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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

Co nta cto :Co nta cto : [email protected]

Tesis Doctoral

Mecanismo de activación de laMecanismo de activación de laproteína quinasa A dependiente deproteína quinasa A dependiente de

cAMP: proteínas sustrato y decAMP: proteínas sustrato y deanclaje de PKA de Saccharomycesanclaje de PKA de Saccharomyces

cerevisiaecerevisiae

Galello, Fiorella Ariadna

2011

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:

Galello, Fiorella Ariadna. (2011). Mecanismo de activación de la proteína quinasa A dependientede cAMP: proteínas sustrato y de anclaje de PKA de Saccharomyces cerevisiae. Facultad deCiencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

Cita tipo Chicago:

Galello, Fiorella Ariadna. "Mecanismo de activación de la proteína quinasa A dependiente decAMP: proteínas sustrato y de anclaje de PKA de Saccharomyces cerevisiae". Facultad deCiencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2011.

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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Departamento de Química Biológica

Mecanismo de activación de la proteína quinasa A dependiente

de cAMP: proteínas sustrato y de anclaje de la PKA de

��

�

Tesis presentada para optar al título de Doctor de la

Universidad de Buenos Aires en el área Química Biológica

Fiorella Ariadna Galello

Directora: Silvia Graciela Rossi

Consejera de estudios: Silvia Margarita Moreno de Colonna

Lugar de trabajo: Laboratorio de Biología Molecular y Transducción de Señales,

Departamento de Química Biológica, Facultad Ciencias Exactas y Naturales,

Universidad de Buenos Aires.

Buenos Aires, 2011

Resumen 2 �

Mecanismo de activación de la proteína quinasa A dependiente de cAMP:

proteínas sustrato y proteínas de anclaje de la PKA

de��

RESUMEN

La especificidad en la vía de transducción de señales de cAMP4PKA está

determinada por el reconocimiento de la secuencia blanco en el sustrato y por

la localización de la quinasa en compartimentos subcelulares. En

�� los determinantes de la especificidad de la proteína

quinasa A (PKA) están menos caracterizados que en mamíferos. Analizamos el

comportamiento de los sustratos y los determinantes de secuencia alrededor

del sitio de fosforilación de tres proteínas sustrato: Piruvato quinasa 1 (Pyk1),

Piruvato quinasa 2 (Pyk2) y Trehalasa neutra (Nth1). La proteína Nth1 es mejor

sustrato que la proteína Pyk1 y ambas son fosforiladas tanto por Tpk1 como

por Tpk2, dos de las isoformas de la subunidad catalítica de la PKA de

levaduras. Las tres proteínas contienen uno o más motivos consenso de PKA,

Arg4Arg4X4Ser, pero no todos ellos son fosforilados. Análisis de esos sitios

permitieron determinar que los residuos ácidos en la posición P+1 o en el

extremo N4terminal son deletéreos para la reacción catalítica, mientras que los

residuos positivos presentes más allá de las posiciones P42 y P43 la favorecen.

Un residuo hidrofóbico voluminoso en posición P+1 no resulta crítico, a

diferencia de lo que ocurre con los sustratos de la PKA de mamíferos. El mejor

sustrato tiene en la posición P+4 un residuo ácido, equivalente al que se

encuentra en la secuencia inhibitoria de Bcy1, la subunidad regulatoria de la

PKA de levaduras.

Se analizó también el efecto del sustrato sobre la activación de la holoenzima y

demostramos que tanto los sustratos peptídicos como las proteínas enteras

sensibilizan en diferentes grados, dependiendo de sus secuencias, a la

holoenzima para la activación por cAMP. Los resultados también sugieren que

las proteínas enteras son mejores co4activadores que los péptidos.

Resumen 3 �

Se determinaron los �� de las isoformas Tpk1 y Tpk2, y

ambas enzimas mostraron el mismo valor, 3 seg41, diez veces menor que el

valor determinado para las subunidades C de mamíferos.

La compartimentalización de la señal del cAMP, otro punto de regulación de la

especificidad, es mantenida por el agrupamiento de las enzimas de la vía de

señalización en unidades discretas a través de las proteínas de anclaje de la

proteína quinasa A (AKAPs), las cuales interactúan con la subunidad

regulatoria de la holoenzima. Hasta el momento no habían sido identificadas

proteínas de anclaje en levaduras. Definimos, utilizando abordajes ��

bioquímicos de copurificación e identificación por espectrometría de masa,

proteínas que hacen interacción con Bcy1, entre ellas: ��

�� 2 (Ira2), �� (Myo2), �� 60 (Hsp60) and ��

�� 1 (Ptp1). Utilizando �� de péptidos se identificaron

los residuos críticos para la interacción en las proteínas de anclaje. Los

dominios definidos como claves de la interacción presentan una estructura

posible de α4hélice con residuos cargados positivamente que son importantes

para la interacción. Usando mutantes de deleción se definió que las proteínas

estudiadas hacen interacción con la región N4terminal de Bcy1. Se verificó la

interacción �� por ensayos de ��e �� por inmunoprecipitación.

También se demostró que Bcy1 e Ira2 localizan en la misma fracción subcelular

y que péptidos derivados de Ira2 son fosforilados por las Tpks �� . Se

analizó la relevancia fisiológica de la interacción entre Bcy1 y Hsp60 y se

observó que la actividad quinasa de PKA disminuye en ausencia de la

chaperona, indicando que la Hsp60 tendría una función estabilizadora sobre las

Tpks y además que frente a un estrés térmico Bcy1, Tpk1 y Hsp60 aumentan

su localización en la fracción mitocondrial, lo que permitiría modular el

transporte de proteínas mitocondriales por fosforilación.

Palabras clave: PKA, cAMP, �� , Bcy1, sustratos,

AKAPs

Abstract 4 �

Activation mechanism of cAMP%depedent protein kinase A: substrates

and anchoring proteins of PKA from Saccharomyces cerevisiae

ABSTRACT

The specificity in the cAMP4PKA signaling pathway is determined by the

molecular recognition of the substrate target sequence and by the kinase

subcelullar localization. In �� the protein kinase A

(PKA) specificity determinants are less studied than in mammalian PKA. We

analyzed the substrate behavior and sequence determinants around the

phosphorylation site of three protein substrates, Pyruvate kinase 1 (Pyk1),

Pyruvate kinase 2 (Pyk2) and Neutral Trehalase (Nth1). Nth1 protein is a better

substrate than Pyk1 protein and both are phosphorylated by either Tpk1 or

Tpk2, two o three isoforms from the catalytic subunits of yeast PKA. Both

enzymes have also the same selectivity toward the protein substrates and the

peptides derived from them. The three proteins contain one or more Arg4Arg4X4

Ser consensus PKA motif but not all of them are phosphorylated. The

determinants for specificity were studied using peptide arrays. Acidic residues in

position P+1 or in the N4terminal flank are deleterious and positive residues

present beyond P42 and P43 favors the catalytic reaction. A bulky hydrophobic

residue in position P+1 is not critical, unlike what happens in mammalian. The

best substrate has in position P+4 an acidic residue, equivalent to the one in the

inhibitory sequence of Bcy1, the yeast regulatory subunit of PKA. The substrate

effect in the holoenzyme activation was analyzed and we demonstrated that

peptides and protein substrates sensitized the holoenzyme to activation by

cAMP in different degrees, depending on their sequences. The results also

suggest that protein substrates are better co4activators than peptide

substrates.The catalytic turnover numbers of the catalytic subunits isoforms,

Tpk1 and Tpk2, were determined and both enzymes are shown to have the

same value of 3 sec41.

Common challenges to any cell are the processing of the extracellular stimuli it

receives into intracellular signaling cascades that initiate a multitude of diverse

Abstract 5 �

biological functions. Subcellular targeting through the association with adaptor

and scaffolding proteins has emerged as a key mechanism by which cells

maintain signaling specificity. Compartmentalization of cAMP signaling is

maintained by the clustering of cAMP signaling enzymes in discrete units by the

scaffolding protein A4kinase anchoring proteins (AKAPs) through their

interaction with regulatory subunit � No anchoring proteins had been

characterized up to now in yeast. Using �� and biochemical approaches,

like co4inmunoprecipitation and mass spectrometry, we defined proteins that

interact with Bcy1, including: the GTPase activating protein 2 (Ira2), Myosin 2

(Myo2), Heat shock protein 60 (Hsp60) and Protein Tyrosine Phosphatase 1

(Ptp1). Using peptide arrays we identified the critical residues in the protein

domain from the interacting proteins. The key domains for the interaction

present a possible α4helix structure with hydrofobic residues exposed over a

hydrofobic face and positive charged residues that resulted important for the

interaction. Using deletion mutants we defined that Bcy1 binds the interacting

proteins through its N4terminal domain. Using pull4down and

inmunoprecipitation assays we corroborated that these proteins interact ��

We also demonstrated that Bcy1 and Ira2 localize in the same subcellular

fraction and that Tpks can phosphorylate peptides derived from Ira2 sequence

�� . We shown PKA kinase activity decreases in absence of Hsp60. Also we

were able to demonstrate that Bcy1, Tpk1 and Hsp60 increase their

mitochondrial localization during heat shock.

Key words: PKA, cAMP, �� , Bcy1, substrates, AKAPs.

�

�

�

�

Agradecimientos 6

A mi directora, Sil Rossi, por enseñarme con paciencia infinita todo lo que aprendí en

estos años. Por transmitirme tu energía y tu empuje. Por incentivarme a ir un poco

más allá siempre. Por estar tan presente en todo, hasta en el último detalle de cada

experimento. Por tu cariño, tu preocupación y tus retos de madre. Y porque siempre,

siempre, siempre, el tiempo te da la razón.

A Sil Moreno, por trasmitir con pasión todo lo que sabés. Porque es un placer oírte

hablar del último trabajo de PKA hasta de cómo preparaste la cena del día anterior.

Por tu sencillez, tu naturalidad y por estar atenta y presente en todo y para todos.

A Pauli, por tus aportes siempre pertinentes a mi trabajo, por la pasión, la energía y la

garra que le ponés a todo día a día. Por lo códigos y gustos culinarios compartidos, por

hacerme reír tanto, por estar dispuesta a darme una mano siempre, y por tu cariño y

consejos de hermana mayor.

A Jose, compañera de mesada, escritorio y quinasas. Por darme ánimo para seguir

adelante, ponerme la oreja tantas veces, y permitirme escucharte otras tantas. Por el

contrabando de recetas y tips de ama de casa. Por tu naturalidad y dulzura. Por

ayudarme y estar siempre.

A Rich, por hacerme reír hasta las lágrimas. Por querer responder todas mis dudas,

dándome más información de la que puedo procesar. Por tus aguditos, tus videos, tus

fotos, tus anécdotas, tus enojos. Por ser único e irrepetible….por suerte!

A Vane, por tu energía y cariño concentrados en un envase tan chiquitito. Por hacer

más llevaderos esos días de verano encerradas en el cuarto del cultivo, cuando

preparábamos y procesábamos con nuestras propias manos las muestras para MALDI.

Por estar siempre tan atenta a lo que me pasa y por hacer causa común tantas veces.

A Cons, Coti, Cotita loca, Cotita linda, por haberme ayudado cuando la panza no

dejaba verme los pies. Por acurrucarte en un costado de la mesada para que yo trabaje

cómoda, por salvarme tantas veces cuando se me hacían las 5 y tenía que volar hasta

el Jardín. Por ser tan dulce y generosa, y por mimarme tanto.

A Nico (Holaaaaaammmmmmmmmm!), por el intercambio de información sobre las

AKAPs. Por responder mis dudas, y por confiar en mí para contestar las suyas. Por esas

graciosas charlas sobre los achaques de gente mayor, política, personas y personajes.

Por estar siempre tan presente.

A Leti, por esa linda sonrisa que transmite tanta energía. Por darme ánimos cuando

tengo un mal día, por esos ricos budines que nos hacen tan felices, por ser tan

compañera en lo laboral y en lo personal.

A Lucas, por estar dispuesto a ayudarme siempre, por salvarme cuando mi

computadora me jugó alguna mala pasada, por levantar tantos bidones de agua

destilada y tanques de nitrógeno. Por esos mates reconfortantes de la tarde, pero más

que nada por permitirme conocer cuán amplios son los límites de paciencia.

A Barby, por haberme ayudado en mis últimos experimentos. Por tu predisposición

para aprender, tus ganas y tu entusiasmo.

Agradecimientos 7

A Marce y Vicky, por aquellos primeros tiempos compartidos que recuerdo con mucho

cariño. A Jime, por ayudarme en mis primeras quinasas, por compartir con alegría mis

logros laborales y personales. A Pía, por estar siempre con la mejor predisposición para

todo y por ayudarme en mis primeros días en el labo, allá a lo lejos y hace tiempo.

A Gladys, Miriam y Juan, por colaborar desde su lugar con el funcionamiento del

laboratorio y por ser tan amables conmigo siempre. A Martín y Ayelén, por responder

mis dudas miles de veces.

A Eli, Sabri, Lu, Pau, Jose y Joaquín, por aqellos días de mates, libros y risas que me

empujaron hasta acá. Por la amistad que peurdura a pesar de los años y las distancias.

A los Sabatini y los Canales, por su hermosa amistad, por su apoyo y cariño.

A Sabri, por estar siempre al pie del cañón, por ser una gran compañera, una gran

amiga y un gran apoyo en todo momento. Por tantas alegrías y tristezas compartidas.

Por esas largas charlas telefónicas que tan bien me hacen.

A mis amigos, Marian, Hernán, Gaby, Diego, Seba, Noe, Sabri, Pitu, Topo, Ale, Lucho y

Luli, por quererme, por ayudarme, por soportarme y darme fuerzas. Los adoro.

A Estela, por estar siempre interesada en lo que hago y por ayudarme con Juli cuando

lo necesité.

A la Noni, por adoptarme como tu nieta, por ser tan generosa, dulce y atenta.

A mi hermano Adri, por resolver mis dudas informáticas en segundos y con poca

paciencia. Por estar siempre que te necesito, y por ser el mejor y único hermano que

tengo.

A mamá y papá, por haberme permitido elegir mi camino. Por aceptar mis decisiones,

festejar mis aciertos y acompañarme en mis equivocaciones. Por demostrarme con su

ejemplo que nunca es tarde para lograr lo que uno se propone, que el sacrificio vale la

pena, y que todo tiene solución. Por esa fuerza que tienen para levantarse y salir

adelante, y por contagiármela a mí. Por su ayuda infinita, su enorme sacrifico y su

amor incondicional.

A mi hija Julieta, por llenar mi vida de felicidad. Por invitarme a redescubrir el mundo a

través de tus ojitos curiosos. Porque tu sonrisa hace que todo valga la pena.

A Pablo, por ser mi pilar, por sacarme a flote, por llenarme de fuerzas. Por recordarme

todo el tiempo que esto es lo que me hace feliz, por permitirme lograr esta meta

ayudándome en todo lo que estuvo a tu alcance. Por cuidarme y por hacerme tan feliz.

Y a todos los que de alguna manera me han acompañado en este largo camino……..

……………….GRACIAS TOTALES!

A Pablo y Julieta

A mamá y papá

Publicaciones y Financiamiento 9

PUBLICACIONES

Esta tesis dio origen a la siguiente publicación:

“Characterization of substrates that have differential effect on

�� protein kinase A holoenzyme activation”

Galello F, Portela P, Moreno S and Rossi S.

(2010) ! �" �� #�� 285, 29770429779.

Este trabajo fue financiado por:

•••• Agencia de Promoción Científica y Tecnológica

•••• Conicet

•••• UBA

Indice 10

ABREVIATURAS 12 INTRODUCCIÓN GENERAL 15 I. Transducción de señales por cAMP 16 II. Proteína quinasa A en mamíferos 17 II.1. Subunidad catalítica 17 II.1.2. Estructura 17 II.1.3. Reconocimiento del sustrato 20 II.2. Subunidad regulatoria 22 II.3. Holoenzima 26 II.4. Mecanismo de activación 29 II.5. Microdominios de cAMP y localización subcelular de la PKA 31 III. Proteína quinasa A de �� 34� III.1. Subunidad catalítica 34 III.2. Subunidad regulatoria 35 III.3. Holoenzima 37 III.4. Localización subcelular de la PKA de levaduras 37 IV. Sustratos de la PKA 39 IV.1. Sustratos fisiológicos de la PKA 39 IV.2. Sitio consenso de fosforilación de la PKA 40 IV.3. Estructura secundaria y exposición a la superficie de los sitios de fosforilación 41 IV.4. Co4localización de la PKA con sustratos fisiológicos 42 IV.5. Especificidad de sustrato de la PKA de � �� 43 V. Proteínas de anclaje de la PKA 43 V.1. Estructura y función de la unión de las AKAPs a la PKA 44 V.2. Diversidad dentro de la familia AKAP 52 OBJETIVOS GENERALES 54 MATERIALES Y MÉTODOS 57 1. Cepas utilizadas 58 1.1. Cepas de levaduras 58 1.1.1. Construcción de las cepas S331 BCY14TAP, S332 BCY14TAP y S330 BCY14TAP 58 1.1.2. Cepas cedidas por otros laboratorios 59 1.2 Cepas de bacterias 59 2. Plásmidos 60 3. Medios de cultivo 62 3.1. Medios de cultivo para levaduras 62 3.2. Medios de cultivo para bacterias 63 4. Transformación de levaduras 63 5. Preparación de extractos crudos 63 6. Expresión y purificación de proteínas 63 6.1. Expresión y purificación de las proteínas Pyk14His, Pyk24His y Nth14His 63 6.2. Expresión y purificación de la proteína Pyk1 64 6.3. Purificación de las proteínas Bcy1 salvaje y mutantes de deleción aminoterminales 64 7. Ensayos de actividad PKA 65

Indice 11

7.1. Preparación de enzima 65 7.1.1. Purificación de la holoenzima PKA 65 7.1.2. Purificación de la subunidad catalítica de levaduras 66 7.2. Cálculo de las unidades enzimáticas para las purificaciones de Tpk1 y Tpk2 66 7.3. Ensayos de actividad PKA �� 67 7.4. Ensayos de activación de PKA �� 68 8. �� de péptidos 69 8.1. Revelado de ��de péptidos por auto radiografía 69 8.2. Revelado de �� de péptidos por inmunoblot 69 9. Purificación e identificación de proteínas por espectrometría de masa 70 9.1. Purificaciones 70 9.1.1 Purificación TAP 70 9.1.2.Purificación por cAMP4agarosa 71 9.2. Identificación por espectrometría de masa 73 10. Ultracentrifugación en gradiente de sacarosa 73 11. �� 74 12. Inmunoprecipitación �� 75 13. Fraccionamiento subcelular 75 14. Preparación de fracción mitocondrial cruda 76 15. Ensayo de estrés térmico 77 16. Determinación de concentración de proteínas 77 17. �� 77 18. Inmunoblot o �� 77 19. Tinción con �� coloidal 78 CAPÍTULO I: Sustratos de la Proteína quinasa A de �� y su participación en la activación de la holoenzima 79 I.1. Introducción y objetivos específicos 80 I.2. Resultados y discusión 81 I.2.1. Los péptidos derivados de las proteínas Nth1, Pyk1 y Pyk2 son fosforilados por Tpk1 y Tpk2 82 I.2.2. Residuos determinantes para el reconocimiento del sustrato por Tpk 94 I.2.3. Participación de los péptidos sustratos en la activación de la Holoenzima 102 I.2.4. Las proteínas sustrato sensibilizan a la PKA hacia la activación por cAMP 105 I.3. Conclusiones 109 CAPÍTULO II: Identificación y caracterización de proteínas que interactúan con la subunidad regulatoria de la PKA de �� 113 II.1. Introducción y objetivos específicos 114 II.2 Resultados y discusión 120 II.2.1. Identificación de proteínas que hacen interacción con Bcy1 120

Indice 12

II.2.2. El extremo amino terminal de Bcy1 se une �� a péptidos derivados de las proteínas interactoras 127 II.2.3. Los determinantes involucrados en la interacción con Bcy1 difieren de los presentes en las AKAPs de Mamíferos 136 II.2.4. Bcy1 e Ira2 están presentes en las mismas fracciones subcelulares e interactúan �� 146 II.2.5. Péptidos derivados de la proteína Ira2 son fosforilados por Tpks 150 II.2.6. Localización subcelular de Hsp60 y PKA 154 II.2.7. Relevancia fisiológica de la interacción Bcy14Hsp60 157 II.2.8. Red de interacción de Bcy1 161 II.3. Conclusiones 166 CONCLUSIONES GENERALES 173 PERSPECTIVAS 179 APÉNDICE 182 A.1.Tabla de AKAPs canónicas 183 A.2.Tabla de AKAPs no canónicas 201 A.3. Protocolo modificado de la purificación TAP para la obtención de fuente enzimática 202 A.4. Identificación de proteínas por espectrometría de masa 203 BIBLIOGRAFÍA 205

�

Abreviaturas 13

ABREVIATURAS

PKA Proteína quinasa dependiente de cAMP

cAMP Adenosin monofosfato cíclico

ATP Adenosin trifosfato

R Subunidad Regulatoria de PKA

C Subunidad Catalítica de PKA

AKAPs Proteínas de anclaje de PKA

PKI Péptido Inhibidor de PKA

PBC Casete de unión a fosfato

Epac Factor activador de guanina activado por cAMP

D/D Dominio de dimerización y anclaje

CNB Dominio de unión a cAMP

IS Secuencia inhibitoria

Bcy1 Subunidad Regulatoria de��

Tpk Subunidad Catalítica de��

Pyk1 Piruvato quinasa 1

Pyk2 Piruvato quinasa 2

Nth1 Trehalasa neutra 1

TAP ��$$ � �� $ ��

wt % ��

BSA Seroalbúmina bovina

Da Dalton

ADN Ácido desoxirribonucleico

mRNA Ácido ribonucleico mensajero

mtADN Ácido desoxirribonucleico mitocondrial

EDTA ÁcidoTetra Acético diamina etileno

EGTA ÁcidoTetra Acético etilenglicol bis

min Minutos

seg Segundos

ml Mililitro

Ml Microlitro

�m Micrómetro

Abreviaturas 14

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

PMSF Fenil4Metil4Sulfonil fluoridro

SDS Dodecil sulfato de sodio

MALDI4TOF �� &�' ��(��)�� *+�� ,�� -$��

��.� ��

SDS4PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS

NMR Resonancia magnética nuclear

U Unidades enzimáticas

d.p.m. Desintegraciones por minuto

AC Adenilato ciclasa

PDE Fosfodiesterasa

n.d. No determinado

/�� Constante de Michaelis4Menten � �

0��&� � Velocidad máxima

A0.5 50% de activación

/� Constante de especificidad

/�� Constante catalítica

r.p.m. Revoluciones por minuto

�

�� !!��""��##�� $$��

Introducción General 16

I.Transducción de señales por cAMP

Las vías de señalización celular constituyen mecanismos de comunicación

entre y dentro de las células para asegurar un comportamiento coordinado de

los organismos y para regular los variados procesos biológicos.

Intracelularmente, los mecanismos de transducción de señales transmiten

información basados en modificaciones post4traduccionales finamente

controladas. La fosforilación de proteínas es una de las modificaciones post4

traduccionales más comunes.

Las proteínas quinasas son enzimas regulatorias claves que modifican las

propiedades de un determinado sustrato a través de la adición de un grupo

fosfato en un residuo de Serina, Treonina o Tirosina. Regulan numerosos

procesos celulares durante el crecimiento y el desarrollo, siendo una parte

integral de la maquinaria de respuesta a estrés, y encontrándose directamente

involucradas en los procesos de muerte celular.

Una de las vías de transducción de señales que se encuentra bien

caracterizada es el camino de señalización del cAMP, donde la unión de un

ligando a los receptores asociados a proteína G (GPCRs), vía proteínas G y

adenilato ciclasa (AC) conlleva a un aumento intracelular de los niveles del

segundo mensajero cAMP. Esto resulta en la activación de diferentes

moléculas efectoras como por ejemplo, la proteína quinasa dependiente de

cAMP (PKA) [143].

La holoenzima PKA en su forma inactiva es un tetrámero compuesto por dos

subunidades catalíticas (C) unidas a un dímero de subunidades regulatorias

(R). El aumento intracelular de los niveles de cAMP frente a un estímulo

determinado provoca la disociación y activación de la holoenzima. La unión de

cAMP a la subunidad regulatoria provoca una disminución en la afinidad entre

R y C, y como consecuencia, la holoenzima se disocia liberando las

subunidades catalíticas (Figura 1).


Figura 1. Mecanismo de activación de la PKA por cAMP [4].

II. Proteína quinasa A en mamíferos ��%�� &� ��%�'��

�

Existen tres isoformas de la subunidad catalítica en mamíferos, Cα, Cβ y Cγ.

Entre Cα y Cβ las secuencias de aminoácidos difieren aproximadamente un

7%. La isoforma Cα se expresa constitutivamente en todos los tejidos, mientras

que Cβ es tejido específica; la presencia de Cγ sólo se ha demostrado en

testículos. Esta isoforma presenta una identidad del 79% y 83% con Cα y Cβ

respectivamente [5].

Las proteínas que pertenecen a la familia de las quinasas presentan un

dominio quinasa homólogo denominado dominio catalítico, compuesto por 2504

300 residuos de aminoácidos. Los distintos tipos de quinasas, como las

serina/treonina y tirosina quinasas, se clasifican en base al dominio catalítico,

su especificidad de sustrato y modo de regulación. Los miembros de los

distintos grupos y familias comparten propiedades estructurales y funcionales

básicas [6].

La PKA pertenece a la familia de las AGC quinasas, que es un grupo de

serina/treonina quinasas al cual también pertenecen PKC y PKG.


El dominio catalítico posee tres roles:

14 Unión de ATP (o GTP) en complejo con cationes divalente (Mg2+ o Mn2+)

y orientación del fosfato transferible.

24 Unión y orientación de la proteína o péptido sustrato.

34 Transferencia del fosfato γ al oxhidrilo aceptor.

El dominio catalítico se subdivide en 12 subdominios (I4XII), cada uno con una

secuencia primaria conservada (Figura 2). Los residuos aminoacídicos de los

subdominios se encuentran conservados en todas las familias de proteínas

quinasas, y en particular la secuencia aminoacídica de los subdominios VIB,

VIII, IX [6].

Figura 2. Secuencia de la subunidad Cαααα. Los subdominios indicados en colores son los

pertenecientes al ��catalítico conservado en todas las quinasas [7].

La subunidad catalítica presenta una estructura bilobular muy conservada en

todo el grupo de las quinasas. Esta estructura bilobular presenta dos

subdominios o lóbulos (Figura 3). El lóbulo menor, lóbulo N4terminal o lóbulo N,


está formado por cinco estructuras de hojas plegadas β y una α hélice

predominante llamada αC e incluye los subdominios I4IV. El lóbulo C es mayor

y se encuentra principalmente formado por α hélices e incluye los subdominios

VI a XI [8]. Este lóbulo contiene la mayor parte de la maquinaria catalítica así

como también los principales sitios de unión para el sustrato. Entre los dos

lóbulos se encuentra el sitio activo [3].

Figura 3. Estructura cristalográfica de la subunidad Cαααα bovina [9].

Al resolverse la estructura cristalográfica del complejo PKACα4PKI, se pudo

conocer la topología general de la estructura del �� catalítico de una proteína

quinasa [10]. Con la posterior resolución de los complejos ternarios PKACα4PKI

con MgATP o MnAMP4PNP [11,12], se logró asignar un rol preciso a cada uno

de los residuos conservados y se determinó así que cada subdominio del ��

catalítico presenta residuos con una fuerte implicancia en el rol catalítico. Por

ejemplo en el subdominio I (en el lóbulo menor) está presente el motivo

consenso GxGxxGxV denominado� (�� , que forma una estructura flexible

que une los fosfatos no transferibles del ATP y los coordina para la interacción

con las cadenas laterales de otros residuos. Esta interacción permite posicionar


al nucleótido para la catálisis. El sitio activo puede unir dos iones Mg2+ que

permiten la unión de ATP, y juegan un rol fundamental en regular la

fosfotransferencia y en limitar la velocidad de reacción. El resto de los

subdominios presentan residuos claves que permiten anclar y orientar el ATP,

hacer interacción con los residuos de la secuencia de reconocimiento del

sustrato y permitir la fosfotransferencia. La región presente en el subdominio

VIB, denominado �� catalítico, presenta residuos que son necesarios para

que se produzca la fosfotransferencia. La activación de la PKA se logra por

fosforilación de un residuo Thr en posición 197 presente en el subdominio VIII

[6].

��%�(��

�

Los requerimientos generales para el reconocimiento de los sustratos por la

subunidad C se han caracterizado utilizando péptidos sintéticos. El sustrato

proteico se une al �� catalítico presente en el lóbulo mayor. Para que la

fosfotransferencia sea óptima se requiere que los residuos del dominio VIII se

encuentren en una disposición espacial determinada. Los sustratos de la PKA

son el ATP dador de fosfato y una proteína que actúa como aceptor del mismo.

Para que la subunidad C reconozca sus sustratos proteicos es imprescindible

la presencia de una secuencia consenso que incluya dos residuos básicos,

generalmente argininas, seguidos por un residuo pequeño que precede al sitio

fosfoaceptor (RRXS/T) [13415]. Luego del sitio fosfoaceptor, que puede ser una

serina o treonina, se encuentra un residuo hidrofóbico voluminoso. El péptido

sustrato clásico para la PKA deriva del sitio de fosforilación de la piruvato

quinasa de cerdo y se denomina kemptido [13]. �

La nomenclatura con la que se indica la posición de los residuos se basa en

designar el sitio fosfoaceptor como P0. Los aminoácidos que se ubican hacia el

extremo amino terminal de P0 se los designa con el signo – (Ej: P41), mientras

que los se ubican hacia el extremo carboxi terminal se los indica con el signo +

(Ej: P+1).


La cristalización de la isoforma Cα unida al péptido PKI permitió conocer más

en detalle las interacciones necesarias para el reconocimiento del sustrato. El

péptido inhibidor PKI deriva del inhibidor termoestable de proteína quinasa [16].

Este péptido contiene la secuencia consenso de fosforilación descripta

anteriormente y además presenta características adicionales que le confieren

alta afinidad de unión [17].

A partir del cristal del complejo Cα4PKI se observó que [18]:

• La cadena lateral de la fenilalanina en P411 es responsable de la alta

afinidad de unión del extremo amino terminal de PKI. El bolsillo

hidrofóbico sobre la superficie de la subunidad C complementa

perfectamente la cara hidrofóbica de la hélice formada por el péptido.

• La orientación de la región de unión de alta afinidad de PKI está

determinada por contactos iónicos que involucran la Arg en P46 (Figura

4A).

• Las interacciones electroestáticas dominan la porción del péptido

próximo al sitio fosfoaceptor, mientras que las interacciones hidrofóbicas

dominan la región carboxilo terminal al sitio fosforilable.

• Las argininas en P43 y P42 hacen interacción con las cadenas

carboxílicas laterales de distintos residuos de la subunidad C (Figura

4B).

• Los residuos Leu198, Pro202 y Leu205 forman un surco hidrofóbico que

rodea a la cadena lateral de la isoleucina en P+1. Esta región

hidrofóbica sería importante para la orientación correcta del sitio aceptor

de fosfato (Figura 4B).

• La Thr197, uno de los dos sitios de fosforilación estables de esta

enzima, también rodean al sitio P+1. El fosfato es sostenido por

múltiples interacciones electroestáticas lo cual contribuye a la estabilidad

conformacional del residuo hidrofóbico en P+1 y para la correcta

orientación del sitio fosfoaceptor (Figura 4C).


Figura 4. Estructura cristalina del complejo Cαααα%PKI [10]. (A) Interacciones de las

cadenas laterales de la Phe en P411 y la Arg en P46 con la subunidad C. (B) Interacciones

de las Arg en P43 y P42 y de la Ile en P+1 con los residuos de la subunidad C. La cadena

lateral de la Ile en P+1 se proyecta sobre el área hidrofóbica formada por Leu198, Pro202 y

Leu 205. (C) Las subunidades Cα se muestran en gris, los oxígenos en rojo y los nitrógenos

en azul. En amarillo se muestra la posición correspondiente a la Thr197 fosforilada.

Los sustratos se ubican en una conformación extendida a través del bolsillo de

unión al nucleótido, cerca del fosfato γ del ATP. El �� de activación provee

una plataforma para el sustrato. El� �� es fosforilado cuando la quinasa está

activa. Su fosforilación estabiliza la subunidad en una conformación extendida

que permite la unión del sustrato.

��'�� )��

�

Las subunidades regulatorias de la PKA son proteínas que presentan multi4

dominios e interactúan con una gran variedad de proteínas además de actuar

como los principales receptores para el cAMP. Aunque existen distintas


isoformas (RIα y RIβ, RIIα y RIIβ), todas presentan la misma organización

estructural (Figura 5).

Figura 5. Organización de los dominios de las isoformas de la subunidad R [3]. D/D:

dominio de dimerización y anclaje; IS: sitio inhibitorio; Dominio A y Dominio B: dominios de

unión a cAMP (CNBs).

Todas las isoformas presentan un dominio de dimerización y anclaje (D/D) en

el extremo N4terminal, el cual actúa como sitio de unión para las proteínas de

anclaje denominadas AKAPs (ver más adelante). Si bien la estructura del D/D

se encuentra conservada entre RI y RII, la secuencia no se conserva. Ambas

contienen dos regiones helicoidales conservadas separadas por un giro. La

Hélice I, o subdominio 1, presenta los determinantes para el anclaje y la

dimerización, mientras que la Hélice II, o subdominio 2, presenta solo los

determinantes para la dimerización. En contraste a estas hélices conservadas,

existen diferencias importantes en la estructura secundaria del extremo amino

terminal en el pequeño segmento que precede a la Hélice I [19]. El dímero de

RIIα se pliega formando un grupo de cuatro hélices en forma de X que contiene

una interface de dimerización hidrofóbica así como también una superficie de

unión a AKAPs [20], mientras que el dímero de RIα presenta una estructura en

forma de Y [21] (Figura 6).


Otra diferencia entre RI y RII es que las subunidades RI se mantienen como

dímero debido a la presencia de dos uniones puente disulfuro intercatenarias

formadas por residuos de cisteínas presentes en el extremo N4terminal [15].

Posterior al dominio D/D se encuentra un sitio inhibitorio y dos dominios de

unión a cAMP en tándem (CNBs). Las estructuras de las subunidades RIα y

RIIβ en su conformación unidas a cAMP revelaron que los CNBs son motivos

conservados semejantes a la proteína activadora de los genes del catabolismo

(CAP) en bacterias [22,23]. Entre el dominio D/D y los dominios CNB se

encuentra un dominio desplegado llamado zona � �� o bisagra que incluye al

sitio inhibitorio. El � �� es una región desordenada que posee gran flexibilidad

[24]. El sitio inhibitorio de la subunidad RI presenta una alanina (sitio

pseudosustrato) mientras que el de la subunidad RII presenta una serina en la

misma posición (sitio sustrato) (Figura 5).


Figura 6. Dominios D/D de RIαααα y RIIαααα. (A) Alineamiento de secuencias de los dominios D/D

de RIα (bovina) y RIIα (murina). �� ,1� ��: Los residuos críticos para la dimerización se

encuentran coloreados de la siguiente forma: verde, residuos conservados en RIIα y RIα; azul:

residuos no conservados. ��: Los residuos críticos para la unión a las AKAPs se

encuentran coloreados siguiendo el mismo criterio utilizado para el panel izquierdo [19]. (B)

Estructura del dominio D/D de RIα y RIIα. �� : vista lateral; �� $� ��: vista

inferior desde la superficie de unión a la AKAP [25]. (C) Uniones disulfuro en el dímero RIα [26].

�


��(��*��+ ��

�

Existen cuatro isoformas de holoenzima de PKA que se denominan Iα, Iβ, IIα y

IIβ en función de la isoforma de R que acompaña a C.�

El cAMP se une cooperativamente a los sitios CNB4A y CNB4B de cada

subunidad R. En la holoenzima inactiva, solo el sitio B se encuentra expuesto y

disponible para la unión de cAMP. Cuando es ocupado, promueve la unión del

cAMP al sitio A a través de un cambio estérico intramolecular. La unión de

cuatro moléculas de cAMP, dos a cada subunidad R, conlleva a un cambio

conformacional y a la disociación de un dímero de subunidades R con cuatro

moléculas de cAMP unidas y dos monómeros de C activos [27]. �

La PKA de tipo I es más sensible al cAMP con una constante de activación

(/��) de 504100 nM de cAMP y es principalmente citosólica, mientras que cerca

del 75% de la PKA de tipo II, que se encuentra asociada a organelas y a

estructuras celulares específicas, presenta una /�� de 2004400 nM de cAMP

[28430]. Las distintas isoformas de las subunidades R codificadas por distintos

genes se expresan diferencialmente en diferentes tipos celulares. Mientras

que RIα y RIIα son de expresión ubicua [31,32], RII β se expresa

principalmente en tejido endócrino, cerebro, tejidos grasos y reproductivos, y

RIβ se encuentra mayormente en cerebro [33435].

