el presente trabajo se realizó en el laboratorio de
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El presente trabajo se realizó en el laboratorio de microbiología de la
Dirección de Investigación y Estudios de Posgrado (DIEP) del Instituto
Tecnológico de Sonora, y fue asesorado por el Maestro en Ingeniería
Anacleto Félix Fuentes.
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA SONORA
EVALUACIÓN MICROBIOLÓGICA DEL AGUA RESIDUAL Y DE USO ACUÍCOLA EN CULTIVO DE CAMARÓN EN
ESTANQUERÍA
T É S I S
PARA OBTENER EL TÍTULO DE
QUÍMICO
PRESENTA MARCELA DÍAZ ESTRADA CD. OBREGÓN, SON. MAYO DE 2002
DEDICATORIAS
A DIOS por permitirme llegar al lugar en el que estoy, cumpliendo uno de mis sueños. Por darme los mejores padres y una gran familia. A MIS PADRES Guadalupe y Salvador por traerme a este mundo con amor, por cuidarme, apoyarme y guiarme en este largo y difícil camino, por ser los incondicionales y mejores amigos, por estos 23 años que han estado conmigo. Son mi orgullo y ejemplo a seguir, los quiero mucho. A MIS HERMANOS Myriam, Daniel y Gaby, por cada momento que hemos vivido juntos, los cuales no cambiaría por nada. Por enseñarme a luchar por lo que quiero. Por ser un ejemplo a seguir para ser mejor en la vida. Por su alegría y entusiasmo. Los admiro y quiero mucho. Al los próximos miembros de la familia (Lupita o Daniel y la chinita), por darme una alegría tan grande con tu futura llegada. A MIS TIOS Rosalba y Edmundo por ser mas que unos tíos. Por ser como mis segundos padres y estar desde el primer día de mi vida a mi lado, por apoyar y ayudar en mi desarrollo, por esto y más son un gran tesoro que no tiene precio. Son un orgullo y un ejemplo para mi. Los quiero. A MI PRIMA Irlanda por ser como una hermana, por permitirme compartir contigo los momentos importantes y difíciles de tu vida, por quererme y respetarme. Por ser una niña estudiosa y buena hija. Te quiero mucho niña consentida. A MI NOVIO Marco Antonio por los 5 años de noviazgo que hemos compartido, por estar conmigo en los momentos importantes, y por tratar de ser mejor cada día. TE AMO. A MIS CUÑADOS Martín, Maury y Ricardo por ser parte de esta familia, por los momentos que hemos pasado juntos. Les deseo mucha suerte y felicidad en la vida. A MIS ABUELOS Lupita y Manuel (+), Socorro (+) y Daniel (+), por todo el cariño que me han dado por ser una parte muy importante para mi. Que Dios los bendiga.
A LA FAMILIA Tachiquín, Don Vicente, Tere (nina), Judith, Andrea y por supuesto Dany y Alejandro. Por estar siempre presentes para lo que se ofrece, por los momentos de alegría que pasamos juntos. Los aprecio mucho. A MIS TÍOS Celestina y Felipe, por apoyarme y brindarme su confianza. Los quiero y respeto mucho. A MIS PRIMOS Dense y Manuel Alonso, por su cariño y amistad, por las travesuras que hemos compartido.
AGRADECIMIENTOS
A DIOS por bendecirme cada día y por esta gran oportunidad. A MIS PADRES por su esfuerzo y apoyo para tratar que sea mejor cada día. AL ITSON por ser parte de mis sueños y por la oportunidad que me brinda. A MI ASESOR M.I. Anacleto Félix Fuentes, por el apoyo brindado durante mi carrera, por transmitirme sus conocimientos y amistad. M. C. Olga Nidia Campas Baypoli, por compartir sus conocimientos y amistad. A MIS REVISORES, M. C. Cuahutémoc Ibarra, Ing. Luz Elena Beltrán y M. C. Rodrigo Lara por su apoyo y confianza. A MIS MAESTROS Laura E. Gassos, Jorge Cabrera, Diana Patrón, Lupita Apódaca, Raúl Holguín, Dalia Sánchez y Jaime López por ayudar en mi formación. A MI AMIGA Fabiola por todos los momentos que hemos compartido, por ser incondicional y la mejor amiga, por compartir conmigo la amistad de tu familia y a mi tesoro Danae. Siempre juntas. A MIS AMIGOS INCONDICIONALES Zapo, Cisne, Mayito, Pily, Tata, Viejo, Pelón, Ricardo y Toño, por todas loas travesuras que hemos hecho juntos y por los momentos que pasamos. Los quiero. A MIS AMIGOS Marisol, Ana Isabel, Roberto, Verónica, Charys, Jorge, Lupita, Sugey, Jesús, Neto, Adrian, Gladis, Mayra, Carmen, Betty, Marisol, Rosa, Dalia, Maritza, Glenda y Erika, por todo el tiempo y experiencia que compartimos. AL PERSONAL DE LA DIEP Don Chava, Don Armando y Don Ramón.
INDICE
INDICE DE TABLAS
¡
LISTA DE FIGURAS
¡¡
RESUMEN
¡¡¡
INTRODUCCIÓN
V
OBJETIVOS
Vii
HIPÓTESIS
iX
JUSTIFICACIÓN
X
I Revisión bibliografíca
1
1.1 Generalidades
1
1.1.1 Origen del agua
1
1.1.2 Acuacultura en estanques
2
1.1.3 Calidad del agua de cultivo
2
1.1.4 Cantidad del agua
4
1.1.5 Características del suelo
5
1.2 Microbiología Acuática
5
1.2.1 Microbiología de las aguas marinas
6
1.2.2 Aspectos microbiológicos
7
1.3 Microbiología de las aguas
8
1.3.1 Mesófilos aerobios
8
1.3.2 Grupo coliforme
9
1.3.3 Salmonella
11
1.3.4 Vibrio cholerae
12
1.4 Interpretación de las pruebas bioquímicas en los medios correspondientes
13
1.4.1 Prueba de la oxidasa
13
1.4.2 Prueba de la catalasa
13
1.4.3 Prueba del citrato
13
1.4.4 Medio LIA
14
1.4.5 Medios SIM
14
1.4.6 Urea
15
1.4.7 Medio OF
15
1.4.8 Prueba del rojo de metilo
15
1.4.9 Reacción de Voges-Proskauer
16
1.4.10 Agar TSI
16
1.4.11 Medio MIO
17
1.4.12 Prueba de la licuefacción de la gelatina
18
1.4.13 Prueba del malonato
18
1.4 Parámetros fisicoquímicos en el agua de uso acuícola
18
1.4.1 Temperatura
18
1.4.2 pH
18
1.4.3 Salinidad
19
1.4.4 Oxígeno disuelto (OD)
20
II Materiales y métodos
21
2.1 Descripción de la zona de estudio
21
2.2 Periodo de muestreo
23
2.3 Sitios de muestreo
23
2.4 Toma y transporte de la muestra
24
2.5 Análisis microbiológico
25
2.5.1 Determinación de la cuenta total viable de mesófilos aerobios por la técnica de vaciado en placa
25
2.5.2 Determinación del NMP coliformes totales , por la técnica de fermentación de tubos múltiples
25
2.5.2.1 Prueba presuntiva
25
2.5.2.2 Prueba confirmativa
26
2.5.3 Determinación del NMP de coliformes fecales, por la técnica de fermentación de tubos múltiples
26
2.5.3.1 Prueba presuntiva
26
2.5.3.2 Prueba confirmativa
26
2.5.4 Aislamiento e identificación de Salmonella sp
27
2.5.4.1 Aislamiento e identificación
27
2.5.5 Aislamiento e identificación de Vibrio cholerae
27
2.5.5.1 Aislamiento e identificación
27
2.6 Pruebas bioquímicas para identificación
28
2.8 Material y equipo de laboratorio
29
2.9 Reactivos y medios de cultivo
30
III Resultados y discusiónes
32
3.1 Resultados de parámetros fisicoquímicos
33
3.1.1 Temperatura
33
3.1.2 pH 34
3.1.3 Salinidad
34
3.1.4 Oxígeno disuelto
35
3.2 Resultados del análisis microbiológico
36
3.2.1 Cuenta total viable de mesófilos aerobios
36
3.2.2 Número Más Probable de coliformes totales
37
3.2.3 Número Más Probable de coliformes fecales
37
3.2.4 Aislamiento e identificación de Salmonella y Vibrio cholerae
38
CONCLUSIÓNES
39
RECOMENDACIONES
41
BIBLIOGRAFÍA 43
ÍNDICE DE TABLAS
TABLA DESCRIPCIÓN
PÁGINA
1 Fecha de los muestreos
23
2 Sitios de muestreo
24
3 Temperatura en °C de las muestras analizadas
33
4 pH de las muestras analizadas
34
5 Salinidad en g/l de las muestras analizadas
35
6 Oxígeno disuelto en mg/l de las muestras analizadas
35
7 Resultados de la Cuenta Total Viable de mesófilos aerobios UFC/ml
36
8 Número Más Probable (NMP) de coliformes totales en 100 ml
37
9 Número Más Probable (NMP) de coliformes fecales en 100 ml 38
LISTA DE FIGURAS
FIGURA DESCRIPCIÓN
PÁGINA
1 Zona de estudio 22
RESUMEN
El presente trabajo se desarrolló en los laboratorios de la Dirección de Investigación y
Estudios de Posgrado (DIEP), del Instituto Tecnológico de Sonora. Los muestreos se
llevarón a cabo en el Ejido Capacidad Agraria del Parque acuícola la Atanasia, en el
periodo que comprende los meses de Julio a Octubre de 2000. El objetivo fue realizar un
análisis microbiológico al agua que se utiliza en el cultivo de camarón, así como al agua
residual acuícola, para determinar su calidad sanitaria y determinar si se está generando
contaminación bacteriana hacia los mares. Los indicadores bacteriológicos que se
emplearon fueron: cuenta total viable de bacterias mesófílicas aerobias, por el método de
vaciado en placa, el Número Más Probable de coliformes totales y fecales por la técnica de
tubos de fermentación múltiple, y el aislamiento e identificación por pruebas bioquímicas
de Salmonella sp. y Vibrio cholerae. Además se determinaron parámetros fisicoquímicos
como: pH, oxígeno disuelto, temperatura y salinidad.
