el presente trabajo se realizó en el departamento de
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El presente trabajo se realizó en el departamento de Biología Celular y Fisiología de la Universidad de Pittsburgh, PA. EUA, bajo el asesoramiento del Dr. Sergio A. Oñate y la dirección del Dr. Rogelio Maldonado Rodríguez en el departamento de Bioquímica de la ENCB, IPN. Este proyecto fue financiado por la “American Cancer Society” RSG-01-243-01.
Con cariño para todas las personas que son importantes en mi vida y que mis logros los toman como suyos, especialmente para Daniel, Angel y Zara.
AGRADECIMIENTOS
De manera muy especial a la Dra. Rosalba Escamilla Hernández, por la validación de los
iniciadores para la técnica del PCR cuantitativo en tiempo real, por todos sus consejos sobre
la técnica de inmunoprecipitación de la cromatina y por la producción de los vectores Ad-
his-SRC1 y Ad-TATA-Luc utilizados en este trabajo, por su amistad y por todos los momentos
(buenos y malos) que pasamos en Pitt.
A la Dra. Marjet D. Heitzer por todo su apoyo durante mi estancia en Pitt. Gracias por las
buenas charlas dentro y fuera del laboratorio (sin ellas no hubiera mejorado el idioma inglés)
y por los momentos compartidos en los congresos de Denver y Keystone.
A special acknowledgment to Marjet D. Heitzer PhD, thanks for all the support you gave us,
for all the “tasty” chats we shared inside and outside of the lab., and for all the good
moments we enjoyed in Pitt, Denver and Keystone meetings.
A todas las personas del departamento de biología celular y fisiología así como de los
departamentos de patología y bioquímica de la Universidad de Pittsburgh por el apoyo
recibido durante mi estancia.
A todos mis amigos que sabiendo las contrariedades para realizar este trabajo, me seguían
dando su apoyo incondicional en especial a Esmeralda, Alfonso y Ruth.
Un reconocimiento especial al Dr. Daniel Arrieta Baez, por todo su apoyo incondicional, por
ser el sostén más importante para que finalmente obtuviera el grado de doctor, mil gracias
porque siempre estuviste presente.
Al Dr. Rogelio Maldonado Rodríguez, por aceptar ser el director de este trabajo ante la
ENCB.
Al Dr. Sergio A. Oñate, en donde quiera que se encuentre, porque todas las experiencias
vividas en su laboratorio me han enseñado a tomar sólo lo que me sirve para madurar
profesionalmente.
A los miembros del jurado por haber aceptado revisar este trabajo y por las correcciones
que sirvieron para mejorarlo.
Dra. Gloria de la Luz León Avila
Dra. Lucía Quevedo Corona
Dra. Eva Ramón Gallegos
Dr. Radu Gheorghe Racotta Poulieff
Dr. Eduardo Ramírez San Juan
ÍNDICE Indice de tablas y figuras i
Lista de abreviaturas ii
Resúmen iv
Abstract v
1.- Introducción
1.1 Receptor de andrógenos 1
1.2 Organización estructural del gen del AR 1
1.3 Participación de correguladores en el funcionamiento del AR 4
1.4 La próstata como modelo de estudio 5
1.4.1 Anatomía de la próstata 5
1.4.2 El receptor de andrógenos en el desarrollo de la próstata 6
1.4.3 Importancia del AR en cáncer de próstata (CaP) 7
2.- Justificación 9
3. Hipótesis y objetivos
3.1 Hipótesis 10
3.2 Objetivo general 10
3.3 Objetivos particulares 10
4.- Material y métodos
4.1 Reactivos 11
4.2 Cultivos celulares 11
4.3 Construcción del adenovirus recombinante (Ad-his-AR) 12
4.4 Ensayos de transactivación in vitro 12
4.5 Cocultivos 13
4.6 Preparación de los extractos nuclear y citoplásmico 13
4.7 Inmunodetección del receptor de andrógenos 14
4.8 Microscopía de fluorescencia 14
4.9 Ensayos de unión a hormona en células intactas 15
4.10 Ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) 15
4.10.1 Inmunoprecipitación 16
4.10.2 PCR 17
4.11 PCR cuantitativo en tiempo real (QRT-PCR) 17
4.11.1 Cuantificación relativa 18
5.- Resultados
5.1 Aislamiento y cultivo de células de epitelio y estroma de muestras de
próstata humana
19
5.2 Actividad transcripcional del AR en cultivos primarios de celulas de
próstata
20
5.3 Expresión del receptor de andrógenos en un sistema mediado por
adenovirus
22
5.4 Actividad transcripcional de Ad-his-AR en cultivos primarios 26
5.5 Expresión genética de coactivadores en los compartimentos celulares de
la próstata humana.
27
5.6 La actividad transcripcional del AR es deficiente en estroma proveniente
de muestras con cáncer de próstata
28
5.7 La células de epitelio modulan la actividad del AR en el estroma al
favorecer la asociación de coactivadores con los HRE de los genes
blanco.
29
5.8 SRC-1 incrementa la atividad transcripcional regulada por el AR en células
de estroma (BAS y CAS)
32
6.- Discusión 34
7.- Conclusiones 39
8.- Perspectivas 40
9.- Bibliografía 41
10.- Anexo (publicación) 46
LISTA DE TABLAS Y FIGURAS
TABLAS
Tabla 1. Secuencia de los iniciadores y sondas utilizados en los ensayuos de PCR cuantitativo
en tiempo real.
FIGURAS
Figura 1. Representación esquemática del gen del AR humano.
Figura 2. Acción de andrógenos.
Figura 3. Interacciones estroma-epitelio en la próstata
Figura 4. Esquema del sistema de cocultivo.
Figura 5. Caracterización de los cultivos primarios de próstata humana.
Figura 6. Actividad transcripcional regulada por AR en células de epitelio y estroma.
Figura 7. Actividad transcripcional en cultivos de estroma.
Figura 8. Inmunolocalización in vivo del Ad-his-AR.
Figura 9. Curva de titulación y espresión del Ad-his-AR.
Figura 10. Caracterización cinética del Ad-his-AR.
Figura 11. Actividad transcripcional del Ad-his-AR en células prostáticas
Figura 12. Cuantificación de la expresión de algunos coactivadores en las células de
próstata.
Figura 13. Actividad transcripcional regulada por AR en células de estroma aisladas de tejido
normal (BAS) o tejido canceroso (CAS)
Figura 14. Actividad transcripcional del Ad-his-AR en cocultivo.
Figura 15. Asociación del AR y correguladores con el HRE del promotor de MMTV.
Figura 16. Efecto de SRC1 sobre la actividad transcripcional del AR en células de estroma.
i
LISTA DE ABREVIATURAS
293: línea celular correspondiente a epitelio de riñón humano
AR*: receptor de andrógenos
ARA*: activador del receptor a andrógenos
ARE*: elemento de respuesta a andrógenos
β-gal: beta galactosidasa
BAS*: estroma aislado de tejido benigno
BSA*: albúmina sérica de bovino
Bp*: pares de bases
CaP*: cáncer de próstata
Cas: casodex (bicalutamida) antagonista de andrógenos
CAS*: estroma aislado de tejido canceroso
cdFBS*: FBS tratado con carbón activado y dextrán
CDM*: medio de cultivo químicamente definido
CIP*: fosfatasa alcalina de intestino de ternera
CK*: citoqueratina
CMV: citomegalovirus
cpm: cuentas por minuto
CV-1: Línea celular correspondiente a fibroblastos de riñon de mono verde africano
ChIP*: inmunoprecipitación de la cromatina
DBD*: dominio de unión a DNA
Dex: dexametasona
DMEM*: medio eagle dulbecco modificado
DNA*: ácido desoxyribonucleico
dNTP*: desoxi nucleósidos trifosfato
DHT: dihidrotestosterona
E2: estradiol
EDTA*: ácido diamino tretra acético
EGF*: factor de crecimiento epidermal
EGTA*: ácido etilenglicol tretra acético
EtOH: etanol
FAM: 6-carboxi-fluoresceína
FBS*: suero fetal de ternera
ii
FGF*: Factor de crecimiento fibroblástico
FITC*: isotiocianato de fluoresceína
GTM*: maquinaria general de la transcripción
GUS: β-glucuronidasa
GR*: receptor de glucocorticoides
HeLa: línea celular de adenocarcinoma de cervix uterino
Hsp*: proteínas de choque térmico
HRE*: elementos de respuesta a hormona
IGF*: factor de crecimiento insulinoide
Kd: constante de disociación
kDa: kilo dantones
KGF*: factor de crecimiento queratinocítico
LAPC-4: línea celular de metástasis de cáncer de próstata, aislada de nódulo linfático
LBD*: dominio de unión a ligando
LNCaP: línea celular de carcinoma de próstata aislada de nódulo linfático
Luc: luciferasa
Mib: mibolerona agonista sintético de andrógenos
MMTV*: virus del tumor mamario de ratón
NADH*: dinucleótido de nicotinamida adenina reducido
NCoR*: correpresor de los receptores nucleares
PBS*: buffer de sales y fosfato
PC-3: línea celular de cáncer de próstata aislada de metástasis en hueso
PMSF*: fluoruro de fenil metano sulfonilo
PCR*: reacción en cadena de la polimerasa
PSA*: antígeno específico de próstata
QRT-PCR*: PCR cuantitativo en tiempo real
RLU*: unidades relativas de luz
RNA*: ácido ribonucleico
RT-PCR*: transcripción reversa - PCR
SDS*: dodecil sulfato de sodio
SDS-PAGE: gel de poliacrilamida desnaturalizante
R5020: progestina sintética
R1881: metribolona, agonista sintético de andrógenos
RPMI: medio de cultivo desarrollado en Roswell Park Memorial Institute
iii
RU486: antagonista de glucocorticoides
SRC*: coactivador de receptores esteroides
T: testosterona
TAMRA: 6-carboxi-tretametil-rodamina
TBS*: buffer de tris, borato y SDS
TBST-T*: buffer TBS con tween 20 y triton X-100
Tfm*: ratón con feminización testicular
TGF*: Factor de crecimiento transformante
* Estas abreviaturas conservan las siglas de la terminología anglosajona.
iv
RESÚMEN El mesénquima prostático dirige el desarrollo y diferenciación de la próstata a través de
procesos dependientes de andrógenos, según fue demostrado por experimentos de
recombinación de tejidos. El funcionamiento de la próstata necesita de procesos
dependientes de andrógenos tanto en el epitelio como en el estroma. Para estudiar la
actividad transcripcional del receptor de andrógenos (AR) en cultivos primarios de próstata
(epitelio y estroma) se usó un sistema de expresión mediada por adenovirus. Este sistema de
transcripción consiste de el gen reportero de luciferasa cuya actividad está modulada por el
promotor MMTV que contiene secuencias de DNA que responden a andrógenos. Los
resultados obtenidos indican que el estroma y epitelio contienen AR y éste es capaz de
activar al gen reportero en presencia de andrógenos. La actividad transcripcional del AR en
el epitelio se induce aproximadamente 10 veces, con respecto a la actividad observada en
ausencia de hormona, mientras que en el estroma es de sólo 3 veces. También se observó
que la actividad transcripcional del AR en el estroma aumentó cuando se determinó en la
presencia del epitelio a través de cocultivos, así como también en presencia de medio
condicionado proveniente de células epiteliales. Los ensayos de inmunoprecipitación de
cromatina (ChIP) indicaron que el aumento en la actividad transcripcional del AR en las
células de estroma expuestas a los factores epiteliales se debe a un aumento en la
capacidad del complejo de transcripción del AR de asociarse con coactivadores,
específicamente SRC-1, por un mecanismo que es dependiente de andrógenos. También se
observó que la capacidad de la células de estroma de responder a los factores paracrinos
epiteliales está alterada en los tumores de próstata. La repuesta del AR a la presencia de
andrógenos es ineficiente y la actividad transcripcional es limitada. Como lo indica el
ensayo de ChIP, Los andrógenos inducen la unión del AR a secuencias específicas de DNA
en estroma aislado de tumores, sin embargo, el receptor permanece asociado a los
correpresores SMRT y NcoR. Estos resultados sugieren que la capacidad del epitelio de
modular el reclutamiento de correguladores al complejo transcripcional del AR mediado por
andrógenos, está alterado en el compartimento estromal en el cáncer de próstata.
v
ABSTRACT
Tissue recombination experiments show that prostate mesenchyma directs prostate epithelial
cell growth and development in an androgen-dependent manner, and that functional
differentiation of prostate epithelium requires androgen-driven processes in both epithelia
and stroma. The androgen induction of target genes in primary cultures of prostate stromal
and epithelial cells was determined using an adenoviral expression system, which employed
the MMTV-enhancer driven luciferase reporter as an androgen receptor (AR)-mediated
transcription assay. These studies indicate that both cell types contain functional AR.
Androgen induction of luciferase reporter activity is 3-fold in stromal cells compared with 10-
fold in epithelial cells. AR-mediated transcription activity in stroma cells was enhanced by
coculture with epithelial cells or epithelial cell-conditioned media. The elevated AR-mediated
transcription activity in stromal cells that were exposed to epithelial factors correlated with
increased recruitment of coactivators to the AR transcriptional complex. Epithelial cells
facilitated interactions of AR with SRC-1 in an androgen-dependent manner. However, AR-
mediated transcriptional activity in stromal cells isolated from prostate cancer was reduced
compared with stromal cells isolated from benign prostate and continued to be reduced
when cocultured with tumor-derived prostate epithelial cells. The occupancy of AR and
coregulators on target genes showed that androgen-bound AR in prostate cancer stromal
cells was associated with the corepressor silencing mediator for retinoid and thyroid hormone
receptor. Thus, the ability of epithelial cells to modulate coregulator recruitment to the AR
transcriptional complex on androgen-responsive genes seems to be altered in the stromal
microenvironment of prostate cancer.
vi
1
1. INTRODUCCIÓN
Los andrógenos son hormonas fundamentales para la expresión del fenotipo masculino. Ellos
tienen papeles vitales durante la diferenciación sexual masculina así como también durante
el desarrollo y mantenimiento de las características sexuales secundarias y la
espermatogénesis (George y Wilson, 1994). Los dos andrógenos más importantes al respecto
son la testosterona y la 5-α-dihidrotestosterona que es un producto de la acción de la 5-α-
reductasa de tipo 2 sobre la testosterona, esta conversión es irreversible y dependiente de
NADH (Russell y Wilson, 1994). Ambos andrógenos ejercen su acción a través del receptor de
andrógenos (AR), la interacción con éste es diferente para cada uno. La testosterona tiene
menor afinidad que la 5-α-dihidrotestosterona por el AR, y la velocidad de disociación de la
testosterona del AR es 5 veces más rápida comparado con la 5-α-dihidrotestosterona (Grino
et al., 1990).
1.1. RECEPTOR DE ANDRÓGENOS
La acción de los andrógenos se ejerce a través del receptor de andrógenos (AR). Este es un
factor de la transcripción dependiente de ligando y se agrupa en la familia de los
receptores nucleares. Esta familia incluye a los receptores de hormonas esteroides, hormonas
tiroideas, ácido retinoico, vitamina D y a los receptores activados por ecdisona y peroxisoma
(Evans 1988, Laudet et al., 1992, Robinson-Rechavi et al., 2001). En esta familia también se
incluyen otros receptores cuya estructura proteínica es similar a la de los receptores
nucleares pero cuyo ligando es desconocido, y se conocen como receptores huérfanos
(Enmark y Gustafsson, 1996). Los análisis comparativos tanto funcionales como estructurales
de los receptores nucleares hormonales revelaron que comparten una organización
estructural y pueden ser divididos en 4 dominios funcionales: un domino N-terminal, un
dominio de unión a DNA, una región de bisagra y un dominio de unión a ligando.
1.2. ORGANIZACIÓN ESTRUCTURAL DEL GEN DEL AR
El gen del AR se encuentra como una sola copia en el cromosoma X en la posición Xq11-12
(Brown et al., 1989) y codifica para una proteína con masa molecular de 98 kDa que en un
gel de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE) migra como una molécula de 110 kDa. El
gen consiste de 8 exones y la organización estructural es casi idéntica a la de los genes que
2
codifican para los otros miembros de los receptores hormonales esteroideos (Kuiper et al.,
1989, Lubahn et al., 1989).
El AR humano consta de 919 amino ácidos que se estructuran en 4 dominios funcionales: el
dominio de transactivación localizado en el amino terminal (1-555 bp), que esta totalmente
codificado por el exon 1, el dominio de unión al DNA (DBD) codificado entre 556-623 bp por
los exones 2 y 3, la región de bisagra entre 624-665 bp y el dominio de unión a ligando C-
terminal (LBD) entre 666-918 bp, codificado por los últimos 5 exones (Culig et al., 2003). El
DBD, la región de bisagra y el LBD del AR comparten un alto grado de homología con los
otros receptores esteroideos (Figura 1). Los análisis de mutantes y deleciones en el gen del
AR identificaron tres regiones importantes para la activación de la transcripción; dos
localizados en el amino terminal AF-1 y AF-5 entre los residuos 101-370 y 360-485
respectivamente, responsables de la activación constitutiva del receptor, es decir
independiente de ligando (Jenster et al., 1995) y una región localizada en el LBD (AF-2) sin la
cual se reduce dramáticamente la actividad transcripcional del receptor en presencia de
ligando (He et al., 1999).
Figura 1. Representación esquemática del gen del AR humano. El gen del AR humano se mapeó en elbrazo largo del cromosoma X. El AR está codificado en 8 exones (919 aminoácidos). Al igual que otrosreceptores nucleares, el AR consiste de diferentes dominios estructurales. Modificado de Brinkmann,2006.
