Download - Informe de Laboratorio Practica N 1
ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL
INFORME DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
AMBIENTAL
Práctica No 1
DATOS GENERALES
Estudiantes: Código:
Stalin Flores 2188
Rodrigo Guerrero 2172
Denis Pilco 2167
Jose Latorre 1979
Nivel: Quinto ¨B¨
Fecha de realización: 24/10/2013
Fecha de entrega: 31/10/2013
1. TEMA: Columna de Winogradsky
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo General:
2.1.1 Comprobar con el uso de la columna de Winogradsky como los
microorganismos ocupan diferentes zonas para su desarrollo de acuerdo
a cada una de las necesidades que este requiera.
2.2. Objetivos Específicos:
2.2.1 Identificar a los distintos microorganismos dependiendo de las zonas en
las que se desarrollan.
2.2.2 Identificar cuáles son los ciclos que realizan los microorganismos y la
interdependencia que llega a existir entre ellos.
2.2.3 Reconocer como es el tipo de interrelaciones que se dan en la Columna
de Winogradsky entre los microorganismos.
3. MARCO TEÓRICO
Esta técnica fue desarrollada inicialmente por el microbiólogo ruso Sergei Winogradsky
(1856-1953), quien usó la columna para estudiar los microorganismos del suelo.(4)
La columna de Winogradsky es un sistema que permite observar en el laboratorio el
proceso evolutivo de los microorganismos, es decir, el proceso de adaptación a los
diferentes ambientes empleando diferentes estrategias para la obtención de energía. (4)
Una vez que se prepare la columna y se exponga a la luz solar, se desarrollará una
sucesión de comunidades bacterianas interrelacionadas metabólicamente, de un modo
similar a lo que ocurre en la naturaleza, que se podrán observar fácilmente por su
distinta coloración. Además, la columna es un sistema anóxico en miniatura que puede
usarse como suministro a largo plazo de bacterias para cultivos de enriquecimiento
La columna de Winogradsky es una demostración clásica de cómo los microorganismos
ocupan microespacios altamente específicos de acuerdo con sus tolerancias
medioambientales y sus necesidades vitales (requerimientos de carbono y energía) e
ilustra como diferentes microorganismos desarrollan sus ciclos, y la interdependencia
que llega a existir entre ellos (las actividades de un microorganismo permite crecer a
otro y viceversa). Esta columna es un sistema completo y autónomo de reciclamiento,
mantenido sólo por la energía de la luz. (2)
Al pasar algunos días se diferenciación claramente la formación de tres estratos, se los
identifica debido a su color característico, los cuales presentamos a continuación:
Figura 1. (Columna Winogradsky)
ZONA AEROBIA (RICA EN OXÍGENO)
La parte superior de la columna de agua puede contener abundantes poblaciones de
bacterias de diferentes tipos. Son organismos aerobios que se encuentran habitualmente
en los hábitats acuáticos ricos en materia orgánica (estanques poco profundos, arroyos
contaminados, etc). Suelen ser flagelados, lo que les permite moverse y establecerse en
nuevas áreas. Puede desarrollarse también microorganismos fototrófos variados
procedentes directamente del agua o del barro utilizado originalmente en el montaje de
la columna. La superficie del barro puede presentar en esta zona un ligero color castaño.
Esta es la parte de la columna más rica en oxígeno y más pobre en azufre. (1)
ZONA MICROAERÓFILA:
Es la zona en donde se guardan ambos gradientes, el oxigeno y el sulfuro de hidrogeno.
Aparecen bacterias oxidadoras del azufre como Beggiatoa, Thiothrix o Thiobaccillus,
que usan como fuente de carbono la materia orgánica, y oxidan el H2S que llega por
difusión desde las capas inferiores a azufre elemental. La reacción química que se lleva
a cabo es la siguiente: (1)
Son, por lo tanto, microorganismos mixotrofos. Estos géneros acumulan gránulos de
azufre en sus citoplasmas por oxidación del H2S que es muy baja, los gránulos de
azufre elemental intracitoplasmático presentes en estas bacterias empiezan a
desaparecer por oxidación total a sulfatos.(3)
ZONAS ANAERÓBICAS
Esta zona contiene H2S, en la zona anaeróbica superior predominan las bacterias
fotosintéticas anaerobias, y en la columna se observan una serie de bandas de colores
rojo y verdes: (1)
Bacterias rojas no del azufre: Rhodospirillum, Rhodomicrobium o
Rhodopseudomona, son bacterias anaerobias fotoorganótrofas, que solo pueden realizar
la fotosíntesis en presencia de una fuente de carbono orgánico. Forman una capa de
color rojo-anaranjado.
