència del siRNA i la seva funcionalitat han trobat característiques en la seqüència que contribueixen de forma significativa al potencial de silenciament dels siRNA (152). Un d’aquests estudis ha ponderat l’efecte dels motius estructurals sobre la funcionalitat, establint així un sistema de valors per a seleccionar una seqüència eficient mitjançant l’assignació d’un valor a cada paràmetre (-1, 0 o 1) (Taula 5). S’ha proposat que un valor de 6 o més incrementa substancialment la probabilitat de silenciar efectivament el gen diana.

Criteri Valor si es compleix Valor si no es compleix Contingut en G i C: 30-50% 1 0 A o U a les posicions 15-19 5 (1 per cada posició) 0

No repeticions internes 1 0 A en posició 19 1 0 A en posició 3 1 0

U en posició 10 1 0 A o U en posició 19- 0 -1 No G en posició 13 0 -1

Taula 5. Criteris per al diseny d’una seqüènia de siRNA funcional. Adapatat de Reynolds A.D. et al. (2004) Nature Biotechnology A mesura que s’ha anat aprofundint en del coneixement el mecanisme d’acció dels siRNA i s’han realitzat estudis estadístics sobre seqüències de siRNA validades, s’han anat coneixent factors que poden determinar l’efectivitat d’una seqüència del siRNA, permetent el disseny racional de les seqüènies efectores. Alguns d’aquests factors es detallen a continuació:

1. Incorporació de la cadena guia a RISC.

- 53 -


La inestabilitat termodinàmica a l’extrem 5’ de la cadena antisentit del dúplex facilita que l’activitat helicasa hi actui preferentment i incorpori aquesta cadena al complex RISC (el que s’ha anomenat asimetria funcional del siRNA). Així, el disseny de siRNA amb un extrem 5’ inestable en la cadena antisentit (ric en A o U) n’afavoreix la incorporació de la cadena al RISC, incrementant la seva efectivitat. Pel contrari, quan la inestabilitat és major a l’extrem 3’ de la cadena, la funcionalitat del siRNA és menor degut a la ineficiència en la càrrega de la cadena antisentit al RISC (153). L’ús de seqüències de siRNA sintètics de 27-30 nucleòtids (D-siRNA) o shRNA de 29 nucleòtids pot aportar una major potència de silenciament que les seqüències equivalents de 21 nucleòtids (154; 155). Aquestes molècules són processades per DICER, donant lloc als siRNA efectors de 21 nucleòtids. S’ha especulat que l’increment en la potència de silenciació radica en la implicació de DICER en el mecanisme de processament dels D-siRNA i els shRNA, conferint una major eficàcia en la incorporació de la cadena guia a RISC. Sembla, doncs, que el traspàs de la cadena guia des de DICER cap al RISC és un pas determinant per a l’eficiència de silenciament.

2. Efectivitat del tall de el mRNA diana Les diferències d’activiat silenciadora entre diferents seqüències de siRNA contra un mateix mRNA poden també ser degudes a diferències en l’accessibilitat del complex RISC a la regió diana del mRNA, conseqüència d’estructures secundàries del RNA (151; 153). Per tant, estudis predictius de l’estructura secundària del mRNA diana podrien ajudar a millorar el diseny del siRNA. Existeixen múltiples algoritmes accessibles per al disseny de siRNA i shRNA que incorporen aquestes premises i altres regles com l’alineament de les seqüencies amb el GeneBank® per a descartar efectes inespecífics o off-target (Taula 6).

Laboratori URL Ambion www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html

Dharmacon www.dharmacon.com/DesignCenter/DesignCenterPage.aspx Dr. Hannon katahdin.cshl.org:9331/portal/scripts/main2.pl

Integrated DNA Technologies (IDT) scitools.idtdna.com/RNAi

Invitrogen rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress Dr. McMannus web.mit.edu/mmcmanus/www/home1.2files/siRNAs.htm

Quiagen www1.qiagen.com/Products/GeneSilencing/CustomSiRna/SiRnaDesigner.aspx Sfold Algorithm sfold.wadsworth.org.pl

Dr.Tuschl www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html Whitehead Institute jura.wi.mit.edu/siRNAext

Taula 6. Llocs web d’interès per al diseny de siRNA o shRNA efectius.

- 54 -

Introducció

Efectes deleteris que poden associar-se a l’ús de RNAi en mamífers En un principi, donada l’especificitat en el reconeixement de seqüència dels siRNA, es considerava el RNA d’interferència com a un fenòment lliure d’efectes secundaris. No obstant, a mesura que s’ha anat aprofundint en el coneixement del mecanisme silenciador dels siRNA i estudiant la seva aplicació en cèl·lules de mamífer, han anat apareixent possibles efectes deleteris derivats del mecanisme d’acció dels siRNA. En conseqüència, aquests són factors a tenir en compte, a part de la complementarietat i l’activitat contra el mRNA diana, a l’hora de dissenyar la seqüència de siRNA i d’avaluar el fenotip derivat d’un experiment de silenciació. A continuació es descriuen aquests efectes deleteris:

Silenciament inespecífic per complementarietat parcial (off-target)

Inicialment, el fenòmen de silenciament post-transcripcional s’havia descrit com a altament específic de seqüència; tant que, tot i poder existir una certa tolerància (144), només un desaparellament entre el siRNA i el mRNA diana podia arribar a abolir l’efecte de silenciament (140; 151). No obstant, l’any 2003 es va desciure, per primera vegada, l’existència d’un efecte off-target associat al RNAi; definit com a la silenciació inespecífica i dosi-depenent de gens no relacionats amb el gen diana (156). En aquells moments es desconeixia la causa d’aquests efectes off-target, aixecant les alarmes sobre l’especificitat del procés de silenciament mediat per siRNA. Estudis mecanístics posteriors van revel·lar que aquests efectes off-target estan associats a la complementarietat parcial entre la regió seed (tant de la cadena sentit com la antisentit) i regions 3’UTR en la gran majoria dels casos, però també amb regions codificants dels mRNA (157; 158). Aquests tipus de reconeixement del mRNA diana és una reminiscència del mecanisme dels miRNA. Per tant, aquest efecte off-target és dependent de seqüència, no pas del vector emprat per a vehiculitzar el siRNA (158), i implica l’activitat del RISC. El coneixement del mecanisme de silenciament ha permès l’adopció d’estratègies de prevenció i minimització de l’efecte off-target depenent de seqüència aplicables en el moment del disseny de la molècula efectora, basades en : a) el disseny in silico de seqüències minimitzant la homologia en la regió seed amb gens inespecífics i b) modificacions químiques de l’esquelet del nucleotídic del siRNA.

- 55 -


Activació de la resposta immune innata

Tot i que els siRNA són, en teoria, massa curts per a activar les vies de defensa enfront a RNA de doble cadena (Figura 20), s’ha descrit l’activació d’aquestes vies en resposta, tant a algunes seqüències de siRNA sintètics (159), com de vectors d’expressió de shRNA (160). Tot i que el mecanisme d’activació d’aquestes vies per siRNA o shRNA encara no està descrit completament, l’estimulació dels Toll like receptor (TLR) de forma dependent de seqüència sembla estar-hi implicada. Diferents grups han associat els motius 5’-GUCCUUCAA-3’ (161) i 5’-UGUGU-3’ (162) i 5’UGGC3’ (163) a aquest tipus de toxicitat. El disseny de seqüències de siRNA que no continguin aquests motius i la incorporació de modificacions químiques sobre l’esquelet nucleotídic del siRNA poden ajudar a evitar aquesta activitat inmunoestimulatoria.

Saturació maquinària endògena de processament miRNA

El fet que la maquinària de processament dels shRNA sigui compartida amb els miRNA endogens (Figura 21) pot comportar efectes tòxics derivats de la saturació d’aquesta maquinària compartida.

pre-miRNA

DICERDICER

Exp 5

shRNA

miRNA>>shRNA miRNA~shRNA miRNA<<shRNA

ToxicitatSilenciamentestable

RNAiineficient

SeqüènciaLongitudTempsDosi

Figura 23. Model de competició dels shRNA per saturació de la via endògena de processament dels miRNA. Adaptat de Grimm et al. (2006) Nature.

- 56 -

Introducció

Aquest tipus de toxicitat és dosi depenent, ja que implica la saturació de la maquinària de processament dels shRNA exogens i dels miRNA endogens a nivell de la Exportina-5 (Exp5) i té com a conseqüència la disminució dels nivells de miRNA endògens i de la seva funcionalitat, així com la desaparició progressiva dels siRNA processats i del seu efecte silenciador (164). La severitat de la toxicitat sembla estar determinada per la dosi (quantitat de shRNA processat per la cèl·lula), la persistència en el temps de l’expressió dels shRNA exogens i la seqüència de shRNA. Per tant, per a evitar aquest problema sembla ser necessari testar diferents dosis per a avaluar la capacitat endògena de processament dels siRNA i delimitar el llindar màxim a partir del qual els shRNA poden resultar tòxics (Figura 23). RNAi in vivo La vehiculització efectiva a la cèl·lula diana continua sent el principal repte de les aplicacions in vivo de la tecnologia de RNAi. En les aplicacions in vivo, l’administració sistèmica de siRNA sintètics nuus (no modificats) resulta altament ineficient: els siRNA nuus ténen una vida mitja de minuts en plasma, ja que són ràpidament degradats per endo- i exonucleases plasmàtiques i excretats pel filtrat glomerular renal. Aquest factor, sumat a la incapacitat del siRNA nuu sense modificar per a ser dirigit de manera específica al teixit diana després d’una injecció intravenosa, explica perquè menys de l’1% del siRNA és captat pel teixit diana. Algunes aproximacions per a superar aquestes limitacions farmacològiques inclouen modificacions químiques sobre l’esqulet del siRNA, la conjugació amb macromolècules de naturalesa catiònica i la inclusió en vectors no virals. Aquestes estratègies hi confereixen resistènica a nucleases, en milloren la biodistribució i/o la biodisponibilitat i permeten reduïr les dosis, i l’efecte off-target. L’ús de vectors virals de shRNA o de mètodes físics (com la injecció hidrodinàmica) també han aportat eficiències de transducció satisfactòries per a la validació de dianes terapèutiques en models animals.

Modificacions químiques sobre l’esquelet del siRNA Les modificacions químiques sobre l’esquelet del siRNA que s’han aplicat són les mateixes que en el passat s’havien emprat per a estabilitzar els oligonucleòtids antisentit (Figura 24) amb la salvedat que els siRNA han de mantenir els paràmetres estructurals a la cadena guia, per tal de permetre al RISC mantenir la seva activitat. A més, l’extrem 5’ de la cadena guia ha de mantenir-se lliure per permetre la seva fosforilació per RISC prèvia a la seva activació:

- 57 -


� Enllaç fosforotioat: la introducció d’enlaos fosfotioéster als extrems 3’ de la cadena sentit i antisentit confereix estabilitat enfront a exonucleases plasmàtiques. Aquestes són ben tolerades sense afectar la funcionalitat del siRNA.

� 2’-O-Metil: la substitució 2’-O-Metil-ribosil confereix estabilitat enfront a endonucleases plasmàtiques. Estudis recents han demostrat que la substitució d’un únic residu 2’-O-Metil-ribosil a la posició 2 de la cadena guia redueix molt eficientment la silenciació inespecífica de gens deguda a la complementarietat amb la regió seed, sense afectar a la funcionalitat del siRNA (144; 165). Les modificacions 2’-O-Metil són útils també per a minimitzar la estimulació de la resposata immune innata mediada per la interacció dels siRNA amb els TLR (166).

� siLNA (locked nucleic acid): són anàlegs de d’RNA amb un enllaç metilè entre la posició 2’ i 4’. Les modificacions LNA a la cadena sentit o a la regió 3’ de l’antisentit confereixen una major estabilitat en sèrum i redueix l’efecte off-target sense perdre la funcionalitat (167).

� sisiLNA (small internally segmented interfering locked nucleic acid): en aquetes molècules, la cadena sentit, a més de les modificacions LNA està fragmentada en dos segments. Aquestes noves molècules han reportat una gran persistència de l’efecte in vivo (168).

OO base

O

PO O- OH

OO base

O

PO S- OH

OO base

O

PO O- O

CH3

OO base

O

PO O- O

No modificat Fosfotioat 2’O-metil LNA

3’ 5’3’5’

Enllaç fosfotioat

2’-O-MetilLNA

Figura 24. Estructures químiques de les modificacions sobre els enllaços fosfodiéster i la ribosa als siRNA. El panell inferior es mostra un esquema d’un siRNA modificat químicament per a millorar la seva estabilitat en sèrum i minimitzar els efectes deleteris.

- 58 -

Introducció

Conjugació dels siRNA

La conjugació dels siRNA amb macromolècules o la seva inclusió en vectos no virals, de naturalesa polimèrica o lipídica, confereix resistència enfront a les nucleases plasmàtiques i evita la seva fitració glomerular. S’incrementa així l’estabilitat i la vida mitja en cirulació, permetent que els complexos s’introdueixin de forma passiva preferentment als teixits vascularitzats com el fetge, pulmó, melsa, ronyó o teixit tumoral angiogènic. El repte es troba en aconseguir la captació selectiva del siRNA pel teixit diana. Només en cas que els conjugats o complexos incorporin un lligand específic per a un receptor de membrana, l’entrada a la cèl·lula serà activa (per endocitosi mediada per receptor) i exclusiva en aquelles cèl·lules que l’expressin. Les estratègies de vehiculització dels siRNA sintètics més exitoses són:

� Colesterol: la conjugació del siRNA amb colesterol a la regió 3’ de la cadena sentit en millora l’estabilitat al fluxe sanguini i, per tant, les propietats farmacocinètiques (els conjugats de colesterol s’uneixen a la albúmina sèrica, protegint el siRNA de les nucleases plasmàtiques i de la filtració al ronyó) i la biodisponibilitat (gràcies gràcies a la lipofilicitat aportada pel colesterol). No obstant, la manca d’una vehiculització selectiva al teixit diana continua sent una limitació en aquesta estratègia, fent necessàries dosis no farmacològiques (50 mg/Kg) per a obtenir efectes terapèutics (169).

� Lipoplex: l’us de lípids catiònics per a mediar l’entrada a la cèl·lula in vitro éstà molt extès. No obstant, cal extremar les precaucions en el seu ús in vivo, ja que aquest tipus de vectors poden induir la via d’interferó (162).

� Liposomes: la encapsulació dels siRNA en liposomes (SNALP,Stable nucleic Acid LipidParticle; comercialitzat per Invitrogen, o Smarticles; comercialitzades per IDT) estabilitza els complexos en la circulació,incrementant-ne la vida mitja. L’epiteli fenestrat de fetge facilita la captació passiva dels complexos circulants, afavorint l’acumulació quasi exclusiva i total al fetge després d’una única injecció intrvenosa a dosis farmacològiques (1-4 mg/kg). Aquesta estratègia ha mostrat activitat terapèutica a mig termini (fins a 11 dies) en models primats no humans d’hipercolesterolèmia amb un siRNA contra ApoB (170). Roman pendent d’explorar si aquestes formulacions poden vehiculitzar els siRNA a teixits extrahepàtics.

� Atelocol·lagen: la barreja de siRNA amb atelocol·lagen (producte de la digestió del col·lagen amb pepsina) sembla estabilitzar el siRNA al sèrum, allargant fins a tres vegades

- 59 -


la vida mitja del complex respecte del siRNA nuu, i propociona una biodistribució preferencial al tumor, per mecanismes no descrits (171).

� Nanopartícules de polímers catiònics: d’entre els polímers catiònics, el PEI és el més emprat per a vehiculitzar siRNA. La compactació de siRNA amb PEI resulta en nanopartícules d’uns 100 nm que, estabilitzat amb PEG i unit a un lligand específic de teixit tumoral, aconseguí una més selectiva i eficient captació pel teixit tumoral (172). No obstant, igual que els lípids catiònics, el PEI pot contribuir a l’efecte tòxic independent de seqüència(173). D’altra banda també s’ha reportat la hiperreativitat deguda a la generació d’anticossos en resposta a l’exposició a nanopartícules estabilitzades amb PEG (174; 175). Nanopartícules capaces de mediar endocitosi mediada per receptor d’una forma i eficient, estables en fluids fisiològics sense PEG en la seva formulació podrien bypassar aquestes limitacions. A l’addendum del present treball s’aprofundirà més en aquest aspecte.

� Protamina-Fab: la unió per forces electrostàtiques del siRNA a proteïnes de fusió compostes per protamina-regió Fab d’un anticòs específic d’un antígen (receptor) de membrana han permès vehiculitzar els siRNA cap a una població cel·lular tumoral (176) o de limfòcits T (177), però no a altres teixits, després de la injecció intravenosa del complex amb unes dosis farmacològiques (1-4 mg/Kg). Calen, però, estudis que aprofundeixin sobre la biodistribució i toxicitat del vector.

� Immunoliposomes: Són la última sofisticació i consisteixen en liposomes amb un anticòs específic a la superfície, amb la filnalitat d’aconseguir l’entrada del siRNA a la cèl·lula diana. Aquests liposomes s’han mostrat capaços de mediar in vivo la internalització del siRNA específicament a una població cel·lular limfocitària amb alta eficiència i selectivitat després d’una injecció sistèmica (178). L’avantatge d’aquests liposomes radica en la gran capacitat de càrrega de siRNA per partícula, l’estabilitat en circulació que el liposoma confereix al siRNA i la gran selectivitat en la biodistribució que l’anticòs confereix al sistema.

Aplicacions terapèutiques basades en RNA d’interferència La tecnologia del RNA d’interferència ha revolucionat la investigació biomèdica, fent realitat la promesa de 20 anys d’estratègies antisentit i permetent, a través de la silenciació gènica, identificar la funció dels gens i validar-los com a potencial diana terapèutica. No es d’estranyar, doncs, que nombroses companyies farmacèutiques estiguin ja invertint capital i esforços en desenvolupar teràpies basades en la tecnologioa del RNAi, algunes de les quals han arribat ja a fases avançades

- 60 -

Introducció

d’estudi clínic. En els darrers anys s’ha publicat una miríada de treballs en els que s’ha emprat la tecnologia del RNAi com a estratègia terapèutica (179; 180). La taula 7 recopil·la els estudis més significatius en els que s’ha aplicat la tecnologia de RNAi per a la silenciació d’un gen endogen en un model de malatia.

Model Diana Òrgan Vehicle Ruta Efector Ref. Infecció

Hepatitis B HBV Fetge SNALP i.v. siRNA (181) Ebola Ebola-L Fetge PEI i.p. siRNA (182)

Apoptosi Hepatitis Fas Fetge IH siRNA (183)

Hepatitis B Caspasa 8 Fetge IH shRNA (184) Inflamació

Colitis TNF� Colon Lipoplex i.r. siRNA (185) Malalties neurodegeneratives

Esclerosi amieloide lateral SOD1 Local Lentivirus i.m. shRNA (186)

Ataxia espinocerebral Ataxina 1 Local AAV i.c. shRNA (187) Hungtinton Hungtintina Local AAV i.c. shRNA (188) Alzheimer BACE1 Local Lentivirus i.c. shRNA (189)

Metabolisme Obesitat AGRP SNC i.c. siRNA (190)

Hipercolesterolemia ApoB Fetge Colesterol iv. siRNA (169) Hipercolesterolemia ApoB Fetge SNALP i.v. siRNA (170)

Tumors

Sarcoma de Ewing EWS-FL1 Tumor Nanopartícula-Transferrina i.v. siRNA (191)

Xenograft subcutani VEGF Tumor Atelocol·lagen i.v. siRNA (192) Xenograft Gp160 Tumor Protamina-Fab i.v siRNA (176)

Affeccions oculars NVC VEGF Ull salí i.vt. siRNA (193) DME VEGF Ull Lipoplex i.vt. siRNA (194)

Taula 7. Selecció d’exemples d’aplicacions terapèutiques de RNAi en mamífers.

DM; degeneració macular, IH; Injecció hidrodinàmica, i.p.; Injecció intraperitonial, i.c.; Injecció intracraneal, s.c.; Injecció subcutania, i.m. Injecció Iitramusculat, i.r.; Injecció intrarectal, i.n. administració intranasal, i.vt. injecció intravitreai.eps. injecció intraespinal, AGRP; Agouti related peptide, NVC Neovascularització coroidal induïda per làser, DME degeneració macular induïda per làser. El potencial terapèutic de les estratègies basades en RNA d’interferència està compromès per l’eficiència en el delivery en termes de dosi, especificitat i estabilitat en fluids fisiològics, en el cas de la molècula sintètica; i en termes de seguretat, en el cas de l’ús de vehicles virals i no virals. És per aquesta raó que els estudis que han arribat a fase clínica són aquells basats en aplicacions locals, mentre que els esforços per a les aplicacions sistèmiques es centren en la optimització de la vehiculització al teixit diana.

- 61 -


La facilitat de transfecció del fetge tant per mètodes virals com no virals (siRNA o shRNA) n’ha facilitat la validació de dianes farmacològiques actives en aquest òrgan. De fet, les primeres demostracions del potencial terapèutic de la tecnologia dels siRNA in vivo va venir de la mà de Song (183) i Zender (195), els quals van van demostrar que la injecció hidrodinàmica de siRNA proporcionava quasi un 100% de silenciació en fetge in vivo contra dianes endògenes (receptor de Fas i caspasa 8, respectivament), protegint contra el dany hepàtic en models animals de toxicitat aguda. No obstant, aquest mètode de transfecció proporciona una limitada eficiència de transducció i una expressió de curta durada (196). El tropisme dels adenovirus recombinants cap al fetge (197) ha permès el delivery de shRNA en fetge de forma més eficient i relativament mes persistent, permetent estudis de validació de dianes. .

- 62 -

OBJECTIUS

Objectius

La producció de glucosa hepàtica està sotmesa a un estricte control hormonal i de substrats (198). En individus sans, la gluconeogènesi hepàtica és responsable de fins a un 90% de la glucèmia en dejuni (199). En individus diabètics, l’increment de la gluconeogènesi hepàtica, secundària a la resistència a insulina o a la manca de secreció de la hormona, repercuteix de forma directa sobre l’homeòstasi de la glucosa (100). A més, s’ha observat una relació directa entre la sobrexpressió de PEPCK-C, l’increment de la producció hepàtica de glucosa i el desenvolupament d’hiperglucèmia en models animals (101; 102). Malgrat aquest conjunt d’evidències, la validació de PEPCK-C com a diana terapèutica per a disminuir la producció hepàtica de glucosa en la diabetis no ha estat investigada en profunditat fins al moment. Una intervenció sobre PEPCK-C amb aquesta finalitat hauria de ser, sota en nostre criteri, específica de fetge per vàries raons. D’una banda, la delecció sistèmica de l’enzim resulta letal (93; 95). D’altra banda, la rellevància de l’enzim sobre el metabolisme energètic, no només al fetge, sinó a teixits extrahepàtics, ha estat recentment demostrada en models murins de genossupressió i transgènesi de l’enzim (87-89; 98). Finalment, la inhibició farmacològica de l’activitat PEPCK-C, amb un inhibidor no competitiu de l’enzim com és l’àcid 3-mercaptopicolínic (SK&F 34288, Smith Kline & FrenchLaboratories), redueix la producció hepàtica de glucosa (200) i la glucèmia (201), efecte que va acompanyat d’acidosi làctica, segurament secundària a la inhibició de l’activitat enzimàtica al ronyó. No obstant, una gran controvèrsia ha esdevingut en els últims anys sobre la preponderància de la gluconeogènesi hepàtica en el control de la glucèmia. Els estudis amb ratolins genosuprimits per PEPCK-C hepàtica han demostrat que la supressió de l’enzim de manera específica al fetge, aboleix la gluconeogènesi sense afectar al control de la glucèmia en repòs (93; 95; 96), i han demostrat la rellevància de l’activitat PEPCK-C en el metabolisme energètic a través del manteniment del flux del cicle de Krebs (94; 97). Amb aquests precedents, ens vam interessar per estudiar els efectes aguts sobre l’homeòstasi energètica i de la glucosa derivats la modulació de l’activitat PEPCK-C hepàtica a fi de validar aquest enzim com a una possible diana per a una estratègia terapèutica per a controlar la hiperglucèmia diabètica. Per a assolir aquest objectiu general, s’ha aplicat tècniques de RNA d’interferència sobre diferents models animals de la patologia diabètica. Els objectius concrets del present treball són:

- 65 -

Objectius

1. Disseny i validació de seqüències actives i segures d’RNA d’interferència contra la PEPCK-C de ratolí.

2. Vehiculització selectiva i efectiva de les molècules d’RNA d’interferència al fetge. 3. Silenciació in vivo de PEPCK-C hepàtica de forma específica i exclusivament al fetge.

4. Avaluació de la rellevància directa de la PEPCK-C sobre el control de la glucèmia mitjançant la reducció de l’activitat PEPCK-C hepàtica en un model animal lliure de l’acció de la insulina.

5. Avaluació de l’impacte sobre l’homeòstasi de la glucosa i la sensibilitat a insulina de la

reducció de l’activitat PEPCK-C hepàtica en el context de diabetis tipus II. 6. Avaluació de l’impacte sobre l’homeòstasi energètica de la silenciació de la PEPCK-C en

fetge en el context de la diabetis tipus II.

7. Estudiar els possibles mecanismes de regulació de la via gluconeogènica hepàtica en resposta a la reducció de la PEPCK-C al fetge.

- 66 -

RESULTATS

CAPÍTOL 1

Disseny de seqüències de shRNA i estudi de l’efecte sobre l’homeòstasi de la glucosa de la silenciació de PEPCK-C al fetge

de ratolins diabètics en absència d’insulina

Capítol 1: Introducció

INTRODUCCIÓ

Donat el potencial teòric de disminuir la producció hepàtica de glucosa a través d’una intervenció puntual a nivell de PEPCK-C, ens vam proposar l’objectiu de reduir el contingut hepàtic de PEPCK-C. Per a valorar el reflex de la reducció de l’activitat PEPCK-C sobre la glucosa post-absortiva vam utilitzar un model murí de diabetis tipus I, com és la diabetis induïda per estreptozotocina. La manca d’insulina en aquest model ens ha de permetre, teòricament, dilucidar de manera directa els efectes de la reducció de PEPCK-C al fetge sobre l’homeòstasi post-absortiva de la glucosa, determinada principalment pel flux gluconeogènic. Per a disminuir el contingut de PEPCK-C de forma específica al fetge es va optar per la tecnologia del RNA d’interferència. La injecció hidrodinàmica va ser el primer mètode d’elecció per a la introducció de siRNA sintètics (202) i de vectors d’expressió de shRNA (203) a fetge. La primera constatació de silenciament d’un gen cromosòmic endogen en un model animal in vivo emprant shRNA va venir del laboratori del Dr. Hannon (204). Aquests autors demostraren que, mitjançant la injecció hidrodinàmica de vectors d’expressió de shRNA (pSHAG), es pot arribar a obtenir una silenciació quasi completa de la proteïna verda fluorescent (GFP) en fetge de ratolins transgènics. Un estudi coetani, comparatiu entre shRNA de diferents longituds van demostrar que els shRNA de 29 nucleòtids de llargària eren més eficients que els de 21 nucleòtids (147) per una raó encara no dilucidada. Per tant, per a silenciar de forma específica la PEPCK-C hepàtica en models murins es va optar per emprar l’aproximació de la injecció hidrodinàmica (per la seva versatilitat) de vectors d’expressió de shRNA amb una seqüència de 29 nucleòtids d’homologia al mRNA diana, en aquest cas Pck1 (per la seva major eficiència respecte als de 21 nucleòtids).

- 71 -

Validació de seqüències de shRNA contra la PEPCK-C

RESULTATS

Disseny i generació de vectors d’expressió de shRNA dirigits contra PEPCK-C Per a dur a terme l’objectiu de validar la silenciació de PEPCK com a diana terapèutica per la diabetis, el primer pas necessari és generar les eines que permetin abordar els reptes experimentals plantejats. En el present estudi, pels motius explicats a l’apartat introductori del present capítol, es va optar pel disseny de vectors d’expressió de shRNA de 29 nucleòtids. Quan ens plantegem l’ús de la tecnologia d’RNA d’interferència per a silenciar el gen objecte del nostre estudi, l’ús de hRNA ofereix, respecte de l’ús de siRNA sintètics, la possibilitat d’obtenir les molècules efectores a partir d’un vector d’expressió, amplificant-ne la potència i la durada de l’efecte. No obstant, requereix la generació prèvia dels vectors d’expressió. Per a obtenir vectors d’expressió de shRNA cal clonar una seqüènica codificant per la cadena sentit i l’antisentit del shRNA unides per un linker en un vector d’expressió sota el control d’un promotor adequat (Figura 22 i 25). Addicionalment, donat que no totes les seqüències de siRNA dissenyades aporten la mateixa eficiència de silenciament, és recomanable testar la capacitat de silenciament de més d’una seqüència i seleccionar aquella que aporti major eficiència a una dosi menor. Les seqüències de shRNA emprades en el present treball es van dissenyar emprant l’algoritme publicat pel grup del Dr. Greg Hannon (147; 204) que es pot trobar a la pàgina http://katahdin.cshl.org:9331/homepage/portal/scripts/main2.pl. Es van dissenyar dues parelles d’oligonucleòtids de DNA codificants per shRNA dirigits contra la regió codificant de la PEPCK-C de Ratus novergicus i de Mus musculus. Els oligonucleòtids dissenyats es van designar, en funció de la localització de l’inici de la regió d’homologia comptant a partir de codó d’inici del cDNA de Pck1, 482 i 664 respectivament. La seqüència nucleotídica de cada parell d’oligonucleòtids es detalla a la secció de Materials i Mètodes. Aquests oligonucleòtids tenen una seqüència tal, que en ser transcrits es genera un RNA amb una estructura de forquilla on, de 5’ a 3’, hi trobem una seqüència antisentit de 29 nucleòtids - el loop- i la seqüència sentit (Figura 25 B). Per a evitar plegaments de les cadenes sobre si mateixes degut a complementarietats internes entre la regió sentit i antisentit de l’oligonucleòtid, fet que dificultaria l’anellament correcte dels oligonucleòtids durant el clonatge, l’algoritme introdueix alguns aparellaments G-U a la seqüència sentit (en vermell a les seqüències de shRNA de la Figura 25 A). Aquestes modificacions en la seqüència de l’oligonucleòtid impedeixen l’anellament entre bases de DNA, però no entre bases de RNA. Per tal de facilitar la selecció dels

- 72 -

Capítol 1: Resultats

clons positius (aquells que hagin introduït les seqüències al plasmidi pSHAG-1), la forquilla que connecta la regió sentit amb l’antisentit conté una diana de restricció HindIII (Figura 25 A). Cada parella (A i B) d’oligonucleòtids es van anellar i en van clonar en un plasmidi d’expressió (pSHAG-1) que conté el promotor del gen U6 humà (snRNA present als splicesomes), transcrit per RNA polimerasa III. El clonatge es va fer al les dianes BserI i BamHI de pSHAG-1 gràcies a la inclusió, als extrems 3’ i 5’ dels oligonucleòtids, de les bases adequades per tal de generar extrems cohesius amb aquestes dianes. Les construccions resultants es van anomenar pSHAG-482 i pSHAG-664, respectivament. Com a seqüència control inespecífica, es va emprar un shRNA específic per al mRNA de la luciferasa de Photinus Pyralis (pSHAG-Ff), cedit pel laboratori del Dr. Hannon.

L1

L2

Kan R

pUC ori

BseRI

BamHI

shRNAPromotor hU6

L1

L2

Kan R

pUC ori

BseRI

BamHI

shRNA

L1

L2

Kan R

pUC ori

BseRI

BamHI

shRNAPromotor hU6

L1

L2

Kan R

pUC ori

BseRI

BamHI

shRNA

GAA5’ ACAUGCUGGCCACCACAUAGGGCGAGUCU G

UGU

GCGGCCGGUGGUGU UGCUC

GAGUCG UCUCGGUG GCUA

UUAGA GGA UA UU

SentitTTTTT* * * *

*Sentit

TTTTT* * * *

*Sentit

TTTTT* * * *

*Sentit

TTTTT* * * *

*

AUCC AGA C3’UGG GUU

GAA 5’ GGAUUCCAAUUCAGCGGGAGCCACCUGAU G

CCUAAGGUU C G C3’ UAA GUU

GAA5’ GAAGGAGAUGAUCUCUCUGCGGUCCGGGA G

CUUCCUCUA G CGC GGCC C3’ UGG GUU

shRNA Ff

shRNA 482

shRNA 664

Antisentit (guia) HindIIIT

A per GC per T


A per GC per T

5’ 3’Antisentit (guia) HindIII

T

A per GC per T


A per GC per T

5’ 3’

A

B C

Figura 25. Vectors d’expressió de shRNA dissenyats. A: Disseny dels oligonucleòtids de shRNA. Els asteriscs indiquen la modificació de bases en la cadena sentit per a evitar aparellaments entre la cadena sentit i antsentit dels oligonucleòtids de DNA durat el clonatge. La representació correpon a l’oligonucleòtid A B: Plasmids pSHAG codificants per les seqüències de shRNA. C: Seqüències dels shRNA contra PEPCK-C de rata i ratolí (codificat per pSHAG-482 i pSHAG-664) i del shRNA control contra la luciferasa de Photinus pyralis (codificat per pSHAG-Ff). Per a obtenir un efecte de silenciació específic sobre el gen diana és essencial descartar possibles efectes de silenciament inespecífic o off-target depenents de seqüència. Aquest tipus de silenciació off-target s’explicaria per dos factors: a) tolerància en front a aparellaments incorrectes puntuals entre el mRNA diana i el siRNA (144; 151) i b) el reconeixent entre la regió seed dels siRNA i els 3’UTR d’un gen no específic (157; 163). Per tal d’assegurar la selectivitat de les seqüències dissenyades pel

- 73 -

Validació de seqüències de shRNA contra la PEPCK-C

mRNA diana vàrem voler descartar una possible homologia de les seqüències dels shRNA Ff, 482, 664 amb altres gens dels genomes de Mus musculus i Rattus novergicus. Per a això es va fer un MEGABlast (alineament de seqüències petites) contrastant les seqüències sentit i antisentit dels shRNA amb les seqüències de mRNA del GenBank d’ambdues espècies. En cap cas es van trobar homologies superiors al 50%, ni corresponents a la regió seed amb cap regió codificant diferent de Pck1 en ambdues espècies descartant, teòricament, la possibilitat de tenir efectes off-target.

Silenciament de la PEPCK-C mitjançant shRNA in vitro

Per confirmar la funcionalitat i especificitat de les seqüències dissenyades in vitro, es va emprar la línia cel·lular d’hepatoma humà Huh7, que no expressa endògenament PEPCK. Es van realitzar experiments de co-transfecció del plasmidi d’expressió de PEPCK-C amb les diferents construccions de plasmidis pSHAG a diferents relacions molars. La capacitat de silenciament dels dos shRNA es mostra a la Figura 26.

pC/PEPCKpSHAG-FfpSHAG-664

+ ++ + �+ � � � +� + + � �

pSHAG-482� + + � ��

� ��

PEPCK-C

MAPK

+ + pC/PEPCKpSHAG-FfpSHAG-664

+ ++ + �+ � � � +� + + � �

pSHAG-482� + + � ��

� ��

PEPCK-C

MAPK

+ +0

25

50

75

100

125

Act

ivita

t PE

PC

K(u

nita

ts re

lativ

es)

Figura 26. Silenciament in vitro de PEPCK pels vectors pSHAG-482 i pSHAG-664. Una quantitat constant del plasmidi pC/PEPCK-C (2.25 �g) es va co-transfectar amb diferents coeficients molars de pSHAG-482, pSHAG-664 (1:0, 1:6 i 1:12) o pSHAG-Ff (a una relació molar 1:12). Com a control intern de transfecció es va afegir a cada barreja de transfecció una quantitat constant de pGL3 (1 �g). Com a vector de transfecció es va emprar PEI. Passades 48 hores, es van mesurar les activitats enzimàtiques PEPCK i luciferasa. L’activitat enzimàtica PEPCK es va normalitzar per l’eficiència de transfecció (estimada per l’activitat luciferasa) i s’expressa com la relació activitat PEPCK/activitat luciferasa (A). L’efecte de silenciació es va confirmar sobre el contingut proteic de PEPCK-C per Western blot (B).

- 74 -


Tant els nivells de proteïna com l’activitat enzimàtica va disminuir en presència de pSHAG-664 i pSHAG-482, arribant a un llindar màxim d’un 80%. En comparació, pSHAG-482 resultà menys eficient a les mateixes proporcions, però sobretot, va aportar un silenciament menys reproduïble entre els diferents experiments realitzats. Aquest experiment previ suggereix la millor idoneïtat de la seqüència 664 per a la silenciació de PEPCK-C. En contraposició, pSHAG-Ff no altera l’activitat enzimàtica relativa, ni la quantitat de proteïna PEPCK-C citoplasmàtica, confirmant que l’efecte és específic de seqüència. Addicionalment, l’observació que, a grans trets i salvant la variabilitat en l’eficiència de transfecció interexperimental (que depèn de múltiples factors), l’activitat luciferasa disminueix en les co-transfeccions amb pSHAG-Ff i manté constant en les co-transfeccions amb pSHAG-482 i pSHAG-664 (Figura 27) suggereix també que la silenciació dels shRNA Ff, 482 i 664 és específica. Finalment, cap de les seqüències utilitzades sembla estar induint toxicitat, com evidencien els nivells estables del normalitzador endogen MAPK.

pC/PEPCKpSHAG-FfpSHAG-664

+ ++ + �+ � � �� + + � �

pSHAG-482� + + � ��

+ +� ��

�

0

100

200

300

400

500

600

Act

ivita

t luc

ifera

sa(R

LU/m

g pr

ot)

Figura 27. Silenciament in vitro de luciferasa pel vector pSHAG-Ff. Activitat luciferasa mesurada en els extractes cel·lulars obtinguts tal i com es descriu a la figura 15.

Avaluació de la funcionalitat dels vectors pSHAGs in vivo transduïts mitjançant la tècnica de transferència gènica hidrodinàmica El mètode d‘injecció hidrodinàmica es basa en la injecció intravascular d’un gran volum de solució salina que conté el DNA nuu. La primera demostració de que la pressió hidrostàtica pot incrementar

- 75 -

Validació de seqüències de shRNA contra PEPCK-C

l’eficiència en la transferència gènica als hepatòcits in vivo la va donar Budker et al. en 1996 (205) mitjançant una injecció intraportal d’un mil·lilitre de solució en ratolins. Adaptacions de la metodologia per a transfectar el fetge en altres models animals (rata i gos) (206), múscul esquelètic en rata (207) i primats (208) han estat també explorades. La injecció hidrodinàmica a la vena caudal va ser descrita per primera vegada per Liu et al. (209) seguit molt d’aprop per Zhang et al. (210). Es tracta d’una injecció ràpida (entre 5 i 8 segons) d’una solució salina (10% v/p) de DNA nuu a través de la vena caudal i proporciona una transducció transitòria de fins a un 40% dels hepatòcits. També es transdueixen, amb una eficiència 4-5 ordres de magnitud inferior altres òrgans, com el ronyó, el pulmó, la melsa i el cor. Un cert grau de dany hepàtic agut es reflexa en un increment de transaminases sèriques, però ràpidament (al segon dia després de la injecció) torna a nivells basals. Estudis cinètics i de biodistribució demostren que, després de la injeció intravenosa de baix volum, el DNA és ràpidament degradat per les nucleases plasmàtiques i s’acumula a les cèl·lules hepàtiques no parenquimals (Figura 28). En canvi, la injecció hidrodinàmica, tot i tenir una cinètica similar, proporciona una ràpida internalització del DNA als hepatòcits (196; 209).

Lewis et al (2005) Methods Enzymol Figura 28. Localització hepàtica d’un plasmidi injectat intravenosament a la vena de la cua. Quan el plasmidi fluorescent és injectat amb un volum baix (foto de l’esquerra), aquest, o els seus productes de degradació, s’acumulen a cèl·lules no parenquimals (s). Quan la injecció és hidrodinàmica (foto de la dreta) el DNA és capat principalment pels hepatòcits (h). El volum injectat a la vena caudal desemboca a la vena cava, el flux injectat sobrepassa la capacitat cardíaca causant un increment de la pressió, que resulta en un flux retrògrad cap al fetge a través de la vena hepàtica. L’estructura flexible del fetge pot assimilar grans volums, equilibrant la pressió hidrostàtica i permetent l’accés del DNA als hepatòcits a través de l’epiteli fenestrat dels seus capil·lars (Figura 29). El mecanisme exacte pel qual el DNA entra als hepatòcits no ha estat del tot dilucidat. Diversos estudis apunten a que l’entrada als hepatòcits està mitjançada per un procés físic no específic (211) batejat com a “hidroporació” per Zhang et al. (212) en el que l’alta pressió

- 76 -


provocada per la injecció causaria petits porus a la membrana dels hepatòcits fent-los hiperpermeables al DNA (213).

Figura 29. Injecció hidrodinàmica a través de la vena cauda i detall de l’epiteli hepàtic fenestrat.

Comparat amb altres mètodes no virals, el mètode de transferència gènica hidrodinàmica resulta molt atractiu en termes d’eficiència, reproducibilitat i simplicitat (214). No obstant, l’aplicabilitat d’aquest mètode a la clínica humana presenta moltes dificultats, principalment l’escalabilitat dels volums a injectar. Les aplicacions més destacables de la transferència gènica hidrodinàmica inclouen, sobretot, l’avaluació del potencial terapèutic de determinats gens in vivo, (especialment proteïnes de secreció, convertint el fetge en una plataforma productora de la potencial proteïna terapèutica), l’estudi de nous vectors i elements de transferència gènica, així com l’ús de la metodologia per a l’estudi de la transferència d’elements no plasmídics, entre els que s’inclouen els siRNA i els vectors de shRNA, que ja ha estat aplicada a models murins amb finalitats terapèutiques (203; 215). En tots els experiments in vivo d’aquest capítol les injeccions dels plasmidis es fan per injecció hidrodinàmica, sguint el protocol detallat a la secció de Material i Mètodes.

- 77 -


Inicialment, es va testar la funcionalitat del promotor U6 humà per a transcriure els shRNA in vivo en un sistema murí i, en definitiva, la capacitat de les construccions de shRNA per a silenciar una diana exògena al fetge. Per a assolir aquest objectiu es va co-injectar un vector d’expressió de la luciferasa de Photinus pyralis (pGL3) juntament amb els pSHAG. L’activitat luciferasa detectada es va reduir en un 98% en els fetges dels animals tractats amb pSHAG-Ff en comparació amb els tractats amb el pGL3 sol o conjuntament amb el shRNA no específic per la luciferasa (Figura 30). En canvi, en altres teixits, com el ronyó, no es va detectar activitat luciferasa en cap condició. Aquest experiment, demostrà, un cop més, l’especificitat de de les seqüènices envers la diana silenciada i la idoneïtat del tàndem transfecció hidrodinàmica- vectors pSHAG per al silenciament in vivo d’una diana de forma específica al fetge, validant el sistema experimental que s’aplicarà en els experiments següents.

pGL3

pSHAG-Ff

+ + �

� + �pSHAG-664+ � +

pGL3

pSHAG-Ff

+ + �

� + �pSHAG-664+ � +

**

0

10

150

200

250

Act

ivita

t luc

ifera

sa(U

RL/

mg

prot

)

Figura 30. La transferència gènica hidrodinàmica de vectors d’expressió de shRNA facilita la interferència d’RNA exogen a fetge. Es va injectar a la vena de la cua de ratolins diabètics (ICR (CD1) STZ+) 10 μg de pGL3 amb o sense un shRNA específic (pSHAG-Ff) o inespecífic (pSHAG-664) per la luciferasa en una proporció 1:6. Setanta-dues hores després es va fer un assaig d’activitat luciferasa en extractes de fetge. Les dades representen les mitges ± ES , n=3; ** p< 0.01; test t de Student.

Toxicitat induïda per la injecció hidrodinàmica i/o els shRNA En cèl·lules de mamífer, el RNA de doble cadena de longitud superior a 30 nucleòtids indueix una resposta a estrès, activant la via de PKR/interferó/RNAsaL, que desemboca en un bloqueig inespecífic de la síntesi de proteïnes, degradació del RNA i mort cel·lular per apoptosi. Malgrat tot, s’ha descrit que determinades seqüències de siRNA sintètics, així com de vectors de shRNA poden, en alguns casos, activar aquestes vies in vitro (159; 160) i, fins i tot, induir mortalitat in vivo (164). La

- 78 -


causa d’aquest efecte tòxic no ha estat ben determinada, però sembla que hi estan implicats els Tolllike receptors (TLR). Recentment s’ha trobat una correlació entre la presència de motius 5’UGGC3’, i toxicitat cel·lular, especialment quan aquest motius es troben a la cadena guia del siRNA (163). Les seqüències de shRNA Ff i 482 emprades en el present treball contenen el motiu 5’UGGC3’ a la cadena acompanyant (Ff) i a ambdues cadenes (482), respectivament. Vam voler descartar un possible efecte tòxic induït per les seqüències de shRNA in vivo. Els ratolins van ser injectats mitjançant la tècnica hidrodinàmica amb una dosi alta (100μg) dels vectors pSHAG i, a continuació,

es van analitzar: a) l’activació de la via de PKR mesurant els nivells de fosforilació d’eIF2� en fetge

(eIF2�-P/eIF2� total) (159), b) l’activació de la via d’IFN� (216), mesurant els nivells d’IL-12 en sang

i c) la inducció d’apoptosi al fetge, mesurant l’activitat caspasa 3 en extractes hepàtics. Tal i com s’il·lustra a la figura 31, la injecció de poli-dI:dC sintètic (C+) indueix entre 3 i 26 vegades la

fosforilació d’eIF2�, comparat amb els tractaments control salí (C-). En canvi, la injecció dels vectors

pSHAG-Ff i pSHAG-664 no induí en cap cas la fosforilació d’eIF2�. D’altra banda, no es van trobar

alteracions associades a l’expressió dels shRNA en els nivells de IL-12 circulants (dada no mostrada), descartant l’activació de la via d’interferó. A més, tal i com il·lustra la figura 32, en cap cas es va trobar activitat caspasa 3 per sobre dels nivells basals.

24h 48h 72h0.00

0.25

0.50

0.75

1.00 C+pSHAG-FfpSHAG-664C-

eIF2�

-P/ e

IF2�

Figura 31. La via de PKR no s’activa en resposta al tractament amb pSHAG in vivo. Ratolins diabètics (ICR (CD1) STZ+) van ser injectats amb una dosi alta (100 μg) de cada un dels pSHAGs mitjançant la injecció hidrodinàmica. Com a control positiu de la inducció de la via de PKR (C+) es va injectar els ratolins amb 50 �g de poli dI:dC, un anàleg de RNA de doble cadena, intraperitonialment. El grup control negatius (C-) el conformen ratolins injectats amb salí fisiològic intraperitonialment. A les 24, 48 i 72 hores després dels respectius tractaments el contingut hepàtic de eIF2� i P-eIF2� va ser analitzat per Western blot i quantificat per densitometria. L’activació d’eIF2� es valora com a la relació entre la forma fosforilada i la total. Les dades es presenten com l’activació d’eIF2� en relació al control positiu, (n=5).

- 79 -


La transferència gènica hidrodinàmica també indueix dany hepàtic, que es reflexa en un pic de transaminases en sèrum, que torna als nivells basals entre 48 i 72 hores post-injecció (210). Els estudis mecanístics publicats envers a la injecció hidrodinàmica s’han realitzat sempre en animals sans, però no s’ha avaluat el grau de dany hepàtic que comporta la injecció hidrodinàmica en animals diabètics. Per tant, es va controlar, d’una banda, els nivells de transaminases en sèrum (GPT) com a indicador de necrosi, de l’altra, l’activació de caspasa 3 en extractes de fetge, com a indicador d’apoptosi, a diferents temps post-injecció. Els nivells de GPT en els animals injectats amb els pSHAGs amb la injecció hidrodinàmica era significativament superior 48 hores després de la injecció comparat amb els ratolins injectats amb salí fisiològic intraperitonialment, però molt considerablement per sota del dany hepàtic causat per una agressió amb galactosamina més LPS (Figura 32). Tot i que els nivells de transaminases sèriques es troben relativament elevats entre les 24 i 48 hores després de la injecció hidrodinàmica, aquests tornen a la normalitat 72 hores després (Taules 8 i 10). A més, en cap cas en va trobar activitat caspasa 3 per sobre del control negatiu (injecció intraperitonial de salí fisiològic). Tampoc es va detectar diferències en els nivells de GPT ni en l’activitat caspasa 3 entre els dos grups de tractament (Ff i 664), descartant així un possible efecte inespecífic secundari al dany hepàtic associat la seqüència nucleotídica dels shRNA.

Gal

N+L

PS

pSH

AG

-Ff

pSH

AG

-664 sa

lí

0

500

1000

1500

2000

GP

Tsè

rum

(Ul)

***

**

A B

Gal

N+L

PS

pSH

AG

-Ff

pSH

AG

-664 sa

lí

0

500

1000

1500

2000

2500**

Act

ivita

t cas

pasa

3(U�

g pr

ot)

Figura 32. La injecció hidrodinàmica de vectors de shRNA no indueix apoptosi al fetge però sí una lleu necrosi transitòria. L’activitat caspasa 3 en fetge i els nivells de GPT en sèrum 48 hores després de la injecció hidrodinàmica en ratolins ICR (CD1) STZ+ amb 100 μg de vectors pSHAG. El grup control positiu de dany hepàtic (C+) consta de ratolins ICR (CD1) sans injectats i.p. amb 700 mg/kg galactosamina i 100 mg/kg LPS en un volum de 200 μl de salí fisiològic. El grup control negatiu (C-) són ratolins ICR (CD1) injectats i.p. amb 200 μl de salí fisiològic. Les dades es mostren com a les mitges ± ES, n= 3-8, **p<0.01; ***p<0.001; test t de Student

- 80 -


En conjunt, les dades indiquen que la injecció hidrodinàmica dels vectors pSHAG-Ff i pSHAG-664 no activen les vies inespecífiques de bloqueig de la transcripció mediades per PKR/Interferó associades a la seqüència del shRNA, així com tampoc indueixen cap mena de toxicitat o dany hepàtic que derivi en necrosi sostinguda o apoptosi al fetge associat al mètode de transferència gènica. Silenciament específic de PEPCK-C endògena en animals sans Seguidament, es va testar la capacitat de les seqüències 482 i 664 per a silenciar la PEPCK-C endògena in vivo. Com a primera aproximació es van emprar ratolins sans de la soca ICR (CD1). La figura 33 il·lustra el protocol que es va seguir

ICR (CD1) STZ-�6-8 setmanes

d1

SèrumFetge: mRNA

proteïnaRonyó

. dejuni 24h

100 �g pSHAGInjecció hidrodinàmica

15:00 h

d0

ICR (CD1) STZ-�6-8 setmanes

d1

SèrumFetge: mRNA

proteïnaRonyó

. dejuni 24h


15:00 h

d0

Figura 33. Protocol experimental de silenciació de PEPCK-C hepàtica en ratolins sans.

La transferència gènica hidrodinàmica, a més del fetge (òrgan diana majoritari de la tècnica), abasteix de forma minoritària altres teixits, entre els que s’inclou el ronyó (209). Tenint en comte que PEPCK-C s’expressa a ronyó, on exerceix un important paper fisiològic en la gluconeogènesi vam voler corroborar que la injecció hidrodinàmica de vectors de shRNA promou silenciació de PEPCK-C de forma exclusiva a fetge. La injecció hidrodinàmica de pSHAG-664 aconseguí una reducció apreciable en el contingut de proteïna al fetge, pero no al ronyó. Aquesta disminució en el contingut proteïc de l’enzim es reflexà en una reducció d’un 30% en l’activitat enzimàtica PEPCK al fetge (20.1 ± 2.0 vs 28.5 ± 1.9 mU/mg de proteïna; n=4; p<0.05; test t de Student), però no al ronyó. Contràriament, als ratolins injectats amb pSHAG-482 el contingut de PEPCK-C no va disminuïr ni al fetge ni al ronyó (Figura 34), corroborant la ineficàcia en la silenciació de la diana endògena in vivo que els

- 81 -

Silenciament de PEPCK-C hepàtica en ratolins sans

experiments in vitro suggerien. En aquest punt, es va seleccionar per a continuar l’estudi la seqüència 664 ja que, tant in vitro com in vivo resulta més eficient que la seqüència 482, sense comportar mortalitat ni cap efecte tòxic apreciable sobre el fetge ni l’estat general dels dels animals associat a la seqüència de shRNA.

pSHAG-Ff pSHAG-664Fetge

Ronyó

pSHAG-Ff pSHAG-482Fetge

Ronyó

A B

0

5

10

15

20

25

30

35 pSHAG-FfpSHAG-664

salí

pSHAG-482

**

Act

ivita

t PE

PC

K a

l fet

ge(m

U/m

g pr

ot)

Figura 34. Avaluació de l’eficiència de silenciació de les seqüències de shRNA 482 i 6644 sobre la PEPCK-C endògena en fetge i ronyó. 24 hores després de la injecció hidrodinàmica amb 100 μg de pSHAG els animals, dejunats des del moment de la injecció, van ser sacrificats. A. L’activitat enzimàtica PEPCK es va assajar en extractes hepàtics i es va normalitzar pel contingut proteic de l’extracte. Les dades són mitges ± ES; n=4; *p<0.05; test t de Student. B. El contingut de PEPCK-C en fetge i ronyó després dels tractaments es va valorar per Western Blot. A continuació, es va contrastar el patró d’activitat silenciadora obtingut amb el patró d’expressió resultant de la tècnica hidrodinàmica en el nostre sistema experimental, utilitzant un vector codificant per a la proteïna verda fluorescent (GFP) (Figura 35). La visualització per microscopia de fluorescència de la proteïna verda fluorescent mostra que al fetge hi ha una població d’hepatòcits que expressen GFP. L’eficiència parcial de transfecció al fetge obtinguda en el nostre model és comparable amb els resultats mostrats a la bibliografia (196; 209; 214) i correlaciona amb una eficiència parcial de silenciació de PEPCK-C, tal i com s’ha descrit en els paràgrafs anteriors. Contràriament, al ronyó no s’aprecia una població cel·lular amb una fluorescència significativa per sobre del fons, sinó que les cèl·lules positives per GFP es es troben aïllades i de forma esporàdica, indicatiu de la incapacitat de la metodologia de transduïr les cèl·lules renals i coherent amb l’absència de silenciació de PEPCK-C en ronyó.

- 82 -


Fetge Ronyó

Figura 35. Patró d’expressió de GFP emprant la injecció hidrodinàmica. Ratolins ICR (CD1) van ser injectats amb 100 μg de pEGFP i perfundits amb una solució de 4% PFA 48 hores després. La figura mostra la visualització directa de GFP (verd) sobre les seccions de fetge de 50 �m, per microscopia de fluorescència. PEPCK-C es regula exclusivament a nivell transcripcional a través de l’eix isulina/glucagó. En un animal sa els nivells de mRNA són mínims en alimentació i màxims en dejú (70). Per a discernir possibles diferències en la capacitat de silenciament en funció de l’estat nutricional i valorar de forma directa el poder de silenciació dels shRNA sobre la seva diana endògena, es va valorar el contingut de mRNA en animals alimentats i dejunats en resposta a pSHAG-664. La reducció del mRNA, tot i que no significativa, era d’un 20% en animals dejunats. En canvi, en animals alimentats, es va trobar una reducció significativa del 40% del mRNA (Figura 36).

Ff 664 Ff 6640

100

200

300

400

Alimentació Dejuni

*

mR

NA

PE

PC

K-C

(uni

tats

rela

tives

)

Figura 36. Silenciament de pSHAG-664 sobre el mRNA de PEPCK-C. Els ratolins ICR (CD1) es van injectar anb 100 μg de pSHAG-664 o pSHAG-Ff.segons el mètode hidrodinàmic. La capacitat de silenciament es va mesurar 24 hores després en estat d’alimentació o dejuni. El mRNA hepàtic es va analitzar per Northern blot. Les membranes es van normalitzar amb GAPDH. El resultat s’expressa com la relació entre el mRNA de PEPCK-C i el mRNA de GAPDH. Els valors representen les mitges ± ES ; n=4, * p<0.05; test t de Student.

- 83 -

Silenciament de PEPCK-C hepàtica en ratolins diabètics

Silenciament de PEPCK en el fetge de ratolins diabètics Per tal d’investigar si la inhibició de la PEPCK-C hepàtica podria ser una estratègia vàlida per a reduir la gluconeogènesi i la glucèmia post-absortiva, es van traslladar els experiments a un model de ratolí amb diabetis experimental induïda amb estresptozotocina (STZ). Aquest model de ratolí amb es caracteritza per una disminució, gairebé total, dels nivells d’insulina, una hiperglucèmia severa i alteracions de la transducció de senyals dependents d’insulina. La STZ ([2-deoxi-2(3-metil-nitrosurea)-1-D-glucopiranosa] és una antibiòtic d’ampli espectre produït per Streptomycesachromogenes. que té un potent efecte tòxic sobre la cèl·lula beta pancreàtica, a la qual entra a través del transportador de glucosa Glut2 gràcies a la seva similitud estructural amb la glucosa (Figura 37). S’han proposat diferents mecanismes de toxicitat de la STZ a la cèl·lula beta: 1) metilació del DNA, 2) generació de radicals lliures i 3) producció d’òxid nítric, que desemboquen en mort cel·lular per apoptosi (217).

Figura 37. Estructura química de la STZ

El protocol d’administració de la STZ juga també un paper important sobre el mecanisme d’inducció de la diabetis:

� Una única administració intraperitonial de STZ a dosis elevades (> 160 mg/kg) resulta en una ràpida destrucció de les cèl·lules beta pancreàtiques, amb una pèrdua de més del 90% de la secreció d’insulina, que desemboca en l’aparició d’hiperglucèmia en un període curt de temps (<7 dies).

� Quan la STZ s’administra en múltiples injeccions intraperitonials a dosis baixes (� 50 mg/kg) la seva acció citotòxica és menor, però s’indueix una resposta inflamatòria contra les cèl·lules beta pancreàtiques, que cursa amb una infiltració limfocitària (insulinitis) que les

- 84 -


destrueix, desembocant en una diabetis severa en un període més llarg de temps (vàries setmanes, depenent de la soca emprada).

ICR (CD1) STZ+�6-8 setmanes

d2

SèrumFetge: mRNA

proteïnaRonyó

Control de glucosa i pes(� 400 mg/dl; � 20 g)

9:00 h

IPGTTPlasma

9:00 a.m. fins 15:00 p.m. dejni 6h


15:00 h

d0 d1 d3

9:00 a.m. fins 15:00 p.m. dejuni 6h

ICR (CD1) STZ+�6-8 setmanes

d2

SèrumFetge: mRNA

proteïnaRonyó

Control de glucosa i pes(� 400 mg/dl; � 20 g)

9:00 h

IPGTTPlasma

9:00 a.m. fins 15:00 p.m. dejni 6h


15:00 h

d0 d1 d3

9:00 a.m. fins 15:00 p.m. dejuni 6h

SèrumFetge: crioseccions

mRNAproteïna

Ronyó

A

B

Figura 38. Protocol experimental de silenciació de PEPCK-C hepàtica en ratolins diabètics tipus I. A:Sacrifici a les 72 hores post-injecció. B: Sacrifici a les 48 hores post-injecció.

En el present treball es va aplicar el protocol d’administració única a dosis elevades tal i com es descriu a l’apartat Material i Mètodes. En el moment de la injecció hidrodinàmica els animals tenien una glucèmia superior a 400 mg/dl després d’un dejuni curt de 6 hores i pesaven entre 20 i 25 grams. Només aquells animals que mantenien el seu pes per sobre dels 20 grams durant el desenvolupament de la diabetis eren mantinguts, a fi d’evitar possibles interferències per una possible caquèxia induïda pes l’absència d’insulina. Com a control positiu d’inhibició sistèmica de l’activitat PEPCK-C es va fer servir l’àcid 3-mercaptopicolínic (3-MPA), inhibidor no competitiu de la PEPCK-C (200). Els ratolins es van injectar amb 100 μg de pSHAG-Ff o pSHAG-664. Passades 48 hores o 72 hores (Figura 38), els animals vàren ser sotmesos a un període curt de dejuni (6 hores) abans d’analitzar els pesos i les glucèmies, eutanasiar-los i extreure’n sang i teixits.

- 85 -


0123456789

1011

*

Act

ivita

t esp

ecífi

ca P

EP

CK

(mU

/mg

prot

)

pSHAG-Ff pSHAG-664

PEPCK-C

�-tubulina

PEPCK-C

�-tubulina

48 h

72 h

pSHAG-Ff pSHAG-664

PEPCK-C

�-tubulina

PEPCK-C

�-tubulina

48 h

72 h

A B

0123456789

1011

*

Act

ivita

t esp

ecífi

ca P

EP

CK

(mU

/mg

prot

)

pSHAG-Ff pSHAG-664

PEPCK-C

�-tubulina

PEPCK-C

�-tubulina

48 h

72 h

pSHAG-Ff pSHAG-664

PEPCK-C

�-tubulina

PEPCK-C

�-tubulina

48 h

72 h

0123456789

1011

*

Act

ivita

t esp

ecífi

ca P

EP

CK

(mU

/mg

prot

)

pSHAG-Ff pSHAG-664

PEPCK-C

�-tubulina

PEPCK-C

�-tubulina

48 h

72 h

pSHAG-Ff pSHAG-664

PEPCK-C

�-tubulina

PEPCK-C

�-tubulina

48 h

72 h

A B

Figura 39. Silenciament de PEPCK-C en fetges de ratolins amb diabetis experimental induïda per STZ. Ratolins ICR (CD1) STZ+ va ser injectats amb 100 �g de pSHAG-Ff (barra negra) o pSHAG-664 (barra blanca). A. Passades 48 o 72 hores, els animals van ser sacrificats. Es van obtenir extractes hepàtics i el contingut de PEPCK-C en aquests extractes es va analitzar per Western blot. Es mostren fotos representatives d’almenys tres experiments independents. B. L’activitat enzimàtica es va analitzar en els extractes obtinguts 72 hores post-injecció i es va normalitzar pel contingut proteic dels mateixos, expressant-la com a activitat específica. Les dades són les mitges ± ES (n=7-9; * p<0.05; test t de Student). L’anàlisi per Western Blot del contingut de proteïna PEPCK-C als fetges dels animals va revelar una silenciació parcial i transitòria (Figura 39 A). La quantificació densitomètrica d’aquestes membranes mostrà una reducció aproximada del 50% en els nivells de PEPCK 48 hores post-tractament, mentre que l’eficàcia del silenciament a les 72 hores quedà reduïda al 40%. En concordància, l’activitat enzimàtica PEPCK a les 72 hores després del la injecció hidrodinàmica és un 20% inferior en resposta al tractament amb pSHAG-664 (7.6 ± 0.6 vs 9.7 ± 1.1 mU/mg de proteïna; n=7 i n=9; p<0.05), tal i com es mostra a la figura 39 B. Aquesta reducció parcial en l’activitat PEPCK-C hepàtica es va reflexar consistentment en la glucèmia. Els animals tractats amb pSHAG-664 van patir una disminució de les glucèmies tant a les 48 com a les 72 hores post-injecció. En correlació amb l’activitat enzimàtica i el contingut de PEPCK a fetge, la reducció de la glucèmia mostrà també un patró de transitorietat (Figura 40). L’efecte hipoglucemiant va resultar molt més significatiu i evident a les 48 hores, moment en que la reducció de la glucèmia era d’un 40% (218 ± 26 vs 364 ± 33 mg/dl, n=26 i n= 25 p<0.001). En aquest punt, l’efecte hipoglucemiant de la silenciació parcial de PEPCK-C hepàtica es comparable amb el s’obté amb el tractament sistèmic amb 3-MPA (149 ± 30 mg/dl; n=3). En canvi, a les 72 hores post-injecció la reducció dels nivells de glucèmia en dejú minvà al 25% (350 ± 68 vs 476 ± 35 mg/dl; n=10 i n=12; p=0.05). En cap dels animals tractats es va observar hipoglucèmia.

- 86 -


Figura 40. Efecte de la modulació de l’activitat PEPCK-C hepàtica sobre l’homeòstasi de la glucosa en ratolins amb diabetis experimental induïda per STZ (ICR (CD1) STZ+). A. L’efecte sobre la glucèmia en dejú a les 48 i 72 hores després d’haver injectat els ratolins amb els vectors pSHAG. Els resultats són expressats com a glucèmies relatives del tractament amb el shRNA per PEPCK-C vs el control (48 hores: pSHAG-Ff, n=25 i pSHAG-664, n=26, *** p<0.001; 72 hores: pSHAG-Ff, n=12 i pSHAG-664; p=0.05). B. Test de tolerància a la glucosa. Un bolus de glucosa de 1 mg/g es va injectar intraperitonialment als animals prèviament dejunats. La glucèmia es va controlar en el període de temps indicat en els grups experimentals de ratolins diabètics ICR (CD1) STZ+ pSHAG-Ff (), pSHAG-664 () i en ratolins sans ICR (CD1) STZ- (�). Els valors representen la mitja ± ES (n=5; ** p<0.01).

48 h 72 h0

102030405060708090

100110

***N

ivel

ls re

latiu

sde

glu

cosa

en

sang

48 h 72 h0

102030405060708090

100110

***N

ivel

ls re

latiu

sde

glu

cosa

en

sang

A

B

0 50 100 150

0

100

200

300

400

**

Temps (min)

Glu

cosa

(mg/

dl)

L’efecte positiu sobre el control de la glucèmia ens va empènyer a analitzar més en profunditat l’homeòstasi de la glucosa en aquests animals. Es va realitzar un test de tolerància oral a la glucosa 48 hores després del tractament (Figura 40 B). En el moment d’iniciació de l’assaig els nivells de glucosa en sang en dejuni era un 40% inferior en el animals tractats amb pSHAG-664 respecte del tractats amb pSHAG-Ff (111 ± 30 vs 272 ± 47 mg/dl; p<0.01; n=5). La silenciació parcial de PEPCK-C hepàtica exercí un potent efecte sobre la tolerància a la glucosa: els ratolins injectats amb pSHAG-664 mostraven una corba pràcticament normalitzada. La fase inicial de la corba de tolerància (minut 0 fins a minut 30) evoluciona en paral·lel a tots els grups experimentals analitzats, indicant que l’absorció i utilització de glucosa al fetge no es veu afectada en resposta al tractament amb pSHAG-664 respecte del tractament control. D’altra banda, la reducció dels nivells de glucogen romanent als fetges d’aquests animals indica que la síntesi indirecta de glucogen podria estar afectada per la inhibició de la gluconeogènesi secundària a la menor actvitat PEPCK-C hepàtica. Un cop més, l’efecte té una tendència transitòria, essent significatiu en ambdós temps d’anàlisi, però amb de

- 87 -


menor impacte a les 72 hores (Taula 11). Per tant, podem concloure que l’efecte hipoglucemiant de la silenciació de PEPCK-C no es deu a un increment de la metabolització de glucosa en fetge, sinó més aviat a una reducció de la gluconeogènesi hepàtica i que aquest efecte sobre l’homeòstasi de la glucosa és independent dels efectes directes o indirectes de la insulina, ja que els nivells residuals de la hormona són negligibles després de la injecció d’estreptozotocina (Taula 10). Aquests conjunt de dades suggereixen que: a) l’activitat PEPCK-C exerceix un control directe sobre la glucèmia en dejú a través del control del flux de la gluconeogènesi; i b) la injecció hidrodinàmica de vectors plasmídics implica una pèrdua progressiva de l’expressió dels shRNA, en correlació amb el que s’ha observat en altres estudis (213; 214). En vista dels evidents canvis en l’homeòstasi de la glucosa, ens vam interessar també pel metabolisme lipídic (Taula 10). La concentració de triglcèrids (TAG) i àcids grassos lliures (AGL) presents en sèrum es reduí significativament als animals amb la PEPCK-C hepàtica parcialment silenciada. Les diferències en el metabòlits sèrics també es van mostrar transitòries, en correlació amb l’efecte de silenciament descrit. Acompanyant a la reducció en els nivells d’AGL, es va observar una tendència no significativa a augmentar en els nivells de ß-hidroxibutirat (ß-HBA).

SREBP-1C p125

SREBP-1C p68

FAS

�-tubulin

pSHAG-Ff pSHAG-664

PEPCK

ACC-P�-tubulin

SREBP-1C p125

SREBP-1C p68

FAS

�-tubulin

pSHAG-Ff pSHAG-664

PEPCK

ACC-P�-tubulin

Figura 41. Efectes de la silenciació parcial de PEPCK-C sobre la lipogènesi als fetges de ratolins amb diabetis experimental induïda per STZ. Els nivells d’algunes proteïnes implicades en la regulació del metabolisme energètic van ser analitzades per Western blot realitzats sobre fetges de ratolins en dejuni que havien rebut una dosi de 100 μg de pSHAG-Ff o pSHAG-664 dos dies abans. Es mostren blots representatius d’experiments independents

Per tal d’aprofundir en els mecanismes de regulació involucrats en els canvis metabòlics observats, es va analitzar el contingut hepàtic d’alguns enzims i proteïnes reguladores implicats en la lipogènesi

- 88 -


(FAS i SREBP-1c) i en la ß-oxidació lipídica (ACC-P) (Figura 41). El silenciament de PEPCK-C al fetge s’acompanyà, segons l’anàlisi densitomètric de les membranes, d’una caiguda dels nivells de SREBP-1c, en un 82% i 38% de la forma precursora (p125) i la madura (p68), respectivament. En canvi, els nivells de FAS i de la forma fosforilada d’ACC (inactiva) romangueren estables. Aquest patró d’expressió dels enzims lipogènics és coherent amb la manca d’acumulació de lípids als fetges del grup AdU6-664 (Taula 11) i suggereix que no hi ha una inducció de lipogènesi en resposta a a la silenciació de PEPCK-C al fetge.

Immunolocalització de PEPCK-C després de la injecció hidrodinàmica dels vectors pSHAG Els resultats mostrats fins al moment ens feien palès que la metodologia emprada no permetia obtenir un silenciament total de PEPCK-C en fetge, fins i tot a les altes dosis de transfecció que estàvem utilitzant. Per constatar els límits en l’eficiència de silenciació en funció de l’eficiència i l’abast del mètode de transducció utilitzat, vam comprovar la distribució i abundància de les cèl·lules hepàtiques transduïdes amb el mètode de la transferència gènica hidrodinàmica en relació amb la localització zonal de la PEPCK-C al parènquima hepàtic. Per a això vam injectar els ratolins amb diferents quantitats d’un plasmidi d’expressió de GFP (pEGFP) o pSHAGs i vam visualitzar GFP de forma directa i PEPCK-C per immunohistoquímica en seccions de fetge. La quantitat de cèl·lules positives per GFP incrementa amb la dosi (Figura 42 A i B). Altres autors han demostrat fins a un 40% d’hepatòcits transfectats amb altes dosis de plasmidi injectat hidrodinàmicament (209; 218), però la distribució zonal del transgen no ha estat descrita fins ara. Aquest factor és crucial en el context de la silenciació de un enzim com la PEPCK-C, amb una clara distribució zonal en el lòbul hepàtic decreixent al llarg de l’eix porto-central (Figura 12) (63). En consonància amb el que està descrit per a aquest enzim, a les seccions dels fetges dels animals diabètics, la immunolocalització de PEPCK és extensiva al llarg de tot l’eix, en un gradient d’intensitat, amb una clara compartimentalització a la zona periportal, tal i com reflexa la fluorescència vermella a la figura 42. Contràriament, els hepatòcits positius per a GFP van resultar ser els de menor intensitat en el gradient de PEPCK-C (corresponents a la zona perivenosa-intermèdia), però mostraven una distribució més àmplia a major dosi de plasmidi injectat (Figura 42 C i D). D’aquests resultats hom pot inferir que la distribució relativa al lòbul hepàtic de PEPCK-C respecte de l’expressió del transgen emprant la transferència gènica hidrodinàmica pot ser una explicació per a l’efecte parcial en la silenciació de PEPCK-C descrita en aquest capítol. No obstant,

- 89 -

Injecció hidrodinàmica: transducció hepàtica perivenosa

és important tenir en compte que, als fetges tractats amb 100 μg de pSHAG-664 mitjançant la injecció hidrodinàmica, la senyal de PEPCK-C redueix la seva intensitat tant a la zona perivenosa-intermèdia com a la zona periportal, indicatiu d’un efecte de silenciació global a tot el lòbul hepàtic (Figura 42 E i F).

