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Western BlotIntroduccin y Optimizacin 10 Abril 201310 Abril 2013Ariana Veiga
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Western Blot
En qu consiste el
Western Blot?
Tambin llamado Inmunoblot Tcnica utilizada para identificar una protena en una muestra que contiene
varias protenas
Cmo funciona?
Las protenas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel en funcin de su peso molecular
A continuacin se utiliza un anticuerpo especfico para detectar la protena de inters El resultado aporta informacin sobre el peso molecular de la protena y su cantidad
relativa en la muestra
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relativa en la muestra
Calle 1: Anticuerpo anti- Actina (ab8226) diluido 1/1000Calle 2: ab8226 diluido 1/10000
Calles 3-4: ab8226 diluido 1/500
Calle 1: Lisado celular HeLa (humano)Calle 2: Lisado celular HeLa (humano)Calle 3: Lisado celular HEK293 (humano)Calle 4: Lisado celular 3T3 (ratn)
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En qu casos es til utilizar Western Blot?
Est la protena de inters presente en mi muestra?
El tratamiento con un determinado agente X, aumenta o reduce el nivel de expresin de mi protena?
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protena?
Cmo vara el nivel de expresin de la protena en distintos tejidos o lneas celulares?
Mi muestra es sana o patolgica? El WB permite detectar enfermedades tales como la enfermedad de Lyme, la de las vacas locas, el VIH, etc.
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Organizacin del Webinar
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparacin de la muestra
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Paso 4: Inmunodeteccin
Controles recomendados en WB
Seleccin de anticuerpos
Problemas tcnicos y optimizacin. Ejemplos.
Enlaces a otros productos de inters
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Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparacin de la muestra
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Paso 4: Inmunodeteccin
Controles recomendados en WB
Seleccin de anticuerpos
Problemas tcnicos y optimizacin. Ejemplos.
Enlaces a otros productos de inters
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Preparacin de las muestras para la electroforesis
Lisis: Las clulas o los tejidos se tratan con un tampn de lisis y seguidamente se degradan mecnicamente para liberar las protenas
Clulas: mantenerlas en hielo, lavar con PBS fro y aadir el tampn de lisis (~1ml por cada milln de clulas). Despus agitar durante 30 minutos a 4 C
Tejido: diseccionar rpidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar inmediatamente
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Tejido: diseccionar rpidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar inmediatamente en nitrgeno lquido y homogeneizar en tampn de lisis (300 l por cada 5 g de tejido). Aclarar las cuchillas del homogeneizador con 2 x 300 l de tampn, y agitar despus durante 2 horas a 4 C
Centrifugar a 4 C durante 20 minutos, aspirar el sobrenadante y mantenerlo en hielo
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Lisis
Mantener las muestras en hielo o a 4C para evitar degradacin de las protenas
Los tampones deben prepararse en el momento y mantenerse en fro. Antes de realizar la lisis, aadir al tampn un cocktail de inhibidores de proteasasSi la protena de inters est fosforilada, es importante asegurarse de incluir inhibidores de fosfatasas al tampn de lisis
Elegir un tampn de lisis adecuado en funcin de la localizacin celular de la protena
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Elegir un tampn de lisis adecuado en funcin de la localizacin celular de la protena de inters
Localizacin de la protena Tampn de lisis recomendadoClula entera NP-40 o RIPACitoplasmtica (soluble) Tris-HClCitoplasmtica (citoesqueleto) Tris-TritonMembranal NP-40 o RIPANuclear RIPAMitocondrial RIPA
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Preparacin de las muestras para la electroforesis
Lisis: Las clulas o los tejidos se tratan con un tampn de lisis y seguidamente se degradan mecnicamente para liberar las protenas Clulas: mantenerlas en hielo, lavar con PBS fro y aadir el tampn de lisis
(~1ml por cada milln de clulas). Despus agitar durante 30 minutos a 4 C Tejido: diseccionar rpidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar
inmediatamente en nitrgeno lquido y homogeneizar en tampn de lisis (300 l por cada 5 g de tejido). Aclarar las cuchillas del homogeneizador con 2 x 300