Las bacterias verdes no del azufre son termófilas y, por lo tanto, no crecen en la
columna a temperatura ambiente.
Bacterias rojas del azufre (Chromatium, Thiospirillum, Thiocapsa, forman una capa
roja-púrpura).
Bacterias verdes del azufre (Chloroblum, Pelodyctium). Estas bacterias son
fotolitótrofas y realizan una fotosíntesis anoxigénica, no producen oxigeno ya que no
utilizan H2O como elemento reductor si no H2S, generando en este proceso sulfatos
(SO42-). La reacción que tiene lugar es la siguiente: (3)
Estos microorganismos aparecen como zonas de crecimiento en el lodo de la columna,
pero también pueden desarrollarse en el agua si los fotótrofos oxigénicos son escasos.
En la zona anaeróbica más profunda, de color negro intenso, aparecen microorganismos
capaces de realizar respiración anaeróbica y fermentación.
Bacterias reductoras del sulfato (BRS): Desulfovibrio, Desulfobacter,
Desulfotomaculum, o Desulfomonas. Usan el sulfato, u otras formas parcialmente
oxidadas de azufre como el tiosulfato, y generan grandes cantidades de H2S que
reaccionará con el hierro presente en el sedimento, produciendo sulfuro de hierro (II),
que precipita y da el color negro. Es por esto que, en la naturaleza, los sedimentos
acuáticos son frecuentemente negros.
La reacción sería la siguiente:
Bacterias fermentadoras
Utilizan la celulosa del papel aportado como fuente primaria para su metabolismo,
aparecen las bacterias del género Clostridium.
Clostridium: Son anaerobias estrictas, y no empiezan a crecer hasta que el oxígeno
desaparece del sedimento.
Figura 2. (Microorganismos caracteristicos de la Columna de Winogradsky)
4. MARCO PRACTICO
4.1. Materiales
Preparación de la Columna de
Winogradsky
Botellón de plástico
Lodo
Agua estancada
Huevo cocido
Hojarasca
Papel picado
Clavo
Papel film
Análisis de la Columna de
Winogradsky
3 Pipetas de 10mL
3 Tubos de ensayo
Centrífugador
Asa de siembra
Mechero
Microscopio óptico
Portaobjetos
Cubreobjetos
4.2. Reactivos
Preparación de la Columna de
Winogradsky
5g sulfato de calcio
5g carbonato de calcio
Azufre
Análisis de la Columna de
Winogradsky
Cristal violeta
Lugol
Decolorante
Safranina
Aceite de inmersión
4.3. Procedimiento:
Preparación de la Columna de Winogradsky
Análisis de la Columna de Winogradsky
Cortar una cuarta parte del botellón
Se adiciona al frasco el papel picado con los restos de hojas secas y el huevo cocido
Se adiciona el CaSO4, el CaCO3, el S y el clavo
Se adiciona el lodo, el agua y se llena el frasco completamente
Se tapa para evitar evaporación
Se incuba a temperatura de 28 a 30°C bajo luz incandescente por un mes
Observar con lentes de 10X, 40X y 100X
Realizar la Tinción Gram
Fijar las muestras en los portaobjetos en medio aséptico
Centrifugar las muestras a 2000RPM en 10 min.
Colocar en tres tubos de ensayo las muestras obtenidas hasta completar sus 3 cuartas partes
Obtener con las pipetas una muestra de cada estrato
5. GRÁFICOS
Foto1: Preparacion de la cama Foto 2: Añadicion de lodo y agua estancada
Foto 3: Sellamiento de la columna
Foto4: Extraccion de muestras de diferentes sustratos
Foto 5: Preaparacion de las muestras en la centrifuga
Foto 6: Muestras despues de la centrifugacion
Foto 7: Fijacion de las muestras
Foto 8: Fijacion de las Muestras
Foto 9: Tincion Gram de las muestras fijadas.
