1 Foro Internacional Electrnico ELABORACION DE QUESOS CON CULTIVOS DIRECTOS (DVS) Autores: Viviana Bruno, Guillermo Intorno. Primer parte Introduccin: La produccin de productos lcteos fermentados, tales como quesos y yogures, involucra una compleja interaccin entre la leche, los coagulantes y las bacterias. Debido a que la calidad bacteriolgica de la leche varia considerablemente, los productos fermentados se elaboraran con leche pasteurizada. Siendo que este proceso elimina la mayora de las bacterias presentes en la leche, incluyendo las bacterias cido lcticas (LAB) responsables de producir la acidificacin espontnea, es necesario adicionar a la leche destinada a productos fermentados, cultivos de bacterias cido lctica, para obtener productos con las propiedades deseadas. Los cultivos lcticos cumplen un rol fundamental en todas las fases de la elaboracin del queso y durante el proceso de maduracin. A medida que el cultivo crece en la leche, convierte lactosa en cido lctico, confiriendo un pH ptimo en el queso para la coagulacin, el periodo de prensado, y en la cuajada final. Este aspecto ayuda a determinar el contenido de humedad final en el queso, como as tambin la consistencia y el sabor en los productos fermentados. Durante la maduracin, el cultivo starter influye en el desarrollo de sabor, aroma, textura, y cuando es relevante, en la formacin de ojos. La produccin de cultivos lcticos comerciales de inoculacin directa ha posibilitado la produccin de productos lcteos fermentados y quesos con excelente calidad, consistencia y estabilidad. As mismo se han solucionado los problemas bacteriolgicos y los desvos producidos por las variaciones de la materia prima. Al desarrollarse cultivos con mezcla de cepas, controladas en su composicin y proporcin, ha posibilitado la diversificacin y desarrollo de especialidades con una ptima calidad, homogeneidad y estabilidad a lo largo del tiempo. En el presente trabajo, se comentaran las cualidades de los cultivos de bacterias cido lcticas utilizados en la elaboracin de productos lcteos, su taxonoma y rol en la produccin, detalles de los procesos de produccin de cultivos comerciales, y las tcnicas para minimizar los posibles problemas de bacterifagos, el uso de la biologa molecular y tecnologa de recombinacin de ADN, en combinacin con el entendimiento del metabolismo de las bacterias cido lcticas, para utilizados para el desarrollo de los cultivos comerciales. 2 Taxonoma de las bacterias cido lcticas (LAB): Las primeras clasificaciones taxonmica de las LAB se basaron en: fermentacin de azcares, formacin de gas, morfologa de las clulas, tolerancia al oxgeno, temperatura ptima de crecimiento (Orla Jensen 1.919) . Este esquema de clasificacin an se utiliza debido a su practicidad. Los mtodos ms modernos utilizan para caracterizar microorganismos el anlisis comparativo de los componentes de la pared celular ( peptidoglican y polisacridos), lpidos y el contenido de G+C (guanina + citosina)o por el estudio serolgico de los antgenos de superficie . Si bien estos datos permitieron la diferenciacin e identificacin de LAB , esta clasificacin no necesariamente representa la situacin filogentico natural.. Los anlisis de la secuencia de las macromolculas , tales como DNA y rRNA, hicieron posible el estudio real de la relacin genotpica de LAB ( Schleifer et al 1995). Por medio de la comparacin de la secuencia de nucletidos de las molculas de rRNA 23S y 16S se puede dilucidar la relacin filogentico de las especies. Relaciones ms cercanas se analizan generalmente por medio del mtodo de hibridisacin DNA-DNA., el cual da informacin sobre la relacin del genoma total de las cepas.