Se realizaron un total de 48 muestras de agua en las cuales el 100% presentó desarrollo de
mesófilos aerobios en un rango de10 a 2,570 UFC/ml. El 12.5 % presentó incidencia de
coliformes totales y no se tuvo presencia de coliformes fecales. Todas las muestras
presentaron ausencia de Salmonella, y en lo referente a Vibrio cholerae, en dos muestras se
aisló este microorganismo.
Con los resultados obtenidos se considera que la actividad Acuícola del Ejido Capacidad
Agraria no está contaminando los mares, de hecho se considera que la carga microbiana
que se encontró es la normal para el tipo de actividad realizada.
INTRODUCCIÓN
La acuacultura es la producción, procesamiento y venta de organismos biológicos de un
sistema acuático. Aunque esta actividad ha existido por varios milenios en países asiáticos,
en México y específicamente en el sur de Sonora, es un campo relativamente nuevo
(Wheaton,1982).
En cuanto a recursos naturales, en México se cuenta con aguas costeras las cuales son
aprovechables para el cultivo de camarón. Además existen tierras con eminente vocación
acuícola que presentan las condiciones propicias para el desarrollo de la estanqueria
(Alatorre, 1998).
El agua es necesaria en muchos aspectos en cualquier sistema acuático de producción,
siendo los principales, la oxigenación y la eliminación de desechos. La oxigenación se
realiza en el estanque para prevenir la muerte del camarón por asfixia, y la eliminación de
impuresas es debido a que todos los organismos acuáticos producen desechos nocivos y su
acumulación en el estanque conduciría a la muerte. Por lo tanto son necesarios los
recambios de agua en los estanques. Dichos recambios generan aguas residuales acuícolas
las cuales desembocan en los mares (Wheaton,1982).
Es por esto, que en este estudio se pretende determinar la calidad microbiológica de las
aguas de abastecimiento, así como las de estanques y residuales, utilizando técnicas
establecidas en el Estándar Métodos para la determinación de la cuenta total viable, del
número más probable de coliformes fecales y totales, la determinación de Salmonella y
Vibrio cholerae, para poder determinar, con base a ello, un criterio, y ver si aumenta la
cantidad de microorganismos con este tipo de actividades acuícolas.
OBJETIVO GENERAL Realizar análisis microbiológicos al agua residual acuícola, así como al agua que se utiliza
en el cultivo de camarón para determinar su calidad sanitaria y determinar si el Ejido
Capacidad Agraria del Parque acuícola la Atanasia está generando contaminación hacia los
mares.
OBJETIVO ESPECÍFICOS
Seleccionar los sitios de muestreo.
Realizar la cuenta total viable para la cuantificación de mesófilos aerobios por la
técnica de vaciado en placa.
Determinación del número más probable de coliformes fecales y totales.
Determinación de Salmonella y vibrio cholerae.
Aislamiento de enterobacterias e identificación mediante pruebas bioquímicas.
Monitorear algunos parámetros fisicoquímicos del agua, como la temperatura, pH,
salinidad y la concentración de oxígeno disuelto.
HIPÓTESIS
Es posible que el Ejido Capacidad Agraria del Parque acuícola la Atanasia esté
contaminando microbiológicamente los mares, debido a que las aguas residuales acuícolas
generadas con el cultivo del camarón, se vierten al mar, sin ningún tratamiento previo.
JUSTIFICACIÓN
Para el cultivo de camarón en estanque, es muy importante la calidad del agua que lo
abastece, debido a que de ésta dependerá la calidad sanitaria de los camarones que se
obtengan en la cosecha para el consumo humano. Pero no sólo es importante cuidar la
calidad del agua de abastecimiento, sino también es necesario conocer la calidad del agua
residual que se genera.
La generación del agua residual es debido a los recambios que se realizan en los estanques
con el fin de tener oxígeno disuelto disponible para el camarón. Al realizar estos recambios
de agua, ésta funciona como un eliminador de desechos los cuales son enviados al mar.
Los recambios de agua dependerán de la biomasa que exista en el estanque. Entre mayor
sea el tamaño del camarón, mayor será su demanda de oxígeno. Es por ésto, que en la
presente investigación se pretende conocer la calidad microbiológica de las aguas que se
aportan a los mares a través de las aguas residuales acuícolas, y además que este trabajo
sirva como base para estudios posteriores, ya que es indispensable que se realicen este tipo
de estudios para conservar la calidad de las aguas de este lugar.
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1.1. Generalidades
1.1.1 Origen del agua.
El volumen total de agua en el mundo permanece constante, lo que cambia es la calidad y la
disponibilidad. El agua está constantemente reciclándose en un sistema conocido como el
ciclo hidrológico. Dentro de este ciclo el agua está en constante movimiento dirigido por la
energía solar. El sol provoca la evaporación de los océanos, lo cual forma nubes y las
precipitaciones. Esta evaporación también ocurre en los lagos, ríos y suelos, donde las
plantas contribuyen con cantidades significativas de agua por evapotranspiración. Aunque
el 80% de las precipitaciones vuelven a caer en los océanos, el resto cae sobre la tierra. Es
esta agua la que rellena el suelo y las aguas subterráneas, alimenta las corrientes de los ríos,
lagos y provee toda el agua necesaria para las plantas, animales y desde luego los humanos.
Aunque aparenta haber mucha agua, hay en realidad muy poca que esté disponible para
consumo humano, por lo que, aunque el volumen total del agua en el mundo permanece
constante, su disponibilidad y calidad sí se ven afectados. (Gray, 1994).
1.1.2 Acuacultura en estanques.
Para el cultivo del camarón se utilizan áreas de la superficie terrestre, las cuales no habían
sido totalmente explotadas por el hombre, debido a que son tierras con salinidades altas, y
no son buenas para cultivos tradicionales en la agricultura, sin embargo son aptas para el
cultivo de camarón. El método tradicional que se usa en la región es el sistema semi
intensivo, lo cual comprende estanques desde 3 a 12 hectáreas de espejo de agua, con una
profundidad promedio de 1 metro y con densidades de siembra de 12 a 13 post larvas por
m2. (Wheaton, 1982).