A B

C D

E F

Figura 42. Expressió zonal al parènquima hepàtic i silenciament parcial de PEPCK-C obtingut amb la injecció hidrodinàmica. Els ratolins ICR (CD1) STZ+ van ser injectats amb 10 o 20 μg de pEGFP (panells A fins a D) o 100 μg de pSHAG-Ff (panell E ) o pSHAG-664 (panell F) i perfundits amb una solució de 4% PFA 48 hores després. La figura mostra la visualització directa de GFP (verd) i la immunodetecció de PEPCK-C (vermell) sobre seccions de fetge de 50 μm, per microscopia confocal. Els panells A i B corresponen a camps representatius de la distribució hepàtica de GFP obtinguda amb la transferència gènica hidrodinàmica de dosis de 10 o 20 μg respectivament. La co-localització de la PEPCK-C endògena amb la GFP transfectada a les dosis indicades es mostren en els panells C (10 μg) i D (20 μg). Finalment, es mostren imatges representatives de la distribució de PEPCK-C 48 hores després de la injecció hidrodinàmica amb 100 μg de pSHAG-Ff (panell E) o pSHAG-664 (panell F). Les imatges són augmentades 200X.

- 90 -

Capít

ol 1:

Tau

les

Ta

ula 8

. Pan

ell m

etab

òlic

sang

uini

de r

atol

ins I

CR (C

D1) S

TZ- t

ract

ats a

mb

pSHA

G m

itjan

çant

la tr

ansf

erèn

cia g

ènica

hi

drod

inàm

ica.

Ratol

ins sa

ns va

n ser

injec

tats a

mb 10

0 μg d

e pS

HAG-

664 p

SHAG

-Ff.

Segu

idame

nt va

n ser

sotm

esos

a de

juni d

uran

t les 2

4 ho

res p

oster

iors i

van s

er sa

crific

ats. E

s van

anali

tzar d

ifere

nts m

etabò

lits en

sang

i sèr

um. L

es da

des s

ón le

s mitg

es ±

ES

de

5 anim

als pe

r gru

p.

Sa

ng

Sè

rum

Gl

ucos

a (m

g/dl

)

TAG

(mg/

dl)

AGL

(mm

ol/l)

La

ctat

(m

g/dl

) In

sulin

a (p

g/m

l) GP

T (U

/l)

ß-HB

A (m

mol

/l)

pSHA

G-Ff

38

± 6

70

.0 ±

10.5

2.3 ±

0.2

117.5

± 11

,6 53

.9 ±

20.3

329 ±

108

4.1 ±

0.4

pSHA

G-66

4 42

± 3

83

.3 ±

19.1

2.1 ±

0.3

105.6

± 4,

6 73

.8 ±

9.6

215 ±

29

4.6 ±

0.64

Capítol 1: Taules

Taula 9. Panell metabòlic hepàtic de ratolins ICR (CD1) STZ- tractats amb pSHAG mitjançant la transferència gènica hidrodinàmica. Ratolins sans van ser injectats amb 100 μg de pSHAG-664 pSHAG-Ff. Seguidament van ser sotmesos a dejuni durant les 24 hores posteriors i van ser sacrificats. Es van analitzar diferents metabòlits en fetge. Les dades són les mitges ± ES de 5 animals per grup. n.d., no determinat.

Fetge

TAG (mg/g)

LDH (U/g)

Glicogen (mM/g)

pSHAG-Ff 66.4 ± 9,3 n.d. n.d. pSHAG-664 60.3 ± 8,1 n.d. n.d.

- 92 -

Capít

ol 1:

Tau

les

Ta

ula 1

0. Pa

nell m

etab

òlic

sang

uini

dels

rato

lins I

CR (C

D1) S

TZ+ t

ract

ats p

SHAG

mitj

ança

nt la

tran

sfer

ència

gèn

ica h

idro

dinà

mica

. El

s rato

lins v

an se

r inje

ctats

amb

100

μg p

SHAG

-664

o p

SHAG

-Ff.

Els a

nimals

van

ser s

otmes

os a

un

dejun

i de

6 ho

res a

bans

del

sacri

fici, d

ut a

terme

als t

emps

indic

ats. D

ifere

nts m

etabò

lits de

la sa

ng i e

l sèr

um va

n ser

anali

tzats.

Les d

ades

que e

s pre

sente

n són

les m

itges

± E

S d’e

ntre 7

i 12

anim

als p

er g

rup

obtin

gude

s en

, alm

enys

, tre

s ex

perim

ents

indep

ende

nts. E

l valo

r de

gluco

sa c

orre

spon

a la

mitja

± E

S de

26

(pSH

AG-F

f) i 2

5 (p

SHAG

664

) anim

als. P

er la

resta

de

vaor

s les

dad

es c

orre

spon

en a

la m

itja ±

ES

d’entr

e 7

i 12

anim

als p

er g

rup

obtin

gude

s en

alm

enys

tres

ex

perim

ents

indep

ende

nts. *

p< 0.

05; *

*p<0

.01; *

**p<0

.001;

&p=0

.05; te

st t d

e Stud

ent. n

.d., n

o dete

rmina

t.

Sa

ng

Sè

rum

Gl

ucos

a (m

g/dl

)

TAG

(mg/

dl)

ß-HB

A (m

mol

/l)

AGL

(mm

ol/l)

La

ctat

(m

g/dl

) In

sulin

a (p

g/m

l) GP

T (U

/l)

pSHA

G-Ff

3

64 ±

33

1

02.5

± 15

.8 0.2

5 ± 0.

08

1.44

± 0.

11

73.6

± 7.9

11

.3 ±

5.6

112 ±

16

48 h

pS

HAG-

664

218 ±

26 **

*

64.8

± 11

.4**

0.38 ±

0.14

0.8

9 ± 0.

10***

63

.4 ±

6.0

13.3

± 0.5

14

2 ± 21

pSHA

G-Ff

47

6 ± 35

83.8

± 10

.8 0.1

9 ± 0.

015

1.1 ±

0.2

41.3

± 6.4

n.d

. 36

.9 ±

6.4

72 h

pS

HAG-

664

350 ±

68&

89

.4 ±

14.1

0.24 ±

0.11

1.3

± 0.

4 44

.2 ±

9.9

n.d.

47 ±

8.9

Capítol 1: Taules

Taula 11. Panell metabòlic hepàtic dels ratolins ICR (CD1) STZ+ tractats pSHAG mitjançant la transferència gènica hidrodinàmica. Els ratolins van ser injectats amb 100 μg pSHAG-664 o pSHAG-Ff. Els animals van ser sotmesos a un dejuni de 6 hores abans del sacrifici als temps indicats. Diferents metabòlits en sèrum i fetge van ser analitzats. Les dades que es presenten són les mitges ± ES d’entre 7 i 12 animals per grup obtingudes en, almenys, tres experiments independents. *p< 0,05; **p<0,01; test t de Student; n.d., no determinat

Fetge

TAG (mg/g)

LDH (U/g)

Glicogen (mM/g)

pSHAG-Ff 12.7 ± 0.5 n.d. 43.9 ± 5.2 48 h

pSHAG-664 13.1 ± 0.3 n.d. 12.7 ± 7.0**

pSHAG-Ff 13.3 ± 0.7 10.1 ± 0.0 49.9 ± 3.6 72 h

pSHAG-664 11.2 ± 0.6 13.8 ± 0.0* 30.5 ± 8.0*

- 94 -

Capítol 1: Discussió

DISCUSSIÓ

Transferència gènica hidrodinàmica de vectors de shRNA dirigits contra PEPCK-C En aquest primer bloc es demostra que els vectors de silenciament dirigits de forma específica al fetge mitjançant a la tècnica de transferència gènica hidrodinàmica proporcionen un model adequat per a avaluar: a) l’eficàcia de les seqüències de shRNA; i b) l’impacte metabòlic a curt termini de la reducció de l’activitat de la PEPCK-C. L’efecte transitori de silenciament que s’obté en injectar vectors plasmídics nuus d’expressió de shRNA mitjançant la injecció hidrodinàmica és inherent a la tècnica i ha estat descrita també per altres autors en estudis de de silenciació de gens exogens (214). Els resultats del present treball sobre un gen endogen confirmen la transitorietat d’aquest sistema. Tanmateix, no podem descartar, que la pèrdua dels efectes biològics sigui deguda a una retro-regulació encarregada de mantenir en estat d’equilibri la gluconeogènesi a través de l’estimulació de la transcripció de PEPCK-C. La silenciació parcial de PEPCK-C obtinguda sembla correlacionar amb la biodistribució del DNA injectat amb aquesta tècnica. Tant els resultats aquí presentats com els resultats d’altres autors (209; 218) mostren que la tècnica de transferència gènica hidrodinàmica proporciona una eficiència de transfecció en fetge per sota del 50%. A més, en el cas de la silenciació d’una diana endògena com PEPCK-C amb una distribució heterogènea al fetge (219), la distribució relativa l’expressió del gen diana el plasmidi injectat pren especial importància. La localització zonal dels hepatòcits transduïts amb la tècnica de la injecció hidrodinàmica no ha estat descrita amb anterioritat a aquest treball. Els resultats obtinguts en aquest estudi mostren que l’expressió del transgen després de la injecció hidrodinàmica correspon a la zona perivenosa-intermèdia. Els estudis en ratolins sans van demostrar una major capacitat per a silenciar PEPCK-C en animals alimentats, probablement en correlació amb l’increment de la taxa de transcripció de l’enzim que té lloc durant el dejuni (219). Per tant, un segon factor que pot comprometre la eficàcia de la silenciació a més de l’eficiència de transducció del vector emprat, és l’abundància del mRNA diana, malgrat el “reciclatge” de les molècules de siRNA inherent al seu mecanisme d’acció, tal i com altres estudis han suggerit (220).

- 95 -

Capítol 1:Discussió

Impacte de la reducció PEPCK-C sobre l’homeòstasi de la glucosa La genosupressió de PEPCK-C al fetge no té una repercussió en la glucèmia, ni en alimentació ni en dejuni, degut a efectes compensatoris diversos descrits a l’apartat introductori (93; 95-97). No obstant, quan després d’un dejuni perllongat, aquests ratolins són sotmesos a exercici físic, no són capaços de mantenir la glucèmia i desenvolupen hipoglucèmia poc temps després de l’inici de l’exercici (30 minuts) (95). Aquesta observació, és coherent amb que, en una situació en que els reservoris de glicogen han estat deplecionats prèviament pel dejuni, la gluconeogènesi hepàtica és la única font de glucosa i, sense aquesta, els animals esdevenen hipoglucèmics. Aquests estudis de genosupressió demostraren la dependència del flux gluconeogènic per PEPCK-C i la repercussió directa de l’activitat enzimàtica en la glucèmia en absènica d’efectes compensatoris. En concordança, en el present estudi hem vist que la reducció parcial de l’activitat enzimàtica PEPCK-C hepàtica en ratolins sans no va acompanyada de canvis en la glucèmia. En canvi, en animals amb diabetis tipus I, la reducció parcial dels nivells de PEPCK-C al fetge comporta una reducció molt significativa dels nivells circulants de glucosa en dejuni i una tolerància a la glucosa normalitzada. De fet, en aquests animals, els nivells d’insulina sèrica residual després del tractament amb estreptozotocina és més de deu vegades inferior a la d’un animal sa, descartant així possibles efectes atribuïbles a secreció residual d’insulina o a l’estimulació de la secreció d’insulina secundària al tractament. Per tant, aquest model de ratolí diabètic, on no hi ha efectes indirectes atribuïbles a la senyalització de la insulina, ni al fetge ni als teixits perifèrics, la reducció de l’activitat PEPCK-C té un efecte directe sobre la glucèmia en dejú, reforçant la idea de la contribució de l’activitat PEPCK-C sobre la hiperglucèmia post-absortiva en diabetis. Impacte de la reducció PEPCK-C sobre l’homeòstasi dels lípids La reducció de l’activitat PEPCK al fetge dels animals diabètic no només té conseqüències en el metabolisme glucídic, sinó que també al lipídic. El contingut de glicogen hepàtic i les concentracions de AGL i TAG en sèrum es redueixen, acompanyats d’una tendència a incrementar el cossos cetònics en sèrum. Les implicacions d’aquests canvis són diverses: 1. Una reducció en els dipòsits de glicogen al fetge poden estar indicant una reducció de la síntesi a partir de precursors gluconeogènics (síntesi de glicogen per la via indirecta), en concordància amb el descrit per al ratolí knock-out en fetge de PEPCK (95).

- 96 -


2. La reducció dels AGL en sèrum, acompanyat de la tendència a incrementar que mostren els cossos cetònics (ß-HBA) l’absència d’acumulació de lípids al fetge en forma de triglicèrids, suggeriria una taxa de captació i ß-oxidació d’AGL incrementada. Aquest fet, qeu contrasta amb el bloqueig de la ß-oxidació i la lipidosi hepàtica descrita en el model de ratolí de genosupressió de PEPCK-C al fetge (93; 95-97), podria ser parcialment explicat si els nostres ratolins mantinguéssin la taxa de consum d’oxigen (indicador indirecte del nivell de ß-oxidació en un fetge gluconeogènic), tal i com prèviament s’ha descrita en un model d’innhibició transitòria de PEPCK-C amb l’inhibidor farmacològic àcid mercaptopicolínic en fetge de rata perfòs (200). 3. La reducció de les formes precursora (p125) i madura (p68) de SREBP-1c suggereix una reducció de la lipogènesi de novo. Tot i que transcripció de SREBP-1c és depenent de la insulina (221), en els ratolins injectats amb STZ a les dosis utilitzades en aquest estudis (que tenen nivells d’insulina negligibles) trobem expressió de SREBP-1c independent d’insulina. Anteriorment ja ha estat descrita l’expresió de SREBP-1c en resposta a carbohidrats de forma independent d’insulina en fetges de ratolins tractats amb STZ (222). Això indica que el metabolisme de la glucosa en els ratolins STZ+ és suficientment actiu com per a mantenir cert nivell de captació de glucosa a l’hepatòcit, que en els animals on PEPCK-C està parcialment silenciada podria divergir de lipòlisi a glucòlisi, degut a la caiguda de SREBP-1c. Aquesta caiguda, tenint en compte que Matsuzaka et al. descriuen que els nivells circulants de glucosa poden regular positivament la transcripció de SREBP-1c en fetge, podria ser en reposta a la disminució de la hiperglucèmia. Es podria especular, doncs, amb l’existència d’un mecanisme sensor de l’estat energètic cel·lular que estaria promovent la captació, activació i oxidació dels AGL, cosa que, en segon terme, provocaria la baixada dels nivells de SREBP-1c. Aquest, per la seva banda seria responsable de la inhibició de la síntesi i alliberament de TAG al fetge. A favor d’aquesta hipòtesi estaria el fet que la relació ACC-P/SREBP-1c en els fetges dels animals amb PEPCK-C silenciada és molt superior que en els animals controls, cosa que suggeriria a priori que el pool de AGL esta sent derivat de síntesi cap a oxidació.

- 97 -

CAPÍTOL 2

Validació de PEPCK-C com a diana terapèutica: estudi de l’impacte metabòlic de la silenciació de PEPCK-C hepàtica

en el context de la diabetis tipus II

Capítol 2: Introducció

INTRODUCCIÓ

Un cop constatada la contribució directa de la PEPCK-C hepàtica en la hiperglucèmia post-absortiva en diabetis i en la homeòstasi energètica ns vàrem plantejar estudiar els efectes, tant directes com indirectes, de la reducció del contingut de l’enzim al fetge sobre el metabolisme hepàtic en un model de resistència a insulina. La presència de la hormona i la resistència dels teixits perifèrics a aquesta ens haurien de permetre estudiar-ne els efectes sistèmics i el balanç d’algunes vies del metabolisme energètic que conflueixen al mitocondri. No obstant, els estudis amb ratolins genosuprimits per a PEPCK-C hepàtica, publicats pels laboratoris del Dr. Mark Magnuson (94-97) i el Dr. Richard W. Hanson (93) en el decurs de la realització del treball experimental d’aquesta tesi doctoral, descriuen un fenotip que no es correspon amb una implicació de PEPCK-C hepàtica en el manteniment de l’homeòstasi de la glucosa, tot i que la gluconeogènesis queda abolida en absència de PEPCK-C al fetge d’aquests animals. Aquests estudis, qüestionen la relació directa ente l’activitat PEPCK-C i el control del flux de la via gluconeogènica, sugerrint una preponderància de l’enzim en el sosteniment del cicle de Krebs i la funció mitocondrial a través de la cataplerosi. Resulta essencial el fet que, tant el context fisiopatològic com l’abast de la supressió de l’activitat PEPCK-C al fetge divergeixen entre aquest model de ratolí genosuprimit i el model de diabetis experimental o genètica estudiats en el nostre laboratori. Per això ens vam plantejar estudiar: a) les implicacions de la silenciació de PEPCK-C sobre l’homeòstasi de la glucosa i la resistència a la insulina en el marc de la patofisiologia de la diabetis b) la rellevància de la magnitud de la silenciació de PEPCK-C en fetge envers dels efectes sobre la cataplerosi i la funció mitocondrial, i c) les alteracions del metabolisme energètic resultants de la reducció de la gluconeogènesi hepàtica en el context de la resistència a la insulina. Aquests estudis ens han perrmès extreure importants conclusions sobre la implicació de PEPCK-C en el control de la gluconeogènesi i la glucèmia, validant idoneïtat de la PEPCK-C hepàtica com a diana una terapèutica plausible per la diabetis. Per a desenvolupar aquests objectius vàrem utilitzar un model animal amb diabetis tipus II d’origen genètic, amb resistència perifèrica a insulina i disfunció sistèmica del metabolisme lipídic com són els ratolins de la soca C57BKS.Cg- +Leprdb/+Leprdb/Ola Hsd (db/db).

- 101 -


RESULTATS

Silenciació gènica de PEPCK-C al fetge de ratolins diabètics C57BKS.Cg-+Leprdb/+Leprdb Ola Hsd (db/db) mediada per un vector adenoviral codificant per un shRNA específic Els ratolins db/db tenen una mutació espontània al gen del receptor de la leptina (Leprdb). Desenvolupen polifàgia, polidípsia i poliúria i obesitat a partir de les tres o quatre setmanes de vida. A més, manifesten hiperinsulinèmia a partir de les dues setmanes de vida i hiperglucèmia, resistència a la insulina i intolerància a la glucosa a partir de la quarta setmana de vida. Aquest pannell simptomatològic el fan un excel·lent model de diabetis tipus II. En el capítol anterior hem vist que la transferència gènica hidrodinàmica té algunes limitacions en termes d’abast i persistència de l’expressió del transgen. Per a obtenir una silenciació més potent i persistent en el temps, que permeti avaluar el paper de PEPCK-C en el desenvolupament de la diabetis, així com l’impacte d’una silenciació parcial vs una de total sobre el metabolisme energètic, es va optar per un vector que fos capaç d’arribar de forma homogènia a tot el fetge i mantingués per un període de temps més llarg l’expressió, en comparació amb la injecció hidrodinàmica, com ara els vectors adenovirals. Es van subclonar, doncs, els casets d’expressió dels shRNA Ff i 664 en vectors adenovirals del serotip 5, tal i com es descriu a l’apartat de Material i Mètodes. Els adenovirus són virus de DNA de doble cadena, sense embolcall, amb un genoma d’entre 26 i 45 kb capaços d’infectar i replicar-se tant en cèl·lules quiescents com replicatives. Entre els avantatges d’aquests virus es troben la facilitat en la producció a gran escala i l’eficiència en l’obtenció de partícules infectives. En infeccions sistèmiques, els adenovirus recombinants del serotip 5 són especialment eficients infectant el fetge (197). Als adenovirus recombinants basats en el serotipus 5, s’ha deleccionat una regió del genoma (E1 o E1-E3), fent-los deficients en la replicació i permetent la inserció de material genètic exogen. En models animals immunocompetents l’expressió de proteïnes virals a partir del genoma viral residual indueix una resposta immune citotòxica que neutralitza el virus, provocant la pèrdua d’expressió en algunes setmanes. Per tant, tot i que molt eficients en la infecció d’alguns teixits, la seva aplicació es limita a trasfeccions transitòries amb una alta resposta immune, cosa que impossibilita un efecte terapèutic perllongat i/o la reinjecció del vector. Es van realitzar experiments de dosi i temps-resposta (Figura 43). Aquests experiments van constatar la capacitat de l’adenovirus de reduir fins al 90% el contingut de PEPCK-C en el fetge dels ratolins db/db durant un període d’almenys dues setmanes.

- 102 -


5*10

8

5*10

8

0109

109

5*10

9

5*10

9

AdU6-Ff AdU6-664

PEPCK

�-tubulina

p.f.u. Ad-

U6-

Ff

Ad-

U6-

664

Ad-

U6-

Ff

Ad-

U6-

664

Sal

í

Ad-U

6-66

4

7d 14d 21d

PEPCK

�-tubulina

A B

5*10

8

5*10

8

0109

109

5*10

9

5*10

9

AdU6-Ff AdU6-664

PEPCK

�-tubulina

p.f.u. Ad-

U6-

Ff

Ad-

U6-

664

Ad-

U6-

Ff

Ad-

U6-

664

Sal

í

Ad-U

6-66

4

7d 14d 21d

PEPCK

�-tubulina

Ad-

U6-

Ff

Ad-

U6-

664

Ad-

U6-

Ff

Ad-

U6-

664

Sal

í

Ad-U

6-66

4

7d 14d 21d

PEPCK

�-tubulina

A B

Figura 43. Assaig de dosi (A) i temps-resposta (B). A: Ratolins db/db mascles de 6 setmanes d’edat i un pes mig de 32 grams van ser infectats amb les dosis indicades d’adenovirus recombinant. Una setmana després els animals van ser sacrificats en alimentació i el contingut de PEPCK-C en el fetge es va analitzar per Western Blot. B: Ratolins de les mateixes característiques van ser infectats amb la dosi més alta (5*109 p.f.u.) i el contingut de PEPCK-C en el fetge es va analitzar als 7, 14 i 21 dies després de la infecció.

Seguidament, es va constatar els nivells de proteïna PEPCK-C residuals en alimentació catorze dies després de la infecció amb dosis que anomenarem intermitja (2.5*109 p.f.u.) o alta (uns 5*109 p.f.u.). En correlació amb els resultats preliminars mostrats a la figurs 43, la dosi intermitja proporciona una reducció parcial, mentre que la dosi alta proporciona una reducció quasi total del contingut de PEPCK-C en fetge (Figura 44).

Ad-U6-Ff Ad-U6-664PEPCK

�- tubulin

PEPCK

�- tubulin

5*109 p.f.u.

2*109 p.f.u.


�- tubulin


�- tubulin

PEPCK

�- tubulin

5*109 p.f.u.

2*109 p.f.u.

Figura 44. Nivells de silenciació de PEPCK-C aconseguits amb diferents dosi d’adenovirus. Catorze dies després de la infecció els ratolins db/db es van sacrificar en alimentació i els nivells de PEPCK-C es van analitzar per Western blot d’extractes totals de fetge. La transducció del fetge amb vectors adenovirals de shRNA no comporta toxicitat associada al vehicle ni a les seqüències de shRNA Els vectors adenovirals utilitzats contenen una deleció parcial del seu genoma viral, però en mantenen una part i, en conseqüència, expressen proteïnes virals a la cèl·lula diana, que indueixen

- 103 -

Vectors adenovirals de shRNA

una certa resposta citotòxica. Per aquesta raó es va voler descartar possibles efectes deleteris secundaris a la infecció adenovírica. Es van analitzar, d’una banda, els nivells de transaminases en sèrum com a indicador de necrosi hepàtica, i de l’altra, l’activitat caspasa 3 en extractes hepàtics com a indicador d’apoptosi. Aquests paràmetres van ser analitzats catorze dies després de la infecció amb la dosi intermitja d’adenovirus. No es van observar signes aparents de necrosi hepàtica a nivell macroscòpic durant la necròpsia, ni tampoc nivells de GPT en sèrum significativament fora dels marges de la normalitat en aquest model de ratolí (Figura 45 A). A més, tampoc es van trobar signes d’apoptosi, estimats com a l’activitat caspasa 3 hepàtica (Figura 45 B). D’altra banda també es va voler investigar si les seqüències de shRNA dissenyades (Ff i 664) eren inductores de toxicitat a les dosis emprades en aquest estudi, ja que, s’ha descrit que algunes seqüències de siRNA i shRNA desencadenen un efecte tòxic (159; 160; 163) que pot ariibar a ser letal (164). Aquesta possibilitat es va descartar en no trobar activació de l’expressió gènica de l’enzim 2’oligoadenilat-ciclasa (OAS2), un dels gens diana de la via d’activació de RNAsaL i mediador dels efectes tòxics derivats del dsRNA (Figura 45 C). Addicionalment, durant el període experimental, no es van observa signes de malaltia fora dels relacionats amb la patologia diabètica del model de ratolí db/db.

CT

AdU6-F

f

AdU6-6

640

255075

100125150175

GP

T(U

/l)

A B

C-

AdU6-F

f

AdU6-6

64 C+0

500

1000

1500

2000

Cas

pasa

3 (U

/�g

prot

)

CT

AdU6-F

f

AdU6-6

640.000.250.500.751.001.251.501.75

OA

S 2

mR

NA

(uni

tats

rela

tives

)

C

Figura 45. El tractament de ratolins db/db amb adenovirus recombinants per shRNA no s’acompanya de signes greus de toxicitat derivats de la infecció amb adenovirus recombinants de seqüències de shRNA. Ratolins db/db es van infectar amb 2.5*109 p.f.u. d’adenovirus control (AdU6-Ff) o codificant per un shRNA per PEPCKC (AdU6-664), o amb salí fisiològic (CT). Catorze dies després es van analitzar els nivells de transaminases en sèrum (A), l’activitat cspasa 3 en fetge (B) i l’expresió gènica relativa de la 2’oligoadenilat-ciclasa (OAS2) en fetge (C). Com a controls positiu i negatiu d’apoptosi es van utilitzar extractes hepàtics de ratolins no diabètics injectats intraperitonialment. amb salí o galactosamina + LPS tal i com es descriu als Materials i mètodes.

- 104 -


En vista dels resultats descrits es van fixar les condicions experimentals de l’estudi, tal i com s’il·lustra a la figura 46 i es detalla a continuació: Per a obtenir un efecte de silenciació parcial de PEPCK-C al fetge dels ratolins db/db es va optar per una dosi d’adenovirus intermitja (2.5*105 p.f.u.). La supressió parcial de PEPCK-C podria, hipotèticament, ser suficient per a tenir un efecte positiu sobre l’homeòstasi de la glucosa sense afectar negativament el metabolisme energètic, és a dir, mantenint una cataplerosi suficient per a sustentar el cicle de Krebs. Per a aconseguir una silenciació total o quasi total de PEPCK-C al fetge dels ratolins db/db es va optar per emprar la dosi alta (5*105 p.f.u.). En posteriors experiments, aquestes càrregues virals, van ser corregides pel pes mig dels animals (32 grams), per tal d’estandarditzar les dosis aplicades a cada animal i minimitzar la variabilitat deguda a la càrrega viral. Així, la dosi intermitja correspon a 6.67*1010 p.f.u./kg i la dosi alta correspon a 13.34*1010 p.f.u./kg.

C57BKS Lepr -/- db/db�6-8 setmanes


mRNAproteïna

RonyóTABMúscul

15:00 p.m.Salí i.v.• CTAdenovirus i.v. 2-5*109 pfu•AdU6-Ff•AdU6-664

alimentació

Control de glucosa i pes9:00 h

IPGTTPHGPlasma

IPITTGàbia metabòlica

d4d0 d2 d6dejuni 36h

d8 d10 d12 d14

Control de glucosa i pes

1

dejuni O/N

RIP 9:00 a.m

2

C57BKS Lepr -/- db/db�6-8 setmanes


mRNAproteïna

RonyóTABMúscul

15:00 p.m.Salí i.v.• CTAdenovirus i.v. 2-5*109 pfu•AdU6-Ff•AdU6-664

alimentació

Control de glucosa i pes9:00 h

IPGTTPHGPlasma

IPITTGàbia metabòlica

d4d0 d2 d6dejuni 36h

d8 d10 d12 d14

Control de glucosa i pes

1

dejuni O/N

RIP 9:00 a.m

2

A B

Figura 46. Protocol experimental aplicat en la infecció de vectors adenovirals de shRNA en ratolins db/db.

Els experiments es van finalitzar dues setmanes després de la infecció, un període mitjà que ens podria permetre veure el possible efecte sobre el desenvolupament de la resistència a insulina i obesitat en el model de ratolí diabètic db/db. Aquest punt va ser escollit en base a dos fets: a) en els experiments en els que vam assajar la capacitat de silenciació a diferents temps, vam trobar la millor eficiència a les dues setmanes de la infecció (Figura 43) i b) el model de ratolí diabètic db/db

- 105 -

Silenciació de PEPCK-C hepàtica en ratolins db/db

presenta un patró progressiu de desenvolupament d’hiperinsulinèmia, hiperglucèmia i resistència a insulina, que s’inicia a partir de la quarta setmana d’edat. La injecció de l’adenovirus es realitzà entre la sisena i vuitena setmanes de vida, moment en que la fisiopatologia diabètica està en plena progressió. Finalment, i donat el nostre interès d’estudiar els efectes indirectes de la silenciació de PEPCK-C hepàtica sobre l’homeòstasi de la glucosa i els lípids, la majoria dels anàlisi es van realitzar en alimentació, excepte que no s’indiqui el contrari. Alternativament, amb l’objectiu d’analitzar alguns aspectes puntuals es van realitzar anàlisis (gàbies metabòliques, IPITT, IPGPT, IPGTT...) després de sotmetre els animals a dejuni. Aplicant les condicions anteriorment descrites, el tractament amb AdU6-664 aconsegueix una reducció d’aproximadament un 50% en l’abundància de el mRNA de Pck1 en situació d’alimentació, en comparació amb l’adenovirus control AdU6-Ff (58.1 ± 10.3 vs. 100 ± 19.9 unitats relatives). El percentatge de mRNA silenciat es redueix a un 25% quan l’animal és sotmès a un dejuni d’una nit (93.3 ± 13.1 vs. 133.5 ± 13.1 unitats relatives), tal i com es pot apreciar a la figura 47. Cal destacar que la reducció neta d’mRNA de Pck1 és la mateixa tant en dejuni com en alimentació, per tant, la capacitat de silenciament podria dir-se que és constant, sent l’increment en l’abundància del mRNA de Pck1 (un 33%) el responsable del menor percentatge de silenciament en dejuni. Com s’ha explicat a l’apartat introductori, PEPCK-C està regulada exclusivament a nivell transcripcional a través de l’eix insulina/glucagó i, en dejuni i diabetis, la taxa de transcripció es veu incrementada (Figura 15).

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

dejunialimentació

p=0,05

p=0,06

pck-

1 m

RN

A(u

nita

ts a

rbitr

àrie

s)

Figura 47. Silenciació post-transcripcional del gen Pck1. Ratolins db/db d’entre 6 i 8 setmanes d’edat van ser infectats amb una dosi intermitja de 6.67*1010 p.f.u./Kg d’adenovirus recombinant codificant per a un shRNA inespecífic (AdU6-Ff) o específic contra PEPCK-C (AdU6-664). Dues setmanes després, l’anàlisis per PCR quantitativa a temps real confirma la reducció en el contingut del mRNA de Pck1 al fetge tant en alimentació (p=0.05, test T de Student, n=11) com en dejuni (p=0.06, test t de Student, n=6). Les dades representen la mitja ± ES de la quantitat de mRNA de Pck1 respecte als animals control (infectats amb AdU6-Ff) en alimentació.

- 106 -


En correlació amb l’anàlisi del mRNA, l’anàlisi per Western blot del contingut proteïc de PEPCK-C (Figura 48 A) confirma la major eficiència de silenciamentde PEPCK-C al fetge en els animals en estat d’ alimentació. La quantificació densitomètrica dels blots (Figura 48 B) demostra més d’un 50% de silenciació de PEPCK-C en alimentació (100 ± 15.1 vs. 46.1 ± 6.8 unitats relatives; n=11, p<0.01), percentatge que es redueix a un 20%, aproximament, quan els animals són dejunats durant la nit abans a l’anàlisi (100 ± 5.8 vs. 83.3 ± 4.6 unitats relatives; n=5; p<0.05). No hem d’oblidar, però, que PEPCK-C també és present en teixits com el ronyó i el teixit adipós, on hi té importants funcions en la gluconeogènesi i gliceroneogènesi, respectivament (70). És obvi, doncs, que per a evitar efectes no desitjats és important que la silenciació sigui específica al fetge. La selecció dels vectors adenovirals per a vehiculitzar els shRNA obeeix a una doble intenció: a) el tropisme natural dels adenovirus del serotip 5 pel fetge quan son administrats sistèmicament i b) l’elevada eficiència de transducció sobre aquest teixit (197). No obstant, vam voler confirmar que el tropisme selectiu dels adenovirus es corresponia amb un efecte de silenciació específic de teixit. Es va analitzar, per tant, el contingut proteic de PEPCK-C al ronyó i al teixit adipós epididimal. La figura 48 mostra que no hi ha cap efecte de silenciació en aquests teixits.

Fetge Ronyó TAB0

20

40

60

80

100

120 **

PEPC

K-C

(uni

tats

rela

tives

)

PEPCK

�-tubulinRonyó

PEPCK

�-tubulinTAB

AdU6-Ff AdU6-664

PEPCK

�-tubulinFetge

PEPCK

�-tubulinRonyó

PEPCK

�-tubulinTAB

AdU6-Ff AdU6-664

PEPCK

�-tubulin

AdU6-Ff AdU6-664

PEPCK

�-tubulinFetge

A B

Figura 48. Silenciació específica en fetge de PEPCK-C mitjançant un adenovirus recombinant codificant per un shRNA. A: L’anàlisi per Western blot del contingut proteïc de PEPCK en fetges d’animals alimentats (alim.) i dejunats (dej.), així com en ronyó i teixit adipós en alimentació. Tots els blots es van normalitzar per��-tubulina. Es mostren membranes representatives, de tres experiments independents. B: Quantificació densitomètrica del contingut de PEPCK-C en alimentació en fetge, ronyó i teixit adipós. Fetge en alimentació: n=11; fetge en dejuni: n=5; ronyó: n=4; TAB: n=4. Les dades representen les mitges ± ES respecte el tractament control. *p<0.05; **p<0.05, test t de Student.

- 107 -

Silenciació de PEPCK-C hepàtica en ratolins db/db

Addicionalment, l’anàlisi immunohistoquímic dels fetges mostra una reducció qualitativa en la intensitat del marcatge fluorescent, corresponent a PEPCK-C, en els fetges tractats AdU6-664 en comparació amb els tractats amb AdU6-Ff (Figura 49). La tinció no homogènia a través de l’eix porto-central suggereix una reducció absoluta constant del contingut de PEPCK-C, que està doncs, essent silenciada amb una potència similar en les regions perivenosa i periportal. Això es tradueix en una reducció relativa més potent a la regió pericentral, donada la distribució zonal de la PEPCK-C en un gradient decreixent al llarg de l’eix porto-central (63; 219).

AdU6-Ff

AdU6-664

PP PV

AdU6-Ff

AdU6-664

PP PV

Figura 49. Immunodetecció de PEPCK-C als fetges tractats amb els adenovirus recombinants codificants per shRNA. Catorze dies després de la infecció amb els adenovirus recombinants es van obtenir es fetges en alimentació i es van realitzar crioseccions de 7 �m, sobre les quals es va immunodetectar PEPCK-C. La distribució de PEPCK-C a través de l’acinus hepàtic en ratolins db/db alimentats es mostra en vermell. Els panells de l’esquerra són ampliacions 100X i els del mig i l’esquerra detalls 400X de les regions periportals (PP) i perivenoses (PV), respectivament.

La reducció del contingut de PEPCK-C hepàtica millora l’homeòstasi de la glucosa. Vàrem voler constatar els efectes de la reducció de PEPCK-C en fetge sobre l’homeòstasi de la glucosa en el context de la diabetis tipus II. L’evolució de la glucèmia en alimentació es va controlar periòdicament, durant dues setmanes, i es va comparar amb la glucèmia a l’inici del tractament de cada animal (Figura 50). Es va confirmar un clar efecte hipoglucemiant del tractament amb AdU6-664, respecte dels tractaments control (injectat amb salí) i AdU6-Ff (adenovirus control). El màxim

- 108 -


efecte hipoglucemiant es va trobar al cinquè dia posterior a la infecció, i es mantenia fins a la finalització de l’experiment. Un fet molt interessant és l’efecte coincident sobre la glucèmia en alimentació entre la reducció parcial de PEPCK-C i el tractament oral amb metformina, fàrmac antidiabètic emprat per al tractament de la diabetis tipus II.

0 2 4 6 8 10 12 14

-250

-200

-150

-100

-50

0

50

**** # #

Temps post-infecció (dies)

Glu

cosa

(mg/

dl)

Figura 50. Efecte sobre la glucèmia de la reducció parcial de PEPCK-C hepàtica. A: La glucèmia es va mesurar a les 8 h del matí, els dies indicats posteriors a la infecció en els grups injectats amb salí (CT, n=5, cercles blancs), adenovirus control (AdU6-Ff; n=19; cercles negres) i adenovirus codificant per l’shRNA de PEPCK (AdU6-664; n=19; triangles negres) a una dosi intermitja, o bé en animals administrats amb una dosi diària oral de 400 mg/Kg de metformina a través de l’aigua de beguda durant les dues setmanes de durada de l’experiment (MET; n=5; triangles blancs). Les dades representen les mitges ± error estàndard de la diferència entre la glucèmia en el dia indicat respecte de la glucèmia a dia 0, és a dir, prèvia a l’inici de l’experiment. La significació estadística es determinà mitjançant un test t de Student. * p<0.05 i **p<0.01, AdU6-664 vs AdU6-Ff ; ##p<0.01 MET vs CT Dues setmanes després de la infecció amb l’adenovirus codificant pel shRNA contra la PEPCK-C l’efecte hipoglucemiant en alimentació persistia i, a més, era estadísticament significatiu (Figures 50 i 51 A). La glucèmia en alimentació del AdU6-664 (271 ± 23 mg/dl, n=19) era significativament inferior, tant respecte al grup control injectat amb salí (CT) (409 ± 48 mg/dl, n=5), com al grup infectats amb l’adenovirus codificant pel shRNA inespecífic (AdU6-Ff) (370 ± 38 mg/dl, n=19). En contraposició, la glucèmia en dejuni no va experimentar cap canvi en resposta al tractament amb la dosi intermitja (Figura 52). Aquest fet es podria explicar per una compensació de la glucèmia en dejuni a través de la glicogenòlisi, com suggereix la reducció ostensible del contingut de glicogen hepàtic en dejuni en el grup AdU6-664 (Taula 13). En canvi, sí que es va poder observar una reducció en la glucèmia en dejuni quan el contingut hepàtic de PEPCK-C residual quedava reduït a

- 109 -

Regulació coordinada de la gluconeogènesi hepàtica

un 10% aproximadament, mitjançant la injecció amb la dosi alta d’adenovirus. A més, en els animals tractats amb aquesta dosi alta, el contingut de glicogen hepàtic es reduí sensiblement fins i tot en alimentació (Figura 51 C). Aquestes dades, juntament amb l’anàlisi dels nivells residuals de mRNA i proteïna en alimentació i dejuni amb la dosi intermitja que s’han mostrat a les figures 47 i 48, són suggestives de que, en dejuni, degut a l’increment del mRNA de Pck1, l’eficiència de silenciació decreix i resulta, a la dosi intermitja testada, insuficient per a contrarestar la hiperglucèmia en dejú. Sembla ser, doncs, que es requereix un increment de la dosi d’adenovirus per a silenciar PEPCK-C per sobre d’un llindar per a que aquest silenciament es reflexi en un efecte hipoglucemiant en dejuni.

AdU6-F

f

AdU6-6

640

100

200

300 *

Glic

ogen

(mM

/g fe

tge)

CT

AdU6-F

f

AdU6-6

640

100

200

300

400

500*

*

Glu

cosa

(mg/

dl)

**A B C

Dosi altaDosi intermèdia

CT

AdU6-F

f

AdU6-6

640

20

40

60

80

100

Glu

cosa

(mg/

dl)

Figura 51. Efecte sobre la glucèmia de la reducció parcial vs reducció total de PEPCK-C hepàtica. A: Ratolins db/db d’entre 6 i 8 setmanes d’edat van ser infectats amb una dosi intermitja de 6.67*1010 p.f.u../Kg.: Glucèmia catorze dies després de la injecció en alimentació (barres negres) o set dies després del tractament en dejuni de 32 hores (barres blanques). La significació estadística es determinà mitjançant un test t de Student; *p<0.05. B: Glucèmia en dejuni (32 hores) catorze dies després de la infecció amb la dosi alta (13.34*1010 p.f.u../Kg). *p<0.05, CT: n=5; AdU6-Ff i AdU6-664: n=9, test t de Student. C: Contingut de glicogen hepàtic en animals alimentats vint-i-un dies després de la infecció amb la dosi alta d’adenovirus. n=9, *p<0.05, test t de Student. Les dades representen les mitges ± error estàndard. La reducció sostinguda en el temps de la glucèmia observada en els ratolins db/db en resposta al tractament amb AdU6-664 podria esdevenir com a: a) resultat directe de la reducció de la producció hepàtica de glucosa, secundària a la reducció de la activitat enzimàtica PEPCK-C al fetge, o b) conseqüència indirecta d’una millora en la sensibilitat a glucosa i/o a la insulina. Aquestes possibilitats es van investigar a continuació:

- 110 -


Regulació coordinada de la gluconeogènesi hepàtica Per tal d’avaluar com afecta a un fetge diabètic la disminució del contingut de PEPCK-C sobre el flux gluconeogènic i la producció hepàtica de glucosa, es va assajar la producció de glucosa a partir de piruvat in vivo. A tal efecte es va realitzar un assaig intraperitonial de producció de glucosa (IPGPT), en el qual els ratolins són injectats intraperitonialment amb una solució de piruvat i, seguidament, es segueix l’evolució de la glucèmia durant les dues hores posteriors. En l’IPGPT els fetges amb un contingut inferior de PEPCK-C mostraren una capacitat significativament inferior de generar glucosa a partir de piruvat (Figura 52). L’àrea sota la corba, indicativa de la glucosa produïda a partir de piruvat, és un 35% inferior en el grup AdU6-664, respecte del grup control AdU6-Ff, suggerint que aquests fetges tenen una menor capacitat gluconeogènica. En consonància, els fetges dels ratolins tractats amb AdU6-664, quan eren sotmesos a dejú, tenien un contingut de glicogen significativament inferior (Taula 13), reforçant la idea de que la reducció del contingut de PEPCK-C al fetge hi comporta una reducció en la capacitat gluconeogènica.

*

0 25 50 75 100 125

100

150

200

250

300

350

400

450

Temps (min)

Glu

cosa

(% re

pect

e l'i

nici

)

*

0 25 50 75 100 125

100

150

200

250

300

350

400

450

Temps (min)

Glu

cosa

(% re

pect

e l'i

nici

)

Figura 52. Capacitat de producció hepàtica de glucosa reduïda com a conseqüència de la silenciació de PEPCK-C al fetge. La producció hepàtica de glucosa es va avaluar in vivo assajant la producció de glucosa a partir de piruvat en un IPGPT. Set dies després de la infecció amb AdU6-Ff o AdU6-664, els ratolins es van posar en dejuni durant 32 hores i se’ls va injectar i.p. un bolus de piruvat (2g/Kg). L’evolució de la glucosa en sang es va controlar als temps indicats. AdU6-664 (triangles negres), AdU6-Ff (cercles blancs). El test estadístic ANOVA bidimensional va detectar diferències significatives de la corba entre els dos grups (p< 0.05). Les dades són les mitges ± ES; n=9. També es va analitzar els nivells d’expressió dels gens codificants per a enzims i factors de transcripció implicats en la gluconeogènesi. La glucosa 6-fosfatasa catalitza l’últim pas de la via gluconeogènica i glicogenolítica i és, per tant responsable de la regulació de l’alliberació de glucosa pel fetge. Tant la glucosa 6-fosfatasa (codificat per G6pc), com la PEPCK-C (codificat per Pck1)

- 111 -

Regulació coordinada de la gluconeogènesi hepàtica

estan regulats a nivell transcripcional per factors de transcripció com HNF4-� (codificat per Hnf4-�) i

PGC-1� (codificat per Ppargc1�), el mRNA dels quals minvava en els animals amb PEPCK-C

silenciada en alimentació (Figura 53 A). Malgrat tot, aquesta reducció a nivell de mRNA no es veia

reflexada a nivell de proteïna: el contingut proteic de PGC-1� en extractes nuclears romangué

invariable en els dos grups experimentals (Figura 53 B). No obstant, segons Puigserver i col·laboradors (72), l’activació transcripcional de gens gluconeogènics com Pck1 i G6pc requereix

una acció coordinada entre HNF4-� i PGC-1�; per tant, la reducció de HNF4-� mesurada en els

animals AdU6-664 podria ser suficient per a suposar una regulació negativa de la via.

A

B C

0

50

100

150

PGC

-1�

/ �-t

ubul

ina

(uni

tats

rel

ativ

es)

FOXO1FOXO1-P

AdU6-Ff AU6-6640

100

200

300 *

FOXO

1/FO

XO1-

P(u

nita

ts r

elat

ives

)

FOXO1FOXO1-P

AdU6-Ff AU6-664

FOXO1FOXO1-P

AdU6-Ff AU6-6640

100

200

300 *

FOXO

1/FO

XO1-

P(u

nita

ts r

elat

ives

)

g6pc hnf4� ppar�c1�

0.6

0.8

1.0

1.2 **

mR

NA

(uni

tats

rela

tives

)

AdU6-Ff AdU6-664PGC-1�

�-tub

AdU6-Ff AdU6-664PGC-1�

�-tub Figura 53. Reducció coordinada dels gens gluconeogènics com a conseqüència de la silenciació de PEPCK-C al fetge. A: Els nivells de mRNA de gens implicats en la gluconeogènesi (G6pc, Hnf4-� and Ppargc1�) van ser quantificats en mostres de fetge d’animals alimentats dues setmanes després del tractament amb AdU6-Ff (n=10; columnes negres) o AdU6-664 (n=11; columnes blanques). Cada valor representa la mitja de cada grup relativa a la mitja del grup control ± ES. *p<0,05, test t de Student. B: Anàlisi per Western blot (panell inferior) i quantificació densitomètrica (n=6; panell superior) del contingut nuclear de PCG-1� en extractes nuclears de fetges. La càrrega del gel es va normalitzar amb �-tubulina C: Anàlisi per Western blot (panell inferior) i quantificació densitomètrica (panell superior; n=10) del grau de fosforilació de FOXO1 al residu Ser256 en extractes totals de fetges. El contingut de FOXO1 total es va fer servir com a normalitzador.

- 112 -


D’altra banda, el grau de fosforilació de FOXO1 al residu Ser256 es veu incrementat sensiblement en extractes totals de fetges en alimentació en els ratolins AdU6-664 en comparació amb els AdU6-Ff (Figura 53 C). En absència d’insulina (en dejuni o situacions de resistència a la hormona), FOXO1

forma part d‘un complex transcripcional amb PGC-1� i HNF4-� i s’uneix als motius IRE dels

promotors dels gens gluconeogènics com Pck1 i G6pc. En resposta a insulina, FOXO1 és fosforilat per AKT, fet que comporta la seva exclusió nuclear, contribuint així a la reducció en la transcripció d’aquests gens gluconeogènics. Per tant, el major grau de fosforilació de FOXO-1 podria ser un efecte derivat de la millora de la sensibilitat a insulina. FOXO1 ha estat descrit com a mediador de la senyalització d’insulina en la regulació negativa dels gens gluconeogènics (79) i la supressió de la seva activitat transcripcional comporta una reducció de la producció hepàtica de glucosa acompanyada d’una millora l’homeòstasi de la glucosa i en la sensibilitat a la insulina tant al fetge com als teixits perifèrics (118; 120). Aquestes dades suggereixen que una possible millora en la senyalització de la via d’insulina en resposta a la silenciació parcial de PEPCK-C contribueix a l’increment de la fosforilació depenent d’AKT sobre FOXO1, contribuint així a una retroalimentació en la regulació negativa de la gluconeogènesi.

La reducció del contingut de PEPCK-C hepàtica millora la sensibilitat perifèrica a la glucosa i a la insulina Es va analitzar, a continuació, la possible millora en la sensibilitat a insulina. Es va avaluar la capacitat de captació de glucosa sistèmica en un test de tolerància a la glucosa. Vam observar una millora en la tolerància a la glucosa en el grup AdU6-664, amb una reducció significativa de l’àrea sota la corba d’un 40% i un 20% en comparació amb els grups CT i AdU6-Ff, respectivament (Figura 54 A). Tot i partir del mateix punt, el pic hiperglicèmic als 30 minuts després del bolus és significativament inferior en el grup AdU6-664 (Figura 54 B). Això podria ser indicatiu d’una major capacitat d’aclarament del bolus de glucosa pel fetge i/o pels teixits perifèrics. En concordància amb els resultats de glucèmia i sensibilitat a glucosa, la insulinèmia es va reduir significativament al grup AdU6-664, tant en alimentació com en dejuni (Figura 56 A). Addicionalment, es va fer una estimació del grau de resistència a insulina a partir de l’índex QUICKI (223), que permet evaluar quantitativament la sensibilitat a insulina d’un individu a partir dels valors d’insulinèmia i glucemia en dejuni segons una senzilla fórmula (Figura 55). La inversa de l’index QUICKI ens dóna l’índex de resistència a insulina (IR). Els animals tractats amb AdU6-664 tenien un IR

- 113 -

Paper de PEPCK-C hepàtica en la sensibilitat a insulina

significativament inferior als dels animals control (2.38 ± 0.01, n=14 vs. 2.74 ± 0.07**, n=5, i vs. 2.53 ± 0.01*, n=14; test t de Student, AdU6-664 vs. CT i vs. AdU6-Ff, respectivament).

CT

AdU6-F

f

AdU6-6

640

100

200

300

400

500

600 *###

Glu

cosa

(mg/

dl)

0 25 50 75 100

0100200300400500600

Temps (min)

Glu

cosa

(mg/

dl)

‡†*

**#####

###

A B

Figura 54. Millora de la tolerància a la glucosa després del tractament amb AdU6-664. A: Set dies després del tractament, ratolins prèviament dejunats per un període de 32 hores van ser sotmesos a un test de tolerància a glucosa (IPGTT). Un bolus de 1g/Kg de glucosa en va injectar intraperitonialment- La glucèmia es va controlar en els temps indicats (CT; n=5, AdU6-Ff; n=13, AdU6-664, n=12) *p<0.05 AdU6-664 vs AdU6-Ff; ##p<0.01; i ###p<0.001 Ad-U6-664 vs CT segons un tets t de Student. La significació estadística es va determinar mitjançant un test ANOVA bidimensional. Els grups CT i AdU6-Ff no es comporten significativament diferent entre ells, però sí respecte el grup AdU6-664 (‡p<0.001 i †p<0.05 respectivament). B: Glucèmia als 30 minuts després de la injecció del bolus de glucosa. Les dades representes les mitges ± ES.

QUICKI =glucèmia en dejú (mg/dl)

Log10

glucèmia en dejú (mg/dl)insulinèmia en dejú (ng/ml)

QUICKI =glucèmia en dejú (mg/dl)

Log10

glucèmia en dejú (mg/dl)insulinèmia en dejú (ng/ml)

Figura 55. Càlcul de l’índex QUICKI.

Finalment, una tercera evidència que apunta a una millora en el grau de sensibilitat a insulina indirectament derivada de la disminució de PEPCK-C en fetge en als ratolins diabètics db/db, és la major resposta hipoglucemiant en front a un bolus d’insulina d’aquests animals tenien en comparació amb els grups control (Figura 56 B).

- 114 -


En conjunt, aquestes dades demostren que una reducció parcial del contingut de PEPCK-C al fetge té un efecte beneficiós sobre la tolerància perifèrica a glucosa en els ratolins diabètics db/db i suggereixen una millora en la senyalització de la insulina en el teixits perifèrics.

A B

Alimentació Dejuni0

2

4

6

8

10

*

**

Insu

lina

(ng/

ml)

0 25 50 75 100 125

100

200

300

400

500

600

*

Temps (min)

Glu

cosa

(mg/

dl)

A B


2

4

6

8

10

*

**

Insu

lina

(ng/

ml)

0 25 50 75 100 125

100

200

300

400

500

600

*

Temps (min)

Glu

cosa

(mg/

dl)

Figura 56. Millora de la insulinèmia i la resposta a insulina en els animals tractats amb AdU6-664. A: Els nivells d’insulina plasmàtica es van mesurar a dia catorze post-infeccció en animals alimentats (AdU6-Ff; n=5 i AdU6-664; n=4) o a dia set després d’un dejuni de 32 hores. AdU6-Ff; n= 13, AdU6-664; n=12, *p<0.05, ** p<0.05, test t de Student. B: El test de tolerància a insulina es va realitzar vuit dies després de la infecció en animals alimentats. Un bolus d’insulina de 2 IU/kg es va injectar intraperitonialment. La glucèmia es va controlar als temps indicats (CT: cercles blancs, n=5; AdU6-Ff: cercles negres, n= 8 i AdU6-664: triangles negres, n=9). *p<0.05, test t de Student CT vs AdU6-664. p=0.09 AdU6-664 vs AdU6-664 A continuació, per a refermar la hipòtesi d’una millora en la sensibilitat a la insulina als teixits perifèrics, vam avaluar la via de senyalització d’insulina. La unió de la insulina al seu receptor, provoca una cascada de fosforilacions que activa la via de transducció de senyals de PI3K, a traves de la qual AKT és fosforilada als residus serina 473 i treonina 308. Un cop fosforilada, AKT fosforila i regula l’activitat d’altres enzims i factors de transcripció. A fetge, AKT fosforila FOXO-1 promovent la seva exclusió nuclear i bloquejant així la seva activitat transcripcional sobre els gens gluconeogènics (79). Al múscul i teixit adipós, promou el transport de glucosa a través del transportador Glut4. També promou la síntesi de glicogen a través de la fosforilació de GSK3ß a múscul i fetge. Com a indicador de la funcionalitat de la via de senyalització de la hormona es va analitzar el nivell d’activació d’AKT al fetge, teixit adipós i múscul (segons el grau de fosforilació d’AKT als residus Ser473 i Thr308) en resposta a un bolus d’insulina de 10 U/kg, que produeix un pic en la fosforilació de IR i IRS-1 als 5 minuts (224). Als ratolins db/db, com a conseqüència de la resistència a insulina, aquest pic de

- 115 -

Paper de PEPCK-C hepàtica en la sensibilitat a insulina

fosforilació està atenuat, en comparació amb un ratolí sa. Aquest experiment, per tant, ens aporta informació sobre la capacitat de la insulina d’activar d’AKT.

A

InsulinaFETGE

- - + + - - + +CT

- - + +AdU6-Ff AdU6-664

AKT-P Ser 473

AKT-P Thr 308

AKT

InsulinaFETGE

- - + + - - + +CT

- - + +AdU6-Ff AdU6-664

AKT-P Ser 473

AKT-P Thr 308

AKT

FETGE

- - + + - - + +CT

- - + +AdU6-Ff AdU6-664

AKT-P Ser 473

AKT-P Thr 308

AKT

- - + + - - + +CT

- - + +AdU6-Ff AdU6-664

AKT-P Ser 473

AKT-P Thr 308

AKT

AKT-P Ser 473

AKT-P Thr 308

AKT

- - + + - - + +CT

- - + +AdU6-Ff AdU6-664

MÚSCUL

InsulinaAKT-P Ser 473

AKT-P Thr 308

AKT

- - + + - - + +CT

- - + +AdU6-Ff AdU6-664

MÚSCUL

AKT-P Ser 473

AKT-P Thr 308

AKT

- - + + - - + +CT

- - + +AdU6-Ff AdU6-664

MÚSCUL

AKT-P Ser 473

AKT-P Thr 308

AKT

- - + +- - + + - - + +- - + +CT

- - + +- - + +AdU6-Ff AdU6-664

MÚSCUL

Insulina

- - + + - - + +CT

- - + +AdU6-Ff AdU6-664

TAB

AKT-P Ser 473

AKT-P Thr 308

AKT

Insulina - - + + - - + +CT

- - + +AdU6-Ff AdU6-664

TAB

AKT-P Ser 473

AKT-P Thr 308

AKT

- - + +- - + + - - + +- - + +CT

- - + +- - + +AdU6-Ff AdU6-664

TAB

AKT-P Ser 473

AKT-P Thr 308

AKT

Insulina

B

C

D

E

F

- +0

50100150200250300

Ser473

*#

AKT-

P/AK

T(u

nita

ts a

rbitr

àrie

s)

- +0

100200300400

500600

Ser473

*

AKT-

P/AK

T(u

nita

ts a

rbitr

àrie

s)

- +0

100

200

300

400

500

Ser473

*

AKT-

P/AK

T(u

nita

ts a

rbitr

àrie

s)

- +0

400

800

1200

1600

Thr308

*#

- +0

400

800

1200

1600

Thr308

*

- +0

100

200300

400500600

Thr308

Figura 57. Millora de la senyalització d’insulina. La senyalització d’insulina en fetge i teixits perifèrics (teixit adipós i múscul) es va estimar segons el grau de fosforilació d’AKT en resposta a un bolus d’insulina (10 IU/kg) en ratolins db/db dejunats durant la nit set dies després de la injecció amb salí (CT), adenovirus control (AdU6-Ff), o adenovirus codificant per a un shRNA contra la PEPCK-C (AdU6-664). Es van prendre mostres dels teixits tant abans (-) com cinc minuts després (+) del bolus d’insulina. El grau de fosforilació als residus Ser473 i Thr308, així com el contingut total d’AKT es va detectar per Western blot en fetge (A), múscul (B) i teixit adipós epididimal(C). La quantificació densitomètrica corresponent a fetge (D), múscul (E) i teixit adipós epididimal (F) es mostra a les gràfiques de la dreta. Les barres grises representen el grup CT, les negres el grup AdU6-Ff i les blanques el grup AdU6-664. n=4-6; # p=0.05, *p<0.05, **p<0.01, test t de Student.

- 116 -


Als grups control no infectat (CT) i AdU6-Ff la fosforilació d’AKT als residus Ser473 i Thr308, o bé es manté als nivells basals, o incrementa suaument en resposta al bolus d’insulina. En contraposició, al grup AdU6-664 hi ha un increment ostensible en el grau de fosforilació d’AKT a la Ser473 després del bolus d’insulina, tant al fetge com al teixit adipós i al múscul esquelètic (Figura 57). En canvi, la fosforilació a la Thr308 és sensiblement superior en el grup AdU6-664 al fetge i al múscul, però no al teixit adipós. No obstant, Ono et al. (225) han descrit que, als adipòcits, la fosforilació d’aquest residu està regulat negativament per PTEN (proteïna fosfatasa que desfosforila el PIP3 (fosfoinositol-(3,4,5)-trifosfat), resultant en la inactivació d’AKT), però que aquesta regulació no limita la captació de glucosa en resposta a insulina, procés regulat estretament per la fosforilació sobre el residu Ser473. D’altra banda un major grau de fosforilació de FOXO-1 en alimentació als fetges dels ratolins tractats amb AdU6-664 (Figura 53 C), també és indicatiu d’una millora en la sensibilitat a insulina al fetge indirecta a la silenciació parcial de PEPCK-C. Aquestes dades confirmen una millora en la capacitat de senyalització d’insulina no només al fetge sinó també als teixits perifèrics, com a conseqüència de la reducció parcial de PEPCK-C hepàtica en el model murí de resistència a insulina db/db.

0 3 6 9 12 150

34

36

38

40

42

44

Temps post-infecció (dies)

Pes

(g)

A B C

0102030405060

**G

luco

sa (m

g/dl

)

Ingesta Beguda Orina Femta0

1

2

3

4

5

0

1

2

3

4

5*

**ml

grams

Figura 58. Efecte sobre el fenotip d’obesitat i diabetis de la reducció parcial de PEPCK-C hepàtica. A: Pes dels ratolins pres a les 8 del matí des del dia de la injecció amb salí (CT, n=5, cercles blancs), adenovirus control (AdU6-Ff; n=19; cercles negres) i adenovirus codificant per l’shRNA de PEPCK (AdU6-664; n=19; triangles negres). B: Set dies després de la infecció amb adenovirus control (AdU6-Ff; n=6; barres negres) i adenovirus codificant pel shRNA de PEPCK (AdU6-664; n=6; barres blanques) es van introduir els animals en gàbies metabòliques durant 24 hores. Es van recollir i/o quantificar la ingesta, beguda, orina i femtes. Les dades són les mitges ± ES. t de Student: *p<0.05; ** p<0.01. C: Vint-i-un dies després de la infecció amb la dosi alta d’adenovirus es va analitzar el contingut de glucosa en la orina dels animals en estat d’alimentació mitjançant un “Urine test” (Combur8 test, Boheringer). Les dades representen els valors individuals dels ratolins dels grups AdU6-Ff () i AdU6-664 (�). Es van analitzar 8 i 9 animals de cada grup, respectivament.

- 117 -

PEPCK-C en l’homeòstasi energètica al fetge

La polifàgia (increment de la ingesta), la poliúria (diüresi osmòtica), la polidípsia (increment de la set) i la glucosúria (presència de glucosa a la orina) són símptomes característics de la diabetis tipus II, que sovint va acompanyada d’obesitat, tret característic del model animal emprat en l’estudi. Per a determinar si els canvis a nivell molecular i en els diferents tests de sensibilitat a glucosa i insulina descrits tenien un reflex en la millora del fenotip diabètic, es va controlar l’increment de pes durant la durada dels experiment i es van realitzar estudis de gàbies metabòliques. Addicionalment, es va determinar la concentració de glucosa a la orina recollida de la bufeta dels animals en la necròpsia. Aquests estudis demostraren una millora del fenotip diabètic de polidípsia, poliúria polifàgia, i glucosúria però no en el desenvolupament de la obesitat, tal i com es mostra a la figura 58.

Conseqüències de la silenciació hepàtica de PEPCK-C sobre el metabolisme lipídic La dislipidèmia i la lipidosi hepàtica són característiques del fenotip diabètic. Amb l’objectiu d’investigar els efectes de la silenciació de PEPCK-C sobre el metabolisme lipídic, es van mesurar diferents paràmetres sanguinis i hepàtics. En l’anàlisi del matabòlits sèrics es va observar una reducció en el contingut de triglicèrids (TAG) d’aproximadament un 33%, tant en alimentació com en dejuni; efecte que anava acompanyat d’una tendència a la baixa en els nivells d’àcids grassos lliures (AGL) d’un 15% en alimentació i d’un 36% en dejuni. També es va trobar una tendència a l’alça dels cossos cetònics (ß-HBA) en sèrum d’un 33% en alimentació, percentatge que es duplica en dejuni i un increment net en el colesterol, amb un increment concomitant en la fracció HDL (Taula 12). L’anàlisi histològic del fetge mostra micro i macro-vesícules lipídiques amb una distribució zonal preferent a la regió perivenosa als fetges control, coherent amb la zonació metabòlica dels enzims lipogènics al llarg de l’eix portocentral hepàtic (63; 64). Aquestes vesícules són característiques de la lipidosi hepàtica del model db/db. Les seccions dels fetges del grup tractat amb el shRNA contra la PEPCK-C mostren un increment global de micro i macro-vesícules lipídiques, la distribució de les quals tendeix a desplaçar-se capa a la zona periportal (Figura 59 A), on PEPCK s’expressa amb major intensitat. En correlació amb l’anàlisi histològic, l’anàlisi bioquímic dels fetges ens mostra un increment moderat (d’un 60%) en el contingut de triglicèrids (TAG) en fetge, però una acumulació ostensible (d’un 350%) d’àcids grassos (AG) en el grup AdU6-664 respecte del grup control AdU6-Ff, en alimentació. De forma similar, després en dejú, el contingut de TAG i AG es duplica en el grup AdU6-664 respecte del grup control AdU6-Ff (Figura 59 B). En conjunt, aquestes dades ens estarien suggerint que l’increment del contingut lipídic als fetges amb PEPCK-C silenciada, respon

- 118 -


majoritàriament a una acumulació d’àcids grassos a la zona periportal, més que no pas un increment de la síntesi de triglicèrids als hepatòcits perivenosos.

AdU6-Ff

AdU6-664

PP PVA

B

Alimentació Dejuni0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

***

**

TAG

hep

àtic

s (m

mol

/g)


1

2

3

4***

*

AG

hep

àtic

s (m

mol

/g)

AdU6-Ff

AdU6-664

PP PVA

B


0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

***

**

TAG

hep

àtic

s (m

mol

/g)

AdU6-Ff

AdU6-664

PP PVA

B


0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

***

**

TAG

hep

àtic

s (m

mol

/g)


1

2

3

4***

*

AG

hep

àtic

s (m

mol

/g)

Figura 59. La silenciació de PEPCK-C en fetge de ratolins db/db accentua lleugerament la lipidosi hepàtica. A: Tinció oil red per a visualitzar els lípids hepàtics realitzada sobre crioseccions de 7μm dels fetges dels ratolins catorze dies post-infecció en alimentació. Els panells de la dreta mostren un camp global del fetge a una ampliació 100X. Amplliacions de les zones periportal (PP) i perivenosa (PV) es mostren a 200X. Les imatges són representatives de tres experiments independents. B: Quantificació del contingut de triglicèrids (TAG) i àcids grassos (AG) als fetges dels ratolins tractats amb el shRNA inespecífic (columnes negres, n=14) o dirigit contra PEPCK-C (columnes blanques; n=16) en alimentació o després d’un dejuni d’una nit. Les dades són les mitges ± ES, *p<0,05, **p< 0,01. Dissociació entre lipidosi hepàtica i resistència a insulina La resistència a insulina associada a la lipidosi hepàtica, està associada a l’acumulació de diferents espècies lipídiques (com acil-CoA de cadena llarga, ceramides o diacilglicerol) que actuen com a segons missatgers en l’atenuació de la via de senyalització de la insulina (22; 24). En els animals on

- 119 -


la PEPCK-C en fetge es silencia parcialment, sorprenentment, tot i la lipidosi observada, la sensibilitat a insulina millora, tal i com es mostra a les figures 56 i 57. Aquest no deixa de ser un fet paradòxic que vam voler estudiar més en profunditat. Recentment, s’ha descrit el paper essencial de PKC� en la mediació de l’atenuació de la senyalització d’insulina per part de segons missatgers de naturalesa lipídica (25). L’activació de PKC� per aquestes espècies lipídiques, fan que transloqui a la membrana i bloquegi l’activació de IRS1/2 (Figura 3). Ens vam proposar, doncs, estimar fins a quin punt la l’acumulació de TAG i AG als fetges tractats amb AdU6-664 podrien estar desencadenant aquests mecanismes d’inducció de resistència a insulina a través de la translocació de PKC� a la membrana plasmàtica. Es va detectar per Western blot la PKC� a la fracció membranosa i citosòlica d’homogenats hepàtics i es va quantificar el seu contingut a cada fracció per densitometria. Una major immunolocalització de PKC� a la fracció membranosa seria indicativa d’un major grau de translocació a la membrana de la quinasa i, per tant, suggestiu de que hi està bloquejant la senyalització de la insulina. Per tant, la relació membrana/citosol de PKC� servirà com a indicador molecular de la inducció per lípids de resistència a insulina.

AdU6-Ff AdU6-664

PKC�MC MC

L-PK

EGFR

AdU6-Ff AdU6-664

PKC�MC MC

L-PK

EGFR 0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

PK

C

(mem

bran

a/ci

toso

l)

A B

Figura 60. L’acumulació de lípids al fetge conseqüència de la silenciació de PEPCK-C no implica l’activació de les vies d’atenuació de la senyalització d’insulina per PKC�. A partir d’extractes totals de fetge, les fraccions citosòlica i membranosa es van separar per centrifugacions diferencials successives. A: 50 μg de cada una de les fraccions es van separar en un gel desnaturalitzant de poliacrilamida i el contingut de PKC� a cada fracció es va inmunodetectar per Western blot. Com a marcadors de la fracció citosòlica i membranosa es van utilitzar piruvat quinasa hepàtica (L-PK) el receptor del factor de creixement epitelial (EGFR) respectivament. B: La quantificació desitomètrica de les bandes, corrobora que la proporció de proteïna translocada del citosol a la membrana plasmàtica no varia conseqüència de la silenciació de PEPCK-C. Les dades són les mitges ± ES, n=6.

- 120 -


Els fetges dels ratolins db/db tractats amb el shRNA contra Pck1 no hi ha un major grau de translocació a membrana de PKC� (Figura 60). Podem descartar, per tant, que en nostre model hi hagi una una associació entre l’acumulació de lípids al fetge i l’atenuació de la senyalització d’insulina mediada per PKC�.

Paper integrador de PEPCK-C en el metabolisme energètic En el primer capítol d’aquest treball ja vam trobar indicis de que la reducció de PEPCK tenia implicacions més enllà de l’homeòstasi de la glucosa. Els resultats obtinguts en els models de ratolins genosuprimits han mostrat que, donat que l’activitat PEPCK-C és essencial en la cataplerosi, la supressió de l’enzim resulta en el bloqueig del cicle de Krebs i la funció mitocondrial al fetge. Com a conseqüència, hi ha una disminució de l’oxidació d’àcids grassos i del consum d’oxigen, acompanyat d’una desregulació total del metabolisme energètic i lipidosi hepàtica. Per tant, a continuació ens vam plantejar estudiar cada un d’aquests aspectes en el nostre model de silenciació parcial de PEPCK-C hepàtica en ratolins diabètics.

Síntesi de novo de lípids Per a discriminar si els lípids acumulats als fetges dels ratolins tractats provenien d’un increment de la síntesi de novo, de la reesterificació o de l’import d’àcids grassos circulants en sang o, pel contrari,

d’una disminució en la seva utilització (�-oxidació), es van analitzar el contingut proteic i l’expressió

gènica de diferents enzims i factors de transcripció involucrats en el metabolisme lipídic.

LXR�, de la família dels receptors nuclears d‘oxisterols, actua com a sensor de glucosa, colesterol i

lípids i controla l’expressió de gens relacionats amb la síntesi de colesterol i àcids grassos, com SREBP-1c i ChREBP a través dels elements de resposta a LXR (LXRE) en els seus promotors (18).

LXR� podria, per tant, estar mediant els efectes de la insulina i/o la glucosa sobre la lipogènesi

hepàtica (226). Als fetges dels ratolins tractats amb el shRNA contra Pck1 el mRNA de Lxr� es

redueix significativament, en comparació amb els ratolins tractats amb el shRNA control (Figura 61 A). Una disminució en la glucèmia, juntament amb el descens en la seva expressió, podrien contribuir a una menor activitat transcripcional sobre els seus gens diana.