Foto 10: Sustrato 1 (40X) Foto 11: Sustrato 2 ( 40x) Foto 12: Sustrato 3( 40x)
6. ANALISIS Y DISCUSION DE RESULTADOS:
En el presente laboratorio se recreo el experimento de columna de Sergéi Winogradsky,
a partir de la misma se pudo demostrar principalmente la forma en cómo los
microorganismos ocupan "microespacios" o estratos los cuales son específicos para
cada microorganismo de acuerdo a los distintos limites y barreras que se simulan dentro
de la columna de Winogradsky, como por ejemplo los nutrientes, requerimientos de
oxigeno, la temperatura, la radiación, el PH, etc. De igual forma, su desarrollo debido a
las interrelaciones que se registraron en la columna.
Mediante los conocimientos previos de el experimento de Sergéi Winogradsky se
esperaba que en la columna se diferenciaran por lo menos 7 estratos o 7 capas de
distintos colores correspondientes a una capa anaerobia(negro), capa de difusión(verde
oscuro), capa verde, capa purpura/rojiza, capa color herrumbre, capa color marrón, capa
de agua verde o transparente, sin embargo se visualizo únicamente tres capas muy poco
diferenciadas y desiguales: una capa profunda de color negro, correspondiente a la
anaeróbica, una pequeña capa intermedia de color rojizo y una capa superficial de color
verde oscuro, estos resultados se obtuvieron debido a diversos factores, entre los cuales
podemos citar: la falta de luz artificial o fuente lumínica, escases de nutrientes( hierro,
oxigeno, fosforo, carbonatos, azufre, etc.), o un fallo sistemático en la preparación de la
columna. De manera similar mediante conocimientos teóricos previos se esperaba
obtener 3 estratos o zonas distintas: una zona aerobia en la que se desarrollaran
microorganismos fototótrofos, cianobacterias y algas que son los primeros que toman la
fuente de energía en este caso la luz y el oxigeno y lo distribuyen a los demás gradientes
en formas más asimilables de manera que estos los puedan tomar, en la columna de
Winogradsky correspondiente a la práctica, efectivamente se logró distinguir en la
superficie la presencia de una delgada capa de color verde oscuro que se formo por la
acumulación verdosa como una especie de alfombra la misma que está conformada por
las cianobacterias y las algas. Esta es la parte de la columna más rica en oxígeno y más
pobre en azufre. Además se observo gas en la columna de agua que podría corresponder
a O2 de la fotosíntesis de estos microorganismos. Mientras que en la segunda zona
denominada zona microaerofílica donde la concentración de oxigeno disminuye y la de
azufre aparece progresivamente, siendo a su vez la zona donde ambas zonas tanto
anaeróbica como aeróbica se sobreponen, se combinan o convergen, existiendo como
nutrientes oxigeno( en menor proporción) y el acido sulfhídrico H2S (le da el olor
característico de la columna ya que tiene un fuerte olor a huevo podrido, consecuencia
de la descomposición de la materia orgánica) también en baja proporción, aquí se
esperaba la presencia de algas más pequeñas debido a la escases de oxigeno, lo que
produce disminuye su desarrollo, bacterias gram positivas y negativas, bacterias
oxidadoras del azufre(Thiobacillus, Beggiatoa), debido a la ausencia de oxigeno y la
aparición de fuentes de H2S, las mismas que utilizan como fuente de energía a la
materia orgánica y oxidan el H2S, a esta clase de microorganismos se los denomina
mixotrofos, y provee de azufre elemental a la zona anaerobia, y a la zona aerobia de
oxigeno, correspondiendo a un ejemplo típico de protocooperacion con la zona
anaerobia porque ambos se dan nutrientes de azufre, y una relación de comensalismo
con la zona aerobia porque los mixotrofos toman el oxigeno de esta zona para su
desarrollo, pero no benefician ni perjudican a la zona aeróbica. Este estrato debe poseer
una coloración roja, obtenido por la formación de agregados de microorganismos
adheridos a las paredes del recipiente. Estos microorganismos serian las bacterias rojas
no del azufre. En la columna de Winogradsky correspondiente a esta práctica de
laboratorio, la zona microaerofílica era delgada y escasa, esto debido a que fuente de
azufre así como el oxigeno necesario para que se desarrollen adecuadamente los
microorganismos mixotrofos correspondientes a esta capa fueron deficientes.