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Determinar la concentracin de protenas
l de tampn, y agitar despus durante 2 horas a 4 C Centrifugar a 4 C durante 20 minutos, aspirar el sobrenadante y mantenerlo
en hielo
Condiciones reductoras y desnaturalizantes: las muestras son normalmente tratadas con agentes que rompen las estructuras tridimensionales de las protenas (dmeros, estructuras terciarias) Aadir el tampn de carga a la muestra y calentar 5 minutos a 95-100C o
durante 5-10 minutos a 70C
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Condiciones reductoras y desnaturalizantes
Un tampn de carga estndar contiene SDS (dodecilsulfato sdico) y -mercaptoetanol o DTT (ditiotreitol) El SDS desnaturaliza la protena en su estructura primaria y la recubre de
cargas negativas El -mercaptoetanol y el DTT son agentes reductores que rompen los
puentes disulfuro Todo ello permite que las protenas se separen en funcin del peso molecular
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Todo ello permite que las protenas se separen en funcin del peso molecular mediante SDS-PAGE
La reduccin y desnaturalizacin permiten adems la accesibilidad del anticuerpo a su sitio de unin
SDS y DTT/-mercaptoetanol
Nota: Algunos anticuerpos solo reconocen las protenas nativas (no reducidas y/o no desnaturalizadas). En este caso SDS y/o -mercaptoetanol o DTT no deben aadirse a los tampones.
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Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparacin de la muestra
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Paso 4: Inmunodeteccin
Controles recomendados en WB
Seleccin de anticuerpos
Problemas tcnicos y optimizacin. Ejemplos.
Enlaces a otros productos de inters
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SDS-PAGE
Definicin Mtodo que permite separar las protenas bajo un campo elctrico de acuerdo a su movilidad electrofortica
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SDS : Dodecilsulfato Sdico; PAGE : Electroforesis en gel de poliacrilamida
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Cmo funciona?
El gel de poliacrilamida se coloca en un compartimento que contiene el tampn de migracin. Un tampn de migracin suele contener 25mM Tris; 190mM glicina; 0,1% SDS; pH 8,3
Los lisados proteicos se cargan en las calles del gel, normalmente entre 20 y 40 g por calle
Se aplica un campo elctrico que provoca el movimiento de las protenas hacia el polo positivo
Al haberse tratado las protenas con SDS (cargas negativas), las cargas
SDS-PAGE
funciona? Al haberse tratado las protenas con SDS (cargas negativas), las cargas
endgenas de las mismas son despreciables El resultado es que las protenas se separan en funcin de su talla, o
peso molecular Las protenas de menor tamao quedan menos retenidas en la matriz del
gel y por tanto migran mas rpidamente
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+
Corriente elctricaFrente de migracin
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Geles
Constituidos de poliacrilamida, N, N-metilenbisacrilamida (Bis), persulfato de amonio (APS) y TEMEDLa estructura del gel puede modificarse alterando la proporcin de acrilamida
Para protenas pequeas, se usa un gel con un porcentaje elevado de acrilamida, y viceversa para protenas de gran tamao
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Tamao de la protena (kDa) Porcentaje del gel 4-40 20
12-45 1510-70 12,515-100 1025-200 8
Los geles en gradiente se recomiendan en aquellos casos en los que el tamao de la protena es desconocida
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Electroforesis en condiciones no reductoras y/o no desnaturalizantes
Forma requerida de la protena
Condiciones electroforesis Tampn de carga
Tampn de migracin
Reducida-Desnaturalizada
Reductor y desnaturalizante
Con -mercaptoetanol o DTT Con SDS
Con SDS
Reducida - Nativa Reductor no Con -mercaptoetanol o Sin SDS
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Reducida - Nativa Reductor no desnaturalizante
Con -mercaptoetanol o DTTSin SDS
Sin SDS
Oxidada Desnaturalizada
No reductor y desnaturalizante
Sin -mercaptoetanol ni DTTCon SDS
Con SDS
Oxidada - Nativa No reductor y nativo
Sin -mercaptoetanol ni DTTSinSDS
Sin SDS
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Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparacin de la muestra
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Paso 4: Inmunodeteccin
Controles recomendados en WB
Seleccin de anticuerpos
Problemas tcnicos y optimizacin. Ejemplos.
