DETERMINACION DE BACILLUS CEREUS EN AVENA

Técnica de Recuento en Placa

INTRODUCCIÓN:

BAM: Manual Analítico Bacteriológico de la FDA (Agencia de alimentos y medicamentos)La técnica a seguir para la determinación de Bacillus Cereus es la de Recuento en placa que se encuentra en la 8va Edición del BAM de acuerdo al Método de sedimentación en agar.

EQUIPOS Y MATERIALES

Placas de Petri (15 x 100 mm)

MicroscopioBastidor de tubos

Tubos de ensayoPipetas 1 ml

estériles

Asas de siembra

Matraces Erlenmeyer

Estufa Vortex mezcladorIncubadora

(30 ± 2 ° C y 35 ± 2 ° C)

Contador de colonias Quemador BunsenHomogeneizador

Autoclave

MEDIO DE CULTIVOAgar manitol yema de huevo con polimixina( Mannitol - Egg – Yolk –Polymyxine AGAR: MYP)

Emulsión estéril de yema de huevo

COMPOSICION

CONCENTRACION DEL MEDIO

Peptona

10g/L

Extracto de carne 1g/L

D-manitol

10g/L

Cloruro sódico

10g/L

Rojo fenol

0,025g/L

Agar

15g/L

1 vial de Polimixina B

Preparación del Agar MYP

Pesar 21,5 g de Agar MYP

Agitar hasta ebullición

Disolver el Agar con 450ml de agua destilada

1 2

4

Calentar el agar

3

Distribuir la mezcla en un matraz y taponear con algodón

5 6

Esterilizar en autoclave a 121 ºC (15 psi) por 15 min

Agregar 50 ml de la emulsión estéril de yema de huevo y el contenido de 1 vial de Polimixina B

Verter 15 – 20ml en placas estériles y dejar solidificar

Enfriar a 45 – 50ºC en una cubeta

Almacenar las placas en bolsas de plástico a 2-8ºC

78

910

Preparación del diluyente buffer fosfato Butterfield( solución stock BPW)

1. Disolver 34 g de KH2PO4 en 500 mL de agua destilada

2. Ajustar el pH a 7.2 con NaOH 1N3. Llevar al volumen de 1 L con agua destilada

4. Esterilizar por 15 minutos a 121°C

5. Almacenar en refrigeración

6. Tomar 1.25 mL de esta solución y llevar a 1 litro con agua destilada

PREPARACION DE LA MUESTRA

10 g de avena en 90 ml de buffer fosfato de Butterfield (dilución 1/10)

Homogeneizar diluyente por 2 min a 2500 rpm

12

Realizar diluciones sucesivas tomando 1 ml de la dilución 1/10 y descargándolo en un tubo que contenga 9 ml de diluyente, hasta la dilución 10 - 6

3

Mezclar cada dilución en agitador

TÉCNICA DE RECUENTO EN PLACA

Sembrar 0,1 ml de cada dilución por duplicado en la superficie de

placas de agar MYP

1

Incubar a 30°C por 24 h

2

3

Diseminar el inoculo con una asa formando estrías

Formación de colonias rosadas rodeadas de una zona de precipitación (producción de lecitinasa)

Seleccionar las placas que contienen entre 15 - 150 colonias típicas rosadas con producción de lecitinasa

4

5

Picar 5 ó más de las colonias típicas aisladas y transferir a una estría de agar nutritivo para confirmación. Incubar 30 °C por 24h

6

EJEMPLO Teniendo en cuenta que debes seleccionar las placas que contienes entre 15 – 150 colonias .Supongamos:

En la dilución 10-4 se encontraron placas de 100 y 80 colonias, las cuales están en el rango. Luego se hace un promedio entre las colonias de ambas placas obteniendo como resultado 90 colonias.

UFC/alicuota = 90 UFC/ 0.1mL = 900 UFC/ mL UFC*(inversa del factor de dilución) = 900 * 104 = 9*106 UFC/mL de la muestra