Finalmente en el tercer estrato donde se asienta el lodo es decir el lugar en el cual hubo
una sedimentación de materia orgánica se preveía que se una coloración verde oscura y
roja en la parte superior de esta zona, y una coloración café y negra en la parte inferior,
la coloración roja se debe a las bacterias rojas del azufre que forman una capa roja–
anaranjada, la coloración verde en cambio se produce por las bacterias verdes del
azufre, estas bacterias son fotolitótrofas y realizan una fotosíntesis anoxigénica,
generando en este proceso sulfatos (SO4)2 . En la zona anaerobia más profunda, de
color negro intenso, aparecen microorganismos capaces de realizar respiración
anaeróbica y fermentación( genero Amoebacter), estos microorganismos utilizan el
sulfato y lo convierten en acido sulfhídrico, que será tomado por las bacterias reductoras
del sulfato, también se distinguen las bacterias que degradan la celulosa(tiras de papel
periódico) como por ejemplo las bacterias del genero Clostridium, estas son anaerobias
estrictas así que necesitan la ayuda de otro tipo de bacterias que son las anaerobias
facultativas que reducen todo el oxigeno del medio para que dichas bacterias se
desarrollen normalmente y puedan convertir la celulosa en glucosa y posteriormente
mediante la fermentación de esta glucosa obtener su energía generando como producto
de desecho, formas simples de compuestos orgánico , los cuales son tomados por las
bacterias del azufre que necesitan compuestos orgánicos para su respiración, es el caso
de las fotosintéticas anoxigenicas que en escases de oxigeno utilizan estos compuestos
orgánicos para su fotosíntesis, a esta interrelación se la conoce como
(cometabolismo). Al visualizar la columna de Winogradsky de nuestra práctica se pudo
notar que la parte inferior de esta zona correspondiente a las bacterias que degradan
celulosa y microorganismos anaerobios es la más distinguible y amplia, lo que
demuestra que los requerimientos de dichos microorganismos fueron los adecuados, es
decir la cantidad de materia orgánica (lodo), fuente de celulosa (papel periódico) fue la
adecuada, sin embargo la parte superior de esta zona no presentó la coloración esperada
por lo que se comprueba lo dicho anteriormente, es decir que la fuete de azufre fue
escasa. Al observar al microscopio muestras de las tres zonas previamente fijadas y
después de realizar la tinción gram se logró observar distintos microorganismos siendo
las más notorias y abundantes las algas, cianobacterias y bacterias gram-positivas,
algunas bacterias gram-negativas y protozoos, las muestras tuvieron ciertos defectos
debido a errores en el momento de la toma de la muestra con la pipeta, por lo que en las
3 muestras se evidencio la presencia de algas o restos de materia orgánica.
7. OBSERVACIONES
7.1 Observaciones de la columna de Winogradsky
CAMBIOS DE LA COLUMNA DE WINOGRADSKYFecha Descripción
19/09/2013 En el primer día se pudo observar una sola masa de lodo y agua de color grisáceo sobre aquella masa, del botellón se emanaba un olor pestilente
26/09/2013 Ya pasada una semana se pudo observar que el papel film estaba con presencia de pequeñas gotas de agua, se observaba una capa verde sobre el agua que conservaba el color grisáceo. Del botellón se emanaba un olor pestilente.
03/10/2013 Ya pasadas dos semanas el papel film tiene mayor presencia de gotas de agua, el agua sobre la capa de lodo tenia un color ladrillo con tendencia a rojo, en la superficie del agua la capa verde observada anteriormente se volvió más densa ya con presencia filamentosa de color verde obscuro. La capa de lodo comenzó a obscurecer su color. Del botellón se emanaba un olor pestilente.