Las diferencias en las afinidades por el cAMP y la localización entre las

isoformas de la PKA podrían contribuir a la especificidad en el camino de

señalización del cAMP [36]. RI y RII presentan otras diferencias además de las

mencionadas: las subunidades RI y RII aportan diferentes superficies que

participan en la interacción con la subunidad C [37] y además difieren en el

requerimiento de ATP para dicha interacción. Mientras que la PKA de tipo II

requiere del dominio CNB4B para la formación de la holoenzima, la PKA tipo I

requiere ATP4Mg2+ [38].

Para explicar cómo la subunidad C es inhibida por R, cómo el cAMP activa a la

holoenzima y cuáles son las diferencias estructurales que conllevan a la

regulación diferencial de las holoenzimas de tipo I y tipo II, se cristalizaron

distintas mutantes de deleción de RIα o RIIα en complejo con la subunidad Cα

(Figura 7A y B respectivamente). Para analizar en detalle la estructura de la


holoenzima de tipo I, se cristalizó la mutante RIα(914244) junto con la

subunidad Cα en presencia de un análogo no hidrolizable de ATP (AMP4PNP).

Una extensa superficie de la subunidad C está involucrada en la unión con la

subunidad R. Los principales puntos de contacto son: (1) el sitio activo; (2) el

�� de unión al sustrato (�� P+1) y la hélice αG hidrofóbica; (3) el �� de

activación. La estructura reveló que la subunidad C presenta una conformación

completamente cerrada, con Mn2+AMP4PNP unido al sitio activo del bolsillo

catalítico y que sirve como una plataforma estable para el anclaje de la

subunidad RIα. La superficie de anclaje sobre la subunidad C se encuentra

localizada casi exclusivamente en el lóbulo mayor [39].

Las subunidad RIα presenta importantes cambios conformacionales luego de la

formación del complejo [39]:

i. La secuencia inhibitoria se ancla al sitio activo en el bolsillo

catalítico.

ii. Se ordena la región linker que conecta el sitio inhibitorio y el

dominio CNB4A.

iii. El dominio CNB4A se ancla sobre el lóbulo mayor de la subunidad

C.

La resolución de esta estructura cristalográfica permitió conocer en detalle los

puntos de contacto entre R y C, y puso en evidencia los cambios

conformacionales que debe atravesar la subunidad RI para liberar las

subunidades C y unirse al cAMP. Sin embargo, este complejo carece del

segundo sitio de unión a cAMP, el cual resulta crucial para la activación

alostérica de la PKA por el nucleótido cíclico. La activación de la holoenzima de

tipo I por cAMP es un proceso altamente ordenado, el dominio CNB4A es

inaccesible hasta que el cAMP ocupa el dominio CNB4B (ver más adelante).

Para responder este interrogante, se resolvió la estructura cristalográfica del

complejo formado por la mutante RIα(914379) (que contiene los dos sitios de

unión a cAMP) y Cα en presencia de AMP4PNP y dos iones Mn2+. A partir de

este nuevo cristal se definió un nuevo punto de contacto sobre la subunidad C,

el �� catalítico, que interactúa únicamente con el dominio CNB4B de la


subunidad R. También se observó que la subunidad RIα pasa de una

conformación globular a una conformación extendida cuando se une a la

subunidad C para conformar la holoenzima, en donde los dos dominios de

unión a cAMP se separan a causa de la extensión de la hélice αB/C del

dominio CNB4A.

La mutante de RIIα, RIIα(904400) fue cristalizada junto con la subunidad Cα en

ausencia de ATP. La subunidad catalítica se encuentra en la conformación

abierta, el sitio activo está abierto y la cola C4terminal se encuentra

desordenada. Por otro lado, el sitio inhibitorio y la región � ��, los cuales se

encuentran desordenados en la subunidad RII libre, se ordenan en la

holoenzima, tal como ocurre en la holoenzima de tipo I. El anclaje del dominio

CNB4A sobre el lóbulo mayor de la subunidad C crea una interface extensa

donde el CNB4 B aporta un pequeño pero esencial motivo de anclaje que une al

�� catalítico de la subunidad C [23].

La subunidad RIIα sufre tres cambios importantes [23]:

iv. Se ordena el sitio inhibitorio y la región � �� subsiguiente.

v. Se reorganizan los subdominios helicoidales del dominio A, lo

cual conlleva a la separación de los dominios A y B.

vi. Reorganización del subdominio helicoidal del dominio B para

acomodar el anclaje al �� αH4αI de la subunidad C.


Figura 7. Estructuras cristalográficas de las holoenzimas de tipo I (A) y II (B). (A) En la

figura se observa la secuencia inhibitoria de la subunidad RIα(914379) unida al sitio activo de la

subunidad catalítica. Los recuadros indican los sitios de interacción entre R y C [22]. (B)

Estrucutura de la holoenzima formada por RIIα(904400) y Cα [23].

��,��-�� .��

Es ampliamente aceptado que el cAMP activa a la PKA causando la

disociación de las subunidades R y C. Este mecanismo ha sido validado por

diversos experimentos �� en dónde se demostró que a bajas

concentraciones de cAMP la PKA existe como holoenzima, pero a altas

concentraciones de este nucleótido las subunidades enzimáticas se disocian en

un homodímero de R (R2) y dos monómeros de C [40444].

Sin embargo se ha demostrado que el agregado de un exceso molar de cAMP

a la holoenzima de tipo I causa la disociación parcial de la misma. Sólo el

agregado de un péptido sustrato junto con el cAMP logra la disociación total.

En estas mismas condiciones, sin embargo, un porcentaje significante de

holoenzima de tipo II permanece sin disociar [45]. Por lo tanto, en el

mecanismo de activación de la holoenzima el sustrato juega un rol importante y

es diferencial en la activación de la PKA tipo I versus la de tipo II. Como se

mencionó anteriormente, las subunidades RI y RII comparten los mismos


dominios de organización pero presentan diferencias en cuanto a sus

propiedades bioquímicas. Una de estas diferencias es que la holoenzima de

tipo I necesita dos iones Mg2+ y altas concentraciones de ATP para que se

forme el complejo [38]. El efecto diferencial de estos cofactores sobre la

estabilidad de la holoenzima podría estar directamente relacionado con el

efecto diferencial del sustrato.

El mecanismo propuesto para la activación de la holoenzima de tipo I se

muestra en la Figura 8. La unión del cAMP a RIα provoca un cambio

conformacional alostérico en el subdominio del CNB4A, que interactúa con la

subunidad C, lo cual produce un debilitamiento de las interacciones. Si el

sustrato está presente, éste compite con el sitio inhibitorio y facilita la

disociación completa del complejo R4C. El hecho de que la adición del sustrato

en ausencia de cAMP no causa la disociación de la holoenzima ni provoca

cambios conformacionales, sugiere que el sitio activo de la subunidad C se

encuentra completamente bloqueado en la holoenzima inactiva. Sin embargo,

la unión del cAMP a la holoenzima provoca un cambio conformacional que

permite al sustrato competir con el sitio pseudosustrato por el sitio activo de la

subunidad C. El mecanismo de activación para la holoenzima de tipo II

parecería ser más complejo dado que el sustrato no es tan efectivo como

competidor de la región pseudosustrato de la RII [45].


Figura 8. Modelo propuesto para el mecanismo de activación por cAMP de la PKA [45].

Las subunidades catalíticas se representan en forma de “��” en negro. Las subunidades

R se representan de la siguiente manera: los dominios A y B de unión a cAMP se representan

como elipses azules; el cuadrado verde representa el dominio D/D, y la línea roja la región

� �� que incluye el sitio inhibitorio pseudosustrato. El sustrato se muestra como un rectángulo

celeste. (A) Conformación de la holoenzima a bajas concentraciones de cAMP. (B)

Conformación de la holoenzima luego de la unión del cAMP. (C) Participación del sustrato en la

activación. Ver detalles en el texto.

��/��- �� -�� +�� .��0��

Todas las vías de señalización que involucran al cAMP como segundo

mensajero se basan en un conjunto de componentes moleculares comunes. La

expresión tejido específica de las diferentes isoformas de cada uno de estos

componentes junto con su ensamblaje en localizaciones subcelulares discretas

facilitan la regulación específica de las funciones celulares. Los componentes

principales de estos complejos de señalización son la adenilato ciclasa (AC),

que genera el cAMP, y las fosfodiesterasas (PDEs) que lo degradan. La ACs y

las PDEs son las encargadas de generar los gradientes o microdominios de


cAMP en localizaciones celulares específicas. Estos gradientes de cAMP

actúan localmente siendo los principales efectores la PKA, las proteínas de

intercambio activadas por cAMP (Epacs) que actúan como factores

intercambiadores de GTP y, en algunos tipos celulares, los canales iónicos

gatillados por cAMP. La interpretación de la señal en localizaciones celulares

discretas es llevada a cabo por la ubicación de estos efectores en nodos de

señalización particulares, en donde las proteínas AKAPs juegan un rol

fundamental. Estas proteínas de andamiaje sitúan a la PKA en espacios

celulares específicos cerca de sus sustratos. Las AKAPs no solo anclan a la

PKA sino que también interactúan con las PDEs, los receptores asociados a

proteína G (GPCRs), ACs, Epacs y las proteínas sustrato de la PKA. De esta

manera la regulación de la vía del cAMP ocurre a diferentes niveles: la

generación del cAMP, el control de los efectores, y la terminación de la señal

(Figura 9).

�

Figura 9. Camino de señalización del cAMP [46]. cAMP: círculos rojos; 1) PKA; 2) PDEs; 3)

GEFs; 4) canales iónicos gatillados por cAMP.


La PKA de tipo I se encuentra principalmente localizada en el citosol, pero una

pequeña cantidad se halla anclada por las AKAPs en estructuras subcelulares

específicas [47]. La PKA de tipo II se ancla a estructuras subcelulares definidas

a través de la interacción con las AKAPs [46,48450]. Además de presentar una

localización diferencial, las distintas isoformas de R presentan una expresión

tejido específica: la isoforma RIα se expresa de manera ubicua mientras que

RIβ se expresa principalmente en las células del sistema nervioso central [35];

la expresión de RIIα es ubicua, mientras que RIIβ se encuentra

predominantemente en cerebro como así también en tejido neuroendocrino,

adiposo y reproductivo [36].

Por definición, la subunidad catalítica de la PKA colocaliza con los complejos

R4AKAPs. Luego de la disociación por cAMP la localización de C no está

restringida por la interacción con R y puede fosforilar sustratos preferentemente

cercanos. En células de mamíferos, la señalización nuclear vía cAMP requiere

del movimiento de subunidades C libres dentro del núcleo [51]. Por ejemplo, la

translocación de C es el paso limitante para la fosforilación del factor de

transcripción CREB. Dado que la entrada de C al núcleo es por difusión pasiva,

la fosforilación de CREB es relativamente lenta comparada con la disociación

de la holoenzima por cAMP en el citoplasma [52]. Se piensa que el tiempo

necesario para la translocación nuclear de C podría contribuir a diferencias

cinéticas en la fosforilación de sustratos citoplasmáticos y nucleares. A

diferencia de la entrada, la salida del núcleo de C depende de un mecanismo

de transporte activo. El inhibidor endógeno de la PKA (PKI) es una proteína

pequeña que contiene una secuencia pseudosustrato [53] la cual se une al sitio

de unión del sustrato de las subunidades C libres en el núcleo y de esta

manera previene la fosforilación de sustratos de la PKA. El PKI presenta una

señal de exportación nuclear (NES) que permite la exportación de las

subunidades C desde el núcleo hacia el citoplasma [54,55].

Las subunidades catalíticas también pueden interactuar con proteínas

denominadas AKIPs ('�� ), y esta interacción puede

afectar directamente la actividad quinasa. Varias de estas proteínas están

involucradas en el �� de la subunidad C entre el citoplasma y el núcleo.


Por ejemplo, la AKIP1 interactúa con la hélice A del extremo amino terminal de

la subunidad C anclándola en el núcleo [56].

III. Proteína quinasa A de ��

�

��%�� &� ��

�

En levaduras, la subunidad catalítica está codificada por tres alelos

parcialmente redundantes en su función: TPK1, TPK2 y TPK3. Las tres

proteínas poseen una región carboxilo terminal (300 aminoácidos) que se

encuentra conservada en todas las quinasas dependientes de cAMP, y una

región amino terminal corta. En la región carboxilo terminal, Tpk1 y Tpk3

presentan aproximadamente 88% de identidad, mientras que Tpk2 presenta

76% de identidad respecto a los otros dos alelos. Las secuencias de las TPKs

tiene una identidad de alrededor del 50% con la subunidad C de mamíferos en

la región correspondiente al �� catalítico de la enzima y al extremo C4terminal

[57].

Tanto Tpk2 como Tpk1 poseen mayor actividad que Tpk3 �� . La baja

actividad quinasa de la isoforma Tpk3 podría deberse a la baja expresión de la

proteína [58]. La deleción de los tres genes que codifican para las TPKs resulta

letal para la célula, sin embrago la expresión de uno solo de ellos (cualquiera

sea) es suficiente para que la célula sea viable. Sin embargo se ha demostrado

que cada subunidad catalítica posee roles específicos [59].

De las tres isoformas, Tpk1 es la más estudiada hasta el momento. Esta

isoforma presenta muchas de las características estructurales y cinéticas

presentes en la PKA de mamíferos: alta identidad en el �� catalítico [57],

selectividad por sustratos peptídicos desde el punto de vista cualitativo [60], y

la capacidad de unirse a la subunidad regulatoria y al péptido inhibitorio PKI

[61,62]. Además, las subunidades catalíticas de mamíferos pueden sustituir

funcionalmente a las TPKs �� [63]. A pesar de estas similitudes, Tpk1 se

diferencia de la subunidad C de mamíferos en cuanto a la selectividad

cuantitativa de los sustratos. La mayor diferencia ocurre a nivel de la afinidad

de unión por los péptidos inhibitorios y en la /� aparente para el nucleótido y


los sustratos peptídicos [62,64]. La resolución de la estructura cristalina de la

proteína Tpk1� (carece de los primeros 80 aminoácidos) en ausencia de

ligandos reveló que la proteína presenta una estructura conservada formada

por dos lóbulos globulares y que los cambios conformacionales que ocurren

durante la unión del ligando y la catálisis se encuentran también conservados

entre especies [65].

��'�� )��

�

La subunidad regulatoria de la PKA de levaduras está codificada por un único

gen, BCY1. La proteína Bcy1 presenta una identidad del 40% con las

subunidades regulatorias RI y RII de mamíferos, sin embargo existen

importantes diferencias estructurales en el extremo amino terminal: Bcy1

presenta 47 aminoácidos más en su extremo amino terminal que las

subunidades regulatorias de mamíferos. Tal como ocurre para RI y RII, la

subunidad regulatoria de levaduras también presenta una estructura modular

(ver Figura 5) [66]. El dominio amino terminal de Bcy1 es homólogo al N4

terminal de RI y RII e incluye un sitio de fosforilación en la Ser 145 [67]. Aún no

se conoce cuáles son los residuos involucrados en la dimerización de las

subunidades regulatorias de Bcy1 ni tampoco aquellos que participan en la

interacción con posibles proteínas de anclaje. Sin embargo, el análisis de

secuencia aminoacídica entre Bcy1 y RII indica que los residuos dentro de la

hélice I no se encuentran conservados en levaduras, mientras que sí lo hacen

los residuos de la hélice II y aquellos necesarios para la dimerización (Figura

10).


Figura 10. Alineamiento del dominio D/D (Adaptado Tesis Jimena Rinaldi). En la parte

superior del alineamiento se indica la estructura secundaria predicha para Bcy1, la cual

coincide con la estructura resuelta para las subunidades RI y RII de mamífero. Para cada

secuencia a izquierda y derecha se indica la numeración de aminoácidos. En la parte inferior se

indica la numeración del alineamiento. El sombreado negro, gris oscuro y gris claro

corresponde a 90, 66 y 56% de conservación de tipo de aminoácido, respectivamente. Los

residuos críticos para la dimerización y para la unión con las AKAPs para RI y RII se indican de

la siguiente manera: �� 2 residuos implicados en la dimerización; �� 3�:

residuos involucrados en la unión con las AKAPs.

Recientemente en nuestro laboratorio se resolvió la estructura cristalográfica de

los dominios CNBs de Bcy1 utilizando la mutante de deleción Bcy1(1684416)

unida a cAMP [68]. Las regiones de Bcy1 que difieren con las estructuras de

mamíferos son las mismas regiones en las que difieren RI y RII [69], lo cual

indica que la variabilidad está restringida a regiones específicas de la molécula.

La orientación relativa de los dominios es diferente a RIα y a RIIβ. Esta

orientación diferencial se debe a la diferencias en el quiebre entre las hélices B

y C del CNB4A y determina zonas de contacto distintas a las observadas en las

subunidades R de mamíferos. Bcy1 presenta características similares a RIα,

como la posición de los residuos �� y el entrelazado de puentes de

hidrógeno del casete de unión a fosfato del CNB4A (PBC4A); comparte otras

características con las subunidades RII, como la Ser fosforilable en el IS y la

Met y la Asn conservada del PBC4A. En otros aspectos es diferente a estos dos

grupos, como por ejemplo en la orientación relativa de los dominios, las

interacciones de la Tyr conservada del PBC4A, la cola C4terminal, entre otros

[68].


La disrupción del gen BCY1 no es letal, pero genera sensibilidad al estrés

térmico y a la deprivación de nitrógeno [66].

��(��*��+ ��

�

La cinética de la interacción R4C en � �� difiere de la interacción que

se da entre las subunidades de mamíferos. En mamíferos, la interacción se

encuentra en el rango subnanomolar; en � �� , se ha estimado que la

afinidad se encuentra alrededor de 20 nM [67].

Para la holoenzima de mamíferos se ha estimado que el cAMP decrece la

afinidad R4C 1000 veces [27]. En � �� la afinidad aparente entre R4C

disminuye 20 veces por el agregado de cAMP. Las razones para estas

desigualdades pueden radicar en las diferencias en la estructura primaria de

las subunidades regulatorias Bcy1 y RII y en las diferentes modificaciones

postraduccionales que sufren cada una de ellas. Además las subunidades Tpks

de � �� difieren de su homóloga en mamíferos en cuanto a la afinidad

por el kemptido y por PKI [61].

��,��$�� +�� .��0��

�

La localización de Bcy1 es dinámica y dependiente de la disponibilidad de

nutrientes. En células creciendo en glucosa Bcy1 es predominantemente

nuclear, mientras que en ausencia de esta fuente de carbono se encuentra

distribuida tanto en núcleo como en citoplasma. Bcy1 es retenida en el

citoplasma en ausencia de glucosa debido a la fosforilación de dos �� de

serinas ubicados en el extremo amino terminal de la proteína (primeros 124

aminoácidos). Estos �� son dos regiones particularmente ricas en serinas.

El �� I se ubica en el extremo N4terminal, mientras que el �� II se ubica

entre los residuos de serina 68 y 84. Cuando las serinas del �� I o del

�� II son mutadas a alaninas no se observan grandes cambios en la

localización de Bcy1. Sin embargo cuando se mutan las serinas de ambos

�� se observa que Bcy1 presenta una marcada localización nuclear


cuando las células son crecidas en presencia de glucosa, sugiriendo que la

fosforilación en ambos �� es importante para una adecuada localización.

En cambio, en fase estacionaria se observó que independientemente de cuál

sea la mutación sobre los ��, la localización de Bcy1 mutante era igual a

la de Bcy1 salvaje, indicando que en fase estacionaria los mecanismos de

localización de Bcy1 no involucran a los �� I y II [70]. La fosforilación de

los �� de serinas y la localización de Bcy1 serían dependientes de la

expresión del gen YAK1 [71,72]. Yak1 es una proteína quinasa cuya actividad

es antagónica a la de PKA [73], y su expresión es dependiente de Msn2 y

Msn4, dos factores de transcripción regulados negativamente por PKA [74], lo

cual sugiere que la propia PKA regula su localización. Los mismos autores

identificaron una proteína, Zds1, que hace interacción con el amino terminal de

Bcy1. La fosforilación del ��II de serinas incrementaría la afinidad de Bcy1

por Zds1 la cual puede retener a Bcy1 fosforilada en el citoplasma, por lo que

esta proteína podría funcionar como una AKAP, sin embargo no presenta las

características de éstas (ver más adelante). Dado que para la localización de

Bcy1 se propone que ambos �� son importantes y sin embargo para la

localización dependiente de Zds1 solo está involucrado el �� II, se propone

la participación de otra proteína o factor que interactúe con el �� I.

Durante crecimiento exponencial en glucosa, tanto Bcy1 como Tpk2 localizan

en el núcleo, mientras que Tpk1 y Tpk3 muestran una distribución núcleo4

citoplasmática. En células creciendo en fuente de carbono no fermentable o en

fase estacionaria, las subunidades de PKA se ubican en citoplasma,

encontrándose Tpk2 y Tpk3, pero no Bcy1, asociadas a �� o 4��

�� [75]. La localización de Tpk1 (y posiblemente de Tpk2 y Tpk3) depende

de la interacción con Bcy1, es decir depende de los niveles de cAMP. En las

células que se encuentran creciendo en fuente de carbono no fermentable o en

fase estacionaria de crecimiento, Bcy1 se encuentra citoplasmática, donde

puede inhibir a la subunidad catalítica lo cual es un requerimiento necesario

para el metabolismo en fuente de carbono no fermentable [76]. No se conoce si

la exportación nuclear de las subunidades catalíticas involucra un mecanismo

activo.


IV. Sustratos de la PKA

�1�%��2 ��.) ��0��

�

Las bases moleculares de la especificidad de sustratos de la PKA han sido

originalmente bien definidas mediante el uso de péptidos sustratos derivados

de proteínas sustrato bien caracterizadas y péptidos derivados del PKI. A partir

de la estructura cristalina del complejo PKI4C y mediante el análisis de los

cambios estructurales en la subunidad catalítica, se definieron los

determinantes de unión claves tanto en el PKI como en la subunidad catalítica.

Empleando kemptido (LRRASLG) se ha observado �� que sustituciones

que alejan o acercan el par de R respecto del sitio fosfoaceptor o la sustitución

de éstos por Lys afectan su calidad como sustrato de la PKA, disminuyendo la

constante de especificidad de la catálisis hasta 700 veces [77]. Estos

resultados indicarían que los sustratos nativos deberían conservar una

secuencia específica "mínima" que asegure propiedades cinéticas óptimas para

su fosforilación.

Sin embargo, se han descripto sustratos fisiológicos de la PKA que presentan

sustituciones en las argininas P42 y P43 por lisinas o variaciones en la posición

relativa de estas respecto al residuo fosfoaceptor. Esto indica que los sustratos

"naturales" de la PKA se desvían de la descripción de especificidad obtenida ��

� ��. Los criterios que se deben cumplir para la definición de un sustrato

fisiológico de las proteínas quinasas ha sido expuesto por Krebs y Beavo

(1979) [78]:

1) Demostración �� que la proteína puede ser estequiométricamente

fosforilada por una quinasa y desfosforilada por una fosfatasa apropiada.

2) Demostración que las propiedades de la proteína sufre cambios y

correlaciona con el grado de fosforilación.

3) Demostración que la proteína puede ser fosforilada y desfosforilada ��

� �� o en un sistema celular intacto acompañado de cambios

funcionales.

4) Correlación entre los niveles de proteína quinasa y/o fosfatasa y el grado

de fosforilación de la proteína sustrato.


Así se elaboró una lista de aproximadamente 100 sustratos fisiológicos de la

PKA [79]. Para esto, basándose en los criterios expuestos anteriormente, se

incluyeron los sustratos en los cuales se ha demostrado la fosforilación ��

en respuesta al incremento del cAMP (puntos 3 y 4), más la precisión que

ofrece la identificación del sitio de fosforilación �� . Esto es importante, ya

que no es raro que los sitios �� e �� difieran. No todos los sustratos

incluidos en la lista pueden cumplir con los cuatro puntos. Varios sustratos que

se han incluido no presentan una consecuencia funcional de su fosforilación.

Algunos de ellos pueden incluir efectos que aun no han sido considerados

como localización subcelular o tasa de degradación en células intactas. Al día

de hoy debería haberse incrementado esta lista debido a los distintos sustratos

que han sido caracterizados, sin embargo la misma no ha sido actualizada.

�1�'�� 2�2�� .��0��

�

Los sitos de fosforilación obtenidos a partir de la recopilación realizada por

Shabb permiten la evaluación de la secuencia consenso para PKA en un

contexto fisiológico. La observación de la ocurrencia de todas las

permutaciones de estos sitios demuestra que no existe una secuencia

consenso única que prediga satisfactoriamente los sitios de fosforilación. Por lo

que, muchas veces, se requiere de la confirmación experimental de los sitios

de fosforilación de la PKA [79].

Analizando la probabilidad de fosforilación por PKA como el cociente entre los

sitios fosforilados por PKA determinados experimentalmente sobre los sitios

consensos totales (este número indica cuan eficiente es ese sitio como motivo

consenso de PKA) se ha observado que:

1) Existe una fuerte preferencia por Arginina en P42 y/o P43.

2) La secuencia consenso RRXS es la más abundante, representando

ligeramente más del 50% de todos los sitios. El 80% de todos los sitios

RRXS presentes en los sustratos fisiológicos están sujetos a

fosforilación, indicando que este motivo es el sustrato más eficiente.


3) Si bien la arginina es el residuo básico preferido en las posiciones P42 y

P43, aproximadamente el 15% contiene al menos un residuo lisina en

estas posiciones. El 47% de todos los sitios RKXS son fosforilados en

sustratos fisiológicos por PKA, mientras que la eficiencia de fosforilación

es menos del 20% para KRXS.

4) El residuo serina es preferido como sitio fosfoaceptor frente a la

treonina, la presencia de Ser ocurre en 135 de 145 secuencias

examinadas.

Examinando las posiciones fuera de P42 y P43, surgen otras características.

Existe una leve preferencia por Arg en las posiciones P44 a P47 y una gran

frecuencia de residuos hidrofóbicos (Phe, Ile, Leu y Val) en la posición P+1.

Existe además un incremento en la frecuencia de residuos pequeños en la

posición P41.

De estas observaciones se desprende que la PKA fosforila eficientemente

sustratos fisiológicos que presenten secuencias consenso RRXS, lo cual es

consistente con numerosos estudios �� así como el análisis bioquímico y

cristalográfico de las interacciones entre PKI y PKA. Pero como se ha

mencionado anteriormente este motivo representa solo el 50% de todos los

sitios fisiológicos de la PKA. La fosforilación menos frecuente de motivos con

variaciones tanto en la posición como en el tipo de residuo, dificulta la

predicción de sitios de fosforilación sobre la base de la estructura primaria. Es

importante notar que la flexibilidad en la secuencia consenso podría causar que

diferentes sustratos presenten diferentes afinidades por la subunidad catalítica,

constituyéndose en "mejores" y "peores" sustratos.

�1�(�� 34� � .�� 4�2 � � ��

2�2�� .��

�

Se ha analizado la estructura secundaria de fragmentos de péptidos derivados

de 406 sustratos proteicos para proteínas quinasas. Se ha definido utilizando

varios procedimientos de predicción que los residuos Ser y Thr se encuentran

preferentemente dentro de estructuras del tipo �� (70%), mientras que el 204


30% de las secuencias pertenecerían a estructuras del tipo hélice o extendidas

[80].

Realizando predicción de la accesibilidad a la superficie de los residuos Ser y

Thr presentes en los sustratos, se ha observado que alrededor del 65470% de

los residuos fosforilables estarían en la superficie de la proteína. Por otro lado,

si se realiza este análisis sobre todos los residuos Ser y Thr presentes en las

proteínas sustratos se observa que la Ser y Thr tienen la misma probabilidad

de tener ubicaciones externas o internas en la proteína. Estos resultados

indicarían que el residuo a ser fosforilado debe encontrarse en la superficie de

la proteína sustrato, accesible a la proteína quinasa y debe ser parte de una

cadena polipeptídica relativamente flexible para "adaptarse" al sitio activo de la

enzima.

No existe mucha evidencia experimental que describa cuál es el efecto de las

características estructurales del sitio consenso en la fosforilación por la PKA.

La tasa de fosforilación de la piruvato quinasa de hígado de cerdo resultó

menor que para un péptido derivado de ésta [81]. Además se observó

utilizando análogos estructurales del PKI (6422), que la estructura de la porción

central de éste, comprendida por los residuos 12415, tiene gran influencia sobre

su habilidad para unirse a la subunidad catalítica e inhibirla. Específicamente,

la formación de una estructura del tipo lámina β en la región central disminuye

la interacción de PKI a la subunidad catalítica [82].

�1�,�� +�� .��0��2 ��.) ��

�

El uso de péptidos que compiten la interacción AKAPs4dominio de dimerización

de las subunidades regulatorias de la PKA, ha permitido demostrar el rol de las

proteínas de anclaje de la PKA en las reacciones de fosforilación. Cuando el

péptido Ht31 es introducido en una célula, éste puede bloquear la fosforilación

dependiente de cAMP de un sustrato cuando la AKAP está involucrada en la

co4localización de la PKA y éste [83].

Mediante el uso de este abordaje se definieron varios sustratos cuya

fosforilación depende de su co4localización con PKA. Algunos ejemplos son:

Acuoporina42, receptor β24adrenérgico y canales de calcio sensibles a voltaje.


Sin embargo, se han descripto algunos casos en donde la subunidad catalítica

interacciona directamente con el sustrato, como ser la propia subunidad

regulatoria del tipo II.

�1�/��4� 2 � ��0��

Utilizando péptidos derivados del activador transcripcional Adr1, el cual es

necesario para la expresión de la enzima alcohol deshidrogenasa, se ha

caracterizado la especificidad de sustrato de la PKA de � � �� [84].

Empleando péptidos de diferentes largos alrededor de la Ser230, y como

fuente de enzima la isoforma Tpk1 y la subunidad catalítica de la PKA de

corazón porcino, se demostró que ambos tipos de subunidades catalíticas

presentan determinantes aminoacídicos en común, los cuales incluyen los

residuos proximales del lado amino terminal y hasta la posición P+4 del

carboxilo terminal respecto del sitio fosfoaceptor. Sin embargo, la enzima de

mamíferos presenta mayor afinidad por los sustratos que Tpk1 y tiene

preferencia por péptidos más largos respecto de la posición P44.

Estos resultados sugieren que las subunidades catalíticas reconocen

determinantes aminoacídicos similares pero no idénticos.

V. Proteínas de anclaje de la PKA

Es ampliamente aceptado que la localización subcelular de las subunidades R

de mamíferos ocurre a través de la interacción con las AKAPs. Esta familia

formada por cuarenta y tres genes funcionalmente relacionados es definida

sobre la base de su habilidad para interactuar con las subunidades R de la

PKA. Las primeras proteínas de anclaje fueron detectadas como

contaminantes que co4purificaban con las subunidades R en purificaciones por

cAMP4agarosa [85]. Más tarde, el uso de protocolos de �� que utilizaban

RII como sonda, estrategias de clonado y expresión, y análisis de doble híbrido

en levaduras permitieron identificar más miembros de la familia AKAPs [86488].

Hasta la fecha han sido identificadas alrededor de 50 AKAPs en mamíferos y


organismos inferiores [50] (Apéndice A.1). Se definieron AKAPs que hacen

interacción con RI o con RII y AKAPs que hacen interacción tanto con RI como

con RII. Así se clasificaron en 3 clases dependiendo de su especificidad: RI4

específicas, RII–específicas o de especificidad dual. La principal característica

de las AKAPs es la presencia de un dominio de interacción con R, pero

además presentan un dominio de anclaje a localizaciones subcelulares

específicas. Una propiedad de las proteínas AKAPs es su habilidad para

asociar simultáneamente varias proteínas. Este concepto ha sido bien

establecido por numerosos fraccionamientos subcelulares, �� por doble

híbrido en levaduras, y abordajes de espectrometría de masa. El resultado neto

de estas búsquedas ha sido la clara evidencia de que la mayoría, si no todas

las AKAPs, presentan la capacidad de interactuar con diferentes

combinaciones de activadores, efectores, enzimas involucradas en la

transducción y terminación de la señal, y sustratos [1,89]. Esto le permite a los

complejos de señalización formados por las AKAPs efectuar una rápida y

eficiente transmisión de la señal en ambientes locales. Algunas AKAPs se

expresan ubicuamente, mientras que otras presentan una función específica en

tipos celulares especializados. Por ejemplo, en cardiomiocitos, numerosas

AKAPs ocupan localizaciones celulares precisas para coordinar funciones

críticas del corazón, incluyendo el acoplamiento excitación4contracción, la

homeostasis del oxígeno, el gasto de energía, y el control transcripcional.

1�%��2�� .�� .��0��0��

�

Aunque los dominios de unión a RII de diferentes AKAPs comparten una baja

identidad de secuencia (<30%) se propone que existe un motivo de estructura

secundaria común a todas las AKAPs. La interacción AKAP4R involucra una

región de α4hélice en la proteína de anclaje (dominio AKB, ' /inase "inding) la

cual se une fuertemente al dominio D/D formado por los primeros cuarenta y

cinco aminoácidos de cada monómero de RII [90]. Los dominios de unión a RII

presentan un patrón de residuos hidrofóbicos e hidrofílicos que tiene una alta

probabilidad de formar una hélice anfipática. Este motivo se encuentra

conservado en todas las AKAPs con especificidad para RII (Tabla 1).


Tabla 1. Alineamiento de los dominios de unión a RII de distintas AKAPs. Los

residuos hidrofóbicos conservados se encuentran resaltados en color gris.

Si bien la mayoría de las AKAPs descriptas hasta el momento son específicas

para RII, existen ejemplos de AKAPs con especificidad para RI. La unión entre

las AKAPs y las subunidades RI y RII presentan diferencias. RII se une con

mayor afinidad a las AKAPs y tienen una menor velocidad de disociación que

las subunidades RI. Recientemente se han descripto ejemplos de AKAPs de

tipo dual que también conservan esta característica de unir con mayor afinidad

a RII que a RI [91]. Esta afinidad menor entre RI y las AKAPs se atribuyó,

según ensayos �� , a diferencias estructurales en el dominio D/D N4

terminal de RI que permitirían una disociación más rápida de la hélice

anfipática para RI que para RII; sin embargo, las interacciones dinámicas de

estas proteínas están menos estudiada en sistemas �� [49].

Como se mencionó anteriormente, la superficie de contacto sobre la AKAP es

una α4hélice anfipática. La organización estructural de esta hélice formada por

14418 aminoácidos ubica a los residuos hidrofóbicos sobre la cara interior de la

hélice la cual interactúa directamente con el dominio D/D, y los residuos


hidrofílicos sobre la superficie exterior (Figura 11 B y C). Esto genera una

superficie de unión de alta afinidad que encaja dentro del surco hidrofóbico

formado los dominios D/D de las subunidades R. Cualquier mutación que

perturbe la conformación de esta hélice tiene efectos deletéreos sobre el

anclaje de la PKA [83,90].

Figura 11. Estructura del cristal del dímero del dominio D/D de RIIαααα en complejo con el

péptido D%AKAP2. Los dos monómeros de RIIα se muestran en verde y en amarillo. Los

distintos colores en el péptido D4AKAP2 representan la polaridad de los aminoácidos (azul:

hidrofóbicos, rojo: polar). (A) Vista de la parte superior del sitio de interacción con la AKAP. (B)

Vista desde uno de los lados mostrando la interacción de la cara no polar (azul) del péptido con

el surco hidrofóbico del sitio de interacción con las AKAPs [92].

La resolución del cristal de la hélice anfipática de la D4AKAP2 junto con el

dominio D/D de RIIα permitió conocer más en profundidad el mecanismo de

interacción y la especificidad de la unión entre estas proteínas. Un elemento

estable y otro dinámico, que se encuentran en el dominio D/D de la RII, crean

una superficie asimétrica para la hélice de la AKAP. La hélices I y I´

correspondientes a cada monómero de la R, se empaquetan de forma


antiparalela para formar el surco hidrofóbico (Figura 12A). Las cadenas

laterales del péptido D4AKAP2 complementan la superficie expuesta por RII

[93]. Se ha identificado por mutagénesis que las Ile5 y Leu21 de RII son

necesarias para la interacción con las AKAPs [94,95] (Figura 12C). Estos

residuos crean un bolsillo hidrofóbico bien definido.

Varios estudios han revelado las bases moleculares de la especificidad de

isoforma y han demostrado que existen diferencias en la distribución de cargas

en la superficie. Mientras que RIIα tiene una superficie de interacción

principalmente hidrofóbica, RIα posee residuos adicionales ácidos y básicos en

el sitio propuesto de interacción [26].

La subunidad RIα contiene un N4terminal más extendido formando una hélice

N1 adicional. Estudios de intercambio hidrógeno/deuterio sugieren que la hélice

N1 está involucrada en la unión entre RI y las AKAPs [25]. A partir de la

estructura cristalina del dominio D/D de RIα con el péptido D4AKAP2 se

confirmó la participación de las hélices N1 en la unión con la AKAP y además se

le asignó un rol a las cisteínas presentes en el extremo aminoterminal de RI,

las cuales aparentemente le confieren una estructura ordenada al extremo N4

terminal (Figura 13) [21].

La comparación de los complejos RIα/D4AKAP2 y RIIα/D4AKAP2 permitió

conocer los determinantes moleculares para la especificidad de las

subunidades R por las AKAPs. Se identificaron cuatro bolsillos hidrofóbicos en

RIα que interactúan con pares de aminoácidos hidrofóbicos de la hélice del

péptido D4AKAP2, mientras que RIIα presenta solo dos bolsillos hidrofóbicos

que interactúan con los residuos hidrofóbicos del péptido D4AKAP2 [21,93].