1.1.3 Calidad del agua de cultivo.
La calidad del agua es un término difícil de precisar debido a que depende del uso que se de
a la misma; por ejemplo, un agua de "buena" calidad para el crecimiento de algas puede no
ser "buena" para beber. La calidad del agua es "buena" o "mala" dependiendo del uso que
se le dé. (Wheaton, 1982).
Debido a que nuestro interés es producir organismos acuáticos, el agua de "buena" calidad
se define como el agua capaz de mantener vivo al organismo deseado y capaz de mantener
los estándares sanitarios necesarios para que los organismos cosechados sean utilizados
como se programó. . (Wheaton, 1982).
A pesar de los problemas para definir la "buena" calidad del agua, de tal forma que la
definición sea independiente del uso del agua, ésta debe poseer ciertas características
necesarias en una "buena" agua, se puede ver mejor dividiendo los organismos acuáticos en
tres clasificaciones: animales, plantas fotosintéticas y otros organismos. . (Wheaton, 1982).
La "calidad" del agua es un término relativo y su significado dependerá del uso que se le
intente dar al agua. Por lo tanto, el agua que se abastece a una empresa acuática debe de
poseer varias características para ser definida como agua de "buena" calidad. . (Wheaton,
1982).
La calidad del agua para acuacultura debe reunir algunos estándares como; la temperatura,
el contenido de oxígeno disuelto, la dureza y la salinidad. Estos estándares deben de estar
en los niveles óptimos para los organismos bajo cultivo o deben ser económicamente
rentables alterarlos para obtener tales niveles. La contaminación y los organismos
indeseables en la fuente de agua deben de estar tan cerca como sea posible de los niveles
óptimos requeridos. (Wheaton, 1982).
La temperatura del agua será un criterio importante para determinar si las especies
seleccionadas pueden cultivarse en el agua, ya que si ésta no es apta para el camarón, éste
sufrirá un estrés. La salinidad y sus variaciones son también factores importantes que deben
tomarse en cuenta, ya que algunas especies tienen amplios límites de tolerancia a la
salinidad, pero si los límites de salinidad se exceden, el desarrollo y la reproducción
podrían verse afectados. La elevada turbidez en el agua a causa de sólidos suspendidos
afecta la productividad y la vida misma de los organismos acuáticos. Reduce la penetración
de la luz en el agua y, de este modo, la productividad primaria. Esto, naturalmente también
afecta la producción secundaria. Existen informes de deficiencia de oxígeno en ciertos
casos como resultado de un aumento repentino en la turbidez. (Wheaton, 1982).
La calidad del agua está definida por interacciones químicas y físicas entre el suelo del
estanque, el clima y el agua.
La calidad del agua es un área importante de gran interés, ya que los estanques
comúnmente son contaminados, de una manera controlada, es decir vía fertilización, con la
finalidad de fomentar la productividad primaria y por consecuencia la producción de
camarón. La fertilización incrementa la eutroficación del agua al aumentar el suministro de
los principales nutrientes. Plantas microscópicas, florecen cuando hay un adecuado
suministro de nutrientes. El fitoplancton contribuye a la dieta del camarón, y produce
oxígeno disuelto por medio de la fotosíntesis, pero también consume oxígeno disuelto por
medio de la respiración celular y contribuye a la demanda de oxígeno bacteriano, al morir y
descomponerse. El alimento contamina el agua del estanque, vía consumo de oxígeno al
descomponerse y liberar sus nutrientes. El manejo de estanques tiene como finalidad
aportar suficientes nutrientes para un buen crecimiento del camarón, sin llegar a contaminar
el agua, ya que ello desencadenaría en un estrés del crustáceo, con su consecuente retardo
en el crecimiento. (Ibarra, 2001).
El manejo de la calidad del agua involucra un amplio entendimiento de no solamente lo que
ocurre dentro del estanque, sino lo que sucede con el agua de desecho del mismo. Las
descargas del agua ha llevado a la destrucción de áreas de crecimiento de camarón en Asia,
debido a la contaminación de aguas vertidas en los mismos estuarios. La producción de
camarón depende de un buen manejo de la calidad del agua de los estuarios, la cual está
directamente afectada por la calidad y cantidad de descargas de la granja. (Ibarra, 2001).
1.1.4 Cantidad del agua.
La disponibilidad del agua con calidad es importante para todos los sistemas de
acuacultura. (Wheaton, 1982).
Uno de los parámetros que deben reunir los abastecimientos de agua para empresas
acuaculturales es la cantidad de este líquido vital. La cantidad debe de ser la suficiente para
reponer pérdidas por evaporación y por transmisión; para proveer las cantidades necesarias
de oxígeno y además proveer la suficiente circulación para retirar los productos de desecho.
(Wheaton, 1982).
1.1.5 Características del suelo.
La calidad del suelo es importante en el caso de las granjas de estanques, por su influencia
en la productividad y la calidad del agua que se encuentra en contacto con él. Las
condiciones muy ácidas impiden la producción. Ciertos elementos, en particular el hierro y
el aluminio, son liberados en cantidades tóxicas que vuelven inasequible el fósforo, lo que
causa una incidencia grave de fósforo para el crecimiento de las algas (Pillay, 1998).
1.2 Microbiología acuática.
La microbiología acuática es el estudio de los microorganismos y sus actividades en
estuarios, mares. Se ocupa de virus, bacterias, algas, protozoos y hongos microscópicos que
habitan en aguas naturales. Algunos de estos son habitantes naturales de las aguas; otros
son transitorios que penetran en ese medio llevados por el aire y tierra, o como resultado de
procesos industriales y domésticos. Sus actividades revisten gran importancia en muchos
sentidos: afectan la salud de la humanidad y los animales; tienen un lugar clave en la
cadena alimentaría pues proporcionan nutrientes al siguiente nivel de vida acuática, y son
instrumentos de la cadena de reacciones bioquímicas que se efectúan en el ciclo de los
elementos, como la mineralización. (Pelzcar, 1993).
Las aguas superficiales, son susceptibles a ser contaminadas periódicamente, en mayor o
menor grado, por los microorganismos provenientes del agua atmosférica, por la que corre,
y por todos los desperdicios que son arrojados deliberadamente. La población microbiana
varía tanto en número como en clase de acuerdo al origen del agua, la composición de ésta
con relación a las sustancias nutritivas para los microbios, y las condiciones geográficas,
biológicas y climáticas (Pelzcar,1993).
1.2.1 Microbiología de las aguas marinas.
La flora microbiana de las aguas continentales guarda relaciones más o menos estrechas
con la de la tierra. La mayoría de las bacterias marinas son organismos halófilos, es decir,
necesitan que el medio en que viven tenga una proporción óptima de NaCl. Estos
microorganismos necesitan generalmente ciertas cantidades de iones Na+ y además
algunos de Cl-. Sin embargo, muchas bacterias marinas se desarrollan en el agua de mar
mejor que en las soluciones isotónicas del NaCl.
Aparte de las bacterias halófilas, en el agua de mar hay otras que son únicamente
halotolerantes, esto es, que pueden crecer así mismo bien en el agua dulce. Pero su
importancia es muy escasa en el mar.
La mayoría de las bacterias marinas son gram negativas, esto se ha comprobado en
investigaciones que el 80% de bacterias encontradas en la costa del sur de California tenían
un carácter tintorial.
Casi todas las bacterias marinas son organismos anaerobios facultativos, que por regla
generalmente se desarrollan mejor en presencia de oxígeno que en su ausencia. Sin
embargo, hay relativamente pocas especies aerobias estrictas y menos aún las que son
anaerobias así mismo estrictas.
La mayor parte de las bacterias marinas son capaces de utilizar concentraciones muy bajas
de sustancias nutritivas. Esta capacidad les permite desarrollarse en el agua de mar, aunque
esta sea muy pobre en tales principios por regla general.
Es corriente que en los mismos géneros concurran bacterias marinas con las terrestres y las
de agua dulce, en el mar son particularmente frecuentes las especies pertenecientes a los
géneros Pseudomonas, Beneckea, Spirillum, Alcaligenes y Flavobacterium.
Hasta hace pocos decenios se ha prestado a penas atención a los hongos que viven en el
mar. Sin embargo, entre tanto se ha podido comprobar que estos organismos están
ampliamente difundidos en las aguas marinas. Se han encontrado representantes de los
grandes grupos y se ha demostrado que una parte de ellos solo puede vivir en el agua de
mar y que necesitan de NaCl para subsistir. Su importancia para la microflora del mar es
evidentemente mayor que la de las bacterias correspondientes. (Rheinheimer, 1987).
