ESTADO DEL ARTE ESTADO DEL ARTE EN LAEN LA

MONITORIZACIMONITORIZACIÓÓN DE FN DE FÁÁRMACOSRMACOS

Monitorización de fármacos

EVA MENEVA MENÉÉNDEZ ALONSONDEZ ALONSOQIR de 2 año de BIOQUÍMICA

CLÍNICA17 de Marzo 2010

� FASE ANALÍTICA� MÉTODOS ANALÍTICOS� UTILIDAD DE LA DETERMINACIÓN DE

FÁRMACO LIBRE

� La evolución de TDM se ha visto facilitada por el desarrollo de nuevas técnicas analíticas de alta Sensibilidad y Especificidad

� MÉTODOS INMUNOQUÍMICOS� MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS� OTROS MÉTODOS� MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE FÁRMACO LIBRE

MÉTODOS INMUNOQUÍMICOS

INMUNOENSAYOS

� Técnicas que utilizan la reacción Ag-Ac para el aná lisis cualitativo/cuantitativo de sustancias en fluidos b iológicos

� Ac policlonales / Ac monoclonales� Competitivos / No competitivos� Heterogéneos / Homogéneos

� RIA ⇒⇒⇒⇒ Radioinmunoanálisis� FPIA ⇒⇒⇒⇒ Inmunoensayo de polarización fluorescente� MEIA ⇒⇒⇒⇒ Inmunoensayo por micropartícula� ECLIA ⇒⇒⇒⇒ Inmunoensayo electroquimioluminiscente � CMIA ⇒⇒⇒⇒ Inmunoensayo magnético quimioluminiscente � EMIT ⇒⇒⇒⇒ Inmunoanálisis de multiplicación enzimática � CEDIA ⇒⇒⇒⇒ Inmunoanálisis por clonado de dador

RADIOINMUNOANÁLISIS

� Años 60 RIA: permitió la cuantificación de fármacos en ng/ml � Inmunoanálisis heterogéneo/competitivo

� Usa isótopos radiactivos como marcaje

� Isótopos actividad específica elevada (125I, 14C, 3H)

� Inconvenientes◦ Gran complejidad◦ Larga duración◦ Problema de eliminación residuos◦ No se puede aplicar a todos los fármacos◦ Radioisótopos se degradan con el tiempo

FLUOROINMUNOANÁLISIS

� Inmunoensayo homogéneo/competitivode polarización fluorescente

◦ Usa 3 conceptos clave para la medición� Fluorescencia: Usa como marcador la

fluoresceína (absorbe luz 490nm y la libera a 520nm como luz polarizada)

� Rotación de moléculas en solución : distintas velocidades de rotación (grandes/lentas)

� Luz polarizada: distintas propiedades de polarización entre Ag-F y Ag-F-Ac

� Años 80 aparecen FPIA

ENZIMOINMUNOANÁLISIS

� Años 90 se introducen plataformas analíticas que consolidan los diferentes tipos de inmunoensayos de 3º generación

� EIA: utiliza las propiedades catalíticas del enzima para la cuantificación

� Enzima: alta actividad específica/no encontrarse en medio reacción◦ EMIT, CEDIA◦ El reactivo se conjuga con un enzima◦ Peroxidasa◦ Fosfatasa alcalina◦ Glucosa-6-P-deshidrogenasa◦ Β-galactosidasa

◦ Medición depende de inhibición, activación o cambio conformacional que sufra el enzima

En los últimos años investigando uso β-lactamasa y pirofosfatasa enzimas con altos números de recambio y buena estabilidad térmica

EMIT

� Homogéneo/Competitivo� Fundamento: la sustancia marcada se une al Ac específico

produciendo inhibición del enzima por impedimentos estéricos

� El enzima libre reacciona con un sustrato generando un producto coloreado

� Sensibilidad determinada por:� Cambios en la actividad enzima� Sustancias que interfieran en la

actividad enzimática� Constante de afinidad del Ac en la reacción

CEDIA

� EIA por clonado del dador: usa los principios de la tecnología recombinante

� Fundamento: fraccionamiento mediante técnicas de ADN recombinante, de la β-galactosidasa

� La sustancia a determinar se liga al dador evitando su unión al fragmento aceptor e inactivando el enzima

