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Evaluación de medios de cultivo in vitro para Amburana cearensis (roble) y Centrolobium
tomentosum (tejeyeque) en la fase de establecimiento
Kathelyn Paredes V. Ingrid Morales B.
Edwin Magariños S.
Documento Científico No. 2 - 2008 FOMABO-PROINFOR
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El “Documento Científico” crece de la colaboración FOMABO entre las tres universidades la Carrera de Ingeniería Forestal de la Universidad
Autónoma Gabriel René Moreno (UAGRM) de Santa Cruz, la Escuela de Ciencias Forestales (ESFOR) de la Universidad Mayor de San Simón
(UMSS) de Cochabamba y la División Bosques y Paisaje de la Universidad de Copenhague (KU), Dinamarca. El proyecto FOMABO esta financiado
por la Cooperación Danesa (DANIDA) a través del programa de capacitación e investigación ENRECA.
El documento tiene el fin de acelerar el proceso de difusión resultados de
investigaciones científicas resultado de la colaboración e impulsar la discusión de los resultados.
Las opiniones y juicios expresados en este documento son de exclusiva
responsabilidad del autor y no reflejan necesariamente la opinión o política de UAGRM, UMSS o KU.
Referencia Paredes, K., Morales, I., Magariños, E. 2007. Evaluación de medios de cultivo in vitro para Amburana cearensis (roble) y Centrolobium tomentosum (tejeyeque) en la fase de establecimiento. Documento Científico 2-2008. Proyecto de Manejo de Bosques en Bolivia (FOMABO), Programa de Investigaciones Forestales (PROINFOR). Santa Cruz, Bolivia. Editorial Carrera de Ingeniería Forestal UAGRM Programa de Investigaciones Forestales (PROINFOR) Vallecito, Carretera al Norte Km. 8,5 Santa Cruz de la Sierra, Bolivia Reservados todos los derechos. Ninguna parte de esta publicación se puede reproducir, almacenar en sistema de recuperación ni transmitir en forma alguna por medios electrónicos, mecanismos, fotocopia o cualquier otro medio, sin una adecuada referencia a la fuente.
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Evaluación de medios de cultivo in vitro para Amburana cearensis (roble) y Centrolobium
tomentosum (tejeyeque) en la fase de establecimiento
Kathelyn Paredes 1,*, Ingrid Morales 2, Edwin Magariños 3
1. *Investigador Forestal Universidad Autónoma Gabriel Rene Moreno, Facultad de Ciencias Agrícolas, Carrera de Ingeniería Forestal, Programa de Investigaciones (PROINFOR), El Vallecito, Carretera al Norte Km 8.5, Casilla Postal 3051, Telf./Fax: +591-3-3434363, Santa Cruz de la Sierra, Bolivia. E-mail: [email protected]
2. Profesor Titular de la Universidad Autónoma Gabriel Rene Moreno, Facultad de Ciencias Agrícolas, Carrera de Biología, El Vallecito, Carretera al Norte Km 8.5, Casilla Postal 6025, Telf./Fax: +591-3-3434363, Santa Cruz de la Sierra, Bolivia. E-mail: [email protected]
3. Profesor Adjunto de la Universidad Autónoma Gabriel Rene Moreno, Facultad de Ciencias Agrícolas, Carrera de Ingeniería Forestal, El Vallecito, Carretera al Norte Km 8.5, Casilla Postal 6025, Telf./Fax: +591-3-3434363, Santa Cruz de la Sierra, Bolivia. E-mail: [email protected]
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CONTENIDO
SUMMARY .................................................................................................................................................................. 5 RESUMEN.................................................................................................................................................................... 6 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................................... 7 2. MATERIALES Y MÉTODOS................................................................................................................................ 8
2.1. MATERIAL DE ESTUDIO ....................................................................................................................................... 8 2.2. DESINFECCION DEL MATERIAL VEGETAL........................................................................................................... 12 2.3. PRUEBAS DE PROPAGACION IN VITRO ................................................................................................................ 12 2.4. DETERMINACION DEL EFECTO DE LAS FITOHORMONAS EN EL CRECIMIENTO Y DESARROLLO DE LAS YEMAS DE ROBLE ...................................................................................................................................................................... 13
2.4.1. Efecto del AG3 y Kinetin .......................................................................................................................... 13 2.4.2. Efecto del AG3 y BAP............................................................................................................................... 14 2.4.3. Efecto del IBA y BAP................................................................................................................................ 14
2.5. DETERMINACIÓN DEL EFECTO DE LAS FITOHORMONAS EN EL CRECIMIENTO Y DESARROLLO DE LAS YEMAS DE TEJEYEQUE............................................................................................................................................................... 15 2.6. MULTIPLICACIÓN .............................................................................................................................................. 15 2.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO...................................................................................................................................... 16
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................................................................ 17 3.1. FASE DE INTRODUCCIÓN DEL ROBLE (AMBURANA CEARENSIS)............................................................................ 17 3.2. FASE DE ESTABLECIMIENTO DEL TEJEYEQUE (CENTROLOBIUM TOMENTOSUM)................................................... 20
4. CONCLUSIONES.................................................................................................................................................. 25 AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................................................. 26 REFERENCIAS......................................................................................................................................................... 27 ANEXOS..................................................................................................................................................................... 30
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Summary
Roble is a species which is characterized by slow growth, hardwood and high commercial value.
On the other hand, tejeyeque is fast-growing and soft wood. But both species have difficulties in
their regeneration because of their phenological characteristics and / or morphology. Under this
approach is necessary to take steps for their repopulation and in vitro cultivation is an excellent
alternative to overcome the above-mentioned difficulties, because through this technique it is
possible to reproduce clones with high genetic value, achieving high quality plants and the
proliferation of best individuals of woody species in less time.
This work was undertaken with the aim of contributing to the development of an applicable
methodology to the propagation of Amburana cearensis and Centrolobium tomentosum. To that
end, we studied alternative culture mediums and management of explants at the establishment
phase. The explants of auxiliary buds and apical plant juveniles were established in the culture
medium Murashige and Skoog (MS) supplemented with AG3/KIN, AG3/BAP, IBA / BAP for
roble and BAP/AG3 for tejeyeque.