Enlaces a otros productos de inters
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Objetivo de la transferencia
Una vez realizada la electroforesis, es necesario marcar la protena de inters para poder visualizarla
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El gel no es una superficie adecuada para poder marcar las protenas Los anticuerpos no son retenidos en el gel Los geles son frgiles y difciles de manipular
Por tanto, es necesario transferir las protenas a un soporte ms adecuado
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Cmo funciona la transferencia?
El principio es similar al de PAGE, es decir, las protenas cargadas negativamente migran hacia el polo positivo bajo el efecto de un campo elctricoSe intercala una membrana entre el gel y el electrodo positivo
Las protenas se adhieren a la membrana siguiendo la misma disposicin que en el gel
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Las membranas pueden ser de nitrocelulosa o polifluoruro de vinilideno (PVDF). Estas ltimas requieren un pretratamiento con metanol
Montaje de la transferencia
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Transferencia en medio hmedo o semi seco?
InconvenientesVentajas
Medio Hmedo
El gel y la membrana se intercalan y fijan firmemente entre finas esponjas y papel absorbente
Este montaje sndwich se sumerge en un compartimento que contiene el tampn de transferencia donde se aplica a continuacin la corriente elctrica
El proceso de transferencia es ms largo
Adecuado para protenas grandes o difciles de transferir
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la corriente elctrica Un tampn de transferencia se compone
normalmente de 25mM Tris, 190mM Glicina y 20% de Metanol
Semi Seca
El montaje papel-gel-membrana-papel se humedece con tampn de transferencia
El montaje se coloca directamente entre el ctodo y el nodo donde se aplica la corriente
El tampn de transferencia estndar suele contener 48mM Tris, 39mM Glicina, 0,04% SDS, y 20% Metanol
Ms rpido La membrana puede secarse afectando a la transferencia de las protenas
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Transferencia de protenas >100 kDa
Transferencia en medio hmedo durante la noche a 4 C y bajo voltaje
Aadir 0.1% SDS al tampn de transferencia para reducir la formacin de
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Aadir 0.1% SDS al tampn de transferencia para reducir la formacin de aglomerados en el gel
Reducir la cantidad de metanol en el tampn de transferencia a 10% o incluso menos para evitar la dispersin de protenas en el gel
Si la membrana es de PVDF, el metanol puede retirarse completamente del tampn (sigue siendo necesario sin embargo su pre-tratamiento con metanol)
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Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparacin de la muestra
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Paso 4: Inmunodeteccin
Controles recomendados en WB
Seleccin de anticuerpos
Problemas tcnicos y optimizacin. Ejemplos.
Enlaces a otros productos de inters
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Por qu se utilizan anticuerpos?
Colorantes como Coomassie pueden usarse para teir las protenas despus de realizar el SDS-PAGE SDS3
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Pero, cul de las bandas corresponde a la protena de inters?
El uso de anticuerpos especficos soluciona el problema detectando nicamente la protena de inters
Lisado celular de SDS3 transfectado (ab94303) en SDS-PAGE (izquierda) y en Western Blot con el anticuerpo ab89345 anti-SDS3 (derecha).