El AR en ausencia de hormona se encuentra en el citoplasma unido a proteínas de choque
térmico (Hsp) mediante interacciones con el LBD (estado inactivo), las cuales incluyen hsp90
y hsp70 (Heinlein y Chang, 2001). La activación del receptor ocurre cuando el ligando se une
a éste, dicha unión ocasiona una serie de cambios conformacionales en el receptor (estado
p q
Xq11-12
1 2 3 4 5 6 7 8
Dominio NH2-terminal Dominio de unión a ADN
Dominio de unión a ligando
1 919
Cromosoma X
Gen del AR humano
Proteína
Dominio deunión al DNA
Dominio deunión al ligando
3
activado) que incluyen la disociación de las proteínas de choque térmico del receptor,
dimerización, fosforilación y translocación al núcleo. En el núcleo se une a secuencias de
DNA conocidas como elementos de respuesta a andrógenos (ARE), las cuales se
caracterizan por una secuencia consenso repetida 5’-TGTTCT-3’ separada de tres
nucleótidos al azar, que se encuentra localizada en la región promotora y potenciadora de
los genes que responden a andrógenos (revisado en Gao et al., 2005). La unión del receptor
con su ligando promueve la asociación de otras proteínas denominadas correguladores los
cuales son necesarios para modular la actividad transcripcional del AR (McKenna y O’Malley
2002). Todos estos complicados procesos se inician por un cambio conformacional en el LBD
inducido por la unión del ligando.
Figura 2. Acción de andrógenos. La testosterona circula en el torrente sanguíneo unida a albúmina o ala globulina de unión a hormonas sexuales (SHBG). La testosterona libre entra a las células prostáticasen donde por acción de la 5α-reductasa se convierte en dihidrotestosterona (DHT). La unión de la DHTal AR induce la disociación de éste de las proteínas de choque térmico (HSPs) y su fosforilación. El AR sedimeriza y viaja al núcleo en donde se une a los elementos de respuesta a andrógenos (ARE) en lasregiones promotoras de los genes blanco. Los correguladores también se unen al complejo detranscripción, promoviendo o previniendo la interacción de la maquinaria general de la transcripción(GTM). La activación o represión de los genes blanco conduce a las respuestas biológicas que incluyencrecimiento (crec), supervivencia (sup) y producción del antígeno específico de próstata (PSA).Tomado de Feldman y Feldman, 2001.
Célula que responde a andrógenos
5-α-reductasa
Testosterona
Dimerización yfosforilación
Unión delligando
Unión alDNA
Asociación decoactivadores
Elementos de respuestaa andrógenos
Activación del gen blanco
Respuesta biológica
SupCrec
GTM
4
1.3. PARTICIPACIÓN DE CORREGULADORES EN EL FUNCIONAMIENTO DEL AR
Una vez que el ligando se une al AR y éste se dirige al núcleo para unirse a los ARE’s se
desencadena una serie de eventos que regulan la iniciación de la transcripción, entre estos
eventos se encuentran las interacciones proteína-proteína, remodelación de la cromatina y
el reclutamiento de la maquinaria basal de la transcripción. En la regulación de estos
eventos pueden participar alrededor de 130 proteínas que interaccionan con el AR y que
pueden promover (coactivadores) o inhibir (correpresores) la función del AR (Lonard y
O’Malley 2007). Estos correguladores pueden dividirse de manera general en 4 tipos: 1)
chaperonas, 2) modificadores de histonas (Ej, CBP/p300, NCoR), 3) coordinadores de la
transcripción (Ej. TRAP/DRIP/ARC) y 4) modificadores de la estructura del DNA (Ej.
SWI/SNF/BRG1), (Chmelar et al., 2006). Los coactivadores potencian la actividad
transcripcional regulada por los receptores nucleares sin alterar la actividad basal del
promotor. Utilizando la técnica de los dos híbridos en levaduras, se han identificado un gran
número de proteínas que cumplen con los criterios de coactivadores para los receptores
nucleares y los cuales incluyen la familia p-160 integrada por SRC-1, SRC-2 [TIF2 o GRIP1] y
SRC-3 [ACTR o RAC3 o AIB1 o p/CIP] (Leo y Chen, 2000), así como también ERAP-160, RIP-140
y RIP-160, TRAPs, DRIPs, ARA70, ARA55 o Hic5, ARA54, entre otros (Culig et al., 2004). Los
coactivadores interaccionan con el dominio de unión a ligando a través de tres motivos
LXXLL, altamente conservados, los cuales forman una interfaz que permite la interacción
directa con la hélice 12 de AF-2 (Glass y Rosanfeld, 2000). Por otro lado, los correpresores son
reclutados por silenciadores de la transcripción que están unidos al DNA y que disminuyen la
actividad de transcripción de un gen en particular. Los correpresores regulan el
silenciamiento de la transcripción por mecanismos que incluyen la inhibición directa de la
maquinaria general de la transcripción y el reclutamiento de enzimas modificadoras de la
cromatina (Burd, 2006). De manera general se dice que los correpresores y los silenciadores
de la transcripción actúan de manera análoga a los activadores de la transcripción y a los
coactivadores, pero con el resultado opuesto, lo que conduce al silenciamiento del gen
(Burke y Baniahmad, 2000). A la fecha se han aislado varios correpresores de los cuales los
más estudiados son NCoR (Horlein et al., 1995) y SMRT (Chen y Evans 1995). Se ha
demostrado mediante knockout o mutantes alélicos, que los correpresores son esenciales
para diferentes rutas biológicas y mecanismos homeostáticos, incluyendo diferenciación,
desarrollo, proliferación celular y apoptosis (Privalsky 2004).
5
El análisis de las interacciones de los receptores nucleares con sus correguladores, en las
células, es importante para el mejor conocimiento del papel que juega el corregulador en la
función y especificidad del receptor nuclear bajo condiciones fisiológicas in vivo así como
también es crítico determinar si estas interacciones están alteradas en los estados
cancerosos.
1.4. LA PRÓSTATA COMO MODELO DE ESTUDIO
La próstata forma parte del aparato reproductor masculino, se localiza debajo de la vejiga y
recubriendo totalmente la parte inicial de la uretra, su principal función es producir lìquido
prostático el cual nutre y protege el esperma durante el acto sexual y constituye el principal
componente del semen. Diferentes estudios indican que las hormonas sexuales de tipo
esteroidal, incluyendo andrógenos, progesterona y estrógenos, tienen un papel fisiológico
relevante en el desarrollo y funcionamiento de la próstata (Ekman 2000, Risbridger et al.,
2001, Hsing et al., 2002, Cunha et al., 2004a, Ricke et al., 2007). Sin embargo, los mecanismos
moleculares que regulan la acción de las hormonas en la próstata, aún no están claramente
definidos.
1.4.1 Anatomía de la próstata
La próstata de un adulto esta formada de tejido glandular (50-70 %) y de tejido fibromuscular
(30-50 %) (McNeal, 1981). Es una glándula que consiste de un acino alineado de células
epiteliales que se encuentran sobre una capa de estroma fibromuscular. El compartimento
de células epiteliales está formado principalmente por tres tipos de células: epitelio luminal o
secretor que son células de lento crecimiento bien diferenciadas positivas tanto para el AR
como para el antígeno específico de próstata (PSA); epitelio basal que son células de
rápido crecimiento que expresan niveles bajos de AR y por último células neuroendocrinas,
un pequeño número de células que son negativas a AR (Revisado en Burnstein, 2005). Las
células del estroma son de tipo pleomórfico mesenquimal con la posibilidad de cambiar de
fenotipo en respuesta a los cambios de su entorno. Aunque aún no se han establecido con
claridad los tipos celulares que conforman el estroma prostático, principalmente se
reconocen dos tipos, el de las células de músculo liso que son positivas a la α-actina y a la
desmina y negativas a vimentina denominadas miofibroblastos y el de la células negativas a
la α-actina y positivas a vimentina denominadas fibroblastos. (revisado en Lee, 1996 y
6
Tuxhorn et al., 2002). La distribución de los miofibroblastos se ha asociado con muerte celular
de las células epiteliales que están adyacentes; mientras la distribución de los fibroblastos se
ha asociado ya sea con proliferación o no cambio en el epitelio adyacente, dependiendo
de la presencia de andrógenos en el medio (revisado en Lee, 1996).
1.4.2. El receptor de andrógenos en el desarrollo de la próstata.
La acción de los andrógenos se lleva a cabo a través de su interacción con el AR. La
evidencia de que el AR es absolutamente necesario para el desarrollo de la próstata se
obtuvo con la observación de que los ratones o humanos con AR disfuncional carecen de
próstata (Brown 1995). Los estudios de Prins (Prins y Birch 1995) demostraron que el AR se
encuentra en el estroma durante la morfogénesis de la próstata, y en el epitelio después de
la diferenciación. Los estudios clásicos de recombinación de tejidos hechos por Cunha,
demostraron que el AR en el estroma y no en el epitelio es el responsable de la morfogénesis
prostática (Cunha y Chung 1981, Cunha et al., 1987). Estudios posteriores revelaron que el AR
epitelial es necesario para la expresión de proteínas secretoras tanto en ratón (Donjacour y
Cunha 1993) como en rata (Prins y Birch 1995). La proliferación epitelial y la
citodiferenciación parecen estar dirigidas por factores paracrinos controlados por el AR
estromal, estos hallazgos sugieren una regulación activa mediada por andrógenos durante
el desarrollo de la próstata, además de una interacción muy importante entre las células de
epitelio y de estroma. Las interacciones que existen entre estroma-epitelio han sido objeto
de diversos estudios con el fin de encontrar los moduladores de este tipo de interacciones
(Sung y Chung 2002, Cunha et al., 2003 y 2004b).
Existe también evidencia del papel que juegan otros esteroides incluyendo estrógenos y
vitaminas de tipo retinoide en el desarrollo de la próstata. Se han identificado los receptores
específicos para estas sustancias durante la morfogénesis de la próstata en ratas y, si bien no
son esenciales para el desarrollo de la próstata, si son importantes para regular la expresión
de genes específicos involucrados en la diferenciación y la homeostasis (Prins y Putz 2008).
Las células prostáticas responden a varios factores de crecimiento tales como el factor de
crecimiento epidermal (EGF), el factor de crecimiento queratinocítico (KGF), el factor de
crecimiento insulinoide I y II (IGFs), los factores de crecimiento fibroblásticos (FGFs), y los
factores de crecimiento transformante α y β (TGF). Los factores extrínsecos como las
hormonas esteroideas, se transportan a la próstata en donde son mediadoras de la
7
producción y acción biológica de los factores intrínsecos tales como los factores de
crecimiento. Estos actúan a través de efectos paracrinos (sobre células adyacentes) o de
manera autócrina (en las células en donde son producidos), figura 3, (Ekman P. 2000).
Figura 3. Interacciones estroma-epitelio en la próstata. El control hormonal de la próstata se lleva acabo mediante un sistema complejo de señales endocrinas, autocrinas y paracrinas que dan unbalance entre proliferación celular y apoptosis. Tomado y modificado de Suh et al., 2007
1.4.3. Importancia del AR en cáncer de próstata (CaP).
Hoy en día es ampliamente reconocido que a excepción del cáncer de pulmón, el de
próstata es el cáncer más común en los hombres. Uno de cada tres cánceres es
diagnosticado como cáncer de próstata en hombres estadounidenses (American Cancer
Society, 2007). A pesar de los avances que se han logrado en la ciencia básica y la
medicina clínica, las enfermedades de la próstata siguen siendo un problema importante de
salud.
El desarrollo de la próstata dictado por andrógenos se inicia en el compartimento estromal,
el cual contiene AR y produce factores paracrinos que regulan el crecimiento y
diferenciación del epitelio prostático. En contraste, en CaP el epitelio crece en respuesta a
andrógenos, lo que sugiere que el desarrollo del cáncer es resultado de un mecanismo
autocrino (Gao et al., 2001)
Está bien establecido que el CaP es determinado por andrógenos. De hecho, el cáncer y la
hipertrofia no ocurren en ausencia de andrógenos (Wu y Gu, 1991). Los hombres castrados
Epitelio
Estroma
AR+
AR+
TGF-β
FGF-2+
FGF-7, KGF
+-
Acciónautocrina
Acciónparacrina
Acciónparacrina
8
antes de la pubertad o aquellos que tienen una deficiencia en la enzima 5-α-reductasa no
desarrollan CaP (Schatzl et al., 2003). La terapia de disminución de andrógenos continúa
siendo el tratamiento de elección, con un 80 a 90 % de remisión clínica. Sin embargo,
después de una respuesta inicial favorable a la disminución de andrógenos, casi todos los
pacientes progresan a un cáncer independiente de andrógenos ó refractario a la hormona
y que es incurable. Los coactivadores pueden representar un mecanismo por el cual las
células en el CaP se vuelven independientes de andrógenos. En un estado dependiente de
andrógenos, los coactivadores potencian la transcripción del gen blanco. Sin embargo, si la
sensibilidad de los coactivadores del AR se aumenta, entonces este fenómeno puede ser
responsable de un CaP independiente de andrógenos (Reddy et al., 2006). El estudio de los
correguladores muestran que en CaP existen diferencias de expresión. Se encontró por
ejemplo, que TIF2 y SRC1 están sobre-expresados en CaP recurrente; además TIF2
incrementa la respuesta del AR a los andrógenos adrenales (Gregory et al., 2001). Los niveles
de gelsolina aumentan en CaP después de una terapia de disminución de andrógenos y
promueve la transactivación en presencia de andrógenos (Nishimura et al., 2003). Se reportó
que ARA55 potencia la actividad transcripcional del AR no sólo en respuesta a los
andrógenos adrenales, sino también a los antiandrógenos hidroxiflutamida y otros esteroides
no androgénicos (Rahman et al., 2003). La castración médica o quirúrgica puede reducir la
concentración de andrógenos aunque el subsiguiente incremento en coactivadores del AR
rescatan a las células cancerosas al permitirles la progresión a una forma independiente de
andrógenos. Las mutaciones adquiridas en el gen del AR de manera paralela pueden
provocar una hipersensibilidad a coactivadores (Culig et al., 2003).
9
2. JUSTIFICACIÓN
El AR juega un papel integral en la biología de la próstata normal. Sin embargo, también
juega un papel central en la progresión del CaP. Las alteraciones que sufre el receptor así
como las interacciones con factores de crecimiento, cofactores, cromatina, mecanismos de
modificación post-transcripcional y las rutas de degradación pueden alterar las funciones
del AR, confiriéndo a las células cancerosas una ventaja selectiva en su crecimiento.
Aunque es difícil asociar a la expresión alterada de cofactores con el CaP, la estructura y
función de los mismos sí se pueden asociar con el CaP. Está claro que es importante
determinar los mecanismos moleculares por los cuales el AR y sus correguladores son
capaces de responder de manera diferente a los cambios del medio ambiente para regular
los genes blancos específicos involucrados en los procesos de supervivencia celular,
apoptosis, invasión y metástasis.
La función vital que juega el AR en la progresión del CaP no puede ser cuestionada, de tal
manera que la investigación se debe enfocar en el entendimiento de las funciones del AR
en esta enfermedad. Los estudios de las interacciones entre el AR y los correguladores en los
compartimentos celulares de la próstata son relevantes dado que ellos exploran los
mecanismos moleculares básicos de la acción y especificidad de las hormonas esteroideas
en un tejido endocrino con relevancia fisiológica. Una vez que se establezca como es la
interacción de los receptores a hormonas esteroideas con los coactivadores y como éstas
interacciones afectan la actividad y especificidad del receptor a nivel celular en la próstata
humana, sólo entonces se podrá determinar si estas interacciones están alteradas en
enfermedades prostáticas. Se espera que al tener un mejor entendimiento del control de la
transcripción de genes en la próstata normal ayudará en el desarrollo de herramientas de
diagnóstico y nuevos avances terapéuticos para el tratamiento de las enfermedades de la
próstata.
10
3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
3.1. HIPÓTESIS
La expresión y/o actividad diferente de coactivadores en los compartimentos celulares de la
próstata (epitelio y estroma) contribuye al mecanismo por el cual los receptores esteroideos
regulan la expresión genética de forma diferencial y específica al tipo celular.
3.2.OBJETIVO GENERAL
Identificar los correguladores que modulan la actividad transcripcional del AR en cultivos
primarios de estroma y epitelio y en un sistema de co-cultivo.
3.3. OBJETIVOS PARTICULARES
a ) Caracterizar los cultivos aislados de epitelio y estroma prostático mediante
marcadores celulares específicos para cada uno de ellos.
b) Determinar el efecto de los andrógenos en la actividad transcripcional del AR tanto
en estroma como en epitelio.
c) Producir y caracterizar un adenovirus que sirva como vector de expresión del AR en
cultivos primarios.
d ) Identificar los correguladores del AR en estroma y epitelio mediante
inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP).
e) Determinar la expresión diferencial de coactivadores por PCR cuantitativo (QRT-PCR).
f) Determinar el efecto de las interacciones estroma y epitelio en la actividad
transcripcional del AR cuando estas células se encuentran en cocultivo.
11
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. REACTIVOS
El medio de cultivo químicamente definido para el cultivo de epitelio próstatico (CDM) se
preparó según lo publicado por Krill et al., 1997, el suero fetal de bovino (FBS) y el FBS tratado
con carbon activado y dextrán (cdFBS) se compró de HyClone (Logan, UT). El agonista
sintético de los andrógenos R1881 se obtuvo de Sigma (St Louis, MO). Las hormonas tritiadas
se compraron de NEN Life Sciences Product, Inc. (Boston, MA). El anticuerpo para NCoR
(NCoR), fue de Upstate (Lake Placid, NY) y los anticuerpos anti-AR (AR-441 o AR-C19), anti-
SMRT (N-20) y anti- SRC-1 (M341) se obtuvieron de Santa Cruz (Santa Cruz, CA).
4.2. CULTIVOS CELULARES
El tejido de próstata fue generosamente donado por el departamento de patología de la
Universidad de Pittsburgh. Todas las muestras fueron analizadas por un histopatólogo y
clasificadas como tejido normal o neoplásico. En este estudio se utilizaron 10 muestras de
tejido normal y 14 de tejido neoplásico grado Gleason 6-7 (Gleason y Mellinger, 1974). Es
importante mencionar que las muestras normales se obtuvieron de donadores clínicamente
sanos y sin ningún tratamiento médico. Los cultivos primarios de epitelio y estroma se
obtuvieron de acuerdo a la metodología descrita por Krill et al., 1997. En resumen, el tejido
en estudio (aproximadamente 1 g) se corto en pequeños pedazos y se sometió a un
tratamiento con colagenasa (tipo 1)/DNAsa ( tipo 1). Los cultivos de epitelio se obtuvieron al
cultivar las digestiones del tejido prostático en medio químicamente definido (CDM)
enriquecido con FBS al 10 % para favorecer la adhesión celular (de 2 a 3 días). Después los
cultivos celulares se lavaron y se les adicionó medio nuevo sin FBS y enriquecido con la
mezcla ITS (Sigma) la cual proporciona insulina (5 µg/mL), transferrina (5 µg/mL) y selenio (5
ng/mL). Los cultivos de estroma se obtuvieron al someter la digestión del tejido prostático a
un gradiente discontínuo de percoll de 5 al 10 % (Kassen et al., 1996); las células de estroma
se recuperaron de la parte superior del gradiente (al 5 % de percoll) y se mantuvieron en
cultivo con medio RPMI sin rojo de fenol enriquecido con FBS al 10 %. Las líneas celulares CV-
1, 293, LNCaP, HeLa, PC3, y LAPC-4 se cultivaron en medio DMEM (GIBCO), enriquecido con
5 % FBS y gentamicina 25 µg/mL, se mantuvieron a 37 ºC con CO2 al 5 %.