Se postula que las AKAPs que interactúan con RIα presentarían una secuencia

más larga en su dominio de interacción. Quizás esta sea la razón por la cual

solo unas pocas AKAPs hacen interacción exclusivamente con RIα. Además, la

presencia de los puentes disulfuros en RI le quitan flexibilidad al dímero y

restringen el acceso al sitio de unión de la AKAP [21].


Figura 12. Superficies hidrofóbicas complementarias sobre el dominio D/D de RIIαααα y el

péptido D%AKAP2. (A) El péptido D4AKAP2 se removió de la interface y se rotó 180º para

apreciar las superficies de interacción. Las líneas punteadas esquematizan los residuos del

péptido y del dominio D/D que se empaquetan en la interface hidrofóbica. (B) Interacciones

específicas de las cadenas laterales entre los residuos del dominio D/D y el péptido. (C) Los

residuos hidrofóbicos conservados del dominio D/D se encuentran en color rojo. Los residuos

esenciales para la dimerización se indican con un asterisco verde, y los residuos importantes

para la unión a las AKAPs, pero que no afectan la dimerización, se indican con un asterisco

rojo. Adaptado de [93].


Figura 13. Interacciones entre el dominio D/D de RIαααα y el péptido D%AKAP2. (A) Esquema

de las interacciones entre las cadenas laterales del péptido D4AKAP2 y los monómeros del

dominio D/D de RIα. La flechas sólidas y punteadas indican las interacciones hidrofóbicas y

polares respectivamente. Los bolsillos hidrofóbicos se encuentran indicados con recuadros

azules. (B) Estructura que muestra la interacción. Los distintos motivos estructurales se

encuentran coloreados como en (A). (C) Dominios estructurales de RIα. Los asteriscos verdes

y rojos indican los residuos críticos para la dimerización y el anclaje a las AKAPs,

respectivamente. Las cisteínas conservadas se resaltan en amarillo.


Las AKAPs de especificidad dual, que unen tanto RI como RII, poseen una

secuencia adicional fuera de la hélice anfipática, denominada región específica

para RI (RISR), originalmente identificada en la proteína ezrina [96]. La región

RISR está formada por 30 aminoácidos y contiene dos �� de residuos

básicos (Figura 14 A). Mediante la metodología de�'�� se determinó

que los residuos básicos en las posiciones 359, 360 y 381 son críticos para la

interacción con RI. A partir del alineamiento de las regiones de unión a RI de

distintas AKAPs duales y utilizando el algoritmo MEME se generó la secuencia

consenso Glu4Ser4Lys4Arg4Arg4Gln4Glu4Glu4Ala4Glu4Gln4Arg4Lys a la cual se la

denominó “péptido RISR”, y se comprobó que este péptido se une a RI. Es

importante notar que este péptido no contiene residuos hidrofóbicos. Por

ensayos de dicroísmo circular se determinó que RISR es capaz de adoptar una

configuración helicoidal. Utilizando mutantes de deleción amino terminales de

RI se demostró que el sitio de interacción con RISR se encuentra hacia el C4

terminal del dominio D/D, entre las hélices I y II (Figura 14 B) [96].

Figura 14. Dominios de unión a RI de las AKAPs duales. (A) Alineamiento de las AKAPs

duales Ezrina, D4AKAP1, Merlin, PAP7 y D4AKAP2. El recuadro verde indica el dominio

conservado de hélice anfipática; el recuadro rojo muestra el dominio de unión a RI. Residuos

conservados: Azul: básicos; Rojo: ácidos; Gris: hidrofóbicos. (B) Se muestra el sitio de unión a

RISR en RIα. Adaptado de [96].


Un trabajo posterior describió una nueva proteína AKAP con especificidad dual,

el �� .�� '�� *�� 17A (SFRS17A), el que presenta un

dominio RISR en el cual también los residuos básicos son claves para la

interacción con RI [97].

El rol funcional de las proteínas de anclaje de la PKA es inferido

frecuentemente a través del uso de péptidos inhibidores. Péptidos derivados de

la hélice anfipática de la AKAP4Lbc, también conocida como �� 56

(Ht31), fueron inicialmente caracterizados por su habilidad para romper la

interacción PKA4AKAP [98,99] a través de diferentes abordajes bioquímicos y

fisiológicos. Mediante el análisis de �� de péptidos en los cuales los

residuos en el sitio de unión a R se reemplazaban por otros de diferentes

características junto con subsecuentes estudios bioinformáticos permitieron el

desarrollo del péptido AKAP4 �� (AKAP4+�), además del péptido permeable

para la membrana celular TAT4AKAP4+�, el cual es selectivo para RII sobre RI

(Figura 15) [100,101]. Estudios complementarios llevaron al desarrollo de dos

péptidos selectivos para RI, el péptido PV438 y el péptido RIAD con mucha más

selectividad para RI que para RII [1024104]. Estudios de estos péptidos a través

de análisis de alta resolución de estructura han mostrado cuáles son los

residuos en la hélice anfipática que hacen contacto con el dímero de R (Figura

15A) [93,104]. Modificaciones de las secuencias de estos péptidos permitieron

generar otros más específicos como el RIAD4RISR [96] y el SuperAKAP4+�

[105], ambos utilizados en ensayos �� .


Figura 15. Aspectos estructurales de la interacción de los péptidos derivados de AKAPs

con las subunidades regulatorias de la PKA. (A) Vista detallada de las interacciones entre

AKAP4+� y RII. Los residuos importantes para las interacciones AKAP4RII se encuentran

numerados; los correspondientes sitios de interacción con RII se encuentran resaltados. (B)

Alineamiento de secuencia del dominio de unión a RII de los péptidos de algunas AKAPs [49].�

�

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1�'�� 2�� 0��

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Debido a las variadas funciones de PKA, es concordante que las AKAPs estén

presentes en cualquier tejido y tipo celular y que ocupen la mayoría de las

organelas como la membrana plasmática, citoesqueleto, mitocondria, aparato

de Golgi, núcleo o estructuras vesiculares [50] (Apéndice A.1).

No todas las AKAPs se unen al dominio D/D vía una hélice anfipática. Esas

AKAPs no canónicas incluyen a la pericentrina, cuyo dominio de unión a PKA

es largo (100 aminoácidos), no forma una α hélice, y contiene una región rica

en leucinas que hace interacción con RII [106] (Apéndice A.2).

Solo se conocen unas pocas AKAPs no canónicas, probablemente porque en

las búsquedas se utiliza solo el dominio D/D y no la subunidad R entera [107], o

porque se consideran como falsos positivos porque su unión a PKA no

disminuye por la presencia de los péptidos disruptores [108]. Es probable

entonces que un número considerable de AKAPs no canónicas no hayan sido

aun identificadas.


En invertebrados se identificaron AKAPs en # �� y en ) ��. La

única AKAP conocida en # �� es la AKAPCE [109,110]. La AKAPCE se une

a la RI humana pero no a la RII. # ��solo expresa una isoforma de la

subunidad regulatoria de PKA, RCE, la cual es homóloga a la RIα humana [109].

En ) ��se han descripto varias AKAPs que son capaces de unir

tanto R de )�� como RII de humanos [111].

En #�� , un alga unicelular verde con dos flagelos, se ha

descripto que la proteína radial 3 (RSP3) tendría la función de AKAP. El anclaje

de la PKA al flagelo a través de SPR3 resulta necesario para el movimiento

flagelar [112,113].

El conocimiento de AKAPs en invertebrados es muy escaso, pero los ejemplos

encontrados muestran que el mecanismo de interacción, es decir la unión a

PKA, es necesario para que se produzcan determinados procesos.

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!!5566��11!!�� $$��

Objetivos Generales 55

OBJETIVOS GENERALES

La especificidad de la fosforilación, como hemos descripto en la Introducción,

se encuentra regulada a distintos niveles por dos factores importantes que son

en los cuales focalizamos nuestro estudio: la especificidad del sustrato blanco,

y la localización tanto de la quinasa como del sustrato.

La efectividad de la fosforilación de proteínas por las proteínas quinasas en

general, incluyendo a la PKA, depende de la estructura primaria del sustrato

alrededor del sitio consenso de fosforilación [13,14,114]. Los determinantes de

la especificidad de sustratos para la PKA de mamíferos han sido analizados en

profundidad, mientras que en otros organismos estos determinantes no se

encuentran ampliamente caracterizados. Si bien es aceptado que la secuencia

canónica de fosforilación para PKA es Arg4Arg4X4Ser, péptidos conteniendo

esa secuencia derivados de proteínas que son posibles sustrato no se

fosforilan de igual forma. Por lo tanto, uno de los objetivos de esta tesis fue

analizar los determinantes de la especificidad de sustrato, caracterizando los

residuos alrededor de la secuencia blanco consenso que tienen importancia en

el reconocimiento de una proteína como sustrato en el modelo ��

�� .

La PKA de � �� está conformada por dos subunidades regulatorias

(Bcy1) y dos subunidades catalíticas, de las cuales existen tres isoformas

denominadas Tpk1, Tpk2 y Tpk3. Si bien se ha propuesto por años que las tres

isoformas poseen especificidad de sustrato común [57,66], cada Tpk presenta

funciones diferentes y también superpuestas en respuesta a la activación por

cAMP [115,116]. En un análisis global de fosforilación de proteínas en

levaduras se han identificado sustratos únicos para cada Tpk, y solo ocho

sustratos compartidos por las tres isoformas. Estos resultados indicarían que

las tres isoformas presentarían especificidad diferente de sustrato [117]. En

función de estos antecedentes, otro de los objetivos planteados en esta tesis

fue estudiar la selectividad y especificidad de secuencia de fosforilación de las

distintas isoformas de Tpk.

Objetivos Generales 56

Los sustratos participan en el mecanismo de activación de la holoenzima PKA,

pueden desplazar la subunidad R uniéndose a la subunidad C y por lo tanto

facilitar la disociación de la holoenzima, siendo en ese caso la PKA activada a

menores concentraciones de cAMP. Resultados previos de nuestro grupo de

investigación demuestran que en levaduras un sustrato de la PKA, como es la

proteína Piruvato quinasa 1 (Pyk1), es fosforilado menos eficientemente en

comparación con un péptido derivado que contenga el residuo fosforilable

Ser22, a pesar de presentar mayor afinidad [118]. Otro de nuestros objetivos

fue analizar si las proteínas sustrato y sus péptidos derivados, sensibilizan de

manera diferencial a la holoenzima PKA para su activación por cAMP.

Las proteínas de anclaje de PKA (AKAPs) son claves en la regulación

espacio4temporal de la PKA y permiten por lo tanto también regular la

especificidad en la vía de señalización cAMP4PKA. La mayoría de AKAPs

descriptas hasta el momento corresponden a eucariotas superiores tanto para

R tipo I como R tipo II o ambas; se han descripto una AKAP en # �� y

una proteína que interactúa con la subunidad regulatoria de � ��

(Bcy1), Zds1, pero esta última no cumple con las características estructurales

de las AKAPs [119]. Nuestro siguiente objetivo fue identificar y caracterizar

proteínas que interactúen con la subunidad regulatoria de la PKA en levaduras,

determinar el dominio de Bcy1 involucrado en esta interacción y analizar

cuáles son los residuos en la secuencia de las proteínas interactoras

responsables del anclaje de Bcy1.

Determinar los mecanismos involucrados en la regulación espacial y temporal

de PKA, así como también determinar con exactitud la secuencia consenso

reconocida por la quinasa contribuirá a dilucidar los mecanismos que gobiernan

la vía de transducción de señales cAMP4PKA en levaduras.

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Materiales y Métodos 58

1. Cepas utilizadas

%�%��4��

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Cepa Genotipo

KT 1115

S13-3A (133)

Mata leu2 ura3 his3 pep4�

Matα his3 leu2 ura3 trp1 ade8 tpk2::HIS3 tpk3::TRP1 bcy1::LEU2

Nth1-HA-His* KT1115 + pBG1805-NTH1-HA-His

Pyk1 –HA-His* KT1115 + pBG1805-PYK1-HA-His

Pyk2-HA-His*

JT20454(W)

KT1115 + pBG1805-PYK2-HA-His

MATa his3 leu2 ura3 trp1 tpk1::ade8 tpk2::HIS3 tpk3::TRP1 msn2::LEU2

msn4::TRP1 +pPYK101

033c TAP S288C (ATCC 201388)Mata his3�1 leu2�0 met15�0 ura3�0 BCY1-TAP

S330 W303; MATa tpk2::tpk1::KmR



S330 BCY1-TAP W303; MATa tpk2::tpk1::KmR BCY1TAP

S331 BCY1-TAP W303; MATa tpk2::tpk3::KmR BCY1TAP

S332 BCY1-TAP

1115-BCY1

1115-��N85BCY1

IRA2-HA

IRA2-TAP

PTP1-TAP

MYO2-HA-His*

HSP60-HA-His*

HSP60 wt

HSP60 ts

W303; MATa tpk2::tpk3::KmR BCY1TAP

KT1115 + YEp51-BCY1

KT1115 + YEp51-�85BCY1

MATa IRA2-3HA-G418 ura3-52 leu2�::hisG

S288C (ATCC 201388)MATa his3�1 leu2�0 met15�0 ura3�0 IRA2-TAP

S288C (ATCC 201388)MATa his3�1 leu2�0 met15�0 ura3�0 PTP1-TAP

KT1115 + pBG1805-MYO2-HA-His

KT1115 + pBG1805-HSP60-HA-His

ura3 leu2 his4 trp1 rme1 HMLa hsp60::TRP1 + pYCPlac60

ura3 leu2 his4 trp1 rme1 HMLa hsp60::TRP1 + pYCPlac MIF4

(*) La cepa KT1115 fue transformada con el plásmido BG1805 que contiene el cDNA de los

siguientes ORFs: YDR001C (Nth1), YAL038W (Pyk1), YOR347C (Pyk2), YOR226W (Myo2) o

YLR259C (Hsp60) bajo el promotor GAL1 (Open Biosystems).

%�%�%�� .��4��((%�5�7%��9��(('�5�7%��((:�

5�7%��;�4<%�5��%��9��4<'�5��%��9��4<(�5��%��=�

�

El fragmento que comprende la región c4terminal codificante de BCY1

fusionada al epítope TAP (Tandem Affinity Purification) y que incluye el

marcador de selección HIS3, fue amplificado por PCR utilizando como

templado DNA genómico de la cepa BCY14TAP. Los �� utilizados fueron:

.��2 5´AGACCATGATTATTTCGGTG3´ y 7��2

5´GTAGTAACAGCAGTAGTAGA3´. Las cepas S330, S331 y S332 fueron


transformadas por el método de acetato de litio con los productos de PCR y se

seleccionaron las células en medio mínimo sin histidina. La expresión de las

proteínas de fusión fue analizada por �� utilizando anticuerpos anti

TAP o anti Bcy1 (Figura 1).

�

�

Figura 1. Verificación de las construcciones Tpk1%

Bcy1TAP, Tpk2%BcyTAP y Tpk3%BcyTAP. Extractos

proteicos de las cepas transformantes S3304BCY1 TAP

(TPK3), S3314BCY1 TAP (TPK1) y S3324BCY1 TAP (TPK2)

fueron sembrados en un SDS4PAGE 10% y transferidos a

membrana de nitrocelulosa. La presencia de la proteína de

fusión Bcy14TAP (80KDa) fue verificada utilizando anticuerpos

anti TAP y anti Bcy1.

%�%�'��4�� 4��

�

La cepa +7'��' fue gentilmente cedida por el Dr Heitman del Department of

Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center.

Las cepas ��89��89��fueron gentilmente cedidas por�la Dra Sabine

Rospert del Institute of Biochemistry and Molecular Biology, University of

Freiburg.

%�'��4��

�


Las bacterias 4 �� de la cepa BL214CodonPlus (DE3)4RIPL fueron

transformadas con los vectores recombinantes pRSETb 4 �N168BCY1 o

pRSETb 4 �N138BCY1. Esta cepa expresa los tRNAs de codones poco

frecuentes en 4 �� y la polimerasa T7 bajo un promotor inducible por IPTG.

2. Plásmidos

�

�:�;4�<6�"#;62�La construcción de este plásmido recombinante fue realizada

por la Dra Vanina Zaremberg en el laboratorio de la Dra Moreno [120].

�:�;4�<6��=><"#;62�Se clonaron los fragmentos de ADN que codifican para

el polipéptido Bcy1 864416 en el plásmido YEp51 por amplificación del mismo

por PCR, digestión y ligación. Los �� utilizados fueron .��2

5`GTCCATGGGTATGTTCAAATCCCCCTT3`, 7��2

5`GTAAGCTTTTAATGTCTTGTAGGATCAT3`. Los sitios de restricción

utilizados fueron NcoI y HindIII.

�: �7�4�� =68>"#;6� �� 7�4�� =65>"#;62� Se clonaron los

fragmentos de DNA que codifican para los polipéptidos derivados de Bcy1 1394

416 y 1674416 en el plásmido pRSETb (Figura 2) por amplificación de los

mismos por PCR, digestión y ligación. Se utilizaron los sitios de restricción XhoI

y NdeI, lo cual permite eliminar el péptido de seis His de la construcción. Estas

construcciones fueron realizadas en el laboratorio de la Dra Silvia Moreno por

la Dra Jimena Rinaldi.


Figura 2. Mapa del vector pRSETb.

�

�:� �"�6>9<�=��6��'�� "�6>9<��;/6��'�� "�6>9<��;/��'��

�"�6>9<��;-��'�� "�6>9<��89��'�� 2�El vector BG1805 (Figura

3) es un vector de 2M para levaduras. Los marcos abiertos de lectura de las

proteínas Nth1, Pyk1,Pyk2, Myo2 y Hsp60 se encuentran clonados río abajo

del promotor GAL1 inducible por galactosa. En el extremo C4terminal se

encuentra una etiqueta de fusión compuesta por: 6XHis, el epítope HA, el sitio

para la proteasa 3C y el dominio ZZ de la Proteína A derivado de

��

�

�

�

�

�


�

�

�

�

�

Figura 3. Mapa del vector BG1805 (OpenBiosystems).

:� ��;/6962� Este plásmido contiene el gen de la enzima piruvato quinasa 1

(PYK1) bajo el control de su propio promotor. Fue cedido por el Dr Thomas

Nowak del Department of Chemistry and Biochemistry, University of Notre

Dame.

3. Medios de cultivo

(�%��-� �� 4��

�

El medio de levaduras fue preparado como se describe en la bibliografía [121].

Las cepas fueron crecidas en medio rico conteniendo 2% bactopeptona, 1%

extracto de levaduras y 2% galactosa (YPGal), o 2% glucosa (YPD), o 2%

rafinosa (YPR). El medio sintético (SD) contiene 0.67% de base nitrogenada

para levaduras sin aminoácidos, 2% glucosa más los aminoácidos necesarios

para completar los requerimientos auxotróficos y mantener la selección de los

plásmidos. El medio sólido contiene 2% de agar.

�

�


�

�

(�'��-� �� 4��

Los cultivos de bacterias fueron crecidos en medio Luria4Bertani (LB)

conteniendo 1% peptona, 0.5% extracto de levaduras y 0.5% NaCl.

4. Transformación de levaduras

Las células fueron transformadas por el método de acetato de litio [122].

5. Preparación de extractos crudos

Las células de levaduras fueron crecidas hasta una concentración 0.541.0x107

células/ml (fase exponencial de crecimiento) en medio apropiado. Las células

fueron lisadas por ruptura con perlas de vidrio a 4º C en buffer apropiado para

cada ensayo. El debris celular fue decantado por centrifugación por 5 min,

15000 x�� a 4º C; y el sobrenadante fue usado inmediatamente para los

ensayos en extractos crudos o para la subsecuente purificación parcial.

6. Expresión y purificación de proteínas

>�%��34� .��4�� 2 �� .��4��&��<%�* 9��<'�* ��%�

* �

�

Para la expresión de las proteínas de fusión Pyk14His, Pyk24His y Nth14His, 25

ml de medio SD4URA, 2% rafinosa fue crecido toda la noche a 30ºC y luego fue

diluido en 200 ml de medio fresco. El cultivo fue crecido hasta una DO600nm=1.2

y luego se agregó 100ml de 3x YP, 6% galactosa a una concentración final de

1x YP, 2% galactosa. El cultivo se creció toda la noche a 30ºC y las células

fueron cosechadas por centrifugación. Los pellets fueron conservados a 470ºC

hasta el momento de ser utilizados. Para la purificación, las células fueron


resuspendidas en buffer conteniendo 50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, 0.05%

Tween 20, pH 8 y los extractos crudos fueron preparados. Se agregó al

extracto clarificado 50 Ml de resina Ni4NTA (Qiagen) y se incubó la mezcla toda

la noche a 4ºC con agitación. Luego, se lavó la resina con 50 mM NaH2PO4,

300 mM NaCl, 20 mM Imidazole, 0.05% Tween 20, pH 8. Las proteínas fueron

eluídas con buffer de elución conteniendo 50mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250

mM Imidazole, 0.05% Tween 20, pH 8.

>�'��34� .��4�� 2 �� .��4��&��<%�

�

La proteína Pyk1 fue purificada de la cepa JT20454 que contiene el vector

pPYK101 (plásmido que contiene el cDNA de Pyk1 bajo su propio promotor).

La purificación fue realizada utilizando un método previamente descripto en la

literatura [123]. Esta cepa de levaduras sobreexpresa Pyk1 en presencia de 2%

glucosa en el medio de cultivo. La semipurificación incluyó un primer paso de

cromatografía de intercambio aniónico utilizando DEAE4celulosa, luego

cromatografía de intercambio catiónico empleando resina de fosfocelulosa. La

enzima semi4purificada se precipitó con sulfato de amonio 70% y los pellets

fueron conservados a 420ºC. Antes de ser utilizados, los pellets fueron

desalados por cromatografía en gel Sephadex G425.

>�(�� 2 �� .�� 4��&�� 5��%� ��?� �� .��

��

�

Para la purificación de Bcy1 y sus mutantes de deleción se partió de células

que sobreexpresan estas proteínas bajo un promotor inducible. Bcy1 y

_N85Bcy1 fueron sobreexpresadas en levaduras y su inducción se realizó en

un medio conteniendo galactosa 2%, mientras que �N138Bcy1 y �N168Bcy1

fueron sobreexpresadas en bacterias y la inducción se realizó por agregado de

IPTG 1mM. Se lisaron las células en buffer de lisis (MES 20 mM pH 6.5, NaCl

100 mM, DTT 2 mM). Los extractos proteicos se precipitaron con 60% de

(NH4)2SO4. Los precipitados se resuspendieron en buffer de lisis y se incubaron

con la resina cAMP4agarosa a 4ºC por 2 h. El lavado se realizó con buffer de

lavado (buffer de lisis + NaCl 0,6 M). Se eluyó con buffer de elución (buffer de


lisis + cAMP 40mM pH 5,5). La purificación fue monitoreada por SDS4PAGE

teñido con #�� . La preparación fue cuantificada por Bradford. En la

Figura 4 se muestra un gel representativo de una purificación.

Figura 4. Purificaciones de las proteínas Bcy1 salvaje y

mutantes de deleción por cAMP agarosa. Eluídos de las

distintas purificaciones fueron sembrados en un �)��'�4 12%.

El gel fue teñido con #�� .

7. Ensayos de actividad PKA

@�%��4�� .��+ ��

�

@�%�%�� 2 �� .��+ ��0��

�

La holoenzima PKA de levaduras (TPKs4BCY1) fue purificada a partir de la

cepa de levaduras que contiene el ORF de Bcy1 (YJL033W) fusionado al

epítope TAP (OpenBiosystems). Se utilizó el protocolo estándar de purificación

TAP [124] pero empleando solamente un paso de purificación por afinidad a la

resina de IgG Sepharosa 4B (ver Apéndice A.3). La holoenzima inmovilizada

fue utilizada como fuente de PKA para los ensayos de activación. Previo a

realizar los ensayos, las preparaciones de holoenzima fueron probadas para su


actividad quinasa utilizando distintas cantidades de fuente enzimática,

kemptido 300 MM como sustrato, en ausencia y presencia de cAMP.

@�%�'�� 2 �� .�� &� ��

�

Las enzimas TPK1 y TPK2 de levaduras fueron purificadas a partir de las

cepas TAP las cuales expresan una única isoforma de Tpk y el ORF de Bcy1

fusionado al epítope TAP. Las enzimas fueron purificadas utilizando la

metodología estándar TAP, pero realizando un único paso de purificación por

afinidad con la resina IgG Sepharose 4B. Luego de lavados exhaustivos, Tpk1

o Tpk2 fueron eluídas con 50 mM de cAMP. Esta fuente de enzima purificada

fue utilizada inmediatamente para los ensayos de fosforilación. Para los

experimentos en los cuales se utilizó la mezcla de las tres Tpks, la purificación

de las enzimas fue realizada utilizando el mismo protocolo pero la cepa

utilizada en ese caso fue la cepa BCY14TAP salvaje que expresa las tres

isoformas de las subunidades catalíticas. Previo a realizar los ensayos, las

preparaciones de enzima fueron probadas para su actividad quinasa utilizando

distintas cantidades de fuente enzimática y kemptido 300 MM como sustrato.

@�'��A�� + �A� ��4��4�� 2 �� 4<%��

�4<'�

�

Las unidades enzimáticas para Tpk1 y Tpk2 fueron definidas como los pmoles

de enzima que transfieren 1 pmol de fosfato al sustrato kemptido/min, a 30ºC,

bajo las condiciones estándar del ensayo. La cantidad de cada enzima fue

estimada por comparación con curva de BSA en �)��'�4 y tinción por plata.

Luego de la purificación se verificó la identidad de cada enzima por

espectrometría de masa. Para ello, las bandas de proteínas del gel fueron

cortadas y sometidas a digestión tríptica. Cada digestión fue analizada

utilizando un espectrómetro MALDI4TOF4TOF, Ultraflex II (Bruker)

(CEQUIBIEM, FCEN). En la Figura 5 se muestra un gel representativo teñido

con plata.

El �� de Tpk1 y Tpk2 fue calculado utilizando la

concentración de proteína estimada por SDS4PAGE y la actividad catalítica a


concentración saturante de kemptido (sustrato) de la misma muestra de

purificación.

Figura 5. Purificaciones TAP de las

subunidades catalíticas Tpk1 y Tpk2.

Una alícuota de la preparación

enzimática de Tpk1 o Tpk2 fue

sembrada en un �)��'�4 10% y

teñida con plata para la identificación

de las bandas por espectrometría de

masa.

@�(�� 0��

�

La actividad PKA se determinó ensayando su actividad fosfotransferasa

utilizando como sustratos kemptido o los péptidos S22, Nth141, Nth142, Pyk1,

Pyk2, Ira24S1018 o Ira24S1725. El ensayo se inició mezclando diferentes

cantidades de subunidad catalítica (Tpk1 o Tpk2 solubles; o mezclas de Tpks)

con los sustratos correspondientes (proteína o péptidos), a las concentraciones

indicadas en cada experiment,o en buffer Tris4HCl 15 mM pH 7.5, EGTA 0.1


mM, EDTA 0.1 mM, 24mercaptoetanol 10 mM, MgCl2 15 mM, [γ432P]ATP (1000

dpm/pmol). Un ensayo estándar, por definición de unidad, contiene una

concentración saturante de kemptido de 300 MM. La mezcla de reacción fue

incubada durante 10 min a 30ºC. En las reacciones en las cuales se utilizaron

péptidos como sustrato, una alícuota de la reacción fue procesada de acuerdo

al método de fosfocelulosa (P81; Whatman) [125]. Cuando las proteínas

purificadas fueron utilizadas como sustrato, alícuotas de la mezcla de reacción

fueron analizadas a través de �)��'�4. La incorporación de fosfato al

sustrato fue determinada por análisis digital de imagen y posterior

cuantificación por densitometría, la cual se expresó como unidades arbitrarias.

Alternativamente, la cantidad de fosfato incorporado al sustrato se determinó

por contador de centelleo a partir de las bandas de proteínas fosforiladas

extraídas del gel �)��'�4. Los ensayos de actividad PKA mantuvieron una

relación lineal con el tiempo y con la concentración de enzima. La actividad

PKA se expresó como pmol de fosfato incorporado al sustrato/min a 30ºC.

@�,�� .��0��

�

Para los ensayos de activación de PKA, holoenzima purificada e inmovilizada

fue utilizada para determinar la actividad quinasa a distintas concentraciones

de cAMP. El ensayo se realizó como se indica en el ítem 7.3. Se calculó el

valor de A0.5 para el cAMP utilizando diferentes sustratos. Dos pruebas de

análisis estadístico se aplicaron para validar las curvas obtenidas. El �� de

normalidad de D´Agostino y Pearson, el cual indicó que las curvas no muestran

una desviación significativa del modelo. También se aplicó el programa ALLFIT,

el cual es utilizado para el análisis estadístico de familias de curvas de dosis4

respuesta sigmoideas y utiliza las ecuaciones logísticas de cuatro parámetros.

Todas las curvas presentaron una buena significancia estadística con un

p>0.05, indicando la calidad del ajuste de las mismas. La prueba F fue no

significativa entre los dos grupos de proteínas (Nth1 y Ser22 por un lado y

Pyk1, Pyk2 y kemptido por el otro) indicando con los datos comparten los dos

parámetros: IC50 y pendiente. Sin embargo, la diferencia fue significativa

cuando el análisis se realizó intergrupos.


8. �� de péptidos

B�%�� 4C4� ��4�� )��2&��

�

Los �� de péptidos unidos a celulosa fueron preparados de manera

automática de acuerdo a los protocolos estándar de síntesis SPOT utilizando

un sintetizador SPOT (Abimed Analysentechnik Lagenfeld, Alemania) del

laboratorio de la Dra Susan Taylor del Departamento de Química y Bioquímica

de la Universidad de California en San Diego. Las membranas fueron

embebidas en etanol y luego se incubaron con buffer de fosforilación (Tris4Hcl

50 mM pH 7.4, 24mercaptoetanol 10 mM, EDTA 0.1 mM, EGTA 0.1 mM, NaCl

100 mM, MgCl2 15 mM) conteniendo BSA 0.2 mg/ml durante toda la noche a

temperatura ambiente. Posteriormente las membranas fueron incubadas a

30ºC durante 45 min con buffer de fosforilación conteniendo BSA 1 mg/ml,

NaCl 100 mM y ATP 100 MM. La reacción de fosforilación fue realizada en

buffer de fosforilación conteniendo BSA 0.2 mg/ml, ATP 100 MM, [γ432P]ATP

200 MCi y 150 pmol de subunidad Tpks durante 1 hora a 30ºC. Las membranas

fueron lavadas 10x15 min con NaCl 1M, 3x5 min con H2O, 3x15 min con H3PO4

5%, 3x5 min con H2O y 3x2 min con etanol. Las membranas fueron secadas y

sometidas a análisis de imagen digital (Bio4Imaging Analyzer as41800II e Image

Gauge 3.12, FUJIFILM).

B�'�� 4C4� ��4��

�

Las membranas fueron embebidas en etanol y sonicadas por 20 minutos.

Luego fueron lavadas con buffer TBS pH 7.5, 3 veces durante 10 min. Las

membranas fueron bloqueadas durante toda la noche a 4ºC con solución de

bloqueo (BSA 5%, Tween 20 0.1% en buffer TBS, pH 7.5). Luego se agregó

Bcy1, �N85Bcy1, �N138Bcy1 o �N168Bcy1 purificadas en una concentración

final de 20 Mg/ml en solución de bloqueo. Se incubó 2 horas a temperatura

ambiente y posteriormente se realizaron 3 lavados con buffer TBS4T (TBS pH

7.5, Tween 20 0.1%).


El revelado del �� se realizó con anticuerpo anti4subunidad regulatoria de

��& �que cruza y reconoce específicamente a la subunidad regulatoria

de levaduras (Ver Capítulo II). El primer anticuerpo se incubó en una dilución

de 1:5000 durante 1.5 h a temperatura ambiente. Luego de los lavados con

buffer TBS4T, las membranas fueron incubadas con anticuerpo anti4conejo

1:5000 acoplado a peroxidasa por 1 h a temperatura ambiente. Después de la

incubación, las membranas fueron lavadas tres veces con buffer TBS4T y tres

veces con buffer TBS. Las membranas fueron incubadas con el reactivo

quimioluminiscente Luminol y las bandas inmunoreactivas fueron visualizadas y

analizadas por imagen digital (Bio4Imaging Analyzer Bas41800II and Image

Gauge 3.12, FUJIFILM).

Para el ensayo de competencia con el péptido Ht31, se agregó péptido Ht31 o

péptido ��en una concentración final de 100 MM en el mismo momento

en el cual se realizó la incubación con Bcy1 purificada.

9. Purificación e identificación de proteínas por espectrometría de masa

D�%�� 2 ��

�

D�%�%�� 2 ��

�

100 ml de medio mínimo sin histidina fueron inoculados con las cepas BCY14

TAP o TPK14TAP e incubados a 30ºC toda la noche. Se realizó una dilución de

estos precultivos en 1 litro de medio YPD fresco y se incubaron toda la noche a

30ºC. El protocolo estándar de purificación TAP [124] fue empleado para

obtener los complejos proteicos. En el caso de la purificación de la cepa TPK14

TAP se realizaron lavados con NaCl 150 mM y cAMP 50 mM, y esta fracción

fue utilizada para la posterior identificación de proteínas por espectrometría de

masa. En la Figura 6 se esquematiza el protocolo de purificación utilizado para

cada una de las cepas.


Figura 6. Purificación TAP. Esquematización de los pasos utilizados para la

purificación de BCY14TAP y TPK14TAP y sus proteínas interactoras para posterior

identificación por espectrometría de masa.

D�%�'�� 2 �� -��)��

�

�� &�� ?�� "#;6: 50 ml de medio mínimo sin leucina fueron

inoculados con la cepa 11154BCY1 e incubados toda la noche a 30ºC. Se

realizó una dilución del cultivo en 500 ml de medio YPGal fresco y se incubó

ON a 30ºC para permitir la sobreexpresión de BCY1.

��#@�� : 50 ml de medio YPD o YPGli fueron

inoculados con la cepa 1115 e incubados toda la noche a 30ºC. Se realizó una

dilución del cultivo en 500 ml de medio fresco (YPD o YPGli) y se incubó ON a

30ºC.

Extracto de la cepaTPK1%TAP Extracto de la cepa BCY1%TAP

Contaminantes

IgG beads

Epítope TAPProteínas asociadas

Clivaje por TEV proteasa

Calmodulina beads (Ca )2+

Elución en condiciones nativas (EGTA)

BCY

BCY

BCY

BCY

TPK

TPK

TPK

TPK

IgG beads

Lavados con NaCl y 0.5 M cAMP

BCY

BCY

BCY

BCY

TPK1

TPK 2/3

TPK1

TPK1

Calmodulina beads (Ca )2+


��#@��$�� 2�50 ml de medio YPD fueron inoculados con la

cepa 1115 e incubados toda la noche a 30ºC. Se realizó una dilución del cultivo

en 500 ml de medio fresco y se incubó 7 días a 30ºC.

En todos los casos las células fueron cosechadas por centrifugación y el pellet

fue resuspendido en buffer de lisis (NaH2PO44H2O 10 mM, Na2HPO4 15 mM,

NP440 0.1%, NaCl 0.5 mM, EDTA 2 mM, pH 7.2) e inhibidores de proteasas y

los extractos crudos fueron preparados. La mitad del clarificado fue sembrado

en 50 Ml de resina cAMP agarosa, mientras que la otra mitad fue sembrada en

50 Ml de resina en presencia de 50 mM de cAMP (control de inespecífico). Se

incubó toda la noche a 4 ºC con agitación suave. Las resinas incubadas con los

extractos fueron centrifugadas a 100 x g 10 min. Se realizaron 10 lavados de 1

ml cada uno con buffer de lisis sin NaCl. Se agregó a la resina lavada 50 Ml de

buffer de siembra 4X. En la Figura 7 se esquematizan los pasos de la

purificación.

Extracto cepa 1115 BCY1

BCY

TPK

CAMP%agarosa+CAMP %CAMP

ContaminantesBCY

Figura 7. Purificación por cAMP agarosa. Esquematización de

los pasos utilizados para la purificación de Bcy1 y sus proteínas

interactoras.


D�'�� 2 �� .��4��&��4��4��&��

�

Las purificaciones BCY14TAP, TPK14TAP y BCY1 fueron sembradas en un

�)�� '�4 10%. El gel fue teñido #�� coloidal, desteñido, y las

bandas fueron cortadas del gel. En el caso de la purificación por cAMP agarosa

las bandas seleccionadas fueron aquellas que disminuían o no se encontraban

en el control con cAMP 50 mM. Las bandas seleccionadas fueron cortadas del

gel y sometidas a digestión tríptica. Cada digestión fue analizada utilizando un

espectrómetro MALDI4TOF4TOF, Ultraflex II (Bruker) (CEQUIBIEM, FCEN,

UBA). En el Capítulo II y en el Apéndice A.3 se encuentran las imágenes

correspondientes a los �)��'�4 teñidos con #�� coloidal y la

lista de proteínas identificadas por los distintos métodos de purificación,

respectivamente.