10/10/2013 Ya pasadas tres semanas la coloración roja observada anteriormente parece sedimentarse con el lodo formando una capa roja muy delgada aproximadamente de unos 5mm. En el fondo de la capa de lodo comienzan a aparecer pequeñas manchas amarillas que siguen un patrón lineal de forma lateral. En la superficie de la capa de agua ya se presencia una capa muy densa formada por algas. Del botellón se emanaba un olor pestilente.
17/10/2013 Ya pasadas cuatro semanas la capa de agua se vuelve muy turbia tomando un color verde azulado muy intenso, la capa de lodo en su mayoría se vuelve de un color negro intenso manteniendo la coloración roja en la parte superior y también la coloración amarilla. Se mantiene la capa densa de algas. Del botellón se emanaba un olor pestilente.
24/10/2013 Ya pasadas cinco semanas la coloración verde azulada del agua parece sedimentarse formando una capa del mismo color sobre la capa roja antes descrita la misma que ha ido perdiendo sus propiedades ya que ha su coloración no es muy notoria. La coloración amarilla ha logrado ocupar más lugar en el fondo de la capa de lodo. La capa de algas comienza a sobre poblar la superficie de la capa de agua. Del botellón se emanaba un olor pestilente.
7.2. Observaciones de la columna en el microscopio
ZONA DE LA COLUMNA CARACTERISTICAS DEL
ESTRATO
MICROORGANISMOS
Y TINCION GRAM
ESQUEMA
40X 100X
Algas (de forma alargada
cilíndrica) y bacterias
fotosintéticas (de forma
redonda, cloroplasto
encargado de la fotosíntesis);
microorganismos eran de
color verde (fotosíntesis), se
observo también gran
cantidad de flagelados de
color verde, y células gram
positivas de color azul, y
gram negativas de color rosa-
morado.
Algas
fotosintéticas
Cianobacterias
Microorganismos de color
purpura, de forma redonda,
formando agregados
(bacterias purpuras del
azufre), la presencia de algas
pero eran de menor tamaño,
células fotosintéticas, en
menor densidad poblacional.
Ademas se puede distinguir
filamentos verdosos, nucleos.
Algunos protozoos, que son
mucho más grandes que las
bacterias
Chlorobium
(bacterias verdes
del azufre)
Cromatium
(bacterias
purpuras del
azufre)
Galionella
Protozoo
Algas mucho más pequeñas
(desarrollo mínimo debido a
la falta de luz),
Microorganismos gram
positivos y negativos, se pudo
observar además agregados de
color café, de forma redonda
que estaban muy dispersos,
siendo estos en realidad
fermentadores de celulosa o
productores de hidróxido de
azufre
Amoebacter
(bacterias
purpuras del
azufre)
Clostridium
Desulfovibrio
Algas
pequeñas
8. CONCLUSIONES
ZONAAEROBIA
ZONA MICROAEROF
ILICA
ZONA ANAEROBIA
Se logró identificar en la parte superior de la columna que es más rica en
oxígeno y más pobre en azufre abundantes poblaciones de microorganismos
aerobios ,en la zona microaerofílica que es la zona en la que los
microorganismos solapan ambos gradientes, el de oxígeno y el de sulfuro de
hidrógeno aparecen bacterias oxidadoras del azufre y en la zona anaeróbica
esta zona contiene H2S (procedente del fondo), en la zona anaeróbica
superior predominan las bacterias fotosintéticas anaerobias y en la zona
anaerobia más profunda, aparecen microorganismos capaces de realizar
respiración anaeróbica y fermentación.
Se pudo identificar como los microorganismos necesitan los unos de los
otros para poder existir ya que en la zona inferior de lodos se desarrollan
organismos que desarrollan procesos fermentativos que producen alcohol y
ácidos grasos como subproductos de su metabolismo y estos productos de
"desecho" son a su vez el sustrato para el desarrollo de bacterias reductoras
de sulfato, como resultado se liberan sulfuros que difunden a la zona
superior oxigenada creando un gradiente en el que se desarrollan bacterias
fotosintéticas que utilizan el azufre y por encima de esta zona pueden
desarrollarse las bacterias aerobias que no utilicen el azufre como suelen ser
las cianobacterias y algas crecen en la parte superior y liberan oxígeno que
mantiene aerobia esta zona y así los microorganismos trabajan entre sí para
desarrollarse en óptimas condiciones. Aquí juega un papel fundamental la
exposición constante a la luz luz ya que empieza a penetrarse hacia la región
inferior anaeróbica, para facilitar el desarrollo de los microorganismos
fotosintéticos anoxigénicos que proveen de CO2 es decir materia orgánica a
los microorganismo de arriba que requieren de esta materia orgánica para su
desarrollo y así comienza la relación que estos microorganismos necesitan
para su desarrollo.