12
4.3. CONSTRUCCIÓN DEL ADENOVIRUS RECOMBINANTE (Ad-His-AR)
El gen del receptor de andrógenos se obtuvo al cortar el vector pACSK.2CMV5 (Sommers et
al., 1999) con las enzimas de digestión EcoR1/BamH1. El fragmento así obtenido (2739bp) en
marco de lectura correcto, se subclonó en el sitio de multiclonación EcoR1/BamH1/CIP del
vector pDC315 (Microbix Biosystems, Inc). La metodología para la generación y
propagación del adenovirus está descrita en detalle en el sitio web del proveedor
(www.microbix.com). Brevemente, un cultivo de células 293 (Graham et al., 1977) al 75 % de
confluencia se cotransfectó con 1 µg de el plásmido pBHGlox (Microbix Biosystems, Inc.) y 2
µg del vector que contiene el gen de interés mediante el sistema de transfección superfect
(Qiagen, Valencia, CA), siguiendo las indicaciones del proveedor. El cultivo celular se
mantuvo con DMEM enriquecido con FBS al 5 % durante 14 días a 37 ºC, tiempo suficiente
para que las células presentaran efecto citopático. Las células y el medio de cultivo se
colectaron, la suspensión celular se congeló con hielo seco y descongeló a 37 ºC tres veces
y después se centrifugó (1000 G/10 min) para eliminar los desechos celulares. Los adenovirus
así obtenidos se propagaron en células 293 y se prepararon diluciones de adenovirus a una
concentración de 1 x 1013 partículas/mL. Los adenovirus se diluyeron en medio de cultivo
para su uso como se indica en los resultados.
4.4. ENSAYOS DE TRANSACTIVACIÓN IN VITRO
Para medir la actividad transcripcional del receptor esteroideo endógeno, las células de
epitelio y estroma se sembraron en placas de 24 pozos (200,000 células por pozo) con CDM
enriquecido con cdFBS al 5 %. Los cultivos se incubaron durante 24 h y después se
infectaron durante 3 horas a 37 °C con el Ad-MMTV-Luc, este vector tiene al gen de la
luciferasa bajo el control del promotor de MMTV el cual contiene HRE (Scheidereit y Beato,
1984). Después de la infección, los cultivos se trataron por 36 h a 37 °C con vehículo (EtOH) o
con hormonas esteroideas, las cuales se diluyeron en CDM enriquecido con cdFBS al 5 %. La
actividad de luciferasa se determinó con el ensayo de luciferasa (Promega) en un
luminómetro Lumat LB 9501. La actividad de luciferasa en los extractos celulares se normalizó
con la cantidad de proteína (Bradford) y se reportó como unidades relativas de luz (RLU) por
µg de proteína. Para medir la actividad del receptor de esteroides exógenos, los cultivos se
coinfectaron con Ad-MMTV-Luc y Ad-his-AR y se continúo con el procedimiento descrito
anteriormente.
13
4.5. COCULTIVOS
Las células de epitelio prostático se cultivaron en un sistema de transwellMR (membrana de
poliéster, diámetro de 12 mm, tamaño de poro de 0.4 µm, (Costar, Cambridge, MA). Las
células de estroma se cultivaron en el pozo inferior y las de epitelio en la parte superior (Fig.
4). Las células de epitelio y estroma se sembraron en una proporción 1:1 con CDM para
epitelio y con RPMI enriquecido con 10 % FBS para estroma y se cultivaron separadamente
durante 24 h a 37°C. Después de la incubación el medio se cambió a CDM enriquecido con
5 % cdSFB y el pozo superior se insertó en el pozo inferior (Fig. 4) lo cual separa físicamente a
los dos tipos celulares, pero permite difusión entre los dos compartimentos celulares. Como
control se utilizó el cultivo sencillo, esto es: las células de estroma se cultivaron en presencia
del pozo superior que sólo contenía medio de cultivo y las células de epitelio se cultivaron en
el pozo superior que se insertó en el pozo inferior con medio de cultivo. Los cultivos se
incubaron 24 h a 37 °C y se infectaron para los ensayos de transactivación, de unión a
hormona o de inmunoprecipitación de la cromatina.
Figura 4 . Esquema del sistema de cocultivo. En el sistema de Transwell TM, (Costar, Cambridge, MA), lascélulas epiteliales (C) se cultivan en la cámara superior (B). Las células de estroma (D) se cultivan enuna placa de cultivo regular (A). Tomado de Castellón et al., 2005
4.6. PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS NUCLEAR Y CITOPLÁSMICO
Las células 293 se crecieron en placas de 15 cm a una confluencia del 80 % y se infectaron
con Ad-his-AR (dilución 1:300) durante 3 horas, después de este tiempo se lavaron y se
agregó RPMI enriquecido con 10 % de cdFBS, los cultivos se mantuvieron a 37 °C durante 36
h. Posteriormente las células se incubaron con R1881 5 nM o vehículo (EtOH) durante 4 h a
37 °C. Después del tratamiento con el agonista de hormona se prepararon el extracto
nuclear y citoplásmico de acuerdo a lo descrito por Dignam et al., 1983.
14
4.7. INMUNODETECCIÓN DEL RECEPTOR DE ANDRÓGENOS
Para este análisis se utilizaron 20 µg de las proteínas que están presentes en el extracto
nuclear y citoplasmático, se separaron en un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 7.5 %
(SDS-PAGE) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Optitran BA-S 85). La
membrana se bloqueó con una solución de leche libre de grasa al 3 % en un regulador de
Tris (Tris-HCl 10 nM pH 7.5, NaCl 150 nM). El primer anticuerpo se preparó en una solución de
leche libre de grasa al 1.5 % en TBS (NaCl 500 nM, Tris-Cl 20 nM pH 7.5). Se hicieron dos
lavados con el regulador TBST-T (NaCl 500 nM, Tris-Cl 20 nM pH 7.5, tween-20 0.05 % y tritón X-
100 0.2 %) y una vez con regulador TBS. Se usó el anticuerpo monoclonal RGS-His (Qiagen,
Valencia, CA) o AR 441 (SantaCruz) como primer anticuerpo y como segundo anticuerpo el
conjugado IgGHRP (1:5000 Sigma). Los complejos proteína-anticuerpo se visualizaron con el
sistema de detección por quimioluminiscencia de acuerdo con las especificaciones del
proveedor (NEN life science).
4.8. MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA
Las células CV-1 se sembraron en portaobjetos de 12 mm de diámetro y se incubaron
durante toda la noche. Las células se infectaron con Ad-his-AR (dilución 1:300) durante 3 h,
seguidas de 36 h de incubación a 37 ºC para permitir la expresión de la proteína. Las células
se incubaron durante 1 h con R1881 5 nM o con EtOH como vehículo. Al término de la
incubación las células se lavaron con PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4
2 mM, pH 7.4) y se fijaron con formaldehído (al 4 % en PBS) durante 15 minutos a temperatura
ambiente; después las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0.2 % durante 10 min.
Los sitios no específicos se bloquearon con albúmina de suero de bovino (BSA) al 1 %.
Posteriormente, las células se incubaron en una dilución 1:1000 del anticuerpo específico
contra AR (AR-C19, SantaCruz) durante toda la noche a 4 ºC. Las células se lavaron con
solución IMC (Na2HPO3 8.4 mM, KH2PO4 3.5 mM, NaCl 120 mM, Tris 10 mM pH 7.8) e incubaron
con una dilución 1:300 del anticuerpo secundario FITC (isotiocianato de fluoresceína)
durante 2 h en la oscuridad. Las células se lavaron con IMC tres veces y se trataron con
RNAsa (200 µg/mL) durante 2 h. Los núcleos se tiñeron con ioduro de propidio (50 µg/mL) y
las preparaciones se montaron en portaobjetos con gelvatol para posteriormente ser
visualizadas en un microscopio confocal invertido Leica DM IRBE. Las imágenes se analizaron
con el software “Image analysis TCS-NT”.
15
4.9. ENSAYOS DE UNIÓN A HORMONA EN CÉLULAS INTACTAS
Los ensayos de unión a hormona se realizaron según lo descrito por Ventanas et al., 1990. Las
células se sembraron en placas de 24 pozos (200,000 células/pozo) con CDM enriquecido
con 5 % cdFBS y se incubaron 24 h. Para medir la unión total de esteroides se adicionó 1 nM
de ligandomarcado con tritio (3H-ligando) y para la unión de ligando no específica se utilizó1
nM de 3H-ligando más un exceso de 100 veces de ligando sin marcar. Las células se
incubaron 4 h a 37 °C y posteriormente se lavaron 5 veces con PBS frío. Después de los
lavados se agregó EtOH a los pozos durante 30 minutos a temperatura ambiente para fijar
las células y extraer la hormona, el EtOH se transfirió a viales de centelleo para la
cuantificación de radioactividad en un contador de centelleo (LS 6500). Los resultados se
normalizaron con la cantidad de proteína y se expresaron como cpm/mg de proteína.
4.10. ENSAYO DE INMUNOPRECIPITACIÓN DE LA CROMATINA (ChIP)
Para este ensayo se desarrolló un protocolo modificado en base a la metodología de Nissen
y Yamamoto 2002, Szak et al., 2001 y Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY). Las células de
estroma y de epitelio se cultivaron de acuerdo a lo descrito en cocultivos utilizando placas
de 12 pozos a un 70 % de confluencia. Los cultivos se infectaron con los vectores de
expresión Ad-MMTV-Luc (dilución 1:300) y Ad-his-AR (dilución 1:3000) durante 3 h a 37 °C.
Después de la infección se adicionó medio fresco a los cultivos y se incubaron durante 36 h
a 37 °C para permitir la expresión de las proteínas. El tratamiento con R1881 se hizo durante
1 h a 37 °C y después de lavarlas dos veces con PBS, se adicionó formaldehído al 1 % en PBS
durante 1 h a temperatura ambiente, para producir enlaces entrecruzados entre DNA y las
proteínas que se encuentran asociadas a él, así como entre las proteínas que se encuentran
interaccionando una con otra. La formación de enlaces entrecruzados se detuvo con la
adición de glicina 0.125 M durante 5 min. Las células se lavaron dos veces con PBS frío y se
recolectaron raspando la placa. La suspensión celular se centrifugó a 600 G durante 5 min a
4°C. Los botones celulares se resuspendieron con 500 µL del amortiguador de lisis Chro-IP
(Hepes-KOH 50 mM pH 8, EDTA mM, EGTA 0.5 mM, NaCl 140 mM, glicerol al 10 %, NP-40 al 0.5
%, Triton X-100 al 0.25 %, PMSF 1mM e inhibidor de proteasas 0.7X) y se mezclaron por rotación
durante 10 min a 4°C. Los núcleos así obtenidos se colectaron por centrifugación (16,000 G
durante 5 min) y se resuspendieron en 500 µL del amortiguador de lavado (Tris-HCl 10 nM pH
8, EDTA 1 mM, EGTA 0.5 mM, NaCl 200 mM, PMSF 1mM e inhibidor de proteasas 0.7X) y
16
nuevamente mezclados por rotación. Los núcleo ya lavados, se centrifugaron como en el
caso anterior y se resuspendieron en 500 µL de amortiguador RIPA 1X (Tris-HCl 10mM pH 8,
EDTA 1mM, EGTA 0.5 mM, NaCl 140 mM, Triton X-100 al 1 %, 0.5 % de desoxicolato de sodio,
0.1 % de SDS, PMSF 1 mM e inhibidor de proteasas 0.7X). La muestras fueron sonicadas con
un Fisher Sonicator Dismembrator 100 con “cup-horn” utilizando la potencia 4 durante 10 seg
seguidos de enfriamiento en hielo durante 1 min para un total de 1 min de sonicación. Con
este procedimiento se obtuvieron fragmentos de DNA de 0.3 – 1.5 Kb. Los desechos celulares
se colectaron por centrifugación (16,000 g durante 10 min) y el sobrenadante se pasó a un
tubo limpio y se mantuvo a –80 °C.
4.10.1. Inmunoprecipitación
Por cada columna se utilizaron 10 µg de proteína y se diluyeron con amortiguador RIPA para
un volumen total de 500 µL, los cuales se preclarificaron con 25 µL de una mezcla de DNA de
esperma de salmón, agarosa, proteína A y proteína G (Upstate Biotechnology, Lake Placid,
NY) durante 30 min a 4 °C con agitación rotatoria y se centrifugaron brevemente para
colectar el sobrenadante. La inmunoprecipitación con los anticuerpos correspondientes se
hizo durante toda la noche con rotación. Para precipitar los inmunocomplejos, se agregaron
30 µl de la mezcla de DNA de esperma de salmón, agarosa, proteína A y proteína G durante
1 h a 4 °C con agitación rotatoria. Las muestras se centrifugaron (1000 rpm por 2 min a 4 °C),
el sobrenadante se eliminó y los inmunocomplejos se lavaron durante 5 minutos con rotación
a 4 °C con 1 mL de las siguientes soluciones: dos veces con amortiguador RIPA 1X; una vez
con amortiguador RIPA más DNA de esperma de salmón 100 µg/mL, el cual ha sido
sonicado previamente; una vez con amortiguador RIPA más DNA de esperma de salmón 100
µg/mL más NaCl 500 mM y una vez con amortiguador de LiCl (Tris-HCl a pH 8, EDTA 1 mM,
EGTA 0.5 mM, LiCl 250 mM, Triton X-100 al 1 %, desoxicolato de sodio al 1 % y PMSF 1 mM). Los
inmunocomplejos se extrajeron dos veces con 50 µL de amortiguador de elución recién
preparado (SDS 1 %, NaHCO3 0.1 M) se mezclaron con vortex y se incubaron 15 minutos con
rotación a temperatura ambiente, se centrifugaron y se recuperó el sobrenadante. Para
revertir la formación de los enlaces entrecruzados las muestras se hirvieron 30 min. El DNA se
recuperó utilizando QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA). El DNA se eluyó con
agua libre de DNAsas y RNAsas (Ambion).
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4.10.2. PCR
En las reacciones de PCR para el ChIP, se utilizaron 2 µl de la solución de DNA y 24 ciclos de
amplificación con los iniciadores específicos para la secuencia del HRE presente en MMTV-
LTR, en sentido (5’-TGGTTACAAACTGTTCTTAAAACAAGG-3’) y contrasentido (5’-
AACACTAAGAGCTCAGATCAGAACATTT-3’). La mezcla de reacción se calentó a 95 ºC/3
min, y 30 ciclos de 95 ºC/15 sec y 60 ºC/1 min. Los productos de PCR se analizaron en un gel
de poliacrilamida al 12 %, el cual se tiñó con bromuro de etidio y se observó en un
documentador de geles (GelDoc XR, Biorad).
4.11. PCR CUANTITATIVO EN TIEMPO REAL
La muestras tratadas se lavaron y se lisaron con 300 µl de Trizol (Invitrogen), la purificación de
RNA total se hizo siguiendo las indicaciones del provedor (RNAqueous RNA isolation kit,
Ambion). La reacción de transcripción reversa (RT-PCR) se hizo en 100 µl que contenían 100-
400 ng de RNA, MgCl2 25 mmol/L, dNTP´s 25 mmol/L (Perkin-Elmer, Wellesley, MA), buffer PCR
II 10x (Life Technologies), inhibidor de RNAsa RNAsin 40 unidades/µL (Promega), hexámeros al
azar 45 µmol/L (IDT, Coralville, IA), transcriptasa reversa superscript 200 unidades/µL (Life
Technologies) y agua libre de nucleasas (Ambion). Se realizaron reacciones paralelas sin
transcriptasa reversa como controles negativos. Las muestras se incubaron 10 minutos a 25
ºC, 30 minutos a 48 ºC y 5 minutos a 95 ºC en una máquina de PCR PerkinElmer (PE
GeneAmp PC System 9700). Para todos los análisis cuantitativos se realizaron 3 reacciones RT-
PCR para cada muestra. La cantidad de RNA usado en cada reacción fue 400 ng, 200 ng y
100 ng en 100 µl. Todos los controles negativos se realizaron con 400 ng de RNA. La reacción
de PCR cuantitativo en tiempo real (QRT-PCR) se realizó en una máquina ABI Prism 7700
sequence detector system (PerkinElmer Applied Biosystems, Foster City, CA). Los iniciadores y
las sondas TaqMan para amplificar y detectar los coactivadores listados en la Tabla 1 se
diseñaron usando el software Primer Express (Applied Biosystems). Las sondas se marcaron
con 6-carboxi-fluoresceína (FAM) que sirve como el colorante reportero y 6-carboxi-
tetrametil-rodamina (TAMRA) que sirve como el apagador de la fluorescencia. La reacción
de amplificación se hizo en placas de 96 pozos (Applied Biosystems) en un volumen final de
25 µl que contiene los iniciadores (250 nmol/L), sonda (150 nmol/L) 0.75 U AmpliTaq gold DNA
polimerasa (applied biosystems), dNTP´s (200 µmol/l cada uno), en 1X taqman buffer A
18
(Applied biosystems). La mezcla de reacción se precalentó 50 ºC/2 min, 95 ºC/10 min, y 40
ciclos de 95 ºC/15 sec y 60 ºC/1 min.
Tabla 1. Secuencia de los iniciadores y sondas utilizados en los ensayos de PCR cuantitativo en tiemporeal.