� Medición: tasa de hidrólisis

� EIA homogéneo mas sensibles (10-11mol/L)� Semiautomáticos/automáticos

� Bajos tiempos de procesamiento y preparación de la muestra

� Reactividad cruzada

EIA

� VENTAJAS� Alta sensibilidad� Múltiples ensayos� Fácilmente automatizables� Ampliamente utilizados

en laboratorios de rutina para monitorización de fármacos

� DESVENTAJAS� Medición de la actividad

enzimática en algunos casos compleja

� La actividad enzimática puede verse afectada

� Algunos ensayos homogéneos baja Sensibilidad

� Baja Especificidad, posible reactividad cruzada con metabolitos o pro-fármacos (SOBREESTIMACIÓN)

Farm. Hosp. Vol 30.Nº3 pp 142-148-2006

INMUNOENSAYO POR MICROPARTÍCULAS

� MEIA� Micropartículas de látex� Matriz de fibra de vidrio

� Enzima

� Detector de fluorescencia

� CMIA� Micropartícula magnética

� Imán� Compuesto quimioluminiscente

� Detector de quimioluminiscencia

� Reacción quimioluminiscente ofrece alta sensibilidad y facilidad para la medición.

� Técnicas no competitivas tipo sándwich� Micropartículas de fase sólida con Ac� El marcaje, etapa de separación y tecnología de medición difieren

ElectroquimioluminiscenciaECLIA

� Proceso en el que se generan especies reactivas en la superficie de un electrodo a partir de precursores estables (Ru), volviendo luego al estado basal mediante una reacción quimioluminiscente.� Sándwich/competitiva� El complejo tipo sándwich se fija a una fase sólida (micropartículas de

poliestireno)

� Se aplica una corriente eléctrica y se produce la reacción quimioluminiscente.� Rápido y sencillo

� Corto tiempo de análisis� Alta capacidad de amplificación de la señal

a partir de una molécula marcada.

� Bajos límites detección y ampliosintervalos de medición

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

� Técnicas de separación basada en las distintas velocidades de desplazamiento de los analitos, al ser arrastradas por una fase móvil a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria

� La separación se logra porque la movilidad de cada analito depende de un equilibrio en la distribución entre ambas fases en base a:� Cargas� Tamaño molecular� Polaridad….

� El proceso cromatográfico, se basa en una compleja

unión de fenómenos tales como hidrodinámica,

cinéticos, termodinámicos, química de superficiey difusión

Gran variedad de técnicas

� Varios sistemas de detección� UV� ESPECTROMETRÍA DE MASAS

� CROMATOGRAMA: recoge la respuesta del detector en función del tiempo que tardan los distintos compuestos en salir de la columna

� Tiempo de retención (cualitativo)� Área de pico (cuantitativo)

Amuestra= Área del analito en el cromatograma de la muestraAstandard= Área del analito en el cromatograma de la calibraciónISmuestra= Área del standard en el cromatograma de la muestra

ISStandard= Área del standard en el cromatograma de la calibraciónCStandard = Concentración que tiene el analito en la calibración

Concentración del analito µg/ml = (Amuestra x ISSt andard ) / (Astandard x ISmuestra ) x CStandard

CROMATOGRAFÍA GASEOSA

� Separación de compuestos volátiles que fluyen en una corriente gaseosa a través de una fase estacionaria fijada a una columna

� Fármacos: mayor aplicación la cromatografía líquido-gas (CGL).� Las columnas empacadas son bastante versátiles y permiten el análisis de un

amplio número de fármacos en fluidos biológicos.

� Las capilares otorgan mucho mayor eficiencia, sensibilidad y resolución

� Los detectores usados son versátiles y de alta sensibilidad: detector de ionización de llama (FID), detector de captura electrónica (ECD) y detector de espectrometría de masa (MSD).

� La optimización de la separación se realizavariando la naturaleza de fase móvil y

la temperatura de trabajo (isotérmica o programada).

� Permite separación del fármaco de sus metabolitos y posibles interferentes

� Se planteó la posibilidad de su implantación sistemática

o Principales ventajas de la CG: o El potencial de separación es enorme gracias a las columnas capilares

o La espectrometría de masa, como detector, le otorga la máxima especificidad y gran sensibilidad

o Cuenta con una escala unificada de tiempos de retención

� La necesidad de:◦ Grandes volúmenes de muestra◦ Derivatización química para garantizar la volatilidad del analito◦ Pretratamiento antes de aplicar la técnica cromatográfica.