- 121 -


ChREBP

p125 p6

8 GKFAS

L-PK

ACC0

20406080

100120

**

prot

eïna

(uni

tats

rela

tives

)

chrebp srebf1 fasn mod1 gck lxr�

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4 ** **

mR

NA

(uni

tats

rela

tives

)A

C

BAlimentació

FAS

Chrebpp125p68

�-tub

AdU6-Ff AdU6-664

GK

�-tubL-PK

ACC-PACC �-tub

FAS

Chrebpp125p68

�-tub

AdU6-Ff AdU6-664

GK

�-tubL-PK

ACC-PACC �-tub

Figura 61. La silenciació de PEPCK-C als fetges dels ratolins db/db no activa la lipogènesi. A: L’expressió d’alguns gens rellevants en la lipogènesi es va analitzar en fetges d’animals alimentats als catorze dies després de la infecció amb AdU6-Ff (n=10; columnes negres) o AdU6-664 (n=11; columnes blanques) per RT-PCR quantitativa en un sistema 7900HT Micro Fluidic Card d’Applied Biosystems. Les dades es van analitzar fent el càlcul de Ct utilitzant el gen de la ß-2-microglobulina com a normalitzador. Els valors representen la mitja de cada grup relativa a la mitja del grup control ± ES. *p< 0.05, **p< 0.01; test t de Student. B: Anàlisi per Western blot del contingut proteic de ChREBP, SREBP-1c, GK, FAS, L-PK i ACC, ACC-P Ser79 en homogenats en tampó RIPA de fetges alimentats. Les membranes es van normalitzar amb �-tubulina. Les imatges són representatives de tres experiments independents. C: Quantificació densitomètrica dels blots mostrats a B. Les dades són les mitges ± ES; n=5-18; test T de Student.

SREBP-1c i ChREBP són factors de transcripció de la família hèlix-loop-hèlix que s’uneixen als elements de resposta a insulina (IRE) i als elements de resposta a glucosa (GRE) respectivament, i regulen de forma sinergística l’expressió dels gens lipogèncis (FAS i ACC) i glicolítics (L-PK) al fetge en resposta a insulina i glucosa, respectivament (Figura 1). Després de la silenciació de PEPCK-C el nivell de mRNA d’aquests reguladors clau de la lipogènesi, o bé es manté estable, és el cas de ChREBP, o bé disminueix en un 25% aproximadament, com és el cas de SREBP-1c (Figura 61 A). Els nivells de proteïna corresponents corroboren el mateix patró: ChREBP roman constant, mentre que el contingut de les formes precursora (p125), localitzada al reticle endoplasmàtic, i activa (p68),

- 122 -


localitzada al nucli, de SREBP-1c disminueix en un 65% i un 60% respectivament segons demostra l’anàlisi densitomètric de les membranes (Figura 61 B i C). De forma paral·lela, l’expressió gènica i el contingut proteic dels enzims regulats per aquests factors de transcripció, implicats de forma directa o indirecta en la lipogènesi, es manté inalterada (és el cas de la Sintasa d’àcids grassos (Fasn), la glucoquinasa (Gck), piruvat quinasa (L-PK) o acetil-CoA carboxilasa (ACC)) o fins i tot es redueix sensiblement (és el cas de l’Enzim Màlic (Mod1)) (Figura 61 A). Aquest patró d’expressió descartaria, en principi, que l’activació de la lipogènesi de novo. El malonil-CoA és un important regulador de les vies de ß-oxidació i síntesi d’àcids grassos, actuant de forma dual com a inhibidor al·lostèric de CPT-1 (de, pas limitant de la ß-oxidació) i substrat de FAS (29). Un increment en el contingut de malonil-CoA en aquests fetges (Taula 15), seria suggestiu d’un increment en la lipogènesi. No obstant, l’enzim responsable de la seva síntesis, ACC, no semblava tenir una major activitat, ja que el seu contingut proteïc al fetge i el nivell de fosforilació, que en determina la inactivació de l’enzim, es mantenien estables (Figura 61 B i C). En dejuni, el patró relatiu d’expressió de gens lipogènics resulta equivalent al descrit al d’alimentació,

amb la salvetat de que els nivells de LXR� no varien entre els dos grups experimentals (Figura 62).

chrebp srebf1 fasn mod1 gck lxr�

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

***

mR

NA

(uni

tats

rela

tives

)

A

Dejuni

B

p125

p68

AdU6-Ff AdU6-664

FAS

�-tub

p125

p68

AdU6-Ff AdU6-664

FAS

�-tub

Figura 62. La silenciació de PEPCK-C als fetges dels ratolins db/db no activa la lipogènesi. A: L’expressió d’alguns gens rellevants en la lipogènesi es va analitzar en fetges obtinguts d’animals dejunats durant una nit, catorze dies després de la infecció amb AdU6-Ff (n=10; columnes negres) o AdU6-664 (n=11; columnes blanques). Els valors representen la mitja de cada grup relativa a la mitja del grup control AdU6-Ff en alimentació ± SE, n=5, *p<0.05, **p<0.01; test t de Student. B: Addicionalment, es va analitzar per Western blot el contingut SREBP-1c i FAS en extractes hepàtics de ratolins dejunats durant la nit prèvia al sacrifici.

- 123 -


El conjunt de dades, per tant, descarten la inducció de lipogènesi de novo com a conseqüència de la silenciació parcial de PEPCK-C al fetge dels ratolins db/db. Segons això, l’acúmul de lípids, sobretot d’àcids grassos, en aquests fetges hauria de tenir necessàriament un altre origen com, per exemple,

un increment en l’import o un descens en la utilització d’àcids grassos (�-oxidació).

ß-oxidació El pas limitant en la ß-oxidació és el transport dels acil-CoA de cadena llarga del citoplasma a la matriu mitocondrial, pas catalitzat pel transportador d’àcids grassos de la membrana mitocondrial externa carnitina-palmitoil transferasa-1 (CPT-1), el mRNA del la qual es veu disminuït lleugerament en el grup AdU6-664 en alimentació, però no en dejuni (Figura 63). A més, l’inhibidor al·lostèric de CPT-1, malonil-CoA, tendeix a acumular-se en aquest grup en alimentació (Taula 15), suggerint una tendència a la inhibició de la ß-oxidació.

ucp2 cpt1 hmgc2

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

mR

NA

(uni

tats

rela

tives

)

ucp2 cpt1 hmgc2

0.00.20.40.60.81.01.21.4

*

mR

NA

(uni

tats

rela

tives

)

Alimentació Dejuni

A B

ucp2 cpt1 hmgc2

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

mR

NA

(uni

tats

rela

tives

)

ucp2 cpt1 hmgc2

0.00.20.40.60.81.01.21.4

*

mR

NA

(uni

tats

rela

tives

)

Alimentació Dejuni

A B

Figura 63. Homeòstasi energètica en els fetges en resposta a la silenciació de PEPCK-C. l’expressió de gens rellevants implicats en la funció mitocondrial (Ucp2, Cpt1, Hmgc2) es va analitzar en fetges obtinguts catorze dies després de la infecció amb AdU6-Ff (n=10; columnes negres) o AdU6-664 (n=11; columnes blanques) d’animals alimentats (A) o dejunats durant la nit prèvia al sacrifici (B). L’expressió gènica es va quantificar per RT-PCR quantitativa en un sistema 7900HT Micro Fluidic Card d’Applied Biosystems i les dades es van analitzar fent el càlcul de Ct utilitzant el gen de la ß-2-microglobulina com a normalitzador. Els valors representa la mitja de cada grup relativa a la mitja del grup control (AdU6-Ff) en alimentació ± SE. *p< 0.05, test t de Student. En contraposició, es van trobar diversos indicis en contra d’un possible bloqueig de la ß-oxidació:

1. En primer lloc, el contingut proteic al fetge de PGC-1�, co-activador clau implicat en la

regulació de la gluconeogènesi i la ß-oxidació, es manté constant (Figura 53 B), tot i mostrar una expressió gènica lleugerament disminuïda en alimentació (Figura 53 A).

- 124 -


2. En segon lloc, el contingut sèric de cossos cetònics (que provenen indirectament de la ß-oxidació) tendeix a incrementar, tant en alimentació com en dejuni (Taula 12).

3. A més, l’expressió gènica de HMG-CoA Sintasa (codificada per Hmgc2), implicada en la síntesi de cossos cetònics, roman inalterada (Figura 63).

4. Finalment, hi ha un increment significatiu del contingut hepàtic de propionil-CoA, intermediari de la ß-oxidació d’àcids grassos de cadena imparell (Taula 15).

Globalment, el conjunt de dades obtingudes suggereixen que la ß-oxidació no està afectada significativament als fetges dels ratolins diabètics db/db com a conseqüència de la silenciació parcial de PEPCK-C. No obstant, podria haver-hi una inhibició al·lostèrica sobre CPT-1 exercida pel malonil-CoA, que limitaria el transport dels àcids grassos de cadena llarga cap al mitocondri per a ser oxidats.

Funció mitocondrial La respirometria d’alta resolució és una tècnica que mesura el consum d’oxigen en una suspensió cel·lular o de mitocondris a temps real en presència de diferents substrats i/o drogues, tal i com es descriu a l’apartat Material i Mètodes. L’aplicació d’aquesta tècnica sobre hepatòcits frescos aïllats dels ratolins tractats ens va permetre analitzar la seva funció mitocondrial, per tal de confirmar si la ß-oxidació podria estar limitada per la capacitat mitocondrial. Les mesures corresponents als diferents estats mitocondrials que es van mesurar són: RUTINA: respiració en medi gluconeogènic en presència d’octanoat com a substrat d’oxidació. L’octanoat és un àcid gras de cadena curta que entra al mitocondri independentment de CPT-1, per tant aquesta mesura de respiració és independent de la capacitat de transport d’àcids grassos cap a l’interior del mitocondri. FCCP: respiració totalment desacoblada. Correspon a la màxima capacitat respiratòria. A partir de les dades de la respirometria, es van calcular diferents coeficients respiratoris (227): Relació de control respiratori (RCR): és un indicador de la quantitat de respiració desacoblada. Es calcula fent el quocient entre la respiració totalment desacoblada (FCCP) i la respiració en presència d’oligomicina, un inhibidor de la ATP sintasa.

- 125 -


Relació de control desacoblat (UCR): és una estimació de la capacitat respiratòria de reserva que es calcula com el quocient entre FCCP i RUTINA. Relació de control de la fosforilació respiratòria (RCRP): ens indica la proporció de capacitat respiratòria aplicada a la síntesi d’ATP, i es calcula com a la diferència entre la respiració amb oligomicina i la respiració rutina i dividint per la respiració FCCP.

Rutina FCCP0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

JO

2/ J

CO

X

VDAC

�-tub

VDAC

�-tub

SOD-1

SOD-2

�-tub

AdU6-Ff AdU6-664SOD-1

SOD-2

�-tub

AdU6-Ff AdU6-664

0.31 ± 0.03§0.24 ± 0.01RCRP

5.88 ± 0.185.54 ± 0.38UCR

2.11 ± 0.112.36 ± 0.13RCR

AdU6-664AdU6-Ff

0.31 ± 0.03§0.24 ± 0.01RCRP

5.88 ± 0.185.54 ± 0.38UCR

2.11 ± 0.112.36 ± 0.13RCR

AdU6-664AdU6-Ff

A B

C

Figura 64. La funció mitocondrial es manté íntegre en fetges amb una reducció parcial de PEPCK. A: Catorze dies després de la infecció amb AdU6-Ff (columnes negres) o AdU6-664 (columnes blanques) es van aïllar els hepatòcits, amb els quals es va assajar la respiració tal i com es descriu als Materials i mètodes. L’activitat citocrom c oxidasa (COX) (JCOX) es va utilitzar per a normalitzar les mesures de respiració. Les dades són les mitges ± ES (n=5); §p=0,06. B: Detecció per Western blot del contingut proteic al fetge de la forma citosòlica (SOD-1) i mitocondrial (SOD-2) de la superòxid dismutasa. C: Detecció per Western blot del contingut proteic al fetge del transportador d’ADP de la membrana mitocondrial interna VDAC. Es mostren membranes representatives. La respiració en presència d’octanoat com a substrat de ß-oxidació (Rutina) no es veia alterada per la silenciació de PEPCK-C (Figura 64 A). A més, tant la capacitat màxima respiratòria (FCCP) com el contingut del transportador d’ADP de la membrana mitocondrial interna VDAC, que es va prendre com a indicador de la quantitat de cadenes respiratòries, es mantingueren constants (Figura 64 C), suggerint que el knock-down de PEPCK-C no bloqueja el cicle de Krebs, íntimament lligat a l’activitat de la cadea respiratòria, no afecta negativament la biogènesi mitocondrial, ni tampoc limita la capacitat oxidativa d’àcids grassos independent del transport a la mitocondria. Tampoc es van trobar acúmuls dels intermediaris del cicle de Krebs, com ara acetil-CoA i succinil-CoA (Taula 15), esperables en cas que hi hagués un bloqueig del cicle.

- 126 -


La superòxid dismutasa (SOD), enzim que s’acumula enfront a senyals d’estrès oxidatiu, presentava un patró d’expressió de les formes citosòlica (clarament disminuïda) i mitocondrial (estable) compatible amb un increment de l’oxidació peroxisomal (228) (Figura 64 B). Addicionalment, els paràmetres calulats a partir de la respirometria (RCR i UCR) no variaven en resposta al tractament AdU6-664 (Figura 64 A, quadre intern). Finalment, en correlació amb l’índex UCR sostingut i la clara tendència a incrementar de l’índex RCRP, el nivell d’expressió de la proteïna desacobladora 2 (Ucp2) no incrementà (Figura 63 A). El conjunt de dades descarta el bloqueig del cicle de Krebs i el desacoblament de la respiració mitocondrial com a conseqüència de la silenciació parcial de PEPCK-C. En clara contraposició, la respirometria en hepatòcits amb una silenciació quasi total de PEPCK-C aconseguida amb la infecció dels ratolins db/db amb la dosi alta (Figures 43 i 44), mostrà una clara afectació de la capacitat respiratòria màxima (Figura 65), mentre que el número de cadenes respiratòries es mantingué, tal i com ens estaria indicant el contingut de VDAC. Aquestes dades ens apuntarien a que una supressió total o quasi-total de PEPCK al fetge dels ratolins db/db sí que podria tenir un efecte bloquejant sobre el cicle de Krebs, comprometent la respiració mitocondrial.

Rutina FCCP0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6 *

JO

2/ J

CO

X

0.22 ± 0.010.19 ± 0.02RCRP

5.28 ± 0.956.14 ± 0.66UCR

2.36 ± 0.05**2.79 ± 0.04RCR

AdU6-664AdU6-Ff

0.22 ± 0.010.19 ± 0.02RCRP

5.28 ± 0.956.14 ± 0.66UCR

2.36 ± 0.05**2.79 ± 0.04RCR

AdU6-664AdU6-Ff

�- tubulin

VDACAdU6-Ff AdU6-664

�- tubulin

VDACAdU6-Ff AdU6-664

A B

Figura 65. La funció mitocondrial es veu alterada en fetges amb una reducció total de PEPCK. A: Catorze dies després de la infecció dels ratolins db/db, amb la dosi alta (13.34*1010 p.f.u./Kg) d’AdU6-Ff (columnes negres) o AdU6-664 (columnes blanques) es van aïllar els hepatòcits per perfusió del fetge i es va assajar la respiració tal i com es descriu als Materials i mètodes. Les dades són les mitges ± ES (n=5); *p<0,05¸**p<0,01. Test t de Student. B: Contingut proteic del transportador d’ADP de la membrana mitocondrial interna VDAC, mesurat per Western blot realitzat sobre extractes totals dels fetges.

- 127 -


Càrrega energètica cel·lular És acceptat que la gluconeogènesi depèn de l’oxidació d’àcids grassos com a font d’energia. Un desplaçament de l’equilibri entre aquestes dues vies podria, teòricament alterar la càrrega energètica cel·lular, excepte que alguna altra via consumeixi o produeixi energia per a compensar el desequilibri. Els resultats presentats fins al moment, demostren una clara baixada en la via gluconeogènica i en la producció hepàtica de glucosa, mentre que l’oxidació mitocondrial d’àcids grassos no sembla estar alterada significativament. Com a conseqüència, i corroborant aquesta hipòtesi, la càrrega energètica cel·lular (CEC) s’incrementà considerablement en els fetges dels animals tractats amb AdU6-664, reflex d’una reducció d’un 25% en el contingut d’AMP concomitant a un increment del 50% en el contingut d’ATP, cosa que suposa que es dupliqui la relació ATP/AMP (Taula 14). Això explicaria la manca d’activació d’AMPK (Figura 66 C) i els nivells de fosforilació sostinguts d’ACC (Figura 61 B), substrat directe d’AMPK.

Mecanisme proposat Però, com s’ha orquestrat aquest nou panorama metabòlic en resposta a la reducció d’un únic enzim? Dues possibilitats s’analitzen a continuació:

Activació d’AMPK La metformina, fàrmac d’elecció per pacients diabètics, actua a nivell molecular bloquejant el complex I de la cadena de transport d’electrons (48), fet que desemboca en una disminució del quocient ATP/AMP, i culmina en l’activació de la quinasa depenent d’AMP (AMPK) (50). La AMPK actua com a sensor energètic cel·lular activant les vies de producció d’ATP i reprimint les vies anabòliques (32). En la diabetis, la AMPK s’ha proposat com el mediador de l’efecte hipoglucemiant de la metformina a través de la reducció de la gluconeogènesis hepàtica i també de l’increment de la ß-oxidació a múscul i fetge (50). Tenint això en compte, no ens ha de sorprendre que, en resposta al tractament oral de metformina, observem una disminució en el contingut proteïc de PEPCK-C als fetges, tal i com posa de manifest el Western blot mostrat a la figura 66 A. La quantificació densitomètrica d’aquests blots (Figura 66 B) mostra que la reducció de la proteïna és d’aproximadament un 30% (100 ± 12.04 vs 72.57 ± 4.88, n=3, p< 0.05). En canvi, la reducció de PEPCK-C hepàtica mitjançant RNAi no s’acompanyà d’una activació d’AMPK (Figura 66 C). Per tant, en el nostre model, AMPK no

- 128 -


semblaria estar mediant els efectes de la silenciació hepàtica de PEPCK-C sobre l’homeòstasi de la glucosa. A més, el quocient ATP/AMP al fetge dels ratolins tractats amb AdU6-664 es veu incrementat per la suma de dos factors: a) el contingut hepàtic d’ATP incrementa; i b) el contingut hepàtic d’AMP disminueix (Taula 14). No obstant, l’increment del quocient ATP/AMP, tampoc suposà una disminució en l’estat de fosforilació d’AMPK en aquests fetges. Aquest fet podria ser degut a que els nivells detectats corresponen al seu estat basal, ja que estem analitzant fetges en alimentació

AMPK-P

AMPK �

AdU6-Ff AdU6-664AMPK-P

AMPK �

AdU6-Ff AdU6-664

PEPCK

�-tubulina

CT META B

CT MET0

20

40

60

80

100

120 *

PE

PC

K-C

/ �-tu

bulin

a(u

nita

ts re

lativ

es)

C

Figura 66. Divergència entre el mecanisme molecular de la metformina i la silenciació específica de PEPCK-C hepàtica sobre l’homeòstasi de la glucosa. A: Ratolins db/db van ser tractats amb una dosi oral de 400 mg/Kg dia de metformina (MET) administrada a través de l’aigua de beguda. Al grup control (CT) se’ls va administrar aigua sense additius. Al final del període de tractament els animals van ser sacrificats en alimentació. El contingut de PEPCK-C als fetges es va analitzar per Western blot (n=5). B: Quantificació densitomètrica dels blots. Les dades representen les mitges ± ES. C: L’activació d’AMPK als fetges dels ratolins db/db tractats amb AdU6-Ff o AdU6-664 es va estimar analitzant, per Western blot, la relació entre la forma fosforilada d’AMPK (AMPK-P Thr172) i el contingut total de la proteïna. Es mostren membranes representatives de tres experiments independents.

Regulació negativa de Sirt 1 mediada per senyals metabòliques El recent treball de Rodgers i col·laboradors (80) ha posat de manifest aspectes clau de la regulació de la via gluconeogènica. En dejuni, una senyal nutricional codificada per substrats gluconeogènics com el piruvat, incrementa el contingut de Sirt1. Sirt1 és una deacetilasa depenent de NAD+, que

interacciona i deacetila PGC-1�, potenciant la capacitat de coactivar HNF4-�, factor necessari per a

PGC-1� per a activar la transcripció dels gens gluconeogènics (72). Altres estudis proposen Sirt1

com a regulador positiu de l’activitat transcripcional de FOXO1 (81-83; 229). Més recentment s’ha descrit el mecanisme de regulació de la transcripció de Sirt1 (230). Els autors han descrit un

- 129 -

Sirt 1: mediador de la regulació coordinada de la gluconeogènesi hepàtica

mecanisme a través del qual el NADH estabilitza el complex co-repressor HIC1:CtBP que bloqueja la transcripció de Sirt1. De forma global, Sirt1 sembla funcionar com a sensor nutricional en resposta a les fluctuacions dels nivells de NADH cel·lular i actua com a modulador positiu de la gluconeogènesi. Per tal d’avaluar si Sirt1 podria estar implicat en la regulació negativa coordinada de la gluconeogènesi descrita en el nostre model, vam analitzar els nivells de Sirt1 hepàtics. Es va detectar un evident descens en la immunodetecció de Sirt1 (Figura 67), corresponent al 50%, segons la quantificació densitomètrica de les membranes (100 ± 9.16 vs 47.03 ± 10.19; n=7; ***p<0.001; test t de Student). A més, els resultats mostrats a la figura 67 demostren que els nivells de Sirt1 al fetge dels ratolins no diabètics de la soca C57Bl (CTND) són sensiblement inferiors als nivells detectats als ratolins diabètics originaris de la mateixa soca (db/db), suggerint un hipotètic paper de Sirt1 en la fisiopatologia diabètica en fetge no descrit fins al moment. El fet que en un fetge diabètic hi hagi nivells incrementats de Sirt1 és coherent amb el seu paper pro-gluconeogènic al fetge (80; 231).

CT METCT MET

�-tubulina

Sirt1AdU6-Ff AdU6-664

�-

CT ND

Figura 67. Contingut de Sirt-1 hepàtica en alimentació. El contingut hepàtic de Sirt1 es va analitzar per Western Blot en ratolins sans de la soca C57Bl (CT ND) i en ratolins diabètics db/db control (CT), tractats amb una dosi oral de metformina de 400 mg/Kg dia, o en ratolins diabètics db/db catorze dies després de la infecció amb la dosi intermitja d’adenovirus control (AdU6-Ff) o codificant pel shRNA per la PEPCK-C (AdU6-664). De forma paral·lela al que s’ha observat als animals tractats amb el shRNA contra PEPCK-C, als fetges dels ratolins db/db tractats amb metformina, el contingut proteic de Sirt1 també es veu disminuït qualitativament, quasi un 40% respecte dels animals control (100.0 ± 11.0 vs 63.0 ± 9.8; n=3; *p<0.05). Aquesta dada és suggestiva de que la modulació de Sirt1 en resposta a metformina podria estar mediant la coneguda regulació negativa que el fàrmac exerceix sobre la gluconeogènesi, i en concret, sobre la PEPCK (Figura 66). Un estudi més profund sobre els efectes de la metformina sobre Sirt1 en fetge serien pertinents per a aclarir aquest punt. A més, vàrem observar que l’efecte sobre els nivells de Sirt1 intracel·lulars eren específics de fetge. Tal i com es mostra a la figura 68, al múscul esquelètic no es van trobar variacions en els nivells de

- 130 -


Sirt1 entre els ratolins tractats amb l’adenovirus control (AdU6-Ff) i els ratolins infectats amb l’adenovirus codificant pel shRNA contra la PEPCK-C (AdU6-664).

�-tubulina

Sirt1

AdU6-Ff AdU6-664

Figura 68. Nivells de Sirt1 al múscul de ratolins db/db. El contingut muscular de Sirt1 es va analitzar per Western Blot realitzats amb extractes d’una barreja de Soleus i Gastrocnemius, obtinguts de ratolins db/db catorze dies després de la infecció amb la dosi intermitja d’adenovirus control (AdU6-Ff) o codificant pel shRNA per la PEPCK-C (AdU6-664). Com s’ha esmentat anteriorment, Sirt1 està regulat transcripcionalment en funció dels nivells de NADH intracel·lulars, de manera que nivells incrementats de NADH comporten una menor taxa de transcripció de la deacetilasa (230). Vàrem voler avaluar la possibilitat de que, en resposta al menor flux de la via gluconeogènica als fetges on la PEPCK-C havia estat silenciada, i en absència de limitacions en la ß-oxidació, els nivells de NADH cel·lular estiguessin augmentats. Si fos així, aquest fet podria constituir una explicació a la baixada en el contingut hepàtic de Sirt1 observada. Resultats preliminars mostren, efectivament, una tendència a l’increment en el contingut de NADH i en la relació NADH/NAD+ als fetges tractats amb el shRNA contra la PEPCK-C (Figura 69).

NAD NADH

02468

35

40

45AdU6-FfAdU6-664

� m

ol/g

fetg

e

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

NA

DH

/NA

D+

A B

NAD NADH

02468

35

40

45AdU6-FfAdU6-664

� m

ol/g

fetg

e

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

NA

DH

/NA

D+

A B

Figura 69. Contingut hepàtic de NAD+ i NADH. A: El contingut de NAD+ es va mesurar mitjançant mètodes fluoromètrics en fetges obtinguts de ratolins db/db alimentats als catorze dies de la infecció amb la dosi intermitja d’adenovirus. El contingut de NADH es va calcular a partir de les concentracions de Lactat/Piruvat calculades per mètodes fluoromètrics. B: La relació NADH/NAD és superior, tot i que no significativament, en els animals tractats amb AdU6-664, p=0.15 segons un test t de Student amb una cua (n=3-4).

- 131 -

Capít

ol 2:

Tau

les

Ta

ula 1

2. Pe

rfil m

etab

òlic

sèric

dels

rato

lins d

b/db

des

prés

de l

a sile

nciac

ió p

arcia

l de l

a PEP

CK-C

hep

àtica

. El

s sèr

ums v

an se

r obti

nguts

14 di

es de

spré

s de l

a infe

cció

en ra

tolins

alim

entat

s, o d

ejuna

ts du

rant

tota l

a nit.

Sèru

m

Coles

tero

l (m

g/dl

)

Coles

tero

l (m

g/dl

) AG

(m

M)

TAG

(mg/

dl)

ß-HB

A (m

M)

GPT

(U/l)

(to

tal)

(H

DL)

AdU6

-Ff

0.92

± 0.

05

174

.75 ±

12.61

0.2

2 ± 0.

05

144

.00 ±

11.46

11

6.53 ±

3.16

60.86

± 5.

23

Alim

enta

ció

AdU6

-664

0.

78 ±

0.04

117.8

3 ± 12

.61 *

0.29 ±

0.04

15

0.82 ±

4.99

133.2

7 ± 4.

60 **

74.93

± 4.

75 *

AdU6

-Ff

0.89

± 0.0

8 13

4.50 ±

11.05

0.4

0 ± 0.

05

253.3

3 ±

17.99

10

4.85

± 3.0

6

n.d.

Deju

ni

AdU6

-664

0.5

8 ±

0.02

86.00

± 7.

14

0.66 ±

0.08

20

5.67 ±

5.27

1

32.85

± 2.

07 ##

n.d

.

Les d

ades

repr

esen

ten le

s mitg

es ±

ES.

n=

13-1

6 (Ad

U6-F

f) i n

=15-

18 (A

dU6-

664)

,* p <

0.05

, ** p

< 0.

01 vs

trac

tamen

t amb

el vi

rus c

ontro

l en e

ls ex

perim

ents

en al

imen

tació;

n=6 (

AdU6

-Ff a

nd A

dU6-

664)

, # p <

0.05

, ##p <

0.01

, ### p

< 0.

001 v

s tra

ctame

nt am

b el v

irus c

ontro

l als

expe

rimen

ts en

dejú;

tes

t t de

Stud

ent. n

.d.; n

o dete

rmina

t

Capítol 2: Taules

Taula 13. Perfil metabòlic hepàtic dels ratolins db/db després de la silenciació parcial de la PEPCK-C hepàtica. Els fetges van ser obtinguts 14 dies després de la infecció en ratolins alimentats, o dejunats durant tota la nit.

Fetge

Glicogen (mM/g)

TAG (mg/g)

AG (mmol/g)

AdU6-Ff 273.41 ± 31.34 117.37 ± 15.20 0,48 ± 0,28 Alimentació

AdU6-664 296.74 ± 18.65 173.39 ± 11.43 ** 1,68 ± 0,45 *

AdU6-Ff 70.18 ± 3.33 43.94 ± 4.75 2.30 ±0.21 Dejuni

AdU6-664 19.41 ± 3.69 ### 107.05 ± 11.24 ### 4.01 ± 0.27 ###

Les dades representen les mitges ± ES. n= 13-16 (AdU6-Ff) i n=15-18 (AdU6-664),* p < 0.05, ** p < 0,01 vs tractament amb el virus control en els experiments en alimentació; n=6 (AdU6-Ff and AdU6-664), #p < 0.05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 vs tractament amb el virus control als experiments en dejú; test t de Student.

- 133 -

Capítol 2: Taules

Taula 14. Contingut en nucleòtids als fetges dels ratolins db/db. El fetge va ser obtingut 14 dies després del tractament amb l’adenovirus recombinant.

AMP (μmol/g)

ADP (μmol/g)

ATP (μmol/g)

CEC ATP/AMP

AdU6-Ff 1.05 ± 0.06 1.24 ± 0.08 1.02 ± 0.08 0.47 ± 0.01 1.00 ± 0.12

AdU6-664 0.77 ± 0.11 * 1.16 ± 0.07 1.47 ± 0.17 ** 0.54 ± 0.02 ** 2.28 ± 0.51**

Càrrega energètica cel·lular (CEC=(ATP+ 1/2 AMP)/(ATP+ADP+AMP) Les dades representen les mitges ± ES. n=8; * p < 0.05, **p < 0.01 vs tractament amb el virus control; test t de Student

- 134 -

Capítol 2: Taules

Taula 15. Contingut d’acil-CoA de cadena curta als fetges dels ratolins db/db. El fetge es va obtenir 14 dies després del tractament amb l’adenovirus recombinant.

Acetil-CoA (nmol/g)

Propionil-CoA (nmol/g)

Succinil-CoA (nmol/g)

Malonil-CoA (nmol/g)

AdU6-Ff 140.13 ± 1.95 48.12 ± 0.84 31.44 ± 3.12 2.079 ± 0.239

AdU6-664 130.29 ± 2.47 56.68 ± 1.25** 31.31 ± 2.10 4.472 ± 0.932*

Les dades representen les mitges ± ES. n=8; * p < 0.05. **p < 0.01 vs tractament amb el virus control; test t de Student

- 135 -


DISCUSSIÓ

Control de la glucèmia a través de l’activitat PEPCK-C hepàtica De forma similar al descrit al Capítol I en un model de ratolí diabètic tipus I, la reducció parcial de PEPCK-C hepàtica (d’un 50% aproximadament), en aquest cas en un model de ratolí diabètic tipus II, comporta una clara millora en l’homeòstasi de la glucosa. La capacitat hipoglucemiant en alimentació daquest tractament és similar al d’un tractament amb metformina, un dels fàrmacs hipoglucemiants més emprats en la clínica per al tractament de la diabetis tipus II. No obstant, tot i que la reducció parcial de PEPCK-C té un clar efecte sobre la producció hepàtica de glucosa a partir de piruvat, no suposa un efecte hipoglucemiant en dejú. En canvi, sí que s’observà un efecte hipoglucemiant en dejú quan la silenciació de PEPCK-C en fetge és quasi-absoluta (aproximadament d’un 90%). D’altra banda, els nivells de glicogen hepàtic es mantenen constants en alimentació, però disminueixen en dejú, en resposta a la silenciació parcial de PEPCK-C. Aquest conjunt de dades podria estar indicant que, probablement, hi ha un efecte compensatori per part de la glicogenòlisi hepàtica per a compensar la reducció en la gluconeogènesi, compensant la producció hepàtica de glucosa i la glucèmia en dejú. De fet, la reducció en un 90% de la PEPCK-C redueix significativament la els nivells de glicogen hepàtic en alimentació, suggerint d’una banda, una taxa de glicogenòlisi insuficient per a compensar la reducció de gluconeogènesi en dejuni, i de l’altra, una síntesi de glicogen per la via indirecta reduïda, conseqüència de l’absència de PEPCK-C. Podriem concloure, per tant, que l’activitat PEPCK-C té un rol preponderant en el control de la glucèmia. La silenciació de PEPCK-C hepàtica millora la sensibilitat a la insulina als ratolins db/db Diverses observacions evidencien un efecte positiu sobre la sensibilitat perifèrica a la insulina derivat, directa o indirectament, de la silenciació hepàtica de PEPCK-C en els ratolins db/db:

1. Una clara millora en la tolerància a glucosa i en la insulinèmia en dejuni. 2. La reducció del índex IR, càlcul teòric de l’índex de resistència a insulina. 3. La major captació de glucosa en resposta a insulina observada a l’assaig de tolerància a la

insulina (IPITT) 4. La capacitat superior d’activar la via de senyalització de la insulina, no només a fetge, sinó

també a teixits perifèrics.

- 136 -


5. Una millora dels símptomes clínics de la diabetis, sobretot en la poliúria i glucosúria. Aquesta millora en la sensibilitat a insulina pot tenir diferents orígens:

1. Una menor insulinèmia secundària a la reducció de la glucèmia.

El pes específic de la glucotoxicitat vs. la lipotoxicitat sobre la insulinèmia i la resistència a la insulina al fetge i als teixits perifèrics no està del tot clara. En alguns models transgènics de diabetis tipus II la hiperglucèmia sembla tenir un efecte directe sobre la sensibilitat a insulina del fetge i els teixits perifèrics (232), mentre que en d’altres, la reducció de la hiperglucèmia no va acompanyada d’una reducció de la insulinèmia ni de la millora de la resistència a insulina, suggerint un efecte majoritari de la lipotoxicitat sobre la resistència a insulina (233). El tractament dels ratolins db/db amb floridzina, agent hipoglucemiant que inhibeix la captació intestinal i la reabsorció renal podria ajudar a dilucidar si la reducció de la glucèmia per se te un efecte sobre la insulinèmia i la sensibilitat a insulina en aquest model animal. No obstant, estudis similars demostren que el tractament de ratolins db/db amb una dosi de 400 mg/Kg de floridzina durant un període de dues setmanes, tot i normalitzar la glucèmia, tant en alimentació com en dejú, no restaura la insulinèmia (234), descartant un efecte directe de la hiperglucèmia sobre la insulinèmia en els ratolins db/db. Per tant, la millora de la insulinèmia i la sensibilitat a insulina als ratolins db/db tractats amb AdU6-664 no sembla ser conseqüència directa de la reducció de la glucèmia, encara que, la implicació de la millora de la dislipidèmia sobre la sensibilitat a la insulina no es pot descartar.

2. La intercomunicació entre el fetge i el cervell a través del nervi vague (59). Aquesta via s’ha proposat com a via responsable de coordinar el metabolisme energètic dels òrgans perifèrics en resposta a l’estat del metabolisme energètic del fetge. Aquesta via de comunicació coordinada a nivell de l’hipotàlam (Figura 8) pot arribar a modular la sensibilitat sistèmica a la insulina, en resposta a la modulació del metabolisme energètic en fetge (61; 62). Si aquesta hipòtesi fos certa en el nostre model de ratolí db/db, els efectes sistèmics descrits en resposta a la silenciació parcial de PEPCK-C s’anul·larien si els animals fossin sotmesos a una vagotomia hepàtica o una disrupció de les fibres vagals aferents.

- 137 -


La lipidosi hepàtica secundària a la silenciació de PEPCK-C no indueix resistència a la insulina Una observació que a priori podria semblar contradictòria és la millora de la sensibilitat a insulina a fetge tot i l’acumulació de Acil-CoA i TAG a fetge. La lipidosi hepàtica s’associa generalment a la inducció de resistència a insulina, tot i que la relació causal entre els dos fenòmens no està clara. D’una banda, sembla clar que la resistència a insulina condueixi a esteatosi hepàtica: la resistència a insulina sol anar acompanyada d’hiperinsulinèmia i hiperglucèmia, que poden activar les vies de senyalització que activen la síntesis de lípids (Figura 1). Però, de l’altra, la hipòtesi que la esteatosi per se sigui suficient per a causar resistència a insulina, està sotmeta a debat. Diferents espècies lipídiques (acil-CoA de cadena llarga, diacilglicerol, ceramides) poden actuar com a segons missatgers en la inducció de resistència a insulina en el teixit (235; 236). Recentment s’ha descrit que la resistència a insulina en fetge associada a lipidosi hepàtica no està necessàriament mediada per l’acumulació d’àcids grassos o triacilglicerol (TAG) (26; 237), sinó que és una espècie lipídica derivada, el diacilglicerol (DAG), la que indueix resistència a insulina a través de l’activació de la serina/treonina kinasa PKC�. Un cop activada, PKC� transloca a la membrana, on s’uneix i inhibeix l’activitat tirosina-kinasa del receptor d’insulina, bloquejant així la via de senyalització d’insulina (25). Als fetges dels ratolins db/db on PEPCK-C s’ha silenciat parcialment, tot i la l’acumulació de TAG i AG, podem descartar la inducció de resistència a insulina en base a tres observacions:

1. Una major fosforilació d’AKT en resposta a un bolus d’insulina. 2. Una major fosforilació steady-state de FOXO1 al fetge en alimentació. 3. PKC� no s’acumula a la membrana plasmàtica.

Orígen i destí dels lípids als fetges on PEPCK-C ha estat silenciada Les causes de l’increment d’AG al fetge poden ser quatre:

1. Increment en la síntesis de novo. La contribució de la lipogènesi de novo a l’acumulació de TAG i AG es va avaluar mesurant els nivells d’expressió i el contingut proteïc de diferents enzims lipogènics i factors de transcripció implicats en la seva regulació. En cap cas es va trobar indicis de que la silenciació de PEPCK-C

- 138 -


estigui activant la síntesi de lípids. Reguladors clau de la lipogènesi romangueren inalterats

(ChREBP) o disminuïren (SREBP-1c i LXR�). Addicionalment, enzims glucolítics (L-PK i GK) es

mantinguéren inalterats i enzims lipogènics o bé romangéren inalterats (FAS i ACC) o disminuïren (ME). Per tant, la lipogènesi no pot estar contribuint a l’acumulació de greixos observada (Figura 70). Algunes qüestions referents al patró d’expressió dels gens lipogènics al fetge en resposta a la silenciació de PEPCK-C mereixen discussió: La insulina és considerada la hormona clau en la regulació del metabolisme energètic. SREBP-1c ha emergit en els últims anys com a mediador dels efectes de la insulina sobre els gens glucolítics (GK) i lipogènics (FAS, ACC) (221). N obstant, diferents estudis mecanístics posen en dubte si els efectes reguladors de la insulina estan mediats a través de la via de senyalització de la hormona, o a través d’altres molècules que actuen de sensors metabòlics en paral·lel a la insulina, com la glucosa. Recentment s’ha descrit que la glucosa, independentment d’insulina, pot actuar com a agonista de

LXR�, unint-s’hi directament i incrementant-ne l’activitat transcripcional sobre els gens lipogènics

SREBP-1c i ChREBP (226). LXR� indueix la transcripció de SREBP-1c (19) i ChREBP (18) a través

d’elements de resposta a LXRE dels seus promotors. Aquests i altres treballs han aixecat certa controvèrsia, sobre si els efectes de la insulina sobre SREBP-1c són directes o mediats a través de la

modulació de l’activitat transcripcional de LXR-� per la glucosa.

En el nostre model hem trobat una disminució del mRNA de SREBP-1c. Aquesta disminució pot ser respondre a:

a) la disminució dels nivells de LXR� observada.

b) la disminució l’activitat transcripcional de LXR� conseqüència de la disminució de la

glucèmia en alimentació. No obstant, SREBP-1c també es troba reduïda (tant a nivell de mRNA com

de proteina) en dejuni, tot i no haver diferències ni en l’expressió gènica de LXR� ni en els nivells de

glucosa. Aquesta reducció només pot ser explicada per la menor insulinèmia. No hi ha correlació entre els nivells de SREBP-1c i GK, contràriament al hom esperaria tenint en compte que SREBP-1c regula la transcripció de GK. No obstant hi ha discrepàncies respecte a la mediació de SREBP-1c en la transcripció de Gck en resposta a insulina (238; 239). Les dades aqui

presentades suggereixen que l’eix LXR�/SREBP-1c no està controlant directament la transcripció de

Gck, en correlació amb els resultats obtinguts per Mirtro et al. emprant un agonista de LXR� (226).

- 139 -


Múltiples estudis demostren que la transcripció dels gens lipogènics (ACC, FAS, etc) està regulada de forma sinèrgica pels nivells de glucosa i insulina a través de ChREBP i SREBP-1c. La regulació d’aquests gens per ChREBP requereix la metabolització de la glucosa per GK (17). El manteniment dels nivells de GK i ChREBP, tot i la baixada de la glucèmia, podrien explicar el manteniment de FAS i ACC, malgrat la baixada de SREBP-1C.

ChREBP

ACC FAS

SREBP-1cSREBP-1c

Glucosa6-P

GK

Xilulosa5P ??

� Glucosa

� Glucosa

LIPOGÈNESI SOSTINGUDA

HEPATÒCIT

�Insulina

LXR�

?

IRS1

+++

++

++

Figura 70. Mecanisme proposat per al manteniment de la lipogènesi en els fetges dels ratolins db/db on PEPCK-C s’ha silenciat. Les fletxes en gris representen una reducció de l’estímul.

2. Reducció en l’oxidació d’àcids grassos. No es pot afirmar, amb les dades recopilades en aquest estudi, que l’oxidació d’àcids grassos en fetge incrementi, però tampoc que disminueixi quan PEPCK-C es delecciona al 50% (Figura 71). Algunes consideracions al respecte es discuteixen a continuació:

- 140 -


D’una banda, el pas limitant en l’oxidació d’àcids grassos de cadena llarga és el transport a l’interior del mitocondri per CPT-1. La reducció en els nivells d’expressió de CPT-1, juntament amb l’increment del contingut de malonil-CoA, potent inhibidor al·lostèric de CPT-1, són evidències indirectes d’una tendència a la inhibició de l’oxidació d’àcids grassos. Una sèrie d’evidències apunten a que no hi ha tal inhibició:

a) La inhibició que el malonil-CoA exerceix sobre CPT-1 pot ser sobrepassada per l’abundància d’AG (20; 240).

b) No hem trobat un bloqueig de la respiració mitocondrial en presència d’octanoat (àcid gras de cadena intermitja que entra al mitocondri independentment de CPT-1) no es veu reduïda en els fetges en que PEPCK-C ha estat silenciada parcialment.

c) L’increment del contingut sèric de cossos cetònics i de propionil-CoA (intermediari de l’oxidació d’àcids grassos de cadena imparell) al fetge suggereixen un increment de l’oxidació d’àcids grassos.

d) El patró d’expressió de SOD1 (citosòlica) i SOD2 (mitocondrial) als fetges (disminució i manteniment respectivament) és suggestiu d’un increment de l’oxidació peroxisomal. Altres autors han observat el mateix patró mitjançant la inducció de l’oxidació peroxisomal amb una dosi baixa de ciprofibrat (228).

3. Increment en la captació d’àcids grassos des de plasma. La gluconeogènesi és una via energèticament costosa i, per tant, una reducció en el flux de la via es reflexa en un increment en la càrrega energètica cel·lular, en aquest i altres estudis de modulació de l’activitat PEPCK-C en fetge (97). La captació dels àcids grassos de la circulació cap al fetge és un procés no regulat; la seva activació a acil-CoA, catalitzat per la acil-CoA sintetasa (EC 6.2.1.3) és una reacció que consuméix ATP i genera AMP. Per tant, seria factible que, donat que en els fetges on PEPCK-C està silenciada, la relació ATP/AMP incrementa, aquest l’increment en la càrrega energètica cel·lular s’estigués invertint en la captació i activació d’àcids grassos plasmàtics, contribuint, d’una banda a la tendència a la reducció en sang i de l’altra, a la seva acumulació al fetge.

- 141 -


Citrat

AcetilCoA

�MalonilCoA CPT-1

ACL

ACC

�� AcilCoA�ßHBA

CK

��oxidació

Mitocondri

Plasma

AcetilCoA

cetogènesi

� AGL

AGL�ATP

ADP + Pi

cte-

�TAG (VLDL)

�TAG

� Gliceroneogènesi

Glicerol-3-P

�PEPCK

13

22

HEPATÒCIT

�GNG

Glicerol

NADHFADH

AcetilCoA

Citrat

� ATP

O2

CO2GliK

Figura 71. Metabolisme lipídic en els fetges dels ratolins db/db on s’ha silenciat parcialment PEPCK-C. Es representa els efectes observats sobre la ß-oxidació d’àcids grassos (en vermell els indicis d’una inhibició i en verd els indicis d’una activació de la mateixa). D’altra banda, les causes més probables de l’acumulació intrahepàtica de triglicèrids i àcids grassos: (1) increment de la captació d’àcids grassos de plasma, (2) menor reesterificació d’àcis grassos o (3) menor secreció de triglicèrids en forma de VLDL.

4. Reducció de l’exportació de lípids La dislipidèmia, caracteritzada per un increment dels TAG en sèrum, és una altra anomalia metabòlica associada a la diabetis tipus II (241). La silenciació de PEPCK-C al fetge dels ratolins db/db té un efecte positiu sobre la dislipidèmia. Un rol important de la PEPCK-C, sovint no suficientment considerat, és la regulació dels nivells de glicerol-3-fosfat necessari per a la re-esterificació d’àcids grassos (gliceroneogènesi), que té lloc al teixit adipós i al fetge (242). Al fetge, el glicerol-3-fosfat per a reesterificació prové, bàsicament, de la via gluconeogènica (86). Per tant, una

- 142 -


reducció parcial de l’activitat PEPCK-C al fetge podria suposar una reducció de la reesterificació d’AG i una menor síntesi i exportació de TAG en forrma de VLDL (Figura 16 i 71). Consistentment, es va observar una reducció significativa dels nivells sèrics de TAG i un increment d’AG i TAG a fetge. No obstant, aquests fetges també acumulaven TAG, possiblement perque mantenen una certa capacitat de reesterificació d’àcids grassos gràcies a la generació de glicerol-3-P a partir de glicerol. Cal recordar que els ratolins genosuprimits per Pck1 mantenen certa capacitat de producció de glucosa a partir de glicerol a través de la glicerol quinasa (96). No ens ha de passar per alt que l’augment dels TAG al fetge, juntament amb la seva disminució al sèrum és quantitativament inconsistent amb un rol unificador de la gliceroneogènesi hepàtica. Només un efecte afegit que bloquejés l’ensamblatge i l’exportació de VLDL podria justificar els resultats obtinguts. Aquest aspecte queda obert a noves investigacions, per a intentar esbrinar-ho. Sembla ser, doncs, que l’acumulació de lípids al fetge seria multifactorial, implicant un increment de la captació de dipòsits perifèrics, una reducció de la reesterificació dels àcids grassos per a sintetitzar i una menor exportació de TAG en forma de VLDL (Figura 71). Regulació coordinada de la gluconeogènesi hepàtica derivada del silenciament de PEPCK-C: senyals i mediadors Tot el fenotip descrit deriva, directa o indirectament, d’una reducció de la capacitat gluconeogènica al fetge conseqüència de la reducció del contingut hepàtic en PEPCK-C, tal i com demostra la menor producció de glucosa a partir de piruvat. A més, l’anàlisi transcripcional és coherent amb una regulació negativa coordinada de la gluconeogènesi hepàtica. Dos mecanismes, esquematitzats a la figura 72, podrien estar regulant de forma cooperativa la via gluconeogènica, tant a nivell transcripcional com post-transcripcional:

1. Una senyal hormonal mediada per insulina.

La G6Pasa i la PEPCK-C estan regulades a nivell transcripcional per factors com HNF4-� i FOXO1,

els quals són coactivats per PGC-1�. En resposta a insulina FOXO1 és fosforilat per AKT i exclòs del

nucli, reduint així la seva activitat transcripcional. Un increment molt significatiu de la fosforilació de FOXO1 en els fetges tractats suggereix que la senyalització d’insulina a través d’AKT, més eficient en aquests fetges, contribueix a la reducció dels nivells d’mRNA dels gens gluconeogènics G6pc i Pck1.

- 143 -


L’activitat transcripcional del complex FOXO1/PGC-1�/HNF4-� pot estar disminuïda a través de la

senyalització de la insulina, ja que l’activitat transcripcional del complex depèn de la interacció entre

FOXO1 i PGC-1� (74).

PEPCK

GNG

PHG

Glucosa Insulina

IRS2

AKT-P

� gens gluconeogènicsPck1, G6pc

FOXO1

Sirt1

PGC-1�

Sirt1

PGC-1�

�HNF4 �

FOXO1

NADHNAD� NADHNAD�

Glut2

Glucagó

PKA

CREBP

CREBP

PGC-1�Sirt1

IRHEPATÒCIT

Figura 72. Mecanisme proposat de disminució coordinada de la gluconeogènesis en resposta a la silenciació de PEPCK-C hepàtica. La disminució de la transcripció de gens gluconeogènics respon a senyals metabòliques i hormonals secundàries a la reducció en la producció hepàtica de glucosa. Els mecanismes de regulació que es proposen serien tant a nivell transcripcional, com post-transcripcional. Aquests mecanismes i inclourien la deacetilació de PGC-1� i FOXO1 per part de Sirt-1 i la fosforilació de FOXO1 per part d’AKT. Els paràmetres disminuïts es representen en color gris.

- 144 -


2. Una senyal metabòlica orquestrada per Sirt1. En els últims anys, la histona deacetilasa depenent de NAD+ Sirt1, ha emergit com a eix regulador de l’homeòstasi energètica. Al fetge, en estats de dejuni una senyal nutricional mediada per piruvat

indueix Sirt1 a nivell transcripcional. Sirt1 interacciona i deacetila PGC-1� de forma depenent de

NAD+ (80). La deacetilació de PGC-1� als hepatòcits incrementa la seva capacitat d’interaccionar

amb HNF4-� i activar la transcripció de gens gluconeogènics.

Estudis in vitro proposen un model de regulació de l’activitat transcripcional de FOXO1 basat en el seu estat d’acetilació, que estaria regulant FOXO1 de manera cooperativa juntament amb la fosforilació depenent d’AKT (83; 229). Segons aquest model, l’acetilació de FOXO1 atenua la seva capacitat d’unió al DNA, fent-lo més susceptible a la fosforilació per AKT. Pel contrari, en hepatòcits en cultiu primari, Sirt1 deacetila FOXO1, reclutant-lo al nucli i promovent així la seva activitat transcripcional sobre gens gluconeogènics com Pck1 o G6pc (81). La reducció substancial de Sirt1 als fetges on PEPCK-C ha estat silenciada apunta cap a Sirt1 com a possible mediador d’una senyal metabòlica que modula negativament la gluconeogènesi de forma

coordinada amb la insulina a través de la regulació negatica de l’activitat transcripcional de PGC-1� i

FOXO1. Un menor grau d’acetilació de PGC-1� i FOXO1 secundari a la reducció del contingut

hepàtic de la deacetilasa, podria ser el responsable de la menor taxa de transcripció dels gens gluconeogènics Pck1 i G6pc. Les dades presentades són coherents amb la hipòtesi que, a conseqüència de la reducció del contingut hepàtic de PEPCK-C, una disminució en la via gluconeogènica generés una senyal metabòlica que es traduiria en una disminució de la transcripció de Sirt1, el qual orquestraria un feed-back negatiu sobre la regulació de la gluconeogènesi (Figura 72). Aquesta senyal metabòlica possiblement seria una acumulació de NADH. L’acumumulació de NADH als fetges conseqüència d’una menor gluconeogènesi hepàtica, pot estar relacionada amb la silenciació parcial de PEPCK-C de diferents maneres: 1. Menor consum de NADH citosòlic a la reacció, normalment molt activa, catalitzada per la gliceraldehid-3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH; EC 1.2.1.12).

- 145 -


2. Manteniment de la PHG a partir de glicerol, que podria estar generant un excés de NADH citosòlic en la reacció catalitzada per la Glicerol-3-fosfat deshidrogenasa (GPDH; EC 1.1.1.8), tal i com s’ha suggerit per als models de ratolí genosuprimit per Pck1 (96; 97). Sirt1 com a mediador de senyals metabòliques en el control de la homeòstasi energètica: implicacions en la diabetis Els paral·lelismes entre els efectes de la silencició parcial de PEPCK-C en els ratolins db/db i el tractament amb metformina podrien també explicar-se a través de Sirt1. El tractament d’individus diabètics amb metformina té un efecte de millora sobre la hiperglucèmia diabètica i la sensibilitat a la insulina en fetge i teixits perifèrics, a més de la reducció de la producció hepàtica de glucosa (54). No obstant, el mecanisme molecular de l’acció de la metformina sobre el fetge no es coneix en profunditat. S’ha proposat que la metformina bloqueja el Complex I mitocondrial de la cadena de transport d’electrons, i la respiració mitocondrial (48; 54). Conseqüentment, el pool intracel·lular d’ATP disminueix i la relació NADH/NAD tant citosòlica com mitocondrial incrementa (243). Aquests dos estímuls podrien ser els mediadors dels efectes de la metformina, d’una banda activant la quinasa depenent d’AMP (32; 50; 53), i de l’altra, reprimint la transcripció de Sirt1. Un increment en la relació NADH/NAD en els fetges dels ratolins db/db tractats amb metformina (MET) podria explicar la reducció en el contingut de Sirt1 que estaria orquestrant la regulació negativa de la gluconeogènesi hepàtica. Aquest mecanisme explicaria la reducció en el contingut de PEPCK-C en fetge en els ratolins db/db tractats amb la droga. No obstant, un estudi més profund sobre els efectes de la metformina sobre Sirt1 en fetge serien pertinents per a aclarir aquest punt. Clàssicament s’ha associat Sirt1 amb l’adaptació a la restricció calòrica i longevitat (244). El seu impacte en el metabolisme energètic i en patologies metabòliques com la diabetis no ha estat estudiat en profunditat fins al moment. Els resultats obtinguts en aquest treball suggereixen que, en situacions de diabetis, Sirt1 està incrementat en fetge, en concordança amb l’activitat pro-gluconeogènica de Sirt1 a fetge (80). Per tant, la seva reducció, secundària a la silenciació de

PEPCK, contribuiria a la reducció de la gluconeogènesi hepàtica a través de PGC-1� i a la

sensibilitzció a insulina a través de FOXO1 (Figura 72).

- 146 -


Les discrepàncies entre els dos possibles rols oposats en diabetis de Sirt1 podrien ser degudes a diferents causes:

1. Modulació específica de teixit de Sirt1 En múscul en una situació de resistència a insulina hi ha una reducció del contingut de Sirt1 (245), mentre que en fetge, segons els resultats mostrats en el present treball, hi ha un increment.

2. Efecte específic de teixit de l’activació de Sirt1

Al fetge, Sirt1 activa la glucoenogenesis en resposta a senyals nutricionals de dejuni a través de la

deacetilació de PGC-1� (80). En cèl·lules pancreàtiques Sirt1 regula positivament la secreció

d’insulina a través de la repressió de la transcripció de Ucp2, millorant la capacitat de secreció d’insulina i la tolerància a glucosa (246). Als adipòcits, Sirt1 sembla estar implicat en la mobilització

d’àcids grassos en situacions de dejuni a través de la repressió post-transcripcional de PPAR� (247),

mentre que en cèl·lules musculars Sirt1 activa l’oxidació mitocondrial a través de la deacetilació de

PGC-1� (248).

L’activació de Sirt1 pel tractament amb resveratrol resulta en una menor acetilació de PGC-1��tant

en múscul esquelètic com en teixit adipós i fetge; no obstant l’increment de l’expresió dels gens

mitocondrials diana de PGC-1� s’observa només a múscul i teixit adipós, incrementant-ne la

capacitat oxidativa, fet que explica la protecció que el polifenol suposa enfront al guany de pes i a la resistència a insulina (249; 250). Al fetge, en canvi, els autors no observaren un increment dels gens

diana de PGC-1��(G6pc i Pck1), possiblement a causa del requeriment d’interaccions específiques

de teixit amb altres co-factors (250). Aquests resultats indiquen que els efectes anti-diabètics dels activadors al·lostèrics de Sirt1 deriven de l’activació de la deacetilasa, no a fetge, sinó a múscul i teixit adipós. En concordança amb el concepte de Sirt1 com a regulador pro-gluconeogènic en fetge, resultats molt recents del laboratori del Dr. Puigserver mostren que la sobreexpressió de Sirt1 en fetges de ratolins sans té un efecte hiperglicemiant i redueix la tolerància a glucosa, mentre que la seva silenciació en ratolins db/db redueix la producció hepàtica de glucosa, millora l’homeòstasi de la glucosa, la tolerància i sensibilitat a insulina i repercuteix en una acumulació d’àcids grassos en fetge (231). En

- 147 -


el present treball, mostrem que la silenciació parcial de PEPCK al fetge dels ratolins diabètics db/db resulta en la reducció dels contingut en Sirt1 de forma específica en fetge, no en altres teixits, com el múscul esquelètic, fet compatible amb un efecte anti-diabètic, donada la funció pro-gluconeogènica de Sirt1 a fetge (80).

Sirt1

FETGE MÚSCUL TAB PÀNCREAS

Gluconeogènesi

G6pcPck1

FOXO1PGC1�

ß-oxidació Secreció d’insulinaMovilització greixos

UCP2PPAR-�PGC1�

Figura 73. Possibles implicacions de Sirt1 en el metabolisme energètic.

3. Efectes indirectes no dependents de Sirt1.

Els estudis amb resveratrol in vivo demostren, a més de la menor acetilació de PGC-1�, un

increment de la seva expressió gènica a TAB, múscul i fetge (249; 250) no explicable directament a través de l‘activació al·lostèrica de Sirt1. Per tant una qüestió que roman sense aclarir és la especificitat d’aquests activadors al·lotèrics. El resveratrol és un antioxidant, capaç d’activar AMPK. Estudis recents han suggerit que el resveratrol estimula AMPK tant a cèl·lules musculars (249) com

neuronals (251) en estudis in vitro. AMPK inhibeix la gluconeogènesi hepàtica i activa la �-oxidació

hepàtica i muscular. Per tant, l’activació d’AMPK podria explicar alguns dels efectes beneficiosos del resveratrol sobre els models de dieta hipercalòrica (252). Una aproximació per a diferenciar els efectes derivats de Sirt1 i AMPK en el tractament amb resveratrol seria el tractament de models knock-out per a Sirt 1 o AMPK en fetge o múscul. Addicionalment ratolins amb una deleció específica

- 148 -


en múscul o fetge de PGC-1� podrien determinar si els efectes d’aquests polifenols requereixen

PGC-1� i són únicament depenents de Sirt1.

Per tant, els resultats descrits amb els activadors al·lostèrics de Sirt1 i el resveratrol no són incompatibles amb els resultats mostrats en el present treball, sinó complementaris. En conjunt, aquests resultats apunten a la modulació negativa de l’activitat Sirt1, negativa a fetge i positiva a teixit adipós i múscul, com a possible diana terapèutica en una teràpia per la diabetis, i son compatibles amb l’efecte antidiabètic de la menor activitat Sirt1 en fetge descrit en el present treball (Figura 73).

- 149 -

DISCUSSIÓ GENERAL

Discussió General

Aquest treball té com a objectiu validar la PEPCK-C hepàtica com a diana terapèutica per a la diabetis. Per a això hem emprat emprat la tecnologia del RNA d’interferència. La reducció de l’activitat PEPCK-C al fetge dels individus diabètics hauria, en teoria, de repercutir en una menor gluconeogènesi hepàtica i en una millora en l’homeòstasi de la glucosa. A més, donades les implicacions de l’enzim en el metabolisme energètic, és d’esperar un impacte metabòlic més enllà de la glucèmia. El patró metabòlic i els possibles mecanismes implicats s’han mostrat i discutit en els capítols I i II. A continuació es discutiran, d’una banda, aspectes metodològics rellevants, i de l’altra, elements discrepants i coincidents amb el model de genosupressió descrit al laboratori del Dr. Magnuson i el Dr. Hanson. Disseny de la molècula silenciadora En el disseny de la molècula efectora, es va emprar vectors de shRNA de 29 nucleòtids, adients per a la seva administració in vivo per vàries raons:

1. Obtenir suficient quantitat de siRNA resulta determinant en la funcionalitat de la estratègia de silenciament (220), especialment en el cas d’un gen que expressa mRNA en grans quantitats, com és el cas de Pck1 en diabetis. L’ús de vectors d’expressió de shRNA permet l’amplificació de la molècula efectora ja que, un cop a la cèl·lula diana, la transcripció proveeix d’una gran quantitat de shRNA efector.

2. Diferents estudis han demostrat que els shRNA de 29 nucleòtids (155) o els siRNA sintètics

de 27 nucleòtids (154) poden ser substancialment més efectius que els shRNA o siRNA sintètics de 21 nucleòtids. Aquest fenomen també ha estat observat in vivo emprant la injecció hidrodinàmica (214). L’explicació sembla radicar en el fet que aquestes molècules són reconegudes i processades per DICER gràcies als extrems 3’ protuberants, facilitant així la interacció del RNA guia amb el RISC.

Vehiculització dels shRNA contra la PEPCK-C hepàtica El delivery de les molècules efectores de RNAi és el “taló d’Aquiles” que en compromet la seva aplicabilitat in vivo. El desenvolupament de metodologies de delivery eficients i selectives per al teixit diana, sense toxicitat ni efectes off-target resulta imprescindible per a una aplicació terapèutica d’èxit.

- 153 -

Discussió General

En el present treball, com a eines experimentals de transferència gènica per a la transducció els vectors de shRNA de forma selectiva al fetge hem emprat en un cas, la tècnica de transferència gènica hidrodinàmica, i en l’altre, adenovirus recombinants. El tropisme natural dels adenovirus pel fetge i la idiosincràsia del mètode de transferència gènica hidrodinàmica ens van permetre obtenir sistemes experimentals per a la transducció específica al fetge de vectors d’expressió de shRNA contra PEPCK-C.

A l’acinus hepàtic, la PEPCK-C està present seguint un gradient decreixent a través del l’eix porto-central (219) (Figura 12). Independentment de la metodologia de delivery dels shRNA emprada en el present estudi (injecció hidrodinàmica de plasmidi nuu o vectors adenovirals), hem observat una atenuació de la immunotinció de PEPCK-C homogènia a tot el fetge, sempre mantenint el gradient porto-central d’expressió. Malgrat que la injecció hidrodinàmmica ofereix una distribució del transgen a la zona pericentral-intermèdia, l’efecte de silenciació obtingut mitjançant la injecció hidrodinàmica de plasmidis d’expressió de shRNA és homogènia a tot el fetge. Al nostre laboratori hem vist que, emprant la injecció hidrodinàmica, l’expressió del plasmidi abasteix un perímetre més ampli quan la dosi és major. Altres estudis han descrit que, en resposta a injeccions hidrodinàmiques successives, es transfecten diferents poblacions d’hepatòcits, ampliant el radi d’abast (214). No es pot descartar, per tant, que el perímetre d’abast del plasmidi injectat hidrodinàmicament s’incrementi amb la dosi, podent arribar a la zona periportal a les altes dosis emprades en aquest l’estudi. Tampoc es pot descartar que els shRNA es difonguin pel parènquima hepàtic (des de la zona perivenosa a la periportal), tot i que la amplificació del RNAi de entre les cèl·lules contigües, com passa en Caenorhabditis Elegans, no ha estat descrit fins al moment en mamífers. S’ha demostrat que l’eficiència de silenciació mitjançant shRNA depèn de l’abundància del mRNA diana (220). PEPCK-C s’expressa en altes quantitats en situacions de dejuni i diabetis. En concordança, una injecció hidrodinàmica amb una dosi baixa (30 μg) de pSHAG-664 no va proporcionar silenciament de PEPCK-C en el nostre model (dada no mostrada), fent necessari pujar la dosi fins a 100 μg de plasmidi d’expressió de shRNA per a aconseguir una silenciació significativa. També aquest fet explica que hi hagi una percentatge inferior en la silenciació en dejuni (quan la transcripció de Pck1 és més activa i els nivells de mRNA són superiors al fetge) emprant la injecció hidrodinàmica i també amb l’ús de vectors adenovirals. Així, els alts nivells d’expressió del gen diana Pck1, fan necessari mètodes altament eficients per a la transducció dels shRNA al fetge, com els adenovirus, els quals permeten una transducció altament eficient dels hepatòcits.

- 154 -

Discussió General

Toxicitat associada als vectors de shRNA Els efectes no específics resultants de la introducció de RNAi poden apareixer en resposta a diferents factors:

1. Activació de la resposta immune innata S’ha demostrat que algunes seqüències de siRNA de 21 nt, així com vectors de shRNA poden activar aquestes vies ancestrals de protecció antiviral en cèl·lules de mamífers (159; 160; 162). Això ha fet d’obligat compliment la comprovació de que les seqüències emprades en els experiments de RNA d’interferència no promouen aquestes vies. En aquest estudi, aquesta comprovació es va fer avaluant marcadors d’ambdues vies. No es van trobar indicis d’activació de cap d’aquestes vies, podent descartar així l’activació de mecanismes inespecífics enfront a RNA de doble cadena, tant amb la utilització de mètodes físics que aporten una capacitat de transduccio menor (transferència gènica hidrodinàmica) com amb mètodes virals que aporten una transducció superior (adenovirus).

2. Efectes off-target dependents de RISC. Al principi, la selecció de la seqüència de siRNA es basava en dues premises: a) la identitat total amb el mRNA diana, ja que desaparellaments puntuals atenuen l’efecte silenciador (143; 144) i b) la selectivitat de seqüència per la diana. No obstant, la descripció posterior dels efectes inespecífics (off-target) dependents de seqüència va disparar les alarmes i incrementar el grau de complexitat en el disseny de molècules efectores de siRNA efectives per tal de minimtzar-ne els efectes secundaris. Aquests efectes s’han associat amb aparellaments entre la regió seed i la regió 3’UTR de mRNAs no relacionats amb la diana (157; 158; 163; 165). Els estudis d’alineament contra el genoma de ratolí (MegaBLAST) de les cadenes sentit i antisentit del shRNA descarten una activitat silenciadora inespecífica deguda a aparellaments inespecífics o parcials amb regions codificants, o amb la regió 3’UTR d’altres mRNAs. No obstant, la constatació irrefutable de l’absència d’efectes off-target prové de la reproducibilitat del fenotip obtingut amb una segona seqüència de siRNA independent contra el mRNA diana. Aquests experiments s’estan duent a terme actualment al nostre laboratori. No obstant, no hem d’oblidar que l’ús de siRNA, com d’altres teràpies farmacològiques, no està lliure d’efectes secundaris. De fet, donada la complexitat del genoma, qualsevol seqüència de siRNA estarà

- 155 -

Discussió General

associada a una “empremta” única de gens afectats per l’efecte off-target, depenent únicament de la seva seqüència i no del mètode de vehiculització (158). Se sap que l’addició de residus 2’-O-metil ribosil a la posició 2 de la cadena guiat del siRNA minimitza aquets efectes off-target deguts a complementarietats de la regió seed, sense perdre la funcionalitat de la molècula (144; 165). No obstant, les modificacions químiques són aplicables sobre molècules sintètiques de siRNA, no sobre vectors d’expressió de shRNA. Un aproximació farmacològica per a la reducció de la PEPCK-C hepàtica podria ser la vehiculització d’un siRNA sintètic modificat amb 2’-O-metil per a minimitzar l’efecte off-target, estratègia que s’està desenvolupant activament al nostre laboratori.

3. Saturació de la maquinària cel·lular de processament de miRNA endògens. L’expressió sostinguda d’alts nivells de shRNA pot induir hepatotoxicitat severa, morbiditat i, en casos extrems, mortalitat, com a conseqüència del bloqueig de la via de processament dels miRNA endògens per competència dels shRNA exogens (164). Aquest tipus de toxicitat ha estat observada després de la transducció del fetge amb dosis altes (1012 partícules) de virus adenoassociat del serotipus 8 (AAV8) (164). En contraposició, la transducció del fetge amb dosis altes de vectors adenovirals (fins a 4*109 p.f.u) no ha resultat en el bloqueig de la via de processament dels miRNA (220). Tenint en compte que per a la transducció de més del 95% dels hepatòcits són suficients dosis de 2*1011 partícules de AAV8 (164) o 2*109 p.f.u d’adenovirus (220), la toxicitat per saturació de la via de processament dels miRNA endògens sembla estar associada a la una sobrecàrrega cel·lular de shRNA, per sobre d’un llindar de toxicitat i, possiblement, per sobre del requeriment necessari per a obtenir un silenciament eficient del gen diana. En els nostres models in vivo la potència de la silenciació correlaciona amb la càrrega viral, suggerint que les dosis d’adenovirus emprades no estan saturant la maquinària endògena de processament. Addicionalment, no hem observat cap dels símptomes que s’han associat a aquest tipus de toxicitat: la supervivència dels animals en cap cas es va veure compromesa, aquests mostraven en tot moment un comportament normal, sense signes de morbiditat més enllà de la patologia diabètica i els animals tractats guanyaven pes en paral·lel als control no infectats. La funcionalitat del fetge tampoc es va veure altrada, ja que no es van observar alteracions com necrosi, fibrosi o hepatomegàlia en la necròpsia. Finalment, els nivells de transaminases sèriques i l’activitat caspasa

- 156 -

Discussió General

3 hepàtica confirmen que l’expressió dels shRNA al fetge dels ratolins no provoca toxicitat significativa, més enllà del descrit per als mètodes de transfecció emprats (210). Es pot descartar, per tant, un fenotip inespecífic degut a la inducció de necrosi o apoptosi hepàtica induïda per toxicitat derivada dels shRNA. Impacte metabòlic de la reducció de PEPCK-C hepàtica Durant dècades, la PEPCK-C s’ha considerat com a un enzim eminentment gluconeogènic. No obstant, estudis recents en els que s’han emprat diferents models de ratolí knock-out, tant a nivell sistèmic (93; 95) com de forma específica a fetge (94; 96; 97), o teixit adipós (87), així com ratolins transgènics que sobreexpresen PEPCK a teixit adipós (88; 89) o a múscul (98), combinat amb l’ús de tècniques de marcatge isotòpic, anàlisis bioquímic i ressonància magnètica nuclear, han permès l’estudi del rol metabòlic que PEPCK-C té en els diferents teixits. Aquests estudis, descrits en més detall a l’apartat introductori, han posat de manifest la funció integradora de PEPCK, no només en l’homeòstasi de la glucosa (GNG hepàtica), sinó també en el metabolisme lipídic (gliceroneogènesi hepàtica i en teixit adipós) i energètic (cataplerosi i anaplerosi). Dels resultats obtinguts en el present estudi se’n desprèn la mateixa conclusió en termes generals: PEPCK té una implicació no només en la gluconeogènesi hepàtica, sinó també en la integració del metabolisme energètic hepàtic. Malgrat aquestes coincidències hi ha aspectes concrets on encara existeix controvèrsia. Aquestst aspectes es discuteixen a continuació:

Efecte dels nivells de PEPCK-C sobre la glucèmia La millora en l’homeòstasi de la glucosa observada a conseqüència de la reducció parcial de PEPCK-C al fetge dels ratolins diabètics, fa palesa la transcendència d’aquest enzim gluconeogènic en la hiperglucèmia durant el dejuni característica de la diabetis (52; 100). Aquests resultats contrasten amb la normoglucèmia, fins i tot en períodes llargs de dejuni, que mostra el model de ratolí knock-out per a PEPCK-C hepàtica (95). El manteniment de la glucèmia en aquest model podria ser degut a efectes compensatoris intra i extrahepàtics entre els que s’inclouen: a) Una menor utilització de glucosa a nivell sistèmic, que podria aconseguirse extremant el repòs. En aquest sentit, cal indicar que, els ratolins sense PEPCK-C hepàtica, després d’un dejuni, no son

- 157 -

Discussió General

capaços de mantenir la glucèmia més enllà de pocs minuts després de l’inici de l’exercici (95), suggerint, que son incapaços de generar glucosa suficient per a sustentar un requeriment important. b) Una major gluconeogènesi extrahepàtica (96). La gluconeogènesi extrahepàtica podria donar-se al ronyó i/o a l’intestí prim (dos teixits amb capacitat gluconeogènica) a partir de glutamina, tot i que l’activitat gluconeogènica a aquests teixits no ha estat mesurada de forma directa pels autors. Aquesta glutamina provindria de la transaminació d’intermediaris del cicle de Krebs, que es troba, a més, bloquejat en aquestes ratolins (Figura 74). c) Una altra font de glucosa podria ser la gluconogènesi hepàtica sustentada per la PEPCK mitocondrial (PEPCK-M). No obstant, la PEPCK-M en murins representa només el 5 % del contingut total de PEPCK i resulta improbable que hi tingui cap paper significatiu. A més, els autors no van detectar-ne un increment en l’activitat al fetge (95). L’origen d’aquestes adaptacions no està clar. La deficiència crònica de PEPCK-C hepàtica pot desencadenar efectes compensatoris adaptatius que podrien explicar la manca de control de l’enzim sobre glucèmia en el model de genosupressió, en comparació amb la supressió aguda testada en el nostre laboratori. L’adaptació dels animals genosuprimits a la carència de PEPCK-C al fetge es podria explicar com a conseqüència de la supressió del gen en estadis molt primerencs de l’ontogènia, característica inherent al model de trangènesis. En la generació del model knock-out els ratolins quimèrics amb els al·lels floxed (amb el gen Pck1 flanquejat per les dianes loxP de la Cre recombinasa) són creuats amb els ratolins quimèrics que expressen la recombinasa Cre sota el promotor de la albúmina, que proporciona expressió específica al fetge (95). Aquest promotor comença a expressar el dia 15 prenatal (253), mentre que l’activació transcripcional de PEPCK-C és perinatal (70). Per tant, un possible procés adaptatiu seria vital per a superar el període prenatal, en el que la inducció de la gluconeogènesi hepàtica és essencial per a la supervivència del fetus a mig termini i per al manteniment de la normoglucèmia en dejú a llarg termini. Hi ha altres exemples a la literatura de disparitat entre els resultats obtinguts en models de silenciació a curt termini mediada per RNA d‘interferència i els models de ratolins knock-out (254; 255).