��

�

10. Ultracentrifugación en gradiente de sacarosa

Los gradientes de sacarosa se utilizaron con fines analíticos para estimar el

coeficiente de sedimentación la subunidad R salvaje y de la mutante

�N85BCY1. En todos los casos el gradiente fue lineal de sacarosa 5420% (p/v)

en buffer de lisis, con un volumen final de 4,2 ml. El volumen de la muestra que

se cargó sobre el gradiente fue de 504150 al y la masa de proteína total fue de

entre 50 y 100 ag. Con el fin de calibrar el gradiente para estimar los

coeficientes de sedimentación, se incluyó la proteína estándar (3,5S)

peroxidasa (SIGMA). La centrifugación se realizó en una ultracentrífuga

Beckmann SW50 a 35.000 r.p.m. por 15 horas a 4ºC en rotor SW55Ti. Se

colectaron 30 fracciones de 200 al cada una desde el fondo del tubo.

4��& ��

Se agregaron al gradiente 10 ag de peroxidasa (SIGMA). Se mezclaron 500 al

de solución A (0,5% (v/v) H2O2 en10 mM Tris4HCl pH 7.0), 10 al de solución B

(punta de espátula de ortodianisidina en 1 ml de metanol) y 10 al de cada

fracción del gradiente. En pocos minutos se desarrolla un color naranja en

aquellas fracciones en las cuales está presente la enzima. La fracción con


mayor actividad peroxidasa corresponde a aquella donde se observe coloración

más intensa.

4�� #�

Esta proteína es de color rojo. Se agregan al gradiente 25 ag de citocromo C.

Se determina la fracción con mayor cantidad citocromo C, sembrando unos 20

al en una membrana de nitrocelulosa y observando a ojo la intensidad del color

de la muestra en la membrana.

11. Pull down ��

500 ml de medio rico (YPD o YPGal) fueron inoculados con las cepas IRA24

TAP, PTP14TAP, MYO24HA o HSP604HA. Los cultivos fueron crecidos a 30 ºC

toda la noche, excepto para el caso de la cepa IRA24TAP, el cual fue crecida

hasta una DO600nm de 0.8. Los extractos crudos de las diferentes cepas fueron

realizados como se describe en 5; las células fueron lisadas en buffer

conteniendo Tris4HCl 50mM pH 7, EDTA 5mM, EGTA 3mM, 24mercapto4etanol

10mM, β4glicerolfosfato 5mM, NaCl 100 mM, NP440 0.1%, excepto para IRA24

TAP en donde se utilizó el mismo buffer pero conteniendo CHAPS 0.3% en

reemplazo de NP440 y SDS.

250 ml de medio YPGal fueron inoculados con la cepa 11154BCY1, el cultivo se

creció toda la noche a 30ºC. Las células fueron cosechadas y el pellet fue

resuspendido en buffer de lisis (MES 20 mM pH 6.5, NaCl 100 mM, DTT 2 mM,

coctel de inhibidores de proteasas) y se preparó el extracto crudo como se

detalló anteriormente. El clarificado fue sembrado en 50 Ml de resina cAMP4

agarosa y fue incubado 2 h a 4ºC. La resina se lavó con buffer de lavado A

(buffer de lisis + 700 mM NaCl). Se agregó extracto crudo de las cepas IRA24

TAP, PTP14TAP, MYO24HA o HSP604HA. Se incubó 2 h a 4ºC y se realizaron

lavados con buffer de lavado B (Tris4HCl 50mM pH 7, EDTA 5mM, EGTA 3mM,

24mercapto4etanol 10mM, β4glicerolfosfato 5mM, NaCl 150 mM, NP440 0.2%,

SDS 0.3%). Se agregó a la resina 50 Ml de buffer de siembra 4x y se hirvieron

las muestras. El control se realizó sembrando la misma masa de extracto

proteico en 50 Ml de cAMP4agarosa en presencia de cAMP 40 mM y se


realizaron los mismos procedimientos descriptos para el ensayo de ��

Las muestras fueron sembradas en �)��'�4 10% (para visualizar Bcy1,

Ptp14TAP, y Hsp604HA) y en �)��'�4 6% (para visualizar Ira24TAP y Myo24

HA). Los geles se transfirieron a membrana de nitrocelulosa y las proteínas

fueron visualizadas por ��

12. Inmunoprecipitación ��

�

100 ml de medio YPD fueron inoculados con la cepa IRA24HA y el cultivo fue

crecido a 30ºC hasta alcanzar una DO600nm de 0.8. El extracto crudo fue

preparado como se detalla en el punto 5 utilizando buffer de lisis conteniendo

NaH2PO44H2O 10 mM, Na2HPO4 15 mM, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, CHAPS

0.3% e inhibidores de proteasas. Al extracto clarificado se le agregó anticuerpo

anti4HA y se incubó 1 h a 4ºC. Luego, 15 Ml de proteína A/G agarosa se agregó

a la mezcla y se incubó 4 h a 4ºC. La resina fue lavada con buffer IPP150 (Tris4

HCl 25 mM pH 8, NaCl 150 mM, NP440 0.1%) y con buffer TBS. Como control

se incubó el extracto clarificado con anticuerpo inespecífico. Se agregó a la

resina 50 Ml de buffer de siembra 4x y las muestras fueron sembradas en �)��

�'�4� 10% (para visualizar Bcy1) y en �)��'�4 6% (para visualizar Ira24

HA). Los geles se transfirieron a membrana de nitrocelulosa y las proteínas

fueron visualizadas por ��.

13. Fraccionamiento subcelular

500 ml de medio YPD fueron inoculados con la cepa IRA24HA y el cultivo fue

crecido a 30ºC hasta alcanzar una DO600nm de 0.8. Las células fueron

cosechadas por centrifugación y el pellet fue resuspendido en buffer de lisis

conteniendo Tris4HCl 50 mM pH 7.5, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, CHAPS 0.3%

e inhibidores de proteasas. Las células fueron lisadas por ruptura mecánica

utilizando perlas de vidrio y vortex. El lisado fue centrifugado a 300xg 10 min a

4ºC generándose las fracciones de pellet (P300) y sobrenadante (S300). El

S300 fue centrifugado a 100,000xg 60 min a 4ºC, obteniéndose el pellet


(P100,000) y el sobrenadante (S100,000) correspondiente. El S100,000 fue

concentrado por precipitación con ácido tricloroacético 25%; este precipitado, el

P300, y el P100,00 fueron resuspendidos en 150 Ml urea 8M y SDS 5% y

fueron calentados a 65ºC por 10 min. En el P300 se espera que esté

enriquecido en proteínas integrales de membrana, el P100,000 en proteínas

asociadas a membranas, y el S100,000 en proteínas citosólicas.

14. Preparación de fracción mitocondrial cruda

500 ml de medio YPGal fueron inoculados con un precultivo de la cepa HSP604

HA4His y se incubó el cultivo a 30ºC hasta alcanzar una DO600nm 0.7. Los

cultivos fueron sometidos o no a estrés térmico incubándolos a 37ºC o 30ºC por

2 horas respectivamente. EL cultivo se centrifugó a 3000 xg 5 min para

cosechar las células y el pellet celular se lavó con H2O destilada. Las células se

resuspendieron en 2ml/g en buffer DTT (Tris4HCl 100 mM pH 9.4, DTT 10 mM)

y se incubaron a 30ºC 20 min con agitación suave. Se realizó un lavado con

buffer zymolyasa (sorbitol 1.2 M, fosfato de potasio 20 mM pH 7.4). Se

incubaron las células a 30ºC durante 45 min con 5 mg/g de zymolyasa 20T en

7 ml/g de buffer zymolyasa. Posteriormente se realizó un lavado con buffer de

homogenización (sorbitol 0.6 M, Tris4HCl 10 mM pH7.4, EDTA 1 mM, PMSF

1mM, BSA 0.2%) y luego se homogeneizó por 15 golpes en pistón en 6,5 ml/g

de buffer de homogeneización. El homogenato se diluyó con 1 volumen de

buffer de homogeneización y se centrifugó a 1500 xg 5 min a 4ºC obteniéndose

el S y P 1500. El S1500 se centrifugó a 3000 xg 5min a 4ºC y se obtuvieron el

S y P3000. El S3000 se centrifugó a 12000 xg 15 min a 4ºC. El pellet obtenido

que contiene la fracción mitocondrial cruda (Mit (pellet)) se lavó con buffer SEM

(sacarosa 250 mM, EDTA 1mM, Mops 10 mM pH 7.2) y se resuspendió en el

mismo buffer. Las fracciones correspondientes al homogenato, S1500, S3000 y

Mit(sbn) se precipitaron con ácido tricloroacético 25%; estos pellet y los P1500,

y P3000 fueron resuspendidos en urea 8M y SDS 5% y fueron calentados a

65ºC 10 min.


15. Ensayo de estrés térmico

250 ml de medio mínimo sin leucina fueron inoculados con la cepa HSP60 wt o

HSP60 ts e incubados a 24ºC con agitación toda la noche. A la mañana

siguiente el cultivo fue transferido a un baño a 37ºC para provocar el shock

térmico y se recolectaron alícuotas de 50 ml a los siguientes tiempos: 0, 15, 30

y 60 minutos. Las células se cosecharon por centrifugación y se realizaron los

extractos crudos como se describió anteriormente.

Para la determinación de la activad quinasa, se tomaron 2,5, 5 y 10 Mg de

extracto crudo y se utilizó kemptido como sustrato (300 MM). Los ensayos se

realizaron en ausencia o presencia de cAMP y se procedió como se indica en

el punto 7.3.

16�� Determinación de concentración de proteínas

La concentración de proteínas fue determinada utilizando el método de

Bradford con BSA como proteína estándar.

17� SDS%PAGE

Muestras de preparaciones proteicas fueron separadas por �)��'�4 10%T o

6%T [126].

18��E��

Muestras de preparaciones proteicas (indicado en cada figura) fueron

separadas por �)��'�4, transferidas a membranas de nitrocelulosa usando

Tris 25 mM, Glicina 192 mM, metanol 20% (v/v), durante 90 min a 90 volts. Las

membranas fueron bloqueadas con 5% de leche descremada, 0.05% de Tween

20 en buffer TBS, incubada con los siguientes anticuerpos: anti4BCY1 (Santa

Cruz Biotechnology) 1/200; anti4TPK1 (Santa Cruz Biotechnology) 1/200; anti4


Pyk1 (Santa Cruz Biotechnology) 1/500; anti Pma1/2 (Santa Cruz

Biotechnology) 1/1000; anti4HA (Santa Cruz Biotechnology) 1/1000; anti4TAP

(Open Biosystems) 1/1000. Las membranas fueron lavadas e incubadas con un

anticuerpo anti4cabra, anti4conejo o anti ratón conjugado con peroxidasa (Santa

Cruz Biotechnology) por 1 h a temperatura ambiente. Después de la

incubación, las membranas fueron lavadas dos veces con solución de bloqueo

y dos veces con 0.05% de Tween 20 en TBS. Las membranas fueron

incubadas con el reactivo quimioluminiscente Luminol y las bandas

inmunoreactivas fueron visualizadas y analizadas por imagen digital (Bio4

Imaging Analyzer Bas41800II and Image Gauge 3.12 FUJIFLM).

19. Tinción con �� 5��coloidal

Luego de realizar el �)��'�4, se procedió a la tinción del gel con azul de

#�� coloidal. En primer lugar, se realizan tres incubaciones de 30

minutos con Solución I (Etanol 30%, ácido fosfórico 2%) en agitación

moderada. Posteriormente, se realizan 3 lavados de 20 minutos con Solución II

(ácido fosfórico 2%), y luego se incuba por 30 minutos en Solución III (Etanol

18%, ácido fosfórico 2%, Sulfato de amonio 15 %). Finalmente, se agregan a

25 ml de la solución III, 1 ml de Coomassie G250 2%. Se deja 24 horas en

agitación moderada. Por último, se realizan una serie de lavados con agua

milliQ, con el objeto de eliminar el fondo�de colorante en el gel.

�

�

CCAAPPÍÍTTUULLOO II SSuussttrraattooss ddee llaa PPrrootteeíínnaa qquuiinnaassaa AA ddee �� yy ssuu ppaarrttiicciippaacciióónn eenn llaa aaccttiivvaacciióónn ddee llaa hhoollooeennzziimmaa �

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�

�

Capítulo I 80

I.1% INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Las proteínas quinasas son responsables de la regulación de una amplia

variedad de procesos fisiológicos a través de la fosforilación de sus proteínas

blanco. La fosforilación de las proteínas sustrato por PKA es crítica para la

regulación de diversos procesos celulares como ser metabolismo, expresión

génica, flujo iónico y muerte celular [1]. Para asegurar la fidelidad de la

respuesta, la PKA debe ser específica y actuar solamente sobre un grupo

definido de blancos celulares.

La especificidad de la fosforilación se encuentra determinada por al menos dos

factores importantes: la especificidad del péptido, y la localización del sustrato y

la quinasa. La efectividad de la fosforilación por las proteínas quinasas en

general, incluyendo a la PKA, dependería de la estructura primaria del sustrato

alrededor del sitio consenso de fosforilación. Para definir las secuencias

consenso de fosforilación de la PKA de mamíferos se han utilizado péptidos

sintéticos que permitieron definir como sitios de fosforilación canónicos para

esta enzima a las secuencias Arg4Arg4X4Ser/Thr, Arg/Lys4X4X4Ser/Thr, y

Arg/Lys4X4Ser/Thr [13,14,114,127,128]. Sin embrago, análisis estadísticos

realizados en base a proteínas fosforiladas por PKA, han demostrado que

muchos de los sitios de fosforilación presentes en las proteínas sustrato no

corresponden exactamente a la secuencia consenso definida [80]. Estudios

enfocados en caracterizar cuáles son los determinantes involucrados en el

reconocimiento del sitio de fosforilación, han permitido definir características del

sitio blanco de fosforilación. La secuencia Arg4Arg4X4Ser (RRXS) resultó la

secuencia consenso más representada, correspondiendo aproximadamente a

la mitad de todos los sitios descriptos. Se define dentro de la secuencia

consenso como posición P0 a la serina fosforilable. Aunque las argininas

parecen ser los residuos básicos preferidos en las posiciones P42 y P43, uno de

cada seis sitios contiene al menos una lisina en alguna de estas posiciones. La

serina en P0 es mejor aceptor de fosfato que la treonina [129]. Se demostró

también que existe una leve preferencia por el residuo arginina en las

posiciones P44 a P47, y una alta frecuencia de ocurrencia de residuos

hidrofóbicos como fenilalanina, isoleucina, leucina o valina en la posición P+1

[79]. Finalmente en posición P41 es más probable la presencia de residuos

Capítulo I 81

pequeños, como glicina o prolina. Mientras que los determinantes de

especificidad de sustratos para PKA en mamíferos han sido analizados en

profundidad, no ocurre lo mismo para las quinasas A de otros organismos. A

partir de la secuencia de fosforilación del activador transcripcional ADR1 de��

�� , se estableció la importancia de los residuos presentes en el extremo

amino terminal y C4terminal hasta la posición +4 del sitio fosfoaceptor. Los

residuos presentes en esas dos regiones son compartidos con los sustratos de

la PKA de mamíferos [64].

La PKA de � � �� está formada por una isoforma de la subunidad

regulatoria Bcy1 y tres isoformas de la subunidad catalítica, Tpk1, Tpk2 y Tpk3.

En este modelo se han descripto completamente unos pocos sustratos para

esta quinasa. Si bien mediante abordajes proteómicos el número de posibles

sustratos ha aumentado considerablemente, no se han confirmado las

proteínas candidatas como sustrato de PKA ni se han identificado sus

secuencias blanco de fosforilación [117,130,131].

Las tres subunidades catalíticas de levaduras tendrían funciones celulares

distintivas y también superpuestas entre ellas. Análisis proteómicos clasificaron

sustratos específicos de cada quinasa, siendo unos pocos de estos

reconocidos por las tres o por dos de las isoformas. Estos resultados sugieren

que cada isoforma de la quinasa tendría una especificidad única de sustrato

[131].

Resultados previos de nuestro laboratorio demuestran que la Piruvato quinasa

1 (Pyk1) es sustrato de la PKA de � �� . Se determinó que la proteína

entera, a pesar de presentar mayor afinidad, es menos eficiente como sustrato,

en comparación con un péptido derivado que contiene el residuo blanco

fosforilable Ser22 [118]. Estos resultados indican que la habilidad de la quinasa

para fosforilar una proteína en un sitio específico está influenciada por el

contexto estructural del sustrato.

Como hemos mencionado en la Introducción General, actualmente se postula

que el cAMP no logra la disociación completa de la holoenzima PKA y que los

sustratos intervienen en la activación de la enzima [45,1324134].

El entendimiento del rol biológico de la PKA de � �� requiere la

caracterización completa de la enzima y de sus blancos celulares para poder

Capítulo I 82

avanzar en la descripción y definición de la especificidad de la transducción de

la señal cAMP4PKA.

El objetivo específico de esta parte de la tesis fue evaluar las características de

las secuencias que rodean los sitios de fosforilación en los sustratos de PKA de

levaduras, analizar la selectividad y actividad catalítica de dos de las isoformas

de Tpk, y finalmente evaluar la participación de los sustratos en la activación de

la holoenzima de ��

Capítulo I 83

I.2% RESULTADOS Y DISCUSIÓN

I.2.1. Los péptidos derivados de las proteínas Nth1, Pyk1 y Pyk2 son

fosforilados por Tpk1 y Tpk2

En base a los resultados de un análisis global de fosforilación de proteínas de

levaduras �� que demostró que las tres isoformas de Tpk presentan

selectividad diferencial por los sustratos [117], se decidió evaluar cuáles son las

diferencias en las secuencias blanco de los sustratos que determinan la

especificidad de cada isoforma. Para esto ensayamos el comportamiento

cinético de péptidos derivados de tres proteínas: Pyk1 (piruvato quinasa 1),

Pyk2 (piruvato quinasa 2) y Nth1 (trehalasa neutra 1) identificadas como

sustratos fisiológicos de la PKA de levaduras [118,1354137]. Tanto Nth1 como

Pyk1 han sido descriptas como sustratos selectivos de Tpk1 en el análisis

global de fosforilación de proteínas de levaduras.

Como primer paso, corroboramos que estas tres proteínas son fosofriladas ��

� �� utilizando como fuente enzimática Tpks purificadas (las tres isoformas) y

como sustrato las proteínas recombinantes Nth14His, Pyk14His y Pyk24His.

Para poder utilizar como fuente enzimática las subunidades catalíticas de

levaduras purificadas, se puso a punto un método de purificación que es una

adaptación de la metodología de purificación TAP (��'$$ � �� $ �� ,

ver Apéndice A.3.), partiendo de una cepa que expresa la subunidad

regulatoria como proteína de fusión al epítope TAP (Bcy14TAP) (Ver Materiales

y Métodos).

Como se puede ver en la Figura I.1 las proteínas Pyk1, Pyk2 y Nth1 fueron

fosforiladas por preparación de Tpks. El aumento en el grado de fosforilación

fue correlativo con la cantidad de sustrato.

Capítulo I 84

Figura I.1. Fosforilación de las proteínas Pyk1, Pyk2 y Nth1 por la PKA de levaduras.

Diferentes cantidades de las proteínas recombinantes Pyk14His, Pyk24His y Nth14His fueron

incubadas con preparación de Tpks purificada en presencia de [γ32P] ATP. Las calles 4, 5 y 9

corresponden a las cantidades indicadas de proteína incubadas en ausencia de enzima. Las

muestras fosforiladas fueron analizadas por SDS4PAGE e imagen digital.

A continuación, se diseñaron péptidos para la caracterización de los

determinantes del sitio de fosforilación. Para realizar el diseño de los péptidos

derivados de las proteínas Pyk1, Pyk2 y Nth1, hemos seleccionado las

secuencias aminoacídicas comprendidas entre las posiciones P46 y P+4 que

rodean al sitio de fosforilación P0, ya que se ha descripto que estos residuos

influyen sobre la interacción directa con el sitio catalítico de la quinasa

[129,138].

Para el diseño de los péptidos se tuvo en cuenta que:

• Las proteínas Pyk1 y Pyk2 presentan un único motivo RRXS en su

secuencia primaria.

• Nuestro grupo de trabajo ha demostrado previamente que Pyk1 es

sustrato de Tpk1 y que el residuo Ser22 es el principal sitio de

fosforilación para PKA [118].

• La secuencia que rodea al residuo Ser22 en Pyk1 se encuentra

conservada en la isoforma de levaduras Pyk2 en el residuo Ser24,

aunque difiere en los residuos amino terminales del RRXS.

• La proteína Pyk2 es fosforilada �� por Tpk1 con una constante de

especificidad mayor que la que presenta Pyk1 [135].

• La secuencia aminoacídica de Nth1 muestra tres sitios de fosforilación

potenciales: Ser20, Ser21 y Ser83, los cuales se encuentran incluidos en

un motivo consenso de fosforilación para PKA [137].

Capítulo I 85

• Resultados genéticos han correlacionado la fosforilación de estas tres

serinas con la activación de la trehalasa por la PKA [137].

• Un análisis global del fosfoproteoma �� de levaduras detectó

péptidos conteniendo la serina fosforilable en estas tres posiciones para

Nth1 [131].

En la Tabla I.1 se encuentran las secuencias de los péptidos utilizados para los

ensayos cinéticos que se describen a continuación.

Tabla I.1. Péptidos derivados de las proteínas sustrato. Secuencia de los

péptidos derivados de cada proteína: Pyk1 y Ser22 de piruvato quinasa 1;

Pyk2 de piruvato quinasa 2; y Nth41/Nth142 de la trehalasa neutra. En negrita

se indica la secuencia consenso RRXS que incluye la serina fosforilable; los

superíndices indican la posición del correspondiente residuo en la secuencia

primaria completa de la proteína.

Las isoformas Tpk1 y Tpk2 o la mezcla de Tpks purificadas se obtuvieron a

partir de extractos proteicos de las cepas TPK14BCY1TAP, TPK24BCY1TAP o

BCY14TAP, respectivamente. Las cepas TPK14BCY1TAP y TPK24BCY1TAP

expresan solo la subunidad Tpk1 o Tpk2 respectivamente, ya que presentan

delecionados los genes que codifican para las otras dos isoformas. Las

unidades enzimáticas utilizadas en cada ensayo se calcularon según lo

descripto en Materiales y Métodos. La purificación de la isoforma Tpk3 a partir

de la cepa TPK34BCY1TAP (que solo expresa la isoforma Tpk3) no resultó

exitosa, a pesar de utilizar grandes volúmenes de cultivo para su purificación y

Péptido Secuencia

Pyk1 SDLRRTS24IIGTI

Ser22 LRRTS22IIGTI

Pyk2 QQLRRTS24IIGTI

Nth141 GRQRRLS20SLSEF

Nth142 QQTRRGS83EDDTY

Kemptido LRRASLG

Capítulo I 86

de medir actividad quinasa en la fracción teóricamente purificada con diferentes

sustratos y distintas concentraciones de sustrato y/o ATP. Consideramos que la

dificultad en la purificación de Tpk3 se debe a que es la isoforma que presenta

menores niveles de expresión (ver más adelante en este mismo ítem y

sección).

Para evaluar los parámetros cinéticos de cada isoforma se ensayó la enzima

purificada con diferentes concentraciones de péptidos sustrato en presencia de

[γ432P] ATP y se determinaron los valores de /��/�� y /��que se encuentran

resumidos en la Tabla I.2. En la Figuras I.2 se muestran los gráficos

representativos correspondientes a un ensayo en el cual se utilizó como fuente

enzimática Tpk1 o Tpk2 purificada.

Tabla I.2. Parámetros cinéticos. Preparaciones purificadas de Tpk1 y fueron

utilizados para determinar los valores de /��/�� y /� para los distintos péptidos

sustratos.

Péptido 0��

�(PM)

0��

(min%1)�

04��

(min%1.PM%1)

Tpk1 Tpk2 Tpk1 Tpk2 Tpk1 Tpk2

Nth141 95 ±±±± 5 111 ±±±± 8 479 ±±±± 10 439 ±±±± 12 5.0 3.9

Ser22 35 ±±±± 1 41 ±±±± 1 119 ±±±± 7 128 ±±±± 8 3.4 3

Kemptido 148 ±±±± 5 151 ±±±± 6 99 ±±±± 4 101 ±±±± 5 0.7 0.6

Pyk2 61 ±±±± 1 59 ±±±± 1 24 ±±±± 1 18 ±±±± 0.6 0.4 0.36

Pyk1 52 ±±±± 1 49 ±±±± 1 9 ±±±± 0.1 12 ±±±± 0.4 0.17 0.24

Nth142 >>>>300 >>>>300 nd nd % %

Capítulo I 87

Figura I.2. Cinética de fosofrilación �� de Tpk1 y Tpk2 purificadas. Ensayos cinéticos

representativos utilizando como fuente de enzima Tpk1 o Tpk2 purificadas y los distintos

péptidos sustrato.

Los valores de /� y /�� para Tpk1 y Tpk2 resultaron similares entre sí para

cada uno de los péptidos ensayados, indicando que no existen diferencias en

lo que respecta a la selectividad de sustrato de estas dos isoformas. El

�� (número de eventos catalíticos por unidad de tiempo

y por unidad de enzima) de Tpk1 y Tpk2 fue calculado utilizando la

concentración de proteína estimada por SDS4PAGE y la actividad catalítica a

concentración saturante de kemptido (sustrato) (ver detalles en Materiales y

Métodos). El valor obtenido fue de 3 seg41 para Tpk1 y Tpk2. Este valor es

aproximadamente 10 veces menor que el �� reportado

para la subunidad C de mamíferos, el cual se encuentra en el rango de 20

seg41 [139]. Resultados previos de nuestro laboratorio demostraron que tanto el

kemptido como péptidos derivados de la región IS de la subunidad regulatoria

de � �� y de��& �presentan valores de /� mayores para las

quinasas de hongos y levaduras que para la subunidad catalítica de

Capítulo I 88

mamíferos, indicando que el �� de las subunidades catalíticas de � �

��& �y � �� es menor que el de la C de mamíferos [140].

A pesar de que todos los sustratos incluían la secuencia consenso RRXS, la

/� para cada uno de ellos fue muy diferente. Las diferencias en la /�

resultan en diferencias tanto de /� como de /��. El péptido Nth142 no resultó

fosforilado a pesar de realizar los ensayos utilizando concentraciones de

sustrato mayores a 300 MM. El mejor sustrato fue el péptido Nth141, mientras

que el peor fue Pyk1. La diferencia entre ambos se debe principalmente a sus

valores de�/��. Mientras que las /�� entre ambos difieren entre 40 y 50 veces,

el valor de las /� difieren en 2 veces. La afinidad aparente de Pyk1 es mayor

que la de Nth141, pero su eficiencia de catálisis resultó mucho menor que la de

Nth141. Los péptidos Pyk1 y Pyk2 presentan un comportamiento diferente

como sustratos a pesar de que solo difieren en dos aminoácidos en las

posiciones P45 y P46. Si bien sus valores de /� no difieren demasiado, sí existe

una diferencia notable en los valores de /��, resultando la�/� para Pyk1 dos

veces menor que la de Pyk2. El péptido Ser22, el cual presenta dos

aminoácidos menos en el extremo amino terminal con respecto al péptido

Pyk1, resultó mejor sustrato que este último. En este caso, las diferencias están

dadas por los valores de las /� para cada péptido: el péptido Ser22 posee un

valor 10 veces mayor que Pyk1 para este parámetro. El kemptido, utilizado

como prototipo de péptido sustrato para PKA, presentó un rendimiento

intermedio, debido a su elevado valor de�/�

Estos resultados fueron inesperados, dado que ambas proteínas, Nth1 y Pyk1,

han sido descriptas como sustratos específicos de la isoforma Tpk1 [117].

Aunque la fosforilación de un péptido derivado de la secuencia de una proteína

no necesariamente implica que la proteína completa pueda ser fosforilada,

consideramos estos resultados como un primer indicio de que estas proteínas

podrían ser fosforiladas tanto por Tpk1 como por Tpk2.

Con el objetivo de analizar si las proteínas Nth1 y Pyk1 son también sustratos

de las isoformas Tpk1 y Tpk2 tal como sucede con los péptidos derivados de

ellas, se ensayó la fosforilación de ambas proteínas enteras con preparaciones

purificadas de cada isoforma. En la Figura I.3 puede observarse la fosforilación

de distintas concentraciones de Pyk1 y Nth1 cuando se utilizó iguales

cantidades de Tpk1 y Tpk2. Las pendientes de estas curvas, las cuales

Capítulo I 89

representan una aproximación de la /� para cada proteína, son muy similares

para ambos tipos de Tpk, indicando que ambas proteínas sustrato son

reconocidas de manera similar por cada una de las isoformas. Las pendientes

obtenidas para Nth1 resultaron mayores que las correspondientes a Pyk1,

indicando que la proteína Nth1 es mejor sustrato. Estos resultados concuerdan

con los obtenidos para los correspondientes péptidos derivados de las

proteínas.

Capítulo I 90

Figura I.3. Fosforilación de las proteínas Pyk1 y Nth1 con Tpk1 y Tpk2. Diferentes

cantidades de cada proteína fueron sometidas a fosforilación utilizando como fuente enzimática

Tpk1 o Tpk2 purificadas. Las muestras fosforiladas fueron analizadas por �)��'�4 y análisis

de imagen. La incorporación de fosfato en el sustrato fue determinada por análisis de imagen

digital y posterior cuantificación por densitometría expresada en unidades arbitrarias (UA). Los

gráficos mostrados corresponden al promedio de dos replicas y la imagen a un experimento

representativo.

Teniendo en cuenta nuestros resultados infructuosos para purificar Tpk3 y

considerando antecedentes reportados por Mazón�� [141] que demostraron

que una cepa que sólo contiene el gen TPK3 no presenta actividad de

fosforilación detectable, y que en esa misma cepa no se detecta mRNA para

esta isoforma, consideramos que los resultados indican que Tpk3 es la

isoforma que presenta los menores niveles de expresión. Para reforzar este

Capítulo I 91

concepto se analizó por espectrometría de masa una preparación de las

isoformas de Tpks obtenida de una cepa de levaduras salvaje utilizando el

mismo protocolo de purificación de los ensayos anteriores, y no se detectaron

péptidos derivados de Tpk3. Por lo tanto, predijimos y luego confirmamos que

una mezcla de Tpks exhibiría los mismos parámetros cinéticos que una mezcla

que contenga solamente las isoformas Tpk1 o Tpk2. Las curvas de cinética

típicas se muestran en la Figura I.4 y los datos se encuentran resumidos en la

Tabla I.3. Estos resultados pueden ser interpretados como un indicio de que los

niveles de Tpk3 son muy bajos y que por lo tanto no contribuyen

significativamente al total de la actividad PKA; o si contribuyen, presenta los

mismos parámetros cinéticos que las otras dos isoformas. Los resultados

obtenidos con la mezcla de Tpks valida la utilización de esta mezcla como

fuente enzimática para los experimentos posteriores.

Capítulo I 92

Figura I.4. Cinética de fosofrilación �� de Tpks purificadas. Ensayos cinéticos

representativos utilizando como fuente de enzima mezcla de Tpks purificadas y los distintos

péptidos sustrato.

Capítulo I 93

Péptido 0� (PM) 0�� (min%1)

Nth141 127 ±±±± 12 425 ±±±± 10

Ser22 57 ±±±± 4 150 ±±±± 8

Kemptido 138 ±±±± 9 88 ±±±± 5

Pyk2 64 ±±±± 6 27 ±±±± 2

Pyk1 58 ±±±± 4 15 ±±±± 0.5

Nth142 >>>>300 nd

Tabla I.3. Parámetros cinéticos.

Preparaciones purificadas de mezcla de

Tpks fueron utilizadas para determinar los

valores de /�� Y� /�� para los distintos

péptidos sustratos.

Se han propuesto y demostrado diferentes roles fisiológicos para las isoformas

Tpk1, Tpk2 y Tpk3 de la PKA de levaduras [57,142]. Las cepas que carecen de

las tres isoformas no son viables; sin embargo aquellas que contienen alguna

de las tres Tpks son capaces de propagarse, indicando que cada una es

genéticamente redundante para el crecimiento celular, aunque presenten

algunas funciones específicas [57]. En un análisis global �� de

fosforilación de proteínas de levaduras se observó una diferencia entre los

sustratos fosforilados por Tpk1, Tpk2 y Tpk3 [117]. En ese trabajo los autores

indican que Tpk1, Tpk2 y Tpk3 reconocieron 256, 29 y 70 sustratos,

respectivamente. Sin embargo, solo 8 sustratos fueron reconocidos por las tres

isoformas y 39 por dos de las tres. La mayoría de las proteínas ensayadas

(87.7%) son reconocidas por solo una de las isoformas, concluyendo que cada

quinasa tiene una especificidad de sustrato única dependiendo de la estructura

primaria de la proteína que rodea al sitio de fosforilación. Desde que han sido

publicados, estos resultados han sido considerados como la base para indicar

que existe selectividad diferencial hacia el sustrato entre las tres Tpks. Sin

embargo nuestros resultados contradicen esta conclusión, al menos en lo que

concierne a las proteínas Nth1 y Pyk1, las cuales fueron descriptas como

sustratos de Tpk1 en ese trabajo.

Capítulo I 94

En esta parte de la tesis se estudió el comportamiento cinético de Tpk1 y Tpk2

hacia los sustratos fisiológicos Pyk1, Pyk2 y Nth1, tanto a nivel peptídico como

proteico. Para nuestra sorpresa, las isoformas no mostraron ninguna diferencia

en los parámetros cinéticos medidos, usando péptidos o proteínas como

sustratos. La /� para cada sustrato fue la misma tanto para Tpk1 como para

Tpk2. Es importante destacar que el valor de /�� estimado tanto para Tpk1

como para Tpk2, utilizando kémptido como sustrato fue de 10 veces menor

que el valor para la C de mamíferos [139], indicando que la enzima de

levaduras tiene una velocidad de fosfotransferencia mucho más baja.

Todos los péptidos utilizados presentan la secuencia RRXS para fosforilación

por PKA, sin embargo sus /� fueron diferentes. La diferencia en estos

valores se debe principalmente a las diferencias en las /�� para cada péptido

sustrato, es decir que la velocidad de la transferencia del fosfato es distinta

para cada uno de ellos. Es interesante destacar que el péptido Nth142 no fue

fosforilado por la PKA. La naturaleza química de los residuos que rodean al

sitio de fosforilación debe ser importante para la estabilización del complejo

enzima4sustrato durante la fosfotransferencia. Por supuesto que no

descartamos que en el contexto natural de la secuencia aminoacídica haya

otros determinantes que participen en la reacción.

I.2.2. Residuos determinantes para el reconocimiento del sustrato por Tpk

Con el objetivo de evaluar cuáles son los determinantes involucrados en el

reconocimiento de un péptido por la PKA de levaduras utilizamos la

metodología de �� de péptidos y como fuente enzimática la purificación de

Tpks. El primer paso fue determinar la razón por la cual el péptido Nth142 no

resultó fosforilado por Tpk a pesar de que presenta el motivo consenso RRXS.

La primera observación es que la secuencia de este péptido carece de un

residuo hidrofóbico voluminoso en P+1 y presenta en esta posición un residuo

ácido (Asp), así como también en las posiciones P+2 y P+3 (Glu). En la

estructura cristalina de la subunidad C de mamíferos con el PKI (péptido

inhibidor) se visualiza que en la región hacia el C4terminal del sustrato el

residuo en posición +1 se dispone en la proximidad de un bolsillo hidrofóbico

Capítulo I 95

formado por las cadenas laterales de la Leu198, Pro202 y Leu205 (Figura 3

Introducción General). Como consecuencia, un residuo hidrofóbico grande en

P+1 favorece la interacción con el bolsillo hidrofóbico [13,143,144]. Los

residuos indicados que forman el bolsillo hidrofóbico en la C de mamíferos se

encuentran conservados en todas las subunidades catalíticas de PKA desde

levaduras hasta humanos (Figura 4 Introducción). Además, los residuos de las

secuencias vecinas también están conservados, y estos residuos hacen

interacción con los sustratos de la PKA de mamíferos. Por lo tanto suponemos

que también deben cumplir la misma función en las PKA de otras taxas. La

Figura I.5A muestra que al reemplazar los residuos ácidos de las posiciones

P+1, P+2 o P+3 por alanina se generaron péptidos que fueron fosforilados

eficientemente (Nth142a y Nth142b). Estos resultados sugieren que la presencia

de un residuo ácido en una zona del péptido que debe interactuar con el bolsillo

hidrofóbico de la subunidad catalítica genera un importante impedimento

estérico.

