El proyecto del genoma humano (PGH)

Inició en 1990 y fue un esfuerzo coordinado de13 años entre el Departamento de Energía y el Instituto Nacional de Salud. Fue planeado para 15 años pero los avances en secuenciación aceleraron para completarlo en el 2003.

OBJETIVOS:Identificar los 20-25000 genes del genoma humanoDeterminar la secuencia nucleotídica de los 3 millones de pares de basesAlmacenar la información en Bases de DatosMejorar las herramientas de análisis de datosPermitir la Transferencia de las tecnologías relacionadas al sector privadoManejar las implicaciones éticas, legales y sociales que surgieran en el proyecto.

Cuales son los beneficios prácticos del PGH?

Conocimiento acerca de los efectos de las variaciones entrelos individuos que dirijan a nuevos métodos revolucionariospara diagnosticar, tratar y algún día prevenir los miles detrastornos que nos afectan. Al mismo tiempo provea clavespara el entendimiento de la biología humana, aprendizaje delas secuencias de otros organismos y un entendimiento desus capacidades naturales que puedan ser aplicadas a lasolución de los retos de salud, agricultura, producciónenergética, bioremediación y el secuestro de carbono.

Medidas y Métodos del PGH

MAPEO DEL GENOMA

MAPA

Bases de Datos de Secuencias PGH

Interfases para navegar sobre secuencias genómicas ensambladas

Mapas físicos y genéticos

• Físico: muestra el orden de características a lo largo del cromosoma y su distancia en kilobases o Mb

• Genéticos: muestran su orden y probabilidad de que se separen mediante recombinación

Definición

• Determinación de la variación del DNA dentro de una especie

Recombinantes y no recombinantes

• La recombinación es un mecanismo quegenera Variabilidad Genética

• Descubrir la frecuencia con que se separan 2 loci

Meiosis I

Meiosis II

Recombinación meiótica

Profase I

Ligamiento de genes

• En Cis o trans (según estén combinados los alelos de cada uno de los genes)– Si en el cromosoma heredado del padre hay un alelo

dominante de un gen y otro dominante del otro gen el ligamiento es en FASE DE ACOPLAMIENTO, por ende en el cromosoma materno si el individuo es heterocigoto estarán los alelos recesivos de ambos genes

– En cambio cuando en 1 cromosomas hay un alelo dominante y el otro gen está en forma recesiva, y al revés, en el otro cromosoma los genes están ligados en FASE DE REPULSION (trans)

Ligamiento de genes

P M P M

Ligamiento

• También puede ser TOTAL o PARCIAL dependiendo de que distancia los separe

• Cuánto más cerca están uno de otro menor es la probabilidad de que suceda un crossingover entre ellos y por lo tanto tienden a heredarse en la misma combinación o haplotipo que poseía el cromosoma materno o paterno

• A esto se le denomina LIGAMIENTO TOTAL

• Si en cambio la distancia que los separa es suficiente para permitir entrecruzamientos entre ellos el ligamiento es PARCIAL

Ligamiento parcial

• Considerar que en algunas células habrá crossing over y recombinación y otras donde no lo haya

• Por lo tanto el porcentaje de gametos que tienen nuevas combinaciones o RECOMBINANTES siempre es más bajo que el porcentaje de gametos con la combinación original o PARENTAL

VNTR´s

Marcadores genéticos

• Interés en enfermedadesmapa que muestre orden y distancia entre los genes patológicos

• El mapeo genético requiere heterocigotos dobles

– Personas heterocigotas para 2 enf diferentes son muy raras

– Si se encuentran no tienen hijos, no adecuadas para análisis genéticos

Marcadores genéticos

• Marcador: cualquier carácter mendeliano polimórfico que puede utilizarse para seguir un segmento cromosómico a través de una genealogía– Útil: que sea fácilmente calificable, material

disponible sin gran costo (cel sanguíneas en lugar de biopsia de cerebro!!)

– Suficientemente polimórfico para que 1 persona seleccionada al azar tenga 1 buena posibilidad de ser heterocigoto

Marcadores polimórficos

Haplotipos: producto de la reproducciónsexual en el tiempo

Los cromosomas intercambianfragmentos en cada individuo en cadageneraciónMuchas

generaciones

Los haplotipos son conjuntos de variaciones contenidas en regiones que no han sido interrumpidas porrecombinación, es decir, que se hanheredado en bloque.