� Supuso un freno en su implantaciónen laboratorio clínico

HPLC

� Los componentes de la muestra son llevados a través de la f. estacionaria mediante el flujo de una f. móvil a alta presión

� Para el análisis de los fármacos la técnica más empleada es la Fase Reversa

� Los eluyentes más usados, son mezclas de agua o tampones con metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano.

� Los detectores más empleados: VIS-UV, fluorimétrico, electroquímico y MS

� Es posible trabajar de forma isocrática (una fase móvil) o en gradiente (se varía polaridad, fuerza iónica o pH).

� Características:� Selectividad� Reproducibilidad� Sensibilidad� Rapidez

� Parámetros:� Naturaleza de la f.

estacionaria� Tamaño de partícula� Eluyente (composición y flujo)� Detector

� Tipos :� Fase Directa� Fase Reversa

� Técnica versátil con mínima preparación y bajos volúmenes de muestra

� Eficiencia máxima a bajas velocidades de flujo, bajo tamaño de partícula o altas temperaturas

� Buena Sensibilidad y Especificidad

� ALTERNATIVA A GC frente a los inmunoensayos

� Se puede combinar con espectrómetros de masa en tándem, HPLC-MS, hecho que ha revolucionado el análisis de fármacos

� Se usa actualmente en inmunosupresores, antirretrovirales y cuantificación de fármaco antimicótico

Enferm Infecc Microbiol Clin 2008;26(4):230-9

HPLC-MS método de referencia validado

para ensayos de TDM� La unión de HPLC con espectroscopía de masas ha suministrado

una herramienta con una alta sensibilidad, selectividad y especificidad

� La sensibilidad de la detección depende de la “fuente de ionización”� APCI (ionización química a presión atmosférica)

� ESI (ionización por electrospray)� Su elección depende de propiedades físico-químicas del analito

(polaridad/acidez)� Tras la separación cromatográfica el eluato se introduce en el

detector de masas� Se eliminan los componentes de la fase móvil y se ionizan los

analitos para proceder a su análisisy detección en función de su relación masacarga (m/z)

� Debido a la complejidad de las muestras es frecuente el uso de 2cuadrupolos en serie HPLC-MS-MS

� El ión seleccionado en el 1º cuadrupolo es fragmentado y analizado en el 2º, permitiendo la detección simultánea de iones que coeluyan de la columna

� La identificación del analito se basa en:� Tiempo de retención

� Masa del ión correspondiente al analito( pico base)

� Masa de los iones fragmentados del ión molecular

� La ausencia de iones que interfieran con el ión molecular propicia que la relación señal ruido sea óptima

� HPLC-MS-MS se esta incorporando cada vez más a los laboratorios clínicos� Bajos costos reactivos� Alta disponibilidad de kits comerciales

� Mínima preparación de muestras

� Rendimiento mejorado� Mediciones simultáneas

� Mayor linealidad

� Inconvenientes:◦ Necesidad de personal cualificado y bien

entrenado para su manejo

◦ Alto coste equipos

Ther Drug Monit 2008;30 292-300

OTROS MÉTODOS DE ANÁLISIS

Electroforesis capilar

� Técnica de separación basada en la migración diferencial de moléculas sujetas a un campo eléctrico a través de un capilar

� El uso de altos campos eléctricos reduce tiempos de análisis (alta eficiencia y resolución).

� La existencia del flujo electro-osmótico, posibilita el análisis simultáneo de todos los analitos

� Flujo electro-osmótico mueve la disolución extremo + al – separandolas moléculas por su carga� Carga+ > neutras > carga-

� EC es una técnica sensible y altamente

versátil muy utilizada en investigación farmacéutica

� Litio (espectrofotometría de absorción atómica, fotometría de emisión de llama e ICP-MS)

� Técnica de referencia EAA e ICP-MS

� Potenciometría: diferencia de potencial existente entre un electrodo selectivo y un electrodo de referencia en ausencia de corriente externa

� Electrodo de vidrio para cationes monovalentes (Li+) , medida potenciométrica proporcional

a concentración Li en la muestra

Electrodo selectivo iones

DETERMINACIÓN DE FÁRMACO

LIBRE

CUANTIFICACICUANTIFICACIÓÓN DE LA N DE LA FRACCIFRACCIÓÓN LIBRE DE N LIBRE DE

FFÁÁRMACORMACO

� Fármacos terapéuticos con mas 80% de unión a proteínas

� Determinación de la fracción libre del fármaco complej a.

