1    

   

Detectores  en  cromatografía  de  líquidos  (espectrométricos,  fluorescencia,  refractómetro,  dispersión  de  luz)  

     

1. Introducción                                                                                                                    1  2. Detectores                                                                                                                      2  

     2.1  Características  generales  de  un  detector                                                    3  3. Detectores  en  cromatografía  de  líquidos.  Clasificación                                        4  4. Detectores  espectrométricos  

4.1 Detector  UV-­‐Vis                                                                                            5  4.2 Detector  UV  onda  fija                                                                                5  4.3 Detector  onda  variable                                                                              7  4.4 Detector  de  ordenamiento  de  diodos                                                    7  

5. Detector  de  fluorescencia                                                                                            8  6. Detector  de  índice  de  refracción                                                                            10  

     6.1        Detector  IR-­‐Fresnel                                                                                    11        6.2        Detector  de  deflexión                                                                              11        6.3        Detector  interferométrico                                                                          11  

     7.    Detector  de  dispersión  de  luz                                                                                  12        8.    Incertidumbre  en  los  detectores  IR,  UV,  Fluorescencia                                      13        9.    Sistema  de  toma  y  procesamiento  de  datos                                                        13        10.  Aplicaciones.  Artículo                                                                                                  14        11.  Conclusiones                                                                                                                17        12.  Bibliografía                                                                                                                    17        1.  Introducción    El   detector   es   el   módulo   del   cromatógrafo   de   líquidos,   situado   a   la   salida   de   la   columna,   que  proporcionna   de   forma   continua   información   acerca   de   la   composición   del   flujo   que   circula   a  través  de  él.  Generalmente  origina  una  señal  eléctrica  continua,  que  debidamente  amplificada  y  registrada,  constituye  el  denominado  cromatograma,  del  que  se  extrae  información  cuantitativa  y  cualitativa  de   la  muestra   inyectada.   La   existencia  de  un  detector  on-­‐line   eleva   a   la   categoría  de  instrumento  al  cromatógrafo  de  líquidos.  

Uno  de   los   factores  que  han   influido  en  el   retraso  del  desarrollo  de   la   cromatografía  de  líquidos  con  respecto  a  la  cromatografía  de  gases  está  relacionado  con  el  sistema  de  detección.  Las  concentraciones  bajas  de  un  soluto  no  modifican  sustancialmente   las  características   físicas  de   la  porción   de   fase  móvil   que   lo   contiene   (por   ejemplo   densidad,   constante   dieléctrica   etc.)   y   son  indistinguibles  respecto  a  variaciones  producidas  por  el  caudal  y  la  temperatura,  mientras  que  en  cromatografía  de  gases  pequeñas  concentraciones  de  un  vapor  en  un  gas  modifican  críticamente    las  propiedades  del  mismo.  No  existe  en   la  actualidad  un  detector  en   cromatografía  de   líquidos  equivalente   al   detector   de   ionización   de   llama   en   cromatografía   de   gases.   Otra   diferencia  importante  entre  los  sistemas  de  detección  usandos  en  líquidos  y  gases  consiste  en  que  se  trata  de  adaptaciones  a   la  situación  dinámica  de  principios   instrumentales  ampliamente  desarrollados  en  

2    

instrumentos  (fotómetros,  fluorímetros,  polarógrafos  etc.)  mediante  el  empleo  de  celdas  de  flujo,  mientras  que  los  empleados  en  cromatografía  de  gases  tienen  en  general  una  concepción  y  diseño  distintos   a   los   instrumentos   convencionales.   Un   aspecto   a   resaltar   es   la   tendencia   a   incorporar  sistemas   de   detección   continua   tal   es   el   caso   como   el   espectrómetro   de  masas,   RMN,   técnicas  espectroscópicas  atómicas,  etc.    2.  Detectores    El  detector  es  la  parte  del  equipo  cromatográfico  que  permite  “ver”  y  ubicar  en  tiempo  y  espacio  la  posición  de  cada  componente  de  una  muestra  a  la  salida  de  la  columna  cromatográfica.  Se  trata  del   módulo   del   cromatógrafo   de   líquidos,   situado   a   la   salida   de   la   columna,   que   proporciona  información  de  forma  continua  acerca  de  la  composición  del  flujo  que  circula  a  través  de  él.    

 Fig   1.   Producción   de   artículos   de   cromatografía   de   líquidos   con   diferentes   detectores   (gráfico  obtenido  por  medio  de  la  base  de  datos  www.scopus.com)    

Dependiendo  del  propósito   final  de   la   cromatografía   se  habla  de   cromatografía  analítica  cuando   solo   se  pretende   conocer   y   cuantificar   los   componentes  de  una  muestra.   En   cambio,   se  habla   de   cromatografía   preparativa   cuando   la   técnica   aplicada   permite,   además   de   conocer   y  cuantificar   los   componentes  de   la  muestra,   separarlos   físicamente.   La  modalidad  preparativa  no  permite  el  uso  de  detectores  destructivos,  mientras  que  estos  están  permitidos  en   la  modalidad  analítica  (Sogorb  Sánchez  et.  al  2004).  

A   diferencia   de   la   cromatografía   de   gases,   en   la   cromatografía   de   líquidos   no   hay  detectores  tan  aplicables  universalmente  ni  tan  fiables  como  los  detectores  de  ionización  de  flama  y   de   conductividad   eléctrica.   Uno   de   los  mayores   retos   en   el   desarrollo   de   la   cromatografía   de  líquidos  ha  sido  el  perfeccionamiento  de  los  detectores.  En  la  fig.  1  se  muestra  el  incremento  con  respecto   al   tiempo   de   publicaciones   que   utilizan   algunos   detectores   comúnmente   utilizados   en  cromatografía  de  líquidos.    2.1  Características  generales  de  un  detector    

0  

100  

200  

300  

400  

500  

600  

700  

800  

1976  1980  1984  1988  1992  1996  2000  2004  2008  2012  

Núm

ero  de

 pub

licacione

s  

Año  de  publicación  

Detección  UV  

Detección  fluorescencia  

Detección  Índice  de  refracción  

Detección  dispersión  de  luz  

3    

Las  características  ideales  que  debe  poseer  un  detector  continuo  empleado  para  HPLC  se  resume  a  continuación:    

§ Adecuada   sensibilidad.   Aquello   que   constituye   una   adecuada   sensibilidad   no   puede  evaluarse  de  forma  cuantitativa.  Aunque  todos  se  utilizan  extensamente  y  son  adecuados  en  ciertos  casos,  sin  embargo,  los  menos  sensibles  no  resultan  convenientes  para  algunas  aplicaciones.  En  general,  las  sensibilidades  de  los  detectores  se  encuentran  en  el  intervalo  de  10-­‐15  a  10-­‐8  g  de  soluto/s.  

§ Buena  estabilidad  y  reproducibilidad  § Respuesta  lineal  para  los  solutos  que  se  extienda  a  varios  órdenes  de  magnitud    § Tiempo  de  respuesta  corto  que  sea  independiente  del  caudal  § Alta  fiabilidad  y  manejo  sencillo.  Hasta  el  