Control del flux de la via gluconeogènica Els resultats presentats en el present treball demostren que una reducció d’un 50% en el contingut proteic de PEPCK-C resulta en una menor capacitat de producció hepàtica de glucosa. Contràriament, altres autors han trobat que no hi ha una correlació lineal entre els nivells de PEPCK-

- 158 -

Discussió General

C en fetge i el flux gluconeogènic i que PEPCK-C té un coeficient de control de flux metabòlic de R=0,18 sobre la gluconeogènesi (94), però sí entre els nivells de PEPCK-C i el flux del cicle de Krebs (R=0,88). Aquest i altres estudis anteriors (256), suggerint un paper fonamental de l’enzim sobre el control de la cataplerosi del cicle de Krebs. Cal tenir en compte, per explicar aquestes discrepàncies, que aquests estudis estan fets en fetges aïllats perfundits en absència de senyalitzacions hormonals i nutricionals. En canvi, l’anàlisi fet en el nostre estudi és fisiològic i detecta un efecte coordinat i sobre la via gluconeogènica mediat per senyals metabòliques, però també hormonals (Figura 72), que es reflexa en una menor glucèmia i producció de glucosa a partir de piruvat in vivo, com a conseqüència de la silenciació de PEPCK-Cal fetge. Els mecanismes que condueixen als efectes observats serien directes i indirectes:

�� D’una banda, una senyalització nutricional, directament derivada del menor flux gluconeogènic (increment en la relació NADH/NAD+ intracel·lular), orquestrada per Sirt-1, que coordinaria

directament la regulació negativa de reguladors específics de la via (FOXO1 i PGC-1��i

HNF4-�) generant un feed-back negatiu.

� De l’altra, la millora de la sensibilitat a la insulina al fetge, derivada indirectament de la reducció de la producció hepàtica de glucosa, contribueix a una menor taxa de transcripció de gens gluconeogènics.

Aquests dos mecanismes s’han discutit en profunditat a l’apartat Discussió del Capítol 2.

PEPCK en la cataplerosi i el metabolisme energètic Estudis del laboratori del Dr. Hanson (93) i el Dr. Magnuson (96; 97) demostren que PEPCK-C és essencial en la cataplerosi (eliminació d’àcids tricarboxílics del cicle de Krebs) i que la fallada del procés al fetge dels ratolins sans resulta en un bloqueig del cicle de Krebs, els intermediaris del qual s’acumulen, que deriva en bloqueig de la funció mitocodrial al fetge (Figura 74). En contraposició el conjunt de dades presentades en aquest treball ens indiquen que la reducció en un 50% de PEPCK-C en el fetge dels ratolins diabètics, no comporta un bloqueig en la funció mitocondrial. No hem trobat indicis d’una aturada del cicle de Krebs, ja que no hem trobat acumulació dels intermediaris del cicle, ni indicis d’un bloqueig de la respiració mitocondrial. La mateixa conclusió es desprèn dels estudis d’inhibició farmacològica de PEPCK-C amb l’àcid 3-mercaptopicolínic (3-MPA) en fetges perfundits

- 159 -

Discussió General

de rata i cobaia realitzats a la dècada dels 70 (200; 201) on els fetges en presència de 3-MPA, redueixen dràsticament la producció de glucosa, però manténen el consum d’oxigen.

OAA CitratCICLE

DE KREBS

NADHFADH

AcCoA

AGL

�-oxidació NADHFADH

MalatMalat

OAA

PEP

GNG

PEPCK

TAG

c.t.e-

O2

ATP

mitocondri

�KG

glutamat glutamina

NAD+

NADHNH3

ßHBAPyrAla

Asp

Glucosa Figura 74. Paper de PEPCK en la cataplerosi i el metabolisme energètic en fetge: efectes de la supressió de la seva expressió

El bloqueig del cicle de Krebs al fetge del model de ratolí knock-out, resulta en l’aturada del consum d’oxigen i, presumiblement, en l’aturada de la ß-oxidació d’àcids grassos, que s’acumulen en forma de TAG, fent el fetge gras (93; 95; 97) (Figura 74). Els resultats obtinguts en el nostre model de supressió parcial de PEPCK-C en ratolins diabètics (STZ+ i db/db) no no mostraven indicis d’una aturada del cicle de Krebs ni de la ß-oxidació d’àcids grassos. En canvi, també hi ha acumulació de greixos, principalment àcida grassos, la importació i activació dels quals estaria facilitada per

- 160 -

Discussió General

l’increment en la càrrega energètica cel·lular. Aquests àcids grassos finalment s’acumularien al fetge, sobrepassant-ne la capacitat de metabolitzar-los (Figura 75)

OAA CitratCICLE

DE KREBS

NADHFADH

AcCoA

AGL

�-oxidació NADHFADH

MalatMalat

OAA

PEP

GNG

PEPCK

TAG

c.t.e-

O2

ATP

mitocondri

�KG

ATPNADH

ATPNADH

Pyr ßHBA

GlucosaGlucosa

Hepatòcit periportal

InsulinèmiaSensibilitat a insulina

AGL

sang

Figura 75. Efectes sobre l’homeòstasi de la glucosa i el metabolisme energètic de la supressió parcial de PEPCK en el fetge de ratolins diabètics db/db.

Els ratolins knock-out presenten una ablació total del gen Pck1, mentre el present estudi aconsegueix una reducció parcial aproximadament del 50% gràcies a la tecnologia del RNA d’interferència. Per tant, els resultats d’un i altre estudi no resulten contradictoris, sinó complementaris. Assumint la

- 161 -

Discussió General

importància demostrada de la funció catapleròtica de PEPCK-C per al manteniment del cicle de Krebs, vam analitzar en el nostre model l’efecte de la reducció en un 90% del contingut proteic de PEPCK-C i vam poder constatar una disminució en la capacitat de la respiració mitocondrial, en concordància amb els estudis en ratolins knock-out (94; 95; 97), suggerint que hi ha un llindar, a partir del qual l’absència de PEPCK-C no suporta la cataplerosi relativa al cicle de Krebs i es veu afectat el metabolisme mitocondrial. D’altra banda, no hem d’oblidar que un i altre estudi estan basats en models diferents i tenen objectius diferents. Els estudis de knock-out específic de fetge es van dur a terme en ratolins sans amb la finalitat de discernir el paper fisiològic de PEPCK-C en la integració del metabolisme energètic, mentre que els nostres estudis han estat focalitzats en la dissecció de les implicacions de PEPCK-C en diabetis, on la seva expressió aberrant s’associa a la progressió de la malaltia. Fins al moment, els ratolins knock-out de PEPCK-C en fetge no han estat estudiats en un background genètic de diabetis com el que es presenta en aquest estudi. Salvant les discrepàncies, entre els nostres resultats i els estudis de knock-out sí que trobem concòrdia en el fet que PEPCK-C no només té un paper en la modulació del flux de la via gluconeogènica, sinó que té un paper clau en la integració del metabolisme energètic, tal i com s’ha descrit i discutit al Capítol 2. Les dades aportades en aquest estudi s’uneixen al gruix d’estudis que indiquen que PEPCK-C té un paper clau en la diabetis (52; 100-102; 199) i a més aporten una nova aproximació terapèutica per al tractament de la diabetis. En resum, en aquest treball es presenten evidències per a mantenir que la silenciació parcial de PEPCK en diabetis condueix a una millora en el control de la glucèmia, insulinèmia i la sensibilitat perifèrica a la insulina a través d’un mecanisme coordinat en el que estan implicats efectes directes i indirectes respecte la reducció de la producció hepàtica de glucosa. Una reducció coordinada de la via gluconeogènica, probablement mediada tant per factors nutricionals com hormonals derivats de la reducció de la producció hepàtica de glucosa, implica a reguladors clau

responsables de la activació de la via gluconeogènica (Sirt-1, HNF4-�, PCG-1�) sense afectació del

cicle de Krebs ni de la funció mitocondrial. Addicionalment, aquest model contribueix a trencar el dogma, recentment posat en tela de judici, de que la esteatosi hepàtica necessàriament condueix a resistència a insulina.

- 162 -

CONCLUSIONS

Conclusions

Dels resultats presentats en aquest estudi se’n poden extreure les següents conclusions: 1. S’ha clonat un caset d’expressió de shRNA contra la PEPCK-C, tant de rata com de ratolí, sota

el control del promotor d’RNA polimerasa III U6 humà. S’ha validat la seva funcionalitat tant invitro com in vivo, i s’ha comprovat que no indueix toxicitat associada a la resposta immune innata, ni a efectes off-target que resultin en morbiditat, mortalitat o patrons d’expressió incoherents amb la diana silenciada.

2. La injecció hidrodinàmica de plasmidis proporciona la seva transducció de forma majoritària al

fetge, delimitant l’expressió del transgen als hepatòcits de la zona perivenosa-intermèdia de l’acinus hepàtic.

3. La injecció hidrodinàmica de plasmidis d’expressió de shRNA específics contra la PEPCK-C

resulta en la seva silenciació parcial al fetge. Aquest efecte és coherent amb una transducció parcial del fetge i amb el patró de distribució de l’enzim, en un gradient porto-central a l’acinus hepàtic.

4. L’ús de vectors adenovirals constitueix una eina més potent que la injecció hidrodinàmica per a

la vehiculització de shRNA al fetge, podent aconseguir una silenciació total d’una diana abundant i de distribució heterogènia a l’acinus hepàtic, com és la PEPCK-C.

5. Tant la injecció hidrodinàmica de vectors plasmídics, com els vectors adenovirals del serotip 5

proporcionen una eina adequada per a la transducció preferencial del fetge permetent validar la intervenció sobre una diana hepàtica.

6. La reducció parcial del contingut hepàtic PEPCK-C, en absència d’insulina, redueix la

hiperglucèmia en dejuni, refermant el control directe que l’activitat enzimàtica PEPCK-C exerceix sobre la via gluconeogènica, la producció hepàtica de glucosa i la glucèmia, independentment dels efectes de la insulina sobre els dipòsits de glicogen.

7. En presència d’insulina, en el model murí de diabetis db/db, la reducció del contingut hepàtic de

PEPCK-C millora l’homeòstasi de la glucosa com a conseqüènica de la menor taxa de producció de glucosa a partir de substrats gluconeogènics.

- 165 -

Conclusions

8. En presència d’insulina, en el model murí de diabetis db/db, la reducció del contingut hepàtic de

PEPCK-C millora la sensibilitat a la insulina, tant al fetge com als teixits perifèrics (múscul i teixit adipós).

9. L’activitat PEPCK-C està estretament lligada a l’homeòstasi lipídica: al fetge, la reducció de

PEPCK-C hepàtica condueix a l’accumulació de lípids per causes multifactorials, que podrien incloure una reducció de la gliceroneogènesi hepàtica, un increment de la captació d’àcids grassos circulants i una menor reesterificació i exportació de triglicèrids en forma de VLDL. A nivell sistèmic, es produeix una millora en la dislipidèmia, que cursa amb una reducció de TAG i AGL sèrics.

10. L’acumulació hepàtica de lípids conseqüència de la disminució de PEPCK-C en els ratolins

db/db no està associada a lipotoxicitat mediada per PKC� sobre la via de senyalització de la insulina; dissociant, en aquest model, l’acumulació de lípids hepàtics i resistència a insulina.

11. La reducció del contingut de PEPCK-C hepàtica en els ratolins db/db conflueix en una regulació

negativa coordinada de la gluconeogènesi mediada tant per senyals metabòliques derivades de la reducció de la via gluconeogènica (NADH), com per senyals hormonals (insulina).

12. L’acumulació de NADH intracel·lular secundària a la reducció de la via gluconeogènica podria

ser la causa de la reducció del contingut hepàtic de Sirt1. D’aquesta manera, Sirt1 actua com a mediador d’una senyal metabòlica i modula negativament la via gluconeogènica, reduint

l’activitat transcripcional de factors com FOXO1, PGC-1� i HNF4��implicats en la transcripció

dels enzims gluconeogènics (PEPCK-C i G6Pasa). Per tant, la reducció de l’activitat Sirt1 de forma exclusiva al fetge podria ser una fita per al control de la gluconeogènesi hepàtica.

13. Donada la funció catapleròtica de PEPCK-C, l’ablació total de l’enzim al fetge resulta en un

bloqueig del cicle de Krebs i una disfunció mitocondrial. No obstant, la silenciació parcial del seu contingut hepàtic no cursa amb una menor respiració mitocondrial, suggerint que el cicle de Krebs no està afectat i que la funció mitocondrial no se’n veu perjudicada.

- 166 -

Conclusions

14. La PEPCK-C, al fetge, no només té una funció gluconeogènica, sinó que conforma un important punt d’intersecció en el metabolisme energètic hepàtic, integrant el metabolisme de la glucosa, el dels lípids i la funció mitocondrial a través de la seva funció catapleròtica.

15. La modulació de la activitat PEPCK-C hepàtica constitueix una estratègia plauible per al control

del síndrome metabòlic i la patologia diabètica. En resum, les dades aportades en aquest estudi indiquen que la sobreexpressió de PEPCK-C, característica de la patologia diabètica, juga un paper clau en la regulació de l’homeòstasi energètica en models murins. També argumenten a favor de que la disminució de la seva activitat, de forma específica al fetge, constitueix una estrategia plausible per millorar l’homeòstasi de la glucosa i la sensibilitat a la insulina en la teràpia de la malaltia.

- 167 -

MATERIAL I MÈTODES

ÍNDEX DE CONTINGUTS

TÈCNIQUES DE BIOLOGIA MOLECULAR

Obtenció i manipulació dels vectors plasmídics.................................................................. - 173 - Manipulació enzimàtica del DNA ........................................................................................ - 174 - Electroforesi en gels d’agarosa........................................................................................... - 174 - Aïllament i purificació de fragments de DNA....................................................................... - 174 - Subclonatge ........................................................................................................................ - 175 - Cultius bacterians ............................................................................................................... - 175 -

Cultiu líquid .................................................................................................................... - 175 - Cultiu sòlid ..................................................................................................................... - 175 - Obtenció de cèl·lules d’ Escherichia coli competents per a la transformació de DNA plasmídic........................................................................................................................ - 176 - Transformació en cèl·lules Escherichia coli ................................................................... - 177 -

Selecció de clons ................................................................................................................ - 177 - Preparació d’estocs de glicerol ........................................................................................... - 177 - Purificació de DNA plasmídic.............................................................................................. - 178 - Generació dels vectors d’expressió de shRNA................................................................... - 178 - Generació d’adenovirus recombinants................................................................................ - 180 - Preparació i anàlisi de RNA ................................................................................................ - 183 -

Anàlisi dels nivells de mRNA per Northern Blot ............................................................. - 184 - Anàlisi dels nivells de mRNA per PCR quantitativa a temps real (qRT-PCR)................ - 186 -

TÈCNIQUES DE CULTIU CEL·LULAR I EXPERIMENTS IN VITRO

Línies cel·lulars ................................................................................................................... - 188 - Transfeccions...................................................................................................................... - 188 - Obtenció d’hepatòcits de ratolí............................................................................................ - 189 - Respirometria d’alta resolució............................................................................................. - 191 -

ANÀLISI DE LES PROTEÏNES

Preparació d’homogenats ................................................................................................... - 194 -

Obtenció d’homogenats totals a partir de cèl·lules en cultiu......................................... - 194 - Obtenció d’homogenats totals a partir de teixit .............................................................. - 194 - Obtenció de la fracció nuclear a partir de teixit congelat ............................................... - 195 - Separació de la fracció citosòlica i membranosa de fetge ............................................. - 195 -

Valoració de la concentració de proteïna als homogenats ................................................. - 196 - Mètode BCA................................................................................................................... - 196 - Mètode Bradford ............................................................................................................ - 196 -

Anàlisi de proteïnes per Western Blot................................................................................. - 196 - TÈCNIQUES HISTOLÒGIQUES

Preparació de mostres histològiques................................................................................. - 200 -

Obtenció de seccions de 50 �m .................................................................................... - 200 -

Obtenció de crioseccions de 7 �m ................................................................................ - 200 - Immunohistoquímica de PEPCK-C..................................................................................... - 201 - Tinció de lípids .................................................................................................................... - 202 -

DETERMINACIONS BIOQUÍMIQUES

Activitat PEPCK .................................................................................................................. - 203 - Activitat caspasa 3 .............................................................................................................. - 204 - Determinació de paràmetres sèrics .................................................................................... - 205 -

Determinació de glucosa ............................................................................................... - 205 - Determinació d’insulina.................................................................................................. - 205 - Determinació de Glutamat Piruvat Ttransaminasa (GPT) E.C. 2.6.1.2. sèrica .............. - 205 - Determinació d’àcids grassos no esterificats (AGL), Triglicèrids (TAG), �-Hidroxibutirat (�-HBA), colesterol i lactat. .................................................................. - 205 - Determinació del colesterol HDL.................................................................................... - 205 -

Determinació de metabòlits hepàtics .................................................................................. - 206 - Glicogen......................................................................................................................... - 206 - TAG i àcids grassos hepàtics ........................................................................................ - 206 - Nucleòtids intracel·lulars (ATP, ADP, AMP) .................................................................. - 207 - Acil-CoA de cadena curta .............................................................................................. - 208 -

MODELS ANIMALS I EXPERIMENTS IN VIVO

Models animals ................................................................................................................... - 209 -

Model de diabetis tipus I: inducció de diabetis experimental mitjançant estreptozotocina............................................................................................................ .- 209 - Model de diabetis tipus II: ratolí db/db ........................................................................... - 210 -

Transferència gènica hidrodinàmica ................................................................................... - 210 - Administració dels adenovirus ............................................................................................ - 210 - Administració de galactosamina-LPS ................................................................................. - 211 - Administració d’àcid 3-mercaptopicolínic ............................................................................ - 211 - Mesura de la glucèmia........................................................................................................ - 212 - Administració de metformina............................................................................................... - 212 - Administració de poli dI:dC ................................................................................................. - 212 - Dejuni.................................................................................................................................. - 212 - Test de tolerància intraperitonial a la glucosa..................................................................... - 213 - Test de sensibilitat perifèrica a la insulina........................................................................... - 214 - Test de producció de glucosa a partir de piruvat ................................................................ - 214 - Gàbies metabòliques .......................................................................................................... - 215 - Anestèsia, eutanàsia i presa de mostres ........................................................................... - 215 -

Obtenció de sèrum......................................................................................................... - 215 - Obtenció de teixits ......................................................................................................... - 216 -

Material i Mètodes

TÈCNIQUES DE BIOLOGIA MOLECULAR

Obtenció i manipulació dels vectors plasmídics

Aplicació Nomenclatura Construcció Antibiòtic

Expressió PEPCK-C pC/PEPCK cDNA de PEPCK subclonat al lloc BamHI de pCAGGS, vector bicistrònic que proporciona

elevats nivells d’expressió (257). Amp

pEGFP Promotor CMV unit a una proteïna verda fluorescent Enhanced (EGFP) (Clontech). Amp

pGL3 Promotor SV40 unit al gen de la luciferasa de Photinus pyralis (Promega) Amp

Reporter

pCESlucSV

Proveït pel Dr. Mark Cooper (Copernicus Therapeutics Inc.).

Promotor del factor d’elongació 1 i l’enhancer de CMV unit al gen de la luciferasa de

Photinus pyralis.

Amp

pSHAG-1

Proveït pel Dr. Greg Hannon (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, USA)

Promotor humà U6 de RNA polII (-265_+1) seguit de un lloc BseRI- BamHI per

al clonatge de seqüències d’expressió de shRNA.

Kan

pSHAG-Ff Proveït pel Dr. Greg Hannon (Cold Spring

Harbor Laboratory, NY, USA) pSHAG que expressa shRNA contra la

luciferasa de Photinus pyralis. Kan

pSHAG-482 pSHAG que expressa shRNA contra PEPCK Kan

Expressió de shRNA

pSHAG-664 pSHAG que expressa shRNA contra PEPCK Kan

pTG6600�CMV Vector llançadera per a la construcció

d’Adenovirus, sense promotor. Ad5(1-458)-MCS-Ad5(3328-5788).

Amp

pTG6600-U6-Ff Vector llançadera per a la construcció

d’Adenovirus, amb la seqüència Ff sota el control del promotor humà U6 de RNA polII

Amp

pTG660-U6-664 Vector llançadera per a la construcció

d’Adenovirus amb la seqüència 664sota el control del promotor humà U6 de RNA polII.

Amp

pKp1.4�CMV Genoma adenoviral d’Ad5 ( E1-E3). Amp

pKp1.4-U6-Ff Genoma adenoviral d’Ad5 ( E1-E3) amb el

caset d’expressió del shRNA contra la luciferasa (Ff) controlat pel promotor humà U6

de RNA polII. Amp

Construcció d’adenovirus

pKp1.4-U6-664 Genoma adenoviral d’Ad5 ( E1-E3) amb el

caset d’expressió del shRNA contra la PEPCK-C (664) controlat pel promotor humà

U6 de RNA polII.. Amp

Taula 16. Plasmidis utilitzats. Amp; ampicil·lina, Kan; kanamicina

- 173 -

Tècniques de Biologia Molecular

Manipulació enzimàtica del DNA Les endonucleases de restricció són enzims purificats de bacteris o de fongs, que presenten una marcada especificitat vers seqüències curtes de DNA i actuen sobre elles trencant els enllaços fosfodièsters i, per tant, la cadena de DNA.

De forma general, es digereix el DNA amb una proporció de 5 U�g de DNA durant un període d’1 a

3 hores a 37ºC, excepte que el proveïdor indiqui una altra temperatura òptima per a l’enzim en qüestió. S’ha de tenir present no superar el 5% de glicerol al tampó de restricció, per a no comprometre l’activitat enzimàtica. Electroforesi en gels d’agarosa Per a la separació analítica o preparativa de fragments de DNA de mida superior a 100 pb les mostres de DNA s’han sotmès a electroforesi en gels d’agarosa, en tampó TAE 1X. El pecentatge d’agarosa que aplicarem en el gel dependrà de la mida dels fragments de DNA que esperem. Habitualment es preparen els gels d’agarosa a l’1%. La mostra de DNA es prepara amb tampó de càrrega 1X i es carrega als pouets del gel. El DNA es sotmet a electroforesi a 100V durant 30-60 minuts, fins que el front (blau de bromofenol) arriba al final del gel. La visualització del DNA s'aconsegueix mitjançant la incorporació al gel del colorant fluorescent bromur d'etidi (0,5 μg/ml), que s'intercala entre les cadenes de DNA i apareix com una banda de color taronja quan és sotmès a il·luminació ultraviolada. Aquesta tècnica permet detectar quantitats de fins a 10 ng de DNA.

Tampó de càrrega 10X TAE 50X Glicerol 50% (vol/vol) Tris 40 mM

EDTA 100 mM Àcid acètic 20mM SDS 1% (vol/vol) EDTA 1 mM

Blau de bromofenol 0.1% (p/vol) Xilen Cianol FF 0.1%(p/vol)

Aïllament i purificació de fragments de DNA. Per a la purificació de fragments de DNA en gels d'agarosa s’ha utilitzat el kit Quiaquick Gel Extraction (Quiagen) basat en la dissolució del fragment d'agarosa que conté la banda desitjada en un agent caotròpic. Aquestes condicions permeten una adsorció selectiva del DNA a una matriu de

- 174 -

Material i Mètodes

sílice. El DNA posteriorment es renta i s’elueix en condicions de baixa força iònica, normalment H2O. Es va seguir el protocol dels subministradors. Subclonatge Un cop tenim els fragments de DNA purificats, amb l'objecte de construir molècules híbrides de DNA, els fragments són barrejats a diferents proporcions molars insert:vector (1:1, 1:3 i 3:1) i tractats amb una unitat DNA lligasa del bacteriòfag T4, que catalitza la formació d’enllaços fosfodièster entre els extrems 3’OH i 5’P adjacents, en un volum final de 10 μl. La reacció s’incuba durant 1 hora a temperatura ambient, seguit d’una incubació a 4ºC durant la nit. Al dia següent, es procedeix a la transformació en la soca convenient de bacteris competents. Cultius bacterians Els bacteris que s’utilitzen per els protocols que s’han portat a terme corresponen a les soques

d’Escherichia coli DH5� i XL1-blue per als clonatges rutinaris de plasmidis, i JM5183, TOP10 per al

clonatge de les construccions dels vectors adenovirals.El material de vidre i els medis de cultius (LB o LB-agar) s’esterilitzen per autoclau, i la manipulació dels bacteris es realitza en condicions d’esterilitat (sota flama o en campana de flux laminar).

Cultiu líquid En el cas dels cultius líquids, es fan créixer les cèl·lules en agitació (220 rpm) amb medi LB a 37ºC durant tota la nit (12-16 hores). El recipient on es realitza el cultiu no s’omplirà mai més d’una tercera part, per a garantir una bona oxigenació del cultiu, que permei el creixement exponencial del mateix. En el cas que les cèl·lules transformades amb un plasmidi, per a exercir una pressió selectiva i afavorir el creixement de les cèl·lules que hagin incorporat el plasmidi, s’addiciona un o altre antibiòtic segons la resistència codificada pel plasmidi.

Cultiu sòlid Els cultius sòlids es fan sobre plaques de LB-agar que també inclouran l’antibiòtic d’elecció, en el cas pertinent. Les plaques es deixen cap per avall a 37ºC tota la nit (12-16 hores). És important deixar-los en aquesta posició per tal d’evitar que el vapor d’aigua impregni el medi de cultiu.

- 175 -


LB líquid LB-agar NaCl 5 g/l NaCl 5g/l

Triptona-peptona 10 g/l Triptona-peptona 10 g/l Extracte de llevat 10 g/l Extracte de llevat 10 g/l

Agar 15 g/l

Antibiòtic Estoc (1000X) Concentració en cultiu Ampicil·lina 50 mg/ml 50 μg/ml Kanamicina 30 mg/ml 30 μg/ml

Obtenció de cèl·lules d’ Escherichia coli competents per a la transformació de DNA plasmídic

Per a obtenir grans quantitats del DNA plasmídic clonat, aquest s’introdueix a una soca bacteriana, seguint el protocol de transformació bacteriana, on es mantindrà de forma episomal i s’amplificarà en les successives replicacions bacterianes. Per a capacitar les bacteries per a internalitzar el plasmidi, cal sotmetre-les al següent un tractament que indueixi porus a la membrana externa: 1. Inocular sobre 2 ml de LB sense antibiòtic cèl·lules d’Escherichia coli provinents d’un estoc de

glicerol mare i créixer durant tota la nit a 37ºC en agitació (220 rpm). 2. El matí següent, transvassar el mini-cultiu a un Erlenmeyer que conté 100 ml de LB sense

antibiòtic. Deixar aproximadament 2 hores a 37ºC en agitació. Cada 30 minuts extreure una alíquota del cultiu i mesurar-ne l’absorbància a 595 nm. Aturar el cultiu quan l’absorbància estigui entre 0.35-0.60. En aquest moment el cultiu està en creixement exponencial.

3. Es refreda el creixement durant uns 15 minuts a 4ºC. Un cop refredat es passa el cultiu a tubs de 50 ml (també pre-refredats). A partir d’aquest punt, tot el tractament es realitza a 4ºC, les solucions pre-refredades en gel i el material pre-refreat a la nevera. Això millora la supervivència de les cèl·lules al tractament de xoc amb la solució de competents.

4. Es centrifugua el cultiu bacterià durant 10 minuts a 4ºC a 2500 rpm i es descarta el sobrenedant. 5. El precipitat obtingut es resuspèn en 15 ml de la solució per competents freda i es repeteix la

centrifugació en les mateixes condicions. 6. Es descarta el sobrenedant i es resuspèn en 4 ml de la solució de competents.

7. S’aliquota el més ràpid possible en fraccions de 200 μl i es congela en N2 líquid. Es conserven a

-80ºC. Solució de competents

PIPES 10 mM CaCl2 60 mM Glicerol 15%

pH 7.4

- 176 -

Material i Mètodes

Transformació en cèl·lules Escherichia coli Els productes de la barreja de lligació, o els plasmidis que es volen amplificar són introduïts en cèl·lules competents Escherichia coli segons el següent protocol: 1. Es descongela en gel una alíquota de cèl·lules competents en gel. 2. S’afegeixen uns 50 ng del plasmidi que es vol transformar (en cas que provingui d’una lligació

s’afegirà 5 μl) en 100 μl de competents. 3. Es realitza un xoc tèrmic fred-calor: 20 minuts en gel- 45 segons a un bany a 42ºC- 2 minuts en

gel. 4. S’afegeixen 900 μl de LB sense antibiòtic. Es deixa en agitació 45 minuts a 37ºC per a permetre

a les cèl·lules que es recuperin del xoc tèrmic. 5. Centrifugar durant 1 minut i decantar el sobrenedant. 6. Resuspendre el contingut de cèl·lules amb el volum residual de LB i plaquejar a plaques de LB-

agar amb l’antibiòtic de selecció adient segons el plasmidi. Cultivar durant la nit a 37ºC. Aquelles cèl·lules que han adquirit el DNA plasmídic creixeran preferentment, generant clons que creixen en colònies, mentre que les que no l’hagin incorporat moriran.

Selecció de clons Per tal de verificar quins clons contenen la construcció plasmídica correcta, s’inocula un mini-cultiu de 2ml a partir amb cada una se les colònies que es vulguin analitzar dels clons cresuts a la placa de LB-agar i es creix a 37ºC en agitació (220 rpm) durant la nit. S’extreu el DNA plasmídic i s’analitza per digestió i posterior electroforesi en un gel d’agarosa el patró de bandes. És convenient guardar estocs de glicerol dels clons positius dels plasmidis, per a poder amplificar el clo a partir d’ells. Preparació d’estocs de glicerol Un cop es té la construcció plasmídica final, es guarda un estoc bacterià a partir d’un cultiu exponencial dels bacteris en medi LB (durant la nit a 37ºC en agitació): 810 μl de cultiu i 190 μl de glicerol 80% (percentatge final de glicerol: 15%). Barrejar bé i conservar a -80ºC.

- 177 -


Purificació de DNA plasmídic Per a la purificació de DNA a petita escala es parteix de 2 ml de cultiu bacterià líquid i es segueix el protocol del kit de mini-prep seguint les indicacions del proveïdor (Promega). Un cop purificat el plasmidi, es realitza una digestió amb enzims de restricció per a confirmar que es tracta del plasmidi correcte.

Per a la valoració de la concentració del DNA plasmídic es mesuren les absorbàncies a 260nm i

280 nm de una dilució 1/50 i es calcula la concentració segons la fórmula:

[DNA] (�g/�l) = A260 x 50/��l DNA plasmídic

La puresa s’estima segons la relació A260/ A280. Una solució pura de DNA té una A260/ A280 entre 1.8 i 2. Relacions inferiors són indicatives de contaminació per proteïnes o substàncies aromàtiques (fenol, etc). Relacions superiors poden ser degudes a contaminació per RNA. Per tal d’obtenir quantitats elevades de DNA per al seu us en experiments de transfecció en cultiu cel·lular in vitro o per a la injecció d’animals in vivo es parteix d’un cultiu de 150-500 ml i s’utilitza el kit de maxi-prep (proporciona un rendiment de fins a 500 μg de DNA plasmídic) o mega-prep (proporciona un rendiment de fins a 2 mg de DNA plasmídic), segons les indicacions del kit. En aquests casos s’obtenen preparacions de DNA plasmídic lliures d’endotoxines. La presència d’endotoxines en les preparacions plasmídiques són causa de la inhibició de la seva expressió i provoquen reaccions inflamatòries in vivo, anul·lant-ne l’expressió. En les preparacions de DNA plasmídic a gran escala per a posteriors experiments tant in vitro com in vivo s’han utilitzat els kits comercials GenElute Endotoxin-free Maxiprep plasmid Purification kit (Sigma) o Megaprep:Nucleobond Endotoxin-free Plasmid DNA Purification kit (Macherey-Nagel). Aquests kits permeten l’obtenció de DNA plasmídic lliure d’endotoxines partint de 125 o 500 ml de cultiu bacterià líquid en LB, respectivament. Generació dels vectors d’expressió de shRNA Es van dissenyar dos parelles d’oligonucleòtids codificants per shRNA dirigits contra PEPCK-C de Ratus novergicus com de Mus musculus, el primer començant pel nucleòtid 482 a partir de l’inici de traducció, i el segon començant pel nucleòtid 664. La seqüència nucleotídica es detalla a continuació:

- 178 -

Material i Mètodes

482: OLIGONUCLEÒTID A: 5’CATGCTGGCCACCACATAGGGCGAGTCTGAAGCTTGAGACTCGTCCTATGTGGTGGCCGGCGTGTGGTTTTTT3’ OLIGONUCLEÒTID B: 5’GATCAAAAAACCACACGCCGGCCACCACATAGGACGAGTCTCAAGCTTCACCTGGCGCACTGGCTGAGCATGGCCCACG-3’ 664: OLIGONUCLEÒTID A: 5’AGGAGATGATCTCTCTGCGGTCCGGGAGAAGCTTGTTCCGGATCGCAGGGAGATTATCTCCTTCGGTTTTTT-3’ OLIGONUCLEÒTID B: 5’GATCAAAAAACCGAAGGAGATAATCTCCCTGCGATCCGGAACAAGCTTCTCCTGGACCGCAGAGAGATCATCTCCTTCG-3’ Per a obtenir els plasmidis d’expressió dels shRNA es van seguir els següents passos:

1. Anellament dels oligonucleòtids.Els oligonucleòtids, resuspesos a una concentració de 3 mg/ml van ser barrejats a concentracions equimolars, sotmesos a 95ºC durant 4 minuts per a desnaturalitzar-los, seguit de 70ºC durant 10 minuts i deixats atemperar lentament (uns 10 minuts), per a permetre l’anellament per complementarietat de seqüència. Un cop anellats es conserven en gel fins a successives manipulacions o a -20ºC a llarg termini.

2. Fosforilació dels extrems 5’. Els extrems 5’ fosforilats permeten la lligació dels oligonucleòtids amb el vector desitjat. Es tracta 0,5 μg d’oligonucleòtid anellat amb 10 unitats de T4 polinucleòtid quinasa (Fermentas) durant 30 minuts a 37ºC en presència de 0,1 mM ATP i en un volum final de 10 μl. La reacció es finalitza inactivant l’enzim per calor incubant a 70ºC durant 10 minuts.

3. Es purifiquen els olionucleòtids en columnes Sephadex G50 (GE Healthcare). 4. Lligació.

- 179 -


Un cop anellats, els fragments es van lligar al lloc BamHI-BseRI de pSHAG-1 i es va seguir el procés de clonatge tal i com es detalla a les pàgines anteriors. Els plasmidis obtinguts es van anomenar pSHAG-482 i pSHAG-664, respectivament (Figura 15 i taula 16). Generació d’adenovirus recombinants Els adenovirus utilitzats en aquesta tesi han estat generats al servei de producció de virus del Centre de Biotecnologia Animal i Teràpia Gènica (CBATEG) segons els PNT del servei. Es tracta d’adenovirus del serotipus 5 no replicatiu al qual se li ha delecionat la regió E1-E3. Per tant, per a la seva replicació i amplificació requereixen cèl·lules productores que complementin en trans aquestes regions. A continuació es fa una descripció breu del procés:

1. ConstruccionsEs va subclonar el caset d’expressió de shRNA U6-Ff i U6-664 (resultant de la digestió de pSHAG-Ff i pSHAG-664, respectivament, amb NotI-AscI) al vector llançadora p6600 CMV en el lloc NotI-MluI seguint les tècniques de biologia molecular descrites. Es fa servir la soca bacteriana competent d’E.Coli TOP10.

2. RecombinacióEs linealitza pKp1.4 CMV amb PacI, mitjançant la incubació durant tota la nit (14-16 hores) a 25ºC

amb 10 U d’enzim/�g de DNA. A continuació, es procedeix a la recombinació amb el vector

llançadora. Es co-transformen p6600 CMV i pKp1.4 CMV linealitzat en la soca d’E. Coli BJ5813 RecA+(recombinasa positiva). Només aquells clons en els que hi hagi hagut recombinació entre els dos vectors creixeran al medi de selecció. És molt important en aquest pas comprovar l’absència de vector pKp1.4 CMV parental mitjançant múltiples digestions amb enzims de restricció (Figura 76). Els vector obtinguts, d’expressió del shRNA contra la luciferasa i la PEPCK-C, es van anomenar pKp1.4-U6-Ff i pKp1.4-U6-664, respectivament. Un cop es té el genoma de l’adenovirus recombinant es fa una maxi-prep, es linealitza amb PacI, mitjançant la incubació durant tota la nit (14-16 hores) a

25ºC amb 10 U d’enzim/�g de DNA, i es purifica per precipitació en acetat sòdic.

- 180 -

Material i Mètodes

3. Obtenció de les partícules viralsPer a la generació de partícules virals, les construccions definitives pKp1.4-U6-Ff i pKp1.4-U6-664, linealitzades amb PacI i purificades, es van transfectar en cèl·lules empaquetadores HEK-293. Aquesta línia cel·lular complementa en trans els elements virals que manquen a les construccions pKp1.4, que no són replicatives per si soles, permetent així l’encapsidació del genoma viral i la

generació de les partícules infectives. Es condensen 3 �g dels plasmidis amb PEI per a transfectar

plaques de 6 cm a una confluència del 70-80%. Passades 80 hores (corresponent a dos cicles virals) es recullen les cèl·lules i el medi. Les cèl·lules productores es lisen amb tres cicles de congelació-descongelació, es centrifuga 3500-400 rpm 10 minuts i es recull el sobrenedant on hi ha les partícules virals, que es guarden a -80ºC fins a la seva purificació.

4. AmplificacióL’amplificació de les partícules virals es realitzà mitjançant successives infeccions de les cèl·lules empaquetadores amb el lisat anterior, que conté les partícules virals. Una preparació estàndard correspon a una producció de 20 plaques de 15 cm de diàmetre. La infecció es realitza normalment quan les cèl·lules estan a una confluència del 90-100% en medi sense sèrum durant una hora. Passat aquest temps, s’aspira el medi i s’afegeix medi complet.

5. PurificacióEs fan dues rondes de purificació en columnes de gradient de CsCl2 seguides d’una última purificació en columnes de Sephadex G25 (GE Healthcare).

6. TitulacióLa titulació dels adenovirus es realitzà mitjançant dues metodologies. La primera valora la quantitat de partícules virals (viral particles, v.p.), quantificant el contingut proteic per espectofotometria. La segona valora les partícules infectives. (plaque forming units, p.f.u.), segons l’aparició de l’efecte citopàtic després de la infecció de cèl·lules HEK-293. A tal fi, s’infecten cèl·lules HEK-293 amb una dilució seriada deadenovirus recombinant (factor de dilució entre 101 i 103) i s’observa l’aparició de l’efecte citopàtic (les cèl·lules apareixen arrodonides i birrefringents) durant les 36-48 hores següents. Aquella dilució que provoca efecte citopàtic al 100% de les cèl·lules és la que permet estimar el títol de la preparació segons la fórmula:

- 181 -


Nºcèl·lules al pouet * dilució * 10 pfu/cèl·lula Volum de la dilució emprat en la infecció

= títol (p.f.u./ml)

Les titulacions obtingudes en els stocks virals emprat en els estudis inclosos en aquest treball son:

v.p./ml p.f.u/ml AdU6-Ff 1.83 1012 4.19 1010

AdU6-664 1.33 1012 5.64 1010

7. Emmagatzematge.

Els estocs virals s’han emmatzemat en PBS 1X, 0.5 mM MgCl2, 0.9 mM CaCl2, 10% glicerol a -80ºC

en alíquotes de 50-100 �l.

Not

I

Hin

dIII

Vsp

I

Pac

I

Not

I

Hin

dIII

Vsp

I

Pac

I

Bsp

EI

Not

I

Hin

dIII

Vsp

I

Pac

I

Bsp

EI

Ad5-U6-Ff Ad5-U6-664 pKpCMV1K

b La

dder

Not

I

Hin

dIII

Vsp

I

Pac

I

Not

I

Hin

dIII

Vsp

I

Pac

I

Bsp

EI

Not

I

Hin

dIII

Vsp

I

Pac

I

Bsp

EI

Ad5-U6-Ff Ad5-U6-664 pKpCMV1K

b La

dder

Figura 76. Patró de restricció de les construccions adenovíriques definitives per a Ad5 expressant el shRNA Ff (dirigit contra la luciferasa de Photinus pyralis) i 664 (dirigit contra PEPCK-C).

- 182 -

Material i Mètodes

Preparació i anàlisi de RNA La preparació d’RNA total s’ha realitzat a partir de teixit congelat immediatament després de la seva extracció en nitrogen líquid i posteriorment mantingut a -80º C. Alternativament, en el moment de la necròpsia, el teixit s’ha submergit en solució la estabilitzadora RNAlater (Quiagen) i conservat a 4ºC fins a la extracció del RNA. Durant la purificació, la manipulació de l’RNA s’ha fet en fred (treballant sobre gel), amb material autoclavat i aigua tractada amb DEPC per a eliminar la possibilitat de degradació per RNases.

Per a l’extracció de RNA total per a la realització de Northern blot, es va homogeneïtzar una mostra de fetge de 100 mg de teixit hepàtic, en un politró Polytron PT3000 (Kinematica) aplicant-hi 2 polsos de 10 segons a 10000 rpm en 1 ml de Ultraspec (Biotex), seguint les indicacions del fabricant. Per a aplicacions de qRT-PCR l’extracció s’ha dut a terme amb el kit RNAeasy mini Kit (Quiagen), ja que, tot i tenir un rendiment menor, proporciona un RNA de major puresa. En aquest cas, una peça d’uns 10-20 mg es va homogeneïtzar en un Potter (Bayer) aplicant-hi 2 polsos de 10’’ a 1500 rpm en

600 �l de tampó RLT, i es van seguir les indicacions del kit. Addicionalment es va realitzar un

tractament en columna amb DNAsa, seguint les indicacions del kit, per a evitar possibles contaminacions amb DNA genòmic que poguessin interferir amb la quantificació del mRNA.

A partir duna dilució 1/50 de l’RNA es determina l’absorbància a � 260 i es calcula la concentració

de la mostra segons la fórmula:

[RNA] (�g/�l) = A260 x 40/ �l RNA total

La puresa de la preparació de RNA es valora segons la relació A260/ A280. Una solució pura d’RNA té una A260/ A280 � 2. Relacions inferiors són indicatives de contaminació per proteïnes o substàncies aromàtiques (fenol, etc). La integritat del RNA es comprova per electroforesi en un gel desnaturalitzant d’agarosa a l’1.5% d’una alíquota (0,5-1 μg). Si el RNA no presenta degradació significativa, es poden diferenciar dues bandes definides corresponents a l’RNA ribosòmic 28S (4,8 Kb) i 18S (1,8 Kb).

- 183 -


Anàlisi dels nivells de mRNA per Northern Blot

1. Electroforesi en gels desnaturalitzants d’agarosa-formaldehid.Per tal d’ analitzar la integritat de l’RNA purificat, o com a primer pas de la detecció del mRNA desitjat per Norther blot, la mostra de RNA es desnaturalitza i separa en gels d’agarosa desnaturalitzants amb formaldehid.

� Preparació del gel 1,5 % agarosa/formaldehid: Vf 50 ml 250 ml H2O 36 ml 144 ml MOPS 10X 5 ml 25 ml Agarosa 0.75 g 3.75 ml Escalfar fins a dissoldre l’agarosa, deixar refredar fins 55-65ºC i afegir: Formaldehid 37% 9 ml 45 ml

2. Desnaturalització de la mostra d’RNA. Gel analític Gel Northern

RNA 2 �l 25 �g Tampó de mostra per RNA 10 �l 50 �l Tampó de càrrega per RNA 10X 2 �l 5.5 �l - Incubar 10 minuts a 65 ºC per a defer estructures secundàries del RNA. Clavar immediatament

els tubs en gel. - Carregar el gel d’agarosa/formaldehid i dur a terme l’ectroforesi a 20-25 V durant la nit (12-16

hores) o 70 V durant el dia (4-6 hores).

MOPS 10X 0.2 M MOPS, 50 mM Acetat sòdic, 5 mM EDTA Tampó de mostra per RNA 6% formaldehid, 50% formamida desionitzada, 20mg/ml bromur d’etidi Tampó de càrrega 10X per

RNA 50% glicerol, 0.4% blau de bromofenol, 0.4% xilè cianol

Tampó electroforesi MOPS 1X en H2O DEPC o autoclavada

3. Transferència passiva alcalina invertida.La transferència passiva alcalina invertida és una metodologia senzilla i ràpida per a transferir el mRNA del gel d’agarosa a la membrana de niló o PVDF (Hibond-N+, Amersham). En aquest mètode de transferència el flux va de dalt cap a baix (Figura 77), fet que el converteix en molt més ràpid i eficient, permetent detectar bandes més delimitades i intenses.

- 184 -

Material i Mètodes

Trapicel

Paper cromatogràficMembrana

GelPaper cromatogràfic

Pont (paper cromatogràfic)

Suport

Tampó de transferència

CobertaNivell

Figura 77. Muntatge per a la transferència passiva alcalina invertida S’ensambla el muntatge de transferència segons l’esquema que s’indica a la Figura 77. Les capes inferiors de paper seran seques, mentre que la membrana, gel i capes superiors de paper cromatogràfic (Whatman) i el pont s’humitegen amb tampó de transferència. Es cobreix sistema amb una plataforma de plàstic per a mantenir el sistema humit. No cal afegir cap pes a la part superior, però és important equilibrar el sistema amb un nivell i vigilar que el pont no contacti amb les capes de paper de sota el gel. La transferència es duu a terme durant quatre hores a temperatura ambient. Posteriorment es fixa l’RNA a la membrana a 80ºC durant quinze minuts.

4. Hibridació amb la sonda radioactivaPrehibridació: s’utilitzà la solució ULTRAhybTM (Ambion) segons el protocol del fabricant. Marcatge de la sonda: es va dur a terme seguin el protocol del kit comercial Random primer

Rediprime II-Random Prime labeling system (Amersham Biosciences) utilitzant [�-32P]dCTP (3000

Ci/ mmol). Es quantifica el marcatge mesurant les cpm que emet 1 �l de sonda en un comptador

beta. Hibridació: 106 cpm/ml de sonda marcada s’afegeixen a la solució de prehibridació i s’incuben a 42ºC 14-24 h. Rentats: 2 X 5 min en 2X SSC, 0.1% SDS a 42ºC 2 X 15 min en 0.1X SSC, 0.1% SDS a 42ºC

SSC 20X 3M NaCl, 0.3 M Citrat sòdic, pH 7.4 Tampó de transferència SSC 5X, 10mM NaOH

- 185 -


5. Detecció del marcatge radioactiuContacactar amb films fotogràfics Curix RP2 (Agfa) entre 6 i 24 hores a -80ºC, o amb membranes Phosphoimager (Bio Rad) durant 1-5 hores.

Anàlisi dels nivells de mRNA per PCR quantitativa a temps real (qRT-PCR) La qRT-PCR, per la seva sensibilitat i dinamisme s’ha convertit en la eina d’elecció per a quantificar RNA, fins i tot en aquells casos en que els nivells d’expressió són ínfims. El mètode es basa en la detecció de fluorocroms lligats a les sondes de forma simultània a l’amplificació, superant així les limitacions dels protocols de quantificació basats en la reacció de PCR a punt final. En aquest treball s’han emprat sondes TaqMan, que aprofiten l’activitat inherent 5’nucleasa de la Taq polimerasa, així con d’altres DNA polimerases. Les sondes contenen un fluoròfor (FAM) a l’extrem 5’ i un quencher(TAMRA) al 3’ (absorbeix la fluorescència del primer). Quan la sonda anella amb el cDNA cebador i la Taq comença l’amplificació, la sonda es degrada per l’activitat 5’�3’ exonucleasa, separant el fluoròfor del quencher, resultant en un increment de la fluorescència, en una fase exponencial, fins a arribar a una saturació de la senyal, al punt final de la reacció. El número de còpies del cDNA a la reacció determina l’inici de la fase exponencial, fet que és aprofitat per a estimar el contingut de mRNA de la mostravalor, a partir de del valor ct. El ct correspon al cicle en el que s’inicia l’amplificació exponencial, per sobre d’un llindar detectable. Tot i que la tècnica permet la quantificació absoluta d’un determinat mRNA en termes de número de còpies (si es fa servir una recta patró), en la present tesi s’han determinat els valors relatius al tractament control, segons el càlcul de la ��ct. Així, els càlculs realitzats per a determinar del contingut de mRNA relatiu al grup control són:

�ct = ct gen problema – ct gen normalitzador ��ct = �ct mostra problema – �ct mostra de referència

Quantitat relativa de mRNA = 2(-��ct)

L’amplificació dels mRNA es va realitzar en dos passos: 1) en un pas previ, el mRNA es retro-transcriu a cDNA i 2) el cDNA s’amplifica en els successius cicles de PCR.

1. .Obtenció de cDNA per retro-transcripció del mRNAS’utilitzà el kit comercial Rady-To-Go You-Prime First-Strand Beads (Amersham Biosciences). A

partir de 2 �g de RNA, utilitzant hexàmers aleatoris com a sodes i seguint el protocol del fabricant,

s’obté una població dels cDNA corresponents al RNA total de la mostra.

- 186 -

Material i Mètodes

2. PCR a temps realEls nivells dels mRNA d’interès es van detectar utilitzant el sistema Micro Fluidic Card (Applied Biosystems) en un aparell ABI PRISM® HT7900 Real Time Sequence Detection System (Applied Biosystems). La Micro Fluidic Card és una placa de 384 pouets que conté les sondes TaqMan incorporades. Les Micro Fluidic Card emprades en aquest estudi són d’una configuració 24x8x2, la qual permet amplificar 24 mRNAs (Taula 17) de 8 mostres individuals per duplicat.

Proteïna Gen Sonda TaqMan Chrebp Mlxipl Mm00498811_m1 c-myc Myc Mm00487803_m1

GK Gck Mm00439129_m1 UCP 2 Ucp2 Mm00495907_g1 PFK2 Pfkfb3 Mm00504650_m1 EM Mod1 Mm00782380_s1

cMDH Mdh1 Mm00485106_m1 PGC-1� Ppargc1a Mm00447183_m1 HNF-4� Hnf4 Mm00433964_m1

PEPCK-C Pck1 Mm00440636_m1 OAS2 Oas2 Mm00460961_m1 18S 4342379-18S 4342379-18S �-2-m B2m Mm00437762_m1 Glut 2 Slc2a2 Mm00446224_m1 CPT1 Cpt1a Mm00550438_m1

PPAR� NULL Mm00803186_g1 PPAR� Pparg Mm00440945_m1

FAS Fasn Mm00662319_m1 SREBP-1c Srebf1 Mm00550338_m1

G6Pasa G6pc Mm00839363_m1 HmgCoA Sintasa Hmgcs2 Mm00550050_m1 Glutamina Sintasa Glul Mm00725701_s1

PPAR� Ppara Mm00440939_m1 LXR� Nr1h3 Mm00443454_m1

HNF3� Foxa3 Mm00484714_m1

Taula 17. Sondes TaqMan emprades en les qRT-PCR

- 187 -

Tècniques de Cultiu Cel·lular i Experiments in vitro

TÈCNIQUES DE CULTIU CEL·LULAR I EXPERIMENTS IN VITRO

Línies cel·lulars En els experiments in vitro es va fer servir la línia cel·lular d’hepatoma humà Huh7. Aquesta línia és altament glucolítica, amb una activitat gluconeogènica, i expressió de PEPCK-C pràcticament indetectables. A més, les cèl·lules Huh7 són permissives a l’hora de transfectar-les amb vectors catiònics i/o lipídics, fet que les converteix en una eina molt útil per a estudis de transferència gènica. Medi de cultiu: Dulbecco’s Modified Medium Glutamax (25 mM glucosa), (DMEM,GIBCO-BRL) suplementat amb 10% sèrum fetal boví (FBS, GIBCO-BRL), 2 mM glutamina, 100 U/ml penicilina i 100 μg/ml estreptomicina. Condicions de creixement: 37ºC en atmosfera al 10% CO2. Canviar el medi cada 2-3 dies.

Quan arriben a 100% de confluència, cal tripsinitzar-les i passar-les a una dilució 1:5-1:10.

Transfeccions Les transfeccions rutinàries es realitzaren amb PEI lineal 25 KDa (Aldrich, Cat# 40.872-7 ).

1. En el moment de la transfecció les cèl·lules han d’estar a un 60% de confluència. 2. Preparació del medi de transfecció:

25��l de NaCl 150 mM per �g de DNA

5 �l de PEI per ��g de DNA

Tub A- Diluir el DNA en el volum adequat de NaCl 150 mM, i vortejar suaument. Tub B- Diluir el PEI 5.47 mM en el volum adecuat de NaCl 150mM i vortejar suaument.

3. Afegir els contingut del tub B sobre el tub A i vortejar immediatament. És molt important no invertir l’ordre i ser el més sistemàtic possible en el procediment, per a evitar variabilitat inter-experimental, ja que la mida i eficiència dels complexos resultants dependrà molt de les condicions d’agitació i incubació posteriors.

4. Incubar 10 minuts a temperatura ambient.

- 188 -

Material i Mètodes

5. Fer dos rentats de les cèl·lules amb OPTI-MEM (Gibco-BRL), per tal d’eliminar el sèrum, ja que pot interferir en el procés de transfecció.

6. Posar OPTI-MEM de manera que el volum de transfecció sigui la meitat del de manteniment habitual.

7. Afegir la mescla de DNA/NaCl + PEI/NaCl a cada placa. 8. Agitar suaument la placa. 9. Incubar més o menys 4 hores (no més de 4 hores i mitja perquè si no la viabilitat de les

cèl·lules disminueix molt). 10. Un cop passat aquest temps, hi ha dues opcions:

- retirar el medi de transfecció i afegir 10 ml de DMEM (el qual conté sèrum). Deixar les plaques 48 hores a l’incubador.

- afegir directament els 10 ml de DMEM. Passades 24 hores canviar el medi: afegir 10 ml de DMEM i deixar les plaques 24 hores a l’incubador.

11. L’anàlisi corresponent es fa, normalment, passades 48 hores de la transfecció.

Obtenció d’hepatòcits de ratolí L’aïllament dels hepatòcits dels ratolins db/db ens va permetre estudiar la capacitat respiratòria dels hepatòcits intactes en presència o absència (parcial o total) de PEPCK-C, en sotmetre’ls a la tècnica de respirometria d’alta resolució. Alternativament, els hepatòcits aïllats es poden cultivar ex vivo per a estudiar altres processos metabòlics, ja que el cultiu primari d’hepatòcits manté gran part de les característiques bioquímiques que en l’animal tenien. La metodologia es basa en la perfusió del fetge amb una solució de colagenasa, que disgrega els hepatòcits. A continuació es descriu el procés seguit per a l’aïllament d’hepatòcits de ratolí:

1. Sistema de perfusió Per al circuit de perfusió es van utilitzar tubs translúcids de silicona TYGON 3350 Silicone(Masterflex, ref: 96420-14), una bomba peristàltica Miniplus 3 (GILSON) i un bany (Figura 78). Abans de començar, cal temperar els medis de pre-perfusió i perfusió, i regular que el flux i la temperatura del medi que surten per la cànula són els correctes. En el nostre sistema, vam ajustar el bany Maria a 50ºC i un flux de 7 ml/min.

- 189 -


BanyBomba

peristàltica

Flux

Ratolí

Cànula

Tub de silicona

Figura 78. Esquema del circuit de perfusió

2. El ratolí s’anestesia amb isofluorane-buprenorfina. 3. Es col·loca sobre la taula d’operacions i es ruixa l’abdomen amb etanol 70% per tal d’evitar

possibles infeccions. Es retira la pell de l’abdomen, es desinfecta la zona amb una solució iodada i es realitza una laparotomia. És important retirar tanta pell com sigui possible, sense danyar el diafragma, per a facilitar la manipulació, i evitar possibles contaminacions, en cas que es desitgi cultivar els hepatòcits a posteriori.

4. Es passa un fil de seda per sota la vena porta hepàtica i es deixa preparat per fer un nus. 5. S’inicia la circulació pel circuit amb medi de pre-perfusió i es procedeix a la canulació. Per a

facilitar la canulació es realitza una petita incisió amb unes tisores petites, de punta fina i recta i el flux es baixa a uns 2 ml/min. Ràpidament, es canula la vena porta hepàtica amb una cànula tipus Londwel de tefló de 22G i es tanca fent un doble nus amb força amb la lligadura que hem deixat prèviament preparada a la vena porta. Per a una perfusió òptima de tots els lòbuls hepàtics, és important no introduir la cànula massa a prop del fetge. Si l’extrem de la cànula està massa proper al fetge, només alguns lòbuls es perfondran correctament.

6. Si la canulació ha estat correcta, el fetge es comença a inflar. Immediatament (si el fetge s’infla massa o durant massa estona, provocarem dany i la viabilitat dels hepatòcits no serà adequada), es talla la vena cava inferior (just per sota dels ronyons), per a permetre la sortida del flux. Veurem que el tot fetge perd el seu color vermellós a agafa un to més groguenc.

7. S’ajusta el flux a 7 ml/min i es manté la circulació del medi de pre-perfusió durant uns 5 minuts (aproximadament 35 ml). El medi ha de sortir net de sang.

- 190 -

Material i Mètodes

8. Canviar a la solució de perfusió a la qual s’haurà addicionat Liberase Blendzyme (Roche) just abans de la perfusió. Liberase Blendzyme és una barreja de colagenasa i proteases neutrals que aporten una digestió suau i homogènia per a la dissociació dels teixits. Normalment es dissolen 35 mg de Liberase Blendzyme (0.23U/mg) en 100ml de solució de perfusió (aproximadament 0.08 U/ml). La perfusió es manté fins que el fetge té un aspecte brillant i esponjós, amb els lòbuls amb una forma arrodonida i es queda un petit solc en pressionar-los amb les pinces. El temps de perfusió sol ser al voltant dels 12-15 min, però pot variar segons l’activitat de la barreja Liberase Blendzyme i haurem d’aplicar el nostre criteri. Aturar el circuit quan es consideri que la perfusió està completada

9. S’extreu el fetge curosament, es posa sobre d’una placa de perti sobre gel i s’extreu la càpsula de Wilson.

10. Es disposa el fetge en un embut cobert d’una doble capa de gasa i es dispersa tirant-hi uns 35-50 ml de MEM sense Ca++ (GIBCO) pre-refredat en gel. Es recull l’eluït en un tub de plàstic estèril tipus Falcon submergit en gel.

11. Es centrifuga a 50 g durant 2 minuts i es descarta el sobrenedant. Es resuspèn en 35 ml de MEM sense Ca++ i es repeteix el procés quatre vegades.

12. Es resuspenen els hepatòcits en 15 ml de medi d’assaig. 13. Finalment, cal comprovar la viabilitat mitjançant la tinció amb blau de tripà: es fa una dilució

1:1 entre l’estoc de blau de tripà 0,4 % en NaCl i els hepatòcits, s’aplica una gota d’aquesta barreja a la cambra de Neubauer i s’observa immediatament sota el microscopi. Habitualment, la viabilitat obtinguda seguint aquest protocol oscil·la el 80%.

Medi de pre-perfusió Medi de perfusió

Hank’s BSS (Sigma) 9.5 g/l Hank’s BSS (Sigma) 9.5 g/l HEPES 2.38 g/l HEPES 2.38 g/l EGTA 0.19 g/l CaCl2 0.41 g/l

NaHCO3 0.35 g/l NaHCO3 0.35 g/l Ajustar el pH a 7.2 i esterilitzar per filtració. Emmagatzemar a 4ºC

Respirometria d’alta resolució La mesura polarogràfica del consum d’oxigen dels hepatòcits aïllats de ratolí s’ha dut a terme a 37ºC amb un elèctrode d’oxigen d’alta resolució del tipus Oxygraph (Oroboros, Austria) amb l’agitació fixada a 750 rpm. L’oxigen dissolt al medi d’incubació difon a través d‘una membrana de tefló i es redueix en posar-se en contacte amb l’elèctrode de platí polaritzat a 0,6 V, generant-se un corrent

- 191 -


elèctric proporcional a l’activitat d’oxigen de la solució. El protocol complert es va finalitzar en un període de 50-60 minuts. Les mesures de concentració i consum d’oxigen es van emmagatzemant a intervals de 2 segons utilitzant un sistema d’adquisició de dades informatitzat (Datlab, Austria).

Medi gluconeogènic de respirometria F-12 Coon’s modification (SIGMA)

20 mM HEPE 20 mM lactat

2 mM glutamina 1 mM octanoat conjugat amb 0,5% BSA

S’ha utilitzat un medi de respirometria glucconeogènic, que conté substrats gluconeogènics (lactat i

piruvat) i de �-oxidació (octanoat). Abans de començar les mesures, cal equilibrar el medi de

respirometria amb aire a 37°C i agitació a 750 rpm, fins que s’obté una senyal estable per a la calibració en condicions saturants d’aire. A partir d’aquest moment es pot introduir la mostra i començar les mesures. En el nostre cas, es van resuspendre 50000 hepatòcits en un volum final de 2 ml de medi de respirometria. Les mesures dels diferents estats de la cadena de transport d’electrons es van realitzar afegint, mitjançant la punció amb una xeringa Gilson, diferents drogues de manera successiva tal i com es detalla a continuació:

� Rutina: respiració basal en medi de respirometria.

� Respiració desacoblada: respiració en presència d’oligomicina 1 μg/ml. L’oligomicina inhibeix la ATP sinatasa.

� Respiració totalment desacoblada: s’inicia amb l’addició del desacoblador FCCP (carbonil cianida p-trifluorometoxifenil-hidrazona) 1 μM.

� Aturada de la respiració: s’aconsegueix amb l’addició de 5 μM antimicina A.

� COX: finalment, l’activitat citocrom c oxidasa (COX) (JCOX) es va mesurar en presència de

2mM ascorbat/500�M TMPD. L’activitat COX es va fer servir com a normalitzador intern de

les mesures anteriors de respiració. A partir d’aquestes dades crues es van calcular els índex respiratoris (227) que es detallen a continuació:

� Relació de control respiratori (RCR): és un indicador de la quantitat de respiració desacoblada i es calcula fent el quocient entre la respiració totalment desacoblada (FCCP) i la respiració en presència d’oligomicina.

- 192 -

Material i Mètodes

� Relació de control desacoblat (UCR): és una estimació de la capacitat respiratòria de reserva que es calcula com el quocient entre FCCP i RUTINA.

� Relació de control de la fosforilació respiratòria (RCRP): ens indica la proporció de capacitat respiratòria aplicada a la síntesi d’ATP, i es calcula com a la diferència entre la respiració amb oligomicina i la respiració rutina i dividint per la respiració FCCP.

- 193 -

Anàlisi de les Proteïnes

ANÀLISI DE LES PROTEÏNES

Preparació d’homogenats Per a la obtenció d’extractes per a la posterior mesura de l’activitat enzimàtica és necessari obtenir homogenats en condicions no desnaturalitzants, en que els tampons utilitzats preservin la integritat dels enzims i mantinguin unes condicions fisiològiques. En aquest cas, els tampons a utilitzar són els adequats per a l’activitat enzimàtica que es vulgui analitzar a posteriori. Quan l’objectiu ha estat detectar l’anàlisi del contingut proteic (inclosa la detecció de fosforilacions, per Western blot), S’ha obtingut homogenats en condicions desnaturalitzants utilitzant un tampó RIPA (que conté inhibidors de fosfatases) suplementat amb inhibidors de proteases a una concentració final 1X, seguint el mateix protocol que per als extractes no desnaturalitzants.

RIPA Inhibidors de proteases (100X) Altres inhibidors (100X) 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 100 �g/ml Pepstatina 100 mM PMSF

1% tritó X100 100 �g/ml Aprotinina 1 mM Na3VO4 100 �g/ml Leupeptina 50 mM NaF 100 �g/ml Benzamidina 5 mM EDTA

40 mM��-glicerofosfat 100 mM NaCl

Obtenció d’homogenats totals a partir de cèl·lules en cultiu

1. Disposar les plaques en gel, aspirar el medi i realitzar dos rentats amb PBS 1X pre-refredat

2. Afegir el volum desitjat de tampó d’homogeneïtzació (uns 300 �l per a una placa de 10 cm

de diàmetre). 3. Lisar les cèl·lules realitzant tres cicles de congelació-descongelació. 4. Centrifugar a 10000 g durant 20 minuts i a 4ºC. 5. Recuperar el sobrenedant (fracció soluble).

Obtenció d’homogenats totals a partir de teixit

1. Els teixits (fetges, ronyons, músculs o teixit adipós) un cop realitzada la necròpsia, es mantenen a –80ºC. Es recullen mostres, que fins al moment de l’homogeneïtització es mantenen submergides en N2 líquid.

- 194 -

Material i Mètodes

2. Es pesen els teixits (evitant que es descongelin) i s’apunta els mg que fa cada peça. Habitualment s’agafen peces d’entre 50 i 100 mg.

3. Homogeneïtzació en 9 volums de tampó d’homogeneïtzació pre-refredat. La composició del tampó homogeneïtzació variarà segons l’assaig que es vulgui realitzar. És molt important mantenir les mostres fredes en tot moment submergint el tub en gel per a preservar l’activitat enzimàtica. Depenent de la consistència del teixit la homogeneïtzació s’han aplicat diferents metodologies:

o En teixits tous (teixit adipós i fetge): les mostres s’han homogeneïtzat en un Potter(Bayer), aplicant 10 polsos a 1500 rpm.

o Els teixits més fibrosos (múscul i ronyó): cal un mètode més agressiu, com és el politró. En aquest estudi s’ha utilitzat un Polytron PT3000 (Kinematica). Es realitzen tres pols de 10000 rpm durant 10’’aproximadament.

4. Centrifugar a 20000 g durant 15 minuts a 4ºC. 5. Recuperar el sobrenedant (fracció soluble).

Obtenció de la fracció nuclear a partir de teixit congelat

Per a la immunodetecció d’alguns factors de transcripció (com PGC-1�) en fetge s’ha obtingut la

fracció nuclear a partir dels extractes en tampó RIPA seguint els següents passos: 1. Es recupera el pellet de la centrifugació en el protocol d’obtenció d’extractes totals (punt 4) i

es resuspèn en tampó hipertònic, per a lisar els nuclis. 2. Es vorteja i es deixa incubar en gel durant 30 minuts. 3. Es centrifugar a 20000 g durant 15 minuts a 4ºC. 4. Es recupera el sobrenedant (fracció nuclear).

Separació de la fracció citosòlica i membranosa de fetge

Per a l’estimació de l’activació de PKC� al fetge per l’acumulació de lípids es va quantificar la translocació del citosol a la membrana plasmàtica. Per a tal fi, es va immunodetectar PKC� a la fracció citosòlica i membranosa. Ambdues fraccions es van separar seguint els següents passos, a partir dels homogenats de fetge en tampó RIPA (punt 3 del protocol d’obtenció d’homogenats totals a partir de teixit):

1. Els homogenats es centrifuguen a 800 g durant 10 minuts. 2. Es recupera el sobrenedant i es sotmet a una ultracentrifugació de 100000 g durant 1 hora

a 4ºC.

- 195 -


3. Es separen el sobrenedant (fracció citosòlica) i el pellet (fracció nuclear). Valoració de la concentració de proteïna als homogenats

Cal tenir un patró de BSA amb el mateix tampó en el que es tenen les mostres (d’entre 0 i 5 �g/�l,

per a estar dins del rang e linealitat del mètode), que es pot guardar a -20ºC i reutilitzar. De manera generalitzada, quan el tampó conté SDS, el mètode d’elecció és el BCA, mentre que si conté agents reductors, resulta més convenient el mètode Bradford.

Mètode BCA

El reactiu de BCA es prepara al moment, barrejant les solucions A i B segons la raó 50:1. 1. En una placa ELISA de 96 pouets, es possa a cada pouet, per triplicat:

3 �l de patró de BSA + 200 �l BCA

3 �l de mostra + 200 �l BCA

2. S’incuba a 37ºC durant 30-120 minuts i es realitza la lectura de l’absorvància a 550 nm.

Mètode Bradford

El reactiu de Bradford s’utilitza diluit 1:5 en aigua. 1. En una placa ELISA, de 96 pouets, es possa en cada pouet, per triplicat:

2 �l de patró de BSA + 200 �l Bradford

2 �l de mostra + 200 �l Bradford

2. Es deixa la placa a temperatura ambient de 5 a 10 minuts i es realitza la lectura de

l’absorvància a 620 nm.

Anàlisi de proteïnes per Western Blot

1. Preparació de les mostres

Tampó de càrrega 4X Tris-HCl 200 mM pH:6.8

40% glicerol 8% SDS

20% �-mercaptoetanol 0.8% Blau de bromofenol

- 196 -

Material i Mètodes

El contingut proteic dels extractes es quantifica i iguala en quantitat de proteïna i volum final, es tracta en condicions reductores i desnaturalitzants amb el tampó de càrrega a una concentració final1X i s’escalfa a 95ºC 5 minuts.

2. Separació de proteïnes per SDS-PAGES’ha utilitzat el kit Mini Protean III (Bio-Rad).

Tampó d’electroforesi Tris 30.3 g/L

Glicina 144 g/L SDS 20% 50 ml

pH 8.3 Gel separador: el gel separador es prepara a un percentatge d’acrilamida:bisacrilamida (acrilamida:biasacrilamida 37.5:1, Bio-Rad) que oscil·la entre un 8 i 12%. A major mida de la proteïna a analitzar es requereix menor concentració d’acrilamida:disacrilamida per a aconseguir una bona separació. Depenent de la proteïna a detectar i les condicions experimentals, s’han carregat entre 10

i 50 �g de proteïna. Un cop carregades les mostres en els pouets del gel concentrador es duu a

terme l’electroforesi a 130 V durant aproximadament 90 minuts o fins que el front de Blau de Bromofenol surt del gel.