1.2.2 Aspectos microbiológicos.
La microbiología del agua estudia la estructura y la vida de los microorganismos de los
manantiales, ríos, lagos y mares así como su función en el ciclo material del agua y los
sedimentos. Trata también de las relaciones de esos microorganismos con el resto de
animales y plantas que tienen su hábitat en dichos medios (Rheinheimer,1987).
Por otra parte la flora bacteriana natural del agua incluye principalmente bacilos gram
negativos del género Achromobacter, Alcaligenes, Chomobacterium, Flavobacterium,
Pseudomonas, y vibrios. Estas bacterias se encuentran en casi todas las aguas superficiales,
aún en las más distantes de cualquier fuente de contaminación. Las fuentes de estas
bacterias son muchas y variadas. La contaminación con bacterias comienza con la
condensación de lluvias en la atmósfera. Apenas cae la lluvia, el agua comienza a recoger
el agua del piso y la vegetación. Posteriormente, el agua de los ríos y lagos puede estar
expuesta a contaminación, lo cual aumenta considerablemente la flora.
Las bacterias más comunes en el agua se clasifican de la siguiente manera:
* Bacterias provenientes del aire: Staphylococcus, Sarcina, Bacillus y Micrococus.
* Bacterias naturales del agua: Achomobacter, Alcaligenes, Chromobacterium,
Flavobacterium, Pseudomonas, y Vibrios.
* Bacterias provenientes del suelo: Bacillus y Clostridium.
* Bacterias provenientes de alcantarillas: Acromobacter, Escherichia, Serratia, Proteus,
Streptococcus, Sprillum y Zooglea.
Es importante señalar que entre los organismos que se introducen al agua como resultado
de la contaminación con aguas residuales u otro tipo de contaminación, se encuentran las
bacterias patógenas como la Salmonella, Shigella, Vibrios, etc. (Soluap, 1998)
1.3 Microbiología de las aguas
1.3.1 Mesófilos aerobios.
El recuento de este tipo de microorganismos no pretende poner en evidencia todos los
microorganismos presentes en un agua determinada, ya que la variedad de especies se
diferencia de acuerdo a sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su
crecimiento, oxígeno disponible, etc. Estos factores hacen que el número de colonias
contadas constituyan una estimación de la cifra realmente presente. No obstante, cuando se
sigue fielmente las condiciones que se señalan en la técnica para su desarrollo, pueden
llegar a proporcionar resultados lo suficientemente reproducibles para darle significado a la
prueba.
Dentro de la flora mesófila aeróbica tenemos: bacilos, cocos gram positivo y gram
negativos aislados o agrupados en todas las variedades que son conocidos.
La utilidad de las bacterias mesófilicas aeróbicas en la microbiología sanitaria se han
recomendado para los siguientes objetivos.
Como indicador de la posible presencia de microorganismos patógenos.
Como indicador del valor comercial de un alimento.
Como indicadores de las condiciones higiénicas en las que se ha elaborado el producto.
Como indicador de la idoneidad de un ingrediente cuando se va a incorporar a un alimento.
Para seguir la eficiencia de un proceso germicida o de preservación.
Para predecir la vida de anaquel de un alimento.
Para evaluar la calidad inicial del agua.(Amador, 1993).
1.3.2 Grupo coliforme
Los organismos coliformes constituyen un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente
intestinal para la mayoría de las especies que involucra. Son bacilos cortos, gram negativos,
que fermentan la lactosa con producción de gas. Son anaerobios facultativos y se
multiplican a mayor rapidez a temperatura de 37°C. (Amador, 1993).
A fin de simplificar su manejo en el laboratorio, se ha establecido una definición en base a
las características más constantes que exhibe la especie tipo del grupo, Escherichia coli.
Esta simplificación da lugar a que se incluyan en el grupo, bacterias de origen no intestinal
tales como: Enterabacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae y
Citrobacter, porque comparten características que la definición impone, por lo que no
necesariamente guardan una relación directa con la contaminación de origen fecal y en
consecuencia, tampoco con la presencia de patógenos entéricos (Amador, 1993).
Las principales especies de bacterias coliformes son: Escherichea coli y Enterobacter
aerogenes; no obstante, las especies que es posible que se ajusten a estos criterios, son más
de veinte encontrándose entre las mismas especies de otros géneros de la familia
Enterobacteriaceae e incluso especies de Aeromonas. El grupo de coliformes fecales
incluye a los coliformes capaces de crecer a temperaturas elevadas (44.5-45°C). El primer
objetivo de la prueba de incubación a temperatura elevada fue la diferenciación de los
coliformes de origen fecal de los que no tienen origen fecal.
Se utiliza mucho las técnicas de recuento de coliformes totales y de coliformes fecales, e
incluso el recuento de la E. Coli, habiéndose admitido como recuentos indicadores del
grado de contaminación. (Frazier, 1993).
Como índices de contaminación fecal en el agua los organismos coliformes
individualizados en la E. Coli constituyen el primer ejemplo de una aplicación práctica de
la microbiología en el campo de saneamiento y de la higiene. (Frazier, 1993).
El empleo de los organismos como indicadores de contaminación fecal en el agua se
fundamente (para fines de control sanitario), en las siguientes consideraciones:
Estos microorganismos existen de manera constante en la materia fecal.
Solo una proporción discreta de las bacterias que satisfacen la definición de
organismo coliforme no son huéspedes normales del organismo.
No se multiplican en aguas limpias.
En el agua expuesta a contaminación fecal existen siempre en una proporción miles
de veces superior a las de las bacterias patógenas que eventualmente pudieran estar
presentes.
Tienden a morir en el agua a un ritmo semejante al de las bacterias patógenas
semejantes.
Su recuento en el laboratorio es de fácil ejecución y no requiere de equipo y
material sofisticado. (Fernandez, 1981)
1.3.3 Salmonella
Las personas y los animales son directa o indirectamente la fuente de contaminación de los
alimentos con Salmonelas, estas bacterias producen la gastroenteritis humana. (Frazier,
1993).
El principal hábitat de las especies de Salmonella es el tracto intestinal de animales de
sangre caliente. Como formas intestinales los organismos son excretados en las heces desde
las que pueden ser transmitidas por insectos y por otros seres vivos a un gran número de
lugares. (Jay, 1992).
Cuando el agua y los alimentos que han sido contaminados por insectos o por otros medios
de contaminación son consumidos por personas o animales, estos microorganismos son
diseminados de nuevo por medio de la matera fecal, cerrandose de este modo su ciclo en la
naturaleza. (Jay, 1992)
Estos microorganismos se diferencian de las demás bacterias gram negativas por ser
capaces de crecer en un gran número de medios de cultivo y producir colonias
perfectamente visibles en 24hrs. a temperatura próxima a 37°C. El pH óptimo de
crecimiento se halla en torno a la neutralidad, siendo bactericidas los valores por encima de
9.0 y por debajo de 4.0. Para que su crecimiento sea óptimo, las Salmonellas necesitan un
pH entre 6.6 y 8.2. (Jay, 1992).
Respecto a la humedad disponible, se ha señalado inhibición a valores de actividad de agua
(aw) por debajo de 9.4 en medios con pH neutros, necesitandose valores de actividad de
agua (aw) más elevados mientras el pH disminuye hacía sus valores mínimos de
crecimiento. (Jay, 1992).
A diferencia de los estafilococos, las Salmonelas son incapaces de tolerar altas
concentraciones de sal. Se dice que una concentración de sal superior al 9% en la salmuera
es bactericida. (Jay, 1992)
Para obtener un buen aislamiento de Salmonella, se requiere de un pre-enriquecimiento, el
cual consiste en facilitar a las Salmonelas presentes una recuperación del estado en el que
se encuentren como resultado de la exposición a condiciones traumatizantes, y evitar un
sobre desarrollo de la flora competitiva que enmascararía su aislamiento. (Amador, 1993).