Gen Iniciadores
AR(F) 5’-ACATCAAGGAACTCGATCGTATCA-3’(R) 5’-TGGTAGAAGCGTCTTGAGCAGG-3’(S) FAM-TGGATGCAAAAGAAAAAATCCCA-TAMRA
SRC-1(F) 5’-TCCCTCGGTCAATCCTAGTATCTC-3’(R) 5’-TGGATGGTGGCAATGTGG-3’(S) FAM-CCAGCTCATGGTGTGGCTCGTTCA-TAMRA
p300(F) 5’-ATGAGCAACATGAGTGCTAGTCCT-3’(R) 5’-GAATTTATGGCTGAATGCAACATT-3’(S) FAM-AATGGAGGTGTAGGAGTTCAAACGCCGAG-TAMRA
TIF2(F) 5’-AGCTGCCTGGAATGGATATGA-3’(R) 5’-CAACTGGCTTCAGCAGTGTCA-3’(S) FAM-TAAGCAGGAGGGAGACACAACACGGAAAT-TAMRA
RAC3(F) 5’-ACCTGCACTGGGTGGCTCTA-3’(R) 5’-GCAATACTGGTCTCGCACCTG-3’(S) FAM-TCCCACATTGCCTCTTCGGTCTAATAGCATA-TAMRA
CBP(F) 5’-GGGAAGCAGCTGTGTACCATTC-3’(R) 5’-TGAAACACTTCTCACAGAAATGATACC-3’(S) FAM-TCGCGATGCTGCCTACTACAGCTATCAGA-TAMRA
GUS(F) 5’-CTCATTTGGAATTTTGCCGATT-3’(R) 5’-CCGAGTGAAGATCCCCTTTTTA-3’(S) FAM-TGAACAGTCACCGACGAGAGTGCTGG-TAMRA
4.11.1. Cuantificación relativa
Para determinar la expresión relativa de los coactivadores se usó el método del ΔΔCT
descrito con anterioridad (Giulietti et al., 2001, Livak y Schmittgen 2001). El nivel de
transcripción del gen en estudio se comparó con un gen de referencia, el cual se ha
demostrado que tiene una expresión constante. En este caso se utilizó al gen de la β-
glucuronidasa (β-GUS) como gen de referencia. El nivel de transcripción relativo se expresa
como la diferencia entre los valores de CT
19
5. RESULTADOS
5.5. AISLAMIENTO Y CULTIVO DE CÉLULAS DE EPITELIO Y ESTROMA DE MUESTRAS DE PRÓSTATAHUMANA.
Los cultivos primarios de epitelio y estroma (Figura 5) se caracterizaron mediante sus
marcadores celulares utilizando RT-PCR. El RNA aislado de las células epiteliales obtenidas
por digestión con colagenasa y cultivadas en medio definido dieron amplificados para los
genes de AR, citokeratina 19 (CK19) y 14 (CK14) indicando la presencia de células luminales
y basales (Wang 2001, Hayward 1996). El RNA aislado de las células de estroma que se
separaron por gradiente de percoll y cultivaron en RPMI, fueron positivas para vimentina,
factor queratinocítico de crecimiento (KGF), factor 2 fibroblástico de crecimiento (FGF-2),
PS20 y AR, indicando la presencia de mioblastos y fibroblastos en los cultivos primarios de
estroma (Rowley 1995, Farnsworth 1999, Peehl y Sellers 2000). De esta manera se aseguró que
las células aisladas de tejido prostático corresponden a epitelio secretor y estroma y pueden
ser utilizadas en los experimentos posteriores.
Figura 5. Caracterización de los cultivos primarios de próstata humana. Células de epitelio y estromade prostata humana (x 200). Las células de epitelio y estroma se aislaron por digestión enzimática concolagenasa (1mg/mL) y DNAsa (0.1 mg/mL). Después de la digestión las células se separaron utilizandoun gradiente de percoll. Las células de epitelio se colocaron en medio CDM enriquecido con IDGF (10ng/mL) y FBS (10%) para favorecer la unión de las células a la caja de cultivo. Las células de estroma secolocaron en medio RPMI sin rojo de fenol enriquecido con FBS (10 %). Expresión genética de AR ymarcadores celulares. La expresión de los marcadores celulares para estroma y epitelio se determinópor RT-PCR usando iniciadores específicos para AR, PS20, KGF, FGF-2, vimentina, CK14 y CK19.
AR
PS20
FGF2
KGF
Vimentina
CK14
CK19
Estroma
Epitelio
20
5.2 ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL DEL AR EN CULTIVOS PRIMARIOS DE CÉLULAS DE PRÓSTATA.
Para medir la capacidad del AR endógeno de activar la expresión genética en los cultivos
primarios de epitelio y estroma, se utilizó un vector de expresión adenoviral que contiene al
gen reportero de la luciferasa el cual esta bajo el control de la secuencia de respuesta a
hormona del virus de tumor mamario de ratón (MMTV) de aquí en adelante referido como
Ad-MMTV-Luc. Las células de epitelio y estroma se infectaron con Ad-MMTV-Luc en ausencia
o presencia de concentraciones crecientes de R1881. En La figura 6A se observa que la
actividad del gen reportero Ad-MMTV-Luc en células de epitelio se induce en presencia de
R1881 al menos 10 veces a la concentración 5 nM. Sin embargo, en células de estroma la
inducción fue de sólo 3 veces a la concentración máxima de R1881. Los ensayos de unión a
ligando dieron una capacidad de unión específica comparable entre los dos tipos celulares,
17.1 ± 4.4 fmol/mg de proteína para epitelio y 16.4 ± 1.7 fmol/mg de proteína para estroma
(Figura 6B). Estos resultados indican que el AR se expresa en ambos tipos celulares en
cantidades similares, sin embargo, el AR regula de manera diferente la expresión genética
en cada compartimento celular.
Figura 6. Actividad transcripcional regulada por AR en células de epitelio y estroma. A. Los cultivosprimarios de epitelio (triángulos) y estroma (cuadrados) se infectaron con Ad-MMTV-Luc (7.7 x 109
partículas virales/mL), en ausencia o presencia de concentraciones crecientes del agonista deandrógeno R1881. La actividad relativa de luciferasa medida representa el promedio ± error estándarde tres lecturas independientes. B. La cantidad de AR en ambos tipos celulares se determinó porensayos de unión a hormona. El epitelio y estroma se incubaron en medio que contiene 1 nM [3H]-R1881 (actividad específica = 85 Ci/mmol) con o sin un exceso de 200 nM R1881 sin marca radioactiva.La capacidad específica de unión a hormona se determinó al restar la unión no específica (enpresencia de 200 nM R1881) a la unión total (1nM [3H]-R1881) y está expresada en fmol/mg de proteína.
A B
0
40
80
120
160
0 1 2 3 4 5
Concentración de R1881 (nM)
RLU
/ µ
g p
rote
ína Estroma
Epitelio
0
5
10
15
20
Epitelio Estroma
[3H
] R
18
81
un
ido
al A
R
(fm
ole
s /
mg
de p
rote
ína)
21
Con la finalidad de demostrar que la maquinaria transcripcional de las células de estroma
no esta comprometida, se determinó la actividad transcripcional de otro factor de
transcripción, el receptor a glucocorticoides (GR). En la figura 7A se observa que el
glucocorticoide sintético dexametasona induce la transcripción del gen reportero indicando
que los cultivos de estroma contienen GR funcional y esta actividad es muy similar a la
observada en células de epitelio (resultado no mostrado). Además la actividad
transcripcional es específica al receptor dado que el antagonista de andrógenos casodex
(cas) reduce los niveles transcripcionales mediados por AR y el antagonista de
glucocorticoides RU486 reduce los mediados por GR (Fig. 7A). Los valores del GR medidos a
través de la capacidad de unión específica a ligando fueron 33.3 ± 8.6 fmol/mg de proteína
en células de estroma y 31.7 ± 1.7 fmol/mg de proteína en células de epitelio. (Fig. 7B) . Estos
resultados sugieren que la incapacidad del AR en la células de estroma de inducir la
transcripción del gen reportero en presencia de andrógenos es específica al receptor y no
se debe a deficiencias en la maquinaria general de la transcripción.
Figura 7. Actividad transcripcional en cultivos de estroma. A. Los cultivos primarios de estroma seinfectaron con Ad-MMTV-Luc (7.7 x 109 partículas virales/mL), en ausencia o presencia de R1881, R1881más el antagonista de andrógenos casadox (Cas), el glucocorticoide sintético dexametasona (Dex) yDex más el antagonista de glucocorticoides RU486 a una concentración final de 5 nM. La actividad detranscripción representa el promedio de 3 mediciones independientes ± error estándar. B. La cantidadde GR en epitelio y estroma se determinó por ensayos de unión a ligando. Las cultivos se incubaron enmedio con 1 nM [3H]-dexametasona (actividad específica = 85 Ci/mmol) en ausencia o presencia deun exceso de dexametasona no marcada (200 mM). La capacidad específica de unión se determinócomo en la Fig 6.
A B
0
100
200
300
400
500
EtOH R1881 R1881/Cas Dex Dex/RU486
RLU
/ µg
de
prot
eína
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Epitelio Estroma
[3H
] D
ex u
nid
a a
GR
fmo
l /
mg
de p
rote
ína
22
5.3. EXPRESIÓN DEL RECEPTOR DE ANDRÓGENOS EN UN SISTEMA MEDIADO POR ADENOVIRUS.
Para sobre-expresar al AR en las células de estroma y epitelio, se usó un vector de expresión
mediado por adenovirus el cual resultó ser muy eficiente para infectar a los cultivos primarios
y sobre todo para que éstos expresaran la proteína en estudio. El adenovirus contiene el gen
del AR humano al cual se le adicionó una secuencia de histidinas en el extremo amino (His-
Tag). Los cultivos primarios de células de próstata se infectaron con este vector de expresión
y el His-tag se utilizó en algunos casos para inmunoteñir, inmunoaislar o inmunodetectar al
receptor. Una vez que se logró producir el adenovirus que contiene el gen del AR por la
técnica de recombinación descrita en materiales y métodos, se procedió a realizar los
estudios de caracterización de la proteína para demostrar que actúa como un factor de
transcripción y poder utilizarlo en los experimentos siguientes. La caracterización de este
vector de expresión se hizo en células CV-1 dado que estas células no expresan el AR.
En primer lugar se determinó la expresión de la proteína mediante inmunofluorescencia, los
cultivos de las células CV-1 se infectaron con el vector de expresión Ad-his-AR y se trataron
con R1881 o con vehículo de acuerdo a lo descrito en materiales y métodos. En la figura 8 se
observa que en ausencia de R1881 (A, B y C), el receptor se encuentra tanto en citoplasma
como en el núcleo y siguiendo el mecanismo de acción de los receptores nucleares, en
presencia de R1881 (D, E y F) el receptor migra hacia el núcleo. En esta figura se puede
apreciar que alrededor del 80 % de las células expresan el receptor, lo cual es indicativo de
la efectividad de los adenovirus como vectores de expresión. Los ensayos de Western Blot
utilizando el anticuerpo específico contra el his-tag (G) muestran que la proteína se expresa
del tamaño esperado (110 kDa) tanto en ausencia (-) como en presencia (+) del agonista
de andrógenos, R1881. Como se esperaba y confirmando los resultados de
inmunofluorescencia, en el inciso G se observa que en ausencia de hormona (-), el AR se
recupera en la fracción citosólica (C) así como en la fracción nuclear (N). Sin embargo,
cuando se agrega el ligando (+) se induce la translocación del AR del citoplásma al núcleo.
Las células que fueron infectadas con el vector Ad-β-gal (Este vector contiene al gen de la -
β-galactosidasa) no muestran la inmunodetección del receptor ni en la fracción citosólica ni
en la fracción nuclear. Estos resultados demuestran que la proteína expresada en las células
CV-1 se comporta de acuerdo a lo esperado para un receptor de andrógenos.
23
Figura 8. Inmunolocalización in vivo del Ad-his-AR. Las células CV-1 se infectaron con el Ad-his-AR enausencia (A, B y C) o presencia (D, E y F) de R1881 5 nM. El AR se inmunodetectó con el anticuerpomonoclonal AR-C19 y como segundo anticuerpo se utilizó el IgG anti conejo conjugado con FITC. Losnúcleos se tiñeron con yoduro de propidio (B y E). Las preparaciones se analizaron en un microscopioconfocal invertido Leica DM IRBE y las imágenes se analizaron con el analizador de imágenes TCS-TN,los incisos A y D muestran al AR, B y E a los núcleos y C y F la superposición de los dos anteriores. G)Expresión y distribución celular del Ad-his AR. Las células CV-1 se infectaron con los vectores deexpresión Ad-β-gal el cual se usó como control negativo o Ad-his-AR a una dilución 1:3000 en ausencia(-) o presencia (+) de R1881 5 nM. Las fracciones proteínicas del citosol (C) y del núcleo (N) sefraccionaron por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. La presencia del AR seanalizó por western blot con el anticuerpo RGS-His-Tag, los números a la derecha indican el tamaño enkDa.
Siguiendo con la caracterización del Ad-his AR, la figura 9A muestra que la expresión de la
proteína es proporcional a la cantidad de virus utilizada para infectar a las células. También
se observa que la actividad transcripcional del receptor se induce en presencia de R1881 y,
A
G
B C
D E F
206
119
91
51
+Ad-his-ARAd-β-gal
CCCC N
+N N N
24
una vez que el sistema se satura, la actividad transcripcional del receptor disminuye, lo cual
corresponde con el comportamiento descrito para los receptores esteroideos. La figura 9B
muestra que la actividad basal del receptor se induce en presencia de agonistas de
andrógenos, en este caso R1881 y mibolerone, sin embargo no se induce en presencia del
glucocorticoide sintético dexametasona o del agonista de estrógeno R5020. Estos resultados
indican que el vector de expresión Ad-his-AR produce un receptor que es específico en su
capacidad para unir R1881, en translocarse al núcleo y en activar la expresión de genes
blanco de una manera dependiente de ligando.
Figura 9. Curva de titulación y expresión del Ad-his-AR. A) Las células CV-1 se coinfectaron con elreportero Ad-MMTV-luc y cantidades crecientes de Ad-his-AR en ausencia (barras negras) o presencia(barras blancas) de R1881 5 nM, como control negativo se usó el adenovirus que solo contiene el His-Tag (0), después de 36 h de tratamiento con R1881 las células se lisaron y el extracto celular se usó paradeterminar la actividad de luciferasa y western blot con el anticuerpo RGS-His-Tag. B) Actividadtranscripcional de Ad-his-AR. Las células CV-1 se infectaron con el reportero Ad-MMTV-Luc y Ad-His-ARen ausencia (EtOH) o presencia de R1881 (R1881), mibolerone (Mib), dexametasona (Dex) y R5020(R5020) a una concentración de 5 nM. Después del tratamiento con los ligandos mencionados, sedeterminó la actividad de luciferasa.
Con la finalidad de hacer una caracterización completa del receptor, se determinó la
afinidad y especificidad de Ad-his-AR por el ligando mediante el análisis de Scatchard
(Pedersen y Lindup 1994) y ensayos de unión a hormona (Ventanas et al., 1990). En la figura
10A se muestra la saturación del receptor por R1881 y en 10B se muestra el análisis de
Scatchard en donde la Kd = 3.57x10-11 M cuyo valor es comparable a lo previamente
reportado para el AR y el número de sitios de unión a hormona por célula es de 25 x 106. En
la figura 10C se muestra la especificidad por el ligando medida por ensayos de
competencia. En conjunto, éstos resultados muestran que el Ad-his-AR funciona como un
010002000300040005000600070008000
0
1:15000
1:6000
1:3000
1:1500
1:600
1:300
1:200
1:150
Dilución del Ad-his-AR
RLU
/ µg
prot
eína
A B
0
500
1000
1500
2000
EtOH R1881 Mib Dex R5020
RLU/
µg
prot
eína
Cantidad de Ad-his-AR
25
factor de la transcripción y puede utilizarse para estudiar con más detalle la actividad de
éste receptor en los cultivos de las células de estroma y epitelio.
Figura 10. Caracterización cinética del Ad-his-AR. A) Curva de saturación del receptor por el ligando.Las células CV-1 infectadas con Ad-his-AR se trataron con 3H-R1881 para determinar la unión total deligando (cuadros negros) y con 3H-R1881 en presencia de un exceso de R1881 sin marca paradeterminar la unión inespecífica (círculos), la unión específica se obtiene al restar la unión noespecífica a la total (cuadros blancos). B) Análisis de Scatchard. Con los resultados obtenidos en elinciso A se hizo una gráfica de acuerdo al análisis de Scatchard para obtener la constante de afinidaddel receptor por el ligando (Kd = 3.57 x 10 –11 M) y el número de sitios de unión al ligando por célula (25x 106). C) Unión específica de Ad-his-AR por el ligando. Las células CV-1 se infectaron con Ad-his-AR ylos ensayos de unión a ligando se realizaron por competencia del ligando tritiado, 3H-R1881 contra unexceso de 10 veces (10X) de ligando no tritiado, R1881, mibolerone (Mib) dihidrotestosterona (DHT),dexametasona (Dex) agonista de progesterona R5020 (R5020) o estrógeno (E2). La unión específica seobtuvo como en el inciso A.
5.4. ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL DE Ad-his-AR EN CULTIVOS PRIMARIOS
Los estudios de la actividad y expresión del AR endógeno en las células de próstata
demostraron que el receptor se expresa en ambos compartimentos celulares (Fig. 11). Sin
embargo, se observan diferencias celulares específicas cuando el AR regula la transcripción
de los elementos de respuesta a hormona (HRE). Para determinar la eficiencia del Ad-his-AR
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 1 2 3 4 5 6
3H-R1881 (nM)
cpm
totalinespecíficoespecífico
y = -0.0155x + 0.2443
R2 = 0.9737
00.020.040.060.080.1
0.120.140.160.180.2
0 5 10 15 20
Unido (pmol)
U/L
A B
C
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
3H-R
1881
200X
R18
81
10X
R188
1
10X
Mib
10X
DH
T
10X
Dex
10X
R502
0
10X
E2
cmp/
mg
prot
eína
26
como un factor de transcripción en las células de epitelio y estroma, se midió la actividad
del gen reportero MMTV-Luc co-infectado con cantidades crecientes de Ad-his-AR en
ausencia y presencia de R1881. Como se muestra en la figura 11A, la presencia de R1881, en
células de epitelio, induce una activación eficiente del gen reportero regulada por AR. Sin
embargo, la presencia de R1881 en células de estroma estimula la actividad del gen
reportero en menor magnitud que la observada en células de epitelio. Esta diferencia en la
capacidad del Ad-his-AR de activar al gen reportero MMTV-luc en estos dos tipos celulares
se observó también cuando las células se trataron con diferentes concentraciones de R1881
(Fig. 11B). Los ensayos de unión a hormona revelaron que la expresión relativa del AR en las
células de estroma y epitelio infectadas con Ad-his-AR es comparable; 1532 ± 267 fmol/mg
de proteína para el estroma y 2037 ± 417 fmol/mg de proteína para epitelio (figura 11C).
