Determinación de patógenos en

Alimentos por Biología Molecular

Hugo Mingo Agilent Technologies

Jesús García Microbial System

Introducción a la PCR

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Se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas

Las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína,,

Polimerasas de m.o

Thermus aquaticus (polimerasaTaq) Pyrococcus furiosus (Pfu) Thermococcus litoralis (Vent) Thermus termophilus (Tth).

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Introducción a la PCR

Los 7 componentes de una PCR: http://genomics.agilent.com/ 1-Los 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN. 2-Dos cebadores o iniciadores (primers), oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre 6 y 40 nucleotidos. Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia ,definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.

-Cada cebador debe integrar entre 18 y 24 bases. Los cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy específica, y los que se excedan en longitud harán que perdamos rendimiento en la reacción. -La proporción entre bases púricas y pirimidínicas sea 1:1 (40-60% a lo sumo), y que empiecen y terminen con 1 ó 2 bases púricas. -Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean complementarias entre sí, o se formarán dímeros entre ellos.

http://eu.idtdna.com/Home/Home.aspx 3-Se suele usar magnesio (Mg2+) Cofactores de la polimerasa. 4-Una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. 5-ADN polimerasa 6- ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar. 7-Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.

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PCR; 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 3 pasos a diferentes temperaturas.

Inicio 94-96 °C 1-9 minutos Desnaturalización(94-95 °C) 60 seg La temperatura depende: de la proporción de G+C y longitud de la hebra Alineamiento40-68 °C durante 20-40 segundos El cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde.. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde.. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada. Elongación El tiempo de extensión depende + ADN polimerasa +Longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. **A la temperatura óptima la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto…… polimerasa Taq 75-80 °C Elongación final 70-74 °C 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR.

-Electroforesis en gel de agarosa……fragmentos grandes -Gel de acrilamida……………………...fragmentos pequeños *Marcador de peso molecular

Introducción a la PCR

Introducción a la PCR

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PCR a tiempo real: introducción

Técnica de alta sensibilidad que permite la detección y cuantificación de un producto de PCR en tiempo real.

Amplio rango de aplicaciones: análisis de expresión génica, determinación de carga viral, determinación de GMOs, genotipado de SNPs

Basada en el uso de fluoróforos (termociclador)

light light

SYBR Green I™,

EvaGreen,

LCGreen, SYTO9

TaqMan®

Molecular Beacons

Sondas FRET

Colorantes que se unen al ADN

Sondas específicas marcadas

Taq

Taq

Real-time PCR Detección de productos

SYBR Green: Se une al surco menor del ADN de doble cadena

Fluorescencia muy baja cuando no está unido

1000x cuando se une al ADN

Ventaja: analizar muchos genes Desventaja: poca especificidad

Real-time PCR Colorantes – SYBR Green

unbound probe free in solution

Light emission

Light

energy transfer

Taq

Reporterdye

Acceptordye (Quencher)

Taq

Light emission Light

Sondas específica con fluoróforo y quencher . Desventaja: diseñar una sonda para cada target Ventajas: alta especificidad Permite multiplex: varios target en la misma reacción

Real-time PCR Sondas específicas – Taqman

Estructura de pinza Fluorescencia cuando anilla con el molde

Real-time PCR Sondas específicas – Molecular Beacons

Dos sondas que hibridan próximas Suelen llevar fluoróforos compatibles solo con algunos equipos

Real-time PCR Sondas específicas – Sondas FRET fluorescence resonance energy transfer

Fluoróforo donante

Fluoróforo aceptor

Excitación Emisión Transferencia

Real-time PCR Resumen fluoróforos

Fluoróforo Excitación máxima (nm)

Emisión máxima (nm)

Oregon Green 492 517

FAM 494 518

SYBR Green 494 521

TET 521 538

JOE 520 548

VIC 538 552

HEX 535 553

Cy3 552 570

ROX 587 607

Cy5 643 667

Texas Red 596 615

Amplia variedad de fluoróforos, permite multiplex Compatibles con el equipo y espectros de emisión distintos

Real-time PCR Términos básicos

Línea base: nivel de ruido de los primero ciclos donde no hay incremento detectable de la fluorescencia. Treshold: determinado valor de fluorescencia en la región exponencial de la curva de amplificación Treshold cycle (Ct): ciclo en el que la curva de amplificación alcanza el treshold. Permite calcular el material inicial de partida Señal reporter: señal fluorescente generada por el fluoróforo durante la reacción. Señal normalizada (Rn): intensidad la señal reporter dividida entre la señal del colorante de referencia pasivo

June, 2008 Page 14

Real-time PCR Métodos

Múltiples aplicaciones:

• Partiendo de ARN (valorar niveles de expresión, carga viral…) El ARN se transcribe a cADN RT-PCR en 2 pasos RT-PCR en 1 paso Varias PCRs a partir de una RT Manipulación más simple Flexibilidad en los primer para la RT Rápido Almacenamiento de cADN Bajo riesgo contaminación

•Partiendo de ADN (detección de patógenos, GMOs, genotipado SNPs)

Real-time PCR Tipos de cuantificación

PCR convencional: la mayoría de reacciones habrán alcanzado la fase de plato de la amplificación. Real-time PCR nos asegura estar en la fase exponencial. Tipos de cuantificación: Absoluta: determinamos la cantidad total del gen de interés, expresado en valores de número de copia o concentración Relativa: determinaremos una relación entre la cantidad del gen de interés respecto a un gen endógeno de referencia.