Después de la incubación en los medios de enriquecimiento, se obtiene una flora mixta y a
partir de ellas su procede al aislamiento de las Salmonelas, la cual se realiza en medios
sólidos los que mantienen un efecto inhibidor sobre la flora asociada, estimulando la
formación de las colonias de Salmonella. (Amador, 1993).
1.3.4 Vibrio cholerae
Las bacterias de este género abundan en el agua dulce y en el agua de mar, en el suelo, y
en el tubo digestivo del hombre y de los animales. Algunas medianamente halófilas. Y
algunas especies son patógenas para el hombre. (Fernandez, 1981).
El Vibrio cholerae pertenece a la familia de las Vibrionaceas, al género Vibrio, y se divide
en cuatro biovares: eltor, cholerae, proteus y albensis.
Se encuentran en hábitats acuáticos en una gran variedad de salinidad. Son muy comunes
en ambientes marinos, algunas especies se encuentran sobre la superficie y el contenido
intestinal de animales marinos (Piatkin, 1989, Bojorquez, 1994).
Los vibriones coléricos representan un bacilo encorbado que mide de 1.5-0.3µm de
longitud y 0.3µm de grosor, son muy móviles, monótricos, por lo común no esporulados ni
capsulados, siendo gram negativos. (Piatkin, 1989, Bojorquez, 1994).
Los vibriones del cólera son anaerobios facultativos, su crecimiento óptimo tiene lugar en
los límites térmicos de 18 a 37°C oscilando entre la temperatura de 14 a 42°C. Se cultivan
bien en medios de pH 7.2 a 8.6, en medios sólidos forman colonias redondas, convexas,
translúcidas con bordes enteros de un matiz azul claro. En caldo alcalino y en agua de
peptona a las seis horas de incubación aparece una película efímera compuesta por
vibriones coléricos. Fermentan la D-.glucosa dando como resultado la producción de ácido
pero no, gas. La mayoría de las especies son oxidasa positiva. (Piatkin, 1989, Bojórquez,
1994).
1.4 Interpretación de las pruebas bioquímicas en los medios
correspondientes. Los autores Mc Faddin (1994) y Merck (1994), describen la importancia de las diferentes
pruebas bioquímicas, las cuales se presentan a continuación.
1.4.1 Prueba de la oxidasa
Con esta prueba se determina la presencia de la enzima oxidasa. Y la reacción es positiva si
se observa producción de color púrpura oscuro en la tira reactiva Dry Slide Oxidase dentro
de los primeros 18 a 20 segundos.
1.4.2 Prueba de la catalasa
Determina la presencia de la enzima catalasa. Y la reacción es positiva, si después de añadir
peróxido a una pequeña muestra de la colonia, se forman burbujas bien visibles (formación
de oxígeno).
Prueba negativa si no existe formación de burbujas (producción de oxígeno).
1.4.3 Prueba del citrato.
Determina si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de
carbono para el metabolismo, provocando alcalinidad.
Se toma como prueba positiva, cuando se observa crecimiento con color azul intenso en el
pico de la flauta; y como prueba negativa, cuando no se observa crecimiento ni cambio de
color en el agar de Citrato de Simmons.
1.4.4 Medio LIA
Este medio mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un
aminoácido para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad. Y se emplea para
determinar la descarboxilación y desaminación de la lisina. La primera reacción se lleva a
cabo en condiciones de anaerobiosis y la segunda en aerobiosis.
1.4.5 Medio SIM
Se utiliza básicamente para la identificación de enterobacterias que tengan capacidad de
formar sulfuros, producir indol y que tienen movilidad.
Si el medio presenta una coloración negra, esto indica que se ha liberado ácido sulfhídrico
(H2 S) por acción enzimática, de los aminoácidos que contienen azufre.
La prueba del indol determina la capacidad de un microorganismo de desdoblar el indol de
la molécula de triptófano. Esta se realiza agregando al medio ya inoculado e incubado por
48 horas 5 gotas de éter etílico y 5 gotas de reactivo de Kovac's. Se toma como prueba
positiva si se forma un anillo rojo en la superficie del medio en la capa alcohólica. Es
prueba negativa cuando no se produce color en la capa alcohólica y toma el color del
reactivo de Kovac's (amarillo).
La movilidad determina si un microorganismo es móvil o inmóvil. Las bacterias tienen
movilidad por medio de sus flagelos, que se encuentran principalmente entre los bacilos,
sin embargo. Las bacterias móviles pueden contener un solo flagelo o muchos; además su
localización varia con respecto a su especie bacteriana y las condiciones de cultivo. Los
organismos no móviles carecen de flagelos. Y se dice que un organismo tienen movilidad
cuando en el medio se presenta turbidez, ya que los organismos emigran de la zona de
siembra y se difunden en el medio. Si el medio se mantiene claro, es prueba negativa, ya
que el crecimiento bacteriano esta acentuado siguiendo la línea de siembra.
1.4.6 Urea
Este Medio determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea, formando dos
moléculas de amoníaco por acción de la enzima ureasa.
La prueba positiva se observa por un vire de color que va de rosa pálido (color inicial) a un
color rojo violeta intenso.
1.4.7 Medio OF
En este medio se determina el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de
carbono. Fundamentalmente para diferenciar géneros intestinales no entéricos gram
negativos de las enterobacterias.
La oxidación da positiva cuando en el tubo que no contiene aceite existe producción de
ácido, la cual se observa con el cambio de color, de verde va amarillo.
La fermentación es positiva cuando el tubo que contiene aceite cambia de color, de verde a
amarillo, lo cual indica que hay producción de ácido.
1.4.8 Prueba del rojo de metilo
Esta prueba sirve para determinar la capacidad de un organismo de producir y mantener
estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa, y vencer la
capacidad amortiguadora del sistema. Es una prueba cualitativa de la producción de ácido;
algunos organismos producen más ácido que otros.
Es prueba positiva, cuando el cultivo es suficientemente ácido como para permitir que el
reactivo rojo de metilo mantenga un definido color rojo (pH=4.4) en la superficie del
medio.
Es prueba negativa, cuando presenta color amarillo después de agregar el rojo de metilo
(pH=6) en la superficie del medio.
Reacción retardada, si se presenta un color anaranjado. Se requiere seguir la incubación
hasta cuatro días y repetir la prueba.
1.4.9 Reacción de Voges-Proskauer
Esta reacción determina la capacidad de algunos organismos de producir un producto final
neutro, el acetilmetilcarbinol (acetoína), a partir de la fermentación de la glucosa.
Es prueba positiva cuando se presenta un color rojo rosado en la superficie del medio
(presencia de acetoína), después de la adición de 0.6 ml de∝- naftol y 0.4 ml de KOH al
40%.
Es prueba negativa, si el color es amarillo en la superficie del medio (el mismo color del
reactivo). Puede formarse un color cobrizo, pero aun así la reacción es negativa (debido a la
reacción de los reactivos al mezclarse).
1.4.10 Agar TSI
En este medio se determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono
específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases,
junto con la determinación de posible producción de ácido sulfhídrico (H2S).
Existe fermentación de la glucosa solamente si la capa profunda presenta coloración
amarilla, lo que indica una reacción ácida.
Existe fermentación tanto de la lactosa como de la glucosa, si en el pico de la flauta y en la
capa profunda se presenta la coloración amarilla, lo cual indica una reacción ácida.
En caso de que se presente una coloración roja en el pico de la flauta o en la capa profunda,
esto indica una reacción alcalina.
La producción de gas se manifiesta cuando en el medio se presentan burbujas, un
desdoblamiento del medio, o un desplazamiento completo del medio del fondo del tubo.
Si el medio presenta una coloración negra, esto indica que se ha liberado ácido sulfhídrico
(H2 S) por acción enzimática, de los aminoácidos que contienen azufre.
1.4.11 Medio MIO
Este medio se utiliza para estudiar movilidad, producción de indol y descarboxilación de la
ornitina.
La prueba del indol determina la capacidad de un organismo de desdoblar el indol de la
molécula triptófano. Esta se realiza agregando al medio 5 gotas de reactivo de Kovac's, y da
prueba positiva si se forma un anillo rojo en la superficie del medio.
La movilidad determina si un microorganismo es móvil o inmóvil. Y se dice que un
organismo tienen movilidad cuando en el medio se presenta turbidez, ya que los
organismos emigran de la zona de siembra y se difunden en el medio. Si el medio se
mantiene claro, es prueba negativa, ya que el crecimiento bacteriano esta acentuado
siguiendo la línea de siembra.