3. ElectrotransferènciaS’ha utilitzat membranes de PVDF (Immobilon-P, Millipore, Bedford, MA). La transferència s’ha dut a terme de forma general a 400 mA durant 90 minuts, o durant la nit a 15 V (14-16 hores) en tampó de transferència 1X amb un 10% de metanol.

Tampó de transferència 10X Tampó transferència 10X:

Tris 30.3 g/L Glicina 144 g/L

En qualsevol cas, sempre a la cambra freda i en agitació per a evitar escalfaments de les membranes que puguin danyar les proteïnes.

- 197 -


4. ImmunodeteccióBloquejar la membrana amb TBS-T 1X 5% llet desnatada una hora a temperatura ambient. El percentatge de Tween 20 que s’ha utilitzat en aquesta tesi, ha variat entre el 0.05% (menys astringent) i el 0.5% (més astringent), en funció l’afinitat i/o especificitat de l’anticòs a utilitzar. Incubar les membranes amb la dilució adequada d’anticòs (en una solució de TBS-T 5% llet o BSA 0.05% Azida sòdica) (Taula 18) durant dues hores a temperatura ambient o bé durant la nit (o durant el cap de setmana) a 4ºC. La solució d’anticòs primari es recicla mentre sigui funcional. Rentar les membranes amb un volum petit de TBS-T 1X. Es fa un rentat ràpid i tres de 10 minuts en agitació. Incubar les membranes amb anticòs secundari diluït en TBS-T (1/5000-1/20000) durant una hora a temperatura ambient. Aquest anticòs detecta IgG de l’espècie en que s’ha generat el primari. Rentar les membranes amb un volum petit de TBS-T 1X. Es fa un rentat ràpid i tres de 10 minuts en agitació. Es fa un rentat final de TBS durant 10 minuts.

TBS 20X Tris-HCl 200 mM

NaCl 3 M pH 7.4

Revel·lat L’anticòs secundari està conjugat a l’enzim peroxidasa de rave (HRP), que permet visualitzar les bandes corresponents a les proteïnes que el primari reconeix gràcies a la generació d’ un producte quimioluminiscent quan s’incuba durant un minut amb una barreja 1:1 dels reactius de ECL Western Blotting Detection Reagents, (Amersham Biosciences). El revelat es duu a terme contactant les membranes amb pel·lícules fotogràfiques (CurixRP2, Agfa) durant un temps variable i utilitzant líquids tradicionals de revelat i fixat. Alternativament, es realitza revelat digital en un equip d’imatge FujifilmLAS 3000 Intelligent Dark Box IV. DensitometriaL’estimació quantitativa de les proteïnes es realitza per anàlisi densitomètric dels films mitjançant el programa Quantiy One, quan el revelat s’ha dut a terme en pel·lícules fotogràfiques, o a través del programa Multi Gauge, en el cas de revelat es digital. Els resultats són sempre expressats com a unitats arbitràries (relació entre la intensitat ajustada de la banda de la proteïna en estudi i de la proteïna normalitzadora).

- 198 -

Material i Mètodes

Dilució Origen Mida (kDa) Proveïdor

ACC 1/2000 C 257 (�)/280(�) Upstate ACC-P Ser-79 1/2000 C 257 Upstate AKT 1/400 Ca 60 Sta. Cruzº AKT-P Ser 473 1/1000 C 60 Cell Signalling AKT-P Thr 308 1/1000 C 60 Cell Signalling AMPK � 1/1000 C 62 Cell Signalling AMPK-P Thr 172 1/1000 C 62 Cell Signalling Chrebp 1/1000 C 95 Novus Biologicals EGFR 1/1000 C 175 Dr. Jose Luis Rosa eIF2� 1/1000 C 40 Cell Signalling eIF2�-P Ser 52 1/1000 C 40 Calbiochem FAS (C-20) 1/500 Ca 272 Sta. Cruz FOXO1 1/250 C 82 Sta. Cruz FOXO1-P Ser 256 1/250 C 82 Cell Signalling GK (H-88) 1/500 C 52 Sta. Cruz L-PK 1/1000 C 60 Dr. Ramon Bartrons MAPK (p42) 1/100 C 42 Dr. Francesc Viñals PEPCK-C 1/20000 O 69 Dr. DarylGranner PGC-1� 1/250 C 91 Cell Signalling PKC� (C-15) 1/500 C 82 Sta. Cruz Sirt-1 1/1000 C 110 Upstate SOD-1 1/1000 R 37 Novacastra SOD-2 1/1000 C 20 Dr. Isidre Ferrer SREBP1 (H-160) 1/1000 C 125/68 Sta. Cruz �-tubulina 1/4000 R 50 Sigma �-tubulina 1/10000 R 48 Sigma VDAC 1/1000 R 32 Dra. Aurora Pujol

Taula 18. Anticossos primaris utilitzats. C=,conill; Ca,Cabra; O, ovella; R=,ratolí;.

- 199 -


TÈCNIQUES HISTOLÒGIQUES

Preparació de mostres histològiques En aquest treball s’han aplicat dues tècniques diferents per a obtenir seccions per a realitzar les tècniques d’histologia. La primera, basada en la perfusió de l’animal amb una solució fixadora per a la

poterior obtenció de seccions de 50 �m en un vibràtom. La segona, basada en la fixació del teixit ex

vivo, per a la obtenció de crioseccions de 7 �m. A continuació es detallen ambdós procediments:

Obtenció de seccions de 50 ��m Per a la doble visualització de GFP i PEPCK-C en els fetges dels ratolins injectats amb la

transferència gènica hidrodinàmica es van obtenir seccions de 50 �m tal i com es detalla a

continuació: 1. Els ratolins s’anestesien amb ketamina:xilacina. 2. Es realitza la laparotomia i s’exposa el tòrax. 3. Es perfon el ratolí amb una solució de PBS 1X Heparina 0,05% mitjançant la punció del

ventricle esquerre amb una agulla epicranial (palometa) 25G connectada a un sistema d’infusió. El flux es controla mitjançant una clau de pas. De seguida que veiem que hi ha flux, es perfora l’aurícula dreta.

4. Seguidament, es fa una segona perfusió amb uns 20 ml de PBS 1X, 4% paraformaldehid. 5. Per a completar la fixació dels teixits, es deixen peces de fetge i ronyó durant tota la nit a

4ºC en PBS 1X- 4% paraformaldehid. 6. A partir de les peces de teixit fixades en PBS-4% paraformaldehid es tallen seccions de 50

�m en un vibràtom (Leica VT 1000).

7. Les seccions es submergeixen en solució de criopreservació (34.5% glicerol, 30% etilenglicol, en PBS 1X) i es tenen durant 1 hora (perquè s’impregnin bé) abans de guardar-les a -20ºC.

Obtenció de crioseccions de 7 �m La immunohistoquímica de PEPCK-C i la tinció de lípids en els ratolins db/db infectats amb

adenovirus recombinants es va realitzar sobre crioseccions de 7 �m, que van ser obtingudes tal com

es detalla a continuació:

- 200 -

Material i Mètodes

1. En la necròpsia, es pren una porció del tercer lòbul hepàtic (Figura 80) i es submergeix en una solució del 4% PFA en PBS durant, almenys, 24 hores per a la seva fixació completa.

2. La peça s’equilibra en una solució 30% sacarosa en PBS 1X durant una nit a 4ºC. 3. S’inclou la peça en motlles Cryomold amb Tissue-Tek OCTTM compound (Sakura) i es

congela per flotació sobre una placa petri en un bany de N2 líquid.

4. Els motlles es guarden a -80ºC fins a la obtenció de seccions de 7�m en un criostat.

5. Les crioseccions s’emmagatzemen a -20ºC. Immunohistoquímica de PEPCK-C

Quan es parteix de les seccions de 50 �m les incubacions es realitzen en plaques TPP de 24 pouets

en un volum final de 300 �l. Quan es parteix de crioseccions, les incubacions es realitzen

directament sobre el porta-objectes. 1. Es recuperen les seccions -20ºC. Si es tracta de crioseccions en porta-objectes es deixen

assecar bé (una hora o més) per a que s’hi adhereixin bé. Es fa un rentat ràpid i dos rentats de 20 minuts en PBS 1X.

2. Bloqueig impermeabilització: incubar 2 hores en PBS 1X, 0.3% Tritó X-100, 20% FCS. 3. Incubació amb l’anticòs primari anti-PEPCK-C 1/10000 en PBS 1X, 1% Tritó X-100, 1%

FCS durant 48 hores a 4ºC en agitació lenta. A més, es duen es paral·lel dos controls negatius: un en el que en els que no hi incubem anticòs i un altre en el que hi posem una dilució equivalent de sèrum d’ovella (animal en el que s’ha produït el anticòs contra PEPCK).

4. Quatre rentats de 10 minuts amb PBS 1X a temperatura ambient. 5. Incubació amb l’anticòs secundari: IgG anti-ovella conjugat a Alexa Fluor 456 (Molecular

Probes) a una dilució 1/200 en PBS 1X, 1% Tritó X-100, 1% FCS durant dues hores a 4ºC a baixa agitació. Aquest punt, i els propers s’han de fer protegint la mostra de la llum en tot moment per tal de preservar la fluorescència.

6. Quatre rentats de 10 minuts amb PBS 1X a 4ºC. 7. Muntatge: s’utilitza Mowiol com a medi de muntatge. L’òptim de fluorescència s’obté entre

12 i 24 hores després del muntatge. 8. Les preparacions es van analitzar per microscopia confocal als Serveis Científico-Tècnics

de la Unitat de Biologia del Campus de Bellvitge, Universitat de Barcelona. S’analitzaren

- 201 -


cinc camps escollits de manera aleatòria d’augment 200X per cada secció en un microscopi confocal.

Tinció de lípids Els lípids es van visualitzar mitjançat el mètode d’Oil red. Aquest mètode tenyeix lípids neutres, permetent visualitzar tant triacilglicèrids com àcids grassos. La detecció de lípids amb Oil red s’ha

realitzat sobre les crioseccions de 7 �m seguint el següent protocol:

1. Es recuperen les seccions -20ºC, es deixen assecar bé (una hora o més) i es renten PBS 1X.

2. Es fan dos rentats de 10 minuts en H2Od. 3. Es fa una immersió en isopropanol 60%. 4. S’incuba en la solució de treball Oil red (0.3% Oil red en 60% isopropanol) durant 20 minuts

a temperatura ambient. 5. Es diferencia per immersió en isopropanol 60%. 6. Seguidament, es fan dos rentats amb H2Od de 20 minuts a temperatura ambient. 7. Es contrasten els nuclis tenyint durant 5 minuts amb hematoxilina a tempratura ambient. 8. Es renta sota el corrent d’aigua de l’aixeta durant 10 minuts. 9. Les mostres en monten en Mowiol. 10. Les mostres s’observen en un microscopi de camp clar.

- 202 -

Material i Mètodes

DETERMINACIONS BIOQUÍMIQUES

Activitat PEPCK La mesura de l’activitat PEPCK en cèl·lules en cultiu o en teixit hepàtic es va realitzar mitjançant una reacció acoblada a la malat deshidrogenasa (Figura 79), segons ha descrit prèviament Petrescu et a.l (258).

MalatOAAPEP

GDP + Pi GTP NADH NAD+ + H+

PEPCK-C MDH

CO2 Figura 79. Reaccions acoblades a l’assaig d’activitat PEPCK.

1. Es preparen homogenats totals de fetge en tampó d’homogeneïtzació PEPCK (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 2.5 mM DTT, 0.1% Tritó X100).

2. Es preparen dos sets de tampó de reacció; un contenint NaHCO3 (+NaHCO3, que es gasejarà) i l’altre sense (-NaHCO3, que no es gasejarà). El primer tampó servirà per la mesura de l’activitat PEPCK més altres reaccions inespecífiques. El segon es una mesura de les reaccions inespecífiques. Els tampons de reacció es preparen seguiint l’ordre descrit a la taula següent:

Tampó de reacció Comentaris Tris – HCl 50mM

NaHCO3 20mM En un set de reaccions no s’afegeix

MnCl2 1mM Gasejar amb CO2 durant dos minuts (només en el set que conté NaHCO3)

Rotenona 2ug/cubeta Inhibeix la NADH deshidrogenasa PEP 0,5mM Preparar fresc

NADH 0,1mM Preparar fresc MDH 2IU/cubeta

3. Es prepara el set de cubetes amb: 25 �l de l´homogenat + 965 �l de tampó de reacció

(Vf=990 �l).

- 203 -


4. S’inicia la reacció enzimàtica, afegint 10 �l dGDP (stock 0.2 mM guardat a -20ºC),

completant un Vf=1 ml, a 25ºC

5. Immediatament s’inicia la lectura a 340 nm durant 5 min cada 10 segons en un

espectrofotòmetre DU 800 Beckman Coulter. Si hi ha activitat PEPCK detectable es perfila una pendent negativa, degut a la desaparició de NADH.

6. Per a calcular l’activitat PEPCK de cada mostra es resta la pendent de la reacció en el tampó -NaHCO3 a la pendent obtinguda en el tampó +NaHCO3. L’activitat específica

(mU/mg prot) es calcula a partir del coeficient d’extinció molar () del NADH (6,22

cm2/�mol) i corregint pel contingut proteic de l’extracte.

Activitat caspasa 3 Les caspases són cistein-proteasses que poden ser activades per proteòlisi. Alguns dels membres de la família de les caspases estan implicades en apoptosi. La caspasa 3 és una proteïna efectora implicada en les fases tardanes de l’apoptosi. La seva activació per proteòlisi per altres caspases iniciadores li confereix, al seu temps, activitat proteolítica per a actuar sobre diferents substrats cel·lulars. Per a la determinació de l’activitat caspasa 3 en teixit hepàtic les mostres s’homogeneïtzen en tampó d’homogeneïtzació per caspasa 3 seguint el protocol descrit anteriorment. L’activitat caspasa 3 es llavors determinada en el sobrenedant utilitzant el substrat fluorogènic de caspasa-3 Ac-DEVD-AMC seguint els següents passos:

1. Es quantifica el contingut proteïc de la mostra per BCA (Pierce).

2. Es dilueixen les mostres en tampó de reacció caspasa-3 per tal de tenir 20 �g en 25 �l.

3. Reacció: 20 �g mostra

2 �l de substrat Ac-DEVD-AMC resuspès en DMSO 1mg/ml

123 �l tampó de reacció 1X

S’incuba a 37ºC dues hores protegit de la llum. 4. L’alliberament de AMC (fluorocrom) degut a la proteòlisi per caspasa 3 es mesura en un

fluorímetre de microplaques (Bio-Tek, Winooski, VT) a una d’excitació de 380 nm i

d’emissió de 440 nm. 5. Es defineix una unitat d’activitat caspasa 3 com a la quantitat d’enzim actiu necessari per a

produir l’increment d’una unitat arbitrària de luminiscència en dues hores de reacció.

- 204 -

Material i Mètodes

Tampó d’homogeneïtzació caspasa 3 Tampó de reacció caspasa 3

Tris-HCl 5 mM pH 8 20 mM HEPES pH 7.5) 20 mM EDTA 10% glicerol

0.5% Tritó X-100 2 mM DTT Determinació de paràmetres sèrics

Determinació de glucosa Els nivells de glucosa sèrics es determinen a partir d'una gota de sang dels ratolins obtinguda de l’extrem de la cua. Es va fer servir el sistema Glucocard Memory 2 (Menarini).

Determinació d’insulina La insulina en sèrum es determinà per ELISA (Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA, Bender

MedSystems) seguint les indicacions del fabricant. S’utilitzen 5��l per a animals sans i diabètics tipus

II (db/db) i 25 �l per a animals diabetis experimental induïda amb STZ.

Determinació de Glutamat Piruvat Ttransaminasa (GPT) E.C. 2.6.1.2. sèrica

La Glutamat Piruvat Ttransaminasa (GPT) és un enzim hepàtic. En situacions de dany hepàtic l’enzim és alliberat al corrent sanguini, augmentant-te les concentracions. La mesura d’aquest enzim és, de fet, utilitzada en el diagnòstic de determinades malalties hepàtiques com hepatitis o cirrosi. La mesura dels nivells de GPT en els sèrums dels ratolins es va fer utilitzant les tires reactives de l’autoanalitzador Reflotron®. S’hi va aplicar una dilució 1/8 del sèrum en PBS1X.

Determinació d’àcids grassos no esterificats (AGL), Triglicèrids (TAG), ��-

Hidroxibutirat (�-HBA), colesterol i lactat. Aquestes mesures van ser fetes al servei de Bioquímica Clínica Veterinària de la facultat de Veterinària de la Universitat Autònoma de Barcelona utilitzant un autoanalitzador COBAS-MIRA.

Determinació del colesterol HDL La mesura dels nivells del colesterol HDL en els sèrums dels ratolins es va fer utilitzant les tires reactives de l’autoanalitzador Reflotron®. S’hi va aplicar una dilució 1/8 del sèrum en PBS1X.

- 205 -


Determinació de metabòlits hepàtics

Glicogen Els dipòsits hepàtics de glicogen es van quantificar seguint un mètode basat en la precipitació bàsica del glicogen, seguida de una hidròlisi àcida per a, finalment quantificar la glucosa alliberada. El procediment es el següent:

1. Es pren una peça de fetge de -80ºC d’entre 50 i 60 mg, es pesa i s’anota el pes exacte. Durant aquest procés, per a evitar la descongelació, les peces es mantenen en Eppendorf submergits en N2 líquid.

2. Es posa en un tub tipus Falcon de 15 ml 0.5 ml de 30% KOH i hi tirem la peça. 3. Es bull (bany Maria) durant 1 o 2 hores. Aquesta extracció alcalina ens permet separar el

glicogen de la glucosa exògena en el posterior pas de precipitació amb etanol. 4. Deixar atemperar.

5. Afegir 5 ml d’etanol 100% i seguidament 10 �l de LiCl 4M.

6. Vortejar i deixar precipitar durant la nit a 4ºC. 7. Centrifugar 30 minuts a 3000 g. Descartar el sobrenedant. Al precipitat es troba el glicogen. 8. Resuspendre 0.5 ml de HCl 4M. 9. Bullir les mostres entre 30 i 90 minuts per a resolubilitzar. 10. Deixar atemperar i neutralitzar amb 0.5 ml de K2CO3 4M. Es comprova que el pH estigui

entre 6.5 i 7.5 amb tires indicadores. 11. La concentració de glucosa alliberada per la hidròlisi àcida es mesura fent servir un kit de

mesura de glucosa (Sigma) basat en l’acoblament de les següents reaccions enzimàtiques: Glucosa + H2O + O2 Acid Glucònic + H2O2

H2O2 + O-Dianosina O-Dianosina oxidada (incolor) (marró)

La intensitat de la coloració es mesura a 492 nm en un lector de plaques ELISA SLT 340 ATC i és

proporcional a la concentració de glucosa. TAG i àcids grassos hepàtics

El contingut de triglicèrids en fetge es quantificat seguint un procediment basat en el mètode de saponificació hepàtica de Salmon i Flatt (259) segons el següent protocol:

- 206 -

Material i Mètodes

1. Es pesen peces de fetge (conservat a -80ºC) de 100-200 mg i s’anota el pes. Durant aquest procés, per a evitar la descongelació, les peces es mantenen en tubs tipus Eppendorf submergits en N2 líquid.

2. S’afegeix el mateix volum (mg/�l) de 3M KOH (en 65% etanol) i es vorteja vigorosament per

a assegurar que tota la peça queda ben impregnada i al fons del tub Eppendorf. 3. S’inicia la digestió bàsica incubant a 70ºC durant una hora i continuar-la deixant les mostres

a temperatura ambient durant la nit en agitació, vortejant periòdicament. 4. L’endemà, diluir les mostres de manera que la concentració final sigui 100 mg de teixit en

500 ml de Tris-HCl 50 mM. Per a això utilitzem un estoc 2M de Tris-HCl. 5. Finalment, es mesura:

a. La concentració de TAG en l’homogenat, utilitzant el kit Triglyceride (GPO-Trinder) de Sigma, basat en una sèrie de reaccions acoblades: digenstió dels TAG per la lipoproteina lipasa seguida de successives digestions catalitzades per la glicerol quinasa (GliK), glicerol fosfat oxidasa (GPO) i peroxidasa (POD). El producte final és un cromòfor, que es pot quantificar espectrofotomètricament. La

intensitat de la coloració es mesura a� 550 nm en un lector de plaques ELISA

SLT 340 ATC i és proporcional a la concentració de TAG. b. La concentració d’àcids grassos lliures en l’homogenat, utilitzant el kit NEFA C

ACS-ACOD Method (Wako), assumint que detectarem tant àcids grassos lliures com provinents del TAG. Per tant, per cada mol de TAG hi haurà un mol d’àcids grassos associats, que es resta a la quantitat total d’àcids grassos hepàtics detectats.

Nucleòtids intracel·lulars (ATP, ADP, AMP)

La quantificació dels nucleòtids intrahepàtics es va realitzar per HPLC a les instal·lacions dels Serveis Científico-Tècnics del Campus de Pedralbes, Universitat de Barcelona, seguint el protocol següent:

1. S’obtenen homogenats hepàtics en 10% HClO4. Tot el procés es duu a terme en fred.

2. Es neutralitzen els extractes amb K2CO3 5M.

3. Els extractes es clarifiquen en columnes Ultra Free-MC NMWL 10000 (Millipore), centrifugant a 12000 g durant 30 minuts a 4ºC.

4. Les mostres es guarden a -80ºC fins a l’anàlisi.

- 207 -


5. L’anàlisi dels nucleòtids es va realitzar injectant 40 �l demostra en una columna d’intercanvi

iònic Whatman Partisil 10-SAX i aplicant un gradient lineal de NH4H2PO4 5 mM, pH 2,5 (tampó A) i NH4H2PO4 500 mM, pH 3,9 (tampó B). El gradient es va realitzar de 0% a 100% de tampó B, desenvolupant-se durant un període de 40 minuts a un flux de 1 ml/min. Acil-CoA de cadena curta

El contingut hepàtic d’acilsCoA de cadena curta (acetil-CoA, malonil-CoA, propionil-CoA, succinil-CoA) es va analitzar per HPLC a les instal·lacions dels Serveis Científico-Tècnics del Campus de Pedralbes, Universitat de Barcelona, tal i com està descrit a la bibliografia (260). La obtenció dels extractes es descriu a continuació:

1. S’obtenen homogenats hepàtics en 5% àcid sulfosalicílic amb 50 mM DTE. Tot el procés es duu a terme en fred.

2. Els homogenats es centrifuguen a 600 g durant 10 minuts a 4ºC. Es recull el sobrenedant. 3. Les mostres es guarden a -80ºC fins a l’anàlisi.

4. L’anàlisi dels nucleòtids es va realitzar injectant 80 �l demostra en una columna d’intercanvi

iònic ODS Hipersil (C18) i aplicant un gradient lineal de NaH2PO4 100 mM: 75 mM acetat sòdic, pH 4,6 (tampó A) i 70% tampó A en metanol (tampó B). El gradient es va realitzar de 0% a 100% de tampó B, desenvolupant-se durant un període de 20 minuts a un flux de 1,5 ml/min.

- 208 -

Material i Mètodes

MODELS ANIMALS I EXPERIMENTS IN VIVO

Models animals En tots els experiments amb animals, aquests han estat adquirits de Harlan Interfarma IBERICA. Els animals han estat mantinguts a les instal·lacions de l’estabulari del Campus de Bellvitge, Universitat de Barcelona. Els ratolins han estat estabulats seguint un cicle de 12 hores de llum-foscor a una temperatura constant de 22ºC i alimentats amb una dieta estàndard murina (Harlan Global Diet 2014), amb accés lliure al menjar i l’aigua excepte que protocol experimental requerís dejuni. En tal cas, el pinso era retirat, deixant lliure accés a l’aigua. Tots els protocols aplicats han estat prèviament aprovats pel Comitè Ètic d’Experimentació Animal de la Universitat de Barcelona (C.E.E.A.). Els animals utilitzats en els estudis realitzats són:

� Mus musculus, soca ICR (CD1): mascles d’edat compresa entre 4 i 5 setmanes.

� Mus musculus, soca mutant C57BKS.Cg-+Leprdb/+LeprdbOlaHsd (db/db): mascles d’edat compresa entre 6 i 8 setmanes.

Model de diabetis tipus I: inducció de diabetis experimental mitjançant estreptozotocina

L’estreptozotocina (STZ) és una molècula constituïda per N-metil-N-nitrosurea unida al C-2 de la D-glucosa. És un tòxic que actua majoritàriament sobre la cèl·lula beta pancreàtica productora d’insulina, la qual destrueix. Per a la inducció de la diabetis experimental, ratolins de la soca ICR (CD1) d’entre 22 i 25 g de pes van ser administrats, alimentats ad libitum, amb una única injecció intraperitonial de STZ a una dosi de 200 mg/Kg de pes corporal. Aquests ratolins els anomenarem ICR(CD1)STZ+. La STZ es dissol en una solució de tampó cítric:citrat sòdic 100 mM pH 4.5, immediatament abans de la seva administració, ja que és extremadament làbil (es degrada en 15-20 minuts un cop resuspesa en el tampó). Un cop realitzada la injecció, els animals es deixen en les condicions de manteniment estàndard. Una setmana després, es verifica la inducció de la diabetis mesurant la glucèmia després de 6 hores de dejú (començant entre les 8 i les 9 del matí). Només es van considerar diabètics, i inclosos a l’estudi, aquells ratolins que presenten glucèmies � 400mg/dl en dejú.

- 209 -

Models Animals i Experiments in vivo

Model de diabetis tipus II: ratolí db/db Els ratolins mutants de la soca C57BKS.Cg-+Leprdb/+Leprdb OlaHsd (db/db) contenen una mutació espontània recessiva al receptor de la leptina (Leprdb). Els homozigots desenvolupen polifàgia, polidípsia i poliúria i obesitat a partir de les tres o quatre setmanes de vida. A més, manifesten hiperinsulinèmia a partir de les dues setmanes de vida i hiperglucèmia, resistència a la insulina i intolerància a la glucosa a partir de la quarta setmana de vida. Per aquestes raons és un model profusament emprat com a model de diabetis tipus II. Transferència gènica hidrodinàmica La tècnica d’injecció hidrodinàmica és un mètode físic que aconsegueix una transferència gènica preferentment al fetge amb una eficiència de fins al 40% tal i com prèviament ha estat descrit (209; 210). La injecció hidrodinàmica s’ha realitzat, bàsicament, seguint el procediment descrit per Liu et al. (209), tal i com es detalla a continuació:

1. Per a una eficiència òptima és recomanable injectar animals d’entre 20 i 23 g de pes. Els micrògrams desitjats de vector plasmídic es resuspenen en un volum del 10% (grams de pes del ratolí/ml) de salí fisiològic apirògen (Grifols) o PBS 1X estèril (GIBCO) en una xeringa de 2 ml. És extremadament important utilitzar un DNA d’alta puresa i lliure d’endotoxines, per a evitar al màxim la necrosi hepàtica deguda a LPS.

2. Immobilitzar l’animal per a facilitar la injecció. No cal anestesiar l’animal. Per a dilatar les venes i facilitar la injecció, es submergeix la cua del ratolí en aigua atemperada (40-45ºC) durant uns segons.

3. Es realitza la injecció de la totalitat de la solució salina que conté el plasmidi en una de les venes caudals laterals emprant una agulla 27G (BD MicrofineTM). És extremadament important que la injecció de la solució salina sigui feta de forma ininterrompuda i en un període de menys de 10 segons (normalment, uns set segons), per a una eficiència òptima de transfecció del fetge.

Administració dels adenovirus En infeccions sistèmiques, els adenovirus recombinants del serotip 5 són especialment eficients infectant el fetge (197). Per tant, per a obtenir una òptima eficiència de transducció dels vectors

- 210 -

Material i Mètodes

d’expressió de shRNA al fetge, es van empaquetar les construccions en adenovirus del serotip 5, tal i com es descriu als paràgrafs anteriors. Els adenovirus es van administrar als ratolins de la soca db/db, d’edat compresa entre 6 i 8 setmanes, seguint les següents indicacions:

1. Es pesen els animals. Es calcula els �l de l’estoc viral que es necessitarà. Es van realitzar

injeccions a una dosi intermèdia (aproximadament 2.5 109 p.f.u.) i alta (aproximadament 5*109 p.f.u.).

2. Es recuperen els adenovirus recombinants de -80ºC i es deixen descongelar en gel. És important evitar els cicles de congelació-descongelació. Per tant, descongelarem només les alíquotes necessàries.

3. Els adenovirus es resuspenen en un volum final de 200 �l de salí fisiològic o PBS 1X estèril

(GIBCO). 4. Es realitza la injecció en una de les venes caudals laterals emprant una agulla 27G (BD

MicrofineTM). Per a facilitar la injecció, prèviament es submergeix la cua del ratolí en aigua atemperada (40-45ºC) durant uns segons.

Administració de galactosamina-LPS Com a control positiu d’inducció d’apoptosi hepàtica, els ratolins ICR(CD1) van ser injectats

intraperitonialment amb 200 �l d’una solució de salí fisiològic apirògen (Grifols) contenint 700 mg/kg

galactosamina (Sigma) i 100 �g/kg lipopolisacàrid provinent d’E.coli (Sigma). La combinació

galactosamina-LPS s’ha demostrat altament hepatotòxica (261). Els controls negatius van rebre la injecció equivalent de salí. Passades 6 hores, els ratolins van ser sacrificats, se’ls va extreure sang de la vena cava inferior per mesurar les transaminases sèriques (GPT) i se’ls va extreure el fetge per a assajar l’activitat caspasa 3. Administració d’àcid 3-mercaptopicolínic Com a control positiu de la inhibició sistèmica de l’activitat PEPCK-C es va utilitzar l’àcid 3-mercaptopicolínic (3-MPA, Toronto Research Chemicals), conegut inhibidor competitiu de l’enzim (200). Els ratolins ICR (CD1) diabètics es van dejunar durant 2 hores abans de rebre una primera injecció intraperitonial de 3-MPA 100 mg/kg resuspès en una solució salina de midó 1%. Es van mantenir en dejú. Passades tres hores, se’ls va administrar una segona dosi de 25 mg/kg de 3-MPA

- 211 -


preparat en la mateixa solució. Es van mantenir en dejú. Cinc hores després de la última injecció es va analitzar la glucèmia. Mesura de la glucèmia La glucèmia dels ratolins es controlà regularment durant el període experimental en un glucòmetre Glucocard Memory 2 (Menarini). S’extreu una gota de sang de l’extrem de la cua mitjançant una petita incisió i s’aplica a una tira reactiva, que retorna en pocs segons el valor de la glucèmia. Administració de metformina Els ratolins db/db es van tractar amb una dosi 400 mg/kg de metformina, administrada a través de l’aigua de beguda. Per tal d’ajustar la dosi, es va controlar diàriament, durant la setmana prèvia al tractament, l’aigua consumida per gàbia i dia. A partir d’aquí es va fer una estimació del consum diari d’aigua per ratolí i dia. Tenint en compte això, es va preparar una solució de metformina en aigua de l’aixeta i es va dipositar als biberons de les gàbies, de manera que la dosi diària de metformina administrada fos de 400 mg/kg. Es va controlar el pes, la glucèmia en alimentació i el volum d’aigua consumit tres cops per setmana durant la durada de l’experiment. Administració de poli dI:dC L’anàleg de RNA de doble cadena poli(desoxi-inosina:desoxi-citosina) (poli dI:dC, Amersham Pharmacia) es va administrar als ratolins ICR (CD1)STZ+ com a control positiu de activació de la via

de PKR/Interferó per RNA. Una dosi de 50 �g poli dI:dC resuspesa en un volum final de 200 �l de

salí fisiològic es injectar intraperitonialment als ratolins. Els ratolins control es van injectar amb 200 ml de salí fisiològic (Grifols). Passsades 48 o 72 hores, es ratolins van ser sacrificats se’ls va extreure sang de la vena cava inferior per mesurar el contingut d’interleuquina 12 (IL12) i se’ls va extreure el

fetge per a estimar l’ativació de eIF2�.

Dejuni En els protocols experimentals que requerien dejuni, aquest s’inicià habitualment a partir de les 8 del matí, ja que tot just ha acabat el període de foscor, durant el qual els animals han estat menjant

- 212 -

Material i Mètodes

lliurement. En els ratolins amb diabetis experimental inuïda per STZ, es va aplicar un dejuni curt, de 6 hores, per a evitar hipoglucèmies, ja que, degut a la manca la absència d’insulina, aquests animals no tenen reservoris de glicogen. En els ratolins db/db, en canvi, per tal de deplecionar el glicogen hepàtic per a discernir els efectes de la producció hepàtica de glucosa originària de gluconeogènesi, els dejunis aplicats eren llargs, habitualment de 18 a 32 hores, segons el protocol a realitzar. Test de tolerància intraperitonial a la glucosa Aquest test s'utilitza amb la finalitat d’analitzar la capacitat de captació i metabolització de la glucosa. En resposta a un bolus de glcuosa, un animal sa és capaç de tornar als nivells basals de glucosa circulants en dues hores. En canvi, un animal diabètic encara presenta nivells elevats de glucèmia passat aquest temps. Aquest assaig es realitzà, o bé 48 hores després de la injecció hidrodinàmica dels plasmidis d’expressió de shRNA en ratolins ICR(CD1)STZ+, o bé 7 dies després de la infecció de ratolins db/db amb els adenovirus recombinants. El procediment seguit és el següent:

1. Els animals han d’estar en dejú per a evitar interferències degudes a glicogenòlisi. 2. Es fa una lectura prèvia dels nivells de glucosa circulants. 3. Es fa una injecció intraperitonial de 1g/kg (en els ratolins ICR(CD1) STZ+) o de 2g/kg (en

els ratolins db/db) dissolta en salí fisiològic. 4. A partir d'aquest moment es fan extraccions de sang seriades amb un interval de 30 minuts

fins a les 2 hores. En cada punt s’extreu una gota de sang de la vena de la cua i es mesura la concentració de glucosa en sang.

Test de tolerància intraperitonial a la insulina Aquest test indica la capacitat que tenen els teixits sensibles a insulina de captar glucosa en resposta a un bolus d’insulina. En un animal sa, en resposta al bolus d’insulina, els nivells de glucosa disminuïren més ostensiblement que en un de diabètic. El procediment seguit és el següent:

1. Els animals (ratolins db/db en aquest cas) estaben en alimentació. 2. Es fa una lectura prèvia dels nivells de glucosa circulants. 3. Es fa una injecció intraperitonial de 10 U/kg d’insulina de pàncreas boví (Sigma) en salí

fisiològic.

- 213 -


4. A partir d'aquest moment es fan extraccions de sang seriades amb un interval de 30 minuts fins a les 2 hores. En cada punt s’extreu una gota de sang de la vena de la cua i es mesura la concentració de glucosa en sang.

Test de sensibilitat perifèrica a la insulina Aquest assaig permet estimar la capacitat d’activació de la via de la insulina en resposta a un bolus de la hormona. Es va realitzar en ratolins db/db dejunats durant 32 hores, 7 dies després de la infecció amb els adenovirus recombinants seguint el següent protocol:

1. Els animals són sotmesos a dejuni durant 24 hores, per a disminuir l’activitat de la via d’insulina a nivells basals.

2. S’anestesia el ratolí amb isofluorane:buprenorfina i s’extreu un a mostra de teixit adipós epididimal, de múscul (Soleus i Gastrocnemius) d’una de les extremitats posteriors i de fetge (lòbul 1) es congela ràpidament en N2 líquid.

3. S’injecta a través de la vena de la cua una dosi de 10 U/kg d’insulina de pàncreas boví (Sigma) en salí fisiològic.

4. Cinc minuts després sextreu una altra peça de teixit adipós epididimal, múscul (Soleus i Gastrocnemius) de l’altra extremitat posterior i fetge (lòbul 1). Els teixits es van conservar a -80ºC fins a l’anàlisi.

5. A la finalització de l’experiment,els ratolins són sacrificats per dislocació cervical. Test de producció de glucosa a partir de piruvat Aquest assaig consisteix en la injecció d’un bolus de piruvat en els animals dejunats i permet fer una estimació de la capacitat gluconeogènica. Es va realitzar en ratolins db/db dejunats durant 32 hores 7 dies després de la infecció amb els adenovirus recombinants seguint el següent protocol:

1. Els animals són sotmesos a dejuni durant 32 hores, per a estimular la gluconeogènesi hepàtica.

2. Es fa una lectura prèvia dels nivells de glucosa circulants. 3. Es fa una injecció intraperitonial de 2g/kg de piruvat (Sigma) en PBS 1X estèril (GIBCO). 4. A partir d'aquest moment es fan extraccions de sang seriades, amb un interval de 30 min,

fins a les 2 hores. En cada punt s’extreu una gota de sang de la vena de la cua i es mesura la concentració de glucosa en sang.

- 214 -

Material i Mètodes

Gàbies metabòliques Per a analitzar les funcions fisiològiques bàsiques (ingesta, orina, defecació), els ratolins db/db, setdies després de la infecció amb els adenovirus recombinants, van ser estabulats individualment en gàbies metabòliques amb lliure accés a la beguda i el menjar, durant un període de 24 hores. Passat aquest període, els ratolins van ser tornats a les seves gàbies. Es va quantificar el pinso ingerit, l’H2O beguda, l’orina i la femta excretades. Anestèsia, eutanàsia i presa de mostres Per a l’anestèsia dels ratolins ICR (CD1) es fa servir una combinació d’anestèsic (ketamina) i analgèsic (xilacina) administrada intraperitonialment. Els ratolins de la soca db/db, degut al seu alt contingut corporal de greixos, l’administració intraperitonial d’un anestèsic liposoluble de metabolització hepàtica, com és la ketamina, no resulta una metodologia adequada, ja que el fàrmac queda retingut en els seus dipòsits de greix, dificultant l’anestèsia. Per aquesta raó, en aquest model animal d‘obesitat i diabetis es va optar per l’anestèsia amb isofluorane, un anestèsic que s’administra inhalat, complementat amb l’analgèsic buprenorfina. Les dosis administrades dels anestèsics i analgèsics es recullen a la següent taula:

Principi actiu Nom comercial Proveïdor Dosi Ketamina Imalgène 1000 Merial Laboratorio 150 mg/kg Xilazina Xilagesic 2% Laboratorios Calier 3 mg/kg

Inducció: a demanda Isofluorane Forane Abbot Manteniment: flux 2 % Buprenorfina Buprex 0.3mg/ml Schering Plough 0.3 mg/kg

En el punt final dels experiments, l’animal és sacrificat per intoxicació amb CO2 o bé anestesiat amb Ketamina-Xilazina, o isofluorane-buprenorfina. Seguidament, es realitza una laparotomia i es procedeix a la recollida de mostres.

Obtenció del sèrum de ratolí L’extracció de sang es fa per punció cardíaca o bé a través de la vena cava inferior en el moment de la necròpsia. El sèrum s'obté després de deixar coagular la sang durant 60 min a temperatura

- 215 -


ambient. El coàgul es separa mitjançant centrifugació a 2500 rpm a 4º C durant 15 minuts. El sèrum es manté congelat a -80º C fins al moment de la determinació dels diferents paràmetres.

Obtenció de teixits Durant la necròpsia es va recollir: fetge, ronyó, teixit adipós, pàncreas, melsa, múscul (Soleus i Gastrocnemius). Els teixits un cop extrets, eren cogelats ràpidament en N2 líquid i conservats a -80ºC fins al seu anàlisi. En el cas del fetge les mostres per als diferents assajos, es prenien de forma sistemàtica del mateix lòbul (Figura 80).

lòbul 1lòbul 5

lòbul 4lòbul 2

lòbul 3

Activitat enzimàtica PEPCKi Western blot

RNA

Histologia

AltresAltres

Figura 80. Presa de mostres del fetge i anàlisi realitzats.

- 216 -

BIBLIOGRAFIA

Bibliografia

1. Zimmet P, Alberti KG, Shaw J: Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature 414:782-787, 2001

2. Wild S, Roglic G, Green A, Sicree R, King H: Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care 27:1047-1053, 2004

3. Collins QF, Xiong Y, Lupo EG, Jr., Liu HY, Cao W: p38 Mitogen-activated protein kinase mediates free fatty acid-induced gluconeogenesis in hepatocytes. J Biol Chem 281:24336-24344, 2006

4. Kahn BB: Type 2 diabetes: when insulin secretion fails to compensate for insulin resistance. Cell 92:593-596, 1998

5. Bruning JC, Winnay J, Bonner-Weir S, Taylor SI, Accili D, Kahn CR: Development of a novel polygenic model of NIDDM in mice heterozygous for IR and IRS-1 null alleles. Cell 88:561-572, 1997

6. Kido Y, Burks DJ, Withers D, Bruning JC, Kahn CR, White MF, Accili D: Tissue-specific insulin resistance in mice with mutations in the insulin receptor, IRS-1, and IRS-2. J Clin Invest 105:199-205, 2000

7. Kulkarni RN, Almind K, Goren HJ, Winnay JN, Ueki K, Okada T, Kahn CR: Impact of genetic background on development of hyperinsulinemia and diabetes in insulin receptor/insulin receptor substrate-1 double heterozygous mice. Diabetes 52:1528-1534, 2003

8. Abel ED, Peroni O, Kim JK, Kim YB, Boss O, Hadro E, Minnemann T, Shulman GI, Kahn BB: Adipose-selective targeting of the GLUT4 gene impairs insulin action in muscle and liver. Nature 409:729-733, 2001

9. Bruning JC, Michael MD, Winnay JN, Hayashi T, Horsch D, Accili D, Goodyear LJ, Kahn CR: A muscle-specific insulin receptor knockout exhibits features of the metabolic syndrome of NIDDM without altering glucose tolerance. Mol Cell 2:559-569, 1998

10. Lauro D, Kido Y, Castle AL, Zarnowski MJ, Hayashi H, Ebina Y, Accili D: Impaired glucose tolerance in mice with a targeted impairment of insulin action in muscle and adipose tissue. Nat Genet 20:294-298, 1998

11. Kim JK, Michael MD, Previs SF, Peroni OD, Mauvais-Jarvis F, Neschen S, Kahn BB, Kahn CR, Shulman GI: Redistribution of substrates to adipose tissue promotes obesity in mice with selective insulin resistance in muscle. J Clin Invest 105:1791-1797, 2000

12. Nakae J, Kido Y, Accili D: Distinct and overlapping functions of insulin and IGF-I receptors. Endocr Rev 22:818-835, 2001

13. Michael MD, Kulkarni RN, Postic C, Previs SF, Shulman GI, Magnuson MA, Kahn CR: Loss of insulin signaling in hepatocytes leads to severe insulin resistance and progressive hepatic dysfunction. Mol Cell 6:87-97, 2000

- 219 -

Bibliografia

14. Puigserver P, Rodgers JT: Foxa2, a novel transcriptional regulator of insulin sensitivity. Nat Med 12:38-39, 2006

15. Wolfrum C, Stoffel M: Coactivation of Foxa2 through Pgc-1beta promotes liver fatty acid oxidation and triglyceride/VLDL secretion. Cell Metab 3:99-110, 2006

16. Shimomura I, Matsuda M, Hammer RE, Bashmakov Y, Brown MS, Goldstein JL: Decreased IRS-2 and increased SREBP-1c lead to mixed insulin resistance and sensitivity in livers of lipodystrophic and ob/ob mice. Mol Cell 6:77-86, 2000

17. Dentin R, Pegorier JP, Benhamed F, Foufelle F, Ferre P, Fauveau V, Magnuson MA, Girard J, Postic C: Hepatic glucokinase is required for the synergistic action of ChREBP and SREBP-1c on glycolytic and lipogenic gene expression. J Biol Chem 279:20314-20326, 2004

18. Cha JY, Repa JJ: The liver X receptor (LXR) and hepatic lipogenesis. The carbohydrate-response element-binding protein is a target gene of LXR. J Biol Chem 282:743-751, 2007

19. Chen G, Liang G, Ou J, Goldstein JL, Brown MS: Central role for liver X receptor in insulin-mediated activation of Srebp-1c transcription and stimulation of fatty acid synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A 101:11245-11250, 2004

20. Drynan L, Quant PA, Zammit VA: The role of changes in the sensitivity of hepatic mitochondrial overt carnitine palmitoyltransferase in determining the onset of the ketosis of starvation in the rat. Biochem J 318 ( Pt 3):767-770, 1996

21. Randle PJ, Garland PB, Hales CN, Newsholme EA: The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet 1:785-789, 1963

22. Shulman GI: Cellular mechanisms of insulin resistance. J Clin Invest 106:171-176, 2000

23. Griffin ME, Marcucci MJ, Cline GW, Bell K, Barucci N, Lee D, Goodyear LJ, Kraegen EW, White MF, Shulman GI: Free fatty acid-induced insulin resistance is associated with activation of protein kinase C theta and alterations in the insulin signaling cascade. Diabetes 48:1270-1274, 1999

24. Samuel VT, Liu ZX, Qu X, Elder BD, Bilz S, Befroy D, Romanelli AJ, Shulman GI: Mechanism of hepatic insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease. J Biol Chem 279:32345-32353, 2004

25. Samuel VT, Liu ZX, Wang A, Beddow SA, Geisler JG, Kahn M, Zhang XM, Monia BP, Bhanot S, Shulman GI: Inhibition of protein kinase Cepsilon prevents hepatic insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease. J Clin Invest 117:739-745, 2007

26. Choi CS, Savage DB, Kulkarni A, Yu XX, Liu ZX, Morino K, Kim S, Distefano A, Samuel VT, Neschen S, Zhang D, Wang A, Zhang XM, Kahn M, Cline GW, Pandey SK, Geisler JG, Bhanot S, Monia BP, Shulman GI: Suppression of Diacylglycerol Acyltransferase-2 (DGAT2), but Not DGAT1, with Antisense

- 220 -

Bibliografia

Oligonucleotides Reverses Diet-induced Hepatic Steatosis and Insulin Resistance. J Biol Chem 282:22678-22688, 2007

27. Koves TR, Ussher JR, Noland RC, Slentz D, Mosedale M, Ilkayeva O, Bain J, Stevens R, Dyck JR, Newgard CB, Lopaschuk GD, Muoio DM: Mitochondrial overload and incomplete fatty acid oxidation contribute to skeletal muscle insulin resistance. Cell Metab 7:45-56, 2008

28. McGarry JD, Mannaerts GP, Foster DW: A possible role for malonyl-CoA in the regulation of hepatic fatty acid oxidation and ketogenesis. J Clin Invest 60:265-270, 1977

29. Saha AK, Ruderman NB: Malonyl-CoA and AMP-activated protein kinase: an expanding partnership. Mol Cell Biochem 253:65-70, 2003

30. Abu-Elheiga L, Matzuk MM, Abo-Hashema KA, Wakil SJ: Continuous fatty acid oxidation and reduced fat storage in mice lacking acetyl-CoA carboxylase 2. Science 291:2613-2616, 2001

31. Abu-Elheiga L, Oh W, Kordari P, Wakil SJ: Acetyl-CoA carboxylase 2 mutant mice are protected against obesity and diabetes induced by high-fat/high-carbohydrate diets. Proc Natl Acad Sci U S A 100:10207-10212, 2003

32. Hardie DG, Hawley SA, Scott JW: AMP-activated protein kinase--development of the energy sensor concept. J Physiol 574:7-15, 2006

33. Foretz M, Ancellin N, Andreelli F, Saintillan Y, Grondin P, Kahn A, Thorens B, Vaulont S, Viollet B: Short-term overexpression of a constitutively active form of AMP-activated protein kinase in the liver leads to mild hypoglycemia and fatty liver. Diabetes 54:1331-1339, 2005

34. Kawaguchi T, Osatomi K, Yamashita H, Kabashima T, Uyeda K: Mechanism for fatty acid "sparing" effect on glucose-induced transcription: regulation of carbohydrate-responsive element-binding protein by AMP-activated protein kinase. J Biol Chem 277:3829-3835, 2002

35. Viollet B, Foretz M, Guigas B, Horman S, Dentin R, Bertrand L, Hue L, Andreelli F: Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders. JPhysiol 574:41-53, 2006

36. Towler MC, Hardie DG: AMP-activated protein kinase in metabolic control and insulin signaling. CircRes 100:328-341, 2007

37. DeFronzo RA: Pharmacologic therapy for type 2 diabetes mellitus. Ann Intern Med 131:281-303, 1999

38. Simonson DC, Ferrannini E, Bevilacqua S, Smith D, Barrett E, Carlson R, DeFronzo RA: Mechanism of improvement in glucose metabolism after chronic glyburide therapy. Diabetes 33:838-845, 1984

- 221 -

Bibliografia

39. Turner RC, Cull CA, Frighi V, Holman RR: Glycemic control with diet, sulfonylurea, metformin, or insulin in patients with type 2 diabetes mellitus: progressive requirement for multiple therapies (UKPDS 49). UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group. Jama 281:2005-2012, 1999

40. Kahn CR, Chen L, Cohen SE: Unraveling the mechanism of action of thiazolidinediones. J Clin Invest 106:1305-1307, 2000

41. Goldstein BJ: Rosiglitazone. Int J Clin Pract 54:333-337, 2000

42. Schoonjans K, Auwerx J: Thiazolidinediones: an update. Lancet 355:1008-1010, 2000

43. Hanson RW, Reshef L: Glyceroneogenesis revisited. Biochimie 85:1199-1205, 2003

44. Beale EG, Hammer RE, Antoine B, Forest C: Disregulated glyceroneogenesis: PCK1 as a candidate diabetes and obesity gene. Trends Endocrinol Metab 15:129-135, 2004

45. Lefebvre AM, Chen I, Desreumaux P, Najib J, Fruchart JC, Geboes K, Briggs M, Heyman R, Auwerx J: Activation of the peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes the development of colon tumors in C57BL/6J-APCMin/+ mice. Nat Med 4:1053-1057, 1998

46. Sarraf P, Mueller E, Jones D, King FJ, DeAngelo DJ, Partridge JB, Holden SA, Chen LB, Singer S, Fletcher C, Spiegelman BM: Differentiation and reversal of malignant changes in colon cancer through PPARgamma. Nat Med 4:1046-1052, 1998

47. Saez E, Tontonoz P, Nelson MC, Alvarez JG, Ming UT, Baird SM, Thomazy VA, Evans RM: Activators of the nuclear receptor PPARgamma enhance colon polyp formation. Nat Med 4:1058-1061, 1998

48. Brunmair B, Staniek K, Gras F, Scharf N, Althaym A, Clara R, Roden M, Gnaiger E, Nohl H, Waldhausl W, Furnsinn C: Thiazolidinediones, like metformin, inhibit respiratory complex I: a common mechanism contributing to their antidiabetic actions? Diabetes 53:1052-1059, 2004

49. Shaw RJ, Lamia KA, Vasquez D, Koo SH, Bardeesy N, Depinho RA, Montminy M, Cantley LC: The kinase LKB1 mediates glucose homeostasis in liver and therapeutic effects of metformin. Science 310:1642-1646, 2005

50. Zou MH, Kirkpatrick SS, Davis BJ, Nelson JS, Wiles WGt, Schlattner U, Neumann D, Brownlee M, Freeman MB, Goldman MH: Activation of the AMP-activated protein kinase by the anti-diabetic drug metformin in vivo. Role of mitochondrial reactive nitrogen species. J Biol Chem 279:43940-43951, 2004

51. Bailey CJ: Biguanides and NIDDM. Diabetes Care 15:755-772, 1992

52. Hundal RS, Krssak M, Dufour S, Laurent D, Lebon V, Chandramouli V, Inzucchi SE, Schumann WC, Petersen KF, Landau BR, Shulman GI: Mechanism by which metformin reduces glucose production in type 2 diabetes. Diabetes 49:2063-2069, 2000

- 222 -

Bibliografia

53. Zhou G, Myers R, Li Y, Chen Y, Shen X, Fenyk-Melody J, Wu M, Ventre J, Doebber T, Fujii N, Musi N, Hirshman MF, Goodyear LJ, Moller DE: Role of AMP-activated protein kinase in mechanism of metformin action. J Clin Invest 108:1167-1174, 2001

54. Kirpichnikov D, McFarlane SI, Sowers JR: Metformin: an update. Ann Intern Med 137:25-33, 2002

55. Stumvoll M, Nurjhan N, Perriello G, Dailey G, Gerich JE: Metabolic effects of metformin in non-insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med 333:550-554, 1995

56. Buettner C, Patel R, Muse ED, Bhanot S, Monia BP, McKay R, Obici S, Rossetti L: Severe impairment in liver insulin signaling fails to alter hepatic insulin action in conscious mice. J Clin Invest 115:1306-1313, 2005

57. Okamoto H, Obici S, Accili D, Rossetti L: Restoration of liver insulin signaling in Insr knockout mice fails to normalize hepatic insulin action. J Clin Invest 115:1314-1322, 2005

58. Lam TK, Pocai A, Gutierrez-Juarez R, Obici S, Bryan J, Aguilar-Bryan L, Schwartz GJ, Rossetti L: Hypothalamic sensing of circulating fatty acids is required for glucose homeostasis. Nat Med 11:320-327, 2005

59. Pocai A, Obici S, Schwartz GJ, Rossetti L: A brain-liver circuit regulates glucose homeostasis. CellMetab 1:53-61, 2005

60. Pocai A, Lam TK, Gutierrez-Juarez R, Obici S, Schwartz GJ, Bryan J, Aguilar-Bryan L, Rossetti L: Hypothalamic K(ATP) channels control hepatic glucose production. Nature 434:1026-1031, 2005

61. Bernal-Mizrachi C, Xiaozhong L, Yin L, Knutsen RH, Howard MJ, Arends JJ, Desantis P, Coleman T, Semenkovich CF: An afferent vagal nerve pathway links hepatic PPARalpha activation to glucocorticoid-induced insulin resistance and hypertension. Cell Metab 5:91-102, 2007

62. Uno K, Katagiri H, Yamada T, Ishigaki Y, Ogihara T, Imai J, Hasegawa Y, Gao J, Kaneko K, Iwasaki H, Ishihara H, Sasano H, Inukai K, Mizuguchi H, Asano T, Shiota M, Nakazato M, Oka Y: Neuronal pathway from the liver modulates energy expenditure and systemic insulin sensitivity. Science 312:1656-1659, 2006

63. Jungermann K, Kietzmann T: Zonation of parenchymal and nonparenchymal metabolism in liver. AnnuRev Nutr 16:179-203, 1996

64. Jungermann K, Kietzmann T: Role of oxygen in the zonation of carbohydrate metabolism and gene expression in liver. Kidney Int 51:402-412, 1997

65. Rosella G, Zajac JD, Kaczmarczyk SJ, Andrikopoulos S, Proietto J: Impaired suppression of gluconeogenesis induced by overexpression of a noninsulin-responsive phosphoenolpyruvate carboxykinase gene. Mol Endocrinol 7:1456-1462, 1993

- 223 -

Bibliografia

66. Nordlie RC, Lardy HA: Mammalian liver phosphoneolpyruvate carboxykinase activities. J Biol Chem 238:2259-2263, 1963

67. Utter MF, Kurahashi K: Purification of oxalacetic carboxylase from chicken liver. J Biol Chem 207:787-802, 1954

68. Wiese TJ, Lambeth DO, Ray PD: The intracellular distribution and activities of phosphoenolpyruvate carboxykinase isozymes in various tissues of several mammals and birds. Comp Biochem Physiol B 100:297-302, 1991

69. Chakravarty K, Leahy P, Becard D, Hakimi P, Foretz M, Ferre P, Foufelle F, Hanson RW: Sterol regulatory element-binding protein-1c mimics the negative effect of insulin on phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTP) gene transcription. J Biol Chem 276:34816-34823, 2001

70. Hanson RW, Reshef L: Regulation of phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTP) gene expression. Annu Rev Biochem 66:581-611, 1997

71. Dhakras PS, Hajarnis S, Taylor L, Curthoys NP: cAMP-dependent stabilization of phosphoenolpyruvate carboxykinase mRNA in LLC-PK1-F+ kidney cells. Am J Physiol Renal Physiol 290:F313-318, 2006

72. Rhee J, Inoue Y, Yoon JC, Puigserver P, Fan M, Gonzalez FJ, Spiegelman BM: Regulation of hepatic fasting response by PPARgamma coactivator-1alpha (PGC-1): requirement for hepatocyte nuclear factor 4alpha in gluconeogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 100:4012-4017, 2003

73. Yoon JC, Puigserver P, Chen G, Donovan J, Wu Z, Rhee J, Adelmant G, Stafford J, Kahn CR, Granner DK, Newgard CB, Spiegelman BM: Control of hepatic gluconeogenesis through the transcriptional coactivator PGC-1. Nature 413:131-138, 2001

74. Puigserver P, Rhee J, Donovan J, Walkey CJ, Yoon JC, Oriente F, Kitamura Y, Altomonte J, Dong H, Accili D, Spiegelman BM: Insulin-regulated hepatic gluconeogenesis through FOXO1-PGC-1alpha interaction. Nature 423:550-555, 2003

75. Barthel A, Schmoll D, Kruger KD, Bahrenberg G, Walther R, Roth RA, Joost HG: Differential regulation of endogenous glucose-6-phosphatase and phosphoenolpyruvate carboxykinase gene expression by the forkhead transcription factor FKHR in H4IIE-hepatoma cells. Biochem Biophys Res Commun 285:897-902, 2001

76. Biggs WH, 3rd, Meisenhelder J, Hunter T, Cavenee WK, Arden KC: Protein kinase B/Akt-mediated phosphorylation promotes nuclear exclusion of the winged helix transcription factor FKHR1. Proc Natl Acad Sci U S A 96:7421-7426, 1999

77. Matsuzaki H, Daitoku H, Hatta M, Tanaka K, Fukamizu A: Insulin-induced phosphorylation of FKHR (Foxo1) targets to proteasomal degradation. Proc Natl Acad Sci U S A 100:11285-11290, 2003

- 224 -

Bibliografia

78. Schmoll D, Walker KS, Alessi DR, Grempler R, Burchell A, Guo S, Walther R, Unterman TG: Regulation of glucose-6-phosphatase gene expression by protein kinase Balpha and the forkhead transcription factor FKHR. Evidence for insulin response unit-dependent and -independent effects of insulin on promoter activity. J Biol Chem 275:36324-36333, 2000

79. Nakae J, Kitamura T, Silver DL, Accili D: The forkhead transcription factor Foxo1 (Fkhr) confers insulin sensitivity onto glucose-6-phosphatase expression. J Clin Invest 108:1359-1367, 2001

80. Rodgers JT, Lerin C, Haas W, Gygi SP, Spiegelman BM, Puigserver P: Nutrient control of glucose homeostasis through a complex of PGC-1alpha and SIRT1. Nature 434:113-118, 2005

81. Frescas D, Valenti L, Accili D: Nuclear trapping of the forkhead transcription factor FoxO1 via Sirt-dependent deacetylation promotes expression of glucogenetic genes. J Biol Chem 280:20589-20595, 2005

82. Daitoku H, Hatta M, Matsuzaki H, Aratani S, Ohshima T, Miyagishi M, Nakajima T, Fukamizu A: Silent information regulator 2 potentiates Foxo1-mediated transcription through its deacetylase activity. Proc Natl Acad Sci U S A 101:10042-10047, 2004

83. Matsuzaki H, Daitoku H, Hatta M, Aoyama H, Yoshimochi K, Fukamizu A: Acetylation of Foxo1 alters its DNA-binding ability and sensitivity to phosphorylation. Proc Natl Acad Sci U S A 102:11278-11283, 2005

84. Qiao L, MacDougald OA, Shao J: CCAAT/enhancer-binding protein alpha mediates induction of hepatic phosphoenolpyruvate carboxykinase by p38 mitogen-activated protein kinase. J Biol Chem 281:24390-24397, 2006

85. Yanez AJ, Nualart F, Droppelmann C, Bertinat R, Brito M, Concha, II, Slebe JC: Broad expression of fructose-1,6-bisphosphatase and phosphoenolpyruvate carboxykinase provide evidence for gluconeogenesis in human tissues other than liver and kidney. J Cell Physiol 197:189-197, 2003

86. Kalhan SC, Mahajan S, Burkett E, Reshef L, Hanson RW: Glyceroneogenesis and the source of glycerol for hepatic triacylglycerol synthesis in humans. J Biol Chem 276:12928-12931, 2001

87. Olswang Y, Cohen H, Papo O, Cassuto H, Croniger CM, Hakimi P, Tilghman SM, Hanson RW, Reshef L: A mutation in the peroxisome proliferator-activated receptor gamma-binding site in the gene for the cytosolic form of phosphoenolpyruvate carboxykinase reduces adipose tissue size and fat content in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 99:625-630, 2002

88. Franckhauser S, Munoz S, Pujol A, Casellas A, Riu E, Otaegui P, Su B, Bosch F: Increased fatty acid re-esterification by PEPCK overexpression in adipose tissue leads to obesity without insulin resistance. Diabetes 51:624-630, 2002

89. Franckhauser S, Munoz S, Elias I, Ferre T, Bosch F: Adipose overexpression of phosphoenolpyruvate carboxykinase leads to high susceptibility to diet-induced insulin resistance and obesity. Diabetes 55:273-280, 2006

- 225 -

Bibliografia

90. Olswang Y, Blum B, Cassuto H, Cohen H, Biberman Y, Hanson RW, Reshef L: Glucocorticoids repress transcription of phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTP) gene in adipocytes by inhibiting its C/EBP-mediated activation. J Biol Chem 278:12929-12936, 2003

91. Millward CA, Heaney JD, Sinasac DS, Chu EC, Bederman IR, Gilge DA, Previs SF, Croniger CM: Mice with a deletion in the gene for CCAAT/enhancer-binding protein beta are protected against diet-induced obesity. Diabetes 56:161-167, 2007

92. Schroeder-Gloeckler JM, Rahman SM, Janssen RC, Qiao L, Shao J, Roper M, Fischer SJ, Lowe E, Orlicky DJ, McManaman JL, Palmer C, Gitomer WL, Huang W, O'Doherty R M, Becker TC, Klemm DJ, Jensen DR, Pulawa LK, Eckel RH, Friedman JE: CCAAT/enhancer-binding protein beta (C/EBPbeta ) deletion reduces adiposity, hepatic steatosis, and diabetes in Leprdb/db mice. J Biol Chem, 2007

93. Hakimi P, Johnson MT, Yang J, Lepage DF, Conlon RA, Kalhan SC, Reshef L, Tilghman SM, Hanson RW: Phosphoenolpyruvate carboxykinase and the critical role of cataplerosis in the control of hepatic metabolism. Nutr Metab (Lond) 2:33, 2005

94. Burgess SC, He T, Yan Z, Lindner J, Sherry AD, Malloy CR, Browning JD, Magnuson MA: Cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinase does not solely control the rate of hepatic gluconeogenesis in the intact mouse liver. Cell Metab 5:313-320, 2007

95. She P, Shiota M, Shelton KD, Chalkley R, Postic C, Magnuson MA: Phosphoenolpyruvate carboxykinase is necessary for the integration of hepatic energy metabolism. Mol Cell Biol 20:6508-6517, 2000

96. She P, Burgess SC, Shiota M, Flakoll P, Donahue EP, Malloy CR, Sherry AD, Magnuson MA: Mechanisms by which liver-specific PEPCK knockout mice preserve euglycemia during starvation. Diabetes 52:1649-1654, 2003

97. Burgess SC, Hausler N, Merritt M, Jeffrey FM, Storey C, Milde A, Koshy S, Lindner J, Magnuson MA, Malloy CR, Sherry AD: Impaired tricarboxylic Acid cycle activity in mouse livers lacking cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinase. J Biol Chem 279:48941-48949, 2004

98. Hakimi P, Yang J, Casadesus G, Massillon D, Tolentino-Silva F, Nye CK, Cabrera ME, Hagen DR, Utter CB, Baghdy Y, Johnson DH, Wilson DL, Kirwan JP, Kalhan SC, Hanson RW: Overexpression of the cytosolic form of phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTP) in skeletal muscle repatterns energy metabolism in the mouse. J Biol Chem 282:32844-32855, 2007

99. Magnusson I, Rothman DL, Katz LD, Shulman RG, Shulman GI: Increased rate of gluconeogenesis in type II diabetes mellitus. A 13C nuclear magnetic resonance study. J Clin Invest 90:1323-1327, 1992

100. Consoli A, Nurjhan N, Capani F, Gerich J: Predominant role of gluconeogenesis in increased hepatic glucose production in NIDDM. Diabetes 38:550-557, 1989

- 226 -

Bibliografia

101. Valera A, Pujol A, Pelegrin M, Bosch F: Transgenic mice overexpressing phosphoenolpyruvate carboxykinase develop non-insulin-dependent diabetes mellitus. Proc Natl Acad Sci U S A 91:9151-9154, 1994

102. Sun Y, Liu S, Ferguson S, Wang L, Klepcyk P, Yun JS, Friedman JE: Phosphoenolpyruvate carboxykinase overexpression selectively attenuates insulin signaling and hepatic insulin sensitivity in transgenic mice. J Biol Chem 277:23301-23307, 2002

103. Cao H, van der Veer E, Ban MR, Hanley AJ, Zinman B, Harris SB, Young TK, Pickering JG, Hegele RA: Promoter polymorphism in PCK1 (phosphoenolpyruvate carboxykinase gene) associated with type 2 diabetes mellitus. J Clin Endocrinol Metab 89:898-903, 2004

104. Shin HD, Park BL, Kim LH, Cheong HS, Kim JH, Cho YM, Lee HK, Park KS: Association of a polymorphism in the gene encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 with high-density lipoprotein and triglyceride levels. Diabetologia 48:2025-2032, 2005

105. Shapiro AM, Lakey JR: Future trends in islet cell transplantation. Diabetes Technol Ther 2:449-452, 2000

106. Trucco M: Regeneration of the pancreatic beta cell. J Clin Invest 115:5-12, 2005

107. Levine F, Leibowitz G: Towards gene therapy of diabetes mellitus. Mol Med Today 5:165-171, 1999

108. Riu E, Mas A, Ferre T, Pujol A, Gros L, Otaegui P, Montoliu L, Bosch F: Counteraction of type 1 diabetic alterations by engineering skeletal muscle to produce insulin: insights from transgenic mice. Diabetes 51:704-711, 2002

109. Jimenez-Chillaron JC, Newgard CB, Gomez-Foix AM: Increased glucose disposal induced by adenovirus-mediated transfer of glucokinase to skeletal muscle in vivo. Faseb J 13:2153-2160, 1999

110. Otaegui PJ, Ferre T, Pujol A, Riu E, Jimenez R, Bosch F: Expression of glucokinase in skeletal muscle: a new approach to counteract diabetic hyperglycemia. Hum Gene Ther 11:1543-1552, 2000

111. Jimenez-Chillaron JC, Telemaque-Potts S, Gomez-Valades AG, Anderson P, Newgard CB, Gomez-Foix AM: Glucokinase gene transfer to skeletal muscle of diabetic Zucker fatty rats improves insulin-sensitive glucose uptake. Metabolism 51:121-126, 2002

112. Otaegui PJ, Ferre T, Riu E, Bosch F: Prevention of obesity and insulin resistance by glucokinase expression in skeletal muscle of transgenic mice. Faseb J 17:2097-2099, 2003

113. Mas A, Montane J, Anguela XM, Munoz S, Douar AM, Riu E, Otaegui P, Bosch F: Reversal of type 1 diabetes by engineering a glucose sensor in skeletal muscle. Diabetes 55:1546-1553, 2006

- 227 -

Bibliografia

114. Ferre T, Pujol A, Riu E, Bosch F, Valera A: Correction of diabetic alterations by glucokinase. Proc Natl Acad Sci U S A 93:7225-7230, 1996

115. Desai UJ, Slosberg ED, Boettcher BR, Caplan SL, Fanelli B, Stephan Z, Gunther VJ, Kaleko M, Connelly S: Phenotypic correction of diabetic mice by adenovirus-mediated glucokinase expression. Diabetes 50:2287-2295, 2001

116. Ferre T, Riu E, Franckhauser S, Agudo J, Bosch F: Long-term overexpression of glucokinase in the liver of transgenic mice leads to insulin resistance. Diabetologia 46:1662-1668, 2003

117. O'Doherty RM, Lehman DL, Telemaque-Potts S, Newgard CB: Metabolic impact of glucokinase overexpression in liver: lowering of blood glucose in fed rats is accompanied by hyperlipidemia. Diabetes 48:2022-2027, 1999

118. Altomonte J, Richter A, Harbaran S, Suriawinata J, Nakae J, Thung SN, Meseck M, Accili D, Dong H: Inhibition of Foxo1 function is associated with improved fasting glycemia in diabetic mice. Am J PhysiolEndocrinol Metab 285:E718-728, 2003

119. Qu S, Altomonte J, Perdomo G, He J, Fan Y, Kamagate A, Meseck M, Dong HH: Aberrant Forkhead box O1 function is associated with impaired hepatic metabolism. Endocrinology 147:5641-5652, 2006

120. Samuel VT, Choi CS, Phillips TG, Romanelli AJ, Geisler JG, Bhanot S, McKay R, Monia B, Shutter JR, Lindberg RA, Shulman GI, Veniant MM: Targeting foxo1 in mice using antisense oligonucleotide improves hepatic and peripheral insulin action. Diabetes 55:2042-2050, 2006

121. Seely BL, Staubs PA, Reichart DR, Berhanu P, Milarski KL, Saltiel AR, Kusari J, Olefsky JM: Protein tyrosine phosphatase 1B interacts with the activated insulin receptor. Diabetes 45:1379-1385, 1996

122. Kennedy BP, Ramachandran C: Protein tyrosine phosphatase-1B in diabetes. Biochem Pharmacol 60:877-883, 2000

123. Kenner KA, Anyanwu E, Olefsky JM, Kusari J: Protein-tyrosine phosphatase 1B is a negative regulator of insulin- and insulin-like growth factor-I-stimulated signaling. J Biol Chem 271:19810-19816, 1996

124. Zinker BA, Rondinone CM, Trevillyan JM, Gum RJ, Clampit JE, Waring JF, Xie N, Wilcox D, Jacobson P, Frost L, Kroeger PE, Reilly RM, Koterski S, Opgenorth TJ, Ulrich RG, Crosby S, Butler M, Murray SF, McKay RA, Bhanot S, Monia BP, Jirousek MR: PTP1B antisense oligonucleotide lowers PTP1B protein, normalizes blood glucose, and improves insulin sensitivity in diabetic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 99:11357-11362, 2002

125. Liu G: Technology evaluation: ISIS-113715, Isis. Curr Opin Mol Ther 6:331-336, 2004

- 228 -

Bibliografia

126. Koizumi M, Takagi-Sato M, Okuyama R, Araki K, Sun W, Nakai D, Tsutsumi S, Kawai K: Direct comparison of in vivo antisense activity of ENA oligonucleotides targeting PTP1B mRNA with that of 2'-O-(2-methoxy)ethyl-modified oligonucleotides. Oligonucleotides 16:253-262, 2006

127. Abu-Elheiga L, Matzuk MM, Kordari P, Oh W, Shaikenov T, Gu Z, Wakil SJ: Mutant mice lacking acetyl-CoA carboxylase 1 are embryonically lethal. Proc Natl Acad Sci U S A 102:12011-12016, 2005

128. Oh W, Abu-Elheiga L, Kordari P, Gu Z, Shaikenov T, Chirala SS, Wakil SJ: Glucose and fat metabolism in adipose tissue of acetyl-CoA carboxylase 2 knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A 102:1384-1389, 2005

129. Chirala SS, Chang H, Matzuk M, Abu-Elheiga L, Mao J, Mahon K, Finegold M, Wakil SJ: Fatty acid synthesis is essential in embryonic development: fatty acid synthase null mutants and most of the heterozygotes die in utero. Proc Natl Acad Sci U S A 100:6358-6363, 2003

130. Abu-Elheiga L, Brinkley WR, Zhong L, Chirala SS, Woldegiorgis G, Wakil SJ: The subcellular localization of acetyl-CoA carboxylase 2. Proc Natl Acad Sci U S A 97:1444-1449, 2000