The explants not survived in all treatments, this is the case of roble (Amburana cearensis). All the
tests of establishing roble presented difficulties for being this specie of slow growth in addition to
its high percentage of contamination and phenolization of explants in the laboratory. However,
the results showed that using BAP and AG3 in the culture medium in concentrations 0.5/0.5
respectively, it was possible to achieve a high regeneration and growth of apical segments of
tejeyeque (Centrolobium tomentosum).
Key words: in vitro, establishment phase, roble, tejeyeque, phenolization.
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Resumen El roble es una especie que se caracteriza por su crecimiento lento, madera dura y alto valor
comercial. Por otro lado, el tejeyeque es de rápido crecimiento y madera blanda. Pero ambas
especies presentan dificultades en su regeneración debido a sus características fenológicas y/o
morfológicas. Bajo este enfoque es necesario tomar acciones para su repoblación siendo el
cultivo in vitro una excelente alternativa para superar las dificultades antes mencionadas, pues
por medio de esta técnica es posible reproducir clones con alto valor genético, conseguir plantas
de alta calidad y la multiplicación de los mejores individuos de especies leñosas en menor
tiempo.
El presente trabajo se realizó con la finalidad de contribuir con el desarrollo de una metodología
aplicable a la propagación de Amburana cearensis y Centrolobium tomentosum. Para ello, se
estudiaron variantes de medios de cultivo y manejo de los explantes en la fase de establecimiento.
Los explantes de yemas axilares y apicales de plantas juveniles se establecieron en medio
Murashige y Skoog (MS) suplementado con AG3/KIN, AG3/BAP, IBA/BAP para el roble y
BAP/AG3 para tejeyeque.
Los explantes no sobrevivieron en todos los tratamientos, este es el caso del roble (Amburana
cearensis). Las pruebas de establecimiento de roble presentaron dificultades por ser esta especie
de crecimiento lento además de su alta tasa de contaminación y fenolización en laboratorio. Sin
embargo, los resultados mostraron que con el BAP y AG3 en el medio de cultivo, en
concentraciones de 0.5/0.5 respectivamente, fue posible lograr una alta regeneración y
crecimiento de los segmentos apicales del tejeyeque (Centrolobium tomentosum).
Palabras clave: in vitro, fase de establecimiento, roble, tejeyeque, fenolización.
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1. Introducción
La reducida población en el bosque causada por el aprovechamiento selectivo de especies de
mara (Swietenia macrophylla), cedro (Cedrela fissilis) y roble (Amburana cearensis) que se
realizaba anteriormente ha causado una marcada reducción y degradación de las especies
mencionadas, además de daños al bosque residual (Gullison et al. 1996).
El roble (Amburana cearensis) es una de las especies que se han visto afectadas por la
deforestación debido a su madera de alta calidad y valor comercial, esta especie, es de gran
interés. Pero existen problemas particularmente agudos en la regeneración de las especies
maderables valiosas. Los problemas de regeneración parecen ser más serios para las especies
maderables heliófitas y moderadamente esciófitas (Mostacedo y Fredericksen 2000). Dicha
especie debido a su fenología, no fructifica y produce semillas anualmente.
De la misma manera, se presenta en el tejeyeque (Centrolobium tomentosum) que es una especie
nativa del ecosistema amazónico con un gran valor comercial y que presenta problemas de
propagación vía esquejes y reproducción vía semilla, al ser esta recalcitrante (Villarroel et al.
2007). Tiene gran demanda pero poca posibilidad de conservar la semilla.
No obstante, a través de métodos de propagación tradicional aún existen limitaciones y
dificultades importantes, tales como lentitud en el proceso de germinación, irregularidad en la
obtención de plántulas para formar una población homogénea, en cuanto edad y tamaño,
obtención de semillas a intervalos irregulares y con escasa viabilidad. (Uribe-Moraga y Cifuentes
2004).
Frente a este hecho, es necesario usar técnicas alternativas para generar un sistema de
multiplicación y regeneración de explantes de forma masiva. Por esta razón se piensa en la
biotecnología como herramienta eficaz que, a través del cultivo in vitro, permite propagar
asexualmente y cultivar individuos seleccionados además de conseguir plantas de alta calidad,
ahorrar tiempo y dinero.
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El objetivo del estudio fue desarrollar una metodología alternativa de regeneración en las
especies Amburana cearensis y Centrolobium tomentosum, utilizando la técnica del cultivo in
vitro y micropropagación. Para ello se evaluaron los explantes con mayor regeneración en medios
de cultivo MS (Murashige y Skoog 1962) con diferentes concentraciones de hormonas, con el fin
de producir gran cantidad de plántulas que puedan compensar la baja regeneración de dichas
especies.
2. Materiales y métodos
2.1. Material de estudio
El presente estudio se realizó en el laboratorio de biotecnología BIOFAN ubicado en la Facultad
de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma Gabriel René Moreno (UAGRM). Asimismo,
el material vegetal utilizado consistió en:
- Yemas axilares y apicales de plantas juveniles de roble (Amburana cearensis)
provenientes de plántulas germinadas en el vivero del municipio de San Miguel de
Velasco a cargo de la Unidad Forestal Municipal (UFM).
- Yemas apicales de plantas juveniles de tejeyeque (Centrolobium tomentosum)
provenientes del chapare, donadas por la empresa Bosques Tropicales Bolivia S.A.
Todos los instrumentos utilizados en la manipulación del material vegetal fueron esterilizados en
una estufa a una temperatura de 180ºC, durante dos horas antes de cada sesión de trabajo;
realizándose todas las operaciones de disección y transferencias en la cámara flujo laminar
horizontal, el cual fue esterilizado con alcohol previamente.
El roble es un árbol grande caduco de 15-25 m de altura, con un DAP de 40-110 cm. La copa es
redondeada y ancha, con follaje verde oscuro (Figura 1). El tronco es cilíndrico y poco tortuoso.
La corteza externa es de color castaño – anaranjado y lisa, con lenticelas abundantes. Se
desprende por grietas longitudinales, en forma de descamaciones pequeñas con textura de papel.