1.4.12 Prueba de la licuefacción de la gelatina
Con esta prueba se determina la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo
proteolítico (gelatinazas) que licúan la gelatina.
Se siembran las colonias por picadura en el medio, se incuban a 37 °C por 48 horas.
Después se colocan los tubos a 4°C para observar aquellos en los que la licuefacción de la
gelatina es positiva.
1.4.13 Prueba del malonato
Con esta prueba se determina la capacidad de un organismo de utilizar malonato como
única fuente de carbono, con la consiguiente alcalinidad.
Si se presenta un color azul claro a azul Prusia intenso en todo el medio, la prueba es
positiva.
Si no se presenta cambio de color (verde), únicamente hubo fermentación de la glucosa
1.5 Parámetros fisicoquímicos en agua de uso acuícola. Según Ibarra (2001), las parámetros más importantes para el cultivo de camarón son los
siguientes:
1.5.1 Temperatura.
La temperatura óptima recomendada para el cultivo de camarón es de 26 a 30°C, pero ésta
depende principalmente de la región en la cual se realice esta actividad. Para controlar la
temperatura en agua de estanques, se recomienda realizar recambios.
1.5.2 pH
El pH puede ser definido con fines prácticos como el logaritmo negativo de la
concentración de iones hidrógeno. El pH del agua pura a 25°C es de 7 unidades. Valores de
pH menores a 7 se consideran ácidos, y los que están por arriba son básicos.
El pH óptimo para el crecimiento del camarón se encuentra probablemente entre 7 y 9
unidades. Para controlar la calidad física, química y biológicas del entorno acuático se
emplea la cal, la cual tiene las siguientes funciones:
Eliminar microorganismos, especialmente parásitos, por medio de una reacción
cáustica.
Elevar el pH del agua, de un valor ácido a un valor neutral o ligeramente alcalino.
Promover la productividad biológica, incrementando la descomposición de sustancias
orgánicas por bacterias, creando un incremento en las reservas de oxígeno y carbono.
Posterior a la adición de cal cuando su objetivo principal es la eliminación de parásitos, se
realiza un recambio de agua en el estanque, lo que provoca que los parásitos y algunas
bacterias patógenas se descarguen.
1.5.3 Salinidad
La salinidad es la medida de los iones totales disueltos en agua. Se expresa normalmente en
partes por mil (ppm). Una salinidad que oscile entre 15 y 35 ppm, se considera normal para
el camarón, cultivado en Centroamérica. Las condiciones de hipersalinidad se desarrollan
más rápidamente en los estanques, que en los estuarios, ello debido a la evaporación. Al
aumentar la densidad específica en dichas capas, provoca que la sal se hunda y se acumule
en el fondo del estanque. Mediante los recambios de agua podemos atenuar altas
salinidades de los estanques, pero para ello se requiere que el agua de descarga sea tomada
del fondo de los estanques a efecto de eliminar el agua con mayor salinidad.
1.5.4 Oxígeno disuelto (OD)
La concentración de oxígeno en estanques, se determina principalmente por la producción
de oxígeno y su consumo. El oxígeno es producido únicamente por el fitoplancton, y es
consumido por el camarón y organismos microbianos. En estanques la producción de
oxígeno se realiza prácticamente en la columna de agua.
Los niveles de oxígeno en la mayoría de los estanques semi intensivos son manejados
mediante los recambios de agua. Es decir, el agua de estanque, caracterizada por una mayor
concentración en nutrientes y materia orgánica disuelta, es descargada y remplazada con el
agua del estero de mejor calidad. Comúnmente se recambia entre un 5 y un 10% del
volumen del estanque al día.
Los esteros que reciben desperdicios urbanos y de agricultura pueden tener un contenido
relativamente bajo en OD, especialmente si no existe un intercambio significativo con agua
más limpia de la bahía. Las descargas de las granjas camaroneras pueden sumarse a la carga
orgánica y de nutrientes al estero.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
La realización de los análisis para el estudio de esta investigación, se llevaron a cabo en los
laboratorios de la Dirección de Investigación y Estudios de Postgrado (DIEP), y el Ejido
Capacidad Agraria del Parque acuícola la Atanasia.
2.1. Descripción de la zona de estudio
El presente estudio se realizó en el Parque acuícola la Atanasia, ubicado en el municipio de
San Ignacio, Sonora (Ver figura 1).
FIGURA 1 Zona de Estudio
No. 15 Ejido Capacidad Agraria
2.2 Periodo de muestreo
Para llevar a cabo el estudio, se realizaron muestreos cada quince días durante cuatro
meses. El periodo de muestreo comprende de Julio a Octubre de 2000, y se puede observar
en la tabla 1.
Tabla 1 Fecha de los muestreos
MUESTREO FECHA
1 24 de Julio
2 7 de Agosto
3 21 de Agosto
4 4 de Septiembre
5 18 de septiembre
6 2 de octubre
2.3 Sitios de muestreo
Para seleccionar los sitios de muestreo en esta investigación, se tomaron en cuenta los
estanques que se van a cosechar a lo ultimo, ya que estos estanques no tienen problemas de
producción, por lo tanto se podrán muestrear durante el ciclo completo. La localización de
estos sitios se encuentra en la tabla 2.
Tabla 2 Sitios de muestreo
SITIO UBICACIÓN
1 Entrada del estanque 7
2 Entrada del estanque 8
3 Entrada del estanque 9
4 Salida del estanque 9
5 Salida del estanque 8
6 Salida del estanque 7
7 Dren de descarga
8 Canal de llamada
2.4 Toma y transporte de la muestra
Las muestras se recolectaron por la mañana con frecuencia de quince días
aproximadamente, en frascos de vidrio limpios y estériles, con una capacidad de 300 ml. Se
sumergió el frasco en el agua hasta obtener un volumen de aproximadamente 3/4 partes de
la capacidad del frasco, las muestras se colocaron en una hielera para su transporte, se
conservan a 4°C con suficiente hielo, el análisis se realizó tan rápido como fue posible, no
más de 6 horas después del muestreo a fin de evitar resultados erróneos.
2.5 Análisis microbiológicos
2.5.1 Determinación de la cuenta total viable de mesófilos aerobios, por la
técnica de vaciado en placa.
Se agitó la muestra alrededor de 25 veces, se tomó una alícuota de 10 ml y se agregó a un
frasco de dilución que contenía 90 ml de agua destilada estéril, para obtener la dilución
1:10. A partir de esta dilución se tomó 1 ml y se añadió a un tubo con 9 ml de agua
destilada estéril para obtener la dilución 1:100. Para la dilución 1:1000 se siguió el mismo
procedimiento de la dilución 1:100. De cada una de las tres diluciones se tomó 1 ml, se
inoculó en una caja petri respectivamente, se agregaron de 15 a 20 ml de agar cuenta
estándar previamente esterilizado, se homogenizó y se dejo solidificar. La incubación se
llevó a cabo a 37°C durante 24 a 48 horas. Después de las 24 y 48 horas, se realiza el
conteo de las colonias.
El resultado de bacterias mesófilas aerobias se expresa en unidades formadoras de colonias
por mililitro, el cual se obtuvo multiplicando el número de colonias obtenidas por la inversa
del factor de dilución correspondiente a la placa contada entre 30 y 300 colonias.
2.5.2 Determinación del NMP de coliformes totales, por la técnica de
fermentación de tubos múltiples.
2.5.2.1 Prueba presuntiva.
A partir de las diluciones realizadas de 10:10 a 10:1000 se siembra por triplicado 1 ml en
tubos con 10 ml de caldo lactosado con campana de Durham, después de inoculados se
incubaron de 24 a 48 horas, de 35 a 37°C. Se toman como positivos aquellos tubos que
presentaron turbidez y gas en la campana Durham. Se recomienda que antes de incubar se
verifique que las campanas no tengan burbujas con el fin de evitar falsos positivos.
2.5.2.2 Prueba confirmativa.
De los tubos positivos de la prueba presuntiva se resembró mediante dos asadas en tubos
con 10 ml de caldo Verde Bilis Brillante con campana Durham, se incubaron de 35 a 37°C
por 24 a 48 horas. La presencia de turbidez en el caldo y gas en la campana Durham es
confirmación de la presencia de organismos coliformes totales en la muestra analizada.