Se logró reconocer como es que las bacterias se relacionan entre si para
poder desarrollarse sobre todo en el aspecto nutricional por ende se puede
decir que hay una relación de comensalismo al momento que las bacterias
que desarrollan procesos fermentativos proveen de sustratos a las bacterias
reductoras de sulfato dándose cometabolismo entre estos dos
microorganismos por lo general así se van a encontrar también relaciones de
comensalismo ya que algunas bacterias a partir del H2S lo convierten a
formas más complejas para que lo usen otros microorganismos sin pedir
nada a cambio aquí se da un comensalismo también se da sinergismo debido
a que todo el acido sulfhídrico fue desplazado hacia la parte inferior por
acción de los microorganismos formando sedimentos, y de ahí que mediante
las interrelaciones este fue subiendo para nutrir a los demás
microorganismos, también se elimino el oxigeno de la parte inferior por
parte de las bacterias anaerobias facultativas que ayudo a que anaerobias
estrictas se desarrollen.
9. RECOMENDACIONES
Recomendamos conseguir un buen lodo residual como agua estancada ya que de esto dependerán mucho el desarrollo de los diferentes tipos de microorganismos en nuestra columna.
Se recomienda triturar y homogenizar la hojarasca para poder dispersar por toda la superficie de la botella donde elaboraremos la columna posteriormente cuando se añada las demás sustancias incluyendo el lodo residual formar un mezcla, procurar que esta sea una mezcla homogénea.
Se recomienda que mientras más expuesto a la luz se encuentre la columna el desarrollo de los microorganismos será mucho más rápido.
Es recomendable rotar la columna con regularidad para que la fuente de luz sea homogénea en todas partes de esta y no solo se pueda observar de un solo perfil.
Recomendamos no agitar ni mover bruscamente la columna de winogradski al momento de trasladarla ya que podían mezclarse las zonas diferenciadas en la columna.
Se recomienda no acercar de manera exagerada la columna al foco ya que esta transpirara mucho por efectos del calor y esto será perjudicial en el desarrollo de nuestros microorganismos.
Se recomienda el uso de mascarilla ya que el olor emanado al ser la columna descubierta es algo desagradable.
Al momento de la extracción de muestras se recomienda pipetas rotas o con un ancho orificio ya que de no ser así se taponarán y no podríamos tomar buenas muestras.
Se recomienda no succionar con la boca al momento de tomar las muestras de la columna ya que estas contienen algunos gases como el metano o sulfatos que de ser absorbidos por nosotros serian perjudiciales en nuestra salud.
Se recomienda ser muy eficiente al momento de extraer las muestras con la pipeta para no mezclar el sustrato porque podríamos encontrar microorganismos
que no pertenecen a la muestra tratada. Se recomienda rotular las muestras con el número de grupo y de zona extraída
con el fin de no confundirlas. Es una recomendación importante al momento de la fijación en placa trabajar
cerca del área estéril para evitar contaminación con otros microorganismos provenientes del aire.
10. BIBLIOGRAFÍA
Bibliografía:
1. Brock Biología de los microorganismos 10ª edición (2003). J. Parker, J.M.
Martinko,M.T. Madigan. Pearson Education.
2. Atlas, R. M., Bartha, R. 2002. Ecología Microbiana y Microbiología Ambiental.
PEARSON EDUCACIÓN, S. A., Madrid, España.
Linknografía:
Figura 1. (Columna de Winogradsky Esquema)
3. http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioBiodiversidad.htm
Microbiólogos Ilustres
4. http://microilustres.blogspot.com/2007/01/winogradsky-sergei-1856-1953.html
Figura 2. (Microorganismos representativos de la columna de Winograsky
5. http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/winogradsky.html