El péptido Pyk1, que se fosforila eficientemente, presenta en posición P+1 y

P+2 residuos hidrofóbicos. Con el objetivo de evaluar la hipótesis que supone

que los residuos ácidos en las posiciones hacia el C terminal del P0 afectan el

reconocimiento del péptido por la subunidad catalítica, reemplazamos los

residuos en P+1, P+2 y P+3 del péptido Pyk1a por residuos ácidos (Pyk1b,

Pyk1c, Pyk1d). Puede observarse en la Figura I.6A que si bien un contexto de

residuos ácidos en esta región es desfavorable para la fosforilación, la inclusión

de un residuo de estas características en P+1 resulta clave para evitar el

reconocimiento del sustrato. El péptido Pyk1b, con tres residuos ácidos en

estas posiciones, resultó tan mal sustrato como el péptido Nth142. Los mismos

resultados fueron observados cuando la secuencia del péptido Nth141, el mejor

péptido sustrato de los analizados, fue mutado introduciendo residuos ácidos en

P+1, P+2 y P+3 (Nth141a, Nth141b, Nth141c). En la Figura I.5B se muestra que

un residuo ácido en P+1 o P+2 posee consecuencias inhibitorias más fuertes

que en P+3. Por lo tanto podemos concluir que la presencia de un residuo ácido

hacia el extremo C terminal de P0 es deletéreo para la fosforilación del

sustrato.

Las mutaciones por dos Ala en las posiciones P+1 y P+2 en el péptido Nth141

(Nth141g) no produce ningún efecto sobre la fosforilación. Esta observacion

Capítulo I 96

indica que la presencia de un residuo hidrofóbico voluminoso en P+1 no es tan

crítica para la PKA de levaduras, ya que la presencia de una alanina permite

que el péptido se comporte como un buen sustrato. Por otro lado a partir de

estos resultados también podemos concluir que la Ser fosforilable es aquella en

P0, ya que al reemplazar la Ser en P+1 por Ala los niveles de la fosforilación del

péptido Nth141g alcanzan los mismos valores que el péptido original.

Nuestro análisis indica que la Ser83 de Nth1 (posición P0 del péptido Nth142)

no es un buen sitio de fosforilación para la PKA de levaduras, sin embargo en el

estudio �� que analiza el fosfoproteoma de levaduras se identificó un

fosfopéptido que contiene la Ser83 de Nth1 [131]. Si bien esto parece

contradictorio, ese estudio no brinda información respecto a la quinasa

responsable de la fosforilación de los péptidos identificados. Como hemos

mencionado anteriormente, si bien no necesariamente deben cumplirse los

mismos requerimientos entre péptidos y proteínas enteras, antecedentes de

nuestro grupo y de otros grupos indican que la fosforilación �� de péptidos

derivados de las proteínas Pyk1 o colina quinasa correlaciona con el sitio

fosforilado �� por la PKA [118,145].

La presencia de residuos cargados positivamente en las posiciones P42 y P43

hacia el extremo N terminal del sitio de fosforilación, han sido los determinantes

principales establecidos para la especificidad de PKA, siendo la arginina el

residuo preferido en estas posiciones [13]. Trabajos recientes basados en

métodos de predicción de sitios de fosforilación para PKA [143,146] confirmaron

y generalizaron esta afirmación estableciendo que los requerimientos de

residuos cargados positivos no solo son mayores para las posiciones P42 y P43

sino que pueden ser encontrados inclusive 6 a 8 residuos antes de la serina

fosforilable. La PKA de levaduras ha demostrado tener los mismos

requerimientos en relación a la presencia de residuos básicos en las

posiciones P42 y P43, siendo la arginina mejor que la lisina en P42 [64]. Otro

residuo clave es la serina en P0; el reemplazo de serina por threonina resulta

perjudicial para un sustrato de PKA de levaduras [64]. Nuestros resultados

confirman que estos requerimientos son también válidos. Cuando la serina en

P0 fue reemplazada por threonina en el péptido Pyk1, y cuando la secuencia

Arg4Arg en P42 y P43 fue reemplazada por Lys4Lys, Arg4Lys y Lys4Arg en el

péptido Nth141, se obtuvieron niveles muy bajos de fosforilación (Figura I.7).

Capítulo I 97

También hemos analizado la importancia de los residuos ubicados más allá de

P42 y P43 hacia el amino terminal de la posición P0. El péptido Nth142 presenta

residuos neutros (Gln) en las posiciones P45 y P46. De acuerdo con lo que se

ha observado para los sustratos de la PKA de mamíferos, la adición de una

arginina extra en estas posiciones (Nth142d, Nth142e, Nth142g) convierte al

péptido Nth142a en un mejor sustrato (Figura I.5A). Esto se confirma cuando la

arginina natural en P45 del péptido Nth141 fue reemplazada por un residuo

ácido (Nth141e o Nth141f) ya que los péptidos mostraron menor fosforilación

(Figura I.5B). Como se observa en la Figura I.6A, el péptido Pyk2 es mejor

sustrato que Pyk1 y Pyk1a, ya que no presenta en la posición P45 un residuo

ácido. El mismo razonamiento puede ser aplicado para el péptido Ser22, el cual

es un péptido más corto y una versión mejorada del péptido Pyk1 ya que no

posee el residuo P45 en su secuencia; consideramos que su mayor fosforilación

podría deberse a la falta de este residuo ácido que forma parte de su

secuencia natural (Figura I.6B). Por lo tanto, podemos concluir que la presencia

de residuos ácidos hacia el C terminal de P0 genera una secuencia con un

entorno poco favorable para la fosforilación, y que la inclusión de estos residuos

hacia el extremo N4terminal de la posición P0, también impide que el péptido

sea reconocido como sustrato. Por el contrario, la presencia de residuos

positivos hacia el extremo amino terminal, más allá de las posiciones P+2 y

P+3, favorece la fosforilación.

Capítulo I 98

Figura 5. Residuos determinantes para el reconocimiento de Nth1%1 y Nth1%2 por Tpk.

Los péptidos derivados de Nth141 y Nth142 sintetizados sobre membrana fueron incubados

con preparación purificada de Tpks como fuente enzimática, y sometidos a fosforilación como

se describe en la sección Materiales y Métodos. La incorporación de fosfato en los péptidos

expresada en unidades arbitrarias (UA), fue determinada por análisis de imagen digital y

posterior cuantificación densitométrica. Las imágenes de los �� corresponden a un

experimento representativo. Las barras de lo gráficos de cuantificación corresponden a la

media de tres réplicas y están expresadas en forma relativa a la intensidad del ��

correspondiente a Nth141. Las imágenes de los �� mostrados en A y B corresponden a

una misma membrana revelada por fosforilación pero los �� fueron ensamblados para

facilitar la comparación.

Capítulo I 99

Figura I.6. Residuos determinantes para el reconocimiento de Pyk1 y Pyk2 por

Tpk. Los péptidos derivados de las proteínas Pyk1 y Pyk2 sintetizados sobre membrana

fueron incubados con preparación purificada de Tpks como fuente enzimática, y

sometidos a fosforilación como se describe en la sección Materiales y Métodos. La

incorporación de fosfato en los péptidos expresada en unidades arbitrarias (UA), fue

determinada por análisis de imagen digital y posterior cuantificación densitométrica. Las

imágenes de los ��corresponden a un experimento representativo. Las barras de lo

gráficos de cuantificación corresponden a la media de tres réplicas y están expresadas

en forma relativa a la intensidad del �� correspondiente a Ser22. Las imágenes de los

�� mostrados en A y B corresponden a una misma membrana revelada por

fosforilación pero los �� fueron ensamblados para facilitar la comparación.

Capítulo I 100

Figura I.7. Residuos determinantes para el reconocimiento de Pyk1 y

Nth1 por Tpk. Los péptidos derivados de las proteínas Pyk1 y Nth1

sintetizados sobre membrana fueron incubados con preparación purificada

de Tpks como fuente enzimática, y sometidos a fosforilación como se

describe en la sección Materiales y Métodos. La incorporación de fosfato en

los péptidos expresada en unidades arbitrarias (UA), fue determinada por

análisis de imagen digital y posterior cuantificación densitométrica. Las

imágenes de los ��corresponden a un experimento representativo. Las

barras de lo gráficos de cuantificación corresponden a la media de tres

réplicas y están expresadas en forma relativa a la intensidad del ��

correspondiente a Nth141. Las imágenes de los �� corresponden a una

misma membrana revelada por fosforilación y los �� fueron ensamblados

para facilitar la comparación.

Capítulo I 101

Hasta el momento, para los sustratos de la C de mamíferos no se ha

establecido una secuencia consenso exacta para el extremo C terminal de la

Ser/Thr fosforilable, con excepción de la posición P+1 en la cual es favorable un

residuo hidrofóbico voluminoso, y que en P+2 y P+3 hay una leve preferencia

por residuos pequeños y flexibles [146]. Con respecto a la posición P+4, no se

tenía información ya que esta posición estaba perdida en las estructuras

cristalinas resueltas de la subunidad C de mamíferos unida a PKI. En las

estructuras más recientes de holoenzimas de PKA cristalizadas conformadas

por un complejo entre la Cα de mamíferos y mutantes de deleción en el amino

terminal de las subunidades RI [22] y RII [23], puede observarse claramente

definida la interacción entre el sitio inhibitorio (IS) (incluyendo la posición P+4)

de la subunidad R con la superficie de la subunidad catalítica. Un alineamiento

de las subunidades R de mamíferos y hongos muestra que la secuencia IS se

encuentra extremadamente conservada (Figura I.8). Las subunidades R de

mamíferos presentan la secuencia RRA(S/A)V(C/S)AE, el residuo en la posición

P0 varía dependiendo si es RI, la cual posee la secuencia IS de pseudosustrato

con alanina en P0; o RII que posee una serina autofosforilable en esa posición.

La posición P+2 también varía dependiendo de la isoforma. En hongos, la

secuencia IS predominante es RRTSVS(G/A)E y particularmente en�

� �� la secuencia IS de Bcy1 es RRTSVSGE (Tesis Jimena Rinaldi).

Como puede observarse en el alineamiento de la Figura I.8, el residuo ácido en

P+4 se encuentra absolutamente conservado. En la estructura cristalina

formada por la subunidad C y la RI, el aminoácido que hace interacción con la

posición P+4 de la RI corresponde a una lisina (Lys83) en la subunidad C. Esta

lisina se encuentra en una región de la secuencia altamente conservada en

todas las C, inclusive en Tpk1, Tpk2 y Tpk3 (posiciones 127, 110 y 128

respectivamente). La IS de las subunidades R es uno de los puntos de

contacto de la R con la C que contribuye a la alta afinidad de interacción R4C en

la holoenzima. Es válido entonces asumir que los sustratos proteicos comparten

con la subunidad R los determinantes para la interacción con C en la zona

cercana que rodea al aminoácido fosforilable. Un residuo ácido en P+4, por lo

tanto, puede considerarse como favorable ya que está presente en todas las

subunidades R de hongos. El sustrato Nth141, el mejor de los péptidos

sustratos analizado en este trabajo, presenta un glutámico en P+4.

Capítulo I 102

Figura I.8. Alineamiento jerárquico de la región IS de las subunidades R de hongos y

mamíferos (Adaptado Tesis Jimena Rinaldi). Los residuos conservados se encuentran

coloreados. Se indican las posiciones P0 (flecha negra) y P+4 (flecha roja).

I.2.3. Participación de los péptidos sustratos en la activación de la

holoenzima

Por muchos años fue aceptado el concepto que establece que el cAMP activa a

la holoenzima PKA mediante la disociación de las subunidades R y C,

provocando la liberación de las subunidades catalíticas para fosforilar sus

correspondientes sustratos. Sin embargo, recientemente ha sido demostrado

que la adición de un exceso molar de cAMP causa la disociación parcial de la

holoenzima PKA tipo Iα, y sólo luego de la adición de un péptido sustrato junto

con el cAMP se logra la disociación total de la holoenzima. Los autores también

demuestran que el péptido sustrato juega un rol diferencial en la activación de

la holoenzima de tipo I versus la tipo II, ya que el sustrato puede aumentar la

disociación de la PKA tipo I a concentraciones de cAMP bajas y

fisiológicamente relevantes, pero no ejerce el mismo efecto sobre la interacción

de las subunidades de la quinasa tipo II [133,147]. Estas diferencias de

comportamiento frente al sustrato y al cAMP podrían explicar ciertas diferencias

Capítulo I 103

importantes entre las isoformas de PKA, como por ejemplo la localización

subcelular y los requerimientos de Mg2+ y ATP (ver Introducción General)

[45,133]. Nuestro grupo de trabajo ha demostrado que los sustratos peptídicos

están involucrados en la activación de la PKA en el hongo ��& [134].

En base a estos antecedentes, nuestro siguiente objetivo fue evaluar si la

activación de la PKA de � � �� por cAMP también se encuentra

influenciada por la presencia de sustratos peptídicos. Para esto, los péptidos

Pyk1, Pyk2, Nth141, Ser22 y Kemptido se utilizaron para medir la actividad

dependiente de cAMP de la holoenzima, en presencia de concentraciones

saturantes de cada uno de ellos, con el fin de evaluar si los péptidos pueden

sensibilizar a la PKA frente al cAMP de manera diferente dependiendo de su

secuencia. Para realizar estos experimentos utilizamos holoenzima de

levaduras purificada e inmovilizada, formada por Bcy1 y las tres isoformas de

Tpk. Esta fuente enzimática fue la mejor obtenida, en términos de grado de

purificación y cantidad de enzima. Para la realización de estos experimentos se

necesitó contar con una buena cantidad de enzima ya que previamente a cada

ensayo se requirió del análisis de la calidad enzimática. Para cada preparación

enzimática se realizaban curvas para determinar la dependencia de cAMP, la

/�, del kemptido y se determinaba la cantidad de enzima a utilizar para que

respondiera de forma proporcional a la concentración.� En la Figura I.9 se

observan las curvas de activación para los diferentes péptidos sustratos y en la

tabla insertada en la figura se resumen los valores de A0.5 para el cAMP en

cada situación.

Capítulo I 104

Figura I.9. Los sustratos peptídicos aumentan la activación por cAMP de la PKA de

levaduras. La holoenzima purificada (Tpks4Bcy1) fue incubada con concentraciones

crecientes de cAMP y con los sustratos peptídicos en concentraciones saturantes (3 veces el

valor de /�:. La curva de activación de PKA para cada sustrato se encuentra representada

relativa a la actividad de PKA con ese sustrato a 100 MM cAMP. Los datos de los gráficos y

los valores de A0.5 para cada péptido que se encuentran en la tabla corresponden a la media

± SD de n=4. El análisis estadístico de las curvas sigmoideas dosis respuesta fue realizado

utilizando el programa ALLFIT y el test de normalidad D`Agostino y Person. Todas las curvas

son significativas con un p>0.05.

Las curvas pueden ser comparadas entre sí dado que todos los péptidos fueron

utilizados a una concentración de 3 veces su /�, y para una mejor

interpretación las curvas fueron normalizadas relativas a su valor máximo

respectivo.

La primera observación es que la A0.5 para el cAMP varía en un rango que va

de 0.014 a 0.136 MM, casi un orden de diferencia. Si bien los valores de A0.5

difieren para cada uno de los péptidos, algunos valores se encuentran

aproximados entre ellos haciendo difícil establecer diferencias. Sin embargo, sí

se ve claramente que los péptidos pueden ser divididos en dos grupos de

acuerdo a la concentración de cAMP necesaria para alcanzar la mitad del valor

máximo de su fosforilación. Uno de los grupos se encuentra conformado por los

péptidos Ser22 y Nth141 con una A0.5 para el cAMP que varía en el rango de

0.01 a 0.03 MM; el otro grupo incluye a los péptidos Pyk1, Pyk2 y kemptido con

valores de A0.5 que se encuentran en el rango de 0.0840.14 MM.

Capítulo I 105

La curva de activación obtenida con el péptido Pyk1, si bien se separa un poco

de las curvas correspondientes a kemptido y Pyk2, presenta un valor de A0.5

similar a los obtenidos para estos dos péptidos. Por lo tanto consideramos

apropiado que estos tres péptidos conformen un solo grupo.

Las curvas de activación correspondientes a los péptidos Nth141 y Ser22 están

desplazadas hacia la izquierda, generando valores de A0.5 claramente

diferentes a los de las otras curvas.

A partir de estos resultados podemos concluir que los sustratos peptídicos

sensibilizan diferencialmente a la PKA para la activación por cAMP ya que se

requieren distintas concentraciones de nucleótido cíclico para lograr el 50% de

su fosforilación. Podemos inferir también que los mejores sustratos (aquellos

cuya /� es más alta) son aquellos que promueven la activación de PKA a

concentraciones más bajas de cAMP, y que por lo tanto presentan un efecto de

sensibilización mayor sobre la holoenzima. Todo esto indica que un péptido

sensibiliza a la holoenzima a la activación por cAMP de manera diferente según

su secuencia peptídica.

I.2.4. Las proteínas sustrato sensibilizan a la PKA hacia la activación por

cAMP

Los resultados obtenidos hasta el momento permiten puntualizar la

participación del sustrato peptídico en la activación de la holoenzima. Trabajos

previos de nuestro laboratorio han demostrado que la proteína Pyk1 es un

sustrato fisiológico de la PKA de � �� y que la fosforilación en el sitio

blanco Ser22 modula su actividad enzimática [118]. Consideramos entonces

que la proteína Pyk1 es un buen modelo de sustrato fisiológico para analizar

cómo es su participación en la sensibilización de la holoenzima de levaduras en

presencia de cAMP. Por lo tanto ensayamos la dependencia al cAMP de PKA

en presencia de dos concentraciones de proteína Pyk1 (Pyk1p) y distintas

concentraciones de cAMP. En paralelo, y para poder comparar y validar los

resultados, se realizaron ensayos utilizando el péptido sustrato Pyk1 con la

misma preparación de enzima. Las curvas de activación se ensayaron a dos

concentraciones diferentes de proteína. Al utilizar dos concentraciones distintas

Capítulo I 106

de sustrato proteico se esperaba poder visualizar un cambio en los valores de

A0.5 para el cAMP con cada una de ellas. Cuanto mayor es la concentración de

sustrato, menor debería ser la concentración de cAMP necesaria para lograr la

activación de la holoenzima. Esto es válido tanto para la proteína entera como

para el sustrato peptídico. El péptido Pyk1 se utilizó a concentraciones iguales

a los valores de /� y tres veces esa concentración. Las concentraciones de

Pyk1p fueron elegidas en función de la concentración máxima de proteína que

podía usarse por mezcla de reacción, ya que metodológicamente no era posible

utilizar concentraciones mayores. Por lo tanto, el punto de menor concentración

quedó determinado en función del punto mayor de concentración, y estas

concentraciones fueron 0.3 y 1.5&/�. En cuanto a las concentraciones de

péptido, no pudieron ser exactamente las mismas que la de la proteína ya que

el punto de menor concentración debía ser bastante mayor que 0.3&/�, dado

que a esas concentraciones el grado de fosforilación del péptido es dificultoso

de cuantificar por la poca incorporación de [γ32P] ATP. ��

En la Figura I.10 se muestra que la A0.5 para el cAMP en presencia de la

proteína Pyk1 cambia de acuerdo a la concentración de sustrato utilizada en el

ensayo: 0.10 MM para una concentración de Pyk1p igual a 1.5&/� y 0.24 MM

para una concentración de Pyk1p de 0.3 /�, mientras que en una reacción de

fosforilación en la cual el péptido Pyk1 fue utilizado a 1&/� y 3&/�, los valores

de A0.5 para el cAMP fueron de 0.43 y 0.1 MM respectivamente. Estos

resultados muestran que tanto la proteína como los sustratos peptídicos

sensibilizan a la PKA para la activación con cAMP y sugieren que la proteína es

un mejor activador, dado que para alcanzar una A0.5 de 0.1 MM se necesitó una

concentración de proteína igual a 1,5&/�, mientras que para alcanzar el

mismo valor de A0.5 utilizando el péptido sustrato fue necesario una

concentración dos veces más alta de este último.

Capítulo I 107

Figura I.10. Comparación entre proteína y péptido en el aumento de la activación por

cAMP de la PKA de levaduras. La fosforilación de la proteína Pyk1 (Pyk1p) por la holoenzima

de levaduras purificada (Tpks4Bcy1) fue determinada luego de incubar 10 min a 30ºC con 100

MM [γ32P] ATP. Las concentraciones de proteína ensayadas fueron de 1.5 x /� (13,5 MM) o 0.3

x /�� (2,7 MM). La fosforilación de Pyk1p fue visualizada por SDS4PAGE y análisis digital de

imagen. La cantidad de fosfato incorporado al sustrato fue determinada a partir de la banda

correspondiente a Pyk1p cortada del gel de poliacrilamida y cuantificando la radioactividad

incorporada por contador de centelleo. La misma preparación de enzima fue ensayada en

presencia de dos concentraciones de sustrato peptídico Pyk1: 1 x /� (50 MM) y 3 x /� (150

MM). Pyk1 proteina /�= 9 MM y Pyk1 péptido /�= 50 MM. Los valores de A0.5 que se muestran

en la tabla corresponden a la media +SD de n=3. El análisis estadístico de las curvas

sigmoideas dosis4respuesta fue realizado utilizando el programa ALLFIT y el test de normalidad

D`Agostino y Pearson. Todas las curvas son significativas con un p>0.05.

Capítulo I 108

Capítulo I 109

I.3% Conclusiones

La fosforilación de proteínas juega un rol fundamental en la ejecución y

regulación de muchas funciones celulares. Para lograr un entendimiento

completo sobre la regulación de los eventos de fosforilación, es imprescindible

dilucidar cómo estas enzimas reconocen los diferentes sustratos proteicos.

Las proteínas quinasas reconocen la secuencia que rodea al grupo

fosfoaceptor, mientras que las regiones más distantes que se encuentran en la

estructura proteica juegan un rol menos importante en la especificidad por el

sustrato.

Varios abordajes experimentales y aproximaciones computacionales han sido

utilizados para la búsqueda de sustratos y para la predicción de sitios

específicos de fosforilación para los sistemas de mamíferos [143,148] como así

también para levaduras [64,117,130,146], tanto para quinasas en general

[14,80,117,143] como para la PKA en particular [64,130,146,148]. Si bien estos

abordajes brindan mucha información acerca de cómo son las características

de los sitios consensos reconocidos por las proteínas quinasas, no siempre

estos sitios resultan ser blancos de la enzima. Nuestros resultados contribuyen

a la dinámica de la fosforilación en � � �� demostrando que la

naturaleza química de los residuos que rodean al sitio consenso es de suma

importancia para el reconocimiento por la quinasa.

A partir de nuestros resultados surge una nueva característica para la

predicción de sitios de fosforilación para la PKA de levaduras: un residuo ácido

en la posición P+4, tal como ocurre en la IS de la subunidad R, es beneficioso

para el reconocimiento del sustrato.

Mientras se estaba realizando la preparación del manuscrito correspondiente a

esta parte de la Tesis, se publicó un trabajo en el cual�utilizando un abordaje de

�� de péptidos se determinaron los motivos blanco de fosforilación

reconocidos por 61 de las 122 quinasas de�� [149]. Sus resultados

indican que Tpk1, Tpk2 y Tpk3 presentan solo tres determinantes claros para la

identificación de la secuencia de fosforilación: Ser en P0, y Arg en P42 y P43.

Los resultados presentados en esta parte de la Tesis concuerdan con esos

resultados y avanzan un poco más en discriminar los residuos que favorecen o

Capítulo I 110

perjudican el reconocimiento del sustrato más allá de las posiciones P0, P42 y

P43.

Nuestros resultados no solamente indican que la selectividad de secuencia es

la misma tanto para Tpk1 como para Tpk2, sino que además la actividad

catalítica para ambas isoformas es idéntica.

Si bien nuestros resultados contribuyen a caracterizar la secuencia consenso

reconocida por la PKA de levaduras, debemos tener en cuenta que en el

reconocimiento del sustrato intervienen otros puntos de contacto alejados del

sitio fosfoaceptor. También es importante destacar que más allá de que la

secuencia consenso presente los determinantes adecuados para ser

reconocida por la quinasa, la accesibilidad del sitio fosfoaceptor en la estructura

de la proteína y la localización subcelular del sustrato son de suma importancia

para que ocurra la fosforilación.

La ubicación celular de la PKA y la existencia de microdominios de cAMP

proveen especificidad espacial y temporal sobre los efectos biológicos

controlados por el camino de cAMP4PKA. Se ha demostrado que las isoformas

de Tpk pueden presentar localización diferente en distintas condiciones

nutricionales de estrés [75]. Por lo tanto, aunque las isoformas Tpk1 y Tpk2

presenten la misma especificidad de sustrato �� no necesariamente van a

fosforilar los mismos sustratos �� . Existen antecedentes de este tipo de

comportamiento para Tpk1 y Tpk2. Por ejemplo, se ha demostrado que ambas

isoformas de la PKA juegan roles diferentes durante la diferenciación

pseudohifal: Tpk2 activa la diferenciación pseudohifal mientras que Tpk1 y Tpk3

inhiben el crecimiento filamentoso [150,151]. Se ha demostrado que Tpk2 es la

quinasa responsable de la fosforilación de los factores transcripcionales Flo8 y

Sfl1, los cuales están involucrados en la diferenciación pseudohifal. Sin

embargo, estos reguladores transcripcionales pueden ser fosforilados ��

tanto por Tpk1 como por Tpk2. Los autores proponen que la diferencia en la

localización intracelular del sustrato y la quinasa probablemente contribuya a la

función activadora de Tpk2 en la diferenciación pseudohifal comparada con el

rol inhibitorio de Tpk1 [59].

Hemos demostrado que tanto los péptidos como las proteínas sustrato

sensibilizan a la PKA para la activación con cAMP. Los ensayos realizados con

la proteína Pyk1 dan relevancia fisiológica a los resultados ya que las

Capítulo I 111

concentraciones a las cuales puede aumentar la disociación de la holoenzima

de levaduras (2.7 o 3.5 MM) están en el mismo orden que la concentración

fisiológica de la piruvato quinasa en la célula. Además estas concentraciones

de Pyk1 logran sensibilizar a la holoenzima en un rango de concentraciones

fisiológicas de cAMP (0.03 a 0.13 MM). De todas formas, es importante

destacar que si bien estamos hablando de concentraciones tanto de sustrato

como de cAMP del orden fisiológico, el interior celular se encuentra

compartimentalizado. Las concentraciones de cAMP, sustrato y PKA en cada

compartimento deben ser únicas y necesarias para lograr que la activación de

PKA sea un proceso regulable y específico. Se ha medido la actividad PKA ��

�� en células permeadas, preservando su localización intracelular, y se ha

comparado ese valor con la actividad PKA total medida en extractos crudos ��

� ��. Se pudo establecer que el valor que se puede medir �� es solo el 14

2% del valor de actividad total de quinasa presente en la célula [152]. Estos

datos sugieren que existe un alto efecto inhibitorio ejercido por la subunidad R

en el interior celular, y que la PKA no se encuentra libremente accesible a los

sustratos peptídicos utilizados en los ensayos de fosforilación �� .

Evidentemente, la concentración local del cAMP generado de manera

endógena así como la concentración de sustrato endógeno son los factores

claves involucrados en el mecanismo de activación de la holoenzima PKA. La

disponibilidad del sustrato, tanto como la sensibilización por el mismo sobre la

PKA, podrían ser considerados como un mecanismo de regulación fina sobre la

activación de la holoenzima.

Como se puntualizó anteriormente existe una correlación entre el

comportamiento de los péptidos como sensibilizadores de la activación por

cAMP y su /� para la subunidad C aislada. Esto sugiere que la

sensibilización ocurre por competencia entre el sustrato y la región IS de la

subunidad regulatoria. Sin embargo, resultados de nuestro laboratorio como de

otros grupos de investigación demuestran que existen interacciones a través de

diferentes dominios presentes en la subunidad C como en la subunidad R que

participan en la activación de PKA, además del IS [140,153].

La participación del sustrato en la activación de la holoenzima podría

establecer otro punto de regulación en la especificidad de la señal, haciendo

más sensible la respuesta celular frente al incremento de los niveles

Capítulo I 112

endógenos de cAMP. Es decir, que pequeños cambios en la concentración

intracelular de este segundo mensajero, podrían generar respuestas rápidas y

específicas.

En conclusión, la especificidad en el reconocimiento del sustrato por una

quinasa depende de una interrelación dinámica entre varios factores: la

secuencia de aminoácidos que rodean al residuo fosforilado, la localización del

sustrato y la quinasa y sus niveles de expresión, y la presencia o ausencia de

proteínas de anclaje que limitan las interacciones quinasa4sustrato. En

particular, la especificidad de sustrato de las isoformas Tpk1, Tpk2 y Tpk3 en

levaduras no parece depender de los determinantes de secuencia alrededor del

sitio de fosforilación ni en la diferencia en el /�� para cada isoforma. Por lo

tanto, se podría pensar que la especificidad de sustrato para cada una de estas

isoformas se encuentra mayormente determinada por su localización

subcelular, la cual puede variar dependiendo de las condiciones del medio.

�

CCAAPPÍÍTTUULLOO IIII IIddeennttiiffiiccaacciióónn yy ccaarraacctteerriizzaacciióónn ddee pprrootteeíínnaass qquuee iinntteerraaccttúúaann ccoonn llaa ssuubbuunniiddaadd rreegguullaattoorriiaa ddee llaa PPKKAA ddee ��

Capítulo II 114

II.1% INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Las proteínas de anclaje sirven como plataformas para la integración y

transmisión de múltiples señales. A través del anclaje de una enzima de

señalización a una localización subcelular específica, estas proteínas aseguran

que luego de la activación la enzima se encuentre cerca de sus blancos más

relevantes. Por lo tanto las proteínas de anclaje contribuyen a la resolución

espaciotemporal de la señalización intracelular y son el medio clave por el cual

un camino de señalización común puede servir para diferentes funciones [2].

Las proteínas de anclaje de la proteína quinasa A ('��

o� AKAPs) anclan a la PKA de mamíferos en localizaciones subcelulares

específicas [1,50]. Dado que la PKA es el primer efector del segundo

mensajero cAMP, las AKAPs juegan un rol importante en el direccionamiento y

regulación de los eventos de fosforilación mediados por la PKA. Las AKAPs

permiten formar complejos multi4proteicos que integran la señal del cAMP con

otros caminos y eventos de señalización [2].

Las AKAPs contienen una α4hélice anfipática de 14418 residuos a través de los

cuales se unen al dominio de dimerización amino terminal de las subunidades

regulatorias de la PKA [90,154,155]. La estructura en solución resuelta por

NMR del complejo AKAP4PKA reveló que la cara hidrofóbica de la hélice

anfipática de la AKAP se ubica en el paquete formado por las cuatro hélices de

los dímeros de subunidades R, de este modo permite una extensa interacción

hidrofóbica entre ambas proteínas [20]. El análisis de las hélices anfipáticas de

las AKAPs demostró que el lado hidrofóbico está conformado por residuos

hidrofóbicos pequeños y ramificados, como valina e isoleucina, que interactúan

con el dímero de RII. Si bien se considera que todas las interacciones AKAP4

PKA comparten estas características, existen unas pocas proteínas que anclan

a la PKA por medios alternativos. Por ejemplo, la cola citoplasmática de la α444

integrina, a la cual no se le predice una estructura de hélice anfipática, se une a

la subunidad regulatoria de tipo I sólo cuando ésta se encuentra formando

parte de la holoenzima. Esta interacción involucraría un dominio distinto al

dominio amino terminal de la subunidad regulatoria [156]. Por otro lado, la

proteína pericentrina que ancla a la PKA en el centrosoma se une a la quinasa

Capítulo II 115

a través de un dominio de 100 aminoácidos rico en leucinas el cual interactúa

con dominio amino terminal de RII [106].

Otro tipo de interacción entre la subunidad regulatoria de la PKA y proteínas

que no presenta la características de una proteína de anclaje es la interacción

que ocurre entre RI y la quinasa ribosomal S6 1 (RSK1). RSK1 es una

serina/treonina quinasa que comparte varios sustratos con la PKA. Se ha

demostrado que la forma inactiva (defosforilada) de RSK1 interactúa con la

subunidad RI, mientras que la forma activa (fosforilada) interactúa

preferentemente con la subunidad catalítica de la PKA [157]. El dominio

quinasa amino terminal (NTK) de RSK1 es necesario para la interacción con la

subunidad RI de PKA. Este dominio NTK compite con la subunidad catalítica de

la PKA por la unión a la región pseudosustrato presente sobre la RI [158]. La

unión de RSK1 en su forma activa a la subunidad catalítica incrementa la

interacción entre las subunidades catalíticas y regulatorias disminuyendo la

activación de la holoenzima por el cAMP. De manera contraria, la asociación

entre RSK1 en su forma inactiva con RI disminuye la interacción R4C,

facilitando la activación de la PKA [157].

Muchas de las proteínas que participan en los caminos de transducción de la

señal existen en diferentes conformaciones que corresponden a los estados

activos e inactivos de las mismas. La especificidad y la eficiencia de la

transducción de la señal depende tanto de la localización subcelular de las

moléculas como así también de la interacción proteína4proteína. Las

chaperonas moleculares pueden interactuar específicamente con proteínas en

distintas conformaciones y de este modo pueden interferir en la señalización

intracelular. Las chaperonas moleculares pueden actuar tanto en la maduración

como en la regulación de la transición entre el estado activo e inactivo de

distintas moléculas, como por ejemplo las proteínas quinasas [159].

Las chaperonas Hsp90, Hsp70, Hsp40, Cdc37 y Hop son las 5 proteínas

mínimas y suficientes para plegar proteínas quinasas �� . El ciclo comienza

con el pegado de un polipéptido recientemente sintetizado o mal plegado a

Hsp70 y a Hsp40 [160]. El complejo ternario es estabilizado por la hidrólisis de

ATP por Hsp70, la cual es catalizada por Hsp40. Cdc37 también puede unirse

débilmente a las proteínas mal plegadas en este momento del ciclo. Este

Capítulo II 116

complejo temprano de 1� ��A9��B9�interactúa con Hsp90 a través de

la proteína Hop. En levaduras, el homólogo de Hop, Sti1, es necesario para

promover la unión estable no sólo de la quinasa sino también de Cdc37 a

Hsp90 [161].

Cdc37 y Hsp90 se unen directamente al dominio catalítico de las quinasas

[1624165]. Utilizando mutantes de deleción de quinasas se demostró que

ambas chaperonas se unen al lóbulo menor N4 terminal, aunque Hsp90

también interactúa con ciertas zonas del lóbulo C4terminal [163]. La unión de

Cdc37 a lóbulo N4terminal de las quinasas refleja una inestabilidad intrínseca

en esta parte del dominio catalítico. Se propone que la estabilidad del lóbulo N4

terminal es crucial para determinar si la quinasa debe interactuar con las

chaperonas de manera transciente durante el inicio del plegamiento o debe

hacerlo permanentemente [166]. Las quinasas que necesitan estar unidas a

chaperonas persistentemente pueden dividirse en dos grupos: el primer grupo

incluye a las quinasas que son inestables en su forma inactiva. Un ejemplo es

la quinasa Cdk4, la cual se une a Cdc37 en su conformación inactiva antes de

unirse a la ciclina D [167]. En el caso de Cdk2, la unión a la ciclina incrementa

el empaquetamiento de las interacciones del lóbulo N4terminal, por lo tanto

aumenta su estabilidad [168]. Es posible que Hsp90 y Cdc37 promuevan la

estabilización de la quinasa hasta que la ciclina se una a las Cdks y las activen.

El segundo grupo corresponde a las quinasas que requieren de las chaperonas

para el plegado de las cadenas nacientes y también durante el estado maduro.

A partir de abordajes de genética de levaduras se identificaron componentes

del sistema de chaperonas involucradas en el plegamiento de quinasas

[161,1694171] y se demostró que Cdc37 tiene un rol general en la biogénesis

del “quinoma” además de proteger a las cadenas nacientes de la degradación

durante o inmediatamente después de su traducción [172]. Mandal ��

proponen que Cdc37 funciona en distintos pasos de la biogénesis de las

quinasas, y estos pasos involucran proteger a las cadenas nacientes de una

rápida degradación y plegarlas adecuadamente junto con Hsp90 [172]. Los

dominios a los cuales se unen las chaperonas incluyen regiones que se

encuentran involucradas en la dinámica de la quinasa durante la activación y el

ciclo catalítico [8]. De hecho, la forma activa de la quinasa Akt co4

inmunoprecipita con Cdc37, sugiriendo que esta chaperona tiene otras

Capítulo II 117

funciones más allá de su participación en el plegado y en la estabilización

[173].

Además de prevenir la agregación, las chaperonas intervienen en el proceso de

degradación vía proteosoma de proteínas mal plegadas. Por ejemplo, la

inhibición de Hsp90 lleva a la ubiquitinación y agregación de muchas proteínas

quinasas y diversos receptores nucleares [174]. Distintos estudios genéticos y

bioquímicos han demostrado que Hsp70 es importante para la degradación de

proteínas citosólicas mal plegadas [1754177]. Hsp40 coopera con Hsp70 en

este proceso [178].

En levaduras la proteína Ydj1, una chaperona Hsp40 de tipo I, fue identificada

como una chaperona que protege una cohorte de quinasas similar a la que

protege Cdc37. Se propone que Ydj1 protege las cadenas nacientes durante o

inmediatamente después de la síntesis, en contraposición con lo que ya está

descripto en la literatura. Además se demostró que en células ��36� la

maduración de varias quinasas, así como también su actividad, se ve

disminuida con respecto a las células salvajes para Ydj1. Se demostró que

Ydj1 protege y controla el grado de maduración de Tpk2, y se observó que en

cepas ��36� los niveles proteicos y de actividad de esta quinasa disminuyen un

40% respecto a las células salvajes [179].