131. Harada N, Oda Z, Hara Y, Fujinami K, Okawa M, Ohbuchi K, Yonemoto M, Ikeda Y, Ohwaki K, Aragane K, Tamai Y, Kusunoki J: Hepatic de novo lipogenesis is present in liver-specific ACC1 deficient mice. Mol Cell Biol, 2007

132. Savage DB, Choi CS, Samuel VT, Liu ZX, Zhang D, Wang A, Zhang XM, Cline GW, Yu XX, Geisler JG, Bhanot S, Monia BP, Shulman GI: Reversal of diet-induced hepatic steatosis and hepatic insulin resistance by antisense oligonucleotide inhibitors of acetyl-CoA carboxylases 1 and 2. J Clin Invest 116:817-824, 2006

133. Burger HJ, Schubert G, Hemmerle H, Kramer W, Herling AW: Pharmacological interference with hepatic glucose production. Ann N Y Acad Sci 892:312-314, 1999

134. Lei KJ, Shelly LL, Pan CJ, Sidbury JB, Chou JY: Mutations in the glucose-6-phosphatase gene that cause glycogen storage disease type 1a. Science 262:580-583, 1993

135. van Dijk TH, van der Sluijs FH, Wiegman CH, Baller JF, Gustafson LA, Burger HJ, Herling AW, Kuipers F, Meijer AJ, Reijngoud DJ: Acute inhibition of hepatic glucose-6-phosphatase does not affect gluconeogenesis but directs gluconeogenic flux toward glycogen in fasted rats. A pharmacological study with the chlorogenic acid derivative S4048. J Biol Chem 276:25727-25735, 2001

136. Huang A, Chen Y, Wang X, Zhao S, Su N, White DW: Functional silencing of hepatic microsomal glucose-6-phosphatase gene expression in vivo by adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA. FEBS Lett 558:69-73, 2004

137. Dentin R, Benhamed F, Hainault I, Fauveau V, Foufelle F, Dyck JR, Girard J, Postic C: Liver-specific inhibition of ChREBP improves hepatic steatosis and insulin resistance in ob/ob mice. Diabetes 55:2159-2170, 2006

- 229 -

Bibliografia

138. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC: Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391:806-811, 1998

139. Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA, Bartel DP: RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101:25-33, 2000

140. Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T: RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev 15:188-200, 2001

141. Martinez J, Patkaniowska A, Urlaub H, Luhrmann R, Tuschl T: Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell 110:563-574, 2002

142. Liu J, Carmell MA, Rivas FV, Marsden CG, Thomson JM, Song JJ, Hammond SM, Joshua-Tor L, Hannon GJ: Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science 305:1437-1441, 2004

143. Haley B, Zamore PD: Kinetic analysis of the RNAi enzyme complex. Nat Struct Mol Biol 11:599-606, 2004

144. Amarzguioui M, Holen T, Babaie E, Prydz H: Tolerance for mutations and chemical modifications in a siRNA. Nucleic Acids Res 31:589-595, 2003

145. Bartel DP: MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116:281-297, 2004

146. Krutzfeldt J, Stoffel M: MicroRNAs: a new class of regulatory genes affecting metabolism. Cell Metab 4:9-12, 2006

147. Paddison PJ, Caudy AA, Bernstein E, Hannon GJ, Conklin DS: Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev 16:948-958, 2002

148. Tuschl T: Expanding small RNA interference. Nat Biotechnol 20:446-448, 2002

149. Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R: A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296:550-553, 2002

150. Paddison PJ, Caudy AA, Sachidanandam R, Hannon GJ: Short hairpin activated gene silencing in mammalian cells. Methods Mol Biol 265:85-100, 2004

151. Holen T, Amarzguioui M, Wiiger MT, Babaie E, Prydz H: Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger Tissue Factor. Nucleic Acids Res 30:1757-1766, 2002

152. Reynolds A, Leake D, Boese Q, Scaringe S, Marshall WS, Khvorova A: Rational siRNA design for RNA interference. Nat Biotechnol 22:326-330, 2004

- 230 -

Bibliografia

153. Shao Y, Chan CY, Maliyekkel A, Lawrence CE, Roninson IB, Ding Y: Effect of target secondary structure on RNAi efficiency. Rna 13:1631-1640, 2007

154. Kim DH, Behlke MA, Rose SD, Chang MS, Choi S, Rossi JJ: Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency and efficacy. Nat Biotechnol 23:222-226, 2005

155. Siolas D, Lerner C, Burchard J, Ge W, Linsley PS, Paddison PJ, Hannon GJ, Cleary MA: Synthetic shRNAs as potent RNAi triggers. Nat Biotechnol 23:227-231, 2005

156. Jackson AL, Bartz SR, Schelter J, Kobayashi SV, Burchard J, Mao M, Li B, Cavet G, Linsley PS: Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol 21:635-637, 2003

157. Birmingham A, Anderson EM, Reynolds A, Ilsley-Tyree D, Leake D, Fedorov Y, Baskerville S, Maksimova E, Robinson K, Karpilow J, Marshall WS, Khvorova A: 3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nat Methods 3:199-204, 2006

158. Jackson AL, Burchard J, Schelter J, Chau BN, Cleary M, Lim L, Linsley PS: Widespread siRNA "off-target" transcript silencing mediated by seed region sequence complementarity. Rna 12:1179-1187, 2006

159. Sledz CA, Holko M, de Veer MJ, Silverman RH, Williams BR: Activation of the interferon system by short-interfering RNAs. Nat Cell Biol 5:834-839, 2003

160. Bridge AJ, Pebernard S, Ducraux A, Nicoulaz AL, Iggo R: Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells. Nat Genet 34:263-264, 2003

161. Hornung V, Guenthner-Biller M, Bourquin C, Ablasser A, Schlee M, Uematsu S, Noronha A, Manoharan M, Akira S, de Fougerolles A, Endres S, Hartmann G: Sequence-specific potent induction of IFN-alpha by short interfering RNA in plasmacytoid dendritic cells through TLR7. Nat Med 11:263-270, 2005

162. Judge AD, Sood V, Shaw JR, Fang D, McClintock K, MacLachlan I: Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA. Nat Biotechnol 23:457-462, 2005

163. Fedorov Y, Anderson EM, Birmingham A, Reynolds A, Karpilow J, Robinson K, Leake D, Marshall WS, Khvorova A: Off-target effects by siRNA can induce toxic phenotype. Rna 12:1188-1196, 2006

164. Grimm D, Streetz KL, Jopling CL, Storm TA, Pandey K, Davis CR, Marion P, Salazar F, Kay MA: Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature 441:537-541, 2006

165. Jackson AL, Burchard J, Leake D, Reynolds A, Schelter J, Guo J, Johnson JM, Lim L, Karpilow J, Nichols K, Marshall W, Khvorova A, Linsley PS: Position-specific chemical modification of siRNAs reduces "off-target" transcript silencing. Rna 12:1197-1205, 2006

- 231 -

Bibliografia

166. Judge AD, Bola G, Lee AC, MacLachlan I: Design of noninflammatory synthetic siRNA mediating potent gene silencing in vivo. Mol Ther 13:494-505, 2006

167. Mook OR, Baas F, de Wissel MB, Fluiter K: Evaluation of locked nucleic acid-modified small interfering RNA in vitro and in vivo. Mol Cancer Ther 6:833-843, 2007

168. Bramsen JB, Laursen MB, Damgaard CK, Lena SW, Babu BR, Wengel J, Kjems J: Improved silencing properties using small internally segmented interfering RNAs. Nucleic Acids Res 35:5886-5897, 2007

169. Soutschek J, Akinc A, Bramlage B, Charisse K, Constien R, Donoghue M, Elbashir S, Geick A, Hadwiger P, Harborth J, John M, Kesavan V, Lavine G, Pandey RK, Racie T, Rajeev KG, Rohl I, Toudjarska I, Wang G, Wuschko S, Bumcrot D, Koteliansky V, Limmer S, Manoharan M, Vornlocher HP: Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature 432:173-178, 2004

170. Zimmermann TS, Lee AC, Akinc A, Bramlage B, Bumcrot D, Fedoruk MN, Harborth J, Heyes JA, Jeffs LB, John M, Judge AD, Lam K, McClintock K, Nechev LV, Palmer LR, Racie T, Rohl I, Seiffert S, Shanmugam S, Sood V, Soutschek J, Toudjarska I, Wheat AJ, Yaworski E, Zedalis W, Koteliansky V, Manoharan M, Vornlocher HP, MacLachlan I: RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. Nature 441:111-114, 2006

171. Takeshita F, Minakuchi Y, Nagahara S, Honma K, Sasaki H, Hirai K, Teratani T, Namatame N, Yamamoto Y, Hanai K, Kato T, Sano A, Ochiya T: Efficient delivery of small interfering RNA to bone-metastatic tumors by using atelocollagen in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 102:12177-12182, 2005

172. Schiffelers RM, Ansari A, Xu J, Zhou Q, Tang Q, Storm G, Molema G, Lu PY, Scaria PV, Woodle MC: Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Res 32:e149, 2004

173. Akhtar S, Benter I: Toxicogenomics of non-viral drug delivery systems for RNAi: potential impact on siRNA-mediated gene silencing activity and specificity. Adv Drug Deliv Rev 59:164-182, 2007

174. Ishida T, Wang X, Shimizu T, Nawata K, Kiwada H: PEGylated liposomes elicit an anti-PEG IgM response in a T cell-independent manner. J Control Release 122:349-355, 2007

175. Semple SC, Harasym TO, Clow KA, Ansell SM, Klimuk SK, Hope MJ: Immunogenicity and rapid blood clearance of liposomes containing polyethylene glycol-lipid conjugates and nucleic Acid. JPharmacol Exp Ther 312:1020-1026, 2005

176. Song E, Zhu P, Lee SK, Chowdhury D, Kussman S, Dykxhoorn DM, Feng Y, Palliser D, Weiner DB, Shankar P, Marasco WA, Lieberman J: Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors. Nat Biotechnol 23:709-717, 2005

- 232 -

Bibliografia

177. Peer D, Zhu P, Carman CV, Lieberman J, Shimaoka M: Selective gene silencing in activated leukocytes by targeting siRNAs to the integrin lymphocyte function-associated antigen-1. Proc Natl Acad Sci U S A 104:4095-4100, 2007

178. Peer D, Park EJ, Morishita Y, Carman CV, Shimaoka M: Systemic leukocyte-directed siRNA delivery revealing cyclin D1 as an anti-inflammatory target. Science 319:627-630, 2008

179. Uprichard SL: The therapeutic potential of RNA interference. FEBS Lett 579:5996-6007, 2005

180. de Fougerolles A, Vornlocher HP, Maraganore J, Lieberman J: Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov 6:443-453, 2007

181. Morrissey DV, Lockridge JA, Shaw L, Blanchard K, Jensen K, Breen W, Hartsough K, Machemer L, Radka S, Jadhav V, Vaish N, Zinnen S, Vargeese C, Bowman K, Shaffer CS, Jeffs LB, Judge A, MacLachlan I, Polisky B: Potent and persistent in vivo anti-HBV activity of chemically modified siRNAs. NatBiotechnol 23:1002-1007, 2005

182. Geisbert TW, Hensley LE, Kagan E, Yu EZ, Geisbert JB, Daddario-DiCaprio K, Fritz EA, Jahrling PB, McClintock K, Phelps JR, Lee AC, Judge A, Jeffs LB, MacLachlan I: Postexposure protection of guinea pigs against a lethal ebola virus challenge is conferred by RNA interference. J Infect Dis 193:1650-1657, 2006

183. Song E, Lee SK, Wang J, Ince N, Ouyang N, Min J, Chen J, Shankar P, Lieberman J: RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Nat Med 9:347-351, 2003

184. McCaffrey AP, Nakai H, Pandey K, Huang Z, Salazar FH, Xu H, Wieland SF, Marion PL, Kay MA: Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat Biotechnol 21:639-644, 2003

185. Zhang Y, Cristofaro P, Silbermann R, Pusch O, Boden D, Konkin T, Hovanesian V, Monfils PR, Resnick M, Moss SF, Ramratnam B: Engineering mucosal RNA interference in vivo. Mol Ther 14:336-342, 2006

186. Ralph GS, Radcliffe PA, Day DM, Carthy JM, Leroux MA, Lee DC, Wong LF, Bilsland LG, Greensmith L, Kingsman SM, Mitrophanous KA, Mazarakis ND, Azzouz M: Silencing mutant SOD1 using RNAi protects against neurodegeneration and extends survival in an ALS model. Nat Med 11:429-433, 2005

187. Xia H, Mao Q, Eliason SL, Harper SQ, Martins IH, Orr HT, Paulson HL, Yang L, Kotin RM, Davidson BL: RNAi suppresses polyglutamine-induced neurodegeneration in a model of spinocerebellar ataxia. NatMed 10:816-820, 2004

188. Harper SQ, Staber PD, He X, Eliason SL, Martins IH, Mao Q, Yang L, Kotin RM, Paulson HL, Davidson BL: RNA interference improves motor and neuropathological abnormalities in a Huntington's disease mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A 102:5820-5825, 2005

- 233 -

Bibliografia

189. Singer O, Marr RA, Rockenstein E, Crews L, Coufal NG, Gage FH, Verma IM, Masliah E: Targeting BACE1 with siRNAs ameliorates Alzheimer disease neuropathology in a transgenic model. Nat Neurosci 8:1343-1349, 2005

190. Makimura H, Mizuno TM, Mastaitis JW, Agami R, Mobbs CV: Reducing hypothalamic AGRP by RNA interference increases metabolic rate and decreases body weight without influencing food intake. BMCNeurosci 3:18, 2002

191. Hu-Lieskovan S, Heidel JD, Bartlett DW, Davis ME, Triche TJ: Sequence-specific knockdown of EWS-FLI1 by targeted, nonviral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastatic Ewing's sarcoma. Cancer Res 65:8984-8992, 2005

192. Takei Y, Kadomatsu K, Yuzawa Y, Matsuo S, Muramatsu T: A small interfering RNA targeting vascular endothelial growth factor as cancer therapeutics. Cancer Res 64:3365-3370, 2004

193. Tolentino MJ, Brucker AJ, Fosnot J, Ying GS, Wu IH, Malik G, Wan S, Reich SJ: Intravitreal injection of vascular endothelial growth factor small interfering RNA inhibits growth and leakage in a nonhuman primate, laser-induced model of choroidal neovascularization. Retina 24:132-138, 2004

194. Shen J, Samul R, Silva RL, Akiyama H, Liu H, Saishin Y, Hackett SF, Zinnen S, Kossen K, Fosnaugh K, Vargeese C, Gomez A, Bouhana K, Aitchison R, Pavco P, Campochiaro PA: Suppression of ocular neovascularization with siRNA targeting VEGF receptor 1. Gene Ther 13:225-234, 2006

195. Zender L, Hutker S, Liedtke C, Tillmann HL, Zender S, Mundt B, Waltemathe M, Gosling T, Flemming P, Malek NP, Trautwein C, Manns MP, Kuhnel F, Kubicka S: Caspase 8 small interfering RNA prevents acute liver failure in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 100:7797-7802, 2003

196. Lewis DL, Wolff JA: Delivery of siRNA and siRNA expression constructs to adult mammals by hydrodynamic intravascular injection. Methods Enzymol 392:336-350, 2005

197. Huard J, Lochmuller H, Acsadi G, Jani A, Massie B, Karpati G: The route of administration is a major determinant of the transduction efficiency of rat tissues by adenoviral recombinants. Gene Ther 2:107-115, 1995

198. Desvergne B, Michalik L, Wahli W: Transcriptional regulation of metabolism. Physiol Rev 86:465-514, 2006

199. Landau BR, Wahren J, Chandramouli V, Schumann WC, Ekberg K, Kalhan SC: Contributions of gluconeogenesis to glucose production in the fasted state. J Clin Invest 98:378-385, 1996

200. Jomain-Baum M, Schramm VL, Hanson RW: Mechanism of 3-mercaptopicolinic acid inhibition of hepatic phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTP). J Biol Chem 251:37-44, 1976

201. DiTullio NW, Berkoff CE, Blank B, Kostos V, Stack EJ, Saunders HL: 3-mercaptopicolinic acid, an inhibitor of gluconeogenesis. Biochem J 138:387-394, 1974

- 234 -

Bibliografia

202. Lewis DL, Hagstrom JE, Loomis AG, Wolff JA, Herweijer H: Efficient delivery of siRNA for inhibition of gene expression in postnatal mice. Nat Genet 32:107-108, 2002

203. McCaffrey AP, Meuse L, Pham TT, Conklin DS, Hannon GJ, Kay MA: RNA interference in adult mice. Nature 418:38-39, 2002

204. Paddison PJ, Caudy AA, Hannon GJ: Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A 99:1443-1448, 2002

205. Budker V, Zhang G, Knechtle S, Wolff JA: Naked DNA delivered intraportally expresses efficiently in hepatocytes. Gene Ther 3:593-598, 1996

206. Zhang G, Vargo D, Budker V, Armstrong N, Knechtle S, Wolff JA: Expression of naked plasmid DNA injected into the afferent and efferent vessels of rodent and dog livers. Hum Gene Ther 8:1763-1772, 1997

207. Budker V, Zhang G, Danko I, Williams P, Wolff J: The efficient expression of intravascularly delivered DNA in rat muscle. Gene Ther 5:272-276, 1998

208. Zhang G, Budker V, Williams P, Subbotin V, Wolff JA: Efficient expression of naked dna delivered intraarterially to limb muscles of nonhuman primates. Hum Gene Ther 12:427-438, 2001

209. Liu F, Song Y, Liu D: Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther 6:1258-1266, 1999

210. Zhang G, Budker V, Wolff JA: High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther 10:1735-1737, 1999

211. Kobayashi N, Kuramoto T, Yamaoka K, Hashida M, Takakura Y: Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures. J Pharmacol Exp Ther 297:853-860, 2001

212. Zhang G, Gao X, Song YK, Vollmer R, Stolz DB, Gasiorowski JZ, Dean DA, Liu D: Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery. Gene Ther 11:675-682, 2004

213. Kobayashi N, Nishikawa M, Hirata K, Takakura Y: Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery. J Gene Med 6:584-592, 2004

214. Kobayashi N, Matsui Y, Kawase A, Hirata K, Miyagishi M, Taira K, Nishikawa M, Takakura Y: Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression. JPharmacol Exp Ther 308:688-693, 2004

215. Giladi H, Ketzinel-Gilad M, Rivkin L, Felig Y, Nussbaum O, Galun E: Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Mol Ther 8:769-776, 2003

- 235 -

Bibliografia

216. Pruett SB, Fan R, Zheng Q: Acute ethanol administration profoundly alters poly I:C-induced cytokine expression in mice by a mechanism that is not dependent on corticosterone. Life Sci 72:1825-1839, 2003

217. Szkudelski T: The mechanism of alloxan and streptozotocin action in B cells of the rat pancreas. Physiol Res 50:537-546, 2001

218. Zeini M, Hortelano S, Traves PG, Gomez-Valades AG, Pujol A, Perales JC, Bartrons R, Bosca L: Assessment of a dual regulatory role for NO in liver regeneration after partial hepatectomy: protection against apoptosis and retardation of hepatocyte proliferation. Faseb J 19:995-997, 2005

219. Ruijter JM, Gieling RG, Markman MM, Hagoort J, Lamers WH: Stereological measurement of porto-central gradients in gene expression in mouse liver. Hepatology 39:343-352, 2004

220. Narvaiza I, Aparicio O, Vera M, Razquin N, Bortolanza S, Prieto J, Fortes P: Effect of adenovirus-mediated RNA interference on endogenous microRNAs in a mouse model of multidrug resistance protein 2 gene silencing. J Virol 80:12236-12247, 2006

221. Foufelle F, Ferre P: New perspectives in the regulation of hepatic glycolytic and lipogenic genes by insulin and glucose: a role for the transcription factor sterol regulatory element binding protein-1c. BiochemJ 366:377-391, 2002

222. Matsuzaka T, Shimano H, Yahagi N, Amemiya-Kudo M, Okazaki H, Tamura Y, Iizuka Y, Ohashi K, Tomita S, Sekiya M, Hasty A, Nakagawa Y, Sone H, Toyoshima H, Ishibashi S, Osuga J, Yamada N: Insulin-independent induction of sterol regulatory element-binding protein-1c expression in the livers of streptozotocin-treated mice. Diabetes 53:560-569, 2004

223. Hrebicek J, Janout V, Malincikova J, Horakova D, Cizek L: Detection of insulin resistance by simple quantitative insulin sensitivity check index QUICKI for epidemiological assessment and prevention. J Clin Endocrinol Metab 87:144-147, 2002

224. Shao J, Yamashita H, Qiao L, Friedman JE: Decreased Akt kinase activity and insulin resistance in C57BL/KsJ-Leprdb/db mice. J Endocrinol 167:107-115, 2000

225. Ono H, Katagiri H, Funaki M, Anai M, Inukai K, Fukushima Y, Sakoda H, Ogihara T, Onishi Y, Fujishiro M, Kikuchi M, Oka Y, Asano T: Regulation of phosphoinositide metabolism, Akt phosphorylation, and glucose transport by PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10) in 3T3-L1 adipocytes. Mol Endocrinol 15:1411-1422, 2001

226. Mitro N, Mak PA, Vargas L, Godio C, Hampton E, Molteni V, Kreusch A, Saez E: The nuclear receptor LXR is a glucose sensor. Nature 445:219-223, 2007

227. Kuznetsov AV, Strobl D, Ruttmann E, Konigsrainer A, Margreiter R, Gnaiger E: Evaluation of mitochondrial respiratory function in small biopsies of liver. Anal Biochem 305:186-194, 2002

- 236 -

Bibliografia

228. Dhaunsi GS, Singh I, Orak JK, Singh AK: Antioxidant enzymes in ciprofibrate-induced oxidative stress. Carcinogenesis 15:1923-1930, 1994

229. Nakae J, Cao Y, Daitoku H, Fukamizu A, Ogawa W, Yano Y, Hayashi Y: The LXXLL motif of murine forkhead transcription factor FoxO1 mediates Sirt1-dependent transcriptional activity. J Clin Invest 116:2473-2483, 2006

230. Zhang Q, Wang SY, Fleuriel C, Leprince D, Rocheleau JV, Piston DW, Goodman RH: Metabolic regulation of SIRT1 transcription via a HIC1:CtBP corepressor complex. Proc Natl Acad Sci U S A 104:829-833, 2007

231. Rodgers JT, Puigserver P: Fasting-dependent glucose and lipid metabolic response through hepatic sirtuin 1. Proc Natl Acad Sci U S A 104:12861-12866, 2007

232. Kim JK, Zisman A, Fillmore JJ, Peroni OD, Kotani K, Perret P, Zong H, Dong J, Kahn CR, Kahn BB, Shulman GI: Glucose toxicity and the development of diabetes in mice with muscle-specific inactivation of GLUT4. J Clin Invest 108:153-160, 2001

233. Zhao H, Yakar S, Gavrilova O, Sun H, Zhang Y, Kim H, Setser J, Jou W, LeRoith D: Phloridzin improves hyperglycemia but not hepatic insulin resistance in a transgenic mouse model of type 2 diabetes. Diabetes 53:2901-2909, 2004

234. Kjorholt C, Akerfeldt MC, Biden TJ, Laybutt DR: Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes 54:2755-2763, 2005

235. Browning JD, Horton JD: Molecular mediators of hepatic steatosis and liver injury. J Clin Invest 114:147-152, 2004

236. Accili D: Lilly lecture 2003: the struggle for mastery in insulin action: from triumvirate to republic. Diabetes 53:1633-1642, 2004

237. Monetti M, Levin MC, Watt MJ, Sajan MP, Marmor S, Hubbard BK, Stevens RD, Bain JR, Newgard CB, Farese RV, Sr., Hevener AL, Farese RV, Jr.: Dissociation of hepatic steatosis and insulin resistance in mice overexpressing DGAT in the liver. Cell Metab 6:69-78, 2007

238. Hansmannel F, Mordier S, Iynedjian PB: Insulin induction of glucokinase and fatty acid synthase in hepatocytes: analysis of the roles of sterol-regulatory-element-binding protein-1c and liver X receptor. Biochem J 399:275-283, 2006

239. Gregori C, Guillet-Deniau I, Girard J, Decaux JF, Pichard AL: Insulin regulation of glucokinase gene expression: evidence against a role for sterol regulatory element binding protein 1 in primary hepatocytes. FEBS Lett 580:410-414, 2006

- 237 -

Bibliografia

240. Drynan L, Quant PA, Zammit VA: Flux control exerted by mitochondrial outer membrane carnitine palmitoyltransferase over beta-oxidation, ketogenesis and tricarboxylic acid cycle activity in hepatocytes isolated from rats in different metabolic states. Biochem J 317 ( Pt 3):791-795, 1996

241. Kahn SE, Prigeon RL, Schwartz RS, Fujimoto WY, Knopp RH, Brunzell JD, Porte D, Jr.: Obesity, body fat distribution, insulin sensitivity and Islet beta-cell function as explanations for metabolic diversity. JNutr 131:354S-360S, 2001

242. Beale EG, Hammer RE, Antoine B, Forest C: Glyceroneogenesis comes of age. Faseb J 16:1695-1696, 2002

243. Fulgencio JP, Kohl C, Girard J, Pegorier JP: Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. BiochemPharmacol 62:439-446, 2001

244. Haigis MC, Guarente LP: Mammalian sirtuins--emerging roles in physiology, aging, and calorie restriction. Genes Dev 20:2913-2921, 2006

245. Sun C, Zhang F, Ge X, Yan T, Chen X, Shi X, Zhai Q: SIRT1 improves insulin sensitivity under insulin-resistant conditions by repressing PTP1B. Cell Metab 6:307-319, 2007

246. Bordone L, Motta MC, Picard F, Robinson A, Jhala US, Apfeld J, McDonagh T, Lemieux M, McBurney M, Szilvasi A, Easlon EJ, Lin SJ, Guarente L: Sirt1 regulates insulin secretion by repressing UCP2 in pancreatic beta cells. PLoS Biol 4:e31, 2006

247. Picard F, Kurtev M, Chung N, Topark-Ngarm A, Senawong T, Machado De Oliveira R, Leid M, McBurney MW, Guarente L: Sirt1 promotes fat mobilization in white adipocytes by repressing PPAR-gamma. Nature 429:771-776, 2004

248. Gerhart-Hines Z, Rodgers JT, Bare O, Lerin C, Kim SH, Mostoslavsky R, Alt FW, Wu Z, Puigserver P: Metabolic control of muscle mitochondrial function and fatty acid oxidation through SIRT1/PGC-1alpha. Embo J 26:1913-1923, 2007

249. Baur JA, Pearson KJ, Price NL, Jamieson HA, Lerin C, Kalra A, Prabhu VV, Allard JS, Lopez-Lluch G, Lewis K, Pistell PJ, Poosala S, Becker KG, Boss O, Gwinn D, Wang M, Ramaswamy S, Fishbein KW, Spencer RG, Lakatta EG, Le Couteur D, Shaw RJ, Navas P, Puigserver P, Ingram DK, de Cabo R, Sinclair DA: Resveratrol improves health and survival of mice on a high-calorie diet. Nature 444:337-342, 2006

250. Lagouge M, Argmann C, Gerhart-Hines Z, Meziane H, Lerin C, Daussin F, Messadeq N, Milne J, Lambert P, Elliott P, Geny B, Laakso M, Puigserver P, Auwerx J: Resveratrol improves mitochondrial function and protects against metabolic disease by activating SIRT1 and PGC-1alpha. Cell 127:1109-1122, 2006

251. Dasgupta B, Milbrandt J: Resveratrol stimulates AMP kinase activity in neurons. Proc Natl Acad Sci U S A 104:7217-7222, 2007

- 238 -

Bibliografia

252. Schwer B, Verdin E: Conserved metabolic regulatory functions of sirtuins. Cell Metab 7:104-112, 2008

253. Tilghman SM, Belayew A: Transcriptional control of the murine albumin/alpha-fetoprotein locus during development. Proc Natl Acad Sci U S A 79:5254-5257, 1982

254. De Souza AT, Dai X, Spencer AG, Reppen T, Menzie A, Roesch PL, He Y, Caguyong MJ, Bloomer S, Herweijer H, Wolff JA, Hagstrom JE, Lewis DL, Linsley PS, Ulrich RG: Transcriptional and phenotypic comparisons of Ppara knockout and siRNA knockdown mice. Nucleic Acids Res 34:4486-4494, 2006

255. Christoph T, Grunweller A, Mika J, Schafer MK, Wade EJ, Weihe E, Erdmann VA, Frank R, Gillen C, Kurreck J: Silencing of vanilloid receptor TRPV1 by RNAi reduces neuropathic and visceral pain in vivo. Biochem Biophys Res Commun 350:238-243, 2006

256. Groen AK, van Roermund CW, Vervoorn RC, Tager JM: Control of gluconeogenesis in rat liver cells. Flux control coefficients of the enzymes in the gluconeogenic pathway in the absence and presence of glucagon. Biochem J 237:379-389, 1986

257. Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J: Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108:193-199, 1991

258. Petrescu I, Bojan O, Saied M, Barzu O, Schmidt F, Kuhnle HF: Determination of phosphoenolpyruvate carboxykinase activity with deoxyguanosine 5'-diphosphate as nucleotide substrate. Anal Biochem 96:279-281, 1979

259. Salmon DM, Flatt JP: Effect of dietary fat content on the incidence of obesity among ad libitum fed mice. Int J Obes 9:443-449, 1985

260. Demoz A, Garras A, Asiedu DK, Netteland B, Berge RK: Rapid method for the separation and detection of tissue short-chain coenzyme A esters by reversed-phase high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Appl 667:148-152, 1995

261. Gujral JS, Knight TR, Farhood A, Bajt ML, Jaeschke H: Mode of cell death after acetaminophen overdose in mice: apoptosis or oncotic necrosis? Toxicol Sci 67:322-328, 2002

- 239 -

Success is going from failure to failure without loss of enthusiasm

Winston Churchill

PUBLICACIONS

Overcoming Diabetes-Induced Hyperglycemia throughInhibition of Hepatic Phosphoenolpyruvate

Carboxykinase (GTP) with RNAi

Alicia G. Gomez-Valades,1 Anna Vidal-Alabro,1 Maria Molas,1 Jordi Boada,1 Jordi Bermudez,1

Ramon Bartrons,2 and Jose C. Perales1,*

1Biophysics Unit and 2Biochemistry Unit, Department of Physiological Sciences II, IDIBELL–University of Barcelona,

Feixa Llarga s/n, 08907 LTHospitalet del Llobregat, Spain

*To whom correspondence and reprint requests should be addressed at the Departament de Ciencies Fisiologiques II,

Universitat de Barcelona, Feixa Llarga s/n, 08907 LTHospitalet, Spain. Fax: +34 93 4024268. E-mail: [email protected].

Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK; EC 4.1.1.32) is the rate-controlling enzyme ingluconeogenesis. In diabetic individuals, altered rates of gluconeogenesis are responsible forincreased hepatic glucose output and sustained hyperglycemia. Liver-specific inhibition of PEPCKhas not been assessed to date as a treatment for diabetes. We have designed a therapeutic,vector-based RNAi approach to induce posttranscriptional gene silencing of hepatic PEPCK usingnonviral gene delivery. A transient reduction of PEPCK enzymatic activity (7.6 F 0.6 vs 9.7 F 1.1mU/mg, P bbb 0.05) that correlated with decreased protein content of up to 50% was achievedusing this strategy in diabetic mice. PEPCK partial silencing was sufficient to demonstrate loweredblood glucose (218 F 26 vs 364 F 33 mg/dl, P bbb 0.001) and improved glucose tolerance togetherwith decreased circulating FFA (0.89 F 0.10 vs 1.44 F 0.11 mEq/dl, P bbb 0.001) and TAG (65 F 11 vs102 F 16 mg/dl, P bbb 0.01), in the absence of liver steatosis or lactic acidosis. SREBP1c was down-regulated in PEPCK-silenced animals, suggesting a role for this pathway in the alterations of lipidmetabolism. These data reinforce the significance of PEPCK in sustaining diabetes-inducedhyperglycemia and validate liver-specific intervention at the level of PEPCK for diabetes genetherapy.

Key Words: phosphoenolpyruvate carboxykinase, diabetes mellitus, hydrodynamic gene transfer,RNA interference, gluconeogenesis

INTRODUCTION

Gluconeogenesis is responsible for sustained productionof glucose in fasting animals [1,2]. Phosphoenolpyruvatecarboxykinase (PEPCK)3 catalyzes the formation of phos-phoenolpyruvate from oxaloacetate, the rate-controllingstep in the gluconeogenic pathway. In addition, asignificant role of the enzyme in the regulation of energyhomeostasis and flux through the TCA cycle has beenrecently demonstrated in a liver-specific gene-deletion

mouse model [3]. PEPCK is also involved in the control ofacid–base in the kidney [4,5], glyceroneogenesis inadipose tissue [5,6], and glutamine metabolism in smallintestine [5,7]. In diabetic individuals, altered rates ofgluconeogenesis are responsible for increased hepaticglucose output (HGO) and, therefore, sustained hyper-glycemia observed in both IDDM and NIDDM [8,9].Expression from the gene for cytosolic phosphoenolpyr-uvate carboxykinase (PEPCK-C) is induced during diabe-tes, both in animals and in human patients and thisinduction correlates with the increased rate of gluconeo-genesis in liver and kidney [10].

Several pathways involved in energy metabolism arealtered in the liver, adipose tissue, and muscle duringdiabetes. These alterations are secondary to a resistance toinsulin signaling (NIDDM) or a reduced concentration ofinsulin (IDDM). The mechanism of action of current

DTD 5

3Abbreviations used: PEPCK, phosphoenolpyruvate carboxyki-nase; NIDDM, non-insulin-dependent diabetes mellitus; IDDM,insulin-dependent diabetes mellitus; TZD, thiazolidinediones;Gly, glycogen; PKR, protein kinase R; poly(dI:dC), poly(deox-yinosine:deoxycytosine); ACC-P, phosphorylated acetyl-CoAcarboxylase, FAS, fatty acid synthase; SREBP1c, sterol regulatoryelement binding protein 1c.

YMTHE-03886; No. of pages: 10; 4C: 6

ARTICLEdoi:10.1016/j.ymthe.2005.08.026

ARTICLE IN PRESS

MOLECULAR THERAPY Vol. xx, No. xx, Month Year 1Copyright C The American Society of Gene Therapy

1525-0016/$30.00

drugs for the treatment of NIDDM, biguanides (e.g.,metformin) and thiazolidinediones (e.g., rosiglitazone)[11,12], induces an increase in insulin sensitivity inperipheral tissues and the liver. The antihyperglycemicaction of thiazolidinediones is a direct result of activationof the nuclear receptor peroxisome proliferator-activatedreceptor-g (PPAR-g) [13], whereas metformin has beenlinked directly to inhibition of liver gluconeogenesis[14,15]. However, these drugs activate upstream regula-tors (e.g., PPAR-g or AMP-K) that are involved in a broadrange of physiological functions [13,16–19].

Because of the theoretical potential of blocking HGOby means of a specific inhibition of a key enzymatic stepin the pathway, we have aimed at down-regulatinghepatic PEPCK-C. To accomplish this goal, we havedeveloped specific short-hairpin RNA (shRNA) reagentsto knock down PEPCK-C and achieved organ specificityusing liver-directed transfection. Silencing of endogenousgenes mediated by RNA interference is a conservedbiological process that can be used to induce experimen-tal sequence-specific gene silencing with either smallinterference duplexes (siRNA) or shRNA expression vec-tors. This kind of vector drives shRNA expression from ahuman U6 promoter and their efficacy has been demon-strated both in mammalian cells [20] and in mice afterhepatic hydrodynamic gene delivery [21].

We report here an efficient reduction in the levels ofmRNA, protein, and enzyme activity of hepatic PEPCK-Cin animals treated with specific shRNAs. As a result,plasma glucose of diabetic mice was reduced up to 40%,with no associated lactic acidosis or hepatic steatosis. Wedemonstrate that the inhibition of PEPCK-C gene expres-

sion using shRNA also results in alterations in lipidmetabolism, exemplified by reduced serum NEFA andtriglycerides (TAG) in parallel to a clear reduction of bothprecursor and mature forms of the key lipogenic tran-scription factor SREBP1c. Hence, liver-specific PEPCKgene silencing provides a novel therapeutic approachfor the treatment of diabetes.

RESULTS

PEPCK-C Gene Silencing by Means of shRNAExpression in VitroWe generated two mammalian expression cassettes con-taining the human U6 polymerase III gene promoterdriving expression of shRNAs (pSHAG vector) comple-mentary to both mouse and rat PEPCK-C transcripts. Bothsequenceswere designedwithhomology to a 29-bp stretchfrom nucleotides 482 and 664 of the cDNA (pSHAG-482and pSHAG-664, respectively). We used an equivalentcassette expressing a shRNA specific for a Photinus pyralisluciferase sequence (pSHAG-Ff) as a control.

We confirmed efficient silencing of the gene forPEPCK-C in Huh-7 cells using cotransfection experimentswith a constant amount of PEPCK-C expression vector(pC/PEPCK-C) and different molar ratios (1:6 and 1:12) ofthe silencing vectors (664, 482, or Ff). Cotransfection ofpSHAG-Ff, whatever the ratio used, never altered PEPCK-C activity or protein levels. In contrast, as shown in Fig.1, PEPCK-C activity and protein levels significantlydecreased when pSHAG-664 and pC/PEPCK-C plasmidswere cotransfected. The suppression of PEPCK-C wasclose to 80% as determined by enzyme activity and

FIG. 1. pSHAG-664 induces PEPCK gene silencing in vitro.

(A) pC/PEPCK-C (2.25 Ag) was cotransfected with different

molar ratios of pSHAG-664 (1:0 (striped), 1:6 (white), and

1:12 (gray)). As a control for nonspecific gene silencing

pSHAG-Ff was cotransfected at a 1:24 ratio (black). pBlue-

script was used as stuffer. As an internal transfection

control, 1 Ag of pGL3 was added to all plates. PEPCK-C

activity was measured 48 h after transfection and normal-

ized for luciferase activity. Data are expressed as relative

PEPCK activity (PEPCK activity/luciferase activity). (B)

Silencing was confirmed at the protein level using Western

blot. A representative blot is shown.

ARTICLE doi:10.1016/j.ymthe.2005.08.026

MOLECULAR THERAPY Vol. xx, No. xx, Month Year2Copyright C The American Society of Gene Therapy

ARTICLE IN PRESS

Western blot at both 1:6 and 1:12 molar ratios (Fig. 1),whereas pSHAG-482 inhibited PEPCK-C gene expressionwith a lower efficiency (data not shown).

Hepatic Gene Silencing in Vivo Using HydrodynamicGene TransferHydrodynamic gene transfer is an efficient and conven-ient method for preferential transfection of DNA to theliver [22,23]. Since we aimed at down-regulating hepaticPEPCK-C, hydrodynamic gene transfer seemed an appro-priate tool to achieve our objective. We, therefore,assessed the efficiency of shRNA silencing in vivo usinga validation model whereby luciferase gene expression inthe liver was induced by transfection of a luciferaseexpression vector (pGL3) cotransfected with pSHAG-Ff, aluciferase-specific silencing vector. Luciferase activity wasinhibited by about 98% in mice treated with pSHAG-Ffcompared with animals injected with reporter vectoralone or nonspecific pSHAG (Fig. 2). Luciferase activitywas undetectable in kidney extracts after pGL3 injection(data not shown). This experiment demonstrates specificand efficient silencing in the liver mediated by shRNAand validates the experimental system.

Specific Silencing of Endogenous PEPCK-C in HealthyAnimalsWe demonstrated silencing of endogenous PEPCK-C geneexpression in healthy animals 24 h after tail vein injectionwithpSHAG-664plasmid.Wenoted a reduction in PEPCK-C mRNA content independent of the nutritional status(fed or 24 h fasted) and it was statistically significant (40%reduction) in fed animals (Fig. 3A). Moreover, hepaticPEPCK-C activity after 24 h fasting was decreased by 30%compared with pSHAG-Ff (20 F 1.98 vs 28.5 F 1.89 mU/mg protein, n = 4, P b 0.05) (Fig. 3B). We found no

significant reduction in PEPCK-C activity or protein inkidney compared with pSHAG-Ff or saline groups (datanot shown). In the liver, and correlating with effectsobserved on mRNA content and enzymatic activity,protein levels were also reduced as determined byWesternblot analysis (Fig. 3C). These animals remained euglyce-mic and euinsulinemic, and we noted no lactic acidosis orchange in serum or hepatic lipids (data not shown).

Silencing of Liver PEPCK-C in Streptozotocin-TreatedAnimalsTo assess whether the inhibition of PEPCK-C in the livercould be a feasible strategy to overcome fasting hyper-

FIG. 3. PEPCK-C gene silencing in healthy mice. Analysis of the silencing

capacity of pSHAG-664 in nondiabetic mice assessed at the mRNA, enzyme

activity, and protein levels. Mice were injected in the tail vein with 10% (w/v)

physiological saline solution containing 100 Ag of either pSHAG-664 or

pSHAG-Ff plasmid. Silencing of PEPCK-C was assayed 24 h later. (A) Hepatic

PEPCK mRNA content was analyzed from fed and 24-h fasted mice by

Northern blot and is represented as the relative amount of PEPCK-C mRNA

with respect to GAPDH mRNA. (B) Specific PEPCK activity in liver extracts from

fasted animals is presented. Values are expressed as the means F SE (n = 4,

*P b 0.05). (C) Further confirmation of PEPCK silencing was obtained by

analysis of the PEPCK-C protein content by Western blot. Representative blots

are shown (n = 4).

FIG. 2. Liver-specific RNAi-induced gene silencing using hydrodynamic gene

transfer. Luciferase expression vector pGL3 (10 Ag) was co-injected with

specific (pSHAG-Ff) or nonspecific (pSHAG-664) shRNA at a 1:6 molar ratio,

using the hydrodynamic method. Luciferase activity was assayed 72 h later in

liver extracts (n = 3).



ARTICLE IN PRESS

glycemia in diabetic animal models and to study themetabolic implications of such inhibition, we introducedpSHAG-664 into the liver of streptozotocin (STZ)-treatedmice. At the time of injection, mice were hyperglycemic(N400 mg/dl) and weighed 20–25 g. Only animals thatmaintained their weight above 20 g during the course ofthe experiment were further analyzed. We used 3-mercap-topicolinic acid (3-MPA), a well-known noncompetitiveinhibitor of PEPCK-C, as a positive control for the systemicinhibition of gluconeogenesis in these animals.

We carried out tail vein injections with 100 Ag ofpSHAG-Ff or pSHAG-664. We analyzed weight andglycemia at 48 and 72 h postinjection after a short fast.We observed the greatest hypoglycemic effect 2 days aftertreatment with pSHAG-664, when fasting blood glucoseconcentration was dramatically reduced (40%) comparedto control (pSHAG-Ff) animals (218 F 26 vs 364 F 33 mg/dl, n = 26 and n = 25, P b 0.001), similar to 3-MPA-treateddiabetic mice (149 F 30 mg/dl). Overt hypoglycemia(blood glucose concentration below 30 mg/dl) was notobserved in any of the animals treated. Three days aftertreatment glycemia in the treated group was reduced byapproximately 25% (350 F 68 vs 476 F 35 mg/dl, n = 10and n = 12, P = 0.05) (Fig. 4A). These data suggest aprogressive loss of expression from the injected vectorDNA in good agreement with previously reported tran-sient expression of silencing vectors introduced byhydrodynamic gene transfer [24].

In addition, we performed an intraperitoneal glucosetolerance test 48 h after injection of pSHAG expressionvector. At the time of initiation of the experiment, thefasting glucose concentration in treated animals (pSHAG-664) was about 40% lower than in controls (pSHAG-Ff)(111 F 30 vs 272 F 47 mg/dl, P b 0.01, n = 5). Diabeticanimals treated with pSHAG-664 showed a normalizedglucose tolerance compared to healthy mice (Fig. 4B).

PEPCK-C protein content in the liver, as analyzedusing Western blot, was also transiently silenced, corre-lating with significant enzyme activity changes (approx-imately 20% decrease) demonstrated 72 h after injection(9.7F 1.1 vs 7.6F 0.6 mU/mg protein, n = 9 and n = 7, P b0.05) (Fig. 5).

The concentrations of TAG and free fatty acids (FFA) inserum were significantly lower in PEPCK-silenced animals48 h after injection. This reduction was also transient; weobserved no differences at 72 h postinjection. Accom-panying the decrease in serum FFA, we observed anonsignificant increase in serum h-hydroxybutyrate(h-HBA) (Table 1). Liver glycogen content was dramati-cally decreased at 48 h, whereas we observed a lesspronounced reduction 72 h after treatment. In addition,we observed a significant increase in the activity oflactate dehydrogenase (LDH) 72 h after injection.

To gain insight into the regulatory mechanismsinvolved in altered lipid metabolism in the livers oftreated animals, we performed specific immunoblotting

against key regulatory proteins involved in lipogenesis(SREBP1c and FAS) and fatty acid h-oxidation (ACC-P) inwhole liver extracts (Fig. 5). A very profound down-regulation of SREBP1c, precursor (p125) and mature (p68)forms, paralleled PEPCK silencing, whereas we found nosignificant changes in ACC-P or FAS. Densitometricanalysis of the blots demonstrated an 82 and 38%reduction in p125 and p68 SREBP1c forms, respectively.

Green Fluorescent Protein (GFP) Expression andPEPCK-C Immunohistochemistry afterHydrodynamic Gene TransferTo assess whether the percentage of hepatocytes trans-fected using the hydrodynamic procedure correlates withsilencing efficiency of endogenous PEPCK-C, we injected

FIG. 4. Blood glucose and glucose tolerance after silencing PEPCK-C in the

livers of diabetic animals. (A) Streptozotocin-induced diabetic mice received

an intravenous injection as explained under Materials and methods with 100

Ag of either pSHAG-Ff (solid bars) or pSHAG-664 (empty bars). Glycemia at 48

h (pSHAG-Ff, n = 26, and pSHAG-664, n = 25, ***P b 0.001) and 72 h

(pSHAG-Ff, n = 12, and pSHAG-664, n = 10, P = 0.05) in 8-h fasted animals is

presented. Results are expressed as relative glycemia. (B) A glucose tolerance

test was performed at 48 h after hydrodynamic gene transfer by ip injection of

a glucose bolus (1 mg/g) in pSHAG-Ff (filled squares), pSHAG-664 (empty

squares), and healthy control animals (empty circles). Values are the means FSE (n = 5, **P b 0.01).



ARTICLE IN PRESS

diabetic mice with various amounts of pEGFP. Weassessed hepatic distribution of GFP and PEPCK-C pro-teins using direct (GFP) and indirect (PEPCK immunohis-tochemistry) fluorescence under confocal microscopy 48h after the injection. Compared with uninjected animals,GFP expression was easily detected in liver sections andthe amount of GFP-positive cells increased with the doseof DNA injected (Figs. 6A and 6B). More intense PEPCK-Cimmunostaining was localized in the periportal zone,which is characteristic of this gene. Strikingly, GFP-positive hepatocytes were localized in the lower part ofthe gradient of PEPCK-C immunoreactivity (perivenousand intermediate zone), with a broader distributionapparent when a higher dose of plasmid was injected(Figs. 6C and 6D). These data are consistent with gene

FIG. 5. PEPCK-C silencing in the liver of diabetic mice. Mice received an

intravenous injection of pSHAG-Ff or pSHAG-664 (100 Ag). Liver extracts

were prepared from animals at 48 and 72 h after injection as described

under Materials and Methods. PEPCK content was analyzed by Western blot

and enzymatic activity. In addition, the level of a number of key proteins

involved in the regulation of energy metabolism was analyzed. (A)

Representative blots from independent experiments are shown. (B) PEPCK

specific activity 72 h after the injection is shown. Values are the means F SE

(*P b 0.05).

TABLE1:Metabolic

profile

afterpartialliverPEPCK-C

silencingin

diabeticmice

Blood

Serum

Liver

Gluco

se

(mg/dl)

TAG

(mg/dl)

h-H

BA

(mmol/L)

FFA

(mEq/L)

Lactate

(mg/dl)

Insulin

(Ag/L)

GPT

(U/L)

TAG

(mg/g)

LDH

(mU/m

g)

Gly

(mM/g)

48h

pSHAG-Ff

(meanF

SE)

364F

33

102F

16

0.25F

0.08

1.44F

0.11

73.6

F7.9

0.11F

0.04

112F

16

12.7

F0.5

nd

43.9

F5.2

PSHAG-664

(meanF

SE)

218F

26***

65F

11**

0.38F

0.14

0.89F

0.10***

63.4

F6.0

0.13F

0.02

142F

21

13.1

F0.3

nd

12.7

F7.0**

72h

pSHAG-Ff

(meanF

SE)

476F

35

83.8

F10.8

0.19F

0.05

1.1

F0.2

41.3

F6.4

nd

36.9

F6.4

13.3

F0.7

10.1

F0.0

49.9

F3.6

PSHAG-664

(meanF

SE)

350F

68

(P=0.05)

89.4

F14.1

0.24F

0.11

1.3

F0.4

44.2

F9.9

nd

47.0

F8.9

11.2

F0.6

13.8

F0.0**

30.5

F8.0*

Streptozo

tocin-induceddiabeticmicewere

injectedwith100Ag

ofpSHAG-FforpSHAG-664.Liverandserum

metabolitemeasurementswere

perform

edatdifferenttimes(48and72h)asdescribedunderMaterialsandmethods.Data

are

meansF

SEof7–12anim

alsexceptforbloodgluco

se(n

=26pSHAG-Ffandn=25pSHAG-664).nd,notdeterm

ined.

*Pb0.05.

**Pb0.01.

***

Pb0.001.



ARTICLE IN PRESS

transfer to an area corresponding to the perivenous andintermediate hepatic acinus regions and are in agreementwith the metabolic zonation of the liver [25]. From theseresults onemight infer that the relative distribution in theliver lobule of hepatic PEPCK-C and transgene expressionusing hydrodynamic gene transfer might provide anexplanation for the partial silencing of hepatic PEPCK-Creported here. Nevertheless, it is important to note thatafter pSHAG-664 transfection (100 Ag/animal), PEPCK-Cimmunostaining is reduced globally (Figs. 6E and 6F); thatis, the periportal–perivenous intensity gradient is partiallylost, suggesting that PEPCK-C is being knocked down notonly in the perivenous and intermediate zone, but also inthe periportal area.

Nonspecific Gene Silencing via PKR/InterferonPathwaySystemic and/or nonspecific suppression of transcriptiondue to dsRNA-induced PKR/interferon stress response hasbeen previously demonstrated using specific siRNAsequences and RNAi vectors [26,27]. To discard theinduction of this pathway in treated animals, we inves-tigated the level of activation of downstream targets ofPKR, i.e., increased phosphorylation of the eukaryoticinitiation factor 2a (eIF2a) in liver extracts [26] and theproduction of IL-12 [28].

We used poly(dI:dC), a well-known dsRNA analogue,as a positive control for PKR-dependent stimulation ofeIF2a phosphorylation in the liver. We observed thatpoly(dI:dC) injection induced 3- to 26-fold higher levelsof phosphorylated eIF2a compared to pSHAG treatment.Moreover, treatments with shRNA vectors did notincrease the level of eIF2a phosphorylation comparedwith control saline-injected animals (Fig. 7A). eIF2aactivation (ratio of phosphorylated over total protein)was comparable among the various pSHAG-injected(both Ff and 664 groups) and control (saline-injected)livers. Furthermore, the levels of IL-12 in plasma were notaltered by pSHAG gene transfer (data not shown),altogether discarding nonspecific silencing induced by aPKR/interferon-mediated response.

Hydrodynamic gene transfer has also been shown toinduce transient liver damage [23] resulting in increasedserum transaminase levels immediately after injectionand a return to near normal levels by 48–72 h. However,the degree of damage induced by hydrodynamic genetransfer in the liver of STZ-administered mice has notbeen assessed to date. Therefore, to discard nonspecificeffects due to gene transfer we have performed bothserum transaminase (GPT) measurements and caspase 3activation analysis in whole-cell liver extracts fromtreated animals. The levels of GPT were significantlyabove saline ip-injected controls (27.0 F 2.4, n = 5) 48 hafter injection and returned to control values by 72 h(Table 1). Importantly, we observed no significant differ-ences between transfected groups at either time point. Inaddition, we investigated long-term deleterious conse-quences on hepatocyte viability using a general apoptosisinduction analysis involving the determination of cas-pase 3 activity in whole-cell liver extracts (Fig. 7B). Thesedata demonstrated that gene transfer by hydrodynamicinjection did not induce apoptosis compared to saline ip-injected controls in marked contrast with galactosamine/lipopolysaccharide (LPS) induction [29] used as a positivecontrol.

DISCUSSION

Pharmacological intervention in diabetes focuses on aseries of targets, including h-cell function (sulfonylur-eas) [30], FFA reesterification in adipose tissue (TZD),

FIG. 6. Zonal expression in the liver after hydrodynamic gene delivery

promotes partial PEPCK-C silencing throughout the liver parenchyma. Mice

were injected with either (A to D) 10 or 20 Ag of pEGFP or (E and F) 100 Ag of

pSHAG using the hydrodynamics procedure. Direct visualization of GFP

(green) and indirect immunodetection of PEPCK (red) on fixed liver sections

were analyzed using confocal microscopy. (A and B) correspond to

representative fields of hepatic GFP distribution after hydrodynamic gene

transfer at either 10 or 20 Ag dose, respectively. Colocalization of GFP and

PEPCK signals at the indicated doses (C, 10 Ag, and D, 20 Ag) in fixed liver

sections is also shown. Representative PEPCK immunostaining after trans-

fection of 100 Ag pSHAG-Ff (E) or pSHAG-664 (F) is shown. Original

magnification, 200�.



ARTICLE IN PRESS

insulin sensitivity in the muscle (TZD) [13,31], andglucose output in the liver (metformin) [15,32]. Despiterecognition through extensive investigation of thecritical role that PEPCK exerts in controlling gluconeo-genesis in the liver [1,3,9,33,34], the validation of thisenzyme as a target for liver-specific gene therapy orpharmacological intervention in diabetes has not beenextensively investigated to date. Therefore, we havedeveloped a therapeutic, vector-based RNAi approach invivo to validate liver PEPCK as a target for diabetes genetherapy.

Silencing vectors (Fig. 1), together with liver-specificgene transfer (achieved using a hydrodynamic-basedprocedure) (Fig. 2), provide the model to evaluate theefficacy and metabolic alterations induced by PEPCKinhibition in the liver. Initially, we confirmed that thesilencing vector was able to down-regulate endogenousPEPCK in healthy mice. These data demonstrated anincreased capacity to silence PEPCK-C in fed (Fig. 3A)versus fasted animals, probably related to increased targetmRNA levels after transcription up-regulation of PEPCK-C induced by fasting [25]. Nevertheless, even in fastedanimals, a significant reduction in PEPCK-C activity andprotein was detected after injection of pSHAG-664although the reduction of PEPCK-C mRNA was signifi-cant only in fed animals (Fig. 3). This reduction was notaccompanied by changes in carbohydrate or lipid metab-olites in healthy mice, as expected from a partialinhibition of the gene and in contrast to results obtainedby a complete ablation of hepatic PEPCK-C [3].

In diabetic animals, treatment with pSHAG-664silencing vector also showed a significant reduction inPEPCK protein and enzyme activity that correlated witha significant reduction of blood glucose levels andimproved glucose tolerance in the absence of insulin orstimulation of insulin release by the treatment (Table 1).Such a large impact in glucose homeostasis after a partialreduction in liver PEPCK-C reinforces the importance ofthis gluconeogenic enzyme in sustaining fasting hyper-glycemia in diabetes [9,14,35]. Apart from a clearhypoglycemic effect, partial silencing of liver PEPCK-Cdemonstrated several other metabolic consequences.Liver glycogen and serum FFA and TAG were signifi-cantly reduced, concomitant with increased liver LDHactivity and a tendency toward increased serum h-HBA.The implications of these changes are severalfold. First ofall, a decrease in glycogen stores in treated animalsmight reflect a diminished glycogen synthesis fromgluconeogenic precursors, in agreement with previousobservations describing a liver-specific PEPCK-C knock-out [3]. Second, lower plasma FFA, correlating withincreased serum h-HBA levels, suggests a higher rate ofFFA uptake and h-oxidation. These data might bepartially explained by the maintenance of O2 consump-tion observed in perfused liver after acute inhibition ofgluconeogenesis [36], an indirect measure of the level ofh-oxidation in gluconeogenic liver. Increased FFA oxida-tion could be secondary to an increase in eithermitochondrial or extramitochondrial (peroxisomal) oxi-dation. Immunoblotting analysis of key targets of regu-latory pathways involved in energy metabolism such asphosphorylated ACC, FAS, and SREBP1c have confirmedno significant changes in the level of ACC phosphor-ylation. On the other hand, SREBP1c, both precursor(p125) and mature (p68) forms, were very significantlyreduced, suggesting an inhibition of its transcription andarguing for an inhibitory effect of elevated concentra-

FIG. 7. PKR/interferon or apoptosis pathways are not activated upon pSHAG

hydrodynamic injection. Positive control (C+) for PKR/interferon pathway

activation was obtained from liver extracts of diabetic mice injected ip with 50

Ag of a dsRNA analogue (poly(dI:dC)). Negative controls (C�) were saline-

injected mice. eIF2a and eIF2a-P were detected by Western blot performed

with liver extracts from the various groups. (A) Results are presented as the

ratio of the phosphorylated form versus total eIF2a after densitometric analysis

of the blots (n = 5). (B) Caspase 3 activity in liver extracts from healthy mice

following hydrodynamic injection of with 100 Ag of either pSHAG Ff or pSHAG

664 (n = 7). Positive control for hepatic apoptosis induction was obtained

from liver extracts of mice injected ip with 700 mg/kg galactosamine and 100

mg/kg LPS (n = 3). Negative controls were ip saline-injected mice (n = 3).



ARTICLE IN PRESS

tions of fatty acids on glucose metabolism and lipo-genesis [37]. Animals treated with streptozotocin at thedoses utilized in these experiments have remarkably lowlevels of insulin (Table 1). However, insulin-independentexpression of SREBP1c in liver extracts of STZ-treatedmice has been previously described [38] and is alsoapparent in the liver of mice shown here (Fig. 5).Therefore, glucose metabolism is sufficiently active tosustain a certain level of glucose uptake [38] that couldbe diverted from lipogenesis to glycolysis after SREBP1cinhibition in pSHAG 664 injected animals. It is thereforetempting to speculate that a yet to be identified energysensing mechanism would induce FFA uptake andactivation, resulting in down-regulation of SREBP1c thatin turn would inhibit TAG synthesis and release from theliver. In fact, the ratio of ACC-P/SREBP1c in PEPCK-silenced animals is much higher, suggesting an increasedflux from FFA synthesis to oxidation. Conversely, asignificant reduction in glycemia as observed uponPEPCK partial silencing would down-regulate SREBP1ctranscription indirectly since plasma glucose levels canaffect the levels of SREBP1c directly in the liver ofstreptozotocin-treated mice [38].

In the present report we show transient silencing usinghydrodynamic gene transfer of RNAi-inducing vectors, inagreement with the reported duration of gene expressionafter hydrodynamic transfection (72–96 h) [24]. However,we cannot rule out that the transitory biological effectobserved is due to a feedback regulation responsible forsteady-state maintenance of gluconeogenesis upon stim-ulation of PEPCK transcription.

We and others [22,39] have shown up to 40%hepatocyte transfection using this procedure, althoughthe zonal distribution of hepatocyte delivery has notbeen reported to date. This issue is of special importancedue to metabolic zonation of PEPCK-C (a decreasinggradient through the portocentral axis) in the liver [40].Nevertheless, during fasting or diabetes the absoluteincrease in the concentration of PEPCK mRNA is similarthroughout the liver [25]. Our results show extensiveimmunolocalization of PEPCK throughout the entireliver and quantitative compartmentalization of PEPCK-C in periportal hepatocytes, whereas GFP expression afterhydrodynamic injection colocalizes to a discrete com-partment corresponding to a more perivenous zone (Fig.6). Nevertheless, the distribution and levels of transgeneexpression broaden in a dose-dependent manner as seenby the increasing number of GFP-expressing hepatocytesobtained when injecting 20 Ag versus 10 Ag of thereporter plasmid. Consequently, upon injection of 100Ag of therapeutic plasmids, silencing of the endogenousPEPCK-C gene might achieve a broader distribution. Infact, direct immunohistochemistry for PEPCK-C afterhydrodynamic gene transfer of 100 Ag of pSHAG showedlower immunostaining throughout the liver parenchymawith a partial loss of the portocentral PEPCK-C gradient.

Taking into consideration the concept of metaboliczonation in the liver and the incomplete colocalizationof the transgene and PEPCK-C, one might infer that thecombination of shRNA expression vectors and hydro-dynamic gene transfer would lead to a partial silencing ofthe hepatic PEPCK-C. Data presented in this articleconfirm this possibility.

This study demonstrates acute effects of a partialreduction of gluconeogenesis in the diabetic liver. There-fore, it is not clear whether the changes observed could besustained over time in this model. However, preliminarydata from our group suggest that a longer lastingexpression of pSHAG-664 in diabetic db/db mice resultsin a significant decrease in glycemia, as well as weightgain, both in fed and in fasted animals, that wasmaintained for as long as 7 days. All in all, these datasupport the notion that PEPCK-C not only is a gluconeo-genic enzyme, but also has an important role in cataple-rosis [5], glyceroneogenesis, and the triglyceride cycleflux control [41], and its deregulation is implicated in thedevelopment of obesity and diabetes [35].

MATERIALS AND METHODS

Chemicals. Polyethylenimine (PEI) was from Aldrich (PEI 25,000 Da; Cat.

No. 40,872-7; Steinheim, Germany). Media, sera, and antibiotics were

obtained from Life Technologies, Inc. (Grand Island, NY, USA). Poly(dI:dC)

was purchased from Amersham Biosciences Corp. (Piscataway, NJ, USA)

and 3-MPA from Toronto Research Chemicals, Inc. (North York, ON,

Canada). Galactosamine and LPS from Escherichia coli 0111:B4 were from

Sigma (St. Louis, MO, USA).

Plasmids. pEGFP was purchased from Clontech (Palo Alto, CA, USA) and

contains an early cytomegalovirus promoter and an enhanced green

fluorescent protein. The firefly (P. pyralis) luciferase reporter vector

(pGL3) was obtained from Promega (Madison, WI, USA). The cDNA for

rat cytosolic PEPCK-Cwas kindly provided byDr. RichardW.Hanson (Case

Western Reserve University, Cleveland, OH, USA) and it was cloned into

the BamHI–BglII site of a pCAGGS vector (pC/PEPCK), which allows high

levels of transgene expression [42]. Short-hairpin RNA expression vectors

pSHAG-Ff and pSHAG-1 were a kind gift from Dr. Greg Hannon (Cold

Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, NY,USA). pSHAG-1 contains

the U6 promoter region from �265 to +1, a cloning site for short-hairpin

RNAs (BamHI–BseRI), and a U6 terminator sequence. pSHAG-Ff contains the

U6 promoter followed by a short-hairpin RNA directed against P. pyralis

luciferase [20,43]. Two shRNAsets of oligonucleotides targetedagainst rat and

mouse PEPCK-CmRNAwere designedutilizing a published algorithm [20,43]

available at http://katahdin.cshl.org: 9331/siRNA/html/shrna. The first

shRNA targeted a sequence that starts at nucleotide 482 from the start site

of translation (5V-CATGCTGGCCACCACATAGGGCGAGTCTGAAGCTTGA-

GACTCGTCCTATGTGGTGGCCGGCGTGTGGTTTTTT-3V and 5V-GAT-

CAAAAAACGGTGAGCCATACTCAGCCAATGCGCCAGATCAAGCTT-

CACCTGGCGCACTGGCTGAGCATGGCCCACG-3V). The second targeted a

sequence that starts at nucleotide 664 from the start site of translation

(5V-AGGAGATGATCTCTCTGCGGTCCGGGAGAAGCTTGTTCCGGATCG-

CAGGGAGATTATCTCCTTCGGTTTTTT-3Vand 5V-GATCAAAAAACCGAAG-

GAGATAATCTCCCTGCGATCCGGAACAAGCTTCTCCTGGACCGCAGA-

GAGATCATCTCCTTCG-3V). Each pair of primers was annealed and cloned

into BamHI–BseRI of pSHAG-1. The plasmids obtained were named pSHAG-

482 and pSHAG-664, respectively.

Plasmid DNA was prepared using Endo-Free (Sigma) or Macherey–

Nagel (Dqren, Germany) Maxi Prep kit and contained no detectable

bacterial genomic DNA or RNA contamination by DNA gel electro-



ARTICLE IN PRESS

phoresis. Plasmid DNA preparations had less than 20% open circular or

linear DNA.

Cell culture. For in vitro assays, the human hepatoma cell line Huh-7 was

maintained in DMEM supplemented with 5 mM glutamine, 100 units/ml

penicillin, 0.1 mg/ml streptomycin, and 10% fetal bovine serum. Cells

were transfected at 30–50% confluence using PEI in 10-cm diameter

plates.

Animal care and treatment.Male ICR (CD1) mice purchased from Harlan

Interfarma IBERICA S.L (Spain) were maintained under a constant 12-h

light–dark cycle and fed a standard rodent chow and water ad libitum. All

animal protocols were approved by the Ethics Committee at the

University of Barcelona.

Mice weighing 22–25 g were made diabetic with a single ip injection

of 200 mg/kg streptozotocin in 100 mM citric/citrate buffer, pH 4.5. One

week later, glycemia was assessed after a 6-h fast. Only those mice that

had concentrations of blood glucose over 400 mg/dl were used in this

study.

Hydrodynamic gene transfer was as described by Liu et al. [22]. Only 5

of 35 animals injected with shRNA-664 did not respond to hydrodynamic

gene delivery in terms of decreased postinjection glycemia, probably due

to the variability intrinsic to this procedure [22] and to noted problems

during injection. Therefore, only those animals that responded to the

injection were subsequently analyzed.

3-MPA was injected into diabetic animals as described elsewhere [44].

Briefly, 3-MPA was administered in a 1% (w/v) starch suspension to 2-h

fasted mice. An initial dose of 100 mg/kg, followed 3 h later by a second

dose of 25 mg/kg, was administered by intraperitoneal injection. Blood

glucose was analyzed 5 h later.

Galactosamine/LPS has been shown to produce extensive hepatocel-

lular apoptosis in mice [45] and was used as a positive control. Control

mice (20–25 g) were injected ip with 700 mg/kg galactosamine and 100

mg/kg LPS in 200 Al of saline. Negative control animals were injected with

an equivalent volume of saline. Animals were killed 6 h after.

Animals were killed after ketamine–xylazine anesthesia or CO2

inhalation, and liver and kidney were dissected and snap frozen in liquid

nitrogen. Tissues were stored at �808C until analysis. Blood was taken by

heart puncture and serum was obtained by centrifugation at 2500 rpm at

48C for 15 min.

Confocal microscopy. Four percent buffered paraformaldehyde-fixed

tissue was cut into 50-Am sections using a Leica VT M1000 slicing blade

microtome. GFP was detected in sections using a spectral confocal

microscope (Leica TCS-SL). PEPCK-C was immunostained using indirect

immunofluorescence with a sheep anti-PEPCK-C primary antibody

(kindly provided by Dr. Daryl Granner, Vanderbilt University) at a

1:1000 dilution followed by a donkey (1:200 dilution) anti-sheep anti-

body conjugated to Alexa Fluor 546 (Molecular Probes, Europe BV,

Leiden, The Netherlands).

Enzyme activity assays. Liver extracts were obtained using a Polytron in

appropriate lysis buffer. PEPCK activity was measured spectrophotometri-

cally by coupling the conversion of phosphoenolpyruvate to oxaloacetate

by PEPCK to the subsequent conversion to malate by malate dehydrogen-

ase as described previously [46]. Activity was expressed as mUnits/mg

protein in the supernatant. Caspase 3 activity assay was performed using a

fluorometric assay essentially as described [47].

Western blot. Western blot was performed with 50 Ag of cell protein

extract from cultured cells or 20 Ag from liver or kidney extracts in RIPA

buffer. Proteins were separated in 10% SDS–PAGE and transferred to an

Immobilon membrane (Millipore Corp., Bedford, MA, USA).

Sheep anti-PEPCK-C antiserum was used at a 1:20,000 dilution.

Antibodies against eIF2a-P Ser51 (Oncogene Research Products, San

Diego, CA, USA) and ACC-P (Ser79) (Upstate Biotechnology, Lake

Placid, NY, USA) were used at a 1:1000 dilution. FAS antibody (Santa

Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) was used at 1:500. All

membranes were normalized using monoclonal anti-a-tubulin (1:4000)

(Sigma) or anti-MAPK (1:2000) antibodies (New England Biolabs, Inc.,

Hitchin, UK).

RNA isolation and Northern blot. Total RNA was isolated using Ultraspec

RNA (Biotecx, Houston, TX, USA). The PEPCK-C probe used was a BamHI–

BglII fragment (1.5 kb) from the rat cDNA. Loading differences were

normalized using a GAPDH-specific probe.

Analytical procedures. Blood glucose levels were measured using a

Glucocard Memory 2 apparatus (A. Menarini, Inc., Florence, Italy). Blood

was collected from the tail tip. Unless indicated otherwise, animals were

fasted for 8 h prior to blood and specimen collection.

The concentration of FFA in serum was measured using a NEFA C kit

(Wako, Pure Chemical Industries, Osaka, Japan). Serum triglycerides,

lactate, and h-hydroxybutyrate were quantified using a colorimetric kits

(Sigma). Some measurements of metabolites were performed by the

Clinical Biochemistry Service from the Veterinary Hospital in Bellaterra,

Spain. Serum insulin and IL-12 were determined using mouse insulin

(healthy animals) and ultrasensitive mouse insulin (diabetic animals)

ELISAs (Mercodia AB, Uppsala, Sweden) and a mouse IL-12 ELISA (Bender

MedSystems, San Bruno, CA, USA), respectively.

To determine hepatic glycogen content, livers were homogenized in

400 mM acetic/acetate buffer, pH 4.8, and boiled for 15 min. The

homogenates were centrifuged for 5 min at 6000g. The supernatant was

digested with 1 unit of a-amiloglucosidase from Leuconostoc (Sigma) and

the glucose produced was quantified using a glucose oxidase kit (Sigma).

The hepatic TAG content was quantified using a TAG kit (Sigma) from 3M

KOH, 65% ethanol extracts based on the method of Salmon and Flatt for

liver saponification.

LDH activity was measured from liver extracts (50 mM Tris, 0.1%

Triton X-100, 2.5 mM DTT) using a LDH kit (Roche, Indianapolis, IN,

USA).

Transaminase (GPT) levels in serum were quantified using a Reflotron

system (Roche).

Statistics. Results are expressed as the means F standard error. Statistical

analysis was always performed by one-way analysis of variance and

StudentTs t test. A P b 0.05 was considered significant.

ACKNOWLEDGMENTS

The authors are indebted to Dr. Richard W. Hanson for helpful discussions and

reviewing the manuscript. A. G. Gomez-Valades and A. Vidal-Alabro were

supported by fellowships awarded from F.P.U., the Ministerio de Educacion y

Ciencia (Spain), and F.I., DURSI, Generalitat de Catalunya, respectively. This

study was supported by grants from the Ministerio de Ciencia y Tecnologıa

(Spain) (SAF02-02964 and BFI03-02539) and the Fundacio Marato de TV3

(031633). We also thank the Research Support Services from the Biology Unit of

Bellvitge, University of Barcelona, for their technical assistance.

RECEIVED FOR PUBLICATION MARCH 10, 2005; REVISED AUGUST 31, 2005;

ACCEPTED AUGUST 31, 2005.

REFERENCES1. Landau, B. R., Wahren, J., Chandramouli, V., Schumann, W. C., Ekberg, K., and Kalhan,

S. C. (1996). Contributions of gluconeogenesis to glucose production in the fasted

state. J. Clin. Invest. 98: 378 –385.

