UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ.
FACULTAD DE INGENIERÍA.
INGENIERO AGROINDUSTRIAL.
por
Francisco de Jesús Hernández Negrete.
Dr. Luis Manuel Rosales Colunga.
Asesor.
Noviembre del 2016 San Luis Potosí, S.L.P.1
*Introducción.
*Antecedentes.
*Objetivos.
*Justificación.
*Metodología.
*Resultados
*Cronograma de actividades.
*Referencias bibliográficas.
2
Muchos de los procesosindustriales se basan en eluso de combustibles fósilescomo el petróleo, gas, ycarbón.
• Dependencia energética.• No son renovables.• CO2.• Efecto invernadero.• Calentamiento global.
FUENTE: anpier.org/
FUENTE: veoverde.com
Introducción
4
Productos valiosos a partir de biomasa.
Almidón
(componente de la biomasa).
Alternativas.
FUENTE:
curiosidadesdelamicrobiologia.mx
FUENTE: miliarium.com
5
Introducción
Almidón.
• Amilosa (α-glucano
lineal).
• Amilopectina (α-glucano
ramificado).
FUENTE: blogalimentos.com
6
Introducción
Microbios capaces de hidrolizar el
almidón.
FUENTE: wikipedia.org/wiki/Bacillus_megaterium
7
Introducción
Ventajas adaptativas.Métodos de manipulación
sencillos.
Amplio conocimiento acerca de sus sistemas.
Se pueden modificar para generar una gran variedad de productos y
utilizar diversos sustratos.
E. coli
8
Introducción
E. coli.
Microorganismo modelo.
No puede metabolizar
almidón.
FUENTE: samiorza.blogspot.mx/
9
Introducción
No es dependiente de
maltosa.
E. coli. produce
una α amilasa
citosólica (AmyA).
Cepas de E. coli. para utilizar
almidón y otras maltodextrinas
y producir compuestos valiosos.
FUENTE: elgrafico.mx
11
Introducción
Actividad de la amilasa secretada. tinción de M9 con Lugol
más almidón, placas donde WT , Amy0, y Bacillus megaterium
se cultivaron (Rosales-Colunga, 2014).
Ingeniería de Escherichia coli K12 MG1655 para
utilizar almidón.
FUENTE: microbialcellfactories.com/content/13/1/74
Antecedentes.
14
Wt = cepa silvestre
Amy0 = cepa que
secreta AmyA al
medio
B.M = bacillus
megaterium
15
¿Esta cepa desarrollada tiene la capacidad de hidrolizar
y crecer utilizando diferentes tipos de almidón?
Diferentes tipos de almidón (dif. Porcentaje de amilosa y amilopectina)
Introducción
Evaluar la degradación de distintos tipos de almidón y
el crecimiento asociado por distintas cepas de E. coli.
FUENTE: http://www.cdc.gov/ecoli/
16
O. específicos.
*Obtener las cepas MG1655 (silvestre) y las mutantes
*Evaluar el crecimiento de estas cepas utilizando maltosa y
almidón.
*Evaluar la degradación del sustrato por cada una de las cepas.
*Interpretar el crecimiento de las diferentes cepas mutantes de E.
coli.
FUENTE: elproyectomatriz.wordpress.com
17
El aprovechamiento de la biomasa es fundamental para establecer
procesos sustentables dirigidos a la generación de productos valiosos.
Siendo el almidón un componente considerable de la biomasa y un
residuo abundante en la industria alimentaria, se busca entender el
catabolismo de almidón y sus componentes por uno de los
microorganismos más empleados tanto en investigación como en la
industria.
FUENTE: abc.es
Justificación.
19
H(a): El crecimiento de cada cepa utilizada es influenciado por los distintos tipos de almidón, sin afectar el metabolismo
de maltosa.
20
*
Tabla 1.1 muestra Cepas MG1655 (silvestre) y las mutantes amyA , malS y malZ de la colección KEIO.
23
Cepas. Nombre. Descripción.
Silvestre (Wt) E. coli MG1655 Cepa silvestre de E. coli.
Mutante 1 E. coli ΔamyA Cepa que carece del gen amyA.
Mutante 2 E. coli ΔmalS Cepa que carece del gen malS.
Mutante 3 E. coli ΔmalZ Cepa que carece del gen malZ.
Mutante adaptada E. coli Amy6 Mutante adaptativa a crecer en
almidón, que sobreexpresa y secreta
AmyA.
Metodología.
FUENTE: ehowenespanol.com
Las cepas se cultivaran a 37°C en
medio mínimo M9 utilizando
maltosa y almidón como fuente de
carbono.
El crecimiento se determino
midiendo la D.O. a 600 nm
Metodología.
25
27
*
• M9/maltosa y M9/almidón
• Cultivos 37°C, 150 rpm
• Toma de las muestras.