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Inmunodeteccin
Bloqueo de la membrana Leche, BSA, etc
Incubacin con el anticuerpo primario Anticuerpo
Eptopo
Protena Protena
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Lavado (TBST)
Lavado (TBST)
Incubacin con anticuerpo secundario
conjugado AnticuerpoProtenaProtena
DeteccinProtena
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Deteccin
Un sustrato quimioluminiscente, como el ECL, reacciona con un anticuerpo
Sustrato (perxido de hidrgeno + luminol)
Producto (sensible a la luz)
Los sustratos cromognicos (4-cloronaftol o DAB) tambin pueden utilizarse con las enzimas HRP o AP, dando lugar a un producto coloreado que se deposita en la membrana prximo a la zona del anticuerpo
Un sustrato quimioluminiscente, como el ECL, reacciona con un anticuerpo secundario conjugado a la enzima HRP, produciendo una seal que se captura en una pelcula fotogrfica
Los anticuerpos secundarios conjugados a fluorforos tambin pueden usarse siempre y cuando se disponga de un equipo de deteccin especial
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ECL : Enhanced chemiluminescenceHRP : HorseRadish Peroxidase
DAB : 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochlorideAP : Alkaline Phosphatase
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Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparacin de la muestra
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Paso 4: Inmunodeteccin
Controles recomendados en WB
Seleccin de anticuerpos
Problemas tcnicos y optimizacin. Ejemplos.
Enlaces a otros productos de inters
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Controles de carga
Los controles de carga son anticuerpos usados para asegurar que la carga de protenas en cada calle del gel de SDS PAGE es constante
Un anticuerpo control de carga detecta una protena altamente conservada y presente en cantidades similares independientemente del tipo de muestra
Control de carga Tipo de muestra
Peso molecular (KDa) Precauciones
Actina Clula entera / Citoplasma
42 No es vlido para muestras del musculo esqueltico. Cambios en las condiciones de crecimiento celular e interacciones con los componentes de la matriz extracelular pueden alterar la sntesis de
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componentes de la matriz extracelular pueden alterar la sntesis de la protena actina (Farmer et al, 1983)
GAPDH Clula entera / Citoplasma
30-40 Algunos factores fisiolgicos, como hipoxia o diabetes, aumentan el nivel de expresin de GAPDH en determinados tipos celulares
Tubulina Clula entera / Citoplasma
55 La expresin de tubulina puede variar con la resistencia a sustancias antimicrobianas y antimitticas (Sangrajrang S. et al, 1998, Prasad V et al, 2000)
VDCA1/Porinas Mitocondria 31COXIV Mitocondria 16 Muchas protenas migran al mismo peso molecular (16KDa) que
COXIV Lamin B1 Ncleo 66 No es vlido para muestras en las que se ha eliminado la
membrana nuclear Protena de unin a TATA (TBP)
Ncleo 38 No es vlido para muestras sin ADN
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Controles de carga
Calle 1: Clulas HeLa (humano) a 20 gCalle 2: Clulas 3T3 (ratn) a 20 g
Todas las calles - anticuerpo anti - Actina control de carga (ab8227) diludo 1/1000
Nota: la afinidad del anticuerpo puede variar segn la especie o naturaleza de la protena (nativa o recombinante), etc
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Calle 2: Clulas 3T3 (ratn) a 20 gCalle 3: Hgado de pescado a 20 gCalle 4: Hgado de conejo a 20 gCalle 5: Clulas MDCK (perro) a 20 gCalle 6: Clulas EBTr (bovino) a 20 gCalle 7: Clulas SL-29 (pollo) a 20 gCalle 8: Clulas CHO (Hamster chino) a 20 gCalle 9: Embrin de Xenopus a 20 g
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Controles positivos y negativos
Realizar en paralelo el ensayo de muestras desconocidas con muestras en las que se ha comprobado el nivel de expresin de la protena de inters Protena recombinante Clulas transfectadas con la protena de inters Tejidos o lneas celulares que expresen la protena Tejidos o lneas celulares que expresen la protena
Incluir tambin una muestra que no exprese la protena a detectar Muestras knockout o siRNA Tejidos o lneas celulares que no expresen la protena
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Pptidos de bloqueo
La pre-incubacin del anticuerpo primario con el pptido inmungeno permite bloquear de manera especfica los sitios de unin del anticuerpo
Las bandas especficas no sern visibles en el blot ya que el anticuerpo pre-incubado no puede unirse a la protena en la membrana
til para determinar si las bandas observadas corresponden a isoformas, fragmentos de la protena o protenas no especficas
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protena o protenas no especficas
Calle 1: Preparado de Histona, clulas HeLa
Calle 2: Preparado de Histona de clulas HeLa tratadas con colcemida
Calle 3: Preparacin de histona de clulas HeLa 0,5g con pptido de bloqueo Histona H3 fosfo S10, trimetil K9 (ab15644) a 1 g/ml
Calle 4: Preparacin de histona de clulas HeLa tratadas con colcemida 0,5g con pptido de bloqueo Histona H3 fosfo S10, tri metil K9 (ab15644) a 1 g/ml
Todas las calles: Anti-Histona H3 (fosfoS10) [mAbcam 14955] - ChIP Grade (ab14955) a 1 g/ml
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Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparacin de la muestra
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Paso 4: Inmunodeteccin
Controles recomendados en WB
Seleccin de anticuerpos
Problemas tcnicos y optimizacin. Ejemplos.