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Las hojas son alternas, pinnadas, de 6-20 cm de largo, hay de 7– 10 foliolos alternos y elípticos
de 2-5 cm de largo por 1,5-3 cm de ancho, con ápice redondeado, base roma y borde entero
(Figura 2).
Figura 1: Copa y fuste del roble
Fuente: Mostacedo et al. (2003)
El fruto es una vaina oblonga dura de 5-8 cm de largo por 1-2 cm de ancho, de color castaño
oscuro. Hay una semilla ovoide castaña de 4-6 cm de largo, incluyendo un ala larga. La
inflorescencia es un racimo terminal o axilar, y las flores presentan un pétalo redondeado y
blanco. Hermafroditas, zigomorfas, cáliz unido, con 5 lóbulos; pétalos 5, libres, blancos,
amariposados; estambres libres 10; ovario súpero largamente estipitado, con estilo corto. Florece
de marzo a mayo y los frutos maduran entre julio y septiembre; las semillas son dispersadas por
el viento.
Las plántulas presentan hojas de similares características a las de los árboles adultos, éstas tienen
las hojas compuestas, los foliolos alternos, oblongos, el borde entero, la base redondeada y el
envés blanquecino. Tienen un olor característico cuando se las estruja.
Se encuentra distribuido ampliamente en los departamentos de Pando, Beni, La Paz y Santa Cruz
desde 200 a los 1200 msnm (Mostacedo et al. 2003). El roble es perseguido por el gran valor
comercial de su madera. Prefiere los suelos arcillo - arenosos. Crece en los bosques semideciduos
bien drenados, y es común cerca de afloramientos rocosos. Es una especie heliófita de
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crecimiento moderado, aunque tiene un crecimiento inicial lento. Su población de por si no es
numerosa y se va reduciendo aún más por la excesiva explotación.
Además, es una especie que posee semillas utilizadas comercialmente para la perfumería. La
cáscara del tallo presenta propiedades terapéuticas, comprobadas científicamente, contra
afecciones respiratorias. Por lo tanto, debido a su intensa explotación económica, esta especie se
encuentra amenazada de extinción (Bezerra et al. 2004).
En la amazonía se encuentra A. cearensis var. acreana, mientras que en el centro y sur del país se
encuentra A. cearensis var. cearensis. La corteza de la variedad acreana es más rugosa y de color
más oscuro que la variedad cearensis. Algunos autores reconocen a éstas dos variedades como
dos especies distintas.
Figura 2. Características morfológicas de la especie Amburana cearensis
Fuente: Mostacedo et al. (2003)
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Por otro lado, el Tejeyeque es un arbol semi-decíduo a decíduo. Los árboles mayores alcanzan
dimensiones próximas a 35 m de altura y 100 cm de DAP (Figura 3).
Figura 3: Características de la especie Centrolobium tomentosum
Fuente: Ramalho y Botosso (2005)
El tronco es cilíndrico, recto. Las hojas son compuestas, imparipinadas, alternas, con 19 folíolos
irregularmente opuestos o alternos, ovado-lanceolados, base redonda u oblicua; ápice agudo a
obtuso, asimétrico y piloso ambos lados, siendo la cara inferior cubierta de pelos ferrugíneos
presentando puntuaciones resinífieras (Ramalho 2005).
Las flores tienen el cáliz castaño-oscuro-tormentoso y corola amarillo-anaranjada reunídas en
panícula terminal. La epidermis externa del ovario es uniseriada presentando tricomas secretores
y tectores (Siqueira y Oliveira 2000).
Fruto sámara; núcleo seminífero con acúleos tormentosos (Lima 1989, Vidal 1978). La
dispersión es anemócora. Los frutos portadores de frágiles espinos sobre el núcleo seminífero son
ocasionalmente transportados por pequeños roedores, que parecen apenas actuar como
predadores (Lima 1989). La geminación se desenvuelve más o menos sin presencia de luz.
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2.2. Desinfeccion del material vegetal
Explantes constituidos de segmentos nodales, provenientes de plántulas germinadas en el vivero
del municipio de San Miguel de Velasco a cargo de la Unidad Forestal de dicho municipio,
fueron introducidos a laboratorio. Todos los instrumentos utilizados para la manipulación del
material vegetal fueron esterilizados en una estufa a una temperatura de 180ºC, durante dos horas
y manteniendo la asepsia.
Los fragmentos de tallo fueron cortados midiendo aproximadamente 3 cm cada uno, portando
una sola yema axilar o apical. Seguidamente, se sometieron durante 30 minutos a un proceso de
desinfección con Benomyl a una concentración de 2 g/l y en agitación contínua. Inmediatamente,
y después de realizar tres enjuagues con agua destilada estéril, se sumergieron durante 60
segundos en etanol al 80%. Finalmente, los trozos de tallo se desinfectaron con hipoclorito de
sodio (NaClO) a una concentración de 2% durante 30 minutos, concluido el tiempo de inmersión
el material vegetal se lavó tres veces sucesivas con agua destilada estéril para luego ser
sumergidas en Gentamicina dentro de la cámara flujo laminar.
2.3. Pruebas de propagacion in vitro
Los experimentos estuvieron compuestos por las sales inorgánicas del medio basal propuesto por
Murashige y Skoog (MS, 1962) suplementado con relaciones de 0/0, 0/0.5, 0/1, 0.5/0 de Ácido
Giberélico (AG3) y Bencilaminopurina (BAP) respectivamente, Sacarosa al 3% y Ácido Cítrico
20ml/L. Luego de preparar la solución, el pH del medio de cultivo se ajustó a 5,6 (con KOH) una
vez agregando 10 ml a cada frasco y cubiertos con papel aluminio fueron al autoclave a 120ºC,
por 20 minutos para su esterilización.
En la cámara flujo laminar, en condiciones de asepsia, los explantes fueron seccionados a
aproximadamente 0.5 cm y sembrados in vitro en el medio basal líquido contenido en los frascos
y llevados al agitador a 78 rev/mit, con temperatura de 25 oC, fotoperiodo de 16 horas luz diarias
a una intensidad de 600 lux.