2. Katz, J., and Tayek, J. A. (1998). Gluconeogenesis and the Cori cycle in 12-, 20-, and

40-h-fasted humans. Am. J. Physiol. 275: E537 – E542.

3. She, P., Shiota, M., Shelton, K. D., Chalkley, R., Postic, C., and Magnuson, M. A.

(2000). Phosphoenolpyruvate carboxykinase is necessary for the integration of hepatic

energy metabolism. Mol. Cell. Biol. 20: 6508 –6517.

4. Curthoys, N. P., and Gstraunthaler, G. (2001). Mechanism of increased renal gene

expression during metabolic acidosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 281: F381 – F390.

5. Owen, O. E., Kalhan, S. C., and Hanson, R. W. (2002). The key role of anaplerosis and

cataplerosis for citric acid cycle function. J. Biol. Chem. 277: 30409 –30412.

6. Hanson, R. W., and Reshef, L. (2003). Glyceroneogenesis revisited. Biochimie 85:

1199 –1205.

7. Croset, M., Rajas, F., Zitoun, C., Hurot, J. M., Montano, S., and Mithieux, G.

(2001). Rat small intestine is an insulin-sensitive gluconeogenic organ. Diabetes 50:

740 –746.

8. DeFronzo, R. A., and Ferrannini, E. (1991). Insulin resistance: a multifaceted syndrome

responsible for NIDDM, obesity, hypertension, dyslipidemia, and atherosclerotic

cardiovascular disease. Diabetes Care 14: 173 –194.

9. Consoli, A., Nurjhan, N., Capani, F., and Gerich, J. (1989). Predominant role of



ARTICLE IN PRESS

gluconeogenesis in increased hepatic glucose production in NIDDM. Diabetes 38:

550 –557.

10. Hanson, R. W., and Reshef, L. (1997). Regulation of phosphoenolpyruvate carbo-

xykinase (GTP) gene expression. Annu. Rev. Biochem. 66: 581 –611.

11. Bailey, C. J. (1992). Biguanides and NIDDM. Diabetes Care 15: 755 –772.

12. Goldstein, B. J. (2000). Rosiglitazone. Int. J. Clin. Pract. 54: 333 –337.

13. Schoonjans, K., and Auwerx, J. (2000). Thiazolidinediones: an update. Lancet 355:

1008 –1010.

14. Hundal, R. S., et al. (2000). Mechanism by which metformin reduces glucose

production in type 2 diabetes. Diabetes 49: 2063 –2069.

15. Zhou, G., et al. (2001). Role of AMP-activated protein kinase in mechanism of

metformin action. J. Clin. Invest. 108: 1167 –1174.

16. Lefebvre, A. M., et al. (1998). Activation of the peroxisome proliferator-activated

receptor gamma promotes the development of colon tumors in C57BL/6J-APCMin/+

mice. Nat. Med. 4: 1053 –1057.

17. Sarraf, P., et al. (1998). Differentiation and reversal of malignant changes in colon

cancer through PPARgamma. Nat. Med. 4: 1046 –1052.

18. Saez, E., et al. (1998). Activators of the nuclear receptor PPARgamma enhance colon

polyp formation. Nat. Med. 4: 1058 –1061.

19. Stumvoll, M., Nurjhan, N., Perriello, G., Dailey, G., and Gerich, J. E. (1995). Metabolic

effects of metformin in non-insulin-dependent diabetes mellitus. N. Engl. J. Med. 333:

550 –554.

20. Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., and Conklin, D. S. (2002).

Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells.

Genes Dev. 16: 948 –958.

21. McCaffrey, A. P., Meuse, L., Pham, T. T., Conklin, D. S., Hannon, G. J., and Kay, M. A.

(2002). RNA interference in adult mice. Nature 418: 38 –39.

22. Liu, F., Song, Y., and Liu, D. (1999). Hydrodynamics-based transfection in animals by

systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6: 1258 –1266.

23. Zhang, G., Budker, V., and Wolff, J. A. (1999). High levels of foreign gene expression in

hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum. Gene Ther. 10:

1735 –1737.

24. Kobayashi, N., et al. (2004). Vector-based in vivo RNA interference: dose- and

time-dependent suppression of transgene expression. J. Pharmacol. Exp. Ther. 308:

688 –693.

25. Ruijter, J. M., Gieling, R. G., Markman, M. M., Hagoort, J., and Lamers, W. H. (2004).

Stereological measurement of porto-central gradients in gene expression in mouse

liver. Hepatology 39: 343 –352.

26. Sledz, C. A., Holko, M., de Veer, M. J., Silverman, R. H., and Williams, B. R.

(2003). Activation of the interferon system by short-interfering RNAs. Nat. Cell Biol.

5: 834 –839.

27. Bridge, A. J., Pebernard, S., Ducraux, A., Nicoulaz, A. L., and Iggo, R. (2003).

Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells. Nat. Genet.

34: 263 –264.

28. Pruett, S. B., Fan, R., and Zheng, Q. (2003). Acute ethanol administration profoundly

alters poly I:C-induced cytokine expression in mice by a mechanism that is not

dependent on corticosterone. Life Sci. 72: 1825 –1839.

29. Martin, E. J., and Forkert, P. G. (2004). Evidence that 1,1-dichloroethylene induces

apoptotic cell death in murine liver. J. Pharmacol. Exp. Ther. 310: 33 –42.

30. Korytkowski, M. T. (2004). Sulfonylurea treatment of type 2 diabetes mellitus: focus on

glimepiride. Pharmacotherapy 24: 606 – 620.

31. Miyazaki, Y., et al. (2001). Effect of rosiglitazone on glucose and non-esterified fatty

acid metabolism in Type II diabetic patients. Diabetologia 44: 2210 –2219.

32. Kirpichnikov, D., McFarlane, S. I., and Sowers, J. R. (2002). Metformin: an update. Ann.

Intern. Med. 137: 25 –33.

33. Valera, A., Pujol, A., Pelegrin, M., and Bosch, F. (1994). Transgenic mice overexpressing

phosphoenolpyruvate carboxykinase develop non-insulin-dependent diabetes mellitus.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9151 –9154.

34. Sun, Y., et al. (2002). Phosphoenolpyruvate carboxykinase overexpression selectively

attenuates insulin signaling and hepatic insulin sensitivity in transgenic mice. J. Biol.

Chem. 277: 23301 –23307.

35. Beale, E. G., Hammer, R. E., Antoine, B., and Forest, C. (2004). Disregulated

glyceroneogenesis: PCK1 as a candidate diabetes and obesity gene. Trends Endocrinol.

Metab. 15: 129 –135.

36. Jomain-Baum, M., Schramm, V. L., and Hanson, R. W. (1976). Mechanism of

3-mercaptopicolinic acid inhibition of hepatic phosphoenolpyruvate carboxykinase

(GTP). J. Biol. Chem. 251: 37 –44.

37. Kawaguchi, T., Osatomi, K., Yamashita, H., Kabashima, T., and Uyeda, K. (2002).

Mechanism for fatty acid "sparing" effect on glucose-induced transcription: regulation

of carbohydrate-responsive element-binding protein by AMP-activated protein kinase.

J. Biol. Chem. 277: 3829 –3835.

38. Matsuzaka, T., et al. (2004). Insulin-independent induction of sterol regulatory

element-binding protein-1c expression in the livers of streptozotocin-treated mice.

Diabetes 53: 560 –569.

39. Zeini, M., et al. (2005). Assessment of a dual regulatory role for NO in liver

regeneration after partial hepatectomy: protection against apoptosis and retardation

of hepatocyte proliferation. FASEB J. 19: 995 –997.

40. Jungermann, K., and Kietzmann, T. (1996). Zonation of parenchymal and non-

parenchymal metabolism in liver. Annu. Rev. Nutr. 16: 179 –203.

41. Reshef, L., et al. (2003). Glyceroneogenesis and the triglyceride/fatty acid cycle. J. Biol.

Chem. 278: 30413 –30416.

42. Niwa, H., Yamamura, K., and Miyazaki, J. (1991). Efficient selection for high-expression

transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108: 193 –199.

43. Paddison, P. J., Caudy, A. A., and Hannon, G. J. (2002). Stable suppression of gene

expression by RNAi in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 1443– 1448.

44. Simon, C., Herling, A. W., Preibisch, G., and Burger, H. J. (2000). Upregulation of

hepatic glucose 6-phosphatase gene expression in rats treated with an inhibitor of

glucose-6-phosphate translocase. Arch. Biochem. Biophys. 373: 418 –428.

45. Gujral, J. S., Knight, T. R., Farhood, A., Bajt, M. L., and Jaeschke, H. (2002). Mode of cell

death after acetaminophen overdose in mice: apoptosis or oncotic necrosis? Toxicol.

Sci. 67: 322 – 328.

46. Petrescu, I., Bojan, O., Saied, M., Barzu, O., Schmidt, F., and Kuhnle, H. F. (1979).

Determination of phosphoenolpyruvate carboxykinase activity with deoxyguanosine

5V-diphosphate as nucleotide substrate. Anal. Biochem. 96: 279 –281.

47. Herrera, B., et al. (2001). Activation of caspases occurs downstream from radical

oxygen species production, Bcl-xL down-regulation, and early cytochrome C release in

apoptosis induced by transforming growth factor beta in rat fetal hepatocytes.

Hepatology 34: 548 –556.



ARTICLE IN PRESS

Pck1 Gene Silencing in the Liver Improves GlycemiaControl, Insulin Sensitivity, and Dislipidemia in db/dbMiceAlicia G. Gomez-Valades,

1Andres Mendez-Lucas,

1Anna Vidal-Alabro,

1F.X. Blasco,

1M. Chillon,

2

R. Bartrons,1

J. Bermudez,1

and Jose C. Perales1

OBJECTIVE—Cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK-C; encoded by Pck1) catalyzes the first committed stepin gluconeogenesis. Extensive evidence demonstrates a directcorrelation between PEPCK-C activity and glycemia control.Therefore, we aimed to evaluate the metabolic impact of andtheir underlying mechanisms of knocking down hepaticPEPCK-C in a type 2 diabetic model.

RESEARCH DESIGN AND METHODS—PEPCK-C gene tar-geting was achieved using adenovirus-transduced RNAi. Thestudy assessed several clinical symptoms of diabetes and insulinsignaling in peripheral tissues, in addition to changes in geneexpression, protein, and metabolites in the liver. Liver bioener-getics was also evaluated.

RESULTS—Treatment resulted in reduced PEPCK-C mRNA andprotein. After treatment, improved glycemia and insulinemia,lower triglyceride, and higher total and HDL cholesterol weremeasured. Unsterified fatty acid accumulation was observed inthe liver, in the absence of de novo lipogenesis. Despite hepaticlipidosis, treatment resulted in improved insulin signaling in theliver, muscle, and adipose tissue. O2 consumption measurementsin isolated hepatocytes demonstrated unaltered mitochondrialfunction and a consequent increased cellular energy charge. Keyregulatory factors (FOXO1, hepatocyte nuclear factor-4�, andPGC-1�) and enzymes (G6Pase) implicated in gluconeogenesiswere downregulated after treatment. Finally, the levels of Sirt1, aredox-state sensor that modulates gluconeogenesis throughPGC-1�, were diminished.

CONCLUSIONS—Our observations indicate that silencingPEPCK-C has direct impact on glycemia control and energymetabolism and provides new insights into the potential signifi-cance of the enzyme as a therapeutic target for the treatment ofdiabetes. Diabetes 57:1–12, 2008

The liver has a central role in maintaining glucoseand energy homeostasis. Postabsorptive metab-olism in hepatocytes ensures glucose synthesisvia gluconeogenesis and glycogenolysis to main-

tain blood glucose levels. In diabetic patients, sustained

rates of gluconeogenesis independent of nutrient statusare responsible for increased hepatic glucose output(HGO) and, therefore, hyperglycemia (1,2).Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) cata-

lyzes the first committed step in gluconeogenesis. Genetranscription from the cytosolic form of PEPCK(PEPCK-C) is highly regulated by the glucagon/insulinaxis. During diabetes, the lack of insulin (type 1 diabetes)or resistance to its action (type 2 diabetes) is responsiblefor an important upregulation of the enzyme, and thisinduction correlates with increased rates of gluconeogen-esis in liver and kidney (3). Also, PEPCK gene modulationin the liver has resulted in remarkable effects on systemicglucose metabolism in mice. A twofold overexpression ofPEPCK-C results in insulin resistance (4), whereas asevenfold overexpression results in hyperglycemia (5).Moreover, studies by Burgess et al. (6) and She et al. (7,8)using a liver-specific PEPCK-C knockout mouse have shedlight on the critical role of PEPCK-C in the integration ofenergy metabolism through a mechanism that implicatescataplerosis from mitochondria, as highlighted by hypo-glycemia and lethality after ablation of PEPCK-C gene inmice (7–9). Furthermore, a polymorphism in the promoterfor Pck1 is associated with the development of type 2diabetes (10) and dysregulation of gluconeogenesis hasdirect implications for glucose homeostasis in humans(2,11).Despite all evidence, the validation of this enzyme as a

target for liver-specific gene therapy or pharmacologicalintervention in diabetes has not been extensively investi-gated to date. Prior studies in streptozotocin-treated miceusing RNAi-directed downregulation of PEPCK-C in theliver have shown a direct role for this enzyme in theregulation of glucose homeostasis in the absence of insulin(12). Here, we have focused on evaluating the indirectmetabolic impact of knocking down hepatic PEPCK-C in amodel of insulin resistance.We show that partial silencing of hepatic PEPCK-C in

db/db mice leads to improved glycemia control directly,through the coordinate inhibition of components of thegluconeogenic pathway in the liver, and indirectly, byimproving insulinemia and peripheral sensitivity to thehormone. Our observations indicate that PEPCK-C plays akey role in the control of hepatic energy metabolism andprovides a novel therapeutic approach for the treatment ofdiabetes.

RESEARCH DESIGN AND METHODS

Experimental animals and adenovirus. Male C57BKS.Cg-�Leprdb/�Leprdb

(db/db) mice were purchased from Harlan Interfarma, maintained in aconstant 12-h light/dark cycle, and fed a standard rodent chow and water adlibitum. At the beginning of the experiment, animals were 6–8 weeks old. All

From the 1Biophysics Unit, Department of Physiological Sciences II, IDIBELL-University of Barcelona, L’Hospitalet del Llobregat, Spain; and the 2Centerof Animal Biotechnology and Gene Therapy, Universitat Autonoma deBarcelona, Barcelona, Spain.

Corresponding author: Dr. Jose C. Perales, [email protected] 20 September 2007 and accepted 20 April 2008.Published ahead of print at http://diabetes.diabetesjournals.org on 28 April2008. DOI: 10.2337/db07-1087.

© 2008 by the American Diabetes Association. Readers may use this article aslong as the work is properly cited, the use is educational and not for profit,and the work is not altered. See http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ for details.

The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page

charges. This article must therefore be hereby marked “advertisement” in accordance

with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.

ORIGINAL ARTICLE

DIABETES, VOL. 57, AUGUST 2008 1

AQ: B

AQ: C

AQ: D

rich4/zdb-diab/zdb-diab/zdb00808/zdb5373d08a allend S�8 6/12/08 14:40 4/Color Fig: 1,5 Facing: 4-5,8-9 doi: 10.2337/db07–1087artno: 1087

animal protocols were approved by the Ethics Committee at the University ofBarcelona.Recombinant E1-E3 deficient adenovirus (serotype 5) encoding shRNA

against PEPCK-C (Ad-shPck1) and Phothinus pyralis luciferase (Ad-shCT)(used as unspecific control sequence) were generated in the Viral ProductionUnit of the Center of Animal Biotechnology and Gene Therapy (UPV-CBATEG) (Bellaterra, Spain).Adenovirus was administered by tail vein injection of 6.67 � 1010 plaque-

forming units (pfu)/kg in 200 �l physiological saline. Fed blood glucose andweight were measured at 8:00 A.M. Surgery was performed under isofluoraneanesthesia (Abbot). Tissues were snap-frozen in liquid nitrogen and stored at�80°C until analysis. Blood was collected by inferior cava puncture.Peripheral insulin sensitivity. Overnight fasted mice were anesthetized,and gastrocnemius muscle, epididymal fat, and liver samples were taken attime 0 and 5 min after a 10-IU/kg insulin bolus was injected via tail vein.

Glucose and insulin tolerance tests. Glucose tolerance was assayed 7 daysafter treatment in 32-h-fasted mice after a 1-g/kg glucose bolus intraperitonealinjection. Insulin tolerance was determined in mice fed ad libitum, afterintraperitoneal injection of 2 IU/kg bovine insulin (Sigma) at day 8 aftertreatment. Blood glucose was measured at the indicated time points afterchallenge.Glucose production from pyruvate. A 2 g/kg buffered pyruvate (Sigma)bolus was injected intraperitoneally in 32-h-fasted mice, on day 7 afteradenoviral infection. Glucose levels were measured at indicated time points.RNA extraction and quantitative RT-PCR. Total RNA was extracted usingRNAeasy mini kit (Qiagen). cDNA synthesis from 2 �g RNA was performedusing Ready-To-Go You-Prime First Strand Beads (Amersham Biosciences)with random hexamers. mRNA levels of selected genes were quantified usinga Low Density Array (Applied Biosystems) in a HT7900 Real-Time RT-PCRsystem (Applied Biosystems). Gene expression was normalized with �-2-

A

DC

PEPCK

γ-tubulinKidney

Ad-shCT Ad-shPck1

PEPCK

γ-tubulinLiver

PEPCK

γ-tubulinWAT

PP PVB

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75p=0.05

Fed Fasting

p=0.06

pc

k-1

mR

NA

(rel

ativ

e un

its)

Liver Kidney WAT0

20

40

60

80

100

120 **PE

PCK

-C (r

elat

ive

units

)

Ad-

shP

ck1

Ad-

shC

T

FIG. 1. Adenovirus-mediated shRNA knocks down PEPCK-C specifically in the liver. A dose of 6.67 � 1010 pfu/kg control (Ad-shCT) andPEPCK-C–directed shRNA (Ad-shPck1) adenovirus was injected in male, 6- to 8-week-old db/db mice. A: PEPCK-C expression analyzed byquantitative RT-PCR in fed (n � 11) or overnight-fasted (n � 5) animals 14 days after treatment. �-2-microglobulin was used as housekeepinggene. Data are represented as relative Pck1 gene expression compared with control-fed animals (Ad-shCT). Data are means � SE. Student’s t testwas used to discriminate statistic significance. B: PEPCK-C immunohistochemistry was performed in 7-�m cryosections obtained from liverstreated with either control or PEPCK-C–targeted shRNA. Confocal microscopy was used to determine signal distribution throughout the liveracinus. �100 (right) and �400 image magnification blow up from periportal (PP) and perivenous (PV) zones are shown. Pictures arerepresentative of three independent experiments. C: PEPCK-C immunodetection in total protein extracts from liver, kidney, and epididymalWAT. �-Tubulin was used to normalize protein loading. Representative blots from three independent experiments are shown. D: Densitometricquantification of liver (n � 11), kidney (n � 4), and WAT (n � 4) blots shown in C. f, Ad-shCT; �, Ad-shPck1 group. Data are means � SE; **P <0.01, Student’s t test.

Pck1 GENE SILENCING IN THE LIVER

2 DIABETES, VOL. 57, AUGUST 2008

AQ: E

AQ: F

COLOR


microglobulin as a housekeeping gene. Data analysis is based on the Ctmethod.Western blot. Tissue was homogenized in radioimmunoprecipitation assaybuffer supplemented with protease and phosphatase inhibitors and centri-fuged at 15,000 � g for 15 min at 4°C. Western blots were performed with20–50 �g tissue extract. Proteins were separated in 8–12% SDS-PAGE andtransferred to an Immobilon membrane (Millipore). Nuclear extracts wereobtained as described previously (13).Sheep anti–PEPCK-C antiserum (a gift from Dr. Granner, Vanderbilt

University, Nashville, TN) was used at a 1:20,000 dilution; antibodies againstacetyl-CoA carboxylase (ACC) and ACC-P (Ser79) (Upstate) were used at1:2,000; and antibodies against AMPK, AMPK-P (Thr172), AKT, AKT-P (Thr308),AKT-P (Ser473) (Cell Signaling), Sirt1 (Upstate), and sterol regulatory element–binding protein 1c (SREBP-1c; Santa Cruz Biotechnology) were used at1:1,000. VDAC antibody (provided by Dr. Pujol, IDIBELL) was diluted 1:1,000.FAS and protein kinase C ε (PKCε) antibodies (Santa Cruz Biotechnology)were used at 1:500 dilution. FOXO1 (Santa Cruz Biotechnology), FOXO1-P(Ser256) (Cell Signaling), and PGC-1 (Cell Signaling) were used at 1:250. Allmembranes were normalized using monoclonal anti–-tubulin (Sigma) at1:10,000. Horseradish peroxidase activity linked to secondary antibody wasdetected with ECL substrate (Pierce) in a Fujifilm LAS 3000 Intelligent DarkBox IV imaging system. Densitometry was performed using Multi Gaugesoftware.PKCε activity was estimated as the ratio of membrane to cytosol PKCε

signal. To separate membrane and cytosolic fractions, liver homogenates werecentrifuged at 800 � g for 10 min, and supernatants were further centrifugedat 100,000 � g for 45 min. Enrichment was assessed after blotting themembranes with antibodies (1:1,000) against cytosolic (pyruvate kinase[L-PK]; gift from Dr. Bartrons, University de Barcelona) and membrane-associated (EGFR, gift of Dr. Rosa, University of Barcelona) proteins.Histology and immunofluorescence. A portion of the third hepatic lobulewas fixed for at least 24 h in 4% paraformaldehyde, equilibrated in 30%saccharose, embedded in Tissue-Tek OCT compound (Sakura), and stored at�80°C until 7-�m-thick cryosections were obtained. Oil red lipid staining andPEPCK-C immunostaining were previously described (12).Blood and liver biochemical analysis. Blood glucose was measured using aGlucocard Memory 2 apparatus (Menarini) by tail clipping. Serum metaboliteswere measured in the Veterinarian Clinical Biochemistry Service, VeterinaryHospital, Universitat Autonoma de Barcelona (Barcelona, Spain). Seruminsulin was determined using Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA (Mercodia).HDL cholesterol was quantified using a Reflotron system (Roche Diagnostics).Hepatic glycogen was measured essentially as previously described (9).

Hepatic triglycerides and fatty acid content were quantified using a TAG kit(Sigma) and NEFA kit (Wako), respectively, in 3 mol/l KOH, 65% ethanolextracts, based on the method of Salmon and Flatt for liver saponification.Hepatic short chain acyl-CoAs (acetyl-CoA, malonyl-CoA, propionyl-CoA, andsuccinyl-CoA) were analyzed by high-performance liquid chromatography(HPLC) as described previously (14) in the Research Support Services fromthe University of Barcelona. Nucleotides (ATP/ADP/AMP) were determined inneutralized 10% perchloric acid extracts by HPLC.High-resolution respirometry. O2 consumption was measured using ahigh-resolution Oxygraph respirometer (Oroboros, Innsbrook, Austria) inisolated hepatocytes. Briefly, liver was preperfused with calcium-free Hanks’balanced salt solution (HBSS) buffer (Sigma) at 37°C before perfusion withCa2�-containing HBSS and 3.5 mg/ml Liberase Blendzyme (Roche). Hepato-cytes were cleared by repeated centrifugation at 50� g for 5 min, and viability(�80%) was assessed by trypan blue exclusion. The respiration mediumconsisted of F-12 Coon’s modification supplemented with 20 mmol/l HEPES,20 mmol/l lactate, 2 mmol/l pyruvate, 2 mmol/l glutamine, and 1 mmol/loctanoate conjugated with 0.5% BSA. Medium was equilibrated with air at37°C and stirred at 750 rpm until a stable signal was obtained for calibrationat air saturation. At least 106 hepatocytes per milliliter were used formeasurements. The titration protocol, which was completed within 50–60min, was recorded at 2-s intervals using a computer-driven data acquisitionsystem (Datlab; Oroboros).Statistical analysis. Results are expressed as the means � SE. Statisticalanalysis was always performed by one-way or two-way ANOVA and two-tailedStudent’s t test. A P 0.05 was considered significant.

A

0 2 4 6 8 10 12 14

-250

-200

-150

-100

-50

0

50

**** # #

Time (days)

Glu

cose

cha

nge

(mg/

dl)

0 25 50 75 100

0100200300400

500600

Time (min)

Glu

cose

(mg/

dl)

B

C

†‡* **###

##

###

CT

AdU6-Ff

AdU6-664

0

100

200

300

400

500*

*G

luco

se (m

g/dl

)

FIG. 2. Knocking down hepatic PEPCK-C in diabetic db/db mice leadsto improved glucose homeostasis. A: Fed glycemia (f) was assessed 14days after treatment with saline (CT; n � 5), with adenovirus express-ing a nonspecific shRNA (Ad-shCT; n � 19), or with a PEPCK-C specificshRNA (Ad-shPck1; n � 19). Fasting glycemia was measured after a32-h fast on day 7 after infection (�) in the same animals. Data aremeans � SE; *P < 0.05, Student’s t test. B: Fed glycemia relative toglycemia before treatment. Fed glycemia was scored in CT group(n � 5; E), Ad-shCT (n � 19; F), and Ad-shPck1 (n � 19; Œ) beforetreatment and over the duration of the experiment. An additionalexperimental group was treated orally with metformin (MET) (n � 5;‚). Metformin was added to drinking water to achieve a daily dose of400 mg � kg�1 � day�1 in view of the daily water consumption. Averagedaily water consumption was calculated every day for 1 week beforeinitialization of experiment. Water consumption and metformin dosagewas recalculated twice a week and corrected, if necessary, to adjustdosage. Data are means � SE; **P < 0.01 Ad-shPck1 vs. Ad-shCT; and##P < 0.01 MET vs. CT, Student’s t test. C: Seven days after adenoviralinfection, an intraperitoneal glucose tolerance test was performed in32-h-fasted mice as described in RESEARCH DESIGN AND METHODS, andglucose was measured at the indicated time points in CT (n � 5),Ad-shCT (n � 13), and Ad-shPck (n � 12) groups. *P < 0.05

Ad-shPck1 vs. Ad-shCT; ##P < 0.01; and ###P < 0.001 Ad-shPck1 vs. CT,Student’s t test. A two-way ANOVA did not detect significant differ-ences between the CT and Ad-shCT groups but demonstrated statisti-cally significant changes when comparing the Ad-shPck1 versus CT(‡P < 0.001) and versus Ad-shCT (†P < 0.05) treatment groups. Dataare means � SE.

A.G. GOMEZ-VALADES AND ASSOCIATES


AQ: G

AQ: H

AQ: I

AQ: J

AQ: K


FIG. 3. Improved insulin sensitivity in hepatic PEPCK-C–silenced animals. A: Plasma insulin levels was assessed in fed mice 14 days after infection(Ad-shCT, n � 5; Ad-shPck1, n � 4; **P < 0.01, Student’s t test) or in 32-h-fasted mice 7 days after infection (Ad-shCT, n � 13; Ad-shPck, n �12; *P < 0.05, Student’s t test). f, Ad-shCT; �, Ad-shPck1 group. B: For IPITT, a 2-IU/kg insulin bolus was injected into awake fed mice. Bloodglucose levels were determined at the indicated time points after insulin bolus (CT, E, n � 5; Ad-shCT, F, n � 8; Ad-shPck1, Œ, n � 9). Data are




RESULTS

Liver-specific PEPCK-C gene silencing. A previouslyvalidated shRNA sequence against PEPCK-C (12) wasengineered into an adenovirus vector (Ad-shPck1) andtested for relative silencing efficiency compared with acontrol sequence (Ad-shCT). Treatment with Ad-shPck1achieved a 42 and 25% reduction in Pck1 gene expressionin fed and fasted livers, respectively (Fig. 1A). Interest-ingly, the net amount of RNA silenced was similar, inde-pendent of nutritional status. Densitometric quantificationof Western blots confirmed a similar amount of hepaticPEPCK-C protein reduction on treatment (100 � 15.1 vs.46.1 � 6.8 relative units; n � 11, P 0.01) (Fig. 1C and D).Because PEPCK-C is also present in kidney and adiposetissue, we assessed the tissue specificity of silencing. Nochanges in PEPCK-C protein content were observed eitherin kidney or epididymal adipose tissue (Fig. 1C and D).Finally, immunohistochemical analysis of PEPCK-C dem-onstrates a nonhomogeneous reduction of PEPCK-C im-munoreactivity; more evident in pericentral than peripor-tal hepatocytes (Fig. 1B).Whole-body glucose homeostasis and insulin sensitiv-ity. To investigate the consequences of PEPCK-C silencingon glycemia control, key metabolic parameters were mea-sured. Fed blood glucose was significantly reduced inAd-shPck1 animals (271 � 23 mg/dl) compared with bothsaline-treated (409 � 48 mg/dl) and Ad-shCT–treated(370 � 38 mg/dl) groups, although no significant changeswere found in fasted animals (Fig. 2A). Interestingly,PEPCK-C silencing and oral metformin treatment demon-strated similar variations in fed glycemia (Fig. 2B).Systemic glucose clearance, assessed using a glucose

tolerance test, was improved after Ad-shPck1 treatment,as demonstrated by a reduction in the area under the curveof�40 and 20% compared with saline-treated and Ad-shCTgroups, respectively (Fig. 2C). Also, fed and fasting insu-linemia were significantly reduced after treatment withAd-shPck1 (Fig. 3A). Accordingly, an intraperitoneal insu-lin tolerance test showed that PEPCK-C–silenced animalshave higher sensitivity to insulin (Fig. 3B). Furthermore,Ad-shPck1–treated animals scored significantly lower(2.38 � 0.01, n � 14 vs. 2.74 � 0.07, P 0.01, n � 5 andvs. 2.53 � 0.01, P 0.05, n � 14; Ad-shPck1 vs. salinetreated and vs. Ad-shCT, respectively) when their degreeof insulin resistance was assessed from the QUICKI index(15).Next, we directly evaluated insulin signaling in vivo

measuring insulin-stimulated AKT phosphorylation inliver, muscle, and epididymal adipose tissue (white adi-pose tissue [WAT]). AKT phosphorylation at Ser473 andThr308 was enhanced in Ad-shPck1–treated animals afterinsulin treatment, in marked contrast to reduced signalingby insulin in saline-treated and Ad-shCT–treated groups(Fig. 3C–H). These data demonstrate improved peripheral

TABLE1

Metabolicprofileof

db/d

bmiceafterpartialliversilencingofPEPCK-C

Bloodmetabolites

Livermetabolites

FFA

(mmol/l)

TAG(mg/dl)

�-HBA

(mmol/l)

GPT(units/l)

Total

Cholesterol

(mg/dl)

HDL

Cholesterol

(mg/dl)

Glycogen

(mmol

�l�1

�g�1)

TAG(mg/g)

Fattyacids

(mmol/g)

Fed

Ad-shCT

0.92

�0.05

174.75

�12.61

0.22

�0.05

144.00

�11.46

116.53

�3.16

60.86

�5.23

273.41

�31.34

117.37

�15.20

0.48

�0.28

Ad-sh

Pck1

0.78

�0.04

117.83

�12.61*

0.29

�0.04

150.82

�4.99

133.27

�4.60†

74.93

�4.75*

296.74

�18.65

173.39

�11.43†

1.68

�0.45*

Fasted

Ad-shCT

0.89

�0.08

134.50

�11.05

0.40

�0.05

253.33

�17.99

104.85

�3.06

ND

70.18

�3.33

43.94

�4.75

2.30

�0.21

Ad-sh

Pck1

0.58

�0.02

86.00

�7.14

0.66

�0.08

205.67

�5.27

132.85

�2.07‡

ND

19.41

�3.69§

107.05

�11.24§

4.01

�0.27§

Dataaremeans

�SE,n

�13–16(Ad-shCT)and

n�15–18(Ad-sh

Pck1),*P

0.05,†

P 0.01vs.controlvirustreatmentinfedexperiments,unpairedStudent’s

ttest;n

�6(Ad-shCT

andAd-sh

Pck1),‡P

0.01,§P

0.001vs.controlvirustreatmentinfastingexperiments;unpairedStudent’s

ttest.ND,nondetermined.Serawereobtained14daysafteradenoviral

infectionfrom

fedorovernight-fastedmice.

means � SE, *P < 0.05 (CT vs. Ad-shPck1) and P � 0.09 (Ad-shCT vs.Ad-shPck1), Student’s t test. Insulin signaling in liver (C and F),muscle (D and G), and epididymal fat depots (E and H) was assessed inovernight fasted mice 1 week after infection by means of an intrave-nous insulin bolus (10 IU/kg) as described in RESEARCH DESIGN AND

METHODS. The level of AKT phosphorylation (at both Ser473 and Thr308

residues) and the total AKT protein content were detected by Westernblot (C–E). Representative blots of two independent experiments areshown. Additionally, bands were quantified by densitometry (F–H). o,saline-injected animals (CT); f, Ad-shCT group; �, Ad-shPck1 group.Bars represent the AKT-P–to–AKT ratio related to control (CT) groupin the basal state. Data are means � SE of 4–6 animals per group. *P <0.05 and **P < 0.01, Student’s t test.



F1

F2

F3

AQ: L


insulin sensitivity after partial hepatic PEPCK-C knock-down in the db/db mouse model.Gluconeogenesis and HGO. HGO, determined by theflux from pyruvate to glucose in vivo, was reduced inAd-shPck1--treated animals (Fig. 4A). Moreover, liver gly-cogen was significantly reduced in Ad-shPck1–treatedanimals on fasting (Table 1), consistent with decreasedhepatic glucose production capacityGlucose-6-phosphatase catalyzes the last step in the

gluconeogenic and glycogenolysis pathways, and is, there-fore, responsible for regulating HGO. The mRNA of thisenzyme (encoded by G6pc) was significantly reduced atlevels comparable with those observed for PEPCK-C (en-coded by Pck1). Glucose-6-phosphatase and PEPCK-C areregulated by transcription factors like hepatocyte nuclearfactor-4� (HNF-4�) (encoded by Hnf4�) and FOXO1,which are co-activated by PGC-1� (encoded by Ppargc1�).PGC-1� mRNA was slightly reduced in PEPCK-C–silencedanimals (Fig. 4B), although PGC-1� protein in nuclearextracts was constant (Fig. 4C and D). HNF-4� is down-regulated, albeit nonsignificantly, in treated animals. Inaddition, FOXO1 phosphorylation at Ser256 increased inliver of Ad-shPck1–treated animals (Fig. 4E and F). Thesedata suggest that insulin signaling through AKT-dependentFOXO1 phosphorylation contributes to the observed re-duction in steady-state mRNA levels for gluconeogenicgenes such as G6pc and Pck1.Lipid homeostasis. To investigate the effects of liver-specific PEPCK-C knockdown on lipid metabolism, sev-eral blood and liver parameters were analyzed. Serumtriglycerides were pronouncedly reduced both in fed andfasted animals after PEPCK-C silencing in the liver, ac-companied by decreased serum free fatty acids (FFAs)and increased �-HBA. Furthermore, a net increase in totalserum cholesterol with a concomitant increase in HDLcholesterol was found (Table 1).Lipid accumulation in the liver is a characteristic of the

diabetic phenotype in db/db mice. Oil red staining demon-strated both micro- and macrovesicular lipid droplets inAd-shCT–treated livers, which are more profuse in Ad-shPck1 group, especially in periportal compared withperivenous hepatocytes (Fig. 5A). Consistently, we ob-served a moderate increase in hepatic triacylglycerol(TAG) and a 3.5-fold increase in liver fatty acid contentafter PEPCK-C silencing (Fig. 5B). Meanwhile, the level ofFAS mRNA was unaltered, whereas SREBP1-c and LXR-�decreased �25% (Fig. 5C). Correspondingly, the precursor(p125) and active form (p68) of SREBP1-c were reduced,whereas FAS protein content was unchanged (Fig. 5D andE). Moreover, mRNA and protein levels from glycolyticand lipogenic enzymes, such as glucokinase (Gck), L-PK, ormalic enzyme (Mod1), were unaltered or significantlyreduced (Fig. 5C–E). ChREBP, which plays an importantrole in regulating glycolytic (L-PK) and lipogenic (ACC andFAS) genes, was unaltered (Fig. 5C–E), which supportsthe absence of de novo lipogenesis in livers of Ad-shPck1–treated mice.Malonyl-CoA is an important contributor to the oppos-

ing regulation of fatty acid �-oxidation and fatty acidsynthesis through its dual function as allosteric inhibitorof CPT-1 and FAS substrate (16). Although, a significantincrease of malonyl-CoA content in liver was found (Table2), ACC, the enzyme responsible for its synthesis, was notstimulated because the ratio of ACC-P to ACC was un-changed in the liver of PEPCK-C–silenced mice (Fig.5F).These data further support the view that PEPCK-C

silencing in the liver of db/db mice does not induce net denovo lipogenesis.Interestingly, despite liver lipidosis (Fig. 5A and B),

hepatic and peripheral insulin signaling was improved inPEPCK-C–silenced animals (Fig. 3). PKCε plays a criticalrole in mediating fat-induced hepatic insulin resistance(17). No activation of PKCε was observed after partialPEPCK-C knockdown in db/db livers (Fig. 5G and H),suggesting that lipid accumulation is dissociated frominsulin resistance induction in our model.Modulation of energy metabolism. Because impairmentof the tricarboxylic acid cycle (TCA cycle) and mitochon-drial function are hallmarks of liver-specific PEPCK-Cknockout mice (6,8,9), we evaluated several parameters ofmitochondrial function, including �-oxidation. The rate-limiting step in �-oxidation is the transport of acyl-CoAinto the mitochondria catalyzed by the CPT-1 shuttle,whose mRNA content was slightly reduced (Fig. 6B).Consistently, the mRNA for PGC-1�, a key player in theregulation of both �-oxidation and gluconeogenic path-ways, was lowered after treatment (Fig. 4B). In contrast, aslight increase in serum ketones in both fed and fastedanimals (Table 1), together with unchanged levels ofHMG-CoA synthase mRNA (Fig. 6B) and a significantincrease in propionyl-CoA, an odd chain �-oxidation inter-mediate (Table 2), suggests that �-oxidation was notmarkedly affected.The mitochondrial respiration rate, determined in

freshly isolated hepatocytes in the presence of octanoate,was unaffected by treatment with Ad-shPck1. Moreover,the maximum mitochondrial respiration capacity (uncou-pler carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenyl-hydra-zone [FCCP]) (Fig. 6A) and the content of the innermitochondrial membrane ADP transporter, VDAC (Fig.6C), a marker of the amount of respiratory chains andhence mitochondrial content, were unchanged, suggestingthat partial PEPCK-C knockdown does not impair the TCAcycle and does not negatively affect mitochondrial biogen-esis or limit mitochondrial oxidative capacity in excess ofmedium-chain fatty acid substrate. Consistently, no accu-mulation of TCA intermediates, like acetyl-CoA and succi-nyl-CoA, was observed (Table 2). Additionally, theexpression profile of cytosolic (decreased) and mitochon-drial (unaltered) superoxide dismutases (SODs) is com-patible with increased peroxisomal oxidation activity (18)(Fig. 6D). The ratios estimated from respirometry data(respiratory control ratio [RCR], uncoupling control ratio[UCR], and phosphorylation RCR [RCRP]) were unalteredafter Ad-shPck1 treatment (Fig. 6A). In agreement withUCR index, the level of expression from the gene encodingthe uncoupling protein two (Ucp2) was unchanged, sug-gesting that mitochondrial respiration was not uncoupled(Fig. 6B).It is widely accepted that gluconeogenesis is dependent

on fatty acid oxidation as an energy source. An imbalancebetween these two pathways would, theoretically, altercellular energy charge (CEC), unless a correspondingenergy producing or consuming pathway compensates forsuch disequilibrium. Our data show an apparent reductionin gluconeogenesis while �-oxidation is maintained. Con-sistently, CEC was greatly increased, because of a 25%reduction of AMP and a 50% increment in ATP content(Table 2). As a result, the master switch energy sensorAMPK (19), which is activated by decreasing energycharge, was not stimulated, as determined by the ratio ofphosphorylated versus total AMPK (Fig. 6E), and ACC, a



F4

T1

AQ: O

F5

AQ: P

AQ: Q

T2

AQ: R

F6

AQ: S


target for AMPK, was not inhibited by phosphorylation(Fig. 5D).The work of Rodgers et al. (20) sheds some light on the

regulation of gluconeogenesis in response to nutrients andchanges in red-ox potential mediated by Sirt1, a NAD�-dependent deacetylase involved in PGC-1� activation.Therefore, we evaluated the levels of Sirt1 to investigatewhether the pathway could be responsible for the coordi-nated reduction in gluconeogenic enzymes and regulatoryfactors. A reduction of�50% (100� 9.16 vs. 47.03� 10.19;n � 7; P 0.001; Student’s t test) in the levels of Sirt1protein in the liver was observed (Fig. 6F–G).

DISCUSSION

The natural tropism of adenovirus for the liver was used toobtain efficient, organ-specific delivery of a shRNA-pro-ducing expression vector against PEPCK-C. Infection ofdb/db mice with adenovirus-directed shRNA allowed inhi-bition of PEPCK-C specifically in the liver, with unalteredlevels in kidney and WAT, where PEPCK-C have importantroles in gluconeogenesis from glutamine and glyceroneo-genesis, respectively (3).

Inmunostaining experiments show a PEPCK-C gradientacross the porto-central axis of the liver acinus (21).Silencing efficiency was higher in the perivenous portionof the acinus (Fig. 1C) where PEPCK-C levels are lower.Although similar silencing pattern and efficiency (�50%)was obtained in our previous study on type 1 diabetes (12)using a hydrodynamic gene transfer technique, the presentreport demonstrates that the use of adenovirus can resultin an absolute higher silencing efficiency (SupplementaryFig. 1, which is detailed in an online appendix [available athttp://dx.doi.org/10.2337/db07-1087]) and longer lasting ef-fects (up to 2 weeks), which allowed us to evaluate themetabolic impact and underlying mechanisms of knockingdown hepatic PEPCK-C in a type 2 diabetic model.Mice with reduced PEPCK-C liver content showed a

clear improvement in glucose tolerance and fed glycemia,comparable with oral metformin. However, fasting glucosewas unchanged, even though HGO from pyruvate wasclearly reduced. Compensatory HGO from glycogenolysis,as supported by reduced hepatic glycogen content infasting and even in fed animals when silencing reached90% (Supplementary Fig. 1), could be responsible for

A

B

C

D

E

F

0 25 50 75 100 125

50

150

250

350

450

Time (min)

Glu

cose

(% o

f ini

tial)

g6pc hnf4α pparγc1α

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2 * *

Rel

ativ

e m

RN

A le

vels

*

0

50

100

150

Prot

ein

leve

l(P

GC

-1α

/γ-t

ubul

in)

shCT shPck1PGC-1

γ-tub

050

100150200250300 *

Phos

phor

ylat

ion

leve

l(F

OXO

1-P/

FOXO

1)

FOXO1

FOXO1-PshCT shPck1

α

FIG. 4. Coordinated downregulation of gluconeogenic genes and decreased hepatic glucose production capacity after hepatic PEPCK-C silencing.A: HGO was evaluated in vivo by assaying the glucose production from pyruvate as described in RESEARCH DESIGN AND METHODS. HepaticPEPCK-C–silenced group reflected a significant reduction in glucose production capacity after a pyruvate bolus injection. Two-way ANOVA wasused to discriminate treatment efficiency. Data are means � SE. Ad-shCT, E, n � 9; Ad-shPck1, n � 9, Œ; *P < 0.05. B: Expression of significantgenes involved in gluconeogenesis (G6pc, Hnf-4, and Ppargc1) was examined 2 weeks after treatment with Ad-shCT (n � 10; f) or Ad-shPck1

(n � 11; �) in fed animals. Gene expression was quantified using quantitative RT-PCR in an Applied Biosystems 7900HT Micro Fluidic Card. Dataanalysis was performed using the Ct method and �-2-microglobulin as housekeeping gene. Each value represents the mean relative amount ofmRNA with respect to that in the control experimental treatment. Student’s t test was used to determine statistical differences betweentreatments. *P < 0.05, Student’s t test. C: Western blot immunodetection of PCG-1 in hepatic nuclear extracts obtained from fed mice 14 daysafter treatment. Representative blots are shown. D: Densitomentric quantification of PGC-1 protein content in blots shown in C are representedas PGC-1 content relative to �-tubulin, which was used to normalize protein charge. Data are means � SE, n � 6. E: Phosphorylation level ofFOXO-1 at the Ser256 residue was analyzed by Western blot in total homogenates of livers from fed mice 14 days after treatment. Total FOXO-1content was used to normalize phosphorylation level. F: Densitometric quantification of blots represented in E. Phosphorylation level isrepresented as FOXO-1–to–phospho-FOXO-1 Ser256 ratio relative to control group. f, Ad-shCT; �, Ad-shPck1 group. n � 10, *P < 0.05, Student’st test.




A

ACC-P

ACC

shCT shPck1

γ-tub

B

D

PP PV

C

E

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

PKCε

(mem

bran

e/cy

toso

l rat

io)

F

Ad-shCT Ad-shPck1

PKCMC MC

L-PK

EGFR

FAS

Chrebpp125p68

γ-tub

shCT shPck1

GK

γ-tubL-PK

**

chrebp srebf1 gck fasn mod1 lxrα

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2 **

Rel

ativ

e m

RN

A le

vels

ChREBPp12

5p68 GK

FASL-P

KACC

0

25

50

75

100

125 ** *

Rel

ativ

epr

otei

n le

vels

TAG Fatty acids0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5 ***

Hep

atic

lipi

d co

nten

t(m

mol

/g)

Ad-

shP

ck1

Ad-

shC

T

ε

G H

FIG. 5. Effect of hepatic PEPCK-C partial silencing on hepatic lipid homeostasis. A: Livers from fed mice 14 days after treatment were fixed in4% paraformaldehide, and oil red staining was performed in 7-�m cryosections. Right panel shows a �100 magnification liver section. A view ofperiportal (PP) and perivenous (PV) zones are shown with a �200 magnification. Representative pictures from three independent experimentsare shown. B: Triglyceride and fatty acid content in fed livers from unspecific shRNA (Ad-shCT; f; n � 14) or PEPCK-C-targeted (Ad-shPck1; �;n � 16) treatment. Data are means � SE; *P < 0.05, **P < 0.01. C: Expression of significant genes involved in glycolysis and lipogenesis (fasn,srebf1, chrebp, mod1, gck, and lxr-) was examined. Livers were obtained in fed state 14 days after infection with Ad-shCT (n � 10; f) orAd-shPck1 (n � 11; �). Gene expression was quantified by quantitative RT-PCR using Applied Biosystems 7900HT Micro Fluidic Card, and datawere analyzed using the Ct method and �-2-microglobulin as housekeeping gene. Each value represents the mean relative amount of mRNAwith respect to that in the control experimental treatment. *P < 0.05, **P < 0.01, Student’s t test. D: Protein levels of glycolytic and lipogenicenzymes and transcription factors in livers from fed animals 14 days after treatment were analyzed by Western blot from total liver extracts.Blots are representative of three independent experiments. E: Densitometric quantification of blots represented in D and F. Data are means �SE, n � 5–19; *P < 0.05, **P < 0.01, Student’s t test. f, Ad-shCT group; �, Ad-shPck1 group. F: Western blot analysis of ACC protein content andphosphorylation levels (ACC-P Ser79) in fed livers from Ad-shCT and Ad-shPck1 groups. Blots were normalized with �-tubulin. Representative



COLOR


unchanged fasting glycemia. Accordingly, fasting glycemiawas significantly reduced in treated animals whenPEPCK-C was 90% silenced (Supplementary Fig. 1).Improved glucose tolerance and insulinemia suggest

increased peripheral insulin sensitivity. Lower insulin lev-els could be secondary to reduced glycemia, however,phloridzin treatment, which inhibits intestinal glucoseuptake and renal reabsorption, has been shown to reduceglycemia with no effects on insulin sensitivity in a type 2diabetes mouse model (22). Moreover, an amelioratedintraperitoneal insulin tolerance test (IPITT) and higherinsulin-stimulated AKT phosphorylation in muscle andadipose tissue strongly support the hypothesis of aninsulin-sensitizing effect. In adipose tissue, AKT phosphor-ylation at Thr 308 was unchanged by either treatment.However, it has been shown that insulin-stimulated glu-cose uptake is independent of signaling through Thr308 andclosely matches Ser473 AKT-P levels (23). The QUICKIindex was also suggestive of an overall reduction in insulinresistance. In addition, hepatic PEPCK-C silencing im-proves clinical symptoms of type 2 diabetes, such aspolydipsia, polyuria, and glycosuria, as revealed by meta-bolic cage studies (data not shown). Cross talking be-tween liver and brain through the vagal nerve (24) couldbe responsible for a coordinated metabolic regulation inperipheral tissues in response to hepatic energy metabo-lism modulation, affecting systemic insulin sensitivity (25).Interestingly, despite hepatic lipid accumulation, AKT

phosphorylation was also evident in the liver of PEPCK-C–silenced mice. Hepatic lipidosis is commonly associatedwith the induction of insulin resistance through incom-pletely understood mechanisms. Recent reports have dem-onstrated that lipid-induced hepatic insulin resistance isnot mediated by fatty acid or TAG accumulation per se(26,27). Instead, diacylglycerol induces insulin resistancevia activation of PKCε translocation to the vicinity ofinsulin receptor substrate-2 (17). In agreement with AKTphosphorylation data, we have observed that PKCε is notmodulated by PEPCK-C silencing, reinforcing the currentview that lipid accumulation is not necessarily linked toinsulin resistance in the liver.Dislipidemia is associated with obesity and insulin re-

sistance in type 2 diabetes (28). PEPCK-C silencing re-sulted in reduced plasma TAG, together with an importantelevation of hepatic lipids, mainly nonsterified fatty acids.An important, not sufficiently appreciated role forPEPCK-C in the liver is glyceroneogenesis: the provisionof glycerol-3-phosphate to sustain fatty acid re-esterifica-tion for triglyceride synthesis (29,30). Therefore, PEPCK-Csilencing could induce a significant reduction in fatty acid

re-esterification activity. How to reconcile a concomitantincrease in liver TAG and a reduction of TAG in plasma isnot apparent. However, elevated fatty acids in the livercould be originated from excess import, reduced oxidationand/or increased de novo synthesis. Results presentedabove, support that PEPCK-C–silenced livers maintainmitochondrial function. Long- and medium-chain fattyacid oxidation is highly regulated through its import intothe mitochondria at the level of CPT-1. Reduced CPT-1mRNA levels in PEPCK-C–silenced animals, together withincreased malonyl-CoA content, a potent allosteric inhib-itor of CPT-1, provide indirect evidence for a slight inhi-bition of fatty acid oxidation. However, this allostericinhibition can be overridden by fatty acid abundance(31,32). Moreover, it is clear from our data that noblockade at the level of mitochondria is responsible for theaccumulation of fatty acids because O2 consumption in thepresence of octanoate, which is imported into mitochon-dria independently of CPT-1, is unaffected in PEPCK-C–silenced hepatocytes. Also, increased plasma ketones andcellular propionyl-CoA, is suggestive of maintained mito-chondrial and increased peroxisomal oxidation. Actually,after a low-dose ciprofibrate-mediated peroxisome prolif-eration, SOD expression is modulated with a similarpattern to that observed in our model (18).The contribution of de novo lipogenesis to the accumu-

lation of TAG and fatty acids seen in livers of Ad-shPck1treated mice can also be discarded. Key regulatory factorsinvolved in lipogenesis were either maintained (ChREBP)or reduced (SREBP1c and LXR-�). Lipogenic enzymesregulated by these factors (ACC and FAS) were unaltered,suggesting a main contribution of ChREBP in gene expres-sion regulation of these targets. Whether liver GK might bea target gene for SREBP1c-mediated induction has re-mained controversial (33,34). Our data revealed no alter-ation on GK mRNA or protein levels, suggesting that theLXR-�/SREBP1c axis is not directly regulating GK in ourmodel, in agreement with results obtained by Mitro et al.(35) using a LXR-� agonist.Fatty acid uptake and activation could instead contrib-

ute to the liver fat accumulation and to decreased serumTAG and FFA. FFA import and activation into the liver isan ATP consuming step that could be sustained by theincreased CEC. Therefore, lipid accumulation in the livermight be multifactorial, involving increased uptake fromperipheral fat stores and reduced triglyceride synthesis,VLDL assembly, and export.Liver-specific knockout animals are euglycemic and able

to bypass the complete absence of PEPCK-C activity intheir livers with extrahepatic gluconeogenesis (8). Burgess

TABLE 2Nucleotide and short-chain acyl-CoA content in fed db/db livers

AMP(�mol/g)

ADP(�mol/g)

ATP(�mol/g) CEC

Acetyl-CoA(nmol/g)

Propionyl-CoA (nmol/g)

Succinyl-CoA(nmol/g)

Malonyl-CoA(nmol/g)

Ad-shCT 1.05� 0.06 1.24� 0.08 1.02� 0.08 0.47� 0.01 140.13� 1.95 48.12� 0.84 31.44� 3.12 2.079� 0.239Ad-shPck1 0.77 � 0.11* 1.16� 0.07 1.47� 0.17† 0.54� 0.02† 130.29� 2.47 56.68� 1.25† 31.31� 2.10 4.472� 0.932*

Data are means � SE, n � 8; *P 0.05; †P 0.01 vs. control virus treatment; unpaired Student’s t test. Tissue was obtained 14 days aftertreatment. CEC � (ATP � 1/2 AMP)/(ATP � ADP � AMP).

blots from three independent experiments are shown. G: Liver cytosolic and membrane fraction were isolated as described in RESEARCH DESIGN AND

METHODS. Membrane and cytosol fractions (50 �g) were loaded in a 10% SDS-PAGE. PKC� protein content in each fraction was detected byWestern blot. Cellular fraction enrichment was assessed with immunodetection of membrane (EGFR) and cytosolic (L-PK) proteins. Represen-tative blots are shown. H: Densitometric quantification of blots shown in G demonstrates unaltered membrane translocation from cytosol ofPKC� after PEPCK-C silencing. Data are means � SE, n � 6. f, Ad-shCT; �, Ad-shPck1 group.



AQ: T

AQ: U

AQ: V


et al. (36) have presented data demonstrating a weak fluxcontrol coefficient for gluconeogenesis in partial PEPCK-Cknockout mice, suggesting that other factors like TCAcycle flux, could contribute to gluconeogenic flux indepen-dent of PEPCK protein content. Because PEPCK-C is notonly required for gluconeogenesis and glyceroneogenesis

but for cataplerosis (i.e., the removal of citric acid cycleanions), the failure of this process would result in animpairment in the TCA cycle and mitochondrial functionin the liver, leading to decreased �-oxidation and oxygenconsumption, together with a complete derangement inenergy metabolism (6,8,9,36). Data presented in this manu-

Routine FCCP0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

JO

2/ J

COX

CA

D

Ad-shCT Ad-shPck1

RCR 2.36 0.13 2.11 0.11

UCR 5.54 0.38 5.88 0.18

RCRP 0.24 0.01 0.31 0.03

B

E

F

γ-tubulin

Sirt-1shCT shPck1

-1-

AMPK-P

AMPK α

shCT shPck1

VDAC

γ -tub

shCT shPck1

SOD-1

SOD-2

γ -tubulin

shCT shPck1

0

20

40

60

80

100

***

Sirt1

(arb

itrar

y un

its)

G

Mitochondrial metabolism

ucp2 cpt1 hmgc2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

*

Rel

ativ

e m

RN

A le

vels

FIG. 6. Energy homeostasis in the liver in response to PEPCK-C silencing. A:High-resolution respirometry in isolated hepatocytes from fed mice 14 daysafter infection with Ad-shCT (f) or Ad-shPck1 (�) was measured in gluconeo-genic medium as described in RESEARCH DESIGN AND METHODS. Measurements of thedifferent mitochondrial chain respiratory states were as follows: Routine respi-ration was measured in the presence of octanoate, followed by the inhibition ofATP synthase with 1 �g/ml oligomycin, and uncoupled respiration was initiatedby the addition of 1 �mol/l FCCP followed by 5 �mol/l antimycin A to stoprespiration. Finally, cytochrome c oxidase (COX) activity (JCOX) was measuredin the presence of 2 mmol/l ascorbate and 500 �mol/l TMPD in each sample. COXactivity measurements served as internal measurement normalization. Inset:Respiratory indexes (44) were calculated as follows: RCR, an indicator of theextent of respiration uncoupling, is the quotient between fully uncoupledrespiration (FCCP) and the respiration in the presence of oligomycin. The UCR,an estimate of the respiratory capacity reserve, is the quotient between fullyuncoupled respiration (FCCP) and routine respiration (octanoate). Finally, theRCRP, a coefficient indicating the portion of respiratory capacity applied to ATP synthesis, is calculated by subtracting oligomycin respirationfrom routine respiration and dividing by FCCP respiration. Data are means � SE (n � 5). §P � 0.06, Student’s t test. B: Expression of significantgenes involved in mitochondrial function (ucp2, cpt1, and hmgc2) was examined in fed Ad-shCT (n � 10; f) or Ad-shPck1 (n � 11; �) animals.Total RNA was extracted with RNAeasy mini kit (Qiagen). cDNA synthesis was performed using Ready-To-Go You-Prime First Strand Beads(Amersham Biosciences) with random hexamers. Gene expression was quantified by quantitative RT-PCR using Applied Biosystems 7900HTMicro Fluidic Card, and data were analyzed using the Ct method. Gene expression was normalized using �-2-microglobulin as housekeepinggene. Values represent the mean relative amount of mRNA with respect to that in the control experimental treatment (Ad-shCT). *P < 0.05,Student’s t test. C: Mitochondrial inner membrane ADP transporter content VDAC, detected by Western blot, was used as indicator ofmitochondrial respiratory chain content. D: Cellular protein content of the cytosolic (SOD-1) and mitochondrial (SOD-2) forms of SOD were usedas indicators of cellular oxidative stress after hepatic PEPCK-C silencing as detected by Western blot. Representative blots are shown. E:Western blot analysis of AMPK protein content and phosphorylation levels (AMPK-P Thr 172) in fed livers from Ad-shCT and Ad-shPck1 groups.F: Sirt1 protein levels in fed livers form control (Ad-shCT) or PEPCK-C silencing adenovirus (Ad-shPck1) animals were estimated by Westernblotting. All blots were normalized using �-tubulin. Representative blots from three independent experiments are shown. G: Densitometricquantification of Sirt1 protein content in fed livers performed from blot shown in F confirms a significant reduction of the protein in Ad-shPck1

(�) compared with Ad-shCT (f) treatment group. Data are means � SE, n � 6; ***P < 0.001, Student’s t test.



AQ: W


script, together with our previous study in streptozotocin-induced diabetic animals (12), demonstrate that a 50%reduction of PEPCK expression results in reduced HGOand glycemia. In addition, mitochondrial respiration andCPT-1–independent �-oxidation of fatty acids is not af-fected, suggesting that TCA cycle flux was sustained aslong as intermediates (acetyl-CoA and succinyl-CoA) werenot accumulated and ketones were overproduced. Thediscrepancy among the various studies might be related toone of three factors: 1) Knockout mice have a completeablation of the PEPCK-C gene in the liver, in contrast tothe partial reduction in the enzyme described in this study.In fact, 90% reduction in PEPCK-C protein levels in theliver, obtained with higher adenoviral dosage (Supplemen-tary Fig. 1), reproduce the blockade on mitochondrialfunction observed in the knockout mice (36). 2) Adapta-tion to a lack of PEPCK-C in knockout animals as aconsequence of deletion of the gene very early duringdevelopment (37) may induce a compensatory increase ingluconeogenesis in tissues other than the liver. In thisregard, a recent study points to a disparity between resultsobtained from a liver Ppar-� knockout mouse and ashort-term knockdown model using chemically modifiedsiRNA against Ppar-� (38). 3) Studies on liver-specificknockout mice were directed toward understanding thephysiological role of PEPCK-C in the liver. To our knowl-edge, liver PEPCK-C knockout animals have not beenpreviously studied in relevant models of diabetes, such asthe one presented in this study.The coordinated regulation of several key players in

energy homeostasis in the livers of Ad-shPck1–treatedanimals is an intriguing observation. We have identifiedSirt1 as a probable mediator in the response of the cell toa partial reduction in PEPCK-C content. A nutrient signal-ing response mediated by pyruvate induces Sirt1 protein inliver during fasting, where it interacts with and deacety-lates PGC-1� in an NAD�-dependent manner, increasingPGC-1� ability to coactivate HNF-4� and, therefore, up-regulate gluconeogenic genes, but not mitochondrialgenes (20). In addition Sirt1-mediated deacetylation ofFOXO1 has been shown to promote its transcriptionalactivity over gluconeogenic genes (39,40), suggesting anintegrated regulation by insulin and Sirt1 over gluconeo-genesis in treated animals. Moreover, Sirt1 transcription isinhibited by a NADH-mediated mechanism (41). In thiscontext, Sirt1 seems to function as a nutrient sensor bydecoding fluctuations in cellular NADH levels. Therefore,our observation of a substantial reduction of Sirt1 identi-fies this nutrient sensor as a potential mediator of thecoordinated downregulation of gluconeogenesis. Recentdata from Sun et al. (42) have shown that oral administra-tion of resveratrol, an activator of Sirt1, improves glucosehomeostasis and insulin sensitivity mainly though its ac-tion on muscle. However, the potential for Sirt1 as atherapeutic target for diabetes in the liver is curtailed byits role in gluconeogenesis, as recently suggested byreduced HGO and improved glucose homeostasis andinsulin sensitivity in db/db mice after hepatic Sirt1 silenc-ing (43).All in all, we present evidence to sustain that partial

silencing of liver PEPCK-C in db/db mice leads to im-proved control of glycemia, insulinemia, and peripheralsensitivity to the hormone through its coordinate inhibi-tion of key players responsible for the activation of livergluconeogenesis, in the absence of a blockade at the levelof mitochondria. In addition, we show that this model

represents a departure from the view, recently challenged,that steatosis leads to insulin resistance. Finally, ourobservations join the growing body of evidence thatindicates that PEPCK-C plays a key role in the control ofhepatic energy metabolism in type 2 diabetes animals,validating liver PEPCK-C as a target for pharmaceuticalintervention. Nonetheless, in view of the known discrep-ancy between the large contribution of gluconeogenesis tohepatic glucose production in small rodent models ascompared to large animals (i.e., canine, human) the suit-ability of the approach should be further tested in a largeranimal model.

ACKNOWLEDGMENTS

Alicia G. Gomez-Valades has received a fellowship fromIDIBELL. Anna Vidal-Alabro has received a fellowshipfrom DURSI (Generalitat de Catalunya). Andres Mendezhas received a fellowship from F.P.I. (Ministerio de Edu-cacion y Ciencia). This study was supported by a grantfrom the Ministerio de Educacion y Ciencia (BFU2006-02802).We thank the Research Support Services from the

Biology Unit of Bellvitge (University of Barcelona) fortheir technical assistance, the UPV-CBATEG (UniversitatAutonoma de Barcelona) for amplification and preparationof adenovirus, Dr. Anna Serafin for her skillful assistancewith histopathology, and Dr. Maria Molas for her invalu-able assistance reviewing the manuscript.

REFERENCES

1. DeFronzo RA, Ferrannini E: Insulin resistance: a multifaceted syndromeresponsible for NIDDM, obesity, hypertension, dyslipidemia, and athero-sclerotic cardiovascular disease. Diabetes Care 14:173–194, 1991

2. Consoli A, Nurjhan N, Capani F, Gerich J: Predominant role of gluconeo-genesis in increased hepatic glucose production in NIDDM. Diabetes

38:550–557, 19893. Hanson RW, Reshef L: Regulation of phosphoenolpyruvate carboxykinase(GTP) gene expression. Annu Rev Biochem 66:581–611, 1997

4. Sun Y, Liu S, Ferguson S, Wang L, Klepcyk P, Yun JS, Friedman JE:Phosphoenolpyruvate carboxykinase overexpression selectively attenu-ates insulin signaling and hepatic insulin sensitivity in transgenic mice.J Biol Chem 277:23301–23307, 2002

5. Valera A, Pujol A, Pelegrin M, Bosch F: Transgenic mice overexpressingphosphoenolpyruvate carboxykinase develop non-insulin-dependent dia-betes mellitus. Proc Natl Acad Sci U S A 91:9151–9154, 1994

6. Burgess SC, Hausler N, Merritt M, Jeffrey FM, Storey C, Milde A, Koshy S,Lindner J, Magnuson MA, Malloy CR, Sherry AD: Impaired tricarboxylicacid cycle activity in mouse livers lacking cytosolic phosphoenolpyruvatecarboxykinase. J Biol Chem 279:48941–48949, 2004

7. She P, Shiota M, Shelton KD, Chalkley R, Postic C, Magnuson MA:Phosphoenolpyruvate carboxykinase is necessary for the integration ofhepatic energy metabolism. Mol Cell Biol 20:6508–6517, 2000

8. She P, Burgess SC, Shiota M, Flakoll P, Donahue EP, Malloy CR, SherryAD, Magnuson MA: Mechanisms by which liver-specific PEPCK knockoutmice preserve euglycemia during starvation. Diabetes 52:1649–1654, 2003

9. Hakimi P, Johnson MT, Yang J, Lepage DF, Conlon RA, Kalhan SC, ReshefL, Tilghman SM, Hanson RW: Phosphoenolpyruvate carboxykinase and thecritical role of cataplerosis in the control of hepatic metabolism. Nutr

Metab (Lond) 2:33, 200510. Cao H, van der Veer E, Ban MR, Hanley AJ, Zinman B, Harris SB, Young TK,Pickering JG, Hegele RA: Promoter polymorphism in PCK1 (phosphoenol-pyruvate carboxykinase gene) associated with type 2 diabetes mellitus.J Clin Endocrinol Metab 89:898–903, 2004

11. Landau BR, Wahren J, Chandramouli V, Schumann WC, Ekberg K, KalhanSC: Contributions of gluconeogenesis to glucose production in the fastedstate. J Clin Invest 98:378–385, 1996

12. Gomez-Valades AG, Vidal-Alabro A, Molas M, Boada J, Bermudez J,Bartrons R, Perales JC: Overcoming diabetes-induced hyperglycemiathrough inhibition of hepatic phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTP)with RNAi. Mol Ther 13:401–410, 2006

13. Zeini M, Hortelano S, Traves PG, Gomez-Valades AG, Pujol A, Perales JC,




Bartrons R, Bosca L: Assessment of a dual regulatory role for NO in liverregeneration after partial hepatectomy: protection against apoptosis andretardation of hepatocyte proliferation. FASEB J 19:995–997, 2005

14. Demoz A, Garras A, Asiedu DK, Netteland B, Berge RK: Rapid method forthe separation and detection of tissue short-chain coenzyme A esters byreversed-phase high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B

Biomed Appl 667:148–152, 199515. Hrebicek J, Janout V, Malincikova J, Horakova D, Cizek L: Detection ofinsulin resistance by simple quantitative insulin sensitivity check indexQUICKI for epidemiological assessment and prevention. J Clin Endocrinol

Metab 87:144–147, 200216. Saha AK, Ruderman NB: Malonyl-CoA and AMP-activated protein kinase:an expanding partnership. Mol Cell Biochem 253:65–70, 2003

17. Samuel VT, Liu ZX, Wang A, Beddow SA, Geisler JG, Kahn M, Zhang XM,Monia BP, Bhanot S, Shulman GI: Inhibition of protein kinase C epsilonprevents hepatic insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease.J Clin Invest 117:739–745, 2007

18. Dhaunsi GS, Singh I, Orak JK, Singh AK: Antioxidant enzymes in ciprofi-brate-induced oxidative stress. Carcinogenesis 15:1923–1930, 1994

19. Hardie DG, Hawley SA, Scott JW: AMP-activated protein kinase: develop-ment of the energy sensor concept. J Physiol 574:7–15, 2006

20. Rodgers JT, Lerin C, Haas W, Gygi SP, Spiegelman BM, Puigserver P:Nutrient control of glucose homeostasis through a complex of PGC-1alphaand SIRT1. Nature 434:113–118, 2005

21. Ruijter JM, Gieling RG, Markman MM, Hagoort J, Lamers WH: Stereologi-cal measurement of porto-central gradients in gene expression in mouseliver. Hepatology 39:343–352, 2004

22. Zhao H, Yakar S, Gavrilova O, Sun H, Zhang Y, Kim H, Setser J, Jou W,LeRoith D: Phloridzin improves hyperglycemia but not hepatic insulinresistance in a transgenic mouse model of type 2 diabetes. Diabetes

53:2901–2909, 200423. Ono H, Katagiri H, Funaki M, Anai M, Inukai K, Fukushima Y, Sakoda H,Ogihara T, Onishi Y, Fujishiro M, Kikuchi M, Oka Y, Asano T: Regulation ofphosphoinositide metabolism, Akt phosphorylation, and glucose transportby PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10) in3T3–L1 adipocytes. Mol Endocrinol 15:1411–1422, 2001

24. Pocai A, Obici S, Schwartz GJ, Rossetti L: A brain-liver circuit regulatesglucose homeostasis. Cell Metab 1:53–61, 2005

25. Uno K, Katagiri H, Yamada T, Ishigaki Y, Ogihara T, Imai J, Hasegawa Y,Gao J, Kaneko K, Iwasaki H, Ishihara H, Sasano H, Inukai K, Mizuguchi H,Asano T, Shiota M, Nakazato M, Oka Y: Neuronal pathway from the livermodulates energy expenditure and systemic insulin sensitivity. Science

312:1656–1659, 200626. Monetti M, Levin MC, Watt MJ, Sajan MP, Marmor S, Hubbard BK, StevensRD, Bain JR, Newgard CB, Farese RV Sr, Hevener AL, Farese RV Jr:Dissociation of hepatic steatosis and insulin resistance in mice overex-pressing DGAT in the liver. Cell Metab 6:69–78, 2007

27. Choi CS, Savage DB, Kulkarni A, Yu XX, Liu ZX, Morino K, Kim S, DistefanoA, Samuel VT, Neschen S, Zhang D, Wang A, Zhang XM, Kahn M, Cline GW,Pandey SK, Geisler JG, Bhanot S, Monia BP, Shulman GI: Suppression ofdiacylglycerol acyltransferase-2 (DGAT2), but not DGAT1, with antisenseoligonucleotides reverses diet-induced hepatic steatosis and insulin resis-tance. J Biol Chem 282:22678–22688, 2007

28. Kahn SE, Prigeon RL, Schwartz RS, Fujimoto WY, Knopp RH, Brunzell JD,Porte D Jr: Obesity, body fat distribution, insulin sensitivity and islet

beta-cell function as explanations for metabolic diversity. J Nutr 131:354S–360S, 2001

29. Beale EG, Hammer RE, Antoine B, Forest C: Glyceroneogenesis comes ofage. FASEB J 16:1695–1696, 2002

30. Kalhan SC, Mahajan S, Burkett E, Reshef L, Hanson RW: Glyceroneogen-esis and the source of glycerol for hepatic triacylglycerol synthesis inhumans. J Biol Chem 276:12928–12931, 2001

31. Drynan L, Quant PA, Zammit VA: Flux control exerted by mitochondrialouter membrane carnitine palmitoyltransferase over beta-oxidation, keto-genesis and tricarboxylic acid cycle activity in hepatocytes isolated fromrats in different metabolic states. Biochem J 317:791–795, 1996

32. Drynan L, Quant PA, Zammit VA: The role of changes in the sensitivity ofhepatic mitochondrial overt carnitine palmitoyltransferase in determiningthe onset of the ketosis of starvation in the rat. Biochem J 318:767–770,1996

33. Hansmannel F, Mordier S, Iynedjian PB: Insulin induction of glucokinaseand fatty acid synthase in hepatocytes: analysis of the roles of sterol-regulatory-element-binding protein-1c and liver X receptor. Biochem J

399:275–283, 200634. Gregori C, Guillet-Deniau I, Girard J, Decaux JF, Pichard AL: Insulinregulation of glucokinase gene expression: evidence against a role forsterol regulatory element binding protein 1 in primary hepatocytes. FEBS

Lett 580:410–414, 200635. Mitro N, Mak PA, Vargas L, Godio C, Hampton E, Molteni V, Kreusch A,Saez E: The nuclear receptor LXR is a glucose sensor. Nature 445:219–223,2007

36. Burgess SC, He T, Yan Z, Lindner J, Sherry AD, Malloy CR, Browning JD,Magnuson MA: Cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinase does notsolely control the rate of hepatic gluconeogenesis in the intact mouse liver.Cell Metab 5:313–320, 2007

37. Tilghman SM, Belayew A: Transcriptional control of the murine albumin/alpha-fetoprotein locus during development. Proc Natl Acad Sci U S A

79:5254–5257, 198238. De Souza AT, Dai X, Spencer AG, Reppen T, Menzie A, Roesch PL, He Y,Caguyong MJ, Bloomer S, Herweijer H, Wolff JA, Hagstrom JE, Lewis DL,Linsley PS, Ulrich RG: Transcriptional and phenotypic comparisons ofPpara knockout and siRNA knockdown mice. Nucleic Acid Res 34:4486–4494, 2006

39. Nakae J, Cao Y, Daitoku H, Fukamizu A, Ogawa W, Yano Y, Hayashi Y: TheLXXLL motif of murine forkhead transcription factor FoxO1 mediatesSirt1-dependent transcriptional activity. J Clin Invest 116:2473–2483, 2006

40. Frescas D, Valenti L, Accili D: Nuclear trapping of the forkhead transcrip-tion factor FoxO1 via Sirt-dependent deacetylation promotes expression ofglucogenetic genes. J Biol Chem 280:20589–20595, 2005

41. Zhang Q, Wang SY, Fleuriel C, Leprince D, Rocheleau JV, Piston DW,Goodman RH: Metabolic regulation of SIRT1 transcription via a HIC1:CtBPcorepressor complex. Proc Natl Acad Sci U S A 104:829–833, 2007

42. Sun C, Zhang F, Ge X, Yan T, Chen X, Shi X, Zhai Q: SIRT1 improves insulinsensitivity under insulin-resistant conditions by repressing PTP1B. Cell

Metab 6:307–319, 200743. Rodgers JT, Puigserver P: Fasting-dependent glucose and lipid metabolicresponse through hepatic sirtuin 1. Proc Natl Acad Sci U S A 104:12861–12866, 2007

44. Kuznetsov AV, Strobl D, Ruttmann E, Konigsrainer A, Margreiter R,Gnaiger E: Evaluation of mitochondrial respiratory function in smallbiopsies of liver. Anal Biochem 305:186–194, 2002 o:p




ADDENDUM: TRANSFERÈNCIA GÈNICA NO VÍRICA

MEDIADA PER RECEPTOR

Addendum

INTRODUCCIÓ

Les tècniques de transferència gènica mediada per receptor aprofiten la capacitat dels receptors de membrana d’una gran varietat de tipus cel·lulars d’unir i internalitzar un lligand. Un vector de transferència gènica mediada per receptor consta de l’àcid nucleic (que pot ser DNA plasmídic, oligonucleòtids, RNA o quimeres de DNA/RNA) conjugat a un policatió unit covalentment al lligand, que serà reconegut pel receptor (Figura 81).