Enlaces a otros productos de inters
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Adecuado para Western Blot
Utilizar anticuerpos que hayan sido previamente testados en Western Blot
Las aplicaciones en las que un anticuerpo ha sido testado se indican en la ficha tcnica del anticuerpo
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Inmungeno y especificidad
Inmungeno: protena especfica o secuencia de amino cidos que se inyecta en un animal para provocarle una respuesta inmunitaria y producir anticuerpos especficos contra ella
La seleccin del inmungeno permite producir un anticuerpo que reconozca y se fije sobre una regin especfica de la protena (eptopo) Asegurarse que la secuencia del inmungeno est presente en la protena de inters cuando se est estudiando una isoforma concreta de la protena, la forma madura o un
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NERTCRCDKP
NERTCRCDKP
cuando se est estudiando una isoforma concreta de la protena, la forma madura o un precursor de la misma si no, el anticuerpo no reconocer la protena
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Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparacin de la muestra
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Paso 4: Inmunodeteccin
Controles recomendados en WB
Seleccin de anticuerpos
Problemas tcnicos y optimizacin. Ejemplos.
Enlaces a otros productos de inters
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Ausencia de bandas, o bandas muy dbiles
Origen del problema SolucinIncompatibilidad con el anticuerpo secundario
Seleccionar un anticuerpo secundario que sea compatible con la especie y el isotipo del anticuerpo primario (ej. Anticuerpo secundario anti-IgM de ratn con anticuerpo primario IgM hecho en ratn)
No hay suficiente protena o anticuerpo para producir una seal
Aumentar la cantidad de lisado, de anticuerpo primario o de anticuerpo secundario (incluso una combinacin de los tres)
Tiempo de incubacin insuficiente para producir una seal
Incubar la membrana con el anticuerpo primario durante la noche a 4C
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para producir una seal durante la noche a 4CLa membrana no se ha bloqueado correctamente
Bloquear durante menos tiempo o usando un agente de bloqueo diferente. La adicin de Tween 20 al tampn de bloqueo reduce la fijacin del anticuerpo al agente de bloqueo
La protena no se ha transferido correctamente del gel a la membrana
Comprobar que se ha producido la transferencia usando un colorante como rojo de Ponceau. Es posible que sea necesario aumentar o disminuir el tiempo de transferencia
Las protenas hidrfobas son ms difciles de transferir
Para este tipo de protenas usar membranas de PVDF
La muestra no expresa la protena de inters
Revisar literatura y bases de datos sobre la protena de inters
El anticuerpo no reconoce la protena de inters
Verificar que la secuencia del inmungeno est presente en la protena a estudiar
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Ruido de fondo
Origen del problema Solucin
Exceso de lisado celular, anticuerpo primario o secundario que provocan uniones no especficas
Reducir la carga de protena en el gel y/o diluir ms los anticuerpos
Temperatura de incubacin del anticuerpo primario muy elevada
Incubar durante la noche a 4C
La membrana no se ha bloqueado correctamente