Real-time PCR Cuantificación absoluta

Standard curve

R2 = 0.999

Slope = -3.366

Amplification efficiency = 98.2%

Real-time PCR Cuantificación relativa

Gen endógeno de referencia: su expresión no varía entre las distintas condiciones experimentales (genes housekeeping: β-actina, 18s RNA…)

Método ∆∆Ct de cuantificación relativa: ∆Ct (muestra problema)= Ct gen target- Ct gen referencia ∆Ct (calibrador)= Ct gen target- Ct gen referencia ∆∆Ct= ∆Ct (muestra problema)- ∆Ct (calibrador) Nivel de expresión= 2 ∆∆Ct

The Stratagene Mx Platform es una plataforma flexible, tanto a nivel de fluoróforos con de aplicaciones.

Real-time PCR Instrumentos

Hardware Specifications • Quartz tungsten-halogen lamp

• 1 PMT detector

• 2 customizable filter wheels

• 350-750nm excitation

• 350-700nm emission

• 14” (33cm) W x 20” (46) D x 18” (43) H

• 45 pounds (20.4 kilograms)

Thermal system

Hot top

Tungsten/Halogen Lamp

Emission filter wheel

Excitation filter wheel

Fiber optic cable and scanning arm

Real-time PCR Instrumentos

Mx3000P/Mx3005P

Real-time PCR Instrumentation

Más de 10 años de experiencia en instrumentos de real-time QPCR

Posibilidad de elegir la configuración de filtros que necesitas.

Sistema de excitación: lámpara halógena Sistema óptica que escanea pocillo a pocillo

Placa de 96 pocillos

4 colores (Mx3000P™) or 5 colores (Mx3005P™) Sistema de detección: PMT

Recuperación de datos en caso de fallo en el ordenador

Real-time PCR Instrumentos – Sistema térmico

• Uniformidad de temperatura:

(+/- 0.25°C @ 72°C).

• Sistema térmico Peltier

• Rampa de temperatura: hasta 2.5°C/s

• Hot Top.

Mx3005

others

Variation of amplicon Tm Herrmann et al., Clin. Chem. 52 (2006) and 53 (2007)

Real-time PCR Instrumentos - Óptica

Halogen lamp Excitation range 350-750 nm

Excitation filter wheel 4 or 5 filters

Fibre optics cable

Emission filter wheel 4 or 5 filters

Photomultiplier Highly sensitive detection of fluorescence

Optics • Excitation

–Quartz-tungsten halogen

–Range of 350-750nM

– 4 or 5 filter sets

• Emission

– Photomultiplier tube (PMT)

–Range of 350-700nm detection

– Filters before the PMT blocks cross-talk

hν

e-

Asynchronous (scanning)

Constant intensity (No positional effects)

Simultaneous (CCD)

Intensity depends on well position

Lamp

Higher intensity

lower intensity

3.5 s scanning time per dye

Escaneado vs. iluminación y detección

Alx350 FAM

TET HEX

JOE ROX Cy5 Cy3

TAM TxRd

Excitation range: 350 to 750 nm Emission range: 350 to 700 nm

Standard filter set on Mx3000P® Standard filter set on Mx3005P®

Elige la combinación de filtros que necesites!

Atto425

Real-time PCR Instrumentos – Fluoróforos detectados

• Software para el manejo del equipo y

tratamiento y análisis de datos.

• Intuitivo, fácil de usar, incluso para

nuevos usuarios de QPCR.

• Se pueden ver y analizar datos en

tiempo real.

• Se pueden exportar gráficos a Excel &

PowerPoint, en formato de texto y

también las imágenes

• MEA Multiple experiment análisis:

analizar varias carreras en un único

proyecto.

MxPro™ QPCR Software

MxPro Software: flexible y fácil de usar

Utilization of the Stratagene Mx3000P QPCR System for the Detection and

Quantification of Mycotoxigenic Fungi

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Standard curves generated for Aspergillus, Penicillium,

and Fusarium.

A mixture of DNA from A. flavus, P. chrysogenum, and F. verticilliodes

was serially diluted 10-fold and analyzed by the genus-specific multiplex

real-time PCR. The initial DNA concentration was 10 ng/μl for A. flavus,

P. chrysogenum, and F. verticillioides.

Analysis of stored distiller’s grain (DG) by multiplex real-time qPCR assay.

Fish Identification Methods

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• Objective results

• More resistant to sample processing

• Easy to perform

• High specificity/sensitivity

DNA-based methods

Sequencing High initial investment (> 100K $)

High maintenance costs

Not usable with mixed samples

Method of choice for new species

PCR-RFLP Discrimination of highly

related species

Works with mixtures

Low initial setup costs

Fish Identification Kit - Workflow

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Sample

purification

< 1 h (depends on # samples)

Amplification of

species ID target

~ 1.5 h

Generation of species

specific patterns

~2.5 h

< 1 h (depending on # samples)

Pattern analysis

using RFLP Decoder Software

~ 6 h from sample to result