2.5.3 Determinación del NMP de coliformes fecales, por la técnica de
fermentación de tubos múltiples.
2.5.3.1 Prueba presuntiva
Para la determinación de coliformes fecales, la prueba presuntiva es exactamente igual que
para coliformes totales.
2.5.3.2 Prueba confirmativa
De los tubos positivos de la prueba presuntiva se resembró por medio de dos asadas en
tubos con 10 ml caldo EC con campana Durham, la incubación se llevó a cabo en baño
María a 44.5°C de 18 a 24 horas. Los tubos que presentaron turbidez en el caldo y gas en la
campana Durham confirman la presencia de organismos coliformes fecales en la muestra
analizada.
2.5.4 Aislamiento e identificación de Salmonella sp.
Primeramente se realizó un preenriquecimiento, tomando de la muestra 25 ml, los cuales se
agregaron a un matraz que contenía 225 ml de caldo lactosado, se incubaron por 24 horas
de 35 a 37°C. Después de transcurridas las 24 horas, se agitó el matraz y se tomó 1 ml del
caldo lactosado y se colocó en un tubo con 10 ml de caldo selenito cisteina, el cual se
incuba de 35 a 37ºC por 24 horas.
2.5.4.1 Aislamiento e identificación
Los tubos con caldo selenito cisteina se sembraron por estrías en Agar MacConkey, y se
incubó de 35 a 37ºC durante 24 horas, de las colonias que se desarrollaron se resembró
nuevamente en el mismo medio para obtener colonias puras, y a partir de ellas se
realizaron pruebas bioquímicas para su identificación.
2.5.5 Aislamiento e identificación de Vibrio cholerae
En cuanto al aislamiento de Vibrio cholerae se utilizaron matraces con 225 ml de caldo
peptona alcalina, el cual se inoculó con 25 ml de muestra y se incubaron de 35-37°C por 18
a 24 horas.
2.5.5.1 Aislamiento e identificación
Las muestras en caldo peptona se siembran por estrías en agar TCBS, se incubaron de 35 a
37°C por 24 horas. Las colonias desarrolladas se resembraron nuevamente para obtener
colonias puras, y a partir de ellas se realizaron pruebas bioquímicas para su identificación.
2.6 Pruebas bioquímicas para identificación
A continuación se presenta la lista de las pruebas bioquímicas que se les realizó a las
colonias puras aisladas en sus respectivos medios.
* Aprovechamiento del carbono de la glucosa.
* Aprovechamiento del carbono de la lactosa.
* Producción de indol.
* Aprovechamiento del molonato como única fuente de carbono.
* Aprovechamiento del citrato como única fuente de carbono.
* Prueba del rojo de metilo.
* Prueba de Vogues-Proskauer.
* Hidrólisis de la gelatina.
* Movilidad.
* Prueba de la oxidasa.
* Prueba de la catalasa.
* Reacciones de oxidación-fermentación.
* Producción de ácido sulfhídrico.
* Aprovechamiento del nitrógeno de la urea.
* Descarboxilación de la lisina.
* Descarboxilación de la ornitina.
* Desaminación oxidativa de la lisina.
2.8 Material y equipo de laboratorio.
A continuaciòn se enlistan los materiales y equipo que se empleo para el desarrollo de
esta investigación.
* Frascos de DBO.
* Matraces de 50ml., 125ml., 250ml., 500ml., y 1000ml., marca: Kimax y Pirex.
* Frascos para dilución de 100ml., marca:Kimax.
* Probetas de 100 y 500ml., marca:Kimax.
* Mecheros fischer.
* Asas de platino.
* Cajeros metálicos.
* Cajas petri de 15 x 100mm., marca: kimax.
* Cajas desechables.
* Pipeteros metálicos.
* Pipetas de 1, 5 y 10ml., marca:Kimax.
* Tubos de ensayo con rosca y tapón, marca: Pirex y Kimax.
* Campanas de Durham.
* Guantes de asbesto.
* Porta objetos.
* Cubre Objetos.
* Goteros.
* Espátulas.
* Gradillas.
* Canastillas metálicas.
* Pisetas.
* Termómetro.
* Microscopio, marca: Swift modelo 1000-D.
* Autoclave, marca : Napco modelo 8000-DSE.
* Olla de presión, marca: Presto con capacidad de 21 lts.
* Potenciómetro, marca:Orion EA 940.
* Incubadoras, marca: Mapsa modelo LC334;VWR Scientific modelo 1545, Imperial II.
* Refrigeradores, marca: Hot-point.
* Contador de colonias Quebec, marca: Darkfield.
* Baño María con temperatura, marca: Thelco.
* Balanza analítica, marca: Mettler AE200; Counting Balance EX 2000N.
* Hielera, marca: Thermo.
2.9 Reactivos y medios de cultivo
La siguiente lista, presenta los reactivos y medios de cultivo empleados en esta
investigación.
* Caldo lactosado.
* Caldo RM_VP.
* Caldo urea.
* Caldo malonato de Ewing modificado.
* Caldo bilis verde brillante.
* Caldo EC.
* Caldo selenito y cistina.
* Medio MIO.
* Medio SIM.
* Medio basal OF.
* Agar nutritivo.
* Agar TCBS.
* Agar de hierro y lisina.
* Agar citrato de Simmons.
* Agar TSI.
* Agar MacConkey.
* Agar estándar métodos.
* Peptona de carne.
* Gelatina nutritiva.
* Tiras reactivas dry slide Oxidase.
* Agua destilada.
* Ácido clorhídrico.
* Cloruro de sodio.
* Hidróxido de sodio.
* Fenol.
* Alcohol etílico.
* Hidróxido de potasio.
* Indicador rojo de metilo.
* Eter etílico
* Colorantes: cristal violeta, safranina.
* Lugol.
* Alcohol-Acetona.
* Aceite mineral estéril.
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓNES
A continuación se presentan y se discuten los resultados obtenidos en las 48 muestras de
agua de uso acuícola, utilizadas en el Ejido Capacidad Agraria del Parque Acuícola la
Atanasia.
Los resultados obtenidos se compararon con los criterios ecológicos de calidad del agua,
para aquellos parámetros en los que existe limite de dichos criterios.
3.1 Resultados de los parámetros fisicoquímicos
A las muestras analizadas también se les determinó la temperatura, pH, salinidad y oxígeno
disuelto.
3.1.1 Temperatura
La temperatura registrada como se observa en la tabla No. 3, estuvo en un rango de 28.1 a
34°C.. Los criterios ecológicos marcan un rango de 26 a 30°C, sin embargo este es un
parámetro que varia según la zona en que se realiza esta actividad. Este parámetro se puede
controlar con recambios de agua.
Tabla 3 Temperatura en °C de las muestras analizadas.
MUESTREO SITIO I II III IV V VI
1 33.0 29.1 29.4 30.2 32.6 29.7 2 33.0 29.5 29.4 30.0 32.6 29.7 3 33.0 29.7 29.4 30.2 32.6 NM 4 33.0 28.6 28.1 29.9 32.6 NM 5 33.0 28.6 28.1 30.0 32.6 29.7 6 33.0 28.8 28.1 29.9 32.6 29.7 7 33.0 28.8 28.4 29.6 32.6 29.7 8 33.0 30.2 30.1 30.4 32.6 31.1
NM = No muestreado
3.1.2 pH
Los resultados del pH se pueden observar en la tabla 4. Las 48 muestras analizadas se
encontraron en un rango de 7.55 a 8.40, por lo tanto todas las muestras estuvieron dentro
del rango de los criterios ecológicos ya que este marca como rango un pH de 7.5 a 8.8
para las aguas de uso acuícola.
Tabla 4 pH de las muestras analizadas.
MUESTREO SITIO I II III IV V VI
1 7.7 7.76 8.24 8.3 8.34 8.32 2 7.7 7.78 8.07 8.2 8.35 8.28 3 7.7 7.79 7.83 8.4 8.38 NM 4 7.6 7.82 8.04 8.2 8.64 NM 5 7.7 7.98 7.8 8.0 7.93 8.12 6 7.7 7.92 7.91 8.3 8.19 7.91 7 7.8 7.92 8.25 8.1 8.4 8.28 8 7.6 7.74 7.98 8.2 8.28 8.14
NM = No muestreado
3.1.3 Salinidad
Referente a la salinidad se encontraron valores que van desde 37 a 49 ppm, como se puede
observar en la tabla 5. Estos valores superan los determinados por los criterios ecológicos
que es de 27 a 35 ppm. Éstos rangos pueden variar según la zona y la especie de camarón.