Aumentar el tiempo de lavado, y aadir un detergente, como Tween 20, al tampn de lavado. Probar otro agente de bloqueo
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Probar otro agente de bloqueo
Uso de una membrana no adecuada
Las membranas de nitrocelulosa suelen dar menos ruido de fondo que las membranas de PVDF
Degradacin de la protena Optimizar la preparacin de la muestra. Mantener las muestras en hielo y aadir una solucin recin preparada de inhibidores de proteasas. Almacenamiento de muestras a largo plazo puede daar las protenas
Presencia de isoformas o fragmentos de la protena de inters
Consultar la literatura y SwissProt
Presencia de polmeros Hervir las muestras durante 10 minutos antes de realizar la electroforesis
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Exceso de protena y/o anticuerpo
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Dilucin de la muestra y anticuerpo primario
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Optimizacin del tampn de bloqueo
5% leche 5% BSA
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A cada anticuerpo le corresponder una solucin de bloqueo ptima
Anti-GAPDH [mAbcam 9484] - Loading Control (ab9484) a una dilucin 1/1000
5% leche5% BSA
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Burbujas de aire, lavados insuficientes, transferencia incompleta
Durante la transferencia, contacto insuficiente entre el gel y la membrana
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Burbujas de aire entre el gel y la membrana durante la transferencia
Lavados insuficientes
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Protenas en estado nativo
Algunos anticuerpos presentan mayor afinidad por las estructuras nativas de las protenas que por las formas desnaturalizadas y/o reducidas
La imagen muestra un Western Blot de colgeno III humano purificado, en la forma reducida y desnaturalizada a la izquierda, y en su forma nativa a la derecha
La estructura tridimensional del sitio de unin del anticuerpo al antgeno se pierde al desnaturalizar y reducir la protena pierde al desnaturalizar y reducir la protena
Forma reducida y desnaturalizada
Forma nativa
Calle 1: Protena en su forma reducida y desnaturalizada
Calle 2: Protena nativa (son reducir ni desnaturalizar)
Colgeno humano purificado (ab7535) a 5 g por calle con el anticuerpo anti-colgeno III(ab6310)
Imagen cortesa de un Abreview enviado por Michaela Leyh
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Conocer la protena de inters
Las protenas no siempre muestran una nica banda al peso molecular esperadoPosibles motivos: fragmentacin de la protena, modificaciones post -traduccionales, expresin de isoformas, propiedades isoelctricas
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Se aconseja consultar siempre SwissProt y la literatura
-traduccionales, expresin de isoformas, propiedades isoelctricas Una diferencia del 10-15% respecto al tamao esperado se considera aceptable y dentro de la normalidad
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Protocolo de Western Blot
Paso 2: Electroforesis en gel
Paso 3: Transferencia gel - membrana
Paso 1: Preparacin de la muestra
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Paso 4: Inmunodeteccin
Controles recomendados en WB
Seleccin de anticuerpos
Problemas tcnicos y optimizacin. Ejemplos.