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Dos días después de la siembra del material y luego de cada 3 días, se efectuaron las evaluaciones
de los explantes hasta su cambio a medio fresco. Se evaluó mortandad (%), contaminación (%),
crecimiento del explante (expresado en mm y medido desde la base y el extremo del primordio
foliar más largo).
En todos los experimentos se realizó un diseño totalmente al azar, considerándose homogéneas
las condiciones del cultivo dentro del laboratorio, siendo los tratamientos la única fuente de
variación.
2.4. Determinacion del efecto de las fitohormonas en el crecimiento y desarrollo de las yemas de roble
2.4.1. Efecto del AG3 y Kinetin Utilizando el medio basal MS se realizaron los tratamientos con acido giberélico y Kinetin en
concentraciones de 0/0 (T1), 0/0.5 (T2), 0/1 (T3) y 0.5/0 (T4) respectivamente (Cuadro 1).
Cuadro 1: Ensayos de diferentes niveles de AG3 con Kinetin
KIN
AG3
0 ppm
0.5 ppm
1 ppm
0 ppm T1 T2 T3
0.5 ppm T4
El ensayo fue establecido según un diseño experimental con 4 tratamientos y 10 repeticiones,
siendo cada unidad experimental constituida de un frasco.
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2.4.2. Efecto del AG3 y BAP
Utilizando el medio basal MS se realizaron tratamientos con ácido giberélico (AG3) y
Bencilaminopurina (BAP) en concentraciones de 0/0 (Go), 0/0.5 (G1), 0/1 (G2), 0.1/0 (G3),
0.1/0.5 (G4), 0.1/1 (G5), 0.5/0 (G6), 0.5/0.5 (G7), 0.5/1 (G8) respectivamente (Cuadro 2).
Cuadro 2: Ensayos de diferentes niveles de AG3 con BAP BAP
AG3
0 ppm
0.5 ppm
1 ppm
0 ppm Go G1 G2
0.1 ppm G3 G4 G5
0.5 ppm G6 G7 G8
El ensayo fue establecido según un diseño experimental con 10 tratamientos y 4 repeticiones.
Cada frasco constituye una unidad experimental.
2.4.3. Efecto del IBA y BAP
Utilizando el medio basal MS se realizaron tratamientos con ácido indol-3-butírico (IBA) y
Bencilaminopurina (BAP) en concentraciones de 0/0 (Bo), 0.01/0.5 (B1), 0.1/0 (B2), 0.1/0.5
(B3), 0.1/2 (B4) respectivamente (Cuadro 3).
Cuadro 3: Ensayos de diferentes niveles de IBA con BAP
BAP
IBA
0 ppm
0.5 ppm
2 ppm
0 ppm Bo
0.01 ppm B1
0.1 ppm B2 B3 B4
1.5 ppm B5
El ensayo fue establecido según un diseño experimental con 6 tratamientos y 10 repeticiones.
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2.5. Determinación del efecto de las fitohormonas en el crecimiento y desarrollo de las yemas de tejeyeque
Utilizando el medio basal MS, suplementado con 30 g de sacarosa y 6 g/l de agar, se realizaron
los tratamientos con ácido giberélico (AG3) y Bencilaminopurina (BAP) en concentraciones de
0/0 (Mo), 0/0.1 (M1), 0/0.5 (M2), 0.3/0 (M3), 0.3/0.1 (M4), 0.3/0.5 (M5), 0.5/0 (M6), 0.5/0.1
(M7), 0.5/0.5 (M8) respectivamente (Cuadro 4).
Cuadro 4: Ensayos de diferentes niveles de AG3 con BAP BAP
AG3
0 ppm
0.1 ppm
0.5 ppm
0 ppm Mo M1 M2
0.3 ppm M3 M4 M5
0.5 ppm M6 M7 M8
Después de 55 días se tomaron datos de las variables altura de la planta (cm), número de hojas,
número de brotes y supervivencia (%). Se realizó en total 14 evaluaciones con intervalos de 4
días.
2.6. Multiplicación
A partir de los explantes más sanos y vigorosos, después de 55 días, se seleccionaron para luego
llevarlos a la cámara flujo laminar y ser seccionados nuevamente y sembrados en medios de
cultivo usando como gelificante agar (sigma chemical, Co.) a razón de 6 g/l. En esta fase se
realizaron nuevamente diferentes pruebas para determinar el medio adecuado.
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2.7. Análisis estadístico
En la totalidad de los experimentos se aplicó un diseño completamente al azar, para la lectura y la
evaluación de las variables, considerándose homogéneas las condiciones del cultivo dentro del
laboratorio y como única fuente de variación los tratamientos.
El análisis estadístico de los datos en las diferentes variables consistió en el análisis de varianza
(SC tipo III). Para detectar las diferencias significativas los análisis están con un alfa de 0.05
usando el comparador SNK.
El número de repeticiones utilizadas en cada experimento in vitro fue variable en cada grupo de
tratamientos según la combinación de hormonas a evaluar.
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3. Resultados y discusión
3.1. Fase de Introducción del roble (Amburana cearensis)
Debido a la alta tasa de contaminación de los explantes los tratamientos con suplementos de
IBA/BAP y AG3/BAP no fueron evaluados. La alta tasa de mortalidad obtenida se asocia a la
fenolización y a la actividad de agentes fúngicos y bacterianos. Las yemas apicales y axiales
mostraron ser muy vulnerables a la contaminación de virus y hongos debido al tamaño de los
explantes y al excesivo manipuleo en cámara (las ramas de las plántulas) son lignificadas y por lo
tanto de difícil corte.
Aunque al final de la evaluación no se obtuvieron explantes vivos se evaluó el porcentaje de
mortandad a los 129 días donde concluyó la evaluación. El tratamiento T1 con 0/0 de AG3/KIN
obtuvo un porcentaje de 78% de mortandad conteniendo esta cifra ya a los 90 días de evaluación;
el T2 con 0/0,5 de AG3/KIN con 90% de mortandad; el T3 con 0/1 de AG3/KIN con 55% de
mortandad a los 122 días y finalmente T4 con 0,5/0 de AG3/KIN con 89% de mortandad. La alta
tasa de mortandad se debió principalmente a la fenolización de los explantes (Figura 4).