Algunos segmentos son compartidos porvarios individuosAA

A

Variabilidad Genómica (Polimorfismos)

• Un polimorfismo genético se refiere a variaciones genéticas

que se presentan en más del 1% de la población

• SNP: Polimorfismos de un sólo nucleótido ( “snips”)

• Se encuentran aproximadamente 1 cada 350 pb La gran

mayoría en regiones no codificantes Un gen contiene en

promedio 4 SNP’s en su región codificante

Desarrollo de marcadores genéticos humanos

Tipo de marcador Núm.De loci

Características

Gpos sanguíneos (1910-1960) 20 Sangre fresca, antisueros rarosNo siempre posible deducir el genotipo por el fenotipo debido a la dominanciaNo es fácil la localización física

Variantes de movilidad electroforética de proteínas séricas (1960-1975)

30 Suero fresco, valoraciones especializadasNo es fácil la localización físicaPolimorfismo limitado

Tipo de tejido HLA (1970-) 1 (haplotipo)

Un gpo enlazado. Muy informativoSolo puede estudiar por enlace a 6p21.3

RFLP de DNA (1975-) >105

(potencialmente)

2 marcadores de alelos, heterocigosidad máx de 0.5Inicial/ requería Southern blotting, hoy PCRLocalización física fácil

Desarrollo de marcadores genéticos humanos

Tipo de marcador Núm. De loci Características

NVRT de DNA (minisatélites) (1985-)

>104 (potencialmente) Muchos alelos. Muy informativoSouthern blottingLocalización física fácilTiende a agruparse cerca de los telómeros

NVRT de DNA (microsatélites) repeticiones de di-, tri- y tetra nucleótidos(1985-)

>105 (potencialmente) Muchos alelos. Muy informativaTipifica mediante PDR multiplexautomatizadaLocalización física fácilDistribuido en la totalidad del genoma

SNP de DNA (polimorfismos de nucleótido único)

>4 x 10 6 Menos informativo que microsatélitesPuede tipificarse a muy grande escala mediante equipo automatizado sin electroforesis en gel

NVRT: número variable de repeticiones en tándem

Polimorfismos que pueden genotipificarse

• SNP: polimorfismos 1 sólo nucleótido; se origina x el cambio de 1 nucleótido aislado. Suelen valorarse mediante secuenciación de DNA

• VNTR (número variable de repeticiones en tándem):surge x inestabilidad en 1 arreglo de repeticiones tándem q causa 1 cambio en el núm de repetición (se emplea + p/minisatélite)

Como se originan los polimorfismos

Subclases de polimorfismos

• SNP de sitio de restricción: el cambio en el nucleótido causa pérdida o ganancia de un sitio de restricción. Se tipifica mediante PCR o hibridación Souhtern (RFLP)

• VNTR microsatélite: polimorfismo de repetición tándem corto (PRCT), o polimorfismo de repetición de secuencia simple (PRSS); repetidos de 1-4 nucleótidos

• VNTR minisatélite: unidad repetida de 9-65 pb de longitud

¿Qué son los Tag SNPs?

SNPs marca o tag:

SNP 1

SNP 3

SNP 6

SNPs inferidos:

SNP 2

SNP 4

SNP 5

Se analizan solamente 3

SNPs y se obtiene

información sobre al menos 6

A/T

1

G/A

2

G/C

3T/C

4

G/C

5A/C

6

alta r2 alta r2 alta r2

AATT

GC

CG

GC

CG

TCCC

ACCC

GC

CG

TCCC

GGAA

GGAA

Carlson et al. (2004) AJHG 74:106

Son SNP’s representativos de una región en el genoma, con los cuales, mediantecálculos estadísticos se pueden inferir otros SNP’s, que junto con ellos, se heredanen bloque.

Clonación posicional

• Ir estrechando el cerco al gen a partir de su localización cromosómica

• Se parte de varios pedigrees en la que se ve la segregación del rasgo respecto a múltiples marcadores genéticos polimórficos.

• En humanos, lo ideal es que la separación entre marcadores no sea mayor de 1cM.

• Luego, por paseo o salto cromosómico, se va uno acercando al gen.

• Análisis de genes candidatos• Se han aislado muchos genes por clonación posicional, pero la

mayoría de ellos sobre la base de mutaciones de delección, translocación o amplificaciones de trinucleótidos.

• La clonación posicional a partir de mutaciones puntuales es más ardua

Mapeo de genes

• Algunos genes se habían localizado respecto al MODO DE HERENCIA ligado al X, algún FENOTIPO SE HEREDABA EN TANDEM con algún grupo sanguíneo o con un heteromorfismo citogenéticamentedetectable.