Enlaces a otros productos de inters
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Protocolos y material de inters
Protocolos detallados de WBwww.abcam.com/protocols
SwissProt www.uniprot.org
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Gua sobre controles de carga:http://www.abcam.com/loadingcontrolguide
Vdeo detallado sobre WB: http://www.abcam.com/westernblotguide
Gua de trucos para WB
Descarga tu gua de trucos para WB en nuestra pgina de protocolosO pide tu copia por e-mail: [email protected]
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Reactivos para Western Blot
Geles prefabricados y soluciones tampn optimizadas para WB Otros reactivos (tincin de gel, Bradford, etc ) www.abcam.com/Optiblot
Optiblot
Marcadores de peso molecular pre coloreados y listos para usarMarcadores de peso
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www.abcam.com/prismproteinladdersde peso molecular Prism
Anticuerpos secondarios AbExcel
Anticuerpos secundarios validados para WB Conjugados a fosfatasa alcalina (AP) o peroxidasa (HRP) www.abcam.com/abexcel
Kits ECL Sustratos ECL de alta sensibilidad para WB www.abcam.com/ecl
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Optiblot reactivos para WB
Fciles de usar pocillos coloreados para facilitar la carga de la muestra
Pocillos de alta capacidad y sin peine que remover
Hasta 10 veces msfuertes que los geles convencionales
Larga duracin 1-2 aos de caducidad
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Todos los reactivos necesarios para tus experimentos: Tampones optimizados Optiblot Blue (ab119211) tincin tipo Coomassie del gel en tan slo 15 minuots Reactivo Bradford y ensayo BCA compatible con detergentes en la muestra Otros productos membranas PVDF de baja fluorescencia, etc
Fciles de abrir, sin esptulas o cuchillos
Geles compatibles con la mayora de tanques
Ms informacin: www.abcam.com/Optiblot
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Histona H3 (fosfoT3) RabMAb
Anticuerpos monoclonales de conejo( ), ptimos para WB
RabMAb: ventajas para WB Alta afinidad mayor factor de dilucin (hasta
1:500.000 en algunos RabMAbs) Alta especificidad seal especfica, sin o
con muy poco ruido de fondo Reconocen eptopos diversos ideal para la
deteccin de modificaciones post-
Anticuerpo histona H3 (fosfoT3) (ab78351), dilucin 1/500,000 en HeLa.
1) Sin tratar, 2) Tratadas con FBS + Caliculina A.
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deteccin de modificaciones post-traduccionales (ej. fosforilacin, metilacin, acetilacin)
Cada RabMAb has sido testado en WB en muestras humanas, de ratn y rata para determinar la reactividad
Ms de 4000 RabMAbs disponibles
Ms informacin: www.abcam.com/rabmabs
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AbExcel anticuerpos secundarios
5 razones para usar secundarios AbExcel Altamente testados AbExcel conjugados a AP se pueden usar en
diluciones de 1/5000 a 1/50000
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Ms informacin:AbExcel: http://www.abcam.com/AbExcel
diluciones de 1/5000 a 1/50000 Con 1 vial de AbExcel conjugado a AP, se
pueden conseguir hasta 1.500 blots (usando dilucin 1/5000 en 3ml leche/BSA)
AbExcel conjugados a HRP se pueden usar en diluciones de 1/2000 a 1/20000
Con 1 vial de AbExcel conjugado a HRP, se pueden conseguir hasta 600 blots (usando dilucin 1/2000 en 3ml leche/BSA)
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Bolgrafo Luminol para membrana (ab166858)La forma ms fcil y segura de calcular el peso molecular de la protena de inters. Una vez las protenas han sido transferidas a la membrana:
Marca los estndares de PM con el boli Lumimol en la membrana
Contina con la hibridacin de la membrana segn tu procedimiento habitual (bloqueo, etc)Revela la membrana por quimioluminiscencia o colorimetra
Visualiza y localiza las bandas del estndar con pelcula o procesador CCD
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Contctanos
Espaa: Telfono: 91 114 65 54, email: [email protected]
Argentina: Tecnolab; Telfono: +54-11-4555-0010, email: [email protected]
Chile: Biosonda; Telfono: +56-2-209-6770, email: [email protected]
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Chile: Biosonda; Telfono: +56-2-209-6770, email: [email protected]
Mjico: CTR Scientific; Telfono: +52-81-8158-0600, email: [email protected]
Otros paises: Abcam; Telfono: +1-617-577-4200, email: [email protected]
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Promocin especial para participantes
20% descuento en los siguientes productos: (hasta el 31 de mayo 2013)
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Gama Optiblot RAbMAbs Gama AbExcel
Cdigo : SPWEB-XBIS1
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Preguntas?
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