• Mediciones del crecimiento en
un espectrofotómetro a 600nm.
Metodología.
FUENTE: pinterest.com
Metodología.
El contenido de almidón se determinará por su
capacidad de formar un complejo con el yodo.
28
Resultados.
31
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 2 4 6 8 10 12
ABSO
RBA
NC
IA (
D.O
)
TIEMPO (h)
Wt
M1
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 2 4 6 8 10 12
ABSO
RBA
NC
IA (
D.O
)
TIEMPO (h)
Wt
M2
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 2 4 6 8 10 12
ABSO
RBA
NC
IA (
D.O
)
TIEMPO (h)
Wt
M3
Wt = cepa
silvestre
M1 = ∆AmyA
M2 = ∆MalS
M3 = ∆MalZ
32
Crecimiento sobre M9/maltosa de las cepas silvestre y mutante adaptiva.
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Abso
rbancia
(D
.O)
Tiempo (h)
Wt Wt6
Resultados.
33
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0 20 40 60 80 100Abso
rbancia
(D
.O)
Tiempo (h)
Wt Wt6
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0 20 40 60 80 100Abso
rbancia
(D
.O)
Tiempo (h)
Wt ∆AmyA
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0 20 40 60 80 100Abso
rbancia
(D
.O)
Tiempo (h)
Wt ∆MalS
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0 20 40 60 80 100Abso
rbancia
(D
.O)
Tiempo (h)
Wt ∆MalZ
Cinéticas de crecimiento sobre M9/maltosa de las cepas silvestre y mutantes
Resultados.
34
Determinación de la degradación del sustrato y actividad amilolítica
por cada una de las cepas con distinto tipo de almidón.
Almidón 1
Almidón 2
Resultados.
35
MG1655
Wt6
Amy0
Amy6
-0.05
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96
ABSO
RBA
NC
IA (
D.O
)
TIEMPO (H)
CINÉTICA DE CRECIMIENTO EN ALMIDÓN 1
MG1655 Wt6 Amy0 Amy6
Resultados.
36
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.035
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
ABSO
RBAN
CIA
(D
.O)
TIEMPO (H)
ALMIDÓN 2
MG1655 Wt6 Amy0 Amy6
MG1655
Wt6
Amy0
Amy6
Resultados.
38
*Todas las cepas evaluadas presentan una fase lag de 12 horas
para el crecimiento en maltosa
*El tipo de almidón influye sobre el crecimiento y la actividad
amilolítica de las cepas evaluadas.
*La cepa adaptativa para crecer en almidón no presenta una
desregulación del operón de maltosa
Conclusiones
Meses/acciones Feb-Mar
2015
Abr-Mayo
2015
Jun-Jul
2015
Agos-Sept
2015
Oct-Nov
2015
Dic-Ene
2015-2016
Agos-sept
2016
Oct-Nov
2016
Búsqueda de tema y recopilación de
información.
Correcciones, retroalimentación y
presentación del protocolo.
Búsqueda de bibliografía.
Conservación de las cepas obtenidas.
Obtener las cepas MG1655 (silvestre) y las
mutantes e Identificar las condiciones de
cultivo de estas cepas.
Evaluar el crecimiento de las cepas
utilizando maltosa y almidón. Evaluar la
degradación del sustrato por cada una de
las cepas anteriores
Interpretar el crecimiento de las
diferentes cepas mutantes de E. coli.
Captura de resultados y presentación del
proyecto.
39
* Aux, G. W. (2009). U.S. Patent Application 12/395,180.
* Cenci, G., Caldini, G., & Strappini, C. (1998). Effect of different starches on
Escherichia coli (S1) β‐glucuronidase expression. Journal of basic
microbiology, 38(2), 95-100.
* Cunningham, S. D., Shann, J. R., Crowley, D. E., & Anderson, T. A. (1997).
Phytoremediation of contaminated water and soil. ISO 690
* EcoCyc E. coli Database (2015), http://ecocyc.org/
* Enzyme: α-amylase (2015), http://ecocyc.org/
* FitzPatrick, M., Champagne, P., Cunningham, M. F., & Whitney, R. A. (2010). A
biorefinery processing perspective: treatment of lignocellulosic materials for the
production of value-added products. Bioresource technology, 101(23), 8915-8922
* Rosales-Colunga and Martínez-Antonio Microbial Cell Factories 2014, 13:74
http://www.microbialcellfactories.com/content/13/1/74 .
* Rosales-Colunga, L. M., Razo-Flores, E., Ordoñez, L. G., Alatriste-Mondragón, F.,
& De León-Rodríguez, A. (2010). Hydrogen production by Escherichia coli ΔhycA
ΔlacI using cheese whey as substrate. international journal of hydrogen energy,
35(2), 491-499
40