Mapeo físico de genes

• Asigna a genes localizaciones determinadas a lo largo de un cromosoma

• Utilizando medidas que son el reflejo de la distancia física entre los genes

• En unidades de pares de bases

Mapeo genético

• Utiliza un análisis de ligamiento, la medición de la frecuencia con la que dos genes permanecen juntos tras una meiosis cuando pasan de generación en generación.

MAPEO FÍSICO DE GENES HUMANOS

• Cultivo celular

– Clonas, crecer en algunos de manera indefinida

– Fibroblastos son la célula más útil, 30-300 generaciones, senescencia vs transformación.

– Sangre periférica con transformación blastoide

Mapeo por transferencia cromosómica

• Permite la transferencia de cromosomas enteros o segmentos desde una célula donante hacia una receptora en cultivo

• Hibridos de cel. Somáticas interespecíficas– Heterocariontes

– Homocariontes

Se pierden cromosomas humanos pero no de roedor!!

Mapeo de un gen a una determinada región de un cromosoma

Radiación Translocaciones

Medida de la distancia genética

• Entre una descendencia el 80% de los genotipos son NO RECOMBINANTES (es decir

igualito a lo del progenitor, se comportan como si no tuvieran

recombinación durante la meiosis) y 20% son RECOMBINANTES

• Entonces la frecuencia de recombinación , es del 20%

• A 20 cM un alelo del otro, convirtiendo la fracción de recombinación en una distancia génica.

• No se realiza observando a una sola familia

De verdad DOS LOCI ESTAN LIGADOS?

• Necesitamos saber si:

– La fracción de recombinación , es significativamente diferente que 50% (del azar entre

dos loci en diferentes cromosomas o simplemente no ligados)

– Que tan “significativa” es, se utiliza la razón de probabilidades (likelihoods odds ratio)

• Los valores de Z mayores a uno sugieren que los lociestán ligados. 3 o mayor es una evidencia definitiva de que los loci están ligados

Bajo esta fórmula cuando es cero, o sea no hay recombinantes, en los descendientes todos tienen igual que el progenitor, la Z es 1.81

Mapas de ligamiento

• Supongamos que dos loci, A y B, están ligados a una distancia de 10cM.

• Esta información no es suficiente para construir un mapa, no sabemos el orden

• Pero si tenemos un locus C y sabemos que este esta a 12 cM de A y a 5cM de B pues tenemos el orden A B C

Relación entre distancia genética y distancia física

• Comparación de parámetros citogenéticos, físicos y genéticos en el genoma

Citogenéticos Tamaño físico Distanciagénica

Contenido en genes

23 cromosomas

3*10 9 pb 4300 cM 50, 000!

Cromosoma medio

1.5 * 10 8 pb 200 cM 2 200

Banda 3 *10 6 pb 5 cM 50

Mapeo de genes de enfermedad por análisis de ligamiento

Heterogeneidad de locus

10cM

• Tiene que estar a un máximo de 7.5 millones de pb del gen de la enfermedad para que pueda detectarse ligamiento

MARCADORES INFORMATIVOS DE ANCESTRIA:

Los Marcadores Informativos de Ancestría (AIMS) pueden ser STRs o SNPs,dependiendo de la informatividad de los mismos.

Actualmente, con el desarrollo de métodos que permiten determinarsimultáneamente SNP’s a mediana y gran escala, hacen que sea una estrategia máseconómica y técnicamente accesible.

El criterio para seleccionar los SNP’s es que presenten frecuencias alélicassustancialmente diferentes entre poblaciones bio-geográficas.

chrom rs_number alleles CEU YRI CHB JPT AMI

chr4 rs4385038 A/G 0.925 0.133 0.744 0.625 0.52

chr15 rs1426654 A/G 1 0.025 0.011 0.011 0

chrX rs2294504 C/T 0.756 1 0.091 0.061 0.17

chrX rs2182191 A/G 0.256 1 0.265 0.227 0.87

chr18 rs12606216 A/G 0.992 0.858 0.3 0.261 0.4

chr4 rs2970869 A/G 0.242 0.025 0.289 0.5 1

chr17 rs9893497 A/G 0.442 0.217 1 1 0.89

chr18 rs1259807 A/G 0.283 0.7 0.456 0.659 1

Las Variaciones Genómicas nos hacenmiembros individuales de nuestra especie

• Dan lugar a las características físicas que diferencian a los individuos y a las poblaciones

• Confieren susceptibilidad o resistencia a enfermedades comunes

• Modulan la respuesta a tratamientos farmacológicos

La información genética contiene informaciónde ancestría (muy importante al aplicartratamiento farmacológico).

Firma Genética.

¿Código de Barra?