Figura 11. Actividad transcripcional del Ad-his-AR en células prostáticas. A) Los cultivos primarios deestroma (cuadrados) y epitelio (círculos) fueron cultivados en medio enriquecido con cdFBS einfectados con Ad-MMTV-Luc y cantidades crecientes de Ad-his-AR (stock 1 x 1012 partículas/mL),después del tratamiento con R1881 5 nM se determinó la actividad relativa de luciferasa. B) Los cultivosprimarios de estroma (cuadrados) y epitelio (círculos) se cultivaron como en el inciso A y se infectaroncon Ad-MMTV-Luc y Ad-his-AR (dilución 1:3000) en ausencia o presencia de concentracionescrecientes de R1881, después del tratamiento con el ligando se determinó la actividad de luciferasa.C) La capacidad específica de unión a ligando del Ad-his-AR se determinó por ensayos de unión aR1881 en cultivos primarios de estroma y epitelio infectados con Ad-his-AR según lo descrito en lafigura 6.
A
0
500
1000
1500
2000
2500
0 2 4 6 8 10 12
Ad-his-AR (uL)
RLU/
µg p
rote
ína
Estroma
Epitelio
Poly.(Epitelio)Poly.(Estroma)
B
C
0
100
200
300
400
500
600
700
0 0.001 0.01 0.1 10
Concentración de R1881 (nM)
RLU/
µg p
rote
ína
Estroma
Epitelio
Poly.(Epitelio)Poly.(Estroma)
0
500
1000
1500
2000
2500
Estroma Epitelio
[3H
] R
18
81
un
ido
a A
R(f
mo
l /
mg
pro
teín
a)
27
5.5. EXPRESIÓN GENÉTICA DE COACTIVADORES EN LOS COMPARTIMENTOS CELULARES DE LAPRÓSTATA HUMANA.
La hipótesis de este trabajo propone que la actividad transcripcional diferente del AR en los
compartimentos celulares de la próstata se debe, al menos en parte, a la expresión
diferente de coactivadores en dichos compartimentos. Para determinar los niveles de
expresión relativa de diferentes coactivadores, se realizó PCR cuantitativo (QRT-PCR) en
estroma y epitelio, utilizando el método comparativo del CT descrito en materiales y
métodos. Para cuantificar los niveles de mRNA de diferentes coactivadores en las células de
próstata mediante QRT-PCR, se aisló RNA de los cultivos primarios de epitelio y estroma y éste
se uso para determinar los niveles relativos de expresión de los mRNA´s, el gen de la β
glucuronidasa (GUS) se usó como gen de referencia y con respecto al cual se determinó el
nivel relativo de expresión de cada uno de los genes probados. Como se muestra en la
figura 12, la expresión genética relativa de varios coactivadores, incluyendo RAC3, SRC-1, TIF
2, p300 y CBP es mayor en epitelio comparado con estroma. Los resultados de la gráfica
muestran que el AR se expresa a niveles comparables en ambos compartimentos de la
próstata y que la expresión relativa de coactivadores aparentemente es mayor en células
de epitelio.
Figura 12. Cuantificación de la expresión de algunos coactivadores en la células de próstata. Losniveles de los transcritos del AR y diferentes coactivadores se determinaron en cultivos primarios deepitelio (barras grises) y estroma (barras negras). Los niveles de transcritos se expresan en unidadesrelativas a la expresión del gen de β-GUS. Los resultados son representativos de tres experimentosindependientes.
0
1
2
3
4
5
AR p300 RAC-3 SRC-1 CBP TIF2
Exp
resi
ón
Rela
tiva
28
5.6. LA ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL DEL AR ES DEFICIENTE EN ESTROMA PROVENIENTE DE
MUESTRAS CON CÁNCER DE PRÓSTATA.
Se probó la capacidad del AR como factor de transcripción en células de estroma aisladas
de tejido prostático tumoral (CAS), por sus siglas en inglés (Cancer Associated Stroma) y
células de estroma aisladas de tejido normal (BAS) por sus siglas en inglés (Benign Associated
Stroma). En la figura 13A, se observa que la actividad transcripcional regulada por el AR
endógeno activada por R1881 en células CAS (grado Gleason 6-7) resultó ser menor
comparada con BAS. Se analizaron 14 muestras y en todas ellas la actividad transcripcional
del AR se encontró reducida desde un 2 hasta un 67 % con respecto a BAS.
Figura 13. Actividad transcripcional regulada por AR en células de estroma aisladas de tejido normal(BAS) o tejido canceroso (CAS). A) La actividad transcripcional del AR endógeno se determinó encultivos primarios de BAS o CAS infectadas con Ad-MMTV-Luc en ausencia (barras blancas) opresencia (barras grises) de R1881. B) La actividad transcripcional del Ad-his-AR se determinó encultivos primarios de BAS o CAS co-infectados con Ad-MMTV-Luc y Ad-his-AR en ausencia (barrasblancas) o presencia (barras grises) de R1881. Los resultados representan el promedio de tres lecturasindependientes +/- error estándar.
Se sabe que en algunas líneas celulares provenientes de tumores, el AR está mutado y en
algunas ocasiones estas mutaciones pueden ocasionar que el receptor sea hipersensible o
insensible a la presencia de andrógenos (Mooney, 2003). Para descartar lo anterior, las
células CAS se infectaron con el Ad-his-AR, esto con la finalidad de tener al receptor tipo
silvestre en estas células tumorales. Una vez que las células fueron coinfectadas con el gen
reportero Ad-MMTV-luc y el Ad-his-AR, se midió la actividad transcripcional y nuevamente se
observó que su actividad se encuentra reducida comparada con las células de BAS (Fig
13B). Estos resultados sugieren que la incapacidad del AR para transactivar al gen reportero
en las células CAS no está relacionada a mutaciones en el AR y que existen otros factores
0
5
10
15
20
25
30
35
BAS CAS
RLU
/ µ
g p
rote
ína
A B
0
20
40
60
80
100
120
BAS CAS
RLU
/ µ
g p
rote
ína
29
que están ocasionando el efecto observado. También se midió la actividad transcripcional
del AR en células de epitelio normal y tumoral pero en este caso no hubo diferencia en los
resultados (resultado no mostrado).
5.7. LAS CÉLULAS DE EPITELIO MODULAN LA ACTIVIDAD DEL AR EN EL ESTROMA, AL FAVORECER
LA ASOCIACIÓN DE COACTIVADORES A LOS HRE DE LOS GENES BLANCO.
Se sabe que las interacciones epitelio-estroma son muy importantes para mantener la
homeostasis de la próstata. Lo anterior hace pensar que la capacidad del AR de funcionar
como un factor de la transcripción en un compartimento celular, por ejemplo estroma,
puede ser regulado por la presencia del otro, llámese epitelio. De tal manera que se usó un
sistema de cocultivo (Fig 4) el cual permite un intercambio contínuo de factores en el medio
sin haber contacto celular, para determinar la actividad del receptor en los cultivos primarios
de células de estroma y epitelio crecidas en cocultivo.
En la figura 14A se muestra que en la células de estroma, la actividad transcripcional del AR
inducida por el ligando, se incrementa cuando el ensayo de transcripción se realiza en la
presencia de células epiteliales (Fig. 14A BAS/epi). Es importante notar que la actividad
transcripcional basal del reportero TATA-luc (el gen de la luciferasa se clonó en el vector de
expresión bajo el control de la caja TATA, con la finalidad de medir solo transcripción basal
debida a la caja TATA), el cual carece de un elemento que responda a hormona, no se
afecta de manera significativa cuando el estroma es cultivado en presencia de epitelio
(Fig.14D TATA-luc). En estos experimentos se probó en lugar de epitelio, las células CV-1 (Fig.
14B) además de otras líneas célulares incluyendo LNCaP, DU145, PC3, LAPC-4 y HeLa (no se
muestra el resultado) y se encontró que todas estas células son incapaces de incrementar la
actividad transcripcional del AR en las células de estroma, lo que es indicativo de que este
tipo de regulación es específico para células de epitelio de próstata. Otro resultado
interesante al realizar estos ensayos fue el hecho de que en las células CAS (Fig 14C) el
epitelio es incapaz de modular la actividad transcripcional del AR. Dado que el sistema de
cocultivo permite la difusión de factores en por el medio, se preparó medio condicionado
de células de epitelio según lo descrito en (DeGeorges et al., 1996). Las células del estroma
se crecieron en presencia del medio condicionado preparado a partir de células de epitelio
y de las lineas celulares probadas en los co-cultivos y el resultado obtenido fue el mismo, lo
que sugiere que el epitelio secreta un factor o factores que actúan de forma paracrina en
30
las células de estroma, (resultado no mostrado). Estos resultados son importantes porque
demuestran que las células de epitelio tienen la capacidad de modular la actividad
transcripcional del AR en las células de estroma de una manera específica a la célula y al
gen.
FIGURA 14. Actividad transcripcional del Ad-his-AR en cocultivo. A. Los cultivos primarios de estromanormal BAS y se coinfectaron con Ad-his-AR y Ad-MMTV-Luc y se crecieron solas o en co-cultivo conepitelio, la actividad de luciferasa se determinó en ausencia (barras blancas) o presencia (barrasgrises) de R1881 5 nM. B. El experimento A se hizo ahora creciendo las células de estroma en co-cultivocon células CV-1, C. El experimento A se repitio con células de estroma aislado de tejido canceroso(CAS). D. El experimento A se hizo con dos tipos de promotores Ad-TATA-Luc (que no tienen elementode respuesta a hormona) y Ad-HRE-Luc el cual si poseé un elemento de respuesta a hormona en suregión promotora.
En un intento por esclarecer los mecanismos moleculares por los cuales las células epiteliales
modulan la actividad transcripcional del AR en el estroma, se analizó la asociación de este
receptor y algunos correguladores con los genes blanco mediante el ensayo de
C D
A B
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
BAS BAS/Epi
RLU
/ µ
g p
rote
ína
0
100
200
300
400
500
600
700
BAS BAS/CV-1
RLU
/ µ
g p
rote
ína
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
CAS CAS/Epi
RLU
/ µ
g p
rote
ína
0
4000
8000
12000
16000
20000
BAS BAS/Epi BAS BAS/Epi
RLU
/ µ
g p
rote
ína
TATA-Luc HRE-Luc
31
inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP). Este ensayo se realizó en las células de estroma
in vivo tanto en cultivo simple (BAS) como en cocultivo con células de epitelio (BAS/ep).
Figura 15. Asociación de AR y correguladores con el HRE del promotor de MMTV. El efecto de lascélulas de epitelio en la asociación del AR y correguladores con el promotor del MMTV en las célulasde estroma, se analizó mediante el ensayo ChIP. Los cultivos primarios de células de estroma aisladasde tejido benigno (BAS) o tejido canceroso (CAS) se infectaron con Ad-his-AR y Ad-MMTV-Luc. Lascélulas infectadas se crecieron en cultivo simple (BAS)y (CAS) o en cocultivo con células de epitelio(BAS/epi) y (TAS/Epi) en ausencia (-) o presencia (+) de R1881. La amplificación del elemento derespuesta a hormona (HRE) del promotor de MMTV se amplificó por PCR a partir del DNA purificado delos complejos inmunoprecipitados con los anticuerpos contra AR, SRC-1, SMRT y NCoR. El control parala unión no específica se realizó utilizando RAM como anticuerpo. En todos los casos se usaroncantidades comparables de DNA genómico (input) para realizar la inmunoprecipitación.
En nuestro estudio, los complejos MMTV-AR-coactivador (DNA/proteína) se determinaron
utilizando iniciadores para la secuencia MMTV-LTR. Como se muestra en la figura 15, la
asociación del AR con la secuencia del HRE del promotor del MMTV en las células de
estroma es débil y además se encuentra en asociación con el correpresor SMRT [BAS (-)]. Se
puede observar que el correpresor NCoR no forma parte del complejo, por lo cual la
asociación con SMRT es específica. Como se esperaba, la presencia de R1881 induce la
liberación del correpresor del complejo DNA-AR y favorece la asociación del coactivador
SRC-1 [BAS (+)]. La asociación del AR y de SRC-1 en la secuencia MMTV que se favorece en
presencia del ligando se aumenta cuando el ensayo se realiza en cocultivo con epitelio
CAS CAS/EpiBAS BAS/Epi
(-) (-)(+) (+)R1881
Input
Ram
AR
SRC-1
SMRT
NCoR
(-) (-)(+) (+)
32
[BAS/Epi). Por otro lado, las células de estroma tumoral presentan un patrón diferente al del
estroma normal: el estroma tumoral en ausencia de ligando se encuentra unido a SMRT,
pero la señal no es tan clara como en las células normales [CAS(-)]. Sin embargo, en
presencia de hormona hay asociación del correpresor NCoR [CAS (-)], y esta asociación
persiste aun cuando las células de estroma tumor se cocultivan con células de epitelio
(CAS/Epi), lo cual sugiere que las células CAS son incapaces de responder a la señal o
señales enviadas por el epitelio.
5.8. SRC-1 AUMENTA LA ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL REGULADA POR EL AR EN CÉLULAS DE
ESTROMA (BAS Y CAS).
Una vez que se demostró que existen diferencias en los niveles de transcripción de
coactivadores en los compartimentos celulares de la próstata (estroma y epitelio) y también
que la asociación del AR con correguladores es diferente entre células normales y
cancerosas, se midió la actividad transcripcional regulada por el AR en células BAS y CAS
cuando hay una sobre expresión del coactivador SRC-1.
Figura 16. Efecto de SRC-1 sobre la actividad transcripcional del AR en células de estroma. Los cultivosprimarios de células de estroma aisladas de tejido benigno (BAS) o tumoral (CAS) se infectaron con losvectores Ad-his-AR y Ad-MMTV-Luc y Ad-his-SRC-1 (+) o Ad-his (-). La actividad de luciferasa sedeterminó en ausencia (-) o presencia (+) de R1881.
0
5000
10000
15000
20000
25000
RLU
/ µg
prot
eína
BAS CAS
(-) (-)(+) (+)SRC-1
(-) (-)(+) (+) (-) (-)(+) (+)R1881
33
En la figura 16 se observa que la sobre expresión de SRC-1 en las células BAS, incrementa la
actividad transcripcional regulada por el AR a los niveles observados en las células de
epitelio. Sin embargo, aun cuando la sobreexpresión del coactivador en las células CAS
incrementa la actividad transcripcional regulada por AR, éste incremento no es comparable
con las células de estroma normales. La baja eficiencia del SRC-1 para incrementar la
actividad transcripcional del AR en células CAS puede deberse a la continua asociación del
AR con los correpresores NCoR y SMRT en presencia de ligando, como se indico en el ensayo
ChIP. Estos resultados sugieren que la función alterada de los correguladores del AR así
como las alteraciones en las intereacciones estroma-epitelio en el microambiente celular,
cambian la señalización celular dependiente de andrógenos en el cáncer de próstata.
34
6. DISCUSIÓN
Durante muchos años, se han utilizado diferentes modelos biológicos para el estudio de la
acción de los andrógenos tanto in vitro como in vivo. Muchos de los sistemas de cultivos
celulares usan líneas derivadas de metástasis, lo cual puede no representar las propiedades
reales de las células tumorales primarias. Por otro lado, diferentes estudios indican que las
interacciones paracrinas en la próstata son determinantes para el control del crecimiento
normal, el desarrollo del tumor y la inducción de la metástasis (Gleave 1992, Wong y Wang
2000, Cunha et al., 2003). Los andrógenos son las principales hormonas involucradas en la
homeostásis de la próstata y el desarrollo del cáncer (Cunha et al., 2003), sin embargo, las
consecuencias biológicas de la actividad del AR son diferentes en cada compartimento
celular. Es difícil elucidar los mecanismos moleculares de la acción de los andrógenos que
conllevan a la biología y patología de la próstata, dado que muchos factores regulados por
hormonas interaccionan en rutas muy complejas en las diferentes etapas del desarrollo
prostático.
Con el objeto de determinar la naturaleza de las células obtenidas del tejido prostático
utilizadas en este estudio, se realizó RT-PCR para determinar los niveles de los mensajeros
específicos del gen del AR y de los genes de citoqueratinas, que son marcadores específicos
de células epiteliales. Los cultivos de epitelio fueron positivos para AR y CK19 que indica la
presencia de células secretoras y CK14 que indica la presencia de células basales. Los
cultivos de estroma fueron negativos para citoqueratinas y positivos para los marcadores de
células de músculo liso y fibroblastos. Los cultivos primarios obtenidos por digestión con
colagenasa sirven como un modelo importante para realizar estudios de actividad de
receptores hormonales. De un gramo de tejido, se pueden obtener alrededor de 10 millones
de células. Los cultivos primarios de epitelio pueden mantenerse en cultivo hasta un máximo
de tres pases antes de que las células se vuelvan seniles mientras que los cultivos de estroma
pueden mantenerse hasta por 10 pases. Los cultivos celulares primarios de epitelio y estroma
proporcionan la oportunidad de explorar la manera por la cual el AR y sus correguladores
funcionan en un sistema in vitro que asemeja el microambiente tisular de la próstata. Para
estudiar las interacciones epitelio-estroma, el complejo AR-correguladores se analizó en los
dos compartimentos celulares usando un sistema de cocultivo, el cual ha sido utilizado en
diferentes estudios (Habib et al., 2000, Castellón et al., 2005). Ambos tipos celulares expresan
el RNAm del AR y niveles comparables de la proteína. La transcripción regulada por el AR
35
difiere significativamente en epitelio comparada con estroma. Las diferencias en la
transactivación regulada por AR entre los dos compartimentos celulares son específicos para
el AR dado que estas diferencias se observaron en concentraciones crecientes de AR
exógeno. Sin embargo, la dexametasona induce de manera eficiente la actividad
transcripcional regulada por el GR en ambos tipos celulares. Por lo tanto, las diferencias en la
transactivación mediada por AR son específicas al tipo celular y al receptor.