( Stackebrandt and Goebel 1994). La identificacin tradicional de los genotipos lleva tiempo es laboriosa y no siempre confiable debido a que los resultados a menudo estn afectados por factores ambientales tales como las condiciones de desarrollo. Los mtodos de identificacin basados en las secuencia de DNA o rRNA son ms confiables ya que no dependen de las condiciones de desarrollo y es posible diferenciar grupos difciles. Los anlisis de las secuencias de rRNA 16S o de hibridacin con oligonucleotidos rRNA 23S o 16S son adecuados para la identificacin de las especies de LAB ( Schleifer et al.,1995). Si bien los anlisis de secuencia de rRNA 16S es muy til para la identificacin de las especies, en algunos casos la resolucin no es suficientemente alta , ej.Lb. plantarum, Lb pentosus,Lb paraplantarum En cada caso se requiere una combinacin de varios tests genotpicos y fenotpicos (Vandamme et al., 1996) Especies importantes en la elaboracin de quesos De las cinco especies del gnero de Lactococcus, solamente las dos subespecies del Lc lactis lactis;lactis y cremoris son las que tienen mayor importancia en la elaboracin de quesos. La capacidad de fermentar el citrato se us como una caracterstica de la subespecies de Lc. Lactis subespecie diacetylactis , debido a que la utilizacin del citrato est ligada a plasmido, resulta un genotipo inestable y no adecuado para la caracterizacin de la subespecie.. Estas especies son ahora denominadas Lc. Lactis subsp.lactis biovar.diacetylactis La nica especie del gnero Streptococcus relevante para la produccin de queso es el S. thermophilus. La estrecha relacin entre esta especie y S. salivarus permite un cambio en el posicionamiento del S. thermophilus como una especie separada o una subespecie del S salivarus . Los estudios de hibridacin ADN-ADN revelaron que los dos grupos 3 pueden ser claramente distinguidos bajo condiciones rigurosas y, consecuentemente , la especie S. thermophilus fue restablecida. Leu. mesenteroides subsp. cremoris y Leu. lactis son importantes para el desarrollo del sabor en los quesos debido a su capacidad de formar diacetilo bajo determinadas condiciones. Leu. Mesenteroides subsp. cremoris fue primeramente llamada Leu.cremoris hasta que Garvie (1.983) la clasific como subespecie de Leu.mesenteroides. Del gnero Lactobacillus , solamente las especies termfilas, Lb. delbrueckii subsp. lactis, Lb. delbrueckii subsp bulgaricus y Lb. helveticus tienen un role significativo en los cultivos para queso. Lb lactis, Lb. bulgariccus y Lb. delbrueckii han sido ubicados en una especie, llamada Lb. delbrueckii, basada en su alta homologa DNA . Los lactobacilos mesfilos , tales como Lb. casei, Lb. plantarum, Lb. brevisy Lb. buchneri, son componentes importantes de las bacterias cido lcticas que no corresponden al starter (NSLAB) y estn presentes en la maduracin de los quesos en un nmero superior a 10E8/g (Teuber, 1.993) Las especies de Propionibacterium que se utilizan en los quesos incluyen P. freudenreichii, P. jensenii, P.thoenii, y P.acidipropionici. P freudenreichii tiene dos subespecies, freudenreichii y shermanii, sobre la base de la reduccin del nitrato y la fermentacin de la lactosa. Aunque no hay suficientes evidencias para soportar esta separacin , se mantiene por su importancia en la tecnologa quesera. ( Moore y Holdeman, 1.974) Tipos de bacterias lcticas (LAB): Los tipos de cultivo descriptos en la tabla 1 pueden ser producidos de diferentes formas: como mezclas no definidas de bacterias, como cultivos de multicepas definidas, y en muchos casos, como cultivos de cepas simples. Las mezclas de cultivos indefinidos contienen varias especies o gneros, con un numero desconocido de las cepas de cada uno. En los cultivos multicepa definidos, los nmero de cepas de cada una de las especies son conocidos. Los cultivos monocepa contienen solamente una cepa. Desarrollo de los cultivos: Originalmente, muchos de los cultivos lcticos para quesos fueron cultivos mezclas de cepas no definidas, siendo en la actualidad con el desarrollo de la queseria moderna, principalmente cultivos de tipo LD utilizados como directos. Los cultivos LD son deseados por la industria queseras por su estabilidad del desarrollo de sabor y la poca sensibilidad al ataque de bacterifagos. Una vez desarrollados, estos cultivos deben ser cuidadosamente preservados y producidos para mantener su balance de cepas y la insensibilidad a los fagos. La clave es limitar el