Ren ��han identificado mutaciones dentro del dominio de unión a proteínas

quinasas de Cdc37 que disminuyen el defecto en el crecimiento de una cepa

de � �� que contiene una mutación sensible a la temperatura en el gen

��(Ts). Estas mutaciones sobre Cdc37 elevan la actividad PKA en esta cepa

termosensible [180].

En levaduras, la entrada principal hacia la mitocondria de las proteínas

codificadas por el genoma nuclear es la �� C��

�� &�� o complejo TOM. Se demostró que la

fosforilación de este complejo por la quinasa CK2 promueve la biogénesis del

mismo, mientras que la fosforilación por PKA del receptor Tom70 inhibe la

importación de preproteínas mitocondriales [181]. Este receptor está

involucrado en la importación de distintos transportadores de metabolitos

mitocondriales.mLas preproteínas que son reconocidas por Tom70 se

encuentran formando un complejo con la chaperona Hsp70, la cual se une

específicamente a Tom70 [182]. Cuando las células se encuentran creciendo

Capítulo II 118

en presencia de glucosa, generan ATP a partir de la fermentación, y por lo

tanto, los requerimientos de la fosforilación oxidativa disminuyen, así como

también disminuye la importación mitocondrial. Por lo tanto en estas

condiciones PKA fosforila a Tom70 en la Ser174, y esta fosforilación impide la

interacción con la chaperona Hsp70 [181]. De esta manera la fosforilación de

Tom70 por PKA representa un mecanismo de regulación el cual puede actuar

rápidamente para ajustar la tasa de importación mitocondrial dependiendo de

las demandas metabólicas de la célula.

Los miembros de la familia Hsp60 se distinguen por sus características

estructurales: forman un homo4oligómero de 14 subunidades con 7 de ellas

dispuestas en forma de anillo [183,184]. Este sistema de doble anillo forma una

extensa cavidad interna que es capaz de acomodar proteínas de un peso

molecular mayor a 50 kDa. Las proteínas que ingresan en esta cavidad son

protegidas de las interacciones con otros componentes que las rodean. Los

sustratos predilectos por Hsp60 son intermediaros de plegado que no han

adquirido aun su estructura nativa. Los sustratos proteicos se unen a los

residuos de los aminoácidos hidrofóbicos que se encuentran expuestos sobre

la pared interna de la cavidad. La unión del ATP induce un cambio

conformacional importante en las subunidades lo cual genera que se abra la

cavidad y se reduzca la hidrofobicidad de su superficie interna. Entonces, las

proteínas son liberadas del complejo Hsp60 y pueden desarrollar nuevas

rondas de plegado.

Las células de levaduras que presentan delecionado el gen HSP60 son

inviables debido a los defectos severos en el plegado de las proteínas

mitocondriales. Las mutantes condicionales acumulan proteínas mal plegadas

en la matriz.

En levaduras aun no se han descripto proteínas de anclaje de la PKA. Hasta el

momento, el único antecedente es un trabajo en el cual se demuestra que la

proteína Zds1 regula la localización de Bcy1 dependiendo de la disponibilidad

de glucosa en el medio. También se demostró que la fosforilación de un ��

de serinas presente en el extremo amino terminal de Bcy1 favorece la

Capítulo II 119

interacción con Zds1 [72]. Sin embargo, el dominio de interacción de Zds1 no

ha sido definido ni caracterizado.

El objetivo específico de este capítulo es la identificación de proteínas que

interactúen con Bcy1 y determinar cuáles son los dominios y determinantes

claves involucrados en esta interacción. También nos propusimos evaluar la

relevancia fisiológica de la interacción de algunas de las proteínas identificadas

con la PKA de ��

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

Capítulo II 120

II.2% RESULTADOS Y DISCUSIÓN

II.2.1. Identificación de proteínas que hacen interacción con Bcy1

Para la identificación de proteínas que interactúan con Bcy1 se emplearon

abordajes de proteómica y bioinformática. Para el abordaje proteómico se

realizaron tres estrategias de purificación. En primera instancia se realizaron

purificaciones a partir de la cepa BCY14TAP y TPK14TAP y se analizaron las

proteínas asociadas a la subunidad regulatoria. En el caso de la purificación

BCY14TAP también co4purifican las subunidades catalíticas y proteínas

asociadas. La purificación de la proteína Tpk14TAP se realizó a partir de una

cepa que solo expresa la isoforma Tpk1 ya que los otros dos genes se

encuentran delecionados. En este caso se analizaron las proteínas que eluían

con NaCl y cAMP, que al disociar la holoenzima liberan en el eluído la

subunidad regulatoria más las proteínas que forman complejos con la misma.

La segunda estrategia consistió en la purificación de Bcy1 y las proteínas

asociadas utilizando cromatografía de afinidad por cAMP4agarosa a partir de

una cepa (11154BCY1) que sobreexpresa Bcy1 bajo un promotor inducible por

galactosa (ver detalles en la Sección Materiales y Métodos). Como control, un

extracto proteico de esta cepa fue pre incubado con 50 mM de cAMP y luego

fue sembrado en la resina. En estas condiciones se espera que todas las

moléculas de Bcy1 se encuentren cargadas con cAMP y por lo tanto no puedan

unirse a la resina. Por lo tanto las proteínas que se unen en estas condiciones

son consideradas como unión inespecífica. Luego de la electroforesis y la

tinción con� #�� coloidal, se seleccionaron las bandas proteicas que

estaban presentes en la muestra y ausentes en el control. Las distintas

proteínas que co4purificaron con Bcy1 fueron identificadas por espectrometría

de masa. Del análisis de los espectros obtenidos surgieron como posibles

candidatos las proteínas Eno2 (cobertura 12%), Hsp60 (cobertura 14%), Cop1

(cobertura 15%), Myo2 (cobertura 7%) entre otras (Tabla II.1, Tabla II.2 y

Apéndice A.3).

La proteína Hsp60 es una chaperona esencial de mitocondria que promueve el

plegamiento de muchas proteínas importadas hacia la matriz mitocondrial.

También participa en el direccionamiento de varias proteínas hacia el espacio

Capítulo II 121

intermembrana de la mitocondria [1854187]. Sin embargo también se ha

reportado la presencia de Hsp60 en citoplasma [1884192]. Mediante el empleo

de abordajes de identificación de complejos proteicos por espectrometría de

masa, se describió que Hsp60 forma parte de complejos multiproteicos con

Tpk1, Tpk2 y Bcy1 [193]. En un estudio de análisis del fosfoproteoma de

levaduras se describió a Hsp60 como sustrato de Tpk1 [117].

En lo que respecta a la proteína Myo2, miosina V de levaduras involucrada en

el transporte basado en actina de diferentes cargos [194], se ha demostrado

que es fosforilada en forma dependiente de la vía cAMP4PKA en su dominio de

unión al cargo y que esa fosforilación regula su actividad �� [195].

La proteína Cop1 es la subunidad alfa del complejo COPI de coatomeros, los

cuales rodean las vesículas de transporte derivadas del retículo

endoplasmático en el camino de secreción temprano [196]. Hasta el momento

no se han reportado datos que relacionen la proteína Cop1 con la vía de

señalización de la PKA.

La enolasa II (Eno2) es una fosfopiruvato hidratasa que cataliza la conversión

del 24fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato durante la glicólisis y la reacción inversa

durante la gluconeogénesis; su expresión es inducida en respuesta a glucosa

[197,198]. Se ha encontrado a la proteína Eno2 formando parte de complejos

proteicos con Tpk2 y Hsp60 [193]. Si bien la enolasa es una proteína presente

en alta concentración en la célula y podría suponerse que es un contaminante,

y no una proteína que se une específicamente a la subunidad regulatoria, ya

que en muchos abordajes proteómicos aparece como tal, no la descartamos

como posible interactora de Bcy1 ya que se reportó que interactúa con Tpk2.

La proteína Eno2 no presenta sitios consenso para la fosforilación por PKA.

En paralelo se realizó un búsqueda bioinformática en colaboración con el Dr.

William McLaughlin (Dept. of Chemistry and Biochemistry, UCSD). A partir del

alineamiento de las secuencias de 22 AKAPs humanas se generó una

secuencia consenso de interacción con RIIα. Dicha secuencia fue utilizada para

realizar un análisis �� de los marcos abiertos de lectura disponibles en la

base de datos del genoma de levaduras (�� Genome Database,

SGD). Los posibles falsos positivos se filtraron en base a los siguientes

criterios:

Capítulo II 122

• Baja probabilidad de que la secuencia adopte una conformación de alfa4

hélice [199].

• Que la secuencia derive de una región con baja conservación evolutiva

[200].

Así se identificaron dominios pertenecientes a algunas proteínas candidatas,

entre las cuales se encontraban con alto �� aunque con probabilidad no

muy buena, algunas de las proteínas que también habían surgido del abordaje

proteómico; y con alto score y alta probabilidad dos nuevas proteínas, Ptp1 e

Ira2. La proteína Ptp1 es una fosfatasa específica para fosfotirosina que

defosforila una amplia variedad de sustratos �� ; presenta localización

citoplasmática y mitocondrial [201,202].

Las proteínas Ira1 e Ira2 pertenecen a la familia de las proteínas activadoras

de GTPasas (GAPs) [2034206]. Se ha demostrado que la proteína Ira1

interactúa con Cyr1, la adenilato ciclasa de levaduras, y podría promover su

localización en membrana [207]. Las proteínas Ira1/2 son proteínas grandes

(∼350 KDa) que se encuentran conservadas desde levaduras hasta humanos

[208,209]. Si bien no han sido descriptas como sustratos de PKA en levaduras,

sus secuencias aminoacídicas presentan dos sitios consenso de fosforilación

para PKA.

En la Tabla II.1 se resumen las proteínas que fueron identificadas por los

distintos abordajes y con las cuales avanzamos en nuestros estudios.

Capítulo II 123

Tabla II.1. Identificación de proteínas que interactúan con Bcy1. Se resumen

algunas de las proteínas identificadas por los distintos abordajes experimentales.

Dado que está descripto que Bcy1 cambia la localización con las condiciones

nutricionales del medio, nos resultó interesante evaluar si las proteínas que

interactúan con Bcy1 varían dependiendo de las condiciones nutricionales del

medio. Además, dado que la mayor cantidad de proteínas candidatas surgieron

del abordaje de purificación por sobreexpresión de Bcy1 y purificación por

cAMP agarosa, evaluamos la bondad de la purificación a partir de una cepa

que no sobreexpresa Bcy1. En este caso se mejora la especificidad

preincubando el extracto con cAMP y ATP. Para esto la cepa 1115 de

levaduras fue crecida en distintas condiciones: glucosa o glicerol como fuente

de carbono en fase exponencial y glucosa como fuente de carbono hasta fase

estacionaria. Las proteínas que purifican junto con Bcy1 se obtuvieron por

cAMP4agarosa (Figura II.1) y se identificaron por MALDI4TOF4TOF. En la Tabla

II.2, se resumen las proteínas identificadas para cada condición con sus

respectivos 4��. Se puede observar que Bcy1 fue identificada en

las 4 condiciones ensayadas, con alto �� 4�� Se encontraron

proteínas que co4purifican con Bcy1 sólo en una de las condiciones ensayadas,

y también algunas que se encuentran en más de una condición.

La proteína glucógeno fosforilasa, Gph1, fue identificada en células creciendo

en glucosa, glicerol y en fase estacionaria. Esta proteína interviene en la

degradación del glucógeno y su expresión aumenta en fase logarítmica tardía.

Su actividad está regulada a través de la fosforilación dependiente de la vía del

cAMP, y presenta sitios de fosforilación para PKA [2104212]. Sólo dos proteínas

Proteína identificada Método de identificación

4�� $ �� ?��/6��'��

�� $ �� ?��'��

��89� �� $ �� ?��'��

Cop1 �� $ �� ?��'��

�� $ �� ?��'��

+�� '�D� � ��

��6� '�D� � ��

Capítulo II 124

se encontraron tanto en glucosa como en glicerol: el factor de elongación 2,

Eft2 [213], y la subunidad α de la fosfofructoquinasa 1 (Pfk1), enzima

involucrada en la glicólisis indispensable para el crecimiento anaeróbico [214].

Las proteínas Glc3 y Hsc82 se encontraron tanto en las purificaciones de

células crecidas en glicerol como en fase estacionaria. La proteína Glc3 es una

enzima encargada de la ramificación del glucógeno [215]. La proteína Hsc82 es

una chaperona citoplasmática perteneciente a la familia de las chaperonas

Hsp90 [216,217] y es fosforilada por PKA. De las 15 proteínas identificadas a

partir de la sobreexpresión de Bcy1, 9 de ellas se encontraron también en

condiciones de no sobreexpresión, entre ellas las proteínas Hsp60, Ssa1

(Hsp70) y Hsc82. Es interesante notar que las proteínas Hsp60, Hsp70 y Hsc82

se encontraron en condiciones en las cuales las células se encuentran

creciendo en presencia de una fuente de carbono no fermentable y con una

alta actividad mitocondrial.

Cada purificación se realizó repetidas veces y las proteínas más relevantes

(mejor �� y 4��) fueron identificadas en cada una de estas

purificaciones. Sin embargo, en cada purificación encontrábamos nuevas

proteínas que co4purificaban con Bcy1. Además dependiendo si se tratara de

Bcy1 endógena, sobreexpresada o etiquetada con el epítope TAP, los

resultados variaron considerablemente. Tal como explican Uetz & Goll se

pueden recuperar distintos complejos aún cuando una purificación se realiza

repetidas veces utilizando siempre la misma proteína etiquetada. Si bien el

ensayo de �� es bastante reproducible también presenta un significativo

margen de error. Se debe considerar también que muchas proteínas forman

parte de diferentes complejos: la proteína “carnada” podría interactuar con

distintos complejos independientes que aparentan ser uno solo. Además,

dependiendo de las condiciones nutricionales del medio los niveles de

proteínas, la expresión de los genes y la traducción de los mensajeros pueden

ser diferentes [218]. Todo esto hace que resulte difícil identificar las mismas

proteínas formando parte de un complejo en cada purificación.

Capítulo II 125

Figura II.1. Purificaciones cAMP agarosa. Extractos proteicos de las cepas 11154BCY1

(sobreexpresión), 1115 en YPD, YPGli o fase estacionaria fueron incubados en presencia o

ausencia de cAMP y sembrados en resina cAMP4agarosa. Las purificaciones se sembraron en

un �)��'�4 y el gel fue teñido con #�� "�� coloidal. (*) banda identificada como

Bcy1.

Capítulo II 126

Tabla II.2 Proteínas identificadas por MALDI TOF TOF. Glucosa: incluye las purificaciones

realizadas por cAMP agarosa a partir de la cepa 1115 y las purificaciones realizadas por la

metodología TAP utilizando la cepa BCY14TAP

Proteína Glucosa ��1��

Glicerol ��1��

Fase estacionaria ��1��

Sobre%expresión

��1��

Rpo21

8.3E404 175

Ura2 2.6E408 120 Rpb2 4.2E414 168 Spt5 5.3E407 107 Gph1 2.1E407 111 0.0045 80 4.6E405 89

Hsp104 0.00048 77 Eft2 8.3E411 145 1.6E409 134 0.009 66 Pfk1 0.085 55 2.5E406 102

Vma2 0.00021 81 Pyk1 0.0043 68 6.6E405 82

Pdc1/2 0.016 62 0.00056 73 Bcy1 3.3E407 109 0.01 65 4E409 130 5.4E406 93 Asc1 5.3E406 97 Rpl20 0.0025 70

Glc3

0.00013 85 1.6E410 144

Fas2 6.3E410 138 Pyc2 0.0048 69 0.0007 77 Ala1 0.0063 68 Kgd1 0.02 63 Aco1 4E412 160 Hsc82 8E421 247 4E408 120 0.0033 71 7.4E406 92

YEL011w 2E406 103 Ssa1 3.2E406 101 2.2E406 88 Icl1 0.025 62

Hsp60 5.6E406 98 0.0074 62 Ald6 0.022 62 Ald4 8E415 187 Idp2 8E408 117 0.0001 86 Pgk1 0.0037 70 5E409 129 Oye2 0.0032 71 Ilv5 1E408 126

Fba1 0.029 61 Pet9 0.0008 77

Rps1a 0.00018 84 Rps4b 0.08 57

Gdb1

4E408 120

Cpa2 0.018 63 Tdh3 0.009 66 5.4E412 153 Fks1 0.001 76 Gal7 0.0067 68 Cop1 0.00011 88 Myo2 0.1 40 Ynk1 2.1E408 117

Hsp70 7.9E406 93 Eno2 9.8E46 96

Capítulo II 127

II.2.2. El extremo amino terminal de Bcy1 se une �� a péptidos

derivados de las proteínas interactoras

Del análisis de predicción se delimitaron las posibles secuencias interactoras

con Bcy1 de las proteínas identificadas. En base a estos resultados, se elaboró

un �� de péptidos con los posibles dominios de unión a Bcy1 para cada una

de las proteínas identificadas. Las secuencias de los péptidos incluidos en el

�� se encuentran resumidas en la Tabla II.3. También se utilizaron como

control las secuencias de interacción de AKAPs de mamíferos: AKAP7

(específica para RII) [219] y AKAP2 (AKAP dual) [220], y el péptido Ht31[90],

utilizado para romper la interacción RII4AKAPs tanto �� como �� .

Proteína Secuencia péptido ��

+�� 2507TVLPTTEVANNIIQKILAKIRSFLP2531

4�� 222AEEALDLIVDAIKAAGHGDKVKIGL246

�� 943LENKVIELTQNASKVKENKEMTERI968

#��6� 618LIKDSNLVGQNIISYLQKSGYPEIA642

��89� 137LRRGSQVAVEKVIEFLSANKKEITT161

��6� 285SDRATEEYTRDLIEQIVLQLRSQRM309

'��A� 270DDAELVALSKRLVENAVLKAVQQYL294

��56� 1246DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY1269

'�� 633ELAWKIAKMIVSDVMQQAHHDQPLEKSTKL662

Tabla II.3. Predicción de secuencias que interactúan con Bcy1. Secuencias

peptídicas derivadas de las proteínas que hacen interacción con Bcy1 identificadas

por los distintos abordajes. Los superíndices indican las posiciones del primer y

último residuo en la secuencia primaria de la proteína. También se incluyeron en el

diseño del array los péptidos correspondientes a la α hélice anfipática de las

proteínas Akap7, Akap2 y Ht31 de mamíferos.

Los primeros análisis estructurales por NMR demostraron que la interacción

entre la subunidad regulatoria y las AKAPs ocurre a través del surco

hidrofóbico formado por los dominios de dimerización y anclaje (D/D) amino

terminales de los dímeros de RII [20,155]. El dominio D/D está formado por

cuatro hélices antiparalelas que conforman la superficie de anclaje para la

Capítulo II 128

hélice anfipática de la AKAP [20,26,155]. Se ha demostrado que los primeros

124 residuos del extremo amino terminal de Bcy1 son necesarios para la

correcta localización subcelular de la proteína [70]. Si bien la secuencia del

extremo amino terminal de Bcy1 difiere con respecto al dominio D/D de las

subunidades regulatorias de mamíferos, los residuos hidrofóbicos definidos

como críticos para la dimerización se encuentran conservados en la subunidad

regulatoria de levaduras, y también se predice un motivo de hélice4��4hélice

característico de la estructura D/D.

En mamíferos, la hélice I se extiende hasta el residuo 39 para RIα y hasta el

residuo 25 para RIIα; y la hélice II se extiende hasta el residuo 62, en el caso

de la RIα, y hasta el residuo 45 en el caso de la RIIα. Los residuos

involucrados en la interacción con las AKAPs se ubican sobre la secuencia de

la Hélice I [94,221]. Además RI presenta una región helicoidal adicional,

denominada N1 que se propone que hace interacción con las AKAPs [25]. De la

predicción de estructura secundaria del extremo N4terminal de Bcy1 surge la

posibilidad de dos hélices: la hélice I que se extiende hasta el residuo 21 y la

hélice II que se extiende hasta el residuo 50 (Tesis Jimena Rinaldi). Sin

embargo, la deleción de los primeros 49 aminoácidos de Bcy1 es suficiente

para impedir su correcta localización, como así también la deleción de los

primeros 124 aminoácidos [70].

Resultados de nuestro laboratorio sugieren que Bcy1 es capaz de formar

dímeros (Tesis Jimena Rinaldi, Nicolás Bardeci comunicación personal). Para

analizar la importancia del extremo amino terminal de Bcy1 en el anclaje a

proteínas, se construyeron mutantes con distintas deleciones amino terminales

(Figura II.2).

Capítulo II 129

Figura II.2. Esquema de las subunidades regulatorias salvaje

y mutantes amino terminales. En el esquema se muestra la

estructura modular de Bcy1 y de las distintas mutantes. En azul

se muestra el Dominio D/D (dominio de dimerización y anclaje);

en rojo el IS (sitio inhibitorio); en rosa y violeta los sitios A y B

del dominio de unión a cAMP.

La primera construcción realizada fue la mutante �N85Bcy1. Esta construcción

se transformó en una cepa de levaduras ��6. La sobreexpresión de esta

proteína en esta cepa fue infructuosa ya que las células no podían crecer.

Estimamos que la sobreexpresión de una proteína que carece del N4terminal, y

que probablemente tiene alterada su localización, resultó tóxica para la célula.

Sin embargo, la proteína �N85Bcy1 sí pudo sobreexpresarse en una cepa

salvaje y purificarse. En las purificaciones no detectamos la presencia de la

proteína Bcy1 endógena. Las proteínas �N138Bcy1 y �N168Bcy1 se

expresaron en 4 � �� . Estas proteínas se utilizaron para revelar el ��

mostrado en la Figura II.3 (ver Figura 4 en sección Materiales y Métodos).

El revelado del �� se realizó con las proteínas Bcy1 salvaje y cada una de

las mutantes y utilizando anticuerpos anti subunidad R. Como puede

observarse en la Figura II.3, Bcy1 interactúa con los péptidos derivados de las

Capítulo II 130

proteínas Ira2, Myo2, Hsp60 y Ptp1 (fila superior del ��). No detectamos

interacción entre Bcy1 y los péptidos de Eno2 o Cop1ni tampoco con los

péptidos derivados de la AKAP7, Ht31 y AKAP2 derivados de proteínas de

mamíferos. Estos resultados dieron los primeros indicios que los residuos

involucrados en la interacción entre Bcy1 y estos péptidos serían diferentes de

los determinantes que participan en la interacción R4AKAP en mamíferos.

El revelado del �� se realizó con un anticuerpo anti4subunidad regulatoria R

de �� & preparado en nuestro laboratorio (anti4R Mr). Se utilizó este

anticuerpo dado que resultó mucho más sensible que el anticuerpo anti4Bcy1

C4terminal comercial. Como control se corroboró que la disminución

(�N85Bcy1) o falta (�N138Bcy1 y �N168Bcy1) de la señal en el revelado de los

�� se debe verdaderamente a la ausencia de Bcy1 y no a la disminución

del reconocimiento de los anticuerpos hacia las proteínas mutantes. Para esto

se realizó un �� con las proteínas purificadas y se reveló con el

anticuerpo anti4R Mr. En la Figura II.4 se puede observar que el anticuerpo anti4

R Mr reconoce con la misma eficiencia la proteína salvaje y las mutantes.

En la Figura II.3 también se observa que la mutante �N85Bcy1 pierde mucha

capacidad de unión por los péptidos del �� con respecto a la proteína

salvaje. Para el resto de las mutantes de deleción no detectamos unión a los

péptidos. A partir de estos resultados surge que la región amino terminal de

Bcy1 es clave para permitir la interacción con los péptidos.

Para verificar que las señales en el �� no se deben a falsos positivos dados

por la interacción entre los anticuerpos y los ��de péptidos, se realizó un

control incubando el �� con los anticuerpos primarios y secundarios en

ausencia de proteína. Pudimos verificar que en estas condiciones no se

observa señal en el ��, y por lo tanto confirmamos que los anticuerpos

revelan específicamente la interacción entre los péptidos del �� y las

proteínas Bcy1 salvaje o mutante. Este control se realizó para todos los ��

que se muestran a continuación.

Capítulo II 131

Figura II.3. La unión de Bcy1 a las proteínas con las cuales interactúa es a

través de su extremo amino terminal. Los péptidos derivados de las distintas

proteínas fueron sintetizadas sobre el fase sólida junto a los péptidos derivados de

la AKAP7, Ht31 y AKAP2 de mamíferos como controles. Cada �� fue incubado

con Bcy1 o sus mutantes de deleción amino terminales purificadas para permitir la

interacción. El revelado se realizó con el anticuerpo anti4subunidad regulatoria Mr.

La intensidad de los �� fue analizada por imagen digital. Las imágenes de los

��corresponden a un experimento representativo.

Figura II.4. El anticuerpo anti subunidad Regulatoria de -��3 reconoce Bcy1

y sus mutantes de deleción. Bcy1 y las mutantes �N85Bcy1, �N138Bcy1 y �N168Bcy1

purificadas fueron analizadas por �)��'�4 12% �� y reveladas con anticuerpo

primario anti Bcy1 C terminal (A) o anti R ��& (B).

Capítulo II 132

La falta del extremo N4terminal seguramente está impidiendo la dimerización de

Bcy1. En la Tesis de Jimena Rinaldi se demostró que Bcy1 es capaz de formar

dímeros y que la región N4terminal es importante para dicha función.

Verificamos entonces si la proteína �N85Bcy1 pura forma o no dímeros. Para

esto se compararon los coeficientes de sedimentación de las proteínas mutante

y salvaje purificadas por gradiente de sacarosa. El S de la proteína �N85Bcy1

(S<2,8) es mucho menor que el de la proteína salvaje (S>4,8), indicando que la

proteína mutante podría ser monomérica y no dimérica (Figura II.5). Estos

resultados coinciden con los presentados en la Tesis de Jimena Rinaldi, en la

que utilizó extractos de cepas que sobreexpresaban Bcy1 y �N85Bcy1.

Análisis de las proteínas salvaje y mutante �N85 por �� de geles no

desnaturalizantes indicaron también que la proteína mutante no forma dímeros

(resultados no mostrados).

Figura II.5. Gradiente de sacarosa de las proteínas Bcy1 y ��N85Bcy1 purificadas. La

presencia de Bcy1 () o �N85Bcy1 () en cada fracción fue determinada por ��

utilizando el anticuerpo anti4Bcy1 C4terminal. Las bandas fueron analizadas por imagen digital y

cuantificadas (UA). Se usaron como marcadores los estándares Peroxidasa (Px) y Citocromo C

(Cyt C).

Capítulo II 133

En base a estos resultados concluimos que la región N terminal presente en los

primeros 85 aminoácidos es clave para la dimerización de Bcy1 y que esta

dimerización es importante para la interacción con otras proteínas.

Para verificar que el extremo amino terminal de Bcy1 está involucrado en la

interacción con las proteínas identificadas realizamos purificaciones por cAMP

agarosa a partir de la cepa 11154�N85BCY1. Las proteínas co4purificadas

fueron analizadas por �)�� '�4. Si bien en la resina de cAMP agarosa se

unen muchas proteínas, se definieron como específicas para la interacción con

Bcy1 a aquellas que disminuyen considerablemente o desaparecen por la

preincubación por cAMP. En la Figura II.6 podemos observar que al patrón de

bandas de la purificación con la proteína mutante �N85Bcy1 no varía por

preincubar el extracto con cAMP, indicando que las proteínas identificadas en

la purificación con Bcy1 salvaje requieren del amino terminal de la subunidad

regulatoria para su interacción. En la purificación realizada a partir de la

proteína Bcy1 salvaje, se observan diferencias en el patrón de bandas en

ausencia y en presencia de cAMP como en los geles anteriores. De esta

manera confirmamos que el extremo amino terminal de Bcy1 está involucrado

en la interacción.

Figura II.6. Purificación cAMP agarosa de la proteína mutante ��N85Bcy1. Extractos

proteicos de las cepas 11154BCY1 y 11154�N85BCY1 fueron incubados con 50 Ml de resina

cAMP agarosa en presencia o ausencia de 50 mM de cAMP. Luego de la incubación y lavados

exhaustivos se agregó buffer de siembra 4x. Los extractos fueron sembrados en un �)��'�E

12% y el gel fue teñido con�#�� .

Capítulo II 134

Dado que el péptido correspondiente a la proteína Hsp60 presenta una

secuencia consenso de fosforilación para PKA surgió como posibilidad que la

interacción con los péptidos no fuera directa, sino a través de las Tpks que

pudieran estar presentes como contaminantes en la purificación. Esto no sería

esperable ya que la subunidad Bcy1 queda retenida en la columna a través de

la unión al cAMP y en estas condiciones la subunidad catalítica se debería

disociar de la regulatoria. Y si de todas formas hubiera Tpks en la purificación

(las cuales no se observaron en los geles teñidos con �� ni por ��

��), la pequeña proporción de holoenzima que pudiera estar presente debería

disociarse en presencia de cAMP y sustrato durante el revelado del ��. Los

otros péptidos analizados no presentan sitios consenso de la fosforilación para

PKA. De todas formas, las preparaciones purificadas de Bcy1 fueron

analizadas por MALDI4TOF y no se detectaron péptidos correspondientes a

alguna de las Tpks en estas preparaciones. Otro punto a destacar es que la

proteína �N85Bcy1 no debería haber perdido la afinidad de interacción con

Tpk ya que la región amino terminal no está involucrada en la interacción entre

éstas dos subunidades, y sin embargo no reconoce los péptidos en el ��

Recientemente ha sido publicado un trabajo en dónde evalúan las interacción

de distintas quinasas con 4200 ORF de � �� utilizando la metodología

de �� [222] En este trabajo encuentran solo unas pocas proteínas que se

unen directamente a Tpk1 (3 proteínas), Tpk2 (7 proteínas) y Tpk3 (6

proteínas), y la mayoría de ellas no están descriptas como sustratos o no

presentan un sitio consenso de fosforilación para PKA y ninguna de ellas

coincide con las evaluadas en nuestros ��. Estos resultados son llamativos

y demuestran que es muy difícil poder apreciar la interacción entre las

subunidades catalíticas de la PKA y sus proteínas sustrato a través de estos

abordajes experimentales. En función de todo lo expuesto consideramos que la

interacción observada en nuestros �� es exclusivamente consecuencia de

una interacción directa con Bcy1.

Para confirmar que las proteínas identificadas, cuyos péptidos fueron

evaluados para su interacción con Bcy1 en el �� interactúan con Bcy1 se

realizaron ensayos de interacción �� e �� . Los ensayos realizados� ��

� �� corresponden a ensayos de �� , en los cuales se ofreció a una

resina de cAMP agarosa con Bcy1 inmovilizada un extracto proteico de cepas

Capítulo II 135

que expresan las distintas proteínas recombinantes Ira24TAP, Ptp14TAP, Myo24

HA, Hsp604HA y Eno24TAP. La interacción específica se evaluó ofreciendo

extracto proteico de las cepas que expresan cada proteína etiquetada a la

resina cAMP agarosa libre de Bcy1 y en presencia de cAMP 50mM. Como se

observa la Figura II.7A, B, C y D las proteínas Ira2, Ptp1, Myo2 y Hsp60

interactúan con Bcy1 �� . Sin embargo no detectamos interacción para la

proteína Eno2 (Figura II.7E), y por esta razón no la consideramos como posible

proteína interactora de Bcy1.

El péptido derivado de la proteína Ptp1 interactuó con baja afinidad con Bcy1

en los ��, sin embargo la proteína recombinante sí pudo unirse a Bcy1

directa o indirectamente �� (Figura II.7B). Es posible que le interacción

entre Ptp1 y Bcy1 involucre residuos extras ubicados en otro dominio de la

proteína, o que se requiera la presencia de otra proteína para que ocurra la

interacción más fuerte.

En base a estos resultados podemos concluir que las proteínas Ira2, Myo2,

Hsp60 y Ptp1 interactúan con Bcy1 �� , confirmando los resultados

obtenidos en el ��.

Capítulo II 136

Figura II.7. Las proteínas Ira2, Ptp1, Myo2 y Hsp60 recombinantes se unen a Bcy1 ��

� �� Extractos proteicos de la cepa 11154BCY1 fueron incubados con 50 Ml de resina cAMP

agarosa por 2 horas a 4ºC. Luego de exhaustivos lavados se le ofreció a la resina con Bcy1

inmovilizada extracto proteico de las cepas IRA24TAP (A), PTP14TAP (B), HSP604HA (C),

MYO24HA (D) o ENO24TAP (E) y se incubó 2 horas a 4ºC. Luego de realizar los lavados

correspondientes, se le agregó a la resina 50 Ml de buffer de siembra 4X y se analizó la

muestra por �)��'�4�y �� El revelado se realizó utilizando anticuerpo anti4TAP (A

y B) o anti4HA (C y D) para detectar las proteínas recombinantes, mientras que para detectar

Bcy1 se utilizó el anticuerpo anti4Bcy1 C4terminal. Los controles fueron realizados incubando

extracto proteico de las cepas que expresan las proteínas con resina cAMP agarosa libre de

Bcy1 y en presencia de cAMP 50mM para descartar falsos positivos. Los inputs corresponden a

un 0.5% del extracto utilizado para el ensayo.

II.2.3. Los determinantes involucrados en la interacción con Bcy1 difieren

de los presentes en las AKAPs de mamíferos

Hace algunos años se ha descripto a través de estudios bioquímicos que el

dominio de anclaje a PKA de las AKAPs se encuentra sobre una hélice

anfipática de 14418 residuos [90]. Estudios estructurales [105,223] muestran

que la cara hidrofóbica de la hélice de las AKAPs se ancla al surco hidrofóbico

formado por los dominios D/D del dímero de subunidades RII. Aunque la

presencia de residuos hidrofóbicos sobre la cara de la hélice que interactúa con

R se encuentran conservados entre las distintas AKAPs, la identidad de esos

residuos no se encuentra totalmente conservada. Esto podría explicar las

Capítulo II 137

diferencias observadas entre las AKAPs en lo que respecta a su afinidad por

RII [224].

En mamíferos, la mayoría de las AKAPs descriptas hasta el momento se unen

a la PKA tipo II, sin embargo también se han descripto varias AKAPs que se

unen de manera específica a RI y también se han encontrado AKAPs con

función dual, es decir que se unen tanto a RI como a RII [220,2254228]. Análisis

de RMN y estructuras cirstalográficas han demostrado que el dominio D/D de

RII presenta una estructura con forma de X formada por 4 hélices, la cual

provee la superficie para el anclaje con las AKAPs [229]. Sin embargo, el

homodímero de RI es mucho más compacto y presenta una estructura del tipo

Y [230]. Estas diferencias estructurales en los dominios amino terminales,

podrían explicar la especificidad en la interacción de las AKAPs con las

subunidades RI y RII.

Como se mencionó en la Introducción General, además de las AKAPs con

dominios de unión conservados, existen AKAPs no canónicas que no

presentan la hélice anfipática conservada [106,156].

Como una primera aproximación para evaluar si los residuos involucrados en la

interacción entre los péptidos analizados y Bcy1 correlacionan con los

determinantes observados en mamíferos, realizamos un ensayo de

competencia entre Bcy1 purificada y el péptido Ht31, disruptor de la unión

AKAPs4R. En la Figura II.8 se observa que el péptido competidor Ht31 no fue

capaz de lograr el desplazamiento de Bcy1. Estos resultados sugieren que la

interacción entre los péptidos y Bcy1 no ocurriría a través de los mismos

determinantes presentes en mamíferos.

Capítulo II 138

Figura II.8. Ensayo de competencia entre Bcy1 y el péptido Ht31. El �� fue

incubado con Bcy1 purificada más el péptido Ht31 o el péptido control (��).

El revelado se realizó con el anticuerpo anti4subunidad regulatoria Mr. La

intensidad de los �� fue analizada por imagen digital.

Para analizar cuáles son los determinantes para la interacción Bcy14proteínas y

�N85Bcy14proteínas, elegimos trabajar con el dominio de interacción de Ira2.

Diseñamos un ��de péptidos�en el cual cada uno de los aminoácidos de la

secuencia de Ira2 fue sustituído por:

• Residuo hidrofóbico pequeño (alanina o glicina)

• Residuo pequeño con carga negativa (aspártico)

• Residuo hidrofílico (serina)

• Residuo pequeño con carga positiva (lisina)

En la Figura II.9 se observa que el reemplazo de residuos hidrofóbicos

voluminosos (leucina e isoleucina), por un aminoácido hidrofóbico pequeño

como la alanina aumenta la interacción del péptido con Bcy1. En este caso, la

interacción se ve favorecida por un cambio en el tamaño del aminoácido y no

por variar la naturaleza química del mismo. Cuando los residuos fueron

reemplazados por glicina, se observó que el reemplazo por este residuo en

posiciones hacia el C4terminal del péptido favoreció la unión de Bcy1. La

mayoría de los residuos presentes en esa zona del péptido también son

hidrofóbicos. La ausencia de residuos hidrofóbicos favorece la interacción con

Bcy1, en contraposición a lo que ocurre en la interacción entre AKAPs4RII de

mamíferos, donde estos residuos en determinadas posiciones resultan claves

para la unión. Cuando los residuos de la secuencia de Ira2 fueron

reemplazados por glutámico (residuo con carga negativa) en muchas de las

Capítulo II 139

posiciones, hubo una notable disminución en la interacción con Bcy1. El

resultado más llamativo se observó cuando los aminoácidos básicos de Ira2

fueron reemplazados por cualquiera de los otros residuos. La ausencia de los

residuos básicos disminuye de manera notable la interacción con Bcy1 (Figura

II.9A). Finalmente vemos que el reemplazo de residuos hidrofóbicos por lisinas

mejora la interacción.