(%) M ortandad
0
10
2030
40
5060
70
8090
100
3 7 11 17 25 35 39 40 47 66 73 80 84 88 90 104 122 129
Dias de evaluación
Mor
tand
ad (%
)
T1% T2% T3% T4%
Figura 4: Porcentaje de mortandad del roble en relación a los días de evaluación de los
tratamientos
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La contaminación de hongos se pudo observar a partir del tercer día de introducción. Teniendo
T1 el 22% de contaminación, T2 con 10%, T3 con 45% y T4 con 11%. La contaminación con
bacterias no se presentó en ninguno de los tratamientos (Figura 5). La contaminación a causa de
hongos se debió principalmente al tamaño del explante el cual presentó dificultad en la incisión
por la dureza de la epidermis.
Porcentaje de Contaminación
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
3 7 11 17 25 35 39 40 47 66 73 80 84 88 90 104 122 129
Dias de evaluacion
Con
tam
inac
ion
(%)
T1% T2% T3% T4%
Figura 5: Porcentaje de contaminación del roble en relación a los días de evaluación de los
tratamientos
Hernández (1997) encontró que el estado de desarrollo de la planta madre y la edad fisiológica
del explante, así como su tamaño, son de gran influencia en el éxito del cultivo in vitro. Mientras
más pequeño es el explante menor el riesgo de contaminación. Este principio ha sido utilizado
para la obtención de plantas libres de enfermedades. Pero esto se dificulta al proceder con la
incisión de las yemas debido a que las ramas del roble (Amburana cearensis) se lignifican desde
temprana edad y por lo tanto presentan consistencia dura.
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Por otro lado, la mayor parte de la muerte de los explantes fue, en su mayor parte, a causa de la
fenolización de los explantes. En la figura 6 se puede observar que el tratamiento T1 obtuvo 78%
de fenolización, T2 con 90%, T3 con 27% y T4 con 33% de fenolización. Cabe resaltar que
aunque algunos explantes mostraron síntomas de fenolización continuaron mostrando
crecimiento en los brotes, alcanzando un tamaño de aproximadamente 1,5 cm (Figura 1A). A
pesar de que el tratamiento T2 obtuvo el mayor porcentaje, los explantes del mismo se
mantuvieron vivos por más días.
Porcentaje de Fenolización
010
2030
405060
7080
90100
3 7 11 17 25 35 39 40 47 66 73 80 84 88 90 104 122 129
Días de evaluación
Feno
lizac
ión
(%)
T1% T2% T3% T4%
Figura 6: Porcentaje de fenolización del roble en relación a los días de evaluación de los
tratamientos
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3.2. Fase de establecimiento del tejeyeque (Centrolobium tomentosum)
Después de introducir en medio líquido, las yemas de tejeyeque fueron cultivadas in vitro
durante 55 días; los tratamientos M1 (0,1/0 de BAP/AG3), M4 (0,1/0,3 de BAP/AG3), M6 (0/0,5
de BAP/AG3), M7 (0,1/0,5 de BAP/AG3), y M8 (0,5/0,5 de BAP/AG3) presentaron crecimiento
de hasta 3 centímetros, el resto no mostró reacción a las hormonas (Cuadro 5).
Cuadro 5: Altura y número de hojas de los explantes cultivados en medio líquido
Tratamiento
Repetición
Altura de la
planta (cm)
Número de
hojas
M1 4 0,5 1
M4 2 1,2 1
M4 4 2,1 2
M6 1 1,9
M7 1 1 2
M8 2 3 2
Se puede observar un rápido crecimiento de la especie en los medios de cultivo. Este
comportamiento puede estar dado a que en el medio líquido es más fácil la absorción de los
nutrientes, hay una oxigenación constante y mejor intercambio gaseoso (Grapin 1998). En la
Figura 7 se describe el comportamiento de los explantes de tejeyeque, la velocidad de
crecimiento y el tiempo que tardaron en mostrar reacción a las hormonas.
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Figura 7: Crecimiento de los explantes durante los días de cultivo en medio líquido
Como se mencionó anteriormente, el mejor tratamiento es el M8 (0.5/0.5 de BAP/AG3) ya que
los explantes presentaron mayor crecimiento y vigorosidad. Este está seguido por el M4 (0,1/0,3
de BAP/AG3) y M6 (0/0,5 de BAP/AG3).
Figura 8: Desarrollo del tejeyeque en medio sólido
Se seleccionaron los explantes que
presentaron mayor tamaño y se
transplantaron a medio sólido (ver Figura 8),
donde no mostraron crecimiento significativo
excepto el tratamiento M8 (0.5/0.5 de
BAP/AG3) el cual presentó un brote de 4,5
centímetros de altura.
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En el análisis de Varianza (SC tipo III) de la contaminación de los medios, se encontró que no
hay diferencia significativa entre los tratamientos pero se concluye que el tratamiento M6 (0/0,5
de BAP/AG3). M7 (0,1/0,5 de BAP/AG3), y M8 (0.5/0.5 de BAP/G3) son los que resultaron
menos contaminados, seguido de los tratamientos Mo (0/0 de BAP/AG3), (M1 (0,1/0 de
BAP/AG3) y M4 (0,1/0,3 de BAP/AG3), siendo el tratamiento M3 (0/0,3 de BAP/AG3), el
tratamiento más contaminado (Figura 9).
Porcentaje de Contaminación
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 1 4 11 13 15 18 25 28 33 35 40 42 47
Días
Porc
enta
je (%
)
M0 M1 M2 M3 M4 M6 M7 M8Tratamientos:
Figura 9: Porcentaje de contaminación del tejeyeque en relación a los días de evaluación de los
tratamientos
La contaminación por hongos se debió principalmente por el tamaño del explante y por el
excesivo manipuleo dentro de la cámara flujo laminar. De acuerdo con Villalobos (1982), el
tamaño del explante es un factor importante que influye en la desinfección y regeneración de
plantas, a medida que el explante es más pequeño es menor el riesgo de contaminación y mas
fácil la regeneración, medidas que con el aumento del tamaño del explante es mayor el peligro de
contaminación y mas rápido el crecimiento y la regeneración de la planta.