numero de repiques para no perder la dominancia de las cepas resistentes a bacterifagos. A mediados de los aos 60 se descubri en Holanda sobre que cultivos de cepas LD, que eran propagados en la industria lctea, que se los denomino cultivos prcticos (P-Starters), eran mucho ms resistentes a fagos que los cultivos similares propagados en el laboratorio. Siendo que esta diferencia resulto de los nmeros repiques realizados en las cepas producidas en el 4 laboratorio, en un ambiente protegido, permitiendo la dominancia de las cepas de las cepas sensibles a los fagos (Stadhouders y Leenders, 1985). Otro problema referido a la calidad, que ocurri en Nueva Zelandia, y se pens que no era debido fagos, Fue el anhdrido carbonico producido desde citrato por cultivos mixtos, que produjo problemas de masa abierta, durante el transporte de quesos a los mercados de europa oriental (Whitehead, 1953). Para evitar estos problemas de textura, fueron aisladas las cepas productoras de cido desde los quesos y fueron utilizadas como cultivos monocepas. El uso de estos cultivos utilizados comercialmente, dando por resultado quesos con textura cerrada, pero los cultivos no fueron consistentes en la produccin de cido, debido primariamente a problemas de fagos. La combinacin cepas simples en sistemas de cultivos realizados en Nueva Zelandia, produjeron un mejor control de la sensibilidad a fagos sin diferencias en el grado de produccin de cido, adems de facilitar la desaparicin de sabores amargos en el queso. Desde los aos 30 hasta mediados de los 60, el uso de cultivos de cepas simple fue limitado a Australia y Nueva Zelandia, con excepcin de unas pocas industria lcteas en Escocia y EEUU. El punto de retorno de los cultivos multicepas de cepas definidas, ocurri en la industria del queso Cheddar en los aos 70. Siendo que progreso tambin en los dems productos fermentados. La racionalizacin en la produccin de lcteos y los sistemas de transporte dejron un incremento en el tamao de fabricas de quesos. La unin de pequeas fbricas queseras en fabricas de mayor produccin de mltiples llenados y manufacturas de quesos en tinas cerradas, ubic a los cultivos bajo un considerable stress durante las fabricaciones de quesos, siendo que los fagos aparecieron inevitablemente resultando en tinas lentas o muertas que no producan acidificacin el cultivo. Los esfuerzos de investigacin en Nueva Zelandia, Australia, EEUU e Irlanda, han ido directamente al desarrollo de sistemas de cultivos multicepas, donde la sustitucin de las cepas de los sistemas, fue la clave para obtener cultivos de una performance consistente. Las cepas fueron seleccionadas por su capacidad de resistencia a la exposicin repetida a los fagos en el laboratorio (Heap y Lawrence, 1976). En estos sistemas de cultivos, las cepas fueron desarrolladas separadamente y mezcladas antes de la inoculacin de los tanques de produccin de cultivos (bulk sarters). Si una propagacin rpida de los fagos era detectada atacando uno de las cepas de los cultivos, el cultivo era retirado y reemplazo por la un cultivo no relacionado de la cepa alternativa, generando un sistema de rotacin de cultivos alternativos. Este sistema, originalmente constituido por 6 cepas no relacionadas, fue denominado sistema de mltiple cultivo. En la pasada dcada, el nmero de cultivos ha sido reducido a dos o tres. Esta aproximacin al reemplazo de cultivo, es comnmente practicada en los cuatro pases antes mencionados. En 1980 los grandes productores de cultivos, introdujeron los cultivos DVS en europa para la produccin de Cheddar. Usualmente el cultivo para Cheddar contena 3 o 4 cepas, las cuales haban sido seleccionadas por su robustez a los ataques de fagos entre otras cosas, siendo que se utilizaban sin rotacin. En caso de que el cultivo se volva lento, era reemplazado por otro cultivo perteneciente a otro grupo de sensibilidad fgica. Estos cultivos fueron ampliamente utilizados en 5 Inglaterra e Irlanda y se propagaron e hicieron populares en otros pases productores de Cheddar. El uso de los cultivos DVS: El valor del uso de cultivos concentrados de uso indirecto (bulk starters) ha sido conocido al cabo de largos aos, como un avance de esta tecnologa, los productores lcteos de todo el mundo, se han dado cuenta de las ventajas de la utilizacin de cultivos de uso directo en el tanque de fermentacin o tina quesera, en la presentacin de congelados o liofilizados. En la produccin de quesos tipo Cheddar, Cottage, Quesos blancos, Feta y otros, el uso de cultivos DVS esta bien establecido. Esta estimado que en los pases de gran produccin de quesos, como Alemania, Francia o Reino Unido, 15; 30 y 40 % respectivamente de la produccin total de lcteos, esta realizado con cultivos DVS (Vindfield, 1994). Los cultivos DVS prcticamente se pueden utilizar en todo tipo de productos lcteos fermentados y quesos, aunque en ciertos casos pueden requerir de cambios en el proceso de elaboracin. Cuando se utilizan cultivos DVS ciertos factores deberan ser observados. En el inicio de la produccin del queso, la inoculacin del cultivo indirecto al 1-2%, baja el pH entre 0,05 y 0,1 unidades, debido al cido lctico contenido en el fermento. Esta cada de pH no ocurre con el uso de DVS. Ademas, algunas veces se requiere de rehidratacin dado que presentan un tiempo prolongado de latencia. La actividad de los cultivos modernos DVS es comnmente mayor que la de los fermentos indirectos (bulk starter) y la diferencia inicial de pH (tiempo de latencia) es menor a 1 hora. (ver figura 4.3). 6 En la produccin de quesos tipo continental es suficiente con incrementar la temperatura de premaduracin con 1C, y tal vez prolongar el tratamiento de premaduracin por 5 a 10 minutos. En la produccin de queso Cheddar, utilizando cultivos mesfilos tipo O, el tiempo de premaduracin se debe prolongar de 10 a 20 minutos, en la fase posterior, los avances de pH son mas rpido con cutilvos DVS que con fermentos indirectos, y para controlar el pH mnimo es necesario trabajar con una acidez titulable menor en el proceso de triturado. Numerosas ventajas se observan con el uso de DVS, en principio el riesgo de ataque por bacteriofagos por acumulacin en la leche, es reducido debido a la eliminacin de la propagacin realizada con los bulk starter (preparacin del cultivo indirecto). La inoculacin directa de la tina o tanque ofrece flexibilidad en la produccin de diferentes tipos de productos lcteos, sin necesidad de contar con instalaciones extras, en tanto que este tipo de cultivo puede ser fcilmente adaptable a cambios en el volumen de la leche u otros cambios en el plan de produccin. Los cultivos DVS son elaborados a travs de un intensivo rgimen de control de calidad antes del despacho, asegurando que los cultivos poseen la actividad y calidad bacteriolgica requerida. Las mezclas de cepas en estos cultivos, pueden ser predeterminadas para asegurar la produccin de cido, textura y sabor consistente, y cepas de termfilos y mesfilos pueden ser mezcladas en un solo cultivo para desarrollar un cultivo castomizado con una performance especfica. Estos tipos de cultivos, seran imposibles de producir en cultivos indirectos, debido a las diferencias de condiciones de multiplicacin requeridas de cada una de las cepas, siendo muy trabajoso si las diferentes cepas fueran propagadas separadamente en leche o medio de cultivo y luego mezcladas. Algunas mezclas especiales DVS, constituidas de cepas con condiciones de crecimiento variables han sido comercializadas tanto para quesos como para leches fermentadas (ver tabla 1, primer parte). Seleccin de cepas: La caracterizacin y seleccin apropiada de las cepas simples antes de su uso son importantes para obtener la performance requerida tanto en el proceso de elaboracin como en el producto final. Los criterios d seleccin son varios, pero comnmente los principales son: el grado de acidificacin a una temperatura determinada y la resistencia al ataque fgico (ver tabla 2). Los bacterifagos y la resistencia fgica sern descriptos ms adelante. Los tests basados en el estudio gentico, tales como el anlisis de ADN y de plsmidos son aplicados en conjunto en relacin con el bacterifago cuando se clasifican las cepas en diferentes grupos fgicos. Como criterio general, no es recomendable combinar cepas de grupos ntimamente relacionas en un cultivo definido, ya que sera mucho ms susceptible a un ataque fgico por un bacterifago simple. 