Para el caso de la interacción �N85Bcy14péptidos la interacción disminuye

notablemente con respecto a la interacción con Bcy1 salvaje (Figura II.9B

Consideramos entonces como negativa la interacción de �N85Bcy con el

péptido Ira2. Pudimos observar que, semejante a lo que ocurre para la

interacción con Bcy1 entera, la presencia de ciertos residuos hidrofóbicos o con

carga negativa presentes en la secuencia de Ira2 resultan perjudiciales para la

interacción. Además la presencia de cargas positivas en ciertas posiciones

favorece la interacción con �N85Bcy1 (Figura II.9B). Estos resultados sugieren

que �N85Bcy1 interactúa con los péptidos de manera diferente que Bcy1, y

que tal vez se generen otros puntos de contacto debido a la ausencia del

dominio amino terminal y la falta de dimerización.

Capítulo II 140

Figura II.9. Determinantes involucrados en la interacción con Bcy1 y

��N85Bcy1. Se diseñó un �� de péptidos a partir de la secuencia derivada de la

proteína Ira2 en donde cada residuo fue reemplazado por alanina, glicina,

aspártico, lisina o serina. Los �� fueron incubados con Bcy1 (A) o �N85Bcy1

(B) purificadas para permitir la interacción. El revelado se realizó con el anticuerpo

anti4Bcy1 C4terminal La intensidad de los �� fue analizada por imagen digital.

La secuencia del péptido utilizada para el �� de alanina se muestra en la fila

“A” de las Figuras A y B, mientras que en la fila “G” se muestra la secuencia

utilizada en el �� con glicina, Fila “D” con aspártico, fila “K” con lisina y fila

“S” con serina. La flecha indica la posición de los �� correspondientes a la

secuencia salvaje del péptido; los puntos indican las secuencias salvajes en el

�� de alanina. Las imágenes de los �� corresponden a una misma

membrana revelada por �� y los �� fueron ensamblados para facilitar

la comparación.

Para verificar los resultados obtenidos que sugieren una fuerte participación de

los residuos básicos en la interacción Bcy14proteínas, como así también el

Capítulo II 141

efecto negativo que presentan los aminoácidos hidrofóbicos o ácidos sobre

esta interacción, realizamos un �� con '�� sobre las secuencias

correspondientes a las proteínas Myo2, Hsp60 y Ptp1 y analizamos la

interacción con Bcy1 (Tabla II.4 y Figura II.10). El revelado de los mismos

demostró similitudes con los resultados vistos anteriormente. El péptido Ptp1

presenta tres residuos negativos concentrados en su extremo amino terminal,

lo cual podría explicar la interacción débil con Bcy1 (Figura II.3). Con el péptido

Hsp60 también confirmamos que el reemplazo de algunos de los residuos

hidrofóbicos favorece de manera sustancial la interacción, mientras que la

ausencia de los residuos básicos va en detrimento de la misma.

El '�� del péptido de la AKAP7 de mamíferos (específica para RII),

demuestra que el reemplazo de aminoácidos hidrofóbicos (leucina y valina) o

ácidos (glutámico) por alanina incrementa la interacción, pasando de una no

interacción a una interacción débil (Figura II.10D). El reemplazo de estos

residuos hidrofóbicos presenta un efecto opuesto a lo que ocurre en la

interacción entre AKAP7 y RII, en dónde la presencia de estos determinantes

es crítica para la interacción.

Péptido Secuencia

�� L E N K V I E L T Q N A S K V K E N K E M T E R I

��89� L R R G S Q V A V E K V I E F L S A N K K E I T T

��6� S D R A T E E Y T R D L I E Q I V L Q L R S Q R M

'/'�A� D D A E L V R L S K R L V E N A V L K A V Q Q Y L

Tabla II.4. Secuencias derivadas de las proteínas que hacen interacciones con Bcy1 y dominio

de interacción de la AKAP7 de mamíferos utilizadas para los �� de la Figura II.10.

Capítulo II 142

Figura II.10. �� ) de los sitios de interacción de Myo2, Hsp60, Ptp1 y AKAP7. Se

diseñó un �� de péptidos a partir de las secuencias derivadas de las proteínas Myo2 (A),

Hsp60 (B), Ptp1 (C) y AKAP7 (D), en donde cada residuo fue reemplazado por alanina. Los

�� fueron incubados con Bcy1 purificada para permitir la interacción. El revelado se realizó

con el anticuerpo anti4Bcy1 C4terminal La intensidad de los �� fue analizada por imagen

digital. La secuencia del péptido utilizada para el �� se muestra en la parte superior de

cada Figura. La flecha indica la posición de los �� correspondientes a la secuencia salvaje

Las imágenes de los �� corresponden a una misma membrana revelada por �� y

los �� fueron ensamblados para facilitar la comparación. Las imágenes de los ��

corresponden a un experimento representativo.

Si analizamos la proporción de residuos de acuerdo a su naturaleza química en

cada una de las secuencias salvajes utilizadas en los diferentes ��,

podemos observar que existe una correlación entre el grado de interacción con

Bcy1 y el porcentaje de residuos básicos y ácidos presentes en las mismas.

Los datos de la Tabla II.5 muestran claramente que las secuencias

correspondientes a Ira2 y Hsp60 presentan un mayor porcentaje de residuos

con cargas positivas respecto a las negativas y estas proteínas presentaron

una mayor interacción con Bcy1, tanto en los �� de péptidos como en los

Capítulo II 143

ensayos de �� . En el caso de Eno2, Ptp1, AKAP7 y AKAP2 el

porcentaje de residuos básicos es menor respecto al de los ácidos, que

correlaciona con la falta de interacción con Bcy1.

Tabla II.5. Distribución de residuos hidrofóbicos, básicos y ácidos. Para calcular

los porcentajes de cada tipo de aminoácido se utilizaron las secuencias que se

encuentran en la Tabla II.2. EF:2� �� ! ��

7 �� G�=)2��

En base a estos resultados pensamos que los residuos básicos son críticos

para la interacción y que los residuos hidrofóbicos no estarían involucrados,

más aún, resultan perjudiciales para la interacción con Bcy1. Estas

características hacen diferentes a los péptidos que interactúan con Bcy1 de los

péptidos que hacen interacción con RI o RII.

Como describimos en la Introducción General, las AKAPs de especificidad dual

presentan un segundo dominio de unión a RI denominado RISR, que si bien

presenta una estructura de α hélice no tiene la misma simetría que los

dominios de unión a RII. Se ha propuesto que el dominio RISR une a RI por un

mecanismo diferente, ya que su unión a RI ocurre en una zona que se

encuentra fuera del área de unión de las α hélices y no presenta simetría

interna. Por lo tanto se piensa que RISR podría hacer contacto con solo uno de

los protómeros del dímero de R. Además, en el dominio RISR los residuos

básicos son claves para la interacción, ya que la mutación de estos residuos

anula la unión a la subunidad R. Por todo esto se propone que RISR es una

región de unión adicional en las AKAPs de especificidad dual.

� -��'� ��4%� ��'� *4>:� ��'� �0��@� �0��'�

H�� $?� �� 20 28 44 36 57 50 34

H��D �� 20 16 12 20 4 12 7

H�D� �� 16 20 4 12 28 16 19

+�� ?�� + + + + 4 ND + (*)

+�� ?�� ++ + ++ +++ 4 4 4

Capítulo II 144

Las predicciones de estructuras secundarias para los péptidos ensayados de

Ira2 y Hsp60 predicen una alfa hélice. Para analizar la disposición de los

residuos básicos en las secuencias de los péptidos utilizados en los ��, se

modelaron las hélices de los putativos dominios de interacción de las proteínas

Ira2, Hsp60, Myo2 y Ptp1 utilizando el programa PyMOL [231]. Los residuos

básicos presentes en Ira2 se encuentran más concentrados en una zona

delimitada hacia el extremo C4 terminal del péptido, y el residuo ácido se ubica

fuera de esta zona (Figura II.11A). Hsp60 presenta una distribución de los

aminoácidos cargados positivos a lo largo de todo el péptido aunque una

densidad de carga positiva queda dispuesta sobre el N4terminal del péptido

(Figura II.11 B y C). Myo2 presenta una distribución más pareja a lo largo del

péptido aunque los residuos básicos quedan más expuestos sobre una de las

caras del péptido. La distribución espacial de los residuos básicos podrían

explicar las diferencias en la interacción. En el caso del péptido Ptp1 (Figura

II.11D), que es el que peor interacciona con Bcy1, presenta una distribución de

residuos básicos y ácidos menos delimitada y podrían ser la causa de la débil

interacción observada con Bcy1 en los ��.

Capítulo II 145

Figura II.11. Visualización de los péptidos Ira2, Hsp60, Myo2 y Ptp1.

Las estructuras están coloreadas de acuerdo a la naturaleza química de

los aminoácidos: �,��2��D ��G��3�2�D� ��.

Griffioen �� demostraron que la localización de Bcy1 es dependiente de la

fuente de carbono. Los autores comprobaron que en ausencia de glucosa Bcy1

se fosforila en dos �� de serinas (�� I y II) que abarcan los primeros

124 aminoácidos de la molécula. La fosforilación de Bcy1 en estos ��

depende de la proteína Yak1, la cual podría activar otras quinasas o inhibir

ciertas fosfatasas de manera de regular el estado de fosforilación de Bcy1.

Dado que las secuencias aminoacídicas de los �� I y II son notablemente

Capítulo II 146

diferentes, los autores sugieren que cada �� podría ser fosforilado por

quinasas distintas. Por último los autores demuestran que la proteína Zds1

afecta la localización de Bcy1: el reclutamiento de Bcy1 en el citoplasma

mediado por Zds1 es controlado por la fosforilación del �� II. [72] La

presencia de grupos fosfato en el extremo amino terminal de Bcy1 como

consecuencia de la fosforilación podrían permitir la interacción con los residuos

positivos expuestos en los dominios de interacción de Ira2, Hsp60 y Myo2.

II.2.4. Bcy1 e Ira2 están presentes en las mismas fracciones subcelulares

e interactúan� ��

�

�� presenta dos tipos de receptores acoplados a

proteína G (GPCRs) para el sensado de feromonas y nutrientes. EL GPCR

involucrado en el sensado de nutrientes es el Gpr1, el cual activa la subunidad

Gα de Gpa2 en respuesta a glucosa y a azúcares estructuralmente

relacionados [2324235]. La proteína Gpa2 activada estimula la producción de

cAMP por la adenilato ciclasa y dispara la vía de señalización de la PKA

[236,237]. Gpa2 se asocia con dos proteínas kelch, Gpb1 y Gpb2, las cuales

son funcionalmente redundantes, y presentan siete motivos de repeticiones

kelch cada una [238].

� �� expresa dos proteínas Ras: Ras1 y Ras2 [239]. Ras1 y Ras2 son

funcionalmente redundantes para el crecimiento celular, pero Ras2 juega el rol

predominante en la vía de señalización por cAMP en respuesta al estímulo de

glucosa. La actividad Ras es controlada positivamente por los factores

intercambiadores de GTP Cdc25 y Sdc25 (GEFs), y negativamente por las

proteínas activadoras de GTPasas (GAPs) Ira1 e Ira2 [2034206]. Se ha

demostrado que cuando la PKA es activada frente al estímulo de glucosa,

provoca una relocalización de Ras2 desde la cara interna de la membrana

plasmática hacia el citoplasma, participando de esta manera en el $��

negativo de la vía cAMP4PKA [240]. Ha sido demostrado que Ira1 interactúa

con la adenilato ciclasa de levaduras y que podría promover su localización en

la membrana [207]. Las proteínas RasGAP Ira1/2 son proteínas grandes (350

kDa) que se encuentran conservadas de levaduras a humanos [208,209]. A

Capítulo II 147

pesar de que los genes IRA1 e IRA2 fueron clonados hace más de una década,

aun no se sabe con certeza cómo es controlada la actividad RasGAP de estas

proteínas. Recientemente se ha demostrado que Ira1/2 serían blancos de las

proteínas kelch Gpb1/2. Gpb1/2 se une al dominio conservado C4terminal y

estabilizaría a Ira1/2 [241]. Esta estabilización induciría la actividad GTPasa de

Ras, colaborando con el apagado de la señal de la vía cAMP4PKA.

Basándonos en estos antecedentes y en los resultados obtenidos previamente,

como primer paso en el estudio de la relevancia fisiológica de la interacción

Bcy14Ira2, resultó interesante estudiar la co4localización de estas proteínas.

Para ello se realizó un fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial

de un extracto crudo de la cepa que expresa IRA24HA. Como marcador de

fraccionamiento se utilizó la proteína integral de membrana Pma1 [242], de

manera de poder diferenciar las proteínas integrales de membranas de

aquellas asociadas a membrana plasmática, como Ira2. Como puede

observarse en la Figura II.12, si bien Bcy1 es considerada una proteína con

distribución núcleo4citoplasmática, se observa la presencia de la misma en las

fracciones correspondientes a proteínas asociadas a membrana (S100,000) y

en la de proteínas integrales de membrana (P100,000). Ira2 se encuentra en la

fracción correspondiente a la de proteínas asociadas a membrana plasmática

(S100,000), en la cual también está Bcy1. "�� han reportado la

presencia de actividad PKA cAMP dependiente en preparaciones de membrana

de células de levaduras así como también la presencia de Bcy1 en esta

fracción [243].

Capítulo II 148

Figura II.12. Determinación de la localización subcelular de Ira2 y Bcy1 mediante

centrifugación diferencial. La cepa IRA24HA fue crecida en YPD hasta una DO600nm=0.8. Los

extractos proteicos se sometieron a una centrifugación diferencial para obtener las distintas

fracciones subcelulares, tal como se detalla en la Sección Materiales y Métodos. Las muestras

fueron analizadas por �)��'�4 y �� y reveladas utilizando anticuerpos anti4HA,

anti4Pma1 o anti4Bcy1 c4terminal según corresponda. �599��5992 sobrenadante y pellet del

599&�� respectivamente; �699�99� �� 699�9992� sobrenadante y pellet del 699�999&�,

respectivamente.

Los resultados obtenidos en los �� de péptidos sugieren que existe una

interacción directa entre Bcy1 e Ira2. Por otra parte, utilizando la metodología

de �� encontramos que ambas proteínas interactúan directa o

indirectamente �� y además, están presentes en la misma fracción celular.

Teniendo en cuenta estos resultados y los antecedentes que se encuentran en

la literatura que indican que Ira2 promueve la localización en membrana de la

adenilato ciclasa de levaduras, y que Bcy1 se encuentra asociada a la fracción

subcelular correspondiente a membrana plasmática, nos permite pensar que

Bcy1 podría encontrarse formando parte de un complejo que incluya a estas

dos proteínas que participan en la vía de la señalización del cAMP. Por lo tanto,

nuestro próximo objetivo fue evaluar la posible interacción �� de Bcy1 e

Ira2. Para ello se prepararon extractos crudos de la cepa IRA24HA y se

inmunoprecipitó la proteína Ira24HA junto con las proteínas que interactúan con

ésta utilizando anticuerpo anti HA y proteína A/G agarosa. El inmunoprecipitado

fue analizado por �� revelado con anticuerpo anti Bcy1 y anti HA. En

la Figura II.13 puede observarse la presencia de Bcy1 en el inmunoprecipitado

de la proteína Ira24HA, por lo que podemos concluir que Ira2 y Bcy1 interactúan

directa o indirectamente �� . En el IP Bcy1 es detectada como dos bandas

Capítulo II 149

(Figura II.13) que consideramos que debe corresponder a Bcy1 proteolizada.

Hemos observado que en ensayos en los cuales se requiere largos períodos de

incubación las muestras se enriquecen en esta forma proteolizada de Bcy1.

Figura II.13. Ira2 se une a Bcy1 �� La cepa IRA24HA fue crecida en YPD

hasta una DO600nm=0.8. Los extractos proteicos fueron incubados con 10Ml de

anticuerpo anti4HA por 1 hora a 4ºC, y posteriormente se agregó Proteína A/G. El

inmunoprecipitado fue lavado exhaustivamente y se le agregó buffer de siembra

4x. Las muestras fueron analizadas por �)��'�4 y �� y el revelado se

realizó utilizando anticuerpo anti4HA o anti4Bcy1 C4terminal según corresponda. +�2�

inmunoprecipitado; ��: extracto incubado con anticuerpo inespecífico.

Como se ha mencionado anteriormente, la presencia de Bcy1 en membrana

plasmática ha sido reportada previamente [243]. Los autores de este trabajo

encontraron que fracciones de membrana plasmática provenientes de células

creciendo con glucosa como fuente de carbono presentaban niveles crecientes

de actividad PKA cAMP4dependiente durante el crecimiento celular. Por lo tanto

la presencia de PKA en membrana aseguraría la pronta respuesta frente al

estímulo de glucosa, aun en presencia de bajos niveles de cAMP. El

interrogante que surge de estas evidencias es cómo se encuentra anclada la

quinasa en la membrana plasmática. La proteína Bcy1 que se encuentra en

membrana no presenta ninguna modificación post4traduccional que le permita

anclarse directamente a la membrana celular. No presenta ningún residuo de

glicina amino terminal típico para la miristilación, ni tampoco presenta una

secuencia de reconocimiento para acetiltransferasas en el carboxi4terminal,

como ocurre en las proteínas palmitoiladas [243]. La interacción de Bcy1 con

Ira2 podría explicar la presencia de la PKA en membrana plasmática, apoyando

la hipótesis de la existencia de proteínas de anclaje en levaduras.

Capítulo II 150

Otra pregunta que nos plateamos al analizar estos resultados fue si las

subunidades catalíticas también co4inmunoprecipitan con Ira2, sin embargo no

pudimos demostrar por �� la presencia de Tpk1 en el

inmunoprecipitado. Hasta el momento, según lo reportado por Harashima et al

[241], se ha descripto la interacción de Ira2 con Gpb1/2 (proteínas Kelch), pero

no con otro componente de las cascada cAMP4PKA. Y según lo reportado por

Peeters et al [244] las proteínas Gpb1/2 se asocian con Gpa2 y con las

subunidades catalíticas de PKA. Según nuestros resultados Ira2 puede hacer

interacción con Bcy1 pero no detectamos la presencia de Tpks.

II.2.5. Péptidos derivados de la proteína Ira2 son fosforilados por Tpks

Se ha demostrado que la neurofibromina (NF1), homóloga de Ira1/2 en

humanos, se encuentra constitutivamente fosforilada y que esta fosforilación

ocurre en un dominio rico en cisteínas/serinas (CSRD) y en el dominio C

terminal (CTD) de la proteína [245]. El dominio CTD presenta sitios específicos

para la fosforilación por PKA. La proteína =�� =�4dimetilarginina

dimetilaminohidrolasa (DDAH) se une a los dominios CSRD y CTD de la

neurofibromina y esta interacción promueve la fosforilación por PKA [245].

Además, la fosforilación del dominio CSRD por PKA promueve la asociación de

NF1 con la proteína 144343, la cual pertenece a una familia de proteínas que se

unen a una gran variedad de proteínas fosforiladas en serina, participando en un

amplio espectro de procesos biológicos. La unión de 144343 regula

negativamente la actividad NF14GAP. Estos resultados sugieren que 144343

regula las funciones bioquímicas y biológicas de la neurofibromina gracias a la

fosforilación mediada por PKA de NF1 [246].

Diversos trabajos indican que la proteína Ira2 de levaduras presenta diferentes

serinas y treoninas fosforiladas, sin embargo en estos trabajos no se determinó

cuál o cuáles son las quinasas responsables de fosforilar estos sitios [2474249].

Por otro lado, en levaduras existen dos genes que codifican para las proteínas

144343: BMH1 y BMH2. Está descripto que Bmh1 presenta interacción genética

con Ira2 [250].

Capítulo II 151

En base a estos antecedentes resultó interesante determinar la presencia de

sitios de fosforilación para PKA en la proteína Ira2. En primer lugar, utilizando el

programa Scansite [251] realizamos un análisis �� de la secuencia

aminoacídica de la proteína con el objetivo de encontrar sitios putativos para la

fosforilación por PKA. A partir de este análisis surgieron dos posibles sitios

como candidatos: ser1018 y ser1745. Ambos sitios se encuentran río arriba de

la secuencia que hemos identificado que interactúa con Bcy1. En trabajos

proteómicos previos se ha encontrado que la ser1018 se encuentra fosforilada

�� [2474249]. Para determinar si estos sitios son fosforilados por la PKA de

levaduras �� , diseñamos los péptidos que se muestran en la Tabla II.6 y

estudiamos su fosforilación utilizando como fuente enzimática mezcla de Tpks

purificadas. En la Figura II.14 se puede observar que ambos péptidos resultaron

fosforilados por la PKA de levaduras �� . El péptido Ira24ser1745 se

comportó como un buen sustrato de las Tpks con una /�=100 MM y una /�� =

614 min41. La /��resultó por lo tanto de 6.14 min41.MM41. Estos valores indican

que este péptido se fosforiló eficientemente con un comportamiento similar a

Nth141 (descripto en el capítulo I).

El péptido Ira24ser1018, sin embargo, resultó muy poco fosforilado por las Tpks

(/� = 545 MM; /�� = 311 min41). En función de los resultados presentados en el

Capítulo I, consideramos que el péptido Ira24ser1018 se fosforila

ineficientemente por la presencia de los residuos ácidos presentes en P+1 y

P+2.

Tabla II.6. Péptidos derivados de la proteína Ira2 y sus parámetros cinéticos. En negrita se

indica la secuencia consenso RRXS que incluye la serina fosforilable; los superíndices indican la

posición del correspondiente residuo en la secuencia primaria completa de la proteína.

�C4� �� 0�� 0�� 04�

Ira24ser1018 IRTRRYS1018DESLG 545 MM 311 min41 0.57 min41.MM41

Ira24ser1745 DILRRNS1745CATRS 100 MM 614 min41 6.14 min41.MM41

Capítulo II 152

0 250 500 7500.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25Nth141Ira24ser1018Ira24ser1745

sustrato (��M)

pm

ol/

min

Figura II.14. Fosforilación �� con Tpks purificadas de péptidos derivados de la

proteína Ira2. Ensayo cinético representativo utilizando como fuente de enzima mezcla de Tpks

purificadas y los péptidos derivados de la proteína Ira2. Como control se utilizó el péptido Nth14

1 utilizado en el Capítulo I.

Sabiendo que al menos uno de los péptidos derivados de Ira2 es fosforilado

eficientemente �� , nuestro próximo objetivo fue ensayar la fosforilación de

la proteína �� . Tanto por la metodología TAP (cepa IRA24TAP) como por

inmunoprecipitación con anticuerpo anti4HA (cepa IRA24HA), la cantidad de

proteína purificada no resultó suficiente para los ensayos de fosforilación.

Además, la proteína inmunoprecipitada resultaba proteolizada durante el

ensayo de fosforilación.

�� han propuesto que la regulación de las proteínas Ira1/2 es llevada a

cabo por la unión de la proteína Gpb1/Krh2. Esta regulación negativa sucede a

nivel de la degradación de las proteínas ya que la unión de Gpb1/Krh2 al

dominio carboxilo terminal de Ira1/2 promueve la proteólisis ubiquitina

dependiente [252]. Sin embargo, trabajos previos se contradicen con estos

resultados ya que proponen que la unión de las proteínas Gpb1/Krh2 y

Gpb2/Krh1 a Ira1/2 estabilizan la proteína [241]. Se ha demostrado también que

la proteína Gpb2/Krh1 interactúa �� con las tres isoformas de las Tpks y con

holoenzima reconstituida �� [244]. Los mismos autores han demostrado que

la unión de Gpb2/Krh1 a las Tpks promueve la formación de la holoenzima, y

por lo tanto se sugiere que las proteínas Gpb1/2 podrían actuar como

Capítulo II 153

reguladores negativos de la PKA [244]. Recientemente Budhwar et al

encontraron que en ausencia de glucosa Gpb1/2 estabilizan los niveles

proteicos de Bcy1 y promueven su fosforilación en el �� II de serinas por

una quinasa aun no conocida [253,254]. Esta estabilización y fosforilación de la

subunidad regulatoria favorecería la unión de Bcy1 con las subunidades

catalíticas contribuyendo al apagado de la señal. Los autores proponen que la

regulación de los niveles de Bcy1 así como la fosforilación en el �� II no

sería un efecto directo de las proteínas Gpb1/2 sobre la subunidad R sino que

estas proteínas estarían actuando directamente sobre las Tpks, ya sea

modificando su actividad o afectando su localización subcelular [254]. Todos

estos resultados sugieren que las proteínas Gpb1/2 actuarían como reguladores

negativos de la vía cAMP4PKA: por un lado actuando directamente sobre la PKA

promoviendo la formación de la holoenzima y por el otro estabilizando a las

proteínas Ira1/2 para que puedan ejercer su actividad GAP sobre las proteínas

Ras inactivándolas para frenar la actividad de la adenilato ciclasa.

Si bien un aumento en la estabilidad de Ira1/2 afecta de manera directa su

actividad GAP, sería importante determinar cuáles son los mecanismos

moleculares que conllevan a la regulación de dicha actividad cuando los niveles

de la proteína se encuentran estables. Basándonos en los resultados reportados

para NF1 y a los resultados de fosforilación �� de los péptidos derivados de

Ira2, proponemos que la fosforilación por PKA de la ser 1745 y, en mucha

menor medida la de la ser1018 podría presentar un rol regulatorio para la

actividad Ira24GAP. Esta fosforilación podría activar la actividad GAP de la

proteína Ira2 o favorecer la interacción de Ira2 tanto con Ras como con Gpb1/2

y así contribuir al apagado de la señal (ver detalles más adelante en Figura

II.17).

Nuestro próximo paso será determinar si la proteína Ira2 es fosforilada ��

por PKA, y si esta fosforilación es importante para la regulación de su actividad

GAP y/o el reclutamiento de otros factores involucrados en la transducción de la

señal.

Capítulo II 154

II.2.6. Localización subcelular de Hsp60 y PKA

En mamíferos, PKA juega un rol crítico en la fisiología mitocondrial, además a

partir de mitocondrias purificadas, se han aislado tanto la subunidad catalítica

como las subunidades RI y RII [255]. Esto sugiere que la PKA activada en esta

organela puede fosforilar eficientemente diversos sustratos y modula su

función. La señalización vía cAMP hacia la mitocondria depende de que ocurra

la correcta localización de PKA en la membrana externa mitocondrial, y esta

localización se da a través de la interacción de la holoenzima con la AKAP121,

la cual la ancla a la mitocondria [256].

Las condiciones del cultivo afectan considerablemente la actividad mitocondrial

en levaduras. Las funciones mitocondriales se encuentran reprimidas y el

contenido de ADNmt se haya reducido cuando las células crecen en presencia

de glucosa [257]. Por el contrario, el crecimiento en una fuente de carbono no

fermentable estimula la respiración e incrementa en contenido de ADNmt.

Mucha de esta regulación es llevada a cabo por la estimulación de la vía

cAMP/PKA sobre la transcripción de genes nucleares, y posiblemente,

mitocondriales. La transcripción de genes mitocondriales requiere de la

fosforilación de diversos sustratos mitocondriales de PKA [258].

Las chaperonas de la familia Hsp60 son los componentes más importantes del

sistema de plegado de proteínas en la matriz mitocondrial [259]. La importancia

de estas chaperonas en la biogénesis mitocondrial fue identificada a partir del

análisis de mutantes termosensibles de �� [186] �

Estos antecedentes sumados al hecho de que Hsp60 es sustrato de PKA,

sugieren que un pool de PKA podría ser dirigido hacia o dentro de la

mitocondria. La presencia de PKA mitocondrial en levaduras ha sido propuesta

por Rahman� �� [258,260,261], basándose en la medición de actividad

quinasa en fracciones mitocondriales purificadas. Sin embargo hasta el

momento no hay evidencias que demuestren la presencia física de las

subunidades regulatoria y catalíticas en dicha organela.

En mamíferos, por otro lado, se ha demostrado que Hsp60 estaría involucrada

en diversas funciones celulares en las cuales la mitocondria no se encuentra

implicada. Por ejemplo, Hsp60 participa en los sistemas de transporte de

aminoácidos [262,263], transducción de señales [264], presentación antigénica

Capítulo II 155

[265] entre otros. También se la ha encontrado en la superficie de ciertas

células tumorales [188,266] y células estresadas [267]. Estos roles diversos

son inconsistentes con una localización exclusivamente mitocondrial de Hsp60.

También se ha demostrado que una cepa de levaduras que presenta una

proteína Hsp60 termosensible (��89��) puede ser complementada con la

proteína SCS1 de localización citoplasmática revirtiéndose el fenotipo [268].

Basándonos en estos antecedentes y en nuestros resultados en los cuales

demostramos que Hsp60 y Bcy1 se encontrarían formando parte de un

complejo proteico �� (ver sección II.2.1), y que Bcy1 y Hsp60 interactúan

�� , decidimos evaluar la co4localización de Hsp60, Bcy1 y Tpk1 en

condiciones normales y en estrés térmico. Para ello, a partir de una cepa que

sobreexpresa la proteína recombinante Hsp604HA4His realizamos

preparaciones de fracción mitocondrial cruda por centrifugación diferencial de

un cultivo sometido a estrés térmico (2 horas, 37ºC) y de un cultivo en

condiciones normales de crecimiento. Mediante �� se determinó la

presencia de Bcy1, Tpk1 y Hsp604HA4His en las distintas fracciones

correspondientes a los diferentes pasos de centrifugación. Como control se

determinó la presencia de Pyk1 como marcador de proteínas citoplasmáticas y

de Pma1como marcador de proteínas integrales de membrana. En la Figura

II.14 se observa que Hsp60 se halla tanto en las fracciones citoplasmáticas

como en la fracción mitocondrial cruda (Mit (sbn) y Mit (pellet)) en condiciones

normales de crecimiento y a 37ºC. En levaduras se ha descripto que la

chaperona Hsp60 tiene una localización exclusivamente mitocondrial [269]. La

proteína es codificada por un gen nuclear [185] para luego ser traducida en el

citosol como un precursor el cual posteriormente es translocado a la

mitocondria y procesado proteolíticamente [270]. La presencia de Hsp604HA4

His en el citoplasma puede deberse a la acumulación de la proteína

sobreexpresada que no pudo ser translocada hacia la mitocondria. Sin

embargo, tomando como referencia los datos presentes en la literatura que

hemos mencionado anteriormente, en los cuales se ha demostrado que esta

chaperona está involucrada en numerosos procesos celulares extra

mitocondriales, no podemos descartar la posibilidad de la existencia de un��

citoplasmático de Hsp60. También podemos observar que cuando las células

Capítulo II 156

se someten a estrés térmico aumentan los niveles de Hsp604HA4His en la

fracción mitocondrial cruda (Mit (pellet)).

En la Figura II.15 observamos que Bcy1 se encuentra tanto en las fracciones

citoplasmáticas como en la fracción mitocondrial y además los niveles de Bcy1

en la fracción mitocondrial aumentan frente al estrés térmico. Para Tpk1 se

observa que solo después de someter a las células al estrés térmico se

observa presencia de Tpk1 en la fracción mitocondrial cruda. Resultados

preliminares de nuestro laboratorio obtenidos por microscopía de fluorescencia

utilizando una cepa que expresa Tpk14GFP y sometiendo a las células a estrés

térmico de 37ºC durante distintos tiempos (5, 10 y 15 minutos), sugieren que

Tpk1 se localiza en la mitocondria después del estrés térmico.

Figura II.15. Localización subcelular de Hsp60%HA%His, Bcy1 y Tpk1 mediante

centrifugación diferencial. La cepa Hsp604HA4His fue crecida en YP Galactosa 2% a 30ºC

hasta alcanzar una DO600nm. Luego las células fueron incubadas durante 2 horas a 30ºC o a

37ºC (estrés térmico). Los extractos proteicos se sometieron a una centrifugación diferencial

para obtener las distintas fracciones subcelulares, tal como se detalla en la Sección Materiales

y Métodos. Las muestras fueron sembradas en �)��'�4 y el revelado se realizó utilizando

anticuerpo anti4HA, anti4Pma1, anti.Pyk1, anti4Bcy1 c4terminal o anti4Tpk1 según corresponda.

Como control de carga se muestra una sección de las membranas post4transferencia teñidas

con Rojo Punceau. �6<992 sobrenadante 6<99&�; �5999��59992�sobrenadante y pellet del

5�999&�, respectivamente; � � E��:�� E��:2 sobrenadante y pellet (fracción mitocondrial

cruda) del 65�999&�.

Capítulo II 157

Si bien hasta el momento no se había descripto aun la presencia física de PKA

dentro de la mitocondria, diversos trabajos demuestran la participación de la

enzima en diferentes procesos biológicos que ocurren en esta organela. En

mamíferos, se han descripto diferentes AKAPs mitocondriales, pero estas

AKAPs anclan a la PKA en la membrana exterior mitocondrial [88,271,272].

Los resultados obtenidos a partir del fraccionamiento subcelular no nos

proveen la información necesaria para asegurar la presencia de Bcy1 y Tpk1

dentro de la mitocondria, ya que las preparaciones utilizadas corresponden a

fracciones mitocondriales crudas. Para la PKA tipo I y II de mamíferos, se

demostró que se encuentran localizadas en la membrana externa mitocondrial.

Como se mencionó en la introducción de este capítulo, en levaduras se ha

demostrado que la PKA fosforila a la proteína Tom70, que forma parte del

complejo de importación TOM. Tom70 se encuentra anclada en la membrana

externa mitocondrial y está involucrada en la importación de ciertos

precursores mitocondriales. El sitio de fosforilación para la quinasa se

encuentra expuesto hacia el citoplasma y la fosforilación de Tom70 impide la

interacción con la chaperona Hsp70 encargada de transportar ciertos

precursores hacia la mitocondria [181]. Estos resultados apoyan la idea de que

en levaduras las PKA podría encontrarse localizada cerca de la membrana

externa mitocondrial.

Existen además resultados publicados en la literatura que demuestran la

interacción de Hsp60 y la proteína fosfofructoquinasa 1 (Pfk1) (proteína

citoplasmática) de levaduras [273] [193], lo cual indica que es posible la

interacción de Hsp60 con proteínas citoplasmáticas. Una propuesta sería que

Hsp60 se una a Bcy14Tpk en citoplasma y las transportara hacia la membrana

mitocondrial y este proceso podría ser regulado por estrés térmico.

�

�

II.2.7. Relevancia fisiológica de la interacción Bcy1%Hsp60

Tomando en cuenta estos antecedentes y nuestros resultados que sugieren

una interacción �� (proteómica y co4localización) e �� (�� de

péptidos y ensayos de ��) entre PKA y Hsp60, nos planteamos como

próximo objetivo determinar si la actividad de la PKA de levaduras y los niveles

Capítulo II 158

de la proteína Tpk1 se encuentran regulados por esta chaperona. Para abordar

este objetivo utilizamos la cepa HSP60ts, la cual cuando crece a la temperatura

no permisiva (37ºC) presenta una proteína no funcional. Las cepas HSP60ts y

HSP60wt se crecieron toda la noche a 30ºC en el medio adecuado. Luego se

sometieron los cultivos a la temperatura no permisiva (37ºC) durante distintos

períodos de tiempo. Para cada tiempo se ensayó la actividad quinasa

dependiente de cAMP en el extracto crudo utilizando kemptido como sustrato y

se determinaron los niveles endógenos de Tpk1 mediante ��. Como

control se determinaron los niveles proteicos de Pyk1.

En la Figura II.16 se observa que la actividad quinasa dependiente de cAMP

para la cepa salvaje disminuye levemente cuando las células se encuentran

37ºC. Griffioen �� han demostrado que, cuando las células de levaduras que

están creciendo en un medio con glucosa como fuente de carbono son

sometidas a un estrés térmico, hay un redistribución de Bcy1 desde el núcleo

hacia el citoplasma y una consecuente hiperfosforilación de los �� de

serinas I y II presentes en el extremo amino terminal de la proteína [119]. Se

observó que esta redistribución e hiperfosforilación de Bcy1 no afecta la

actividad quinasa de la holoenzima. Hasta el momento, estos son los únicos

datos presentes en la literatura que describen el comportamiento de PKA frente

a este tipo de estrés. Nuestros resultados concuerdan con estas observaciones

ya que los niveles de actividad quinasa registrados mostraron poca variación a

lo largo del experimento.

En cambio, para la cepa HSP60ts la disminución en la actividad quinasa es

mucho más marcada que en la cepa salvaje. En este caso, hay un descenso

notable de la actividad a medida que aumenta el tiempo de estrés térmico,

llegando a niveles de actividad quinasa que descendieron hasta un 70% con

respecto al tiempo inicial.