En el análisis de Varianza (SC tipo III) de la fenolización de los explantes, se encontró que no
hay diferencia significativa entre los tratamientos pero se concluye que los tratamientos M6
(0/0,5 de BAP/AG3). M7 (0,1/0,5 de BAP/AG3), M8 (0.5/0.5 de BAP/AG3), M2 (0,5/0 de
23
BAP/AG3), M4 (0,1/0,3 de BAP/AG3), no presentaron fenolización; por el contrario, M3 (0/0,3
de BAP/AG3), mostró fenolización de los explantes, siendo los tratamientos Mo (0/0 de
BAP/AG3) y M1 (0,1/0 de BAP/AG3) los que presentaron mayor porcentaje (40%), como se
puede observar en la Figura 10.
Porcentaje de Fenolización
05
1015202530354045
0 1 4 11 13 15 18 25 28 33 35 40 42 47 50 55
Días
Por
cent
aje
(%)
M0 M1 M2 M3 M4 M6 M7 M8Tratamientos:
Figura 10: Porcentaje de fenolización del tejeyeque en relación a los días de evaluación de los
tratamientos
Otro factor que influyó en el desarrollo de los explantes fue el desarrollo de callos en la parte
basal, es decir, donde se produjo la incisión para introducirlos en los medios de cultivo. En el
análisis de Varianza (SC tipo III), y de acuerdo a la Figura 11, de la formación de callos en los
explantes, se encontró que no hay diferencia significativa entre los tratamientos pero se concluye
que los tratamientos M6 (0/0,5 de BAP/AG3) y Mo (0/0 de BAP/AG3) no presentaron formación
de callos; por el contrario, el resto de los explantes presentaron callos en un rango de porcentaje
de 20% a 60% siendo el mayor del tratamiento M1 (0,1/0 de BAP/AG3).
24
Figura 11: Porcentaje de formación de callos del tejeyeque en relación a los días de evaluación de
los tratamientos
Al finalizar la evaluación se observó gran desarrollo de dichos callos, midiendo así cada uno
hasta aproximadamente 0,8 mm de grosor. Luego de ser evaluados los explantes fueron
transplantados a medios de cultivo sólido para continuar con su desarrollo. Después de 31 días de
cultivo se midió la altura, número de hojas y número y altura de brotes según se observa en el
Cuadro 6.
Cuadro 6: Altura y número de hojas de los explantes cultivados en medio sólido
Tratamiento
Repetición
Altura de la
planta (cm)
Número de
hojas
Número de
brotes
Altura del
brote (cm)
M4 4 0,9 Brote
M6 1 1,9 1
M7 1 1,3 1
M8 2 5,7 6 1 4,5
Finalmente, con respecto al factor medio de cultivo (composición y suplementos de hormonas)
para el establecimiento in vitro, el análisis estadístico no mostró diferencias significativas entre
los tratamientos. Sin embargo, señala las combinaciones hormonales de las cuales se obtuvieron
mejores resultados, siendo la más efectiva la combinación 0,5/0,5 mg/l de BAP y AG3 logrando
incrementos de hasta 5,7 cm (Figura 2A).
25
4. Conclusiones
No se obtuvieron los resultados esperados en el establecimiento in vitro de Amburana cearensis
pues éste se dificulta por presentar crecimiento lento y alta tasa de contaminación y fenolización.
Por otro lado, se logró el establecimiento in vitro de Centrolobium tomentosum con
concentraciones de 0.5/0.5 de BAP y AG3 respectivamente, es decir el tratamiento M8.
El protocolo permite propagar tejeyeque a través del cultivo in vitro mediante segmentos nodales
con yemas apicales, siendo esta un medio útil para multiplicar la especie.
Los resultados demuestran que las yemas apicales de tejeyeque (Centrolobium tomentosum)
mostraron mayor crecimiento y menor porcentaje de contaminación. Por otro lado, se observó
que al introducir yemas axilares para el roble (Amburana cearensis) se obtuvieron mejores
resultados pues las yemas apicales demostraron ser sensibles a los tratamientos de desinfección y
posterior muerte en de los medios de cultivo durante la fase de establecimiento.
Las fases siguientes se encuentran siendo evaluadas en el laboratorio.
26
Agradecimientos Agradezco el apoyo financiero de FOMABO para la realización del presente estudio.
Al laboratorio de biotecnología BIOFAN, a la empresa Bosques Tropicales Bolivia S.A y a todas
las personas que hicieron posible la obtención del material vegetal para realizar la investigación.
27
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Amburana cearensis A.C. Smith. Sociedad Brasileira de Química (SBQ). Manaus,
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30
ANEXOS
Figura 1A: Tamaño de los explantes fenolizados de Amburana cearensis, roble
Figura 2A: Tamaño de los explantes después de 31 de ser cultivados en el tratamientos T6
31
Instrucciones para los autores de “Documento Científico” Proyecto FOMABO-PROINFOR El Documento Científico publica trabajos de investigación científico en español o inglés dentro de las áreas de manejo forestal y recursos naturales en general. Los trabajos necesitan ser realizados con docentes o/y estudiantes de ingeniería, postgrado, maestría o doctorado de las tres instituciones académicas involucradas: La Carrera de Ingeniería Forestal (UAGRM), La Escuela de Ciencias Forestales - ESFOR (UMSS) y La División Bosques y Paisaje (KU). Los trabajos que se presentan deben estar escritos a espacio y medio, en hojas tamaño carta (21 x 28 cm) con márgenes 2.5 cm en todos los lados, con justificación izquierda y usando una sola cara del papel. El trabajo no deben exceder 10.000 palabras (todo incluido). Los nombres científicos desde el rango de género deben ir con letra cursiva. Cada hoja presentada (incluyendo cuadros y figuras), debe numerarse en forma correlativa junto al nombre del autor en el margen superior derecho (tres o más autores figuran con “et al.” a continuación del primer autor). Las figuras, cuadros y leyendas respectivas deberán presentarse en hoja aparte al final del manuscrito; las fotografías deberán ser nítidas y de contraste; no deben exceder a 20 x 12 cm. Las unidades internacionalmente aceptadas son %, °C, mm, cm, ml, l, m, km, mg, g, kg, s, min, h, ha; para la referencia altitudinal se asigna m (p.e. 2.300 m). Serán rechazados los trabajos con excesivas faltas ortográficas y gramaticales así como con gráficos y mapas de baja resolución. Debe enviarse por correo electrónico una copia del texto y figuras/cuadros en formato Word para Windows o Excel. Estructura del Manuscrito para Artículo a) Primera página: Incluye título, nombre de los autores e institución(es) a la que pertenecían durante la realización el
trabajo y direcciones actuales (incluyendo fax y e-mail). El título debe ser informativo y preciso en relación al contenido del trabajo. Los autores que deseen utilizar apellidos paterno y materno, deberán unir ambos por un guión. Si hay varios autores, las direcciones respectivas son referidas por números correlativos indicados como superíndice al final de cada nombre. Debe indicarse a quien se enviará la correspondencia a través de un asterisco en superíndice (*).