àcid nucleïc lligand policatió

compactació

Complex de transferència gènica mediada per receptor

Figura 81. Elements que configuren un vector no viral per a la transferència gènica mediada perreceptor.

Durant el procés d’endocitosi mediada por receptor existeixen diferents barreres que l’oligonucleòtid ha de superar abans d’arribar al nucli (Figura 82). El primer pas en l’endocitosi mediada per receptor és la unió específica del receptor amb el seu lligand, es formen vesícules endocítiques primàries que internaliltzen aquests complexos i es fusionen entre elles formant endosomes de reciclatge. Durant la migració a través del citoplasma, es va acidificant el compartiment endosomal. Aquesta acidificació provoca la ruptura de les unions sensibles a pH entre el lligand i el receptor, cosa que desemboca en la dissociació entre ambdós. El receptor és reciclat pels endosomes de reciclatge cap a la membrana plasmàtica. El lligand es va acumulant als endosomes tardans, als quals es fusionen vesícules que contenen enzims lisosòmics, induint la maduració d’aquests endosomes tardans cap a lisosomes madurs. Idealment, el vector hauria de ser capaç d’escapar dels endosomes abans de ser degradats. Un cop al citoplasma el material genètic, quan es tracta de cDNA que s’ha transcriure, ha de

- 269 -

Transferencia gènica no vírica mediada per receptor

translocar al nucli. Finalment, l’expressió del material genètic ha d’exercir una activitat terapèutica, a nivell local o sistèmic.

2

3

5

6

7

membranaplasmàtica

nucli

1

8

1. Estabilitat al corrent sanguini2. Reconeixemen específic i afí receptor-lligand3. Endocitosi4. Resistència a la degradació per nucleases

cel·lulars5. Escapada de l’endosoma6. Alliberació del material genètic del complex

policationic7. Translocació al nucli8. Persistència al nucli, expressió del DNA i

efecte terapèutic

4

Figura 82. Factors limitants en la internalització del complex DNA-policatió.

Compactació del DNA En els vectors no virals de teràpia gènica basats en la poli-L-lisina (policatió que aporta amines protonables), aquesta té la doble funció de condensar el DNA (polianió) per interaccions electroestàtiques i proveïr un lloc d’anclatge al lligand. Estudis previs del grup han demostrat que la compactació de DNA amb polímers de lisina en una solució concentrada de sals proporcionava complexos metaestables de mida petita (� 30 nm) compatibles amb l’endocitosi a través del receptor de l’asialoglioproteïna, present als hepatòcits (1-7). La compactació del DNA amb una cinètica cooperativa en solució aquosa ja ha estat prèviament descrita al laboratori (8) (Figura 83).

- 270 -

Addendum

Poli-L-lisinaDNA

[DNA

]Figura 83. Diagrama esquemàtic de la unió de la poli-L-lisina al DNA en aigua i en presència d’un excèsde policatió. Quan a una solució de poli-L-lisina a alta concentració se li addicionen alíquotes de DNA en quantitats subestequiomètriques s’afavoreix la unió cooperativa del policatió al DNA. En aquestes condicions es formen partícules monomoleculars de diàmetre reduït i estructure definida. El diàmetre de la partícula resultant és proporcional al pes molecular del DNA compactat.

Estabilitat en fluids fisiològics Els principals obstacles per a una eficient transferència gènica mediada per receptor in vivo continua essent la biodisponibilitat dels complexes i, en últim terme, l’entrada al nucli. El transport eficient del complexe DNA/policatió del lloc de la injecció fins a la cèl·lula diana depèn de múltiples factors que anatòmics, biològics i fisiològics. La primera gran limitació que hom es troba és l’estabilitat dels complexos en fluids fisiològics. Prèviament en el grup, Molas et al. (9) ja van demostrar que les partícules de DNA/Gal-pK compactades eren incapaces de mediar transferència gènica per receptor in vitro. No obstant, aquests complexos es tornen molt inestables en presència de concentracions fisiològiques de ions i tendeixen a agregar i precipitar. Tanmateix, de la mateixa manera que l’estabilitat del complex en fluids fisiològics és essencial per a la seva distribució en el corrent sanguini fins al teixit diana, un cop dins de la cèl·lula és precís que el polímer sigui capaç d’alliberar el DNA per a permetre la seva entrada al nucli i, en últim terme, s’expressi. Addicionalment, s’ha vist que la càrrega de la partícula és un factor determinant en el disseny dels vector no virals en els que la internalització a la cèl·lula és mediada per receptor (9). S’ha demostrat que només les partícules amb una càrrega superficial propera a la neutralitat permeten una la internalització del vector a través de la interacció específica entre el receptor cel·lular i el lligand del vector (10).

- 271 -

Transferencia gènica no vírica mediada per receptor

El treball que s’adjunta descriu la generació de co-polímers de L-lisina-L-serina i L-lisina-L-triptòfan amb l’objectiu de millorar les característiques biofísiques dels complexos de DNA-poli-L-lisina i, en definitiva, d’inhibir-ne l’agregació quan són diluïts en solucions fisiològiques. En el present estudi hipotetitzem que les forces de van der Waals que promouen l’agregació de les partícules en presència de sals poden ser contrarestades augmentant, o bé la hidrofilicitat, o bé la hidrobobitat en la superfície. Hem estudiat la relació entre les característiques hidrofílica/hidrofòbica del co-polímer i l’estabilitat en solucions fisiològiques dels complexos que forma.de sals es va optar per donar hidriofilicitat a la superfície dels complexos (afegint serina al polimer de lisina), o donar-li una capacitat estèrica amb caracteístiques hidrofòbiques i apolars (afegint triptòfan). Per a fer els co-polímers específics de receptor se’ls hi va unir un residu galactosil, de manera que els polímers s’uneixin al receptor d’asialoglicoproteïna, i sigui així internalitzat per la via endocítica. S’ha realitzat un estudi exhaustiu de les seves característiques biofísiques en relació a la mida de les partícules formades, l’estabilitat en fluids fisiològics, la capacitat d’alliberació del contingut genètic i la capacitat de mediar la transferència gènica in vivo.

- 272 -

Addendum

BIBLIOGRAFIA

1. Perales JC, Ferkol T, Beegen H, Ratnoff OD, Hanson RW: Gene transfer in vivo: sustained expression and regulation of genes introduced into the liver by receptor-targeted uptake. Proc Natl Acad Sci U S A 91:4086-4090, 1994 2. Ferkol T, Perales JC, Eckman E, Kaetzel CS, Hanson RW, Davis PB: Gene transfer into the airway epithelium of animals by targeting the polymeric immunoglobulin receptor. J Clin Invest 95:493-502, 1995 3. Ferkol T, Perales JC, Mularo F, Hanson RW: Receptor-mediated gene transfer into macrophages. ProcNatl Acad Sci U S A 93:101-105, 1996 4. Garcia-Valenzuela E, Rayanade R, Perales JC, Davidson CA, Hanson RW, Sharma SC: Axon-mediated gene transfer of retinal ganglion cells in vivo. J Neurobiol 32:111-122, 1997 5. Perales JC, Grossmann GA, Molas M, Liu G, Ferkol T, Harpst J, Oda H, Hanson RW: Biochemical and functional characterization of DNA complexes capable of targeting genes to hepatocytes via the asialoglycoprotein receptor. J Biol Chem 272:7398-7407, 1997 6. Ferkol T, Mularo F, Hilliard J, Lodish S, Perales JC, Ziady A, Konstan M: Transfer of the human Alpha1-antitrypsin gene into pulmonary macrophages in vivo. Am J Respir Cell Mol Biol 18:591-601, 1998 7. Liu G, Molas M, Grossmann GA, Pasumarthy M, Perales JC, Cooper MJ, Hanson RW: Biological properties of poly-L-lysine-DNA complexes generated by cooperative binding of the polycation. J Biol Chem 276:34379-34387, 2001 8. Molas M, Bartrons R, Perales JC: Single-stranded DNA condensed with poly-L-lysine results in nanometric particles that are significantly smaller, more stable in physiological ionic strength fluids and afford higher efficiency of gene delivery than their double-stranded counterparts. Biochim Biophys Acta 1572:37-44, 2002 9. Molas M, Gomez-Valades AG, Vidal-Alabro A, Miguel-Turu M, Bermudez J, Bartrons R, Perales JC: Receptor-mediated gene transfer vectors: progress towards genetic pharmaceuticals. Curr Gene Ther 3:468-485, 2003 10. Schaffer DV, Lauffenburger DA: Optimization of cell surface binding enhances efficiency and specificity of molecular conjugate gene delivery. J Biol Chem 273:28004-28009, 1998

- 273 -

Copolymers of poly-l-lysine with serine and tryptophan form

stable DNA vectors: implications for receptor-mediated

gene transfer

A.G. Gomez-Valades, M. Molas, A. Vidal-Alabro,

J. Bermudez, R. Bartrons, J.C. Perales*

Unitat de Biofısica, Departament de Ciencies Fisiologiques II, IDIBELL-Universitat de Barcelona,

Feixa Llarga s/n, 08907 L’Hospitalet, Spain

Received 28 May 2004; accepted 29 September 2004

Available online 14 November 2004

Abstract

Inefficient gene transfer and poor stability in physiological medium are important shortcomings for receptor-mediated

gene transfer vectors. Here, we evaluate vectors formulated with random copolymers of l-lysine/l-serine (3:1) and l-lysine/

l-tryptophan (4:1), focusing on both their biophysical and functional characterization. By means of dynamic light scattering

(DLS) and transmission electron microscopy (TEM), we demonstrate that poly-l-lysine (pK), poly-l-lysine-l-tryptophan

(pKW) and poly-l-lysine-l-serine (pKS) are able to form compacted, small particles when mixed with plasmid DNA in the

absence of salt. Upon dilution in physiological medium, copolymers of both lys/ser and lys/trp do not aggregate, in contrast

with poly-l-lysine DNA complexes as determined by scattering, DLS and TEM measurements. Tight packing, as

demonstrated by resistance to heparin, SDS and trypsin treatments, is also featured in tryptophan-containing complexes.

Successful receptor-mediated endocytosis gene transfer using galactosylated copolymers into cells expressing the

asiagloglycoprotein receptor correlated with lack of aggregation. Particles obtained using galactosylated poly-l-lysine-l-

tryptophan (Gal-pKW) copolymer demonstrated specific receptor-mediated gene transfer since reporter gene activity

dropped in the presence of an excess ligand in the culture medium during transfection. Although copolymers of

galactosylated poly-l-lysine-l-serine (Gal-pKS) do not aggregate in the presence of salt, they are not able to internalize in a

specific receptor-mediated endocytosis fashion.

The introduction of bulky aromatic/hydrophobic (tryptophan) or hydrophillic (serine) moieties into the positively

charged vectors allows the compacted particles to disperse into salt-containing medium avoiding salt-induced

0168-3659/$ - see front matter D 2004 Elsevier B.V. All rights reserved.

doi:10.1016/j.jconrel.2004.09.020

Abbreviations: CMV, cytomegalovirus; DLS, dynamic light scattering; Luc, Photinus pyralis luciferase; PEG, poly-(ethylenglycol); pK,

poly-l-lysine; pKS, poly-l-lysine-l-serine; pKW, poly-l-lysine-l-tryptophan; Gal-pK, galactosylated poly-l-lysine; Gal-pKS, galactosylated

poly-l-lysine-l-serine; Gal-pKW, galactosylated poly-l-lysine-l-tryptophan; S.E.M., standard error of the mean; TEM, transmission electron

microscopy.

* Corresponding author. Tel.: +34 93 4024295; fax: +34 93 4024268.

E-mail address: [email protected] (J.C. Perales).

Journal of Controlled Release 102 (2005) 277–291

www.elsevier.com/locate/jconrel

GENEDELIVERY

aggregation. Moreover, tryptophan-containing particles are able to mediate specific gene transfer via receptor-mediated

endocytosis.

D 2004 Elsevier B.V. All rights reserved.

Keywords: Nonviral gene delivery; DNA condensation; Receptor-mediated gene transfer; Poly-l-lysine; Poly-l-lysine-l-serine; Poly-

l-lysine-l-tryptophan

1. Introduction

Nonviral gene transfer vectors are very attractive

candidate drug delivery agents for the pharmaceutical

treatment of genetic disorders [1–6], but they still

suffer from several drawbacks, mainly poor gene

transfer efficiency and stability in physiological

medium. Among all nonviral strategies, receptor-

mediated gene transfer is especially suitable for the

development of genetic pharmaceuticals and has been

shown to successfully introduce DNA into targeted

cells both in vitro and in vivo with the advantage of its

modular design and safety (reviewed in Refs. [7,8]).

This approach involves the formation of a complex

between a polycation [i.e., poly-l-lysine (pK)] that

has a covalently linked ligand specific for a cell type,

and the DNA. The overall level of expression of the

transgene in the host cell depends on many factors,

including the stability of the complex.

The nature of the vectors commonly used today is

highly ionic, since they are built upon the noncovalent

electrostatic interaction between two polyelectrolites:

the DNA and a polycation. In a typical formulation,

the polycation in the absence of salt tends to neutralize

the DNA, promoting aggregation by means of the

predominant attractive van der Waals forces resulting

from neutralization of ionic charges [9–11]. However,

at high polycation concentrations, the particle net

positive charge or the excess charged polymer in

solution is sufficient to maintain it in suspension.

Nevertheless, it is known that even polycation/DNA

complexes that are stable in water with an excess

polycation tend to either uncouple or aggregate and

precipitate at physiological concentrations of salt and

serum proteins [12–14], contributing to poor systemic

biodistribution and half-life. Whereas stability in

physiological medium is not very important for in

vitro gene transfer (successful nontargeted transfec-

tion in vitro usually involves aggregation and precip-

itation of the DNA complexes onto the cell surface), it

is the first determinant for vector bioavailability and

efficiency in vivo, altogether influenced by the

vector’s biophysical characteristics and structure in

the DNA compacting medium [15–17]. Thus, proper

formulation is very important in order to achieve

stable DNA complexes. In this regard, there is general

agreement that stabilization of the particle, either

steric (by means of covering attractive forces) or

electrostatic (creating repulsive forces), could be of

importance when designing a nonviral gene therapy

vector [8,18–20].

Current artificial self-assembling systems can be

obtained from a condensing polycationic moiety and a

plasmid DNA for receptor-mediated gene transfer

applications that are sterically or electrostatically

stabilized. For example, vectors obtained from copoly-

mers of the condensing polycationic moiety (i.e., poly-

l-lysine) and polyethylenglycol (PEG) result in

structural entities which are stable in physiological

ionic strength mainly by blocking the electrostatic

interaction of polycation condensed DNA particles in

the presence of salt [18,21–24]. PEG is being widely

used to provide steric stabilization and increased

polymer/DNA complex’s half-life in the bloodstream.

This type of complex confers increased stability in the

presence of salt and serum via solvent exclusion [25–

29]. Although successful targeting using pegylated

delivery systems [30,31] has been reported, difficulties

associated with recognition and efficient receptor-

mediated endocytosis of PEG containing targeted

complexes have also been demonstrated [23,32],

limiting its use for receptor-targeted gene transfer.

We have previously designed vectors that are

metastable at high concentrations of salt, allowing the

formation of unimolecular DNA complexes of mini-

mum size [1–3,33,34]. The process of DNA condensa-

tion at high salt concentration is facilitated by the

cooperative electrostatic neutralization of the polyan-

A.G. Gomez-Valades et al. / Journal of Controlled Release 102 (2005) 277–291278

GENEDELIVERY

ion (DNA) that ensures proper, tight compaction into

small particles that show enhanced delivery via

receptor-mediated endocytosis [33,34]. Recently, it

has been demonstrated that small-sized vectors of

DNA and poly-l-lysine are more amenable for trans-

location to the nucleus of postmitotic cells and that size

imposes an absolute constrain for nuclear import [15].

Disadvantages associated with the use of bhighsaltQ or pegylated DNA complexes for receptor-

mediated gene transfer experiments prompted us to

envision new avenues for particle stabilization of

polycation condensed DNA. In this study, we evaluate

novel vectors obtained from random copolymers of l-

lysine and l-tryptophan (bulky hydrophobic/aromatic

moiety), and l-lysine and l-serine (hydrophilic

moiety), as DNA transfection reagents focusing on

their biophysical characterization in regard to physical

stability in physiological medium and their function-

ality as receptor-mediated endocytosis-based vectors.

We found that all three copolymers are able to form

compacted particles of plasmid DNA in the absence of

salts and promote nonspecific gene transfer at similar

levels into established cell lines in vitro. The stability

in the presence of salt and tighter packing observed

for the copolymer of lysine and tryptophan correlated

positively with receptor-mediated endocytosis of the

DNA particle when directed towards the asialoglyco-

protein receptor.

2. Materials and methods

2.1. Chemicals

Poly-l-lysine (Cat # P7890), poly-l-lysine-l-tryp-

tophan (pKW; random copolymer, 4:1 lys–trp. Cat #

P9285), poly-l-lysine-l-serine (pKS; random copoly-

mer, 3:1 lys–ser. Cat # P9160) and h-d-galactopyr-anosyl phenyl isothiocyanate (Cat # G3141) were

obtained from Sigma (St. Louis, MO, USA). Media,

serum and antibiotics were obtained from Life

Technologies (Grand Island, NY, USA). Minimal

media (MEM and BME) were from GIBCO-BRL.

2.2. Cell culture

The human hepatoma cell line HuH-7 was main-

tained in Dulbecco’s Modified Medium Glutamax

(DMEM; GIBCO-BRL) supplemented with 10% fetal

bovine serum (FBS), 100 units/ml penicillin and 100

Ag/ml streptomycin.

2.3. Reporter genes and plasmid preparation

The expression vector pCES-luc-SV (6.9 kb in

length) was kindly provided by Dr. Mark Cooper and

contains the elongation factor-1 promoter and the

cytomegalovirus (CMV) enhancer linked to the

luciferase gene from Photinus pyralis. Plasmid DNA

was prepared using Endo-Free Maxi Prep kits

(Sigma), and contained no detectable bacterial

genomic DNA or RNA contamination by DNA gel

electrophoresis. Plasmid DNA preparations had less

than 30% open circular or linear DNA.

2.4. Production of galactosylated poly-l-lysine, poly-

l-lysine-l-serine and poly-l-lysine-l-tryptophan

Poly-l-lysine or the copolymers were galactosy-

lated as described previously [35]. Briefly, 10 mg of

poly-l-lysine-HBr (Sigma P-2636, 178 lysine residues

in average unless otherwise noted) in 2 ml of water was

reacted with 1433 Ag of h-d-galactopyranosyl phenylisothiocyanate (Gal-PITC; 5 mg/ml) in a 50% N,N-

dimethyl formamide–50% water solution. Concentra-

tions used when galactosylating copolymers were

adjusted to the corrected amount on the basis of the

ratio of lys to ser or trp. The reaction was adjusted to pH

9.5 (pH 9.0 for lys/trp and lys/ser copolymers) by the

addition of 1/10 volume of 1 M sodium carbonate pH

9.5 and water to a final volume of 5 ml. The tube was

rocked in the dark for 16 h at room temperature, and

then dialyzed against 500 ml of water for 2 days with

two changes of water per day using Spectra-Por

dialysis tubing (3500 M.W. cutoff; Fisher Scientific,

Pittsburgh, PA, USA). The reaction results in galacto-

sylation of 5% of the amino groups present in the

solution. The amount of galactose derivative present in

the galactosylated poly-l-lysine (Gal-pK) can be

calculated from internal standard concentrations of

Gal-PITC by measuring its absorbance at 254 nm.

2.5. Preparation of compacted DNA complexes

Condensation was carried out by slowly adding

dropwise aliquots of an aqueous solution of plasmid

A.G. Gomez-Valades et al. / Journal of Controlled Release 102 (2005) 277–291 279

GENEDELIVERY

DNA (50 Ag/ml) to a solution containing equal

volume of polycation at a concentration of 200 Ag/ml while continuously mixing (N/P=8). The DNA and

poly-l-lysine concentrations used were as described

above unless otherwise noted (as for N/P=2 and N/

P=4). Aliquots of about 50 Al were used and the

procedure generally lasted about 5–10 min depending

on the volume.

2.6. Size determination using dynamic light scattering

(DLS)

A Zetasizer 1000HS photon correlator spectrom-

eter (Malvern Instruments, UK) equipped with a 10-

mW, 633-nm laser and APD was used for DLS

analysis of compacted complexes both in water and

after dilution in 150 mM NaCl. MEM could not be

used for dilution since it absorbs light from the laser.

Analysis was performed in automatic mode (analysis

performed using 10 subruns) and a multimodal

analysis (CONTIN) was selected to best fit the data

to obtain the mean diameter of the sample particle

population.

2.7. Transmission electron microscopy

Samples were applied for 1 min to a carbon-coated

copper grid (Electron Microscopy Sciences, Fort

Washington, PA, USA), quickly washed in water

and immersed in the contrast stain solution (0.04%

uranyl acetate in methanol) for 1 min. Grids were

blotted, air-dried and examined in a JEOL-100C

transmission microscope at a magnification of

19,000. The microscope was calibrated using the

87.5-2 spacing from a catalase crystal grid [36].

The average size of the DNA complexes in each

sample was calculated by measuring the diameter of at

least 50 particles using a scanned image of the

negative, electronically increasing the magnification

to 95,000� from the original negative (19,000�).

Size was measured in spherical particles.

2.8. Aggregation assays

A kinetic assay was devised to evaluate the

increased turbidity resulting from aggregation of the

DNA complexes upon dilution in salt-containing

solutions. The complexes in aqueous solution were

diluted 1:10 in minimal medium (MEM, GIBCO-

BRL). Three hundred and sixty microliters of MEM

was placed in a spectrophotometer cuvette and the

basal absorbance was used to zero the device. The

reactions were started by adding 40 Al of the DNA

complex solution to the medium and quickly mixing.

At 2-s intervals, the absorbance at 320 nm was

obtained for a total of 60 s. Scattering intensity time

tracing was also used to describe the aggregative

behavior of DNA complexes upon dilution into 150

mM NaCl. The reactions were started by adding 50 Alof the DNA complex to the medium and quickly

mixing. At 5-s intervals, the intensity (no attenuation)

of the scattered light was measured using a Zetasizer

1000HS photon correlator for a total of 110 s using

the manufacturer’s provided software.

2.9. Unpacking and gel retardation assays

Twenty microliters from the aqueous complex

solution (approx. 0.5 Ag of plasmid DNA) was

incubated 60 min with either (i) 0.05% trypsin at 37

8C, (ii) 0.2% SDS [17] or (iii) 0.9% heparin [37].

After short vortexing, the mix was analyzed in a 1%

agarose electrophoresis gel.

2.10. Receptor-mediated gene transfer assays

DNA transfection was performed when cells

reached approximately 30–50% confluence, i.e., 1

day after seeding of 0.8�106 cells into 6-well plates.

Calcium chloride concentration in the transfecting

medium (BME) was 1.8 mM and was not further

supplemented. Each well was transfected by adding

DNA solution containing 1 Ag of DNA directly to 0.5

ml of culture medium. Cells were exposed to DNA

complex solution for 2 h at 37 8C in the presence or

absence of 100 mM lactose as a competitor for

binding to the asialoglycoprotein receptor. The

medium was then removed and the cells were rinsed

twice with phosphate-buffered saline. Cells were then

placed in fresh DMEM supplemented with 10% fetal

bovine serum and incubated 48 h before analysis.

2.11. Luciferase activity in cell extracts

Transfection efficiencies were determined 48 h

posttransfection using the Luciferase Assay System


GENEDELIVERY

from Promega (Madison, WI, USA) following the

protocol provided by the manufacturer.

2.12. Measurements of f potential

The f potential of the various DNA/complex

solutions were determined in a Zetasizer 4 (Malvern)

based on the laser-Doppler microelectrophoresis

technique. The f potential was calculated from their

electrophoretic mobility by means of the Henry

correction of the Smoluchowski equation [38],

l ¼ 2ef3g

f jað Þ

where l is the micelle electrophoretic mobility, g is

the aqueous solution viscosity (8.9�10�3 Pad s), and f

(ja) is the Henry coefficient. In this work, f (ja) of1.5 was used throughout these measurements. Experi-

ments were performed in triplicate, and the results

given are the average of four measurements at the

stationary level. The standard deviation of f potential

values was lower than 5% of the mean.

2.13. Statistics

Graphpad Prism v. 4.0.1 software was used to

perform graphing and statistical tasks. Multiple

comparison analysis was performed using one-way

ANOVA statistical analysis and Newman–Keuls

posttest. Multiple set comparisons were performed

using a two-way ANOVA for two variables and a

Bonferroni posttest.

3. Results

3.1. Size and shape of DNA complexes

All three unmodified polymers utilized in these

studies, poly-l-lysine (pK), poly-l-lysine-l-trypto-

phan (pKW) and poly-l-lysine-l-serine (pKS), were

obtained from Sigma and ranged between 15,000 and

20,000 Da average molecular weight. Copolymers are

randomly distributed with an input ratio of 1:3 (serine/

lysine) and 1:4 (tryptophan/lysine). The choice of

polymers aimed at inhibiting aggregation of DNA

complexes obtained with an excess polycation upon

dilution in salt-containing media by increasing hydro-

phillicity in the surface of the DNA particles

(incorporating l-serine) or steric shielding in a

hydrophobic and apolar dispersion (incorporating l-

tryptophan residues). We designed these vectors as

targets for the asialoglycoprotein receptor by attaching

a galactosyl moiety to the lysine epsilon amino group

present in the polymers as described in Materials and

methods.

We planned an initial set of experiments to

determine basic biophysical characteristics of the

complexes prepared in water by adding DNA to an

excess polycation. Compaction of DNA using this

basic formulation has been previously reported [17].

pCES-luc-SV (6.9 kb) plasmid DNA, encoding a

reporter luciferase gene, was condensed by addition of

the polymers at different charge ratios: N/P=2, N/P=4

and N/P=8, and their size determined using DLS. Data

for this initial set of experiments is summarized in

Table 1 and demonstrated that N/P=2 was not

Table 1

DLS and TEM mean diameter of DNA particles

N/P=2 N/P=4 N/P=8

Gal-pK Gal-pKS Gal-pKW Gal-pK** Gal-pKS*** Gal-pKW*** Gal-pK### Gal-pKS## Gal-pKW

Z average diameter

(mean nmFS.D.)a286F28.8 146.5F1 260.3F3.1 236.3F2 84.5F0.9 74.9F0.7 66.3F6.3 65.9F6.3 73.7F8.8

TEM diameter

(mean nmFS.E.)bnd nd nd nd nd nd 30.6F1.1 36.6F1.6 33.1F0.9

Two approaches were used to estimate the mean diameter of the particles: adynamic light scattering and bmanual sizing analysis of TEM

micrographs. Values represent the meanFS.D. from five independent experiments (DLS) and meanFS.E. from at least 50 particles measured in

a micrograph. nd, not determined.

** pb0.01, each copolymer was compared at charge ratios N/P=4 versus N/P=2, using a one-way ANOVA and a Newman-Keuls posttest.

*** pb0.001, each copolymer was compared at charge ratios N/P=4 versus N/P=2, using a one-way ANOVA and a Newman-Keuls posttest.## pb0.01, copolymers compared at charge ratios N/P=8 versus N/P=4 using a one-way ANOVA and a Newman–Keuls posttest.### pb0.001, copolymers compared at charge ratios N/P=8 versus N/P=4 using a one-way ANOVA and a Newman–Keuls posttest.


GENEDELIVERY

sufficient for full compaction of the DNA in small [Z

average diameter in nm was 286F28.8; 146.5F1 and

260.3F3.1—nmFS.D.—, for Gal-pK, galactosylated

poly-l-lysine-l-serine (Gal-pKS) and galactosylated

poly-l-lysine-l-tryptophan (Gal-pKW), respectively]

and stable (data not shown) particles. Complexes

obtained at a N/P=4 charge ratio were significantly

smaller (Z average diameter in nm was 236.4F2 and

84.5F0.9—nmFS.D.—, for Gal-pK and Gal-pKS,

respectively), whereas Gal-pKW complexes formed at

N/P=4 were 74.9F0.7 (nmFS.D.) in diameter, not

significantly different than Gal-pKW complexes

formed at a N/P=8 ratio counterparts (Table 1).

However, their stability upon dilution in solutions

containing NaCl (data not shown) was very poor as

compared to DNA complexes formed at N/P=8.

Therefore, only fully compacted (i.e., small sized)

DNA complexes obtained at N/P=8 charge ratio were

carried on in all subsequent experiments.

DNA complexes were first visualized by trans-

mission electron microscopy (TEM), and their size

and structure determined. Small-sized particles were

generated with all polymers tested at this charge ratio.

Representative electron micrograph images are

shown in Fig. 1A. Condensed DNA is present in

two equally frequent structures: spheres and rods

when the DNA is compacted using galactosylated

poly-l-lysine (Gal-pK) and galactosylated poly-l-

lysine-l-serine (Gal-pKS). Interestingly, when galac-

tosylated poly-l-lysine-l-tryptophan (Gal-pKW) is

used as a compaction agent, most of the structures

visualized are spheres.

Complexes obtained were further characterized by

determining their size in the dispersion medium using

photon correlation spectroscopy (Zetasizer 1000HS,

Malvern Instruments). A unique population was found

for all DNA complexes based on a multimodal

analysis (CONTIN) that best fitted the data in the

Zetasizer 1000HS correlator. Using this analysis, we

obtained a mean diameter of 66.3F6.3, 65.9F6.3 and

73.7F8.8 (nmFS.D.; n=5) for Gal-pK, Gal-pKS and

Gal-pKW DNA complexes, respectively (Table 1). In

contrast, the diameter of particles manually measured

over electronically magnified TEM micrographs,

resulted in diameter sizes significantly smaller (Table

1) in agreement with previous reports [17]. Taken

together, these data show that compacting a plasmid

DNA in water with an excess of the various cationic

polymers or copolymers described in this study results

in similar size distributions although qualitative

analysis demonstrates that only DNA complexes

obtained using Gal-pKW are almost exclusively

spherical, whereas the other two polymers compact

DNA in a mixture of spheres and rods.

3.2. Stability of DNA complexes in saline and culture

medium

DNA compaction into stable, homogenous par-

ticles can be readily achieved in non-NaCl-containing

Fig. 1. Transmission electron micrographs of plasmid DNA condensates. (A) pCES-luc-SV (6.9 kb) was condensed and the DNA complex

solution dialyzed overnight in water before uranyl-acetate staining and visualization under TEM. Note that when pKW is used, almost all

particles are spheres, whereas pK and pKS containing complexes form two structures: spheres (open arrows) and rods (filled arrows). (B) Before

uranyl-acetate staining, DNA complexes were diluted 1:10 (v/v) in 150 mM NaCl. The scale bar equals 520 nm.


GENEDELIVERY

solutions (i.e., water, 270 mM mannitol, 5% dextrose,

etc.) [17]. However, poly-l-lysine/DNA complexes

are very sensitive to changes in NaCl concentration;

therefore, they often aggregate and precipitate at

physiological concentrations of ions.

We attempted to study the relationship between the

polymer hydrophylic/hydrophobic surface properties

and particle stability in physiological media. To this

end, DNA complexes were prepared and observed

under TEM after dilution in 150 mM NaCl solution.

Gal-pK/DNA complexes aggregate into large amor-

phous fibers in the presence of salts (Fig. 1B), whereas

diluted copolymer complexes observed under TEM do

not show any aggregated structures. Micrographs

obtained from solutions of nonaggregating copolymer

complexes in the presence of salt are not different from

those obtained in water (spheres and rods). In order to

confirm the qualitative results obtained by means of

TEM visualization, we devised a simple procedure to

quantitatively test the aggregative behavior of DNA

complexes, measuring the time-dependent turbidity

increase (absorbance at 320 nm) upon dilution into salt-

containing solutions (i.e., MEM). Fig. 2A shows the

change in turbidity over time when plasmid DNA

condensates are diluted 1:10 in MEM. Similar results

were obtained tracing scattering intensity (a more

sensitive probe) over time in a Zetasizer 1000HS

photon correlator (Fig. 2B). The aggregation kinetics

profiled in Fig. 2 are significantly different for

copolymer-containing DNA complexes as compared

to condensates obtained using poly-l-lysine. Scattering

and turbidity after dilution of the Gal-pK/DNA com-

plex solution rapidly increase, since these complexes

aggregate in the presence of salt. In contrast, the

aggregation kinetics for Gal-pKS/DNA and Gal-pKW/

DNA complexes is much slower and the total

absorbance increase at 320 nm at the end of the assay

significantly smaller than pK/DNA, demonstrating that

polymer composition influences the stability of the

final complex in the presence of salt. Similar data has

been obtained for nongalactosylated polymer and

copolymers (data not shown).

In general agreement with the results described

above, further quantitative analysis of samples diluted

in 150 mM NaCl using DLS confirmed that DNA/

Gal-pK DNA complexes aggregated into increased

sized (Z average 284.3F38.1—nmFS.D.—,

pb0.001) particles, whereas DNA/Gal-pKS and

DNA/Gal-pKW complexes size (Z average

101.4F7.8 and 83F1.1—nmFS.D.—, respectively)

remains unchanged over the time of the assay

(automatic DLS analysis consisted of 10 independent

subruns over a period of 5–10 min that are combined

into a final size distribution report).

3.3. Unpacking of DNA complexes

A stable complex is critical for transport in body

fluids. However, DNA particles need to be sufficiently

labile to allow proper unpacking once in the nucleus.

To evaluate the reversibility of DNA and polycation

interaction, we performed a variation of an agarose

Fig. 2. Aggregation profiles of Gal-pK, Gal-pKS and Gal-pKW containing DNA complexes. pCES-luc-SV plasmid DNAwas condensed with

Gal-pK (5), Gal-pKS (o) or Gal-pKW (.). Immediately after dilution 1:10 in MEM, the absorbance at 320 nm was monitored every 2 s over a

60-s period (A). Using a photon correlator, the intensity of light scattered over time was traced upon dilution of the DNA complexes into 150

mM NaCl (B). Data shown are the meanFS.E. from three independent experiments. ***pb0.001, Gal-pK versus Gal-pKS and Gal-pKW

comparison analysis performed using multiple sample, two-way ANOVA and a Bonferroni posttest.


GENEDELIVERY

retardation assay for DNA complexes before and after

incubation with either (i) a 0.05% trypsin solution, (ii)

0.2% SDS and (iii) 0.9% heparin for 1 h at 37 8C.Compacted DNA has no mobility due to charge

neutralization (Fig. 3, lanes 1, 2 and 3). Panel A

shows how trypsin, that catalyzes peptide bond

hydrolysis of lysine-containing peptides, promoted

DNA unpacking from Gal-pK/DNA as well as poly-

Gal-pKS/DNA complexes but it did not affect Gal-

pKW/DNA complexes (Fig. 3A, lanes 4, 5 and 6).

Free DNA can be observed in the gel running as a

single band corresponding to the size of the original

plasmid DNA. These data may point to a different

accessibility of the copolymers to the solvent probably

because of closer binding between the DNA and the

polycation that may result in an improved protection

of the DNA against degradation. In order to test

whether lack of accessibility of trypsin to the polymer

was involved in the reduced digestion of Gal-pKW/

DNA complexes, we treated DNA complexes with

either 0.2% SDS [17] or 0.9% heparin [37], in order to

compete for the positively charged DNA-bound

polymer. Panels C and, to a lesser extent, B

demonstrate the inability of negatively charged SDS

and heparin to sequester DNA-bound copolymer and

resolve Gal-pKW particle packing, in contrast, again

to the almost complete liberation of DNA particles

obtained with Gal-pK and Gal-pKS. Therefore, our

data strongly suggests that Gal-pKW/DNA complexes

are more stable because of an increased core stability.

3.4. Receptor-mediated gene transfer

Receptor-mediated gene transfer into target cells

has been used profusely in the past with ligand

decorated poly-l-lysine/DNA complexes. The ease

Fig. 3. Gel retardation assay. An aliquot of the various DNA complexes was treated either with trypsin (Panel A), 0.9% heparing (Panel B) and

0.2% SDS (Panel C), as described in Materials and methods. The electrophoretic mobility of complexes before (�) and after (+) incubation with

trypsin, heparin or SDS is shown in the figure.


GENEDELIVERY

and reproducibility of the compaction of plasmid

DNA with galactosylated copolymers and the

improved stability and aggregation behavior of the

Gal-pKS and Gal-pKW complexes described in this

report (Figs. 1 and 2, and Table 1), prompted us to

investigate the use of copolymer compacted DNA as

receptor-mediated gene delivery vehicles into HuH-7

cells by means of the asialoglycoprotein receptor.

HuH-7 is a cell line derived from a human hepatoma

that has been shown both, to express functional

asialoglycoprotein receptor [39–41], and afford recep-

tor-targeted gene transfer [17,42,43]. The expression

vector pCES-luc-SV was slowly added to a vortexing

solution containing a 4-fold (w/w) excess of galacto-

sylated polycation (N/P=8). The DNA complex

solution was then transfected into HuH-7 cells in the

absence or presence of cold ligand (100 mM lactose)

and 20 mM glucose as a nonspecific sugar moiety.

Luciferase activity was assayed 48 h after trans-

fection. Fig. 4A demonstrates similar levels of

luciferase activity regardless of the polymer used.

Interestingly, while incubation with 100 mM lactose

does not affect the transfection efficiency of Gal-pK

or Gal-pKS complexes, it reduces it significantly

( pb0.01, one-way ANOVA) when added to Gal-pKW

transfections. There was no significant reduction of

luciferase activity when cells were transfected using

nongalactosylated polymers (Fig. 4B). Reduced luci-

ferase activity in the presence of free lactose in the

solution defines a receptor-specific endocytic process

for the uptake of Gal-pKW particles. Therefore,

pCES-luc-SV compacted with galactosylated pKW

can be delivered and expressed in HuH-7 cells using

asialoglycoprotein receptor-mediated endocytosis as a

specific entry mechanism unlike galactosylated pK or

galactosylated pKS, although the copolymer showed

similar stability in the presence of salt.

3.5. Electrophoretic mobility and particle charge

Particle charge is an important factor in designing

receptor-targeted nonviral vectors [7]. We investigated

the f potential of DNA complexes, as a measurement of

surface charge in the hydration shell both in water and

in the presence of 150 mM NaCl. Table 2 summarizes

these data. Several interesting features can be derived

from the observation of these data. (i) The charge of the

fully compacted DNA particles obtained with Gal-pK

and Gal-pKS in water is close to neutrality, whereas (ii)

the f potential of DNA complexes obtained with Gal-

pKW was significantly larger, indicating a higher

binding capacity of this copolymer to the DNA,

perhaps by layering of the copolymer onto the surface

of the particle. Interestingly, (iii) in the presence of

Fig. 4. Transfection efficiency and specificity of compacted DNA introduced into cells via receptor-mediated endocytosis. (A) pCES-luc-SV

was condensed in the absence of salt with 5% galactosylated pK, pKS and pKW. DNA complex solution was transfected in triplicate into HuH-7

cells in the absence (uncompleted, filled bars) or presence (lactose 100 mM, empty bars) of a saturating concentration of free ligand. Control

corresponds to the background luciferase activity in cellular extracts from untransfected cells. (B) Normalized luciferase activity of

nongalactosylated polymers transfected in the absence (uncompleted, filled bars) or presence (lactose 100 mM, empty bars) of a saturating

concentration of free ligand. Luciferase activity was measured in duplicate from protein extracts obtained 48 h after transfection. Data shown

were standardized against protein content and expressed as an averageFS.E.M. from five independent experiments. **pb0.01, Gal-pKW in the

presence of excess competitor ligand versus Gal-pKW performed using multiple sample, two-way ANOVA and a Bonferroni posttest.


GENEDELIVERY

salts the charge of fully compacted DNA particles

obtained with Gal-pK and Gal-pKS is significantly

larger. In contrast, (iv) Gal-pKW containing DNA

complexes afforded a strong reduction of net charge

upon dilution in 150 mM NaCl.

4. Discussion

We previously described that compaction of DNA

using poly-l-lysine in a high-salt solution results in

metastable complexes of minimum size [1–

3,33,34,44–47]. In this study, stable compacted

DNA vectors are obtained in water with an excess

polycation in order to avoid the disadvantages

associated with the use of high-salt DNA complexes.

The compaction protocol results in particles with a

narrow size distribution, as revealed by DLS and

TEM analysis, in agreement with similar formulations

previously described by Molas et al. [17]. The

formation of properly sized particles is important both

to achieve receptor-mediated gene transfer [34] and

nuclear import [1,2,15,33]. We have obtained fully

compacted (i.e., smallest sized) DNA complexes only

at N/P=8 charge ratio and an increased concentration

of polymers did not result in additional reduction of

size or stability of the complexes. The size of the

particles obtained in the experiments reported here is

within the limits for proper receptor-mediated gene

transfer [34], although larger than the limit set by Liu

et al. [15] for nuclear import in postmitotic cellular

models. It is important to note that the size of the

particles is significantly smaller when measured

directly from EM micrographs as compared to

solution size obtained using dynamic light scattering.

This discrepancy could be accounted by ignoring the

measurement of rod structures when particles in TEM

photographs were sized, that might have led to

significant error for Gal-pK and Gal-pKS/DNA

complexes. However, it should have not affected the

measurements of Gal-pKW/DNA complexes where

we do not observed rods. A more plausible explan-

ation for such discrepancy is that DNA complexes

measured in solution using DLS still contain a

hydration layer, whereas those processed for TEM

analysis are dried onto the film. Nevertheless, from

these data, we can conclude that compaction of

plasmid DNA with the various copolymers does not

affect significantly the size of the complexes; hence,

copolymer composition is not a critical determinant of

the size of the particle and the complexes obtained are

within the size range required for proper receptor-

mediated gene transfer [34].

We wondered whether the use of the poly-l-lysine

copolymers could generate significant morphological

differences in the structure of the DNA complexes as

determined by visual examination under TEM. Qual-

itative characterization by TEM of DNA complexes

revealed slight differences: Gal-pK and Gal-pKS

preparations generated two populations of DNA

complexes of different morphology (spheroids and

ellipsoidal rods) in contrast with Gal-pKW prepara-

tions where almost all DNA complexes obtained are

in the form of spheroids. The morphological differ-

ence suggests a different biophysical behavior of the

copolymer carrying tryptophan, but whether this

different shape is a consequence of different binding

and compaction kinetics or due to a specific role of the

polycation in organizing the DNA compaction process

[48] is not known.

In this study, we hypothesized that van der Waals

forces that promote aggregation of compacted particles

in the presence of salt (salt-bridge formation) could be

counteracted by increasing particle hydrophillicity or

hydrophobicity using copolymers of poly-l-lysine and

either hydrophillic (serine) or hydrophobic/aromatic

(tryptophan) residues. As hypothesized, pKS and

pKW copolymer complexes remained stable in salt-

containing medium as determined by qualitative

assessment using TEM and quantitatively by DLS

and turbidity measurements.

Taken together, these data demonstrate that poly-l-

lysine-l-serine and poly-l-lysine-l-tryptophan DNA

complexes are highly stable in saline and MEM as

compared with poly-l-lysine-containing complexes, a

Table 2

f potential

f potential (mean mVFS.E.)

Gal-pK Gal-pKS Gal-pKW

Water �0.1F0.5 �0.1F0.5 35F0.8***

150 mM NaCl 14F3.4### 15.9F1.2### 17.4F4.4###

*** pb0.001 vs. Gal-pK and Gal-pKS in water, using a one-

way ANOVA and a Newman-Keuls posttest.### pb0.001 vs. particle charge in water, using a one-way

ANOVA and a Newman-Keuls posttest.


GENEDELIVERY

critical parameter for nonviral vector functionality.

This phenomenon may be explained by the incorpo-

ration of hydrophilic and hydrophobic/aromatic moi-

eties from the side-chain of the copolymer amino

acids. Although the surplus positive charge in the

solution containing poly-l-lysine/DNA complexes in

the presence of excess polycation maintains the vector

stably dispersed in the absence of salts, added salt

shields the excess positive charge and promotes

aggregation by means of attractive van der Waals

forces after substantial salt bridging [10]. Introduction

of a hydrophobic/aromatic (tryptophan) or hydrophilic

(serine) moiety may prevent aggregation by introduc-

ing a repulsive force (serine) or an apolar indole

moiety that facilitates hydrophobic collapse (trypto-

phan) of the polymer onto the core of compacted

DNA, resulting in tightly packed DNA and over-

coming (at least at the concentrations used in this

study) van der Waals attractive forces as suggested by

Trubetskoy et al. [49]. Alternatively, the introduction

of tryptophan may result in an increased steric

stabilization due to augmented bulkiness and shield-

ing of the charges on the surface of the particle,

although our data suggests that surface charge (fpotential) is comparable in all complexes in the

presence of salts.

Indeed, insufficient solubility of poly-l-lysine/

DNA complexes in physiological solutions (serum,

cell culture medium, etc.) is a common finding for

nonsterically stabilized DNA complexes that may

hinder their use as gene therapy vectors. Rapid and

infinite dilution after injecting the complex in the

blood circulation may well ameliorate the problem

[3,33], although improved aggregation kinetics in the

copolymers described here may in fact further

improve the bioavailability of targeted DNA com-

plexes in vivo.

These findings prompted us to further characterize

other aspects of the DNA complexes related to their

unpacking capacity. These experiments revealed an

almost complete retardation of complexes prepared

from tryptophan-containing copolymers after trypsin

incubation, indicative of an inability of trypsin to

completely digest the lysine residues on the complex.

Competition for electrostatic binding to the copolymers

using heparin or SDS confirmed these results. Absence

of complete trypsin digestion may result from either

tighter binding between the polycation and the DNA,

preventing the polycation from accessing the solvent

phase or, alternatively, an increased build-up of bound

molecules to the DNA particle. Our data suggest that

Gal-pK and Gal-pKS/DNA complexes obtained by the

addition of small aliquots of DNA to an excess polymer

in the absence of salts carry no significant charge (Table

2), whereas the f potential of DNA complexes obtained

with Gal-pKW was significantly larger. Hence, we

might hypothesize that the excess Gal-pK or Gal-pKS

used to induce monomolecular collapse provides the

microenvironment and charge neutralization necessary

for DNA collapse but does not induce a significant

excess binding of the polymer onto the DNA complex.

In contrast, Gal-pKW containing DNA complexes

have a significantly higher positive charge, indicating

a higher binding capacity of this copolymer to the

DNA, perhaps by layering of the copolymer onto the

surface of the particle. This behavior could also explain

the resistance to unpacking observed when Gal-pKW/

DNA complexes were subjected to trypsin, SDS and

heparin treatments. Thus, we can conclude that the

copolymer-containing tryptophan allows a closer union

between DNA and copolymer, perhaps by additional

layering of the copolymer to the DNA particle. As

previously discussed, tighter packing of DNAmay also

influence the aggregation of the particles in the

presence of salt. In fact, Trubetskoy et al. [49] have

shown that self-assembly of polycation condensed

complexes using a bis-imidoester cross-linker also

results in complexes that are resistant to salt-induced

aggregation, suggesting that improved DNA compac-

tion using their formulation was responsible for the

higher stability of the complexes in salt. We cannot

discard either that the tightness and homogeneity of the

structures (see Fig. 1A) obtained using Gal-pKW is

partially responsible for improved receptor-mediated

gene transfer characteristics of particles obtained with

the galactosylated pKW polymer.

These results all in all demonstrate that even when

complexes have similar structure, stability of the core

depends on the composition of the polycation and its

interactions with the medium. Unpacking of the

complexes during circulation in body fluids has to be

avoided for efficient gene delivery. Stability in saline

and MEM and tighter binding of the tryptophan-

containing copolymer to the DNA demonstrated here

suggest that this type of copolymer could be a candidate

for in vivo gene transfer, improving the delivery not


GENEDELIVERY

only because of its better stability but also preventing

unpacking in body fluids. Although gene expression

may be negatively affected if unpacking is not assured

once in the nucleus, this possibility is unlikely in view

of equivalent gene expression obtainedwith the various

copolymers in this report, although we cannot discard

the possibility of partial suppression of gene expression

due to incomplete unpacking.

The reproducibility of the compaction process,

small size and improved aggregation behavior of the

copolymer-compacted DNA described here (see Figs.

1 and 2, and Table 1) hint at a likely effect on the

capacity of stabilized complexes to induce receptor-

mediated gene transfer. Our aim was to assess the

activity of the various DNA vectors described in this

report carrying galactosylated polycations as ligands

for the asialoglycoprotein receptor. One of the criteria

that we have used to determine the specificity of the

receptor-mediated endocytic process by which the

DNA particle is internalized in the cell is the

quantitative inhibition of gene transfer by an excess

bcoldQ ligand (i.e., ligand not bound to DNA). Based

on results obtained in this assay, we can conclude that

nonspecific transfection levels are similar for poly-l-

lysine and the copolymers, but only when pKW was

used for compaction, transfection was receptor medi-

ated, that is, a significant reduction in expression

following gene transfer was observed in the presence

of 100 mM lactose in the culture medium (Fig. 4).

Molas et al. [17] have already shown that Gal-pK

particles prepared using the protocol utilized in this

report fail to show receptor-mediated gene transfer in

vitro. However, Gal-pK particles prepared using

single-stranded DNA are able to mediate receptor-

targeted gene transfer, either because of their smaller

particle size or the observed increased stability of the

single-stranded complexes when diluted in salt-con-

taining medium [17]. Although positively charged

DNA complexes have certain advantages regarding

homogeneity and ease of formulation, Schaffer and

Lauffenburger [50,51] have clearly shown that ligand

containing DNA vectors obtained in this manner have

physical constraints that impede effective interaction

with the targeted receptor in the presence of excess

positive charge. However, proper ligand–receptor

interaction can be obtained upon shielding of the

particle’s net charge. Our data suggests that DNA

complexes reported here carry a positive charge in the

presence of salts (Table 2), although Gal-pKW/DNA

complexes afforded a decreased positivity upon

dilution in 150 mM NaCl whereas Gal-pK and Gal-

pKS containing particles increased substantially their

surface charge. In view of these data, it is unclear

whether charge may have played a differentiating role

on the observed improvement of Gal-pKW/DNA

complexes as mediators of specific receptor-mediated

gene transfer. We hypothesize that the properties of

the aromatic/hydrophobic moiety provided by trypto-

phan residues not only play a role in core stability but

also allows surface to solvent interactions in the

complex that in turns permits ligand binding to the

receptor. Although it has been previously shown

[48,52] that polymers of lysine carrying a single

tryptophan residue promote gene transfer in a non-

targeted delivery system, we have not obtained

significant differences in global gene transfer effi-

ciency with the various polymers. This may be due, as

intuitively expected from the inability of trypsin, SDS

or heparin to completely resolve pKW–DNA inter-

actions in vitro, to inneficient unpacking of the DNA

complexes once in the cell. We have not quantitated

the independent steps in the process of gene delivery

and expression; therefore, similar levels of reporter

gene activity may be obtained as an aggregate of

improved delivery versus reduced unpacking and vice

versa for the various polymers used. Global gene

transfer efficiency was low compared to commonly

used commercial vectors (i.e., PEI and lipofectin; data

not shown), although our protocol does not include

chloroquine in the transfection mix that aids in

receptor-mediated gene delivery [53].

In fact, preliminary experiments in vivo have

shown no significant luciferase activity in the liver

at 24 h after i.v. injection of the DNA complexes,

together with a marked inhibition on gene transfer to

the lung (nonspecific delivery to the lung) as

compared to Gal-pK compacted complexes, a positive

finding uncommon for DNA complexes obtained

using excess polycation (data not shown).

PEG is being widely used to provide steric

stabilization and increased polymer/DNA complexes

half-life in bloodstream. This type of complex confers

increased stability in the presence of salts and serum

via solvent exclusion [25–29]. Nevertheless, its use in

receptor-targeted gene transfer is limited because of

inherent hindrances in such PEG containing com-


GENEDELIVERY

plexes for receptor-mediated gene transfer. Several

groups have reported successful targeting using

pegylated delivery systems [30,31], whereas others

have demonstrated difficulties associated with recog-

nition and successful receptor-mediated endocytosis

of PEG containing targeted complexes [23,32].

Indeed, pegylated particles may contain an outer shell

sterically separated from the solvent phase, and

therefore require careful engineering of the ligand

spacing moving out from the outer surface of the

pegylated particle for proper ligand–receptor binding

[22].

Interestingly, although Gal-pKS/DNA complexes

showed good stability in salt-containing medium, it

failed to provide improved resistance to trypsin

digestion, destabilization by heparin, and to mediate

specific receptor-mediated gene transfer. This copoly-

mer should present an increased hydrophilicity and a

certain level of nonspecific (electrostatic) binding to

the cell membrane, due to its positive charge in salt-

containing solution, that may impede specific recep-

tor–ligand binding. It is interesting to note that our

findings are not in agreement with results obtained

using a novel galactosyl-d-lysine/d-serine-PEG con-

densing polycation reported to mediate gene transfer

to the liver [54]. The authors, though, did not test the

specificity of the receptor-mediated gene transfer

process using competition assays in vitro. In addition,

the authors used large injection volumes to transfect

animals, which is known to yield efficient gene

transfer to the liver in a nonspecific manner (hydro-

dynamic gene transfer).

Since particles of DNA carrying a ligand for a

specific receptor may use other nonspecific means of

internalization into cells in vitro (i.e., electrostatic

membrane interaction, precipitation, etc.), as well as

in vivo, it is important that a specific delivery process

is demonstrated prior to its utilization in vivo.

5. Conclusion

We used three polymers that are able to form

compacted particles of plasmid DNA in the absence of

salts and promote nonspecific gene transfer at similar

levels into established cell lines in vitro. The stability

in the presence of salt and tighter packing observed

for the copolymer of lysine and tryptophan correlated

positively with receptor-mediated endocytosis of the

DNA particle when directed towards the asialoglyco-

protein receptor.

Taken together, the biophysical characterization,

gel shift and transfection experiments are in good

agreement and point to a role of the tryptophan

residue both in stabilization of the particle and

promoting specific interaction between the ligand

and cell receptor. Currently, we are evaluating the

time course of expression in vivo using copolymers of

various lengths and a secreted protein marker gene in

order to obtain information on the capacity of the

copolymers to mediate gene transfer to the liver more

efficiently as compared to high-salt galactosylated

poly-l-lysine complexes.

Acknowledgments

The authors are indebted to Drs. Joan Estelrich

and Raimon Sabate for f potential determinations,

and to Dr. Mark Cooper for helpful discussions.

Gomez-Valades, A.G. and Vidal-Alabro, A. were

supported by fellowships from F.P.U. bMinisterio de

Educacion, Cultura y DeporteQ (Spain) and F.I.

DURSI (Catalonian Government), respectively. This

study was supported by grants SAF02-02964

and BFI03-02539 from bMinisterio de Ciencia y

TecnologıaQ (Spain).

References

[1] T. Ferkol, J.C. Perales, E. Eckman, C.S. Kaetzel, R.W.

Hanson, P.B. Davis, Gene transfer into the airway epithelium

of animals by targeting the polymeric immunoglobulin

receptor, J. Clin. Invest. 95 (1995) 493–502.

[2] T. Ferkol, J.C. Perales, F. Mularo, R.W. Hanson, Receptor-

mediated gene transfer into macrophages, Proc. Natl. Acad.

Sci. U. S. A. 93 (1996) 101–105.

[3] J.C. Perales, T. Ferkol, H. Beegen, O.D. Ratnoff, R.W.

Hanson, Gene transfer in vivo: sustained expression and

regulation of genes introduced into the liver by receptor-

targeted uptake, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91 (1994)

4086–4090.

[4] G.Y. Wu, J.M. Wilson, F. Shalaby, M. Grossman, D.A.

Shafritz, C.H. Wu, Receptor-mediated gene delivery in vivo.

Partial correction of genetic analbuminemia in Nagase rats,

J. Biol. Chem. 266 (1991) 14338–14342.

[5] J.M. Wilson, M. Grossman, C.H. Wu, N.R. Chowdhury, G.Y.

Wu, J.R. Chowdhury, Hepatocyte-directed gene transfer in


GENEDELIVERY

vivo leads to transient improvement of hypercholesterolemia

in low density lipoprotein receptor-deficient rabbits, J. Biol.

Chem. 267 (1992) 963–967.

[6] A.G. Ziady, T.J. Kelley, E. Milliken, T. Ferkol, P.B. Davis,

Functional evidence of CFTR gene transfer in nasal epithelium

of cystic fibrosis mice in vivo following luminal application of

DNA complexes targeted to the serpin-enzyme complex

receptor, Molec. Ther. 5 (2002) 413–419.

[7] M. Molas, A.G. Gomez-Valades, A. Vidal-Alabro, M. Miguel-

Turu, J. Bermudez, R. Bartrons, J.C. Perales, Receptor-

mediated gene transfer vectors: progress towards genetic

pharmaceuticals, Curr. Gene Ther. 3 (2003) 468–485.

[8] G. Kirchweger, Nanoparticles—the next big thing? Molec.

Ther. 6 (2002) 301–302.

[9] D. Matulis, I. Rouzina, V.A. Bloomfield, Thermodynamics of

cationic lipid binding to DNA and DNA condensation: roles of

electrostatics and hydrophobicity, J. Am. Chem. Soc. 124

(2002) 7331–7342.

[10] V.A. Bloomfield, DNA condensation by multivalent cations,

Biopolymers 44 (1997) 269–282.

[11] S. He, P.G. Arscott, V.A. Bloomfield, Condensation of DNA

by multivalent cations: experimental studies of condensation

kinetics, Biopolymers 53 (2000) 329–341.

[12] M. Ogris, S. Brunner, S. Schuller, R. Kircheis, E. Wagner,

PEGylated DNA/transferrin–PEI complexes: reduced interac-

tion with blood components, extended circulation in blood and

potential for systemic gene delivery, Gene Ther. 6 (1999)

595–605.

[13] P.R. Dash, M.L. Read, L.B. Barrett, M.A. Wolfert, L.W.

Seymour, Factors affecting blood clearance and in vivo

distribution of polyelectrolyte complexes for gene delivery,

Gene Ther. 6 (1999) 643–650.

[14] C.M. Ward, M.L. Read, L.W. Seymour, Systemic circulation

of poly(l-lysine)/DNA vectors is influenced by polycation

molecular weight and type of DNA: differential circulation in

mice and rats and the implications for human gene therapy,

Blood 97 (2001) 2221–2229.

[15] G. Liu, D. Li, M.K. Pasumarthy, T.H. Kowalczyk, C.R.

Gedeon, S.L. Hyatt, J.M. Payne, T.J. Miller, P. Brunov-

skis, T.L. Fink, O. Muhammad, R.C. Moen, R.W.

Hanson, M.J. Cooper, Nanoparticles of compacted DNA

transfect postmitotic cells, J. Biol. Chem. 278 (2003)

32578–32586.

[16] T. Blessing, J.S. Remy, J.P. Behr, Monomolecular collapse of

plasmid DNA into stable virus-like particles, Proc. Natl. Acad.

Sci. U. S. A. 95 (1998) 1427–1431.

[17] M. Molas, R. Bartrons, J.C. Perales, Single-stranded DNA

condensed with poly-l-lysine results in nanometric particles

that are significantly smaller, more stable in physiological

ionic strength fluids and afford higher efficiency of gene

delivery than their double-stranded counterparts, Biochim.

Biophys. Acta 1572 (2002) 37–44.

[18] S.J. Hwang, M.E. Davis, Cationic polymers for gene delivery:

designs for overcoming barriers to systemic administration,

Curr. Opin. Mol. Ther. 3 (2001) 183–191.

[19] R.I. Mahato, Non-viral peptide-based approaches to gene

delivery, J. Drug Target. 7 (1999) 249–268.

[20] J.A. Wolff, The bgrandQ problem of synthetic delivery, Nat.

Biotechnol. 20 (2002) 768–769.

[21] C.M. Ward, M. Pechar, D. Oupicky, K. Ulbrich, L.W.

Seymour, Modification of pLL/DNA complexes with a

multivalent hydrophilic polymer permits folate-mediated

targeting in vitro and prolonged plasma circulation in vivo,

J. Gene Med. 4 (2002) 536–547.

[22] M.C. Woodle, P. Scaria, S. Ganesh, K. Subramanian, R.

Titmas, C. Cheng, J. Yang, Y. Pan, K. Weng, C. Gu, S.

Torkelson, Sterically stabilized polyplex: ligand-mediated

activity, J. Control. Release 74 (2001) 309–311.

[23] D.Y. Kwoh, C.C. Coffin, C.P. Lollo, J. Jovenal, M.G.

Banaszczyk, P. Mullen, A. Phillips, A. Amini, J.

Fabrycki, R.M. Bartholomew, S.W. Brostoff, D.J. Carlo,

Stabilization of poly-l-lysine/DNA polyplexes for in vivo

gene delivery to the liver, Biochim. Biophys. Acta 1444

(1999) 171–190.

[24] J. Fominaya, M. Gasset, R. Garcia, F. Roncal, J.P. Albar, A.

Bernad, An optimized amphiphilic cationic peptide as an

efficient non-viral gene delivery vector, J. Gene Med. 2 (2000)

455–464.

[25] A.S. Sawhney, J.A. Hubbell, Poly(ethylene oxide)-graft-

poly(l-lysine) copolymers to enhance the biocompatibility of

poly(l-lysine)-alginate microcapsule membranes, Biomateri-

als 13 (1992) 863–870.

[26] M.A. Wolfert, E.H. Schacht, V. Toncheva, K. Ulbrich, O.

Nazarova, L.W. Seymour, Characterization of vectors for gene

therapy formed by self-assembly of DNAwith synthetic block

co-polymers, Hum. Gene Ther. 7 (1996) 2123–2133.

[27] C.H. Ahn, S.Y. Chae, Y.H. Bae, S.W. Kim, Biodegradable

poly(ethylenimine) for plasmid DNA delivery, J. Control.

Release 80 (2002) 273–282.

[28] D. Oupicky, M. Ogris, K.A. Howard, P.R. Dash, K. Ulbrich,

L.W. Seymour, Importance of lateral and steric stabilization of

polyelectrolyte gene delivery vectors for extended systemic

circulation, Molec. Ther. 5 (2002) 463–472.

[29] Y. Park, K.Y. Kwok, C. Boukarim, K.G. Rice, Synthesis of

sulfhydryl cross-linking poly(ethylene glycol)-peptides and

glycopeptides as carriers for gene delivery, Bioconjug. Chem.

13 (2002) 232–239.

[30] M. Ogris, G. Walker, T. Blessing, R. Kircheis, M. Wolschek,

E. Wagner, Tumor-targeted gene therapy: strategies for the

preparation of ligand-polyethylene glycol-polyethylenimine/

DNA complexes, J. Control. Release 91 (2003) 173–181.

[31] T. Merdan, J. Callahan, H. Petersen, K. Kunath, U. Bakowsky,

P. Kopeckova, T. Kissel, J. Kopecek, Pegylated polyethyleni-

mine-fab’ antibody fragment conjugates for targeted gene

delivery to human ovarian carcinoma cells, Bioconjug. Chem.

14 (2003) 989–996.

[32] K. Kunath, T. Merdan, O. Hegener, H. Haberlein, T. Kissel,

Integrin targeting using RGD–PEI conjugates for in vitro gene

transfer, J. Gene Med. 5 (2003) 588–599.

[33] J.C. Perales, G.A. Grossmann, M. Molas, G. Liu, T. Ferkol, J.

Harpst, H. Oda, R.W. Hanson, Biochemical and functional

characterization of DNA complexes capable of targeting genes

to hepatocytes via the asialoglycoprotein receptor, J. Biol.

Chem. 272 (1997) 7398–7407.


GENEDELIVERY

[34] G. Liu, M. Molas, G.A. Grossmann, M. Pasumarthy, J.C.

Perales, M.J. Cooper, R.W. Hanson, Biological properties of

poly-l-lysine–DNA complexes generated by cooperative

binding of the polycation, J. Biol. Chem. 276 (2001)

34379–34387.

[35] M. Monsigny, A.C. Roche, P. Midoux, Uptake of neo-

glycoproteins via membrane lectin of L1210 cells, Biol. Cell

51 (1984) 187–193.

[36] J.M. Kupfer, X.M. Ruan, G. Liu, J. Matloff, J. Forrester, A.

Chaux, High-efficiency gene transfer to autologous rabbit

jugular vein grafts using adenovirus–transferrin/polylysine–

DNA complexes, Hum. Gene Ther. 5 (1994) 1437–1443.

[37] I. Moret, J. Esteban Peris, V.M. Guillem, M. Benet, F. Revert,

F. Dasi, A. Crespo, S.F. Alino, Stability of PEI–DNA and

DOTAP–DNA complexes: effect of alkaline pH, heparin and

serum, J. Control. Release 76 (2001) 169–181.

[38] R.J. Hunter, Zeta potential, Colloid Science, Academic Press,

London, 1981, Chap. 3.

[39] R.J. Stockert, A.G. Morell, Second messenger modulation of

the asialoglycoprotein receptor, J. Biol. Chem. 265 (1990)

1841–1846.

[40] J.H. Yik, A. Saxena, P.H. Weigel, The minor subunit splice

variants, H2b and H2c, of the human asialoglycoprotein

receptor are present with the major subunit H1 in different

hetero-oligomeric receptor complexes, J. Biol. Chem. 277

(2002) 23076–23083.

[41] F.Y. Zeng, J.A. Oka, P.H. Weigel, The human asialoglycopro-

tein receptor is palmitoylated and fatty deacylation causes

inactivation of state 2 receptors, Biochem. Biophys. Res.

Commun. 218 (1996) 325–330.

[42] M.M. Mady, M.M. Ghannam, W.A. Khalil, R. Repp, M.

Markus, W. Rascher, R. Muller, A. Fahr, Efficient gene

delivery with serum into human cancer cells using targeted

anionic liposomes, J. Drug Target. 12 (2004) 11–18.

[43] B.T. Kren, A. Cole-Strauss, E.B. Kmiec, C.J. Steer, Targeted

nucleotide exchange in the alkaline phosphatase gene of HuH-

7 cells mediated by a chimeric RNA/DNA oligonucleotide,

Hepatology 25 (1997) 1462–1468.

[44] A.G. Ziady, J.C. Perales, T. Ferkol, T. Gerken, H. Beegen,

D.H. Perlmutter, P.B. Davis, Gene transfer into hepatoma cell

lines via the serpin enzyme complex receptor, Am. J. Physiol.

273 (1997) G545–G552.

[45] E. Garcia_Valenzuela, R. Rayanade, J.C. Perales, C.A.

Davidson, R.W. Hanson, S.C. Sharma, Axon-mediated gene

transfer of retinal ganglion cells in vivo, J. Neurobiol. 32

(1997) 111–122.

[46] T. Ferkol, F. Mularo, J. Hilliard, S. Lodish, J.C. Perales, A.

Ziady, M. Konstan, Transfer of the human alpha1-antitrypsin

gene into pulmonary macrophages in vivo, Am. J. Respir. Cell

Mol. Biol. 18 (1998) 591–601.

[47] T. Ferkol, J.C. Perales, F. Mularo, R.W. Hanson, Transfer of

the gene enconding human a1-antitrypsin into machophages

via the mannose receptor, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 151

(1995) A544.

[48] M.S. Wadhwa, W.T. Collard, R.C. Adami, D.L. McKenzie,

K.G. Rice, Peptide-mediated gene delivery: influence of

peptide structure on gene expression, Bioconjug. Chem. 8

(1997) 81–88.

[49] V.S. Trubetskoy, A. Loomis, P.M. Slattum, J.E. Hagstrom,

V.G. Budker, J.A. Wolff, Caged DNA does not aggregate in

high ionic strength solutions, Bioconjug. Chem. 10 (1999)

624–628.

[50] D.V. Schaffer, D.A. Lauffenburger, Targeted synthetic gene

delivery vectors, Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (2000) 155–161.

[51] D.V. Schaffer, D.A. Lauffenburger, Optimization of cell

surface binding enhances efficiency and specificity of molec-

ular conjugate gene delivery, J. Biol. Chem. 273 (1998)

28004–28009.

[52] D.L. McKenzie, W.T. Collard, K.G. Rice, Comparative gene

transfer efficiency of low molecular weight polylysine DNA-

condensing peptides, J. Pept. Res. 54 (1999) 311–318.

[53] T. Blessing, M. Kursa, R. Holzhauser, R. Kircheis, E. Wagner,

Different strategies for formation of pegylated EGF-conju-

gated PEI/DNA complexes for targeted gene delivery,

Bioconjug. Chem. 12 (2001) 529–537.

[54] S. Hisayasu, M. Miyauchi, K. Akiyama, T. Gotoh, S. Satoh, T.

Shimada, In vivo targeted gene transfer into liver cells

mediated by a novel galactosyl-d-lysine/d-serine copolymer,

Gene Ther. 6 (1999) 689–693.


GENEDELIVERY

validació de la pepck-c hepàtica com a diana en la teràpia...

Documents