7 Tabla 2: Criterios bsicos de seleccin de bacterias lcticas. Los criterios de seleccin especficos estn basados en requerimientos caractersticos del cultivo final. Para este propsito, un entendimiento detallado de la relevancia de la habilidad metablica de cada una de las LAB puede ser de gran ayuda. Mediciones de la velocidad de acidificacin durante el desarrollo inicial de la bacteria son complementadas con estudios de la tasa de multiplicacin y capacidad de acidificacin en leche pasteurizada, tan bien como durante la simulacin del perfil de temperaturas del proceso de un producto fermentado dado. El balance de sabor y la minimizacin del riesgo al ataque fgico, como tambin la sensibilidad trmica de la cepa, han sido utilizados como criterios mas relevantes en la seleccin de cultivos para Cheddar (Heap, 1998). Las cepas seleccionadas a priori, son adems testeadas en plantas pilotos en pequea escala para chequear su habilidad de comportamiento en la planta de produccin. De esta forma, las cepas son seleccionadas con un criterio amplio y especfico. Una alternativa a la seleccin de bacterias naturales con propiedades particulares, es desarrollar cepas con propiedades caractersticas deseadas en el laboratorio. Esto puede ser realizado por medio de la gentica bacteriana tradicional o utilizando las tcnicas de la gentica molecular moderna. El rol de la gentica molecular en el desarrollo de nuevas cepas de cultivos: Las propiedades de un organismo se encuentran codificadas en los genes de su ADN. La gentica molecular involucra un entendimiento exhaustivo del rol de los genes especficos en la expresin de una caracterstica particular. Por ejemplo, los genes de Lc. Lactis que permiten fermentar la lactosa han sido identificados y 8 caracterizados (Van Rooijen et al. 1991), adems se han identificado los genes de las cepas que afectan la sensibilidad fgica (Daly et al., 1996), la actividad proteoltica de las cepas (Kunji et al.) o las que afectan otras propiedades relevantes de las bacterias lcticas han sido exhaustivamente estudiadas (Nes, et al. 1996, Cocaign-Boousquet et al, 1996). El conocimiento y entendimiento de cmo genes especficos afectan propiedades particulares, permite el desarrollo de cultivos lcticos con caractersticas especficas. El contenido total de ADN de un organismo es llamado genoma, y frecuentemente contiene dos tipos de molculas de ADN: una molcula muy larga llamado cromosoma y un nmero de molculas ms cortas denominadas plsmidos. Una bacteria posee un solo cromosoma y solamente una copia de este cromosoma por clula, siendo que los plsmidos existen en mltiples copias en la clula, y una cepa contiene frecuentemente un gran nmero de plsmidos diferentes. Muchas bacterias lcticas contienen plsmidos cuyos genes son de significativa importancia para el ambiente de la industria lctea, incluyendo los pertenecientes a la fermentacin de la lactosa, el transporte de citrato, la produccin de proteinazas y la resistencia a bacterifagos. Existen sistemas naturales de transferencia d plsmidos de una cepa a otra. Nuevos cultivos lcteos han sido producidos por transferencia de plsmidos confiriendo resistencia a bacterifagos desde una cepa donante. El resultado es una nueva cepa, que mantiene sus cualidades queseras o fermentativas, con la ganancia de la resistencia fgica. La transferencia de genes cromosmicos tambin puede ocurrir si el cromosoma de la cepa donante posee un gen codificado en una funcin frtil. Ha habido evidencia que los cambios de genes pueden ocurrir entre miembros de diferentes gneros entre las bacterias lcticas (Johansen y Kibenich, 1992; Boourgoin et al, 1998). Una alternativa vlida de generacin de nuevas cepas es el uso de la tecnologa de recombinacin gentica para