Tabla 5 Salinidad en ppm de las muestras analizadas.
MUESTREO SITIO I II III IV V VI
1 39 40 39 39 40 39 2 40 39 39 38 39 39 3 40 40 38 37 38 NM 4 49 45 40 40 39 NM 5 45 45 41 40 39 40 6 45 45 43 41 40 40 7 40 41 41 40 40 41 8 40 40 39 38 40 38
NM = No muestreado
3.1.4 Oxígeno disuelto
Los valores de oxígeno disuelto (OD) se mantuvieron entre 2.62 y 5.07 mg/l, estos valores
varían según el tamaño del camarón y la biomasa en el estanque. Los criterios ecológicos
señalan un valor de 6 mg/l.
Tabla 6 Oxígeno disuelto en mg/l de las muestras analizadas.
MUESTREO SITIO I II III IV V VI
1 3.57 3.25 4.35 3.01 NM NM 2 3.61 4.19 3.12 3.61 NM NM 3 3.12 4.71 3.14 3.71 NM NM 4 4.48 4.80 3.79 2.84 NM NM 5 4.71 4.84 3.69 2.62 NM NM 6 3.69 3.87 3.64 4.48 NM NM 7 4.70 5.07 3.57 3.45 NM NM 8 3.92 5.06 4.70 4.15 NM NM
NM = No muestreado
3.2 Resultados de análisis microbiológicos
3.2.1 Cuenta Total Viable de mesófilos aerobios
La cuenta total viable se determinó a un total de 48 muestras recolectadas en los diferentes
sitios de muestreo, presentando desarrollo en un rango entre 10 a 2,570 UFC/ml para las
muestras de agua de uso acuícola, mientras que para el agua residual el rango estuvo entre
10 a 2,000 UFC/ml. Como se puede observar en la tabla 7 la cantidad de UFC/ml tanto en
las aguas que alimentan los estanques como la de salida es muy baja, pero su presencia se
debe a que estás aguas se encuentran al aire libre y con una actividad humana mínima, que
se requiere para el cultivo de camarón.
Sin embargo no se puede considerar que esta agua contamine microbiológicamente los
mares ya que la cantidad de flora encontrada se mantiene casi constante, y además el
objetivo principal de este parámetro es el de indicador de la posible presencia de gérmenes
patógenos (Fernandez,1981).
Tabla 7 Resultados de la Cuenta Total Viable de mesófilos aerobios UFC/ml.
MUESTREO
SITIO I II III IV V VI 1 90 320 10 20 10 780 2 34 1170 50 50 20 70 3 80 30 70 2570 10 NM 4 200 20 30 30 20 NM 5 10 100 70 660 50 40 6 20 20 1900 70 90 40 7 2000 20 880 160 70 30 8 10 70 450 30 20 480
NM = No muestreado
3.2.2 Número Más Probable de coliformes totales
Respecto a coliformes totales los criterios ecológicos norman un rango de 0 a 23,000
NMP/100ml, en el cual todas las muestras se encuentran dentro de este rango con un valor
que va de 0 a 2,300 NMP/100ml. Esto se debe al contacto del agua con el medio ambiente
que es su principal fuente de contaminación. También dicha contaminación se puede deber
al tipo de actividad acuícola que se realiza. Sin embargo la cantidad de microorganismos de
este tipo, no es significativa debido al uso que se le da a esta agua y no afecta al cultivo de
camarón, y a su vez no se genera contaminación hacia los mares ya que se crea el efecto de
dilución al llegar el agua de descarga a los esteros o a mar abierto, según el caso de cada
granja.
Tabla 8 Número Más Probable (NMP) de coliformes totales en 100ml
MUESTREO
SITIO I II III IV V VI 1 0 2300 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 400 NM 4 0 0 2300 0 0 NM 5 0 0 0 0 0 0 6 1500 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 2300 0 0
NM = No muetreado
3.2.3 Número Más Probable de coliformes fecales
En la tabla 9 se muestran los resultados del NMP de coliformes fecales. Como se puede
observar en las muestras analizadas no presentaron incidencia de coliformes fecales.
Dentro de los criterios ecológicos se maneja un rango de coliformes fecales que va de 0 a
4,300. Al no tener presencia de estos indicadores de contaminación fecal, se demuestra que
las prácticas de higiene realizadas en el ejido Capacidad Agraria son buenas debido a que
se mantiene controlado cualquier fuente de contaminación de origen fecal. También se
demuestra que el agua que abastece los estanques proviene solo de esteros y que éste a su
vez no recibe descargas de aguas residuales agrícolas o urbanas.
Tabla 9 Número Más Probable (NMP) de coliformes fecales en 100/ml Muestreo
SITIO I II III IV V VI 1 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 NM 4 0 0 0 0 0 NM 5 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0
3.2.4 Aislamiento e identificación de Salmonella y Vibrio cholerae
De las 48 muestras de agua, solo en 2 se presento incidencia de Vibrio cholerae en agua
que abastece a los estanques. Probablemente estos microorganismos se eliminaron al
emplear cal para controlar ciertos parámetros como turbidez y el desarrollo de bacterias
principalmente ya que en agua de estanques no se encontró presencia de Vibrio cholerae,
ni de Salmonella.
Se detectaron géneros de bacterias como lo son Enterobacter, Citrobacter, Vibrio spp.,
Pseudomonas aeroginosa, Yarsina, Aeromonas spp. y Serratia, las cuales se aislaron
principalmente de las muestras que presentaron incidencia de coliformes totales.
CONCLUSIONES
Según los resultados obtenidos en el presente estudio que se realizó en el Ejido Capacidad
Agraria del Parque Acuícola la Atanasia donde se estudiaron las aguas tanto de
abastecimiento, aguas de estanques y aguas de descarga, se llegaron a las siguientes
conclusiones.
No se genera contaminación bacteriana hacia los esteros del Parque Acuícola la
Atanasia.
En la cuenta total viable de microorganismos mesófilos aerobios, su presencia fue en el
100% de las muestras, sin embargo en valores muy bajos que no se consideran una
contaminación hacia los mares.
El NMP de coliformes totales no sobrepasó el criterio ecológico ya que sólo el 12.5%
presentó incidencia, pero dentro del rango. Esto se debe al tipo de actividad que se
realiza en esta agua.
En coliformes fecales el 100% de las muestras se mantuvieron sin incidencia, por lo que
se demuestra el buen manejo de la actividad acuícola, ya que no se tiene contaminación
de origen fecal.
En cuanto a Salmonella no se detectó su presencia en los seis muestreos.
Respecto a Vibrio cholerae, se encontró incidencia en dos muestras de abastecimiento
de agua a los estanques, probablemente en el agua de los estanques no se encontró, ya
que aquí se realiza un tratamiento con cal para controlar el desarrollo de bacterias.
Se aislaron e identificaron Enterobacter, Citrobacter, Vibrio spp., Pseudomonas
aeroginosas, Yarsina, Aeromonas spp. y Serratia. Esta flora se puede considerar normal
para el tipo de aguas y de la actividad que se desarrolla en ellas.
RECOMENDACIONES
Después de Analizar los resultados obtenidos se dan las siguientes recomendaciones.
Cuidar que las aguas del canal de llamada no se mezclen o provengan de aguas
residuales agrícolas o urbanas.
Crear un hábito y conciencia en los trabajadores de lo importante que es desinfectar
toda herramienta y equipo que se utilice en los estanques, con el fin de disminuir
fuentes de contaminación.
Concientizar a propietarios y encargados de las granjas de respetar y mantener los
límites permisibles en que se deben de mantener las aguas para descargarlas a esteros o
mares.
Controlar o retirar de las granjas los desechos humanos y basura que se genere en ellas,
para evitar contaminación a los estanques y posteriormente a los esteros.
Realizar un monitoreo cada 15 días para mantener controlada la contaminación
microbiana hacia los mares y el cultivo.
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