Por ejemplo:
E. Ponce1,2,* y F. Helles1 1, *La División Bosques y Paisaje, Universidad de Copenhague, Rolighedsvej 23, DK-1958 Frederiksberg C., Dinamarca. Telf.: +45 3528 1754, Fax: +45 35282671, E-mail: [email protected] 2 Programa de Investigaciones Forestales (PROINFOR), Universidad Autónoma Gabriel Rene Moreno (UAGRM), El Vallecito, Carretera al Norte Km 8.5, Casilla Postal 6025, Telf./Fax: +591-3-3434363, Santa Cruz de la Sierra, Bolivia: E-mail: [email protected]
b) Resumen: Debe ser un informe conciso (no más de 300 palabras) de resultados y no una lista de temas cubiertos; por
lo que se recomienda incluir referencias cuantitativas de los resultados (porcentaje, rangos, entre otros) para ilustrar la generación de los resultados. Al pie de cada resumen deberán enunciarse hasta cinco palabras claves.
c) Abstract: Incluir el resumen del trabajo en inglés o (español si el trabajo está en inglés), además del título y cinco palabras clave.
d) Introducción: Debe presentar el problema dentro de un marco teórico y/o revisión bibliográfica que acompañe a la(s) hipótesis y/o objetivos(s) del trabajo. En este capitulo se realizara una síntesis e interpretación de la literatura relacionada directamente con el titulo y objetivos del trabajo.
e) Materiales y métodos: Debe describir el sitio de estudio. Puede incluirse aspectos relevantes de historia natural de las especies en estudio, si corresponde. Asimismo, debe incluir una descripción concisa, pero lo suficientemente clara como para permitir replicar el estudio. En los métodos empleados se deberá señalar claramente el procedimiento experimental o de recolección de datos y los métodos estadísticos.
g) Resultados y discusión: Se pueden presentar en texto, cuadros y/o figuras. En el texto debe indicarse la ubicación de los cuadros y figuras. Se deberá evitar tanto la repetición de detalles dados en otros capítulos, como la descripción de aquello que sea evidente al examinar los cuadros o figuras que se presenten. Por otro lado, se debe incluir la
32
interpretación de los resultados y su relación con otros trabajos publicados similares. En realidad, es un análisis crítico de los resultados de acuerdo con los objetivos y la hipótesis, si fuera el caso.
i) Conclusiones: Cada conclusión debe expresarse como una oración corta y clara. Deben dar respuesta a las hipótesis y/o a los objetivos planteados en la introducción.
j) Agradecimientos: Deben ser breves. Incluir a personas o instituciones, que contribuyeron con financiamiento u otro tipo e colaboración.
k) Referencias: Deben incluir sólo aquellas citadas en el manuscrito. Toda referencia bibliográfica es listada en orden alfabético (luego cronológico), como sigue:
Artículos en revistas Sekher, M., 2001. Organized participatory resource management: insights from community forestry practices in India.
Forestry Policy and Economics 3: 137-154. Gasana, J.K., 2002. The good and bad of projects. Tropical Forest Update. International Tropical Timber Organization
(ITTO). 12(2): 9-11. Libros, informes, tesis Pacheco, P., 2001. The role of forestry in poverty alleviation BOLIVIA. Forestry Department of the Food and
Agricultural Organization of the United Nations (FAO), La Paz, Bolivia. 55 p. Hansen, J.N. and Iversen, J.C., 2004. National forest law and indigenous forest management in the lowland of Bolivia.
Forest Management of Timber and Non-Timber Products in the Tropical Lowland of Bolivia (FOMABO), Santa Cruz, Bolivia. 16 p.
Artículos dentro un libro Oehlerich, A., 2000. Avances y propuestas para garantizar los derechos intelectuales de los pueblos indígenas. En: CPTI-
CIDOB, Atlas territorios indígenas en Bolivia, situación de las tierras comunitarias de origen y proceso de titulación. Centro de Planificación Territorial Indígena, Confederación de Pueblos Indígenas de Bolivia, Santa Cruz, Bolivia. p. 203-206.
Para citar las referencias en el texto, seguir en orden cronológico, como los siguientes ejemplos: … como lo sugieren varios autores (Pérez, 1983; Autino, 1994; Mendoza, 1994) … como lo indican Tarifa (1993), Acevedo & Ruiz (1995) y Pinto et al. (1996) … como fue confirmado recientemente por Pacheco & Pérez (1996), Zalles et al. (1999) … contrariamente a lo encontrado por Menotti (1978a, 1978b, 1998) … sin embargo, Beck & García (en prensa) … pero en algunos años florece en octubre (C. Mayto, 1996, com. pers.) Cada autor de correspondencia recibirá en archivo PDF la versión final publicada de su contribución. En el caso que los autores envíen manuscritos basados en tesis de grado, se recomienda que soliciten a PROINFOR instrucciones específicas y previas a su edición en formato de la Revista. Mayores informaciones: Responsable de la Editorial Juan Edgar Ponce C. Programa de Investigaciones Forestales (PROINFOR) Carrera de Ingeniería Forestal UAGRM El Vallecito, Carretera al Norte Km 8.5 Casilla Postal 6025, Santa Cruz de la Sierra, Bolivia Telf./fax: +591-3.3434363 E-mail: [email protected]
¿Que es PROINFOR?