Las diferencias en la transactivación regulada por AR se observaron en células de estroma
aisladas de BAS (benign associated stroma) y CAS (cancer associated stroma). En muestras
clínicas de próstata humana la expresión del AR es heterogénea y varía durante la
progresión del cáncer de próstata (Singh et al., 2004). Olapade-Olaopa et al., reportaron
una disminución significativa en la expresión del AR durante la progresión del tumor a un
estado independiente de andrógenos (Olapade-Olaopa et al., 1999). Sin embargo, otros
laboratorios han reportado cambios menores en la expresión del AR durante la progresión
del cancer. En epitelio y estroma se han reportado cambios discretos en la expresión del AR
(Mohler et al., 1996). En este estudio la expresión del AR tanto en muestras benignas como
malignas fue heterogéneo. Sin embargo, los resultados de los ensayos de unión a hormona
indican que la expresión del AR en BAS y CAS es similar, por lo que los cultivos celulares de
BAS y CAS pueden representar una fracción de las células de estroma positivas a AR.
La expresión o actividad diferente de los correguladores puede permitirle a los receptores
esteroideos lograr especificidad cuando se expresan los genes regulados por hormonas en
un tejido endocrino en particular. Diferentes coactivadores, incluyendo SRC-1 (Misiti et al.,
1999, Shim et al., 1999), FHL2 (Muller et al., 2000), proteína que interacciona con AR 3
(Moilanen et al., 1999), RAP250 (Caira et al., 2000) y PParγ (Puigserver et al., 1998) se expresan
de forma diferencial en los tejidos endocrinos. La expresión diferencial de los genes
regulados por AR en epitelio y estroma, puede ser el resultado de la formación de complejos
transcripcionales con correguladores diferentes. Las células epiteliales tienen una expresión
relativa mayor de los coactivadores SRC-1, RAC-3, TIF2 y p300/CBP. En experimentos
realizados para determinar el patrón de expresión de coactivadores en diferentes tejidos
revelaron que SRC-1 se expresa predominantemente en células de estroma de la glándula
mamaria de ratón, mientras que FHL2 se expresa predominantemente en el epitelio
prostático. De tal manera que la diferente expresión de los correguladores que son
importantes para regular la expresión de los genes que responden a andrógenos es un
36
mecanismo vital del receptor para regular la expresión genética de una manera específica
al tipo celular en el tejido prostático y entre los diferentes tejidos endocrinos.
Los estudios de recombinación de tejidos realizados por Cunha, demostraron que el
mesénquima del seno urogenital es el responsable de inducir el fenotipo prostático (Cunha y
Chung 1981) con la participación de diferentes proteínas prostáticas (Donjacour y Cunha
1993, Takeda et al., 1990). En los fetos de rata, el AR está localizado principalmente en el
estroma más que en epitelio, y una carencia del AR en el mesénquima, pero no en el
epitelio, produce un fenotipo vaginal en lugar de un fenotipo prostático. (Hayward et al.,
1998, Prins y Birch 1995, Cunha et al., 1987, Takeda y Chang 1991). El epitelio prostático
secretor necesita un AR funcional en los dos compartimentos celulares de la próstata
(Thompson et al., 1986, , Shannon y Cunha 1984, Donjacour y Cunha 1988, Cooke et al.,
1991). De tal manera que las células de estroma son necesarias para mantener a las células
de epitelio en un estado diferenciado y para reprimir la proliferación de las mismas de una
manera dependiente de andrógenos. Y, por el contrario, el epitelio prostático mantiene a
las células de estroma en un estado diferenciado. A pesar de todos los experimentos
realizados con recombinación de tejidos, los mecanismos moleculares que dirigen las
interacciones epitelio-estroma están poco estudiados. El sistema de cocultivo, el cual
permite la interacción de estos dos tipos celulares, muestra que el epitelio aislado de tejido
benigno modula la función del AR en el estroma al favorecer el reclutamiento de
coactivadores al complejo transcripcional en el promotor de genes que responden a
andrógenos, el cual contiene un simple ARE y que es inducido por el andrógeno, afectando
de manera mínima la actividad basal del promotor bajo el control de la caja TATA. La
combinación de vectores de expresión adenovirales y la actividad reportera de la luciferasa
permiten un gran número de estudios de expresión con relativamente pocas células en
cultivo. MMTV es un modelo bien caracterizado que contiene un elemento de respuesta a
hormona y que ha sido ampliamente utilizado para estudiar la transcripción de genes
regulados por hormonas, lo cual permite el estudio de los mecanismos moleculares básicos
de la función del AR y sus correguladores, así como la especificidad de éstos en los
diferentes compartimentos celulares de la próstata durante la progresión del tumor de un
estado dependiente de hormonas a uno independiente de ellas. Sin embargo, el reportero
MMTV-Luc puede no reflejar la actividad del AR en un ARE endógeno de las células de
estroma o epitelio. Un ejemplo clásico de regulación genética diferencial mediada por
andrógenos es PSA y KGF/FGF7. Estos dos genes están presentes en el genoma de todas las
37
células prostáticas, pero el epitelio maduro expresa PSA pero no KGF/FGF7, y el estroma
maduro produce KGF pero no PSA. Por lo tanto, una extensión de estos resultados será
determinar las diferencias en el complejo transcripcional del AR en PSA y KGF/FGF7 en el
contexto de las interacciones epitelio-estroma.
Los experimentos de recombinación de tejidos usando estroma aislado de Tfm (ratón con
feminización testicular) mostraron que el AR en el estroma es clave durante el crecimiento y
la función del epitelio tanto en un estado normal así como en un proceso canceroso (Cunha
y Donjacour, 1987). Sin embargo, Gao y col, mostraron que las lineas tumorales aisladas de
metástasis de cáncer de próstata incluyendo LNCaP y LAPC4, son capaces de formar
tumores en presencia de estroma aislado de Tfm (Gao et al.,, 2001). Estos resultados indican
que las líneas antes mencionadas adquirieron un fenótipo “parecido a estroma” que les
permite crecer como xenografías independientes de estroma positivo a AR. El hallazgo de
que los cultivos primarios de células epiteliales de próstata no pueden modular la actividad
del AR y el reclutamiento de correguladores en células CAS demuestra la importancia del
papel que tienen las interacciones epitelio-estroma en el sistema de cocultivo in vitro usado
en este trabajo.
La regulación deficiente de correguladores se ha asociado con diferentes patologías. El
coactivador AIB1 está sobre expresado o amplificado en diferentes líneas celulares de
páncreas, ovario y mama y la expresión alterada de AIB1 y CBP también ha sido
relacionada en el desarrollo y progresión del cancer (Anzick et al.,, 1997). El coativador
ARA55 potencia la actividad transcripcional del AR no solo en respuesta a los andrógenos
adrenales, sino también a los antiandrógenos hidroxiflutamida y otros esteroides no
androgénicos (Rahman et al., 2003). Se ha reportado que los niveles de expresión de SRC-1
se incrementa en cáncer de próstata en donde las células se encuentran pobremente
diferenciadas y en cáncer independiente de andrógenos (Gregory et al., 2001a y b). Con
base en estos reportes se puede decir que las alteraciones en la expresión de
correguladores juega un papel muy importante en la carcinogénesis. En este trabajo se
indica que la actividad transcripcional del AR está reducida en las células de estroma
aisladas de tejido prostático canceroso comparado con células de estroma aisladas de
tejido prostático benigno. Se han reportado diferentes mutaciones del AR en células
cancerosas por lo que a las células CAS utilizadas en este estudio se les introdujo el AR de
tipo silvestre y se evaluó su actividad transcripcional. Los resultados obtenidos muestran que
38
la actividad reducida del AR en estas células no se debe al AR per se; otros factores deben
de estar alterados en la regulación de la trans-activación mediada por AR. Se encontró que
NCoR y AR se encuentra unidos a los HRE del DNA en presencia de ligando en células de
estroma provenientes de tejido canceroso. Este dato apoya el concepto de que los factores
de crecimiento producidos por el estroma bajo la regulación de andrógenos actúan sobre
el epitelio causando un crecimiento anormal de éstas células. El hallazgo de que el AR
interacciona con correpresores (NCoR y SMART) de una manera dependiente de ligando en
CAS abre la posibilidad de que el AR puede reclutar NCoR y SMART en los ARE’s de los
promotores en respuesta a andrógenos. De tal manera que el balance de la actividad del
AR en presencia de andrógenos puede ser regulada por la competencia entre p160’s y
correpresores por la misma superficie en el AF-2 del AR. Los correpresores SMRT y NCoR
pueden participar en el microambiente de la próstata durante el desarrollo del cáncer de
próstata. El factor o factores secretados por el epitelio que tienen efecto sobre el estroma
deben ser identificados dado el papel que pueden jugar en regular la acción de los
andrógenos así como en la homeostasia de la próstata. En conjunto, la expresión alterada y
la actividad de los correguladores en el estroma prostático pueden ser importantes para el
desarrollo y progresión del cáncer de próstata. Los cultivos primarios de células de próstata
en cocultivo pueden ser una alternativa como modelo fisiológicamente relevante in vitro
para estudiar los mecanismos moleculares por los cuales el AR en el estroma influencia la
función del AR en el epitelio secretor durante la progresión del CaP de un estado
dependiente de andrógenos a uno independiente. Si se pueden entender los mecanismos
de la transactivación diferencial del AR en el estroma y el epitelio de una próstata con
cancer estos conocimientos pueden ser usados para el desarrollo de nuevas terapias y así
mejorar la calidad de vida de los pacientes con este tipo de enfermedad.
39
7. CONCLUSIONES
• El modelo del cultivo primario de células de próstata es una herramienta de
relevancia fisiológica para el estudio de los mecanismos moleculares por los cuales
los receptores a hormonas esteroideas y sus correguladores, modulan el crecimiento
normal y patológico de la próstata mediante su actividad selectiva en los
compartimentos celulares de estroma y epitelio.
• El sistema de expresión mediado por adenovirus (Ad-his-AR) infectó de manera
eficiente los cultivos primarios de próstata y la proteína expresada es funcional en su
capacidad de unión al ligando, translocación nuclear en presencia de hormona y
activación de la expresión de genes regulados por andrógenos de manera
dependiente de ligando. Lo anterior lo hace una herramienta de relevacia fisiológica
para el estudio de la transcripción mediada por AR.
• La actividad transcripcional del AR es mayor en epitelio cuando se comparó con
estroma, lo cual concuerda con la expresión relativa mayor de los coactivadores
SARC-1, RAC-3, TIF2, CBP/P300. Sin embargo, el AR en el estroma alcanza los niveles
de transcripción observados en el epitelio cuando se sobre expresa SRC-1 en estas
células.
• Las interacciones estroma-epitelio en la próstata son importantes ya que modulan la
actividad transcripcional mediada por AR en estroma favoreciendo la disociación de
correpresores y la asociación de coactivadores y esto se presume que es a través de
un factor(es) paracrino(s) secretado(s) por el epitelio.
40
8. PERSPECTIVAS
Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que la actividad transcripcional de AR es
mayor en epitelio comparado con estroma, lo cual se observa cuando las células se cultivan
por separado. Sin embargo, cuando los ensayos de transactivación se realizan en co-cultivo,
se observa que la actividad transcripcional del AR en estroma aumenta a niveles
comparables a los observados en cultivos simples con una sobre expresión de SRC-1. Lo
anterior indica que el epitelio secreta algún factor o factores que tienen acción sobre el
estroma. Estos factores deber ser identificados ya que ellos modulan la acción del receptor
en el estroma y además pueden participar en la regulación del desarrollo y mantenimiento
de la homeostasis en la próstata.
El sistema de cocultivo empleado en este trabajo resultó ser un modelo atractivo para el
estudio de la actividad transcripcional del AR. Este modelo puede ofrecer otras alternativas
no sólo para medir transactivación de receptores esteroides sino también para cuantificar la
expresión de diferentes proteínas cuya expresión pueda estar regulada por factores
paracrinos. Este sistema de cocultivo permite la combinación de diferentes clases de tipos
celulares ya sea normales o cancerosos.
Sería interesante investigar que genes se “encienden” o “apagan” cuando las células de
estroma se cultivan en presencia de epitelio y viceversa, tanto en células normales como
cancerosas y las combinaciones de éstas.
41
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10. ANEXO (PUBLICACIÓN)
Los resultados de este trabajo fueron publicados en la revista Cancer Research la cual tiene
un impacto de 7.672 y a la fecha ha sido citado en 4 publicaciones.
Cano P, Godoy A, Escamilla R, Dhir R, Onate SA. Stromal-epithelial cell interactions and
androgen receptor-coregulator recruitment is altered in the tissue microenvironment of
prostate cancer. Cancer Res 2007; 67(2)511-519.
Stromal-Epithelial Cell Interactions and Androgen Receptor-Coregulator Recruitment Is Altered in the TissueMicroenvironment of Prostate Cancer
Patricia Cano,1Alejandro Godoy,
1Rosalba Escamilla,
1Rajiv Dhir,
3and Sergio A. Onate
1,2
Departments of 1Urologic Oncology and 2Pharmacology and Therapeutics, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, New York and3Department of Pathology, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, Pennsylvania
Abstract
Tissue recombination experiments show that prostate mesen-chyma directs prostate epithelial cell growth and developmentin an androgen-dependent manner, and that functionaldifferentiation of prostate epithelium requires androgen-driven processes in both epithelia and stroma. The androgeninduction of target genes in primary cultures of prostatestromal and epithelial cells was determined using an adeno-viral expression system, which employed the MMTV-enhancerdriven luciferase reporter as an androgen receptor (AR)–mediated transcription assay. These studies indicate that bothcell types contain functional AR. Androgen induction ofluciferase reporter activity is 3-fold in stromal cells comparedwith 10-fold in epithelial cells. AR-mediated transcriptionactivity in stroma cells was enhanced by coculture withepithelial cells or epithelial cell–conditioned media. Theelevated AR-mediated transcription activity in stromal cellsthat were exposed to epithelial factors correlated withincreased recruitment of coactivators to the AR transcriptionalcomplex. Epithelial cells facilitated interactions of AR withSRC-1 in an androgen-dependent manner. However, AR-mediated transcriptional activity in stromal cells isolated fromprostate cancer was reduced compared with stromal cellsisolated from benign prostate and continued to be reducedwhen cocultured with tumor-derived prostate epithelial cells.The occupancy of AR and coregulators on target genes showedthat androgen-bound AR in prostate cancer stromal cells wasassociated with the corepressor silencing mediator for retinoidand thyroid hormone receptor. Thus, the ability of epithelialcells to modulate coregulator recruitment to the AR transcrip-tional complex on androgen-responsive genes seems altered inthe stromal microenvironment of prostate cancer. [Cancer Res2007;67(2):511–9]
Introduction
The prostate gland is organized into luminal epithelial andstromal compartments. Androgens and stromal-epithelial cellinteractions are key regulators involved in prostate growth,development, and differentiation (1–9). The effects of androgenson the prostate are mediated by the androgen receptor (AR).Prostate development requires functional AR in stroma, but not
epithelia; therefore, the growth-promoting effects of androgens onthe developing epithelium are mediated through an AR-positivestroma. Full development of differentiated and functional secretoryprostatic epithelia growth requires AR in both cellular compart-ments (10–13). Stromal and epithelial cells synthesize and respondto growth factors in a reciprocal and dynamic manner to developand maintain prostate function, a process that depends onandrogens. Therefore, androgen-driven processes in the stromaland epithelial compartments are important for the normaldevelopment and physiology of glandular epithelia.Disruption of the androgen-regulated pathways in both cellular
compartments may affect the development and progression ofprostate cancer. The development of human prostate cancer occursin the presence of AR-positive stroma (7, 9, 14–17). Transformedepithelial cells actively influence stromal cells, including inflam-matory cells, vascular endothelial cells, and fibroblasts, to generatea microenvironment that fosters carcinogenesis. Myofibroblasts arefound in the stromal microenvironment of most invasive tumorsand are often referred to as ‘‘activated’’ fibroblasts or ‘‘reactivestroma.’’ Studies on the molecular mechanisms by which AR in thestromal and epithelial cells influence AR function in normalprostate tissue are essential to delineate the role of androgens andstromal-epithelial cell interactions in the signaling molecules andpathways that are involved in prostate carcinogenesis (9, 16–18).AR is a ligand-inducible transcription factor that binds specific
DNA sequences and stabilizes the RNA polymerase II (pol II)transcription initiation complex to enhance or diminish theexpression of androgen-regulated genes. Coregulators (coactivatorsand corepressors) are nuclear proteins that modulate AR functionby regulating the interactions between the receptor and the pol IItranscription initiation complex. Coactivators increase androgen-regulated gene expression and corepressors decrease androgen-regulated gene expression. The p160 family of coactivators (SRC-1,GRIP/TIF-2, and AIB1/ACTR/pCIP) recruit histone acetyl-trans-ferases (p300/CBP and pCAF) and methyl-transferases (CARM1and PRMT) to the AR-promoter complex and enhance transcrip-tion by modifying localized chromatin structure on androgen-regulated promoters (19–22). Other coactivators include TRAP220,which is part of the multi-subunit TRAP/DRIP/SMCC mediatorcomplex that contacts the basal transcription machinery toactivate transcription (23). Corepressors include the silencingmediator for retinoid and thyroid hormone receptor (SMRT) andthe nuclear receptor corepressor (NCoR). These corepressorsinteract with histone deacetylases to repress transcription, eitherdirectly or indirectly.This study examines AR-mediated transcriptional activity in
prostatic stromal and epithelial cells that were isolated frombenign and malignant human prostate tissue specimens and showsthat epithelial cells modulate the AR-mediated transcriptional
Note: This work is in partial fulfillment for P. Cano to obtain a doctoral degreeunder the advisors Dr. R. Maldonado and S.A. Onate.
Requests for reprints: Sergio A. Onate, Department of Urologic Oncology, RoswellPark Cancer Institute, Elm and Carlton Streets, Buffalo, NY 14213. Phone: 716-845-1122; Fax: 716-845-8857; E-mail: [email protected].