� Cada vez más habitual en laboratorios de rutina

Clin. Chem. Lab. Med 2010;48(4)

Unión a proteínas de los fármacos mas frecuentement e monitorizados

Fármaco % unión a proteínas Tipo de proteína ¿Monitorizarfármaco libre?

Amicacina

Etosuximida

ProcainamidaTeofilina

Fenobarbital

Fenitoina

CarbamacepinaAcido Valproico

Primidona

< 5%

0 %

10-15 %40 %

40 %

90 %

80 %90-95 %

15 %

__

__

AlbúminaAlbúmina

Albúmina

Albúmina

AlbúminaAlbúmina

Albúmina

No

No

NoNo

No

Si

SiSi

No

Digoxina 25 % Albúmina Si

QuinidinaLidocaina

Ciclosporina

TacrolimusAcido Micofenólico

80 %60-80%

98 %

97 %92 %

α1-glicoproteína ácidaα1-glicoproteína ácida

Lipoproteínas

LipoproteínasAlbúmina

SiSi

Si

SiSi

A. Dasgupta. Clinica Chimica Acta 377 (2007) 1-13

Interés en intoxicaciones tratadas con FAB (DigiBind®)FAB interfieren con inmunoensayos

CUANTIFICACICUANTIFICACIÓÓN DE LA N DE LA FRACCIFRACCIÓÓN LIBRE DE N LIBRE DE

FFÁÁRMACORMACO

� Fármacos terapéuticos con mas 80% de unión a proteínas

� Determinación de la fracción libre del fármaco complej a.

� Cada vez más habitual en laboratorios de rutina

� Métodos� Diálisis en equilibrio , microdiálisis, ultrafiltra ción

y ultracentrifugación

� Recientemente se ha introducido el método SPME

Clin. Chem. Lab. Med 2010;48(4)

� Ultrafiltración/diálisis : Procesos de separación

basados en membranas de polímeros controlados

por la velocidad

� Técnica simple y rápida

� Método actual mas usado, puede combinarse

con detectores UV o MASAS

� Parámetros cruciales:

� Tiempo de centrifugación

� Temperatura

� Volumen de la muestra

� Volumen directamente proporcional a

tiempo de centrifugación e inversamente

proporcional a [ALB] suero

Clinical Biochemistry 40 (2007) 752-764

SPME

� Método prometedor, rápido, simple � Extracción y pre-concentración

� Pequeña fibra de sílice fundida instalada en un soporte, recubierta de una fase polimérica (extractante)

� La SPME esta basada en el reparto de los analitos entre dos fases: la muestra y la fase polimérica. Consiste en la adsorción selectiva de los analitos presentes en la muestra.

� Una vez finalizada la etapa de adsorción, la fibra puede ser inyectada directamente en el detector

� Puede conectarse en línea a un CG, LC o electroforesis capilar

� La combinación de SPME y LC-MS excelente método de screening y determinación de drogas y metabolitos en suero, plasma u orina

� Fácil uso

� Automatización on-line

� Bajos volúmenes de muestra (10µl)� Costes de análisis bajos

� Bajos tiempos de procesamiento

M. Adbel-Rehim, J. Chromatogr.A (2009), doi:10.1016 /j,chroma.2009.09.053

CONCLUSIONES

� Optar por HPLC/HPLC-MS, siempre que las condiciones de trabajo lo requieran, cuando se tenga personal bien cualificado y las casascomerciales tengan buen servicio técnico que responda inmediatamente ante cualquier problema

� Los laboratorios deben participar en programas de control de calidad internos y externos que garanticen la validez y utilidad del dato emitido

� Todas las características del método analítico deben ser documentadas en los procedimientos técnicos (PNTs) que utilice el laboratorio. En ellos se indicarán claramente todas las características del método y requerimientos de la muestra a utilizar así como sus limitaciones.

Farm. Hosp. 2008;32(2) 113-123

GRACIAS POR VUESTRA ATENCIÓN