Los niveles de Tpk1 acompañan la cinética observada para la actividad

quinasa: en la cepa salvaje los niveles de Tpk1 se mantiene constantes

respecto al tiempo cero, y en la cepa mutante los niveles de Tpk1 descienden a

lo largo del tiempo. Como control, evaluamos los niveles de la proteína Pyk1 y

pudimos observar que los mismos se mantienen constantes tanto en el caso de

la cepa HSP60wt como en la cepa HSP60ts. Estos resultados sugieren que la

Capítulo II 159

unión de Hsp60 a Tpk1 podría favorecer el mantenimiento de la estructura de la

quinasa y asegurar de esta forma su actividad catalítica.

Capítulo II 160

Figura II.16. Niveles proteicos de Tpk1 y actividad quinasa en ausencia de Hsp60. Las

cepas HSP60wt y HSP60ts se crecieron toda la noche en medio mínimo a 30ºC. Las células

fueron sometidas a la temperatura no permisiva (37ºC) por distintos períodos de tiempo. De

cada tiempo se preparó un extracto crudo el cual fue ensayado para la determinación de

actividad quinasa dependiente de cAMP utilizando kemptido como sustrato (C). Cada fracción

fue analizada por �)��'�4 �'�4 y �� y el revelado se realizó utilizando

anticuerpo anti4Pyk1 (A) o anti4Tpk1 (B) según corresponda. La cuantificación de Pyk1 y Tpk1

se realizó por análisis digital de imagen y cuantificado por densitometría. La intensidad de las

bandas detectadas por %�� se relativizó a la cantidad proteína sembrada. Los gráficos

corresponden a un experimento representativo.

Capítulo II 161

Como hemos demostrado en la Figura II.16, la actividad quinasa dependiente

de cAMP disminuye en aquellas células que presentan la proteína Hsp60 no

funcional (es decir, en la cepa HSP60ts incubada a 37º). Como hemos

mencionado anteriormente en este mismo apartado, se ha descripto tanto en

mamíferos como en levaduras, una relación funcional entre distintas

chaperonas y quinasas. Específicamente, se ha demostrado que el par Hsp40

(Ydj1)4Hsp70 protege los polipéptidos nacientes de Tpk2 evitando así su

degradación, y además controla la velocidad de maduración de esta isoforma

[179].

Nuestros resultados sugieren una posible relación funcional entre Tpk1 y

Hsp60. En ausencia de esta chaperona los niveles proteicos de la isoforma

Tpk1, así como también la actividad quinasa dependiente de cAMP, se ven

afectados negativamente. El abordaje experimental utilizado no nos permite

concluir si el descenso en la actividad quinasa es sólo a causa de la pérdida de

actividad de la isoforma Tpk1. No descartamos la posibilidad de que las

isoformas Tpk2 y Tpk3 también sean blancos de Hsp60. Tampoco podemos

concluir respecto a si la protección de Hsp60 sobre Tpk1 es a nivel de la

proteína que está siendo sintetizada o sobre la proteína preexistente.

Teniendo en cuenta estos últimos resultados obtenidos planteamos que en el

citoplasma y/o en las cercanías de la mitocondria existiría el complejo Hsp604

PKA, formado por la interacción entre la chaperona y Bcy1. Por lo tanto Hsp60

podría tener dos funciones: darle estabilidad a la quinasa en las fracciones

citoplasmáticas y por otro lado localizaría a la quinasa en la membrana externa

mitocondrial para permitir la regulación del transporte de proteínas

mitocondriales frente a un estímulo de glucosa o frente a un estrés térmico (ver

Conclusiones en esta sección).

II.2.8. Red de interacción de Bcy1

A partir de nuestros resultados obtenidos por proteómica, bioinformática y

ensayos bioquímicos, y tomando los datos de interacción que se encuentran en

la base de datos BioGRID, construimos una red de interacción de Bcy1 que se

muestra en la Figura II.17. Esta red de interacción se construyó utilizando sólo

Capítulo II 162

las interacciones físicas descriptas en la literatura, las cuales incluyen captura

de afinidad4MS, captura de afinidad4�� y doble híbrido. No se tuvieron en

cuenta las interacciones genéticas ni los efectos bioquímicos de una proteína

sobre otra.

Esta red nos permite observar que las proteínas identificadas como interactoras

de Bcy1 también interactúan entre ellas, lo cual genera redes más complejas

que agrupan proteínas con una función biológica similar y proteínas que

participan en una misma vía de tansducción de señal (Tabla II.7). Como

ejemplos puntualizamos que Bcy1 se encuentra formando parte del complejo

compuesto por Gpa24Gpb14Cyr14Ira24Ras1/2, que son proteínas involucrados

en la transmisión de la señal del estímulo de glucosa, o con proteínas

involucradas en el metabolismo de la glucosa, como Pfk1 y Gph1. También

encontramos a la subunidad regulatoria participando del complejo formado por

las chaperonas Ssa1, Hsp82, Hsc82 e Ydj1, lo cual refuerza la idea de la

interacción entre la PKA y las chaperonas moleculares. Finalmente se puede

observar que Bcy1 también interactúa de manera directa con distintas

proteínas mitocondriales como Ilv5 y Kgd1.

Esta red de interacción demuestra que PKA interactúa con diferentes proteínas

involucradas en diversos procesos biológicos. Esto sugiere la necesidad de un

mecanismo que sitúe a la holoenzima cerca de los diferentes sustratos para

responder rápidamente a las señales extracelulares. La interacción de Bcy1

con las proteínas de anclaje, que al mismo tiempo pueden participar en la

transducción de la señal, sería una manera efectiva de asegurar una correcta

transmisión de la señal.

Capítulo II 163

GO Proceso biológico Proteína 7�� ?�� C��7�� Ira2

Gpb1 Bcy1

7��@� Ira2 Hsc82 Rim15 Ssa1

0C��I�� ,�� ?�� 7�� Ras1/2 Bmh1 Tpk1/2/3 Cyr1

�� ?�� Bmh1 Gph1 Gdb1

.�� ?�� Bmh1 Asc1 Gpa2

#�� $�� Bmh1 Gpb1 Gpa2

�C�� D� �� Bmh1 Cpa2 Ura2 Aco1 Ilv5 Pdc1

.�$�� ?��C�� Yak1 Tpk1/2/3 Rim15

0C��I�� ,�� ?�� Gpb1 Asc1

�� ?�� Rpl1 Eft2

" �C�� *�� ?��=')��

Ald6 Ald4

��@� *��?� � Pgk1 Fba1 Tdh3 Pfk1 (glucólisis)

7�� ?�� ?�� Spt5 Rpo21

�� ?�� Aco1 Ilv5 Abf2

# ��#'� Aco1 Kgd1

�� Ald4 Pdc1

Capítulo II 164

�!�� .) �� &�� C��

��>��>��6��89�;�36�

) �� 6�;�36�

7�� ?��I�� .�6�

�� #��6�

�I�� ,�� ?��C��C�� #��6�

)$�$�� ?��C�� 6�

" �C�� D� �� .��

Tabla II.7. Procesos biológicos en los cuales se encuentran involucradas las proteínas

que forman el interactoma. GO: Gene Ontology. Los datos se obtuvieron de la base de datos

BioGRID.

Figura II.17. Interactoma de Bcy1. Las proteínas identificadas por nosotros como intercatoras

de Bcy1 se muestran en color rojo. La interacción de estas proteínas con Bcy1 se representó

con una línea sólida, mientras que la interacción entre estas proteínas con otros componentes

de la red se encuentra representada con una línea punteada. Estas últimas interacciones

surgieron luego del análisis de las interacciones descriptas en la base de datos del genoma de

levaduras (SGD). La interacción entre las Tpks con Bcy1 se muestra con una línea sólida

celeste. Aquellas proteínas que forman parte de la red pero que no han sido identificadas por

nosotros se encuentran coloreadas y con bordes punteados. La distancia proteína4proteína es

arbitraria y no se corresponde con el grado de interacción.

Capítulo II 165

Capítulo II 166

II.3% Conclusiones

Los sistemas para la comunicación celular transmiten la información a través

de modificaciones post traduccionales rigurosamente controladas. La

fosforilación de proteínas es una de las modificaciones post traduccionales más

comunes y se encuentra regulada por las acciones opuestas de diferentes

proteínas quinasas y fosfatasas específicas. Estas proteínas tienen un rol

central en los caminos de transducción de señales y difieren en la especificidad

de sustrato, actuando sobre residuos de serina, treonina o tirosina. Debido a

que la fosforilación de proteínas afecta varios procesos celulares, su regulación

debe ser específica y debe actuar sobre un grupo definido de blancos celulares

para asegurar la fidelidad de la señal. La especificidad se logra por el

ensamblaje de distintos complejos enzimáticos en localizaciones subcelulares

definidas a través de las proteínas de anclaje y andamiaje. Esta organización

permite la regulación espaciotemporal de la señalización celular y constituye el

concepto por el cual un camino de señalización común puede derivar en

diferentes funciones.

En el caso particular de la vía de señalización del cAMP, el control temporal

depende, entre otras cosas, de la asociación a proteínas de anclaje que

aseguran la especificidad de la transducción de la señal ubicando a la

holoenzima cerca de sus efectores y sustratos. En mamíferos, las proteínas de

anclaje de la PKA proveen los medios para llevar a cabo el control espacial de

la señal y facilitar el control temporal posicionando adecuadamente a la PKA en

las cercanías de los microdominios de cAMP.

Los mecanismos de localización de la PKA de � �� no se encuentran

aun totalmente dilucidados. Como mencionamos anteriormente, la fuente de

carbono afecta la distribución celular de las subunidades catalíticas y

regulatorias de la PKA de levaduras [72]. Hasta el momento, Zds1 es la única

proteína descripta que afecta la localización de Bcy1 cuando las células están

creciendo en ausencia de glucosa.

Todas las AKAPs de mamíferos presentan una α4hélice anfipática de 14418

residuos. Los residuos hidrofóbicos presentes en esta estructura son claves

para la interacción con el dímero de RI o RII. Sin embargo, las proteínas de

anclaje duales presentan un segundo sitio de unión. Dicho sitio está compuesto

Capítulo II 167

por una región de la proteína que presenta una estructura de α hélice, y

residuos con carga positiva que participan en la interacción. En el caso de las

proteínas analizadas en esta sección que interactúan con Bcy1, si bien se

predice una α4hélice anfipática, la presencia de residuos hidrofóbicos resultó

desfavorable para la interacción con Bcy1, mientras que los residuos con carga

positiva resultaron claves. A partir de los resultados obtenidos en los ��

surge como conclusión que el dominio aminoterminal de Bcy1 participa en la

interacción con las secuencias derivadas de las proteínas candidatas que unen

Bcy1, ya sea porque la falta de dicho dominio previene la dimerización y se

pierde la interacción o por la falta de residuos necesarios para la interacción.

Un análisis bioinformático realizado por nuestro laboratorio indica que la

superficie de contacto de Bcy1 con el dominio AKB sería más polar que la que

se encuentra en la R de superiores [274]. Por lo tanto, sería razonable pensar

que la interacción entre Bcy1 y las posibles AKAPs de levaduras no tenga una

naturaleza hidrofóbica, sino más bien polar. En estos momentos se están

realizando en el laboratorio estudios bioinformáticos para modelar la posible

interacción péptidos interactor4Bcy1.

En esta parte de la tesis hemos demostrado que péptidos derivados de

distintas proteínas identificadas por proteómica y bioinformática, interactúan

con Bcy1. Estas interacciones fueron corroboradas por ensayos de ��

� ��. Basándonos en los antecedentes que se encuentran en la literatura, nos

resultó interesante profundizar en la interacción entre Bcy14Ira2 y Bcy14Hsp60.

Para estos dos pares de interactores encontramos que:

• Bcy1 co4fracciona e interactúa �� con Ira2.

• Péptidos derivados de Ira2 que presentan sitios consenso para PKA son

fosforilados �� por mezcla de Tpks.

• Hsp60 y Bcy1 se encuentran co4localizando en la fracción

correspondiente al citosol y en la fracción mitocondrial y los niveles de

Bcy1 aumentan en esta última fracción luego de someter a las células a

un estrés térmico. Tpk1 se detecta en la fracción mitocondrial cruda

luego del estrés térmico.

Capítulo II 168

• La ausencia de Hsp60 provoca una disminución en los niveles proteicos

de Tpk1 y en la actividad quinasa dependiente de cAMP.

Estos resultados reflejan una posible relación funcional entre la PKA y las

proteínas Hsp60 e Ira2.

Si bien ninguna de estas proteínas presenta las características clásicas

presentes en las AKAPs de mamíferos, se ha demostrado claramente la

interacción con Bcy1. Para esta interacción son de gran importancia los

residuos básicos presentes en los péptidos derivados de estas proteínas, y

además se demostró que el extremo amino terminal de Bcy1 participa en esta

interacción y en la dimerización. Las características de este dominio de

interacción son similares al dominio RISR presente en las AKAPs de

especificidad dual, las cuales presentan este dominio además de la α hélice

anfipática característica de las AKAPs de mamíferos. El dominio RISR actuaría

en forma sinérgica a la α hélice anfipática para incrementar el anclaje de la

PKA tipo I.

La proteína Bcy1 podría hacer interacción con dos dominios de las proteínas de

anclaje, y tal vez nosotros hemos detectado y caracterizado uno de estos

dominios.

La presencia de otro dominio con las características del dominio canónico de

las AKAPs parece difícil de identificar, ya que a pesar de haber realizado

análisis bioinformáticos con secuencias consenso de AKAPs no hemos podido

identificar estos motivos en las proteínas estudiadas.

En el caso de la interacción Ira24Bcy1, la ubicación de PKA cerca del lugar

donde se recibe el estímulo, asegura en primera instancia la pronta activación

de la holoenzima. Tomando en cuenta los antecedentes reportados en la

bibliografía y los resultados expuestos en esta sección podríamos plantear que

en una situación sin glucosa en el medio, Gpb1/2 se encuentra unida a PKA a

través de su interacción con las Tpks y favoreciendo la formación de la

holoenzima [244] (Figura II.18 (1)). Esta interacción evita que las Tpks ejerzan

su acción inhibitoria sobre una quinasa aun no conocida que puede fosforilar a

Bcy1 en el �� II de serinas, impidiendo de esta manera la disociación de la

holoenzima [253,254]. Se ha propuesto que esta fosforilación sobre Bcy1 le

confiere estabilidad a la pro

inhibir a las Tpks [253]. Ad

favorecería la interacción

residuos básicos presentes

ausencia de glucosa los niv

glucosa se une al receptor

GTP en Gpa2 y en la prote

Gpa24GTP y Ras4GTP es

ciclasa. El cAMP generado

PKA, provocando la disocia

de glucosa las proteínas G

aun desconocido), pierden

inhibir a la quinasa respon

disminución de los niveles d

a Ira2 y la estabilizan, aum

subunidades catalíticas act

presentes en Ira2 (Figura II

unión con Ras y/o con Gpb

Ras4GAP de Ira2 para ate

modo, se daría una regulac

por un lado a la inactivación

vía Ras) y por el otro lado a

de Gpb1/2 sobre las Tpks

consecuente apagado de la

II.18.

Figura II.17. Modelo propues

Harashima, T. et al 2006).

(2): Budhwar et al (2010 & 2011)

dad a la proteína, de forma tal que se encuentra disp

. Además, la fosforilación de la subunidad

interacción de la PKA con la proteína Ira2 a tra

s presentes en el dominio de unión (nuestros resu

cosa los niveles de la proteína Ira2 son bajos [241]

al receptor Gpr1 (Figura II.18 (2)) ocurre el interca

en la proteína Ras, en este último caso por acción

GTP estimulan la producción de cAMP por l

P generado puede unirse a las subunidades regula

o la disociación y la activación de la holoenzima. E

proteínas Gpb1/2 se encuentran inhibidas (por un

o), pierden la interacción con las Tpks y éstas pu

asa responsable de la fosforilación de Bcy1, favo

los niveles de Bcy1 [253]. En estas condiciones, Gpb

bilizan, aumentando los niveles proteicos de la pr

talíticas activadas podrían fosforilar las serinas 10

a2 (Figura II.18 (3)). La fosforilación de Ira2 podría e

y/o con Gpb1/2, como así también podría estimular

a2 para atenuar la actividad de la adenilato ciclas

na regulación a través de un $�� negativo, q

inactivación directa de la adenilato ciclasa (a través

el otro lado a la inactivación sobre la PKA (a través d

re las Tpks y sobre el estado de fosforilación de Bc

agado de la señal. Todo lo planteado se resume e

lo propuesto para la interacción entre Ira2 y Bcy1 (

: fosfatos; círculos rojos: cAMP; (1): Peeters et a

2011) [253,254]. Ver detalles en el texto.

Capítulo II 169

cuentra disponible para

subunidad regulatoria

Ira2 a través de los

uestros resultados). En

[241]. Cuando la

re el intercambio GDP4

o por acción de Cdc25.

cAMP por la adenilato

ades regulatorias de la

loenzima. En presencia

as (por un mecanismo

y éstas pueden ahora

Bcy1, favoreciendo la

iciones, Gpb1/2 se une

os de la proteína. Las

s serinas 1018 y 1745

ra2 podría estabilizar la

a estimular la actividad

nilato ciclasa. De este

negativo, que llevaría

sa (a través de la señal

A (a través de la acción

lación de Bcy1), con el

se resume en la Figura

y Bcy1 (Adaptado de

Peeters et al (2006) [244];

Capítulo II 170

Capítulo II 171

Se ha demostrado que las chaperonas están íntimamente relacionadas con el

plegado y la estabilización de distintas proteínas quinasas, estabilizando la

proteína madura o su precursor. La interacción entre Bcy1 y Hsp60, ya sea en

el citoplasma como en la mitocondria, podría tener como finalidad mantener

próximas las subunidades catalíticas con las chaperonas. De esta manera, se

mantendría la funcionalidad de la quinasa asegurando una respuesta rápida y

eficiente de la PKA frente al estímulo.

Se ha demostrado que la PKA regula negativamente el sistema de importación

mitocondrial a través de la fosforilación del receptor Tom70. Esto indica que la

PKA está involucrada en la regulación de las proteínas mitocondriales y que es

necesaria la localización de la holoenzima cerca de la mitocondria.

En base a los resultados obtenidos y a los antecedentes antes mencionados

proponemos que una de las consecuencias de la interacción Hsp604Bcy1 sería

acercar a PKA a la mitocondria. Cuando las células se encuentran en presencia

de glucosa el ATP se genera por la fermentación de este azúcar. En estas

condiciones la importación de preproteínas mitocondriales así como la actividad

mitocondrial debe disminuir. Este control ocurre a nivel de la fosforilación del

receptor Tom70 por PKA: la PKA que se encuentra localizada cerca de la

membrana mitocondrial gracias a su interacción con Hsp60 se activa como

consecuencia del estímulo de glucosa, las Tpks fosforilan la Ser174 de Tom70

y esta fosforilación impide que Hsp70 interactúe con Tom70 y se inhibe de esta

manera la importación de las preproteínas mitocondriales (Figura II.18) [181].

Otra situación en la cual la importación de preproteínas hacia las distintas

organelas se ve impedida es cuando las células se enfrentan a un estrés

térmico, esto previene la agregación de proteínas mal plegadas en los distintos

compartimentos subcelulares. Se demostró que en estas condiciones las

preproteínas que se encuentran interactuando con las chaperonas no son

liberadas y quedan unidas a éstas hasta que las condiciones vuelven a ser las

adecuadas [275]. Particularmente para Hsp70, se ha demostrado que en esta

situación la chaperona puede actuar como una “sostenedora”, previniendo la

liberación de los sustratos unidos bajo condiciones que favorecerían su

agregación. Nuestros resultados indican que frente a un estrés térmico Hsp60,

Bcy1 y Tpk1 aumentan su localización en la fracción mitocondrial. Proponemos

que durante el estrés térmico, Hsp60 dirige a la PKA hacia la membrana

Capítulo II 172

mitocondrial y allí, una vez activada podría fosforilar a Tom70 para inhibir la

importación de precursores mal plegados hacia la mitocondria y, por otro lado,

evitar su agregación.

También hemos demostrado que en ausencia de Hsp60, tanto los niveles de

Tpk1 como la actividad PKA disminuyen. Esto sugiere que otra posible función

de la interacción Hsp604Bcy1 es la de acercar a la chaperona a las Tpks para

colaborar con el plegado de las mismas y con la mantención de su estabilidad

inmediatamente después de sus síntesis y previo a la unión con la subunidad

regulatoria.

Figura II.18. Posible rol para la interacción entre Hsp60 y Bcy1 (Adaptado de Rao, S ��,

2011). �-�2� membrana externa mitocondrial; �-�2� translocasa de la membrana externa

mitocondrial; círculos rojos: cAMP.

Resulta interesante que tanto en el estímulo por glucosa como en el estrés

térmico, los �� de serina I y II de Bcy1 resultan hiperfosforilados. Esta

distribución de cargas negativas sobre el extremo amino terminal de la

subunidad regulatoria permitiría la interacción con los residuos básicos en los

péptidos sobre estas proteínas que demostramos interactúan con Bcy1.

��

�

��!!��$$""��!!�� $$��

Conclusiones Generales 174

Para comprender en profundidad cómo es regulado el mecanismo de

activación de la PKA, es necesario conocer en detalle los factores involucrados

en el reconocimiento de la enzima por el sustrato, así como también aquellos

que facilitan la rápida y eficiente transmisión de la señal a través de la

localización de la holoenzima en lugares estratégicos en el interior celular. En

esta Tesis hemos avanzado en la caracterización del sitio de reconocimiento de

la PKA así como también en las proteínas que hacen interacción con la

holoenzima a través de la subunidad regulatoria acercándola a sus proteínas

sustrato.

En el Capítulo I de esta Tesis planteamos como principal objetivo determinar

las características de la estructura primaria que rodea al sitio de fosforilación

de la PKA de � � �� para comprender más en detalle cuáles son los

determinantes que hacen que un péptido o proteína sea mejor sustrato que

otro. Hemos confirmado resultados que han sido previamente sugeridos en la

literatura, como que la Arg en posición P42 y P43 son determinantes

importantes del sitio de fosforilación y que cargas positivas extras en la región

que flanquea al extremo N4terminal de P0 son beneficiosas para el

reconocimiento del sustrato. Además hemos demostrado que la presencia de

un sitio Arg4Arg4X4Ser no es suficiente para que el sustrato sea reconocido

como tal por la enzima, ya que un sitio con esa secuencia pero con residuos

ácidos en posición P+1 no es reconocido como buen sustrato. El mejor sustrato

posee un residuo ácido en la posición P+4, tal como ocurre en el IS de las

subunidades R de hongos. Estas características deberían ser incluidas en los

programas de predicción de sitios de fosforilación para PKA de levaduras.

Hasta el momento, para las tres isoformas de la subunidad catalítica de la PKA

de � �� se han demostrado roles fisiológicos diferentes y redundantes.

Además, el trabajo publicado donde se realizó un análisis global de los sitios de

fosforilación en levaduras indica que cada Tpk reconoce una gran cantidad de

sustratos únicos.

Nuestros resultados provenientes del análisis de las proteínas Nth1, Pyk1 y

Pyk2, descriptas como sustratos únicos para Tpk1, indican que el

comportamiento cinético de Tpk1 y Tpk2 hacia estos sustratos fisiológicos es el

mismo para ambas isoformas. Este comportamiento cinético se observó tanto


para las proteínas enteras como para sus péptidos derivados que poseen el

sitio de fosforilación. También hemos demostrado que la actividad catalítica

entre ambas isoformas es idéntica.

Según se puntualizó en la Introducción, el anclaje de la PKA y la existencia de

microdominios de cAMP proveen un mecanismo para controlar la especificidad

temporal y espacial de la vía cAMP4PKA.

Si bien Tpk1 y Tpk2 muestran la misma selectividad de sitios �� , no

necesariamente pueden fosforilar el mismo sustrato �� . Las diferencias en

la localización de la quinasa y el sustrato deben contribuir al reconocimiento de

este último por una de las isoformas, lo que permitiría explicar por qué cada

variante de las Tpks tiene una función fisiológica única.

Finalmente también demostramos la participación del sustrato, tanto como

péptido como proteína completa, en la sensibilización de la PKA por cAMP. Si

bien este concepto había sido probado para la holoenzima de mamíferos,

hemos avanzado en este punto demostrando que existe una correlación entre

el comportamiento de los péptidos como sensibilizadores de la activación por

cAMP de la PKA y su comportamiento como sustrato. Los mejores sustratos

actuaron también como mejores sensibilizadores. Esto sugiere que la

sensibilización ocurre a nivel de la competición entre el sustrato y la región IS

de la subunidad regulatoria. Utilizando la proteína Pyk1 pudimos observar que

las proteínas completas resultan mejores activadores que el péptido derivado

conteniendo la secuencia de fosforilación, sugiriendo la participación de otros

puntos de contacto entre R y C.

Mediciones de actividad PKA �� en células permeadas de levaduras,

indican que de la actividad total de PKA presente en la célula sólo se puede

determinar el 1% o 2% de la misma, indicando que existe un efecto inhibitorio

de la actividad PKA dentro de la célula dado por la misma subunidad

regulatoria [152]. Esto sugiere que la PKA no está libremente accesible al

péptido empleado en el ensayo �� . La concentración local del sustrato y del

cAMP son claves para el mecanismo de activación de la holoenzima. La

disponibilidad del sustrato y cómo el mismo sensibiliza a la holoenzima frente al

cAMP pueden ser considerados como un mecanismo fino de regulación en la

activación de la PKA.


Tratando de avanzar en el entendimiento de la especificidad de la respuesta, el

objetivo planteado en el Capítulo II fue la búsqueda, identificación y

caracterización de posibles proteínas de anclaje para la PKA de levaduras.

Hemos identificado diferentes proteínas que se unen a la subunidad regulatoria

de levaduras, las cuales presentan distintas y variadas funciones y

localizaciones subcelulares.

En mamíferos se han descripto y caracterizado numerosas proteínas de

anclaje, las cuales interactúan con las subunidades R a través de un motivo

conservado formado por una α hélice anfipática presente en las AKAPs. La

cara hidrofóbica de esta hélice contacta con el surco hidrofóbico formado por

los dímeros de R. Sin embargo, nuestros resultados demuestran que en

�� la interacción entre las proteínas de anclaje con

Bcy1 presenta características diferentes respecto a lo que ocurre en

mamíferos. Demostramos que la presencia de residuos con carga positiva son

claves para la unión con Bcy1. Estas características son semejantes a las

demostradas para la interacción de R con las AKAPs duales de mamíferos, en

las cuales además de la α hélice anfipática existe otro punto de contacto sobre

la AKAP que es el dominio RISR, el cual presenta como determinantes claves

para la interacción residuos con carga positiva. El dominio que hemos

identificado como interactor con Bcy1 podría ser un segundo sitio de

interacción tal como ocurre con las AKAPs duales, o puede ser el único

dominio involucrado en esta interacción. Esta última posibilidad podría explicar

la dificultad en encontrar proteínas de anclaje en levaduras, ya que se ha

apuntado en general a la búsqueda de dominios con α hélices anfipáticas. Si

bien en los dominios de interacción definidos en el Capítulo II se pueden

predecir α hélices, los residuos hidrofóbicos no son importantes en la

interacción.

La interacción con las proteínas identificadas ocurre a través del extremo N4

terminal de R. Este extremo amino terminal es necesario para que la subunidad

regulatoria forme dímeros. Con los experimentos realizados en esta Tesis no

podemos concluir si la falta de dimerización es responsable de impedir la

interacción con las proteínas o si la interacción no ocurre por falta de los

residuos involucrados en la unión con las proteínas blanco.


En el extremo N4terminal de Bcy1 se han descripto dos regiones ricas en

serinas que varían su fosforilación según las condiciones nutricionales del

medio y el estrés. Proponemos que la presencia de grupos fosfato de las

serinas fosforiladas pueden ser los puntos de interacción con las cargas

positivas definidas como claves sobre las proteínas interactoras. El cambio en

el patrón de fosforilación podría tener como finalidad modular la interacción de

Bcy1 con estas proteínas.

Para avanzar en la caracterización de las proteínas interactoras se analizaron

distintos aspectos de la interacción entre Bcy14Ira2 y Bcy14Hsp60.

En el caso de la interacción Bcy14Ira2 determinamos que ambas proteínas co

localizan �� y que péptidos derivados de Ira2 son fosforilados por las Tpks

�� . Ira2 es una proteína que se encuentra involucrada en el apagado de la

señal de la vía del cAMP, a través de su actividad GAP sobre Ras. La

fosforilación de Ira2 por PKA podría colaborar con la regulación de la actividad

GAP de Ira2. En este caso, el mismo sustrato podría estar localizando y quizás

participando en la activación de la PKA para que ocurra una rápida y eficiente

transducción de la señal.

Como se ha mencionado en el Capítulo II, las chaperonas presentan otras

funciones además de ayudar al plegado de las proteínas. La unión de estas

moléculas a las proteínas quinasas mantiene la estabilidad de las mismas y

colabora con su maduración. Hemos demostrado que en ausencia de Hsp60

los niveles proteicos y la actividad quinasa de Tpk1 disminuyen

considerablemente. Esto sugiere que una de las posibles consecuencias de la

interacción Bcy14Hsp60 podría ser acercar a la chaperona a las Tpks para

mantener la estabilidad de la actividad quinasa.

Por otro lado observamos que la localización de Bcy1, Tpk1 y Hsp60 varían

durante el estrés térmico, ya que existe una re localización hacia la mitocondria

de estas tres proteínas. Cuando existe un estrés térmico la importación de

proteínas mitocondriales se detiene. Otra función de Hsp60 sería la de llevar a

la PKA hacia la membrana externa mitocondrial para regular mediante la

fosforilación de Tom70 la importación de proteínas hacia la mitocondria. Está

demostrado que durante el estrés térmico está disminuido el transporte

mitocondrial como consecuencia de que Hsp70 es incapaz de replegar


correctamente sus sustratos, y trabajaría como un reservorio de proteínas mal

plegadas para evitar su agregación.

Durante el estrés térmico aumenta la actividad PKA, y como demostramos,

ocurre una mayor localización de PKA en la fracción mitocondrial, lo cual podría

conducir a un aumento de la fosforilación de Tom70, y consecuentemente a

una reducción del transporte de proteínas mitocondriales, como ha sido

demostrado en condiciones de baja disponibilidad de glucosa.

Por lo tanto Hsp60 podría cumplir dos funciones: acercar a la PKA a la

mitocondria para que regule los sustratos involucrados en la importación

mitocondrial y, al mismo tiempo, ayudar a mantener la estabilidad de la

quinasa.

Si bien es necesario realizar más abordajes para determinar fehacientemente

que estas proteínas son homólogas en su función a las AKAPs de mamíferos,

los resultados obtenidos son muy prometedores al respecto. Resulta importante

remarcar que hasta el momento no hay proteínas de anclaje descriptas en

levaduras, a excepción de Zds1, y que este trabajo abre la posibilidad de un

estudio más profundo sobre este tema.

Los resultados obtenidos en esta Tesis demuestran que en ��

�� tanto la localización de PKA como el reconocimiento de los sustratos

depende fuertemente de la secuencia primaria de las proteínas de anclaje y de

los sustratos, respectivamente.

Debido a que las células de levaduras deben responder de manera rápida a los

cambios generados en el ambiente, es de suma importancia que todos los

componentes moleculares involucrados en la respuesta al estímulo se

encuentren compartimentalizados. El hecho de que un sustrato pueda activar y

localizar a la enzima que modifica su actividad es una manera de asegurar que

la señal se trasmita de forma rápida, específica y selectiva.

�

�� 11��

Perspectivas 180

A partir de los resultados obtenidos en esta Tesis quedan planteados distintos

interrogantes. Proponemos las siguientes tareas para poder profundizar en el

entendimiento de la regulación espacio4temporal de la vía cAMP4PKA de

levaduras:

4 Identificar nuevas proteínas de anclaje en levaduras. El tener un mayor

número de proteínas identificadas permitirá evaluar un consenso en el dominio

de unión a Bcy1.

4 En función de la definición de la secuencia consenso de interacción, diseñar

un péptido disruptor de la interacción Bcy14AKAPs en levaduras y evaluar su

efecto �� , analizando localización de Bcy1 (Bcy14GFP), y el efecto sobre

los niveles de activación de la enzima.

4 Análisis �� del dominio interactor de las AKAPs: se podrá comenzar con

Ira2, construyendo una cepa mutante con la deleción a nivel genómico en el

dominio de interacción, y analizar alteraciones en la localización y función en

respuesta a glucosa.

4 Estudios de co4localización, entre Bcy1,y proteínas AKAPs por

inmunofluorescencia , para lo cual deberán construirse cepas Bcy14GFP y

AKAP4RFP a nivel genómico.

4 Analizar si las proteínas identificadas como interactoras de Bcy1 son también

sustratos fisiológicos de la PKA de � �� e �� , y entre ellas

estudiar si Ira2 es fosofrilada por PKA �� y analizar cuál es el estímulo y la

consecuencia de esta modificación.

4 Análisis de la función de Hsp60 en la estabilización de la actividad PKA,

determinando si la misma es co4traduccional.

Perspectivas 181

4 Evaluar si el grado de fosforilación de Bcy1 es importante para la unión a

estas proteínas de anclaje. Se ha descripto en superiores que la fosforilación

en el sitio de autofosforilacion regula la interacción con las proteínas AKAPs

�

�

��88��

Apéndice 183

A.1. Tabla de AKAPs canónicas [92]

Apéndice 184

Apéndice 185

Apéndice 186

Apéndice 187

Apéndice 188

Apéndice 189

Apéndice 190

Apéndice 191

Apéndice 192

Apéndice 193

Apéndice 194

Apéndice 195

Apéndice 196

Apéndice 197

Apéndice 198

Apéndice 199

Apéndice 200

Apéndice 201

A.2. Tabla de AKAPs no canónicas [92]

Apéndice 202

A.3. Protocolo modificado de la purificación TAP para la obtención de fuente enzimática

Esquema de purificación de las subunidades catalíticas de levadura por la metodología

TAP. Extractos proteicos de la cepa BCY14TAP, TPK14BCY1TAP o TPK24BCY1TAP fueron

incubados con resina IgG4Sepharosa. Luego del agregado de cAMP se logró disociar la

holoenzima y obtener purificadas las subunidades catalíticas de levaduras. Ver detalles en

Materiales y Métodos.

Apéndice 203

A.4. Identificación de proteínas por espectrometría de masa

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Proteína e%value Score Matches Cobertura

Rpo21

8.3E404 175 25 18

Ura2 2.6E408 120 25 16 Rpb2 4.2E414 168 27 27 Spt5 5.3E407 107 15 15 Gph1 2.1E407 145 20 29

Hsp104 0.00048 111 15 26 Eft2 8.3E411 55 12 20 Pfk1 0.085 81 10 20

Vma2 0.00021 81 10 23 Pyk1 0.0043 68 8 23

Pdc1/2 0.016 62 8 18 Bcy1 3.3E407 109 11 31 Asc1 5.3E406 97 8 38 Rpl20 0.0025 70 5 32

Proteína e%value score matches %cobertura LIFT score expect

Gph1 0.0045 80 15 20 116 1.E407 Eft2 1.6E409 134 15 26 182 2.5E414 Pfk1 2.5E406 102 18 22 113 2E407 Bcy1 0.01 53 6 32 nd nd

Glc3

0.00013 85 8 16 12 0.29

Fas2 6.3E410 139 24 13 nd nd Pyc2 0.0048 69 13 26 26 0.017 Ala1 0.0063 68 13 19 86 9.8E405 Kgd1 0.02 63 14 17 nd nd Aco1 4E412 160 15 23 250 4E421 Hsc82 4E408 120 14 26 151 3.2E411 Ssa1 3.2E406 101 13 25 191 3.2E415 Icl1 0.025 62 8 16 nd nd

Hsp60 5.6E406 98 13 27 185 1.3E415 Ald6 0.022 62 8 21 150 4E411 Ald4 8E415 187 16 26 nd nd Idp2 8E408 117 12 20 nd nd Pgk1 5E409 129 12 23 nd nd Oye2 0.0032 71 8 23 nd nd Ilv5 1E408 126 11 39 nd nd

Fba1 0.029 61 5 13 nd nd Pet9 0.0008 77 8 25 nd nd

Rps1a 0.00018 84 7 43 nd nd Rps4b 0.08 57 6 23 nd nd

Apéndice 204

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Proteína E%Value score matches %cobertura LIFT score expect

Gph1 4.6E405 89 11 14 11 0.64 Bcy1 4E409 130 12 35 nd nd

Glc3

1.6E410 144 17 26 27 0.17

Hsc82 0.0033 71 7 31 37 0.0063

Gdb1

4E408 120 19 14 nd nd

Cpa2 0.018 63 17 8 nd nd Tdh3 0.009 66 6 18 99 2.1E409

Proteína E%Value score matches %cobertura Eft2 0.009 66 20 17

Pdc1/2 0.00056 73 8 25 Bcy1 5.4E406 110 13 26 Pyc2 0.0007 77 13 8

Hsc82 7.4E406 92 16 24 Ssa1 2.2E406 90 15 23

Hsp60 0.0074 62 6 14 Fks1 0.001 76 21 20 Gal7 0.0067 68 9 17 Cop1 0.00011 88 11 15 Myo2 0.1 40 8 7 Pgk1 0.0001 96 11 21

Proteína E%Value score matches %cobertura Hsc82 8E421 277 30 32 Pgk1 0.00037 70 12 19 Eno2 9.8E406 96 27 27

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