transferir genes de una cepa a otra. El resultado ser una cepa (organismo) que ha sido genticamente modificada u organismos genticamente modificado (GMO), y como tal ser regulado por las normas y leyes de cada pas en particular en los cuales ser elaborado y utilizado. Debido a las diferencias significativas existente en las reglas de diferentes regiones, y el cambio constante de las mismas, se encuentran en revisin constante por investigadores y consultores de las autoridades regulatorias y deberan ser consultadas antes del uso en los procesos de elaboracin en la planta lctea. GMOs grado alimenticio para la industria lctea: Los productos lcteos usualmente contienen bacterias lcticas viables, y en caso de que el cultivo contenga un GMO, ser que los consumidores de este producto lcteo terminen consumiendo un GMO. Las bacterias lcticas son consumidas a travs del pasaje por el tracto digestivo y muchas peden ser excretadas conservando su viabilidad (Klijn et al, 1995). Esto demuestra que las bacterias lcticas sobreviven al tracto digestivo humano y pueden colonizar el mismo. Estas consideraciones ponen en discusin las modificaciones genicas que pueden ser 9 realizadas y ser lo suficientemente seguras para ser aceptadas en el uso en la industria lctea. Una definicin ampliamente usada por los estatutos de grado alimenticio, es que un GMO grado alimenticio (Food grade) debe ser aquel que contiene ADN proveniente de un organismo de su mismo gnero y posiblemente pequeas trazas de ADN sinttico (Johansen, 1999). El ADN sinttico se encuentra en rangos de tamao de 2 a 50 pares de bases y es requerido durante la construccin del GMO. Este ADN no es codificado por protenas o por ARN pero contiene sitios de reconocimiento de las enzimas utilizadas en el proceso de construccin. Por esta definicin de grado alimenticio, un Lc. Lactis GMO solamente contiene ADN proveniente del gnero lactococcus y posiblemente una pequea cantidad de ADN sinttico. El uso de ADN de otro microorganismo podra ser aceptado por los organismos regulatorios (Johansen, 1999) siempre y cuando el organismo donante sea ampliamente reconocido como seguro (GRAS). Utilizando esta definicin, podra ser aceptado la introduccin de ADN de un St. Thermophilus en un Lc. Lactis modificado. Diferentes tipos de modificaciones genticas pueden ser producidas en el marco grado alimenticio por diferentes vas. Un gen puede ser eliminado de una cepa, si este es particularmente relevante por poseer una propiedad negativa, tales como la remocin de un metabolito deseable o permisin en el proceso de infeccin de un bacterifago. Nuevos genes pueden ser introducidos dentro de una cepa, siendo que algunos de ellos pueden resultar en un incremento de la resistencia al ataque de bacterifagos, estos genes son fijados totalmente en la nueva cepa, la cual tenia mayor sensibilidad al ataque desde un cepaje con menor sensibilidad. Para realizar la transferencia individual de un gen se requiere el uso de un vector clonado (food grade), el cual es un plsmido que satisface la definicin de grado alimenticio. Este plsmido permite la introduccin del ADN de inters en otra cepa, donde ser mantenido estable durante la recombinacin y permitir que se exprese la propiedad por la cual fue seleccionado. Los plsmido son frecuentemente inestables y son perdidos de las celular perdindose que se exprese su propiedad ventajosa, normalmente se incluyen marcadores selectivos en el vector para impedir que esto ocurra. Otro aspecto importante de trabajo son las mejoras de textura y sabores, para las cuales se trabaja sobre las mismas cepas seleccionadas por sus propiedades fermentativas en productos originales, y se les fija un gen con propiedades particulares, por ejemplo con capacidad proteoltica o lipoltica, dando por resultado una cepa idntica con una ventaja superlativa. En orden de obtener el mximo beneficio de la gentica tradicional y molecular, es necesario tener un amplio conocimiento de los procesos metablicos de las LAB que son relevantes para la industria quesera y de fermentativa.