El programa de investigaciones forestales (PROINFOR) se constituye en el brazo impulsor de la investigación en la Carrera de Ingeniería Forestal de la Universidad
Autónoma Gabriel Rene Moreno, para generar conocimientos científicos mediante la participación de docentes y estudiantes de la UAGRM y contribuir al alivio de la
pobreza y promover el desarrollo sostenible de los recursos forestales del país y de la región. Los objetivos de PROINFOR son: (1) Desarrollar programas de investigación
que contribuyan al conocimiento científico y tecnológico de los diferentes componentes, productos y utilización de recursos forestales, (2) Contribuir en el
manejo sostenible de los recursos forestales en todos los niveles de usuarios (comunidades rurales, empresas, pequeños, medianos y grandes propietarios de tierras forestales), (3) Difundir los resultados de la investigación y la puesta en conocimiento
para el desarrollo del sector, (4) Intercambiar el conocimiento científico con otros institutos de investigación en el ámbito regional, nacional e internacional, así como
con organizaciones interesadas en estos conocimientos. Las prioridades de investigación identificados por la Carrera de Ingeniería Forestal son: (1) Ecología
forestal, (2) Silvicultura y manejo de bosques naturales y plantaciones, (3) Forestería social, (4) Socio-economía forestal, (5) Productos de la madera, (6) Tecnología de
maderas, (7) Tecnología de accesorios, dispositivos y maquinaria forestal, (8) Manejo de cuencas hidrográficas, y (9) Difusión forestal
Contactos PROINFOR Universidad Autónoma “Gabriel René Moreno” (UAGRM) Facultad de Ciencias Agrícolas Carrera de Ingeniería Forestal “Vallecito”, Carretera al Norte Km. 8.5, Santa Cruz de la Sierra, Bolivia Telf./fax: +591 3 344 2553 E-mail: [email protected]
34
¿Que es el proyecto FOMABO?
El proyecto de mejoramiento de la capacidad de investigación “Manejo de bosques en Bolivia” (FOMABO) es una colaboración entre la UAGRM (Santa Cruz, Bolivia), la UMSS (Cochabamba, Bolivia) y la KU (Copenhague, Dinamarca). En su tercera fase (2007-2009), el proyecto esta operando con el objetivo de desarrollo de apoyar a la investigación y formación académica universitaria, enfocando en las necesidades de
desarrollo del sector forestal de Bolivia concernientes a manejo y planificación forestal. El trabajo esta organizado en tres componentes: (1) Fortalecimiento institucional y organizacional, (2) Colaboración en investigación científica, y (3) fortalecimiento
educacional. La visión de largo plazo del proyecto durante este periodo de 12 años es la de crear las capacidades necesarias de investigación y formación concernientes al manejo y planificación forestal sostenible, especialmente en relación con formas de manejo basadas en comunidades rurales locales y la utilización de especies arbóreas
valiosas produciendo madera y productos no maderables en áreas de manejo forestal natural, agroforestería y reforestación de áreas degradadas.
Contactos FOMABO-UAGRM Universidad Autónoma “Gabriel René Moreno” (UAGRM) Facultad de Ciencias Agrícolas Carrera de Ingeniería Forestal “Vallecito”, Carretera al Norte Km. 8.5, Santa Cruz de la Sierra, Bolivia Telf./fax: +591 3 344 2553 E-mail: [email protected]
FOMABO-UMSS Universidad Mayor de San Simón (UMSS) Facultad de Ciencias Agrícolas y Pecuarias (FCA y P) Escuela de Ciencias Forestales (ESFOR) Av. Atahuallpa (Final), Zona Temporal, Barrio Prefectural, Casilla 447, Cochabamba, Bolivia Telf./fax: +591-4 4451203 E-mail: [email protected]
FOMABO-KVL Universidad Real de Veterinaria y Agricultura (KVL) Centro Danés de Bosque, Paisaje y Manejo Rolighedsvej 23, 1958 Frederiksberg C., Copenhague, Dinamarca Telf.: +45 35 28 17 66 Fax: +45 35 28 15 08 E-mail: [email protected]
35
Publicaciones en la serie “Documento Científico” Proyecto FOMABO
2005 No 1. Ponce, E., 2005. Valoración de niveles de participación de las comunidades de la TCO
”Guarayos”, Bolivia, en actividades de manejo forestal sostenible. Documento Científico Proyecto FOMABO no. 1 - 2005. Proyecto FOMABO, Santa Cruz, Bolivia.
No 2. Ponce, E., 2005. El proceso de desarrollo curricular en la carrera de Ingeniería Forestal de la Universidad Autónoma “Gabriel Rene Moreno” Santa Cruz, Bolivia. Documento Científico Proyecto FOMABO no. 2 - 2005. Proyecto FOMABO, Santa Cruz, Bolivia.
No 3. Ponce, E., 2005. Análisis multicriterio para la planificación de caminos de bajo impacto en la concesión forestal “Lago Rey” Santa Cruz, Bolivia. Documento Científico Proyecto FOMABO no. 3 - 2005. Proyecto FOMABO, Santa Cruz, Bolivia.
2006 No 1. Ponce, E., 2006. Sostenibilidad del manejo de los bosques secos tropicales de Bolivia
aplicando múltiples objetivos. Documento Científico Proyecto FOMABO no. 1 - 2006. Proyecto FOMABO, Santa Cruz, Bolivia.
No 2. Sandoval, E., 2006. Ensayo de longevidad de semillas de quebracho blanco. Documento
Científico Proyecto FOMABO no. 2 - 2006. Proyecto FOMABO, Santa Cruz, Bolivia. No 3. Sandoval, E., 2006. Consideraciones económicas sobre plantaciones de Serebó. Documento
Científico Proyecto FOMABO no. 3 - 2006. Proyecto FOMABO, Santa Cruz, Bolivia.