I2007 American Association for Cancer Research.doi:10.1158/0008-5472.CAN-06-1478
www.aacrjournals.org 511 Cancer Res 2007; 67: (2). January 15, 2007
Research Article
activity in stromal cells in a coculture system. As assessed by thechromatin immunoprecipitation assay, epithelial cells were foundto enhance AR-mediated recruitment of the SRC-1 coregulatorto the AR transcriptional complex in an androgen-dependentmanner. When compared with stromal cells isolated from benignprostate, AR-mediated transcriptional activity in stromal cellsisolated from prostate cancer was reduced because of an alteredinteraction with coregulators. Specifically, occupancy of AR andcoregulators on target genes in prostate cancer stromal showedthat ligand-bound AR in prostate cancer stromal cells associateswith the corepressors SMRT and NCoR. Thus, stromal-epithelialcell interactions that modulate AR-coregulator recruitment and ARfunction seem altered in the stromal cell microenvironment ofprostate cancer.
Materials and Methods
Tissue digestion and prostatic cell isolation. Prostate tissue wasobtained from the Genitourinary Tissue Resource and Morphologic Core atthe University of Pittsburgh and from the Tissue Procurement Resource atthe Roswell Park Cancer Institute. All tissue procurement was conductedfollowing standards and procedures approved by the internal review board,which are consistent with the guidelines established by the NIH. Allprostate tissue samples are routinely analyzed by the histology/pathologycore laboratory and classified as normal, hyperplastic, preneoplastic, orneoplastic. Tissue was obtained from organ donors free from other medicalcomplications or treatments for prostate cancer. Tissue was also obtainedfrom radical prostatectomy specimens. Prostate tissue was cut into 3-mmpieces under sterile conditions and subjected to collagenase/DNasedigestion at 37jC (24). Stromal and epithelial cells were separated usingPercoll gradient. Cells were plated in chemically defined media (ISOMS)containing 10% bovine serum to promote cell attachment. Cocultures weredone using a Transwell insert of 0.4-Am pore size (Costar, Cambridge, MA).The medium conditioned by epithelial cells was obtained from cells seededin six-well plates and cultured in ISOMS supplemented with insulin-likegrowth factor at 37jC for 48 h. Conditioned medium was collected,centrifuged at 1,500 ! g for 10 min at 4jC, and stored at "20jC.
Immunohistochemistry. Prostate tissue specimens were formalin fixedand paraffin embedded. Cultured cells were fixed in situ with 4% (w/v)paraformaldehyde for 30 min at room temperature. The endogenousperoxidase activity of xylene-deparaffinized and rehydrated sections and of
fixed cells was inhibited with 0.3% (v/v) H2O2 in methanol. Nonspecificbinding was blocked with 3% (w/v) bovine serum albumin for 30 min atroom temperature. Histologic sections and fixed cells were immunostainedusing anti-AR antibody PG21 (1:100; Upstate, Charlottesville, VA), anti-cytokeratin-18 (1:200; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti–prostate-specific antigen (anti-PSA; 1:50; Abcam, Cambridge, MA),anti–smooth muscle actin (1:100; DakoCytomation, Carpinteria, CA), anti-vimentin (1:200; Santa Cruz Biotechnology), or anti-desmin (1:200; SantaCruz Biotechnology). Horseradish peroxidase–conjugated anti-rabbit IgG oranti-mouse IgG (1:100; DakoCytomation) was used as a secondary antibody.Peroxidase activity was developed using 3,3-diaminobenzidine tetrahydro-chloride (1 Ag/mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) and H2O2 (1 AL/mL; VWRInternational, West Chester, PA). Hematoxylin was used for nuclearcounterstaining. For immunofluorescence studies, cells were incubatedwith Cy2-conjugated affinity-purified donkey anti-rabbit IgG (1:200; JacksonImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). 4¶,6-Diamidino-2-phenyl-indole was used to visualize nuclei. Negative controls were provided byusing immunocytochemistry in the absence of primary antibodies, or usingpre-immune serum.
Luciferase assays. Epithelial and stromal cells (200,000 per well in24-well plates) in culture were infected with MMTV-promoter drivenluciferase reporter adenoviral expression vector (5 AL/mL, f10"13
adenoviral particles per mL) for 3 h in an RPMI without serum and thenincubated for 36 h in ISOMS containing 5% (v/v) dextran/charcoal–treatedfetal bovine serum supplemented with androgens, as indicated in figurelegends. Cells lysates (25 AL) were assayed for luciferase enzyme activityusing the Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI) and Lumat LB9501 luminometer or Veritas microplate luminometer (Turner BioSystems,Sunnyvale, CA). Luciferase values were normalized to total proteinmeasured using Bradford assays (Bio-Rad, Hercules, CA).
Chromatin immunoprecipitation assay. Stromal and epithelial cells inculture were infected with Ad-MMTV-luc and Ad-his-AR expression vectorsand incubated at 37jC for 36 h to allow protein expression. Following theaddition of hormone for 1 h at 37jC, cells were cross-linked with 1%formaldehyde for 1 h at room temperature. Cross-linking was stopped withglycine buffer (0.125 mol/L final concentration). Cell pellets weresuspended in a 50 mmol/L HEPES (pH 8) lysis buffer containing1 mmol/L EDTA, 0.5 mmol/L EGTA, 140 mmol/L NaCl, 10% glycerol,0.5% NP40, 0.25% Triton X-100, 1 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF), and 0.7! proteinase inhibitor cocktail (Roche, Indianapolis, IN)and nutated for 10 min at 4jC. The crude nuclei were collected bycentrifugation (600 ! g for 5 min at 4jC) and resuspended in 3 cpv washbuffer (10 mmol/L Tris-HCl at pH 8, 1 mmol/L EDTA, 0.5 mmol/L EGTA,
Figure 1. Immunocytochemical analysisof prostatic epithelial and stromal cellmarkers. Expression of AR and cellularmarkers in prostate stromal and epithelial cells.A, formalin-fixed, paraffin-embedded tissuesections and primary cell cultures. Tissuesections and primary cell cultures of stromaland epithelial cells were stained for AR,vimentin, desmin, smooth muscle actin (SMA ),PSA, and cytokeratin 18 (Ck-18 ). Negativecontrols included immunocytochemical assayswithout primary antibody or with nonspecificIgGs. Stromal cells express markers consistentwith stroma. Epithelial cells express markersconsistent with epithelia. B, gene expression ofAR and cellular markers by PCR total RNAfrom primary cultured stromal and epithelialcells were isolated. The expression of stromaland epithelial cell markers were determinedusing standard reverse transcription-PCR andprimers specific for AR, ps20, KGF, FGF-2,vimentin, cytokeratin-14, and cytokeratin-19.Cells cryopreserved in liquid nitrogen for 1 yrwere recovered with f90% viability.
Cancer Research
Cancer Res 2007; 67: (2). January 15, 2007 512 www.aacrjournals.org
200 mmol/L NaCl, 1 mmol/L PMSF, and 0.7! proteinase inhibitor cocktail)and nutated again. Washed nuclei were centrifuged and suspended in500 AL of 1! radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (10 mmol/LTris-HCl at pH 8, 1 mmol/L EDTA, 0.5 mmol/L EGTA, 140 mmol/L NaCl,1% Triton X-100, 0.1% Na-deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mmol/L PMSF, and0.7! proteinase inhibitor cocktail). Samples were sonicated at powersetting 4 (Fisher Sonicator Dismembrator 100) with a 10-s burst and 1 minof ice cooling for a total sonication time of 1 min per sample. Proteinextracts (10 Ag) were diluted in RIPA buffer for immunoclearing with2 Ag sheared salmon sperm DNA and protein A-Sepharose for 30 min at4jC. Immunoprecipitation of AR transcriptional complexes was doneovernight at 4jC with specific antibodies (as described in the figurelegends). Protein-DNA immunocomplexes were boiled 30 min to reversecross-linking; DNA fragments were purified with a QIAquick Gel Extractionkit (Qiagen, Carlsbad, CA); and PCR was amplified using primers forward(TGGTTACAAACTGTTCTTAAAACAAGG) and reverse (AACACTAA-GAGCTCAGATCAGAACATTT) specific for MMTV-LTR.
Results
Primary cultures of human prostatic epithelial and stromalcells. Primary cell cultures of prostatic cells were characterized forepithelial and stromal cellular markers. Paraffin-embedded andformalin-fixed human prostate tissue sections exhibited ARstaining confined to the nuclei of the secretory epithelia andstroma microenvironment. Epithelial cells that were isolated usingcollagenase enzyme digestion of prostate tissue samples andcultured in chemically defined media were positive for AR, PSA,and cytokeratin-18, indicating the presence of luminal epithelialcells in primary cultures (Fig. 1A). Stromal cells that were isolatedusing Percoll gradient or serum-containing media were positive forvimentin and desmin, indicating the presence of myoblasts in theisolated stroma (Fig. 1A). Other stromal cell markers [keratinocytegrowth factor (KGF), fibroblast growth factor-2 (FGF-2), ps20, andvimentin] and epithelial cell markers (cytokeratin-14 and cytoker-atin-18) were detected in stromal and epithelial cell cultures usingreverse transcription-PCR (Fig. 1B). Thus, epithelial and stromalcells were isolated and cultured successfully from fresh humanprostate tissue specimens.Functional characterization of endogenous AR in the
human prostate. An adenoviral expression vector for theluciferase reporter under the control of the mouse mammarytumor virus (MMTV) hormone-responsive DNA element (hereaftertermed Ad-MMTV-Luc) was used to determine the ability of AR toactivate gene expression in both compartments. Epithelial andstromal cells were infected independently with Ad-MMTV-Luc inthe absence or presence of increasing concentrations of R1881. Ad-MMTV-Luc reporter activity in stromal cells from three indepen-dent experiments was induced 3-fold, compared with the 10-foldinduction observed in epithelial cells (Fig. 2A). Radioligand assaysindicated that AR expression is similar in both cellular compart-ments with specific ligand-binding activity of 17.1 F 4.4 fm/mgprotein in epithelial cells and 16.4 F 1.7 fm/mg protein in stromalcells (Fig. 2B). Thus, AR is expressed in prostatic epithelial andstromal cells at similar levels, but AR differentially regulates targetgene expression in each cellular compartment (Fig. 2). Thetranscriptional activity of various transcription factors wasexamined in stromal and epithelial cells to determine whetherthe general transcriptional machinery required to transactivate theAd-MMTV-Luc reporter was compromised in stromal cells. Bothstromal and epithelial cells contain functional glucocorticoidreceptor (GR). Both cell types are equally capable of initiatingtranscription of the adenoviral-mediated reporter gene (Fig. 2C).
The glucocorticoid dexamethasone elicited comparable levels ofligand-inducible transcriptional activity of the Ad-MMTV-Lucreporter in both epithelial and stromal cells (Fig. 2C). Hormone-binding assays indicate that the specific [3H]dexamethasone-binding activity of GR is similar in stromal cells (33.7 F 8.6 fm/mgprotein) and epithelial cells (31.7 F 1.7 fm/mg protein; Fig. 2D).Thus, the inability of stromal cells to induce transcriptional activityefficiently in the presence of androgens is AR specific andunrelated to general changes in the basic transcription initiationmachinery. An adenovirus h-galactosidase expression vector thatencoded the nuclear-targeted h-galactosidase enzyme activity(Ad-h-gal) was used as a control for the effect of adenovirusinfection on infected cells and to determine the relative infectionefficiencies among experiments. Ad-h-gal activity in primaryprostate cultures is present in at least 98% of both epithelial andstromal cells. h-Galactosidase enzyme activity is qualitativelysimilar in both cell types (data not shown).
Figure 2. A, AR-mediated transcriptional in epithelial and stromal cells. Isolatedepithelial (Epi ) and stromal (Str ) cells were infected with Ad-MMTV-Lucreporter expression vector in the presence of increasing concentrations ofR1881. The relative luciferase activity in the epithelial (.) and stromal (o) cellswas determined. B, levels of androgen-binding activities of AR were determinedusing hormone-binding assays in whole cells. Stromal (white columns ) andepithelial (black columns ) cells were incubated in media containing 1 nmol/L[3H]R1881 (specific activity = 85 Ci/mmol) in the absence and presence of200 nmol/L excess of unlabeled R1881. The specific hormone binding activitywas determined by subtracting the nonspecific (200 nmol/L excess unlabeledR1881) from the total [3H]R1881 binding and the amount of receptors expressedin fmol/mg of protein. C, AR and GR-mediated transcriptional activity. Humanprostate epithelial (black columns ) and stromal (white columns ) cells wereisolated and infected with Ad-MMTV-Luc reporter expression vector in theabsence (none) or presence of 10 nmol/L R1881 or dexamethasone (Dex ) andrelative luciferase activity determined. D, levels of glucocorticoid-bindingactivities of GR were determined using hormone-binding assays in whole cells.Stromal (white columns ) and epithelial (black columns ) cells were incubatedin media containing 1 nmol/L [3H]dexamethasone (specific activity = 85 Ci/mmol)in the absence and presence of 200 nmol/L excess of unlabeleddexamethasone, and the specific hormone binding activity was determined asabove.
SMRT/NcoR Recruitment and Prostate Cancer
www.aacrjournals.org 513 Cancer Res 2007; 67: (2). January 15, 2007
Vector encoding human AR (Ad-his-AR) was used as a control todetermine the relative efficiency of exogenous AR-mediated trans-activation in stromal and epithelial cells. Ad-his-AR was coinfectedwith the Ad-MMTV-Luc reporter. AR-mediated transactivation wasdetermined in the absence and presence of increasing concen-trations of androgens. Differences in the ability of Ad-his-AR toactivate the luciferase reporter in these two cellular compartmentswas observed under increasing concentrations of exogenous AR instromal and epithelial cells (Fig. 3A) despite similar expression ofthe receptor (Fig. 3B). His-tagged AR was found to be functionalbecause it bound its cognate ligands, translocated to the nucleus,and activated target gene expression in a ligand-dependent manner(data not shown). A radioligand-binding assay indicated that ARwas expressed in both cell types at similar levels. Specific AR ligand-binding activity was 2,036F 417 fm/mg of protein in epithelial cellsand 1,531 F 267 fm/mg of protein in stromal cells (Fig. 3B). Thedifference in the AR-mediated transcriptional activity of theluciferase reporter by exogenous AR was also observed at differentconcentrations of androgens (Fig. 3C). Therefore, differences in theexpression or recruitment of coregulators may contribute, at leastin part, to the mechanism by which AR differentially regulatesandrogen target gene expression in stromal and epithelial cells ofthe human prostate.Stromal cells modulate AR activity in prostate epithelia.
Because stromal-epithelial interactions in the prostate are wellcharacterized, a trans-well coculture system that allows thecontinuous exchange of factors in the media without direct cellularcontact was used to measure ligand-inducible transcriptionalactivity of AR in epithelial cells in the absence and presence ofstromal cells. AR-mediated transcriptional activity in epithelial cellsisolated from benign prostate increased when cocultured withstromal cells isolated from either benign (BAS) or prostate cancer–
associated (CAS) stromal cells (Fig. 4A). In epithelial cells isolatedfrom the primary tumor, AR-mediated transcriptional activity wasnot increased when cocultured with either BAS or CAS (Fig. 4A).However, in cell lines isolated from metastatic prostate cancer, suchas LAPC-4 (Fig. 4B) and LNCaP (Fig. 4C), ligand-inducibletranscriptional activity of AR increased significantly in the presenceof either CAS or BAS (Fig. 4). These findings provide evidence thatepithelial cells in prostate cancer exhibit altered AR-mediatedtransactivation function, and that stromal-epithelial interactionsalter androgen signaling in both cellular compartments.Epithelial cells modulate AR activity in the stroma. AR-
mediated transcriptional activity in BAS increased 10-fold in thepresence of epithelial cells (Fig. 5A). Basal transcriptional activityof the TATA-luc reporter that lacked the hormone-responsive DNAelement was affected minimally in BAS cocultured with epithelialcells (2-fold induction; Fig. 5A). Conditioned media from epithelialprostatic cells was found to increase AR transcriptional activity instromal cells (data not shown). However, AR-mediated transcrip-tional activity in CAS was affected minimally when cocultured withepithelial cells from either benign or malignant prostate tissue(data not shown). A variety of other prostatic cells, includingLNCaP, LAPC4, PC3, and DU145, failed to modulate AR trans-activation in stromal cells (data not shown). Protein factor(s)produced by epithelial cells in coculture are presumably respon-sible, at least in part, for increased AR-mediated gene transcriptionin stromal cells. The signal(s) involved in stromal-epithelial cellinteractions and AR and coregulator function of the prostate thatare missing in prostate cancer remain to be identified. In addition,the ability of prostatic epithelial cells to modulate AR transcrip-tional activity in prostate stroma is cell type specific.The molecular mechanisms by which epithelial cells modulate AR
transcriptional activity in the stroma was investigated using a
Figure 3. Functional characterizationof Ad-his-AR in prostatic cells.A, transcription activity mediated byAd-his-AR stromal (white columns )and epithelial (black columns ) cellsmaintained in dextran/charcoal–treatedserum-containing media for 36 h wereinfected with Ad-MMTV-Luc reporter andincreasing concentrations of Ad-his-ARvirus (stock: 1 ! 1012 particles per mL).Relative luciferase activity was determinedin the absence (none) or presence of5 nmol/L R1881 (R1881). B, ligandbinding of Ad-his-AR. The relative[3H]R1881-binding activity of AR inepithelial (white columns ) and stromal(black columns ) cells infected withAd-his-AR was determined usinghormone-binding assay. The specifichormone binding activity was determinedby subtracting the nonspecific (200 nmol/Lexcess unlabeled R1881) from the total[3H]R1881 binding and the amount ofreceptors expressed in fmol/mg of protein.C, ligand-dependent transcription activitymediated by Ad-his-AR relative luciferaseactivity in the epithelial (.) and stromal(o) cells was determined in increasingconcentrations of R1881. Points, averageof three independent experiments;bars, SE.
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chromatin immunoprecipitation assay to analyze for the occupancyof AR and coactivators on target genes in stromal cells in vivo .Chromatin immunoprecipitation assay immunoprecipitates cross-linked protein-DNA complexes bound to a specific gene promoterwith antibodies specific for a known DNA-interacting protein. Thegene is detected using PCR and primers specific for the MMTV-LTRregion. In stromal cells, un-liganded AR had limited occupancy onthe MMTV-luciferase reporter and was associated with thecorepressor SMRT (Fig. 5B). Although the corepressor SMRT isassociated with un-liganded AR, NCoR was not part of the complexin the absence of androgens in stromal cells that were isolated frombenign prostate tissue (Fig. 5B). The addition of R1881 released thecorepressor SMRT from the AR-DNA complex and allowedrecruitment of the coactivator SRC-1 (Fig. 5B). Ligand-inducedassociation of AR with SRC-1 on the DNA element in stromal cellsincreased further when the assay was done in the presence ofepithelial cells (Fig. 5B). Consistent with increased recruitment ofSRC-1, overexpression of SRC-1 (Ad-his-SRC-1) in stromal cellsincreased transcriptional activity mediated by AR (Fig. 5C). Thus,
when SRC-1 was transfected into stromal cells using an adenoviralexpression system, it mimicked the effect of epithelial cells in co-culture. These data support the concept that AR-mediated trans-criptional activity in prostatic stromal cells is influenced by theassociated epithelium through recruitment of coregulators for AR.AR-mediated transcriptional activity and coregulator re-
cruitment is altered in the prostate cancer microenvironment.Prostatic stromal cells isolated from BAS or from CAS were used todetermine the effect of androgens on AR-mediated transcriptionalactivity. Endogenous and exogenous AR-mediated transcriptionalactivity was reduced in cultured CAS (Gleason score 6-7) comparedwith cultured BAS from the same human prostatectomy specimen(Fig. 6A and B , respectively). AR-mediated transcriptional activityfrom 14 clinical samples was analyzed. In seven samples, ARactivity in CAS was decreased 67.4 F 16.4%. In six samples,AR activity in CAS was increased 1.87 F 0.54-fold. In one sample,AR activity in CAS was similar to BAS. Therefore, AR expressionand function in primary cell cultures from human clinical samplesis heterogeneous. To standardize the variation, a cohort of a mix ofat least 10 clinical specimens should be used to maintain theheterogeneity observed in vitro and in vivo between individualsamples. In addition, AR-mediated transcriptional activity in CASwas affected minimally when cocultured with epithelial cells fromeither benign (BP-Epi) or malignant (CaP-Epi) prostate samples.The occupancy of AR and AR coregulators on target genes wasdetermined using a chromatin immunoprecipitation assay for ARand coregulator complexes (Fig. 6C). When un-liganded AR in BASwas complexed with the corepressor SMRT, addition of R1881decreased SMRT association (Fig. 6C). Androgens increased ARDNA-binding activity and recruitment of SRC-1 to the promoter(Fig. 6C). Unexpectedly, NCoR, SMRT, and SRC-1 were recruited byandrogens to the AR transcriptional complex in CAS cells (Fig. 6C).The overexpression of SRC-1 increased AR-mediated reporteractivity in BAS cells. However, overexpression of SRC-1 failed toincrease AR activity in CAS cells (Fig. 6D). The low efficiency ofSRC-1 to increase AR-mediated transcriptional activity in CAS cellsmay be due, at least in part, to the continuous association of ARwith the corepressors NCoR and SMRT in the presence ofandrogens. These findings provide evidence that altered ARcoregulator function and altered stromal-epithelial interactionsin the cellular microenvironment of the prostate change theandrogen-signaling axis in prostate cancer.
Discussion
Paracrine factors, including growth factors produced by thestroma, regulate proliferation of the developing epithelia, andinfluence epithelia differentiation. Reciprocal interactions areequally relevant in the development and function of prostatestroma. Fully differentiated secretory prostatic epithelial cellsrequire the expression of functional AR in both stroma andepithelial compartments of the adult prostate (13, 24–28). However,the biological consequences of AR activity differ in each cellularcompartment. It is difficult to elucidate the molecular mechanismsof androgen action that underlie the biology and pathology of theprostate because several hormonally regulated factors interact incomplex ways at various times during prostate development.Studies of the mechanism of androgen action in the prostate havebeen conducted primarily in vitro , which ignores the tissuemicroenvironment. Primary cultures of epithelial and stromal cellsprovide with the opportunity to explore how AR and coregulators
Figure 4. Altered AR and coregulator function in prostate cancer epithelia.A, altered stromal-epithelial interactions in prostate cancer primary cultures ofprostate epithelial cells isolated from benign (BP ) and malignant (CaP ) prostatetissue were infected with 10"10 adenoviral particles/mL of Ad-MMTV-Lucreporter expression and incubated alone or in coculture with stromal cellsisolated from benign or prostate cancer tissue, as indicated. Relative luciferaseactivity (RLU ) was determined in the absence (white columns ) or presence(black columns ) of 5 nmol/L R1881. Columns, average of three independentexperiments; bars, SE. B and C, stromal-epithelial interactions in prostatecancer cell lines metastatic prostate epithelial cells, including LAPC-4 andLNCaP cells, were infected with 10"10 adenoviral particles per mL ofAd-MMTV-Luc reporter expression and incubated alone or in coculture withstromal cells from benign (BAS) or prostate cancer (CAS). Relative luciferaseactivity was determined in the absence (white columns ) or presence(black columns ) of 5 nmol/L R1881.
SMRT/NcoR Recruitment and Prostate Cancer
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function in an in vitro system that models prostate tissuemicroenvironment. To study stromal-epithelial interactions, theAR-coregulator complex was analyzed in both cellular compart-ments using a coculture approach. Both cell types express mRNAencoding AR and AR protein at comparable levels. AR-mediatedtranscriptional activity differs markedly in epithelial cells comparedwith stromal cells. Differences in AR-mediated transactivationbetween the two cellular compartments are specific for AR becausedifferences in androgen-induced reporter activity are observed atincreasing concentrations of exogenous AR. Moreover, dexameth-asone efficiently induces GR-mediated transcriptional activity inboth compartments. Therefore, differences in AR-mediated trans-activation are receptor and cell type specific.Differences in AR-mediated transactivation were observed in
stromal cells isolated from BAS and CAS cells. Expression of AR inhuman prostate clinical samples is heterogenous and varies duringprostate cancer progression (29). Olapade-Olaopa et al. reportedsubstantial decreased in AR expression during tumor progressionto androgen independence (30). However, other laboratoriesobserved slight changes in AR expression during prostate cancerprogression (29). Moderate changes in AR expression occurredin both epithelia and stroma (31). In our studies, AR expressionin benign and malignant clinical samples was heterogeneous.However, hormone binding indicates that AR expression inBAS and CAS was similar. Therefore, primary cell culturesfrom BAS and CAS may represent a subfraction of AR-positivestromal cells.Differential expression or activity of coregulators may allow
steroid receptors to achieve specificity when expressing hormonallyregulated genes in a particular endocrine target tissue. Severalcoactivators, including SRC-1 (32, 33), the AR-specific coactivatorFHL2 (34), AR-interacting protein-three (35), RAP250 coactivator (36),and peroxisome proliferator-activated receptor-g coactivator-one(37), are differentially expressed in endocrine target tissues. Thedifferential expression of AR-regulated genes in epithelial andstromal compartments may result when AR forms activetranscriptional complexes with coregulators that differ betweenthe two compartments. Epithelial cells have consistently higherrelative gene expression of SRC-1, RAC-3, TIF2, and p300/CBPcoactivators. For example, experiments conducted to determinethe precise expression pattern of coactivators revealed that SRC-1is expressed prominently in the stromal compartment of themouse mammary gland, and that the AR coactivator FHL2 isprimarily expressed in the epithelial compartment of the prostate.Therefore, differential expression of coregulators that are relevantfor androgen action is an important mechanism for AR to regulatetarget gene expression in a cell-specific manner in prostate tissueand between different endocrine target tissues.Tissue recombination studies using testicular feminized (Tfm)
urogenital tissue that lacks functional AR shows that AR isrequired in the stroma but not in the epithelia for earlydevelopment and prostatic growth (13, 38, 39). When Tfm(mutated AR) urogenital sinus mesenchyme (UGM) was recom-bined with wild-type urogenital sinus epithelia (UGE) and grownunder the kidney capsule, the resulting recombinant tissue formedstratified epithelia similar to that found in the vagina. When wild-type UGM was recombined with Tfm UGE, the recombinant tissueexhibited ductal morphology similar to immature prostate tissue(13, 38, 39). Thus, the growth-promoting effect of androgens on theepithelium during development is mediated through an AR-positive stroma. Fully differentiated secretory prostatic epithelial
Figure 5. Stromal-epithelial cell interactions modulate coregulator recruitment.A, AR-mediated transcription activity in stromal cells in coculture primarycultures of stromal cells were coinfected with adenovirus expression vectors forAR (Ad-his-AR) at 1 ! 109 particles per mL and Ad-ARE-luc (HRE-Luc) orTATA-Luc (TATA-luc) adenoviral vectors and grown alone or in coculture withepithelial cells, as indicated. Luciferase activity was determined in the absence(white columns ) or presence (black columns ) of 5 nmol/L R1881. Epithelialcells increased AR-mediated transcriptional activity of the luciferase reporter instromal cells. B, recruitment of SRC-1 to the MMTV hormone response DNAelement in vivo . The effect of prostate epithelial cells on the occupancy of ARand coregulators in the MMTV promoter in stromal cells in the absence orpresence of R1881 and epithelial cells was analyzed using chromatinimmunoprecipitation assay. Primary cultures of stromal cells were coinfectedwith Ad-his-AR, Ad-his-SRC-1, and Ad-MMTV-Luciferase reporter andcross-linked with 1% formaldehyde. Cross-linked chromatin complexes wereprepared using sonication and immunoisolated with antibodies against AR,SRC-1, NcoR, and SMRT. Immunoisolated protein-DNA complexes wereanalyzed using PCR and MMTV primers (forward, TGGTTACAAACTGTTCT-TAAAACAAGG; reverse, AACACTAAGAGCTCAGATCAGAACATTT). Analiquot of chromatin complexed before immune isolation was used as Input(lane 1). Nonspecific binding was assessed using rabbit anti-mouse IgG(RAM, lane 2). AR (lane 3 ) interacted with SMRT corepressor (lane 6) in theabsence of ligand. Addition of R1881 decreased SMRT signaling. Addition ofR1881 increased recruitment of AR (lane 3) and SRC-1 (lane 4 ) toMMTV-promoter in stromal cells. AR and SRC-1 occupancy increased inpresence of R1881 in stromal cells cocultured with epithelial cells. C, SRC-1enhances AR-mediated transcriptional activity in stromal cells primary cultures ofstromal cells isolated from benign tissue (BAS) and epithelial (Epi) cells weregrown and infected with Ad-his-AR and Ad-MMTV-luc reporter in the absence(") and presence (+) of Ad-his-SRC-1 expression vector. Ligand-inducedluciferase activity was compared in stromal (white columns ) and epithelial cells(black columns ).
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cells require the expression of functional AR in both the stromaland epithelial compartments of the adult prostate (13, 25, 26,39–42). Therefore, stromal cells are required to maintain epithelialcell differentiation and to repress proliferation in an androgen-dependent manner. Conversely, prostatic epithelia maintainstromal cells in a differentiated state. However, the molecularmechanisms of androgen-driven processes in stromal andepithelial cells are poorly understood in the context of stromal-epithelial cell interactions. The coculture system, which allows forinteraction between these two cell types, shows that epithelial cellsisolated from benign prostate tissue modulate AR function instromal cells by promoting the recruitment of AR coactivators toandrogen-responsive gene promoters that harbor a simpleandrogen-responsive DNA element in a ligand-dependent manner,minimally affecting the basal activity of the promoter under thecontrol of the TATA box DNA element. The combination ofadenoviral expression vectors and luciferase reporter activitypermits numerous gene expression studies with relatively fewcultured prostate cells. MMTV is a classic and well-characterizedhormone-responsive DNA element model system used to studysteroid hormone-mediated gene transcription. It allows study ofthe basic molecular mechanisms of AR and coregulator function
and specificity in the different compartments of the prostateduring tumor progression from androgen-sensitive to castration-resistant prostate cancer. However, the MMTV reporter may notreflect the activity of AR on endogenous androgen response DNAelements in the stromal and epithelial compartments of theprostate. A classic example of differential regulation of androgen-mediated genes is PSA and KGF/FGF7 . These two genes arepresent in the genome of every cell of the prostate; yet, matureepithelia express PSA and not KGF/FGF7, and mature stromaproduce KGF and not PSA. Therefore, an extension of these studieswill be to determine changes in the AR transcriptional complex inthe PSA and KGF/FGF7 cell type–specific gene promoters in thecontext of stromal-epithelial cell interactions.Tissue recombination experiments using stroma isolated from
Tfm mice showed that AR in stroma is a key player in thegrowth and function of the epithelium in both normal anddiseased states (13–17, 38, 39, 43). However, Gao et al. (44)showed that human tumor cell lines isolated from prostatecancer metastases, including LNCaP and LAPC4, are able toform tumors in the presence of stroma isolated from Tfm mice(44). This result indicate that tumor cell lines isolated fromprostate cancer metastasis already acquired a ‘‘stromal cell–like’’
Figure 6. Altered AR and coregulator function in prostate cancer stroma. A, reduced AR-mediated transactivation in stromal prostate cancer cells prostate stromalcells isolated from benign (BAS) and malignant (CAS) prostate tissue were grown and infected with 10"10 adenoviral particles per mL of Ad-MMTV-Luc reporterexpression vector in the absence (white columns ) or presence (black columns ) of 5 nmol/L R1881. The relative luciferase activity was determined. Columns, averageof three independent experiments; bars, F SE. B, altered exogenous AR-mediated transcriptional activity in stromal prostate cancer. Prostate stromal cells isolatedfrom benign (BAS) and malignant (CAS) prostate tissue were coinfected with 10"10 adenoviral particles per mL of AD-his-AR and Ad-MMTV-Luc reporter expressionvector in the absence (white columns ) or presence (black columns ) of 5 nmol/L R1881, and the relative luciferase activity determined as in (A). C, recruitment ofcoregulators to target genes prostate stromal cells isolated from benign (BAS) and malignant (CAS) prostate tissue, either alone or in the presence of epithelial cells(CAS/Epi ), were coinfected with Ad-his-AR, Ad-his-SRC-1, and Ad-MTV-Luciferase reporter and a chromatin immunoprecipitation assay done in the absence (") andpresence (+) of 5 nmol/L R1881. The protein-DNA complexes were immune isolated antibodies against AR, SCR-1, NcoR, and SMRT. An aliquot of the chromatincomplexes before immune isolation was used as input (Input ). Nonspecific binding was assessed using rabbit anti-mouse IgG as a control (Control ). D, reducedSRC-1 coactivation function in malignant prostatic cells. Stromal cells from either benign (BAS) or malignant (CAS) prostate tissue were grown and coinfected withAd-his-AR and Ad-MMTV-Luc reporter. The AR-mediated reporter activity in the absence (") or presence (+) of Ad-SRC-1 was determined in androgen presence(black columns ) and absence (white columns ) of 5 nmol/L R1881.
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phenotype that allow tumor growth as xenografts independent ofan AR-positive stroma. The finding that primary cultures ofprostate cancer epithelial cells and transformed tumor cell linesfailed to modulate AR activity and coregulator recruitment inBAS and CAS cells further highlights the role of stromal-epithelialcell interactions in the in vitro coculture system used in thesestudies.The deregulation of coregulators has been associated with
cancer. AIB1 coactivator is overexpressed or amplified in severalpancreatic, ovarian, and mammary cancer cell lines (45). Themonoallelic inactivation of the CBP gene in CBP null-heterozygous(CBP+/") mice having a gene dose-dependent decrease of CBPexpression resulted in hematologic neoplasia (46). Spleen and bonemarrow cells transplanted from CBP+/" mice into sublethallyirradiated mice results in tumor formation of hematologic origin(46). The altered expression of AIB1 and CBP coactivators has beenimplicated in the development and progression of cancer (45). TheAR coactivator ARA55 is consistently overexpressed in someprostate cancer cells (47). In addition, expression levels of SRC-1increase in more poorly differentiated prostate cancer and incastration-resistant prostate cancer (48, 49). Thus, several reportssupport the concept that alteration in coregulator expression playsa key role in carcinogenesis. This report indicates that ARtranscriptional activity is reduced in stromal cells isolated fromprostate cancer tissue compared with stromal cells isolated frombenign prostate. Because AR mutations are found in prostatecancer, the transcriptional activity of wild-type human AR wasevaluated in prostate cancer–associated stromal cells. The resultsshowed that the reduced AR activity in these cells was not due to ARitself; other factors were involved in the down regulation of AR-mediated transactivation. NCoR in combination with ARwas boundto DNA in the presence of ligands in prostate cancer–associatedstromal cells. These data support the concept that growth factorsproduced by stromal cells under androgen regulation act on
epithelial cells, causing abnormal growth of epithelial cells. Thefinding that AR interacts with corepressors (SMRT and NCoR) in aligand-dependent manner in prostate cancer–associated stromalcells raises the possibility that AR may recruit NCoR and SMRT toandrogen-regulated promoters in response to androgens. Thus, thebalance of overall AR activity in the presence of androgens may beregulated by competition between p160s and corepressors for thesame AR AF-2 surface. Thus, SMRT/NCoR corepressors could play arole in prostate microenvironment during the development ofprostate cancer. The factor(s) secreted by epithelial cells that havesuch effect on stromal cells should be identified because they mayregulate androgen action and modulate the development andmaintenance of prostate homeostasis. Taken together, the alteredexpression or activity of coregulators in the prostate stromamicroenvironment may be important for the development andprogression of prostate cancer. Isolated primary prostate cellcocultures may provide an innovative alternative and physiologi-cally relevant in vitro model for studying the molecular mechanismsby which AR in the stroma influences AR function in the secretoryepithelia during prostate cancer progression from androgen-dependent to castration-resistant prostate cancer. If the mechanismof differential AR trans-activation in the stromal and epithelialcompartments of prostate cancer can be understood, these findingscan be used to develop new therapies for prostate cancer.
Acknowledgments
Received 4/25/2006; revised 9/29/2006; accepted 10/23/2006.Grant support: American Cancer Society grant RSG-01-243-01 *(S.A. Onate).The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page
charges. This article must therefore be hereby marked advertisement in accordancewith 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.
We thank Dr. M. McPhaul (University of Texas Southwestern Medical Center) forproviding the MMTV-Luciferase reporter, Dr. A. Zeleznik (University of Pittsburgh)and Dr. B. Foster (Roswell Park Cancer Institute) for help and discussions, Drs. J.Mohler and C. Johnson for critical reading of the article, and H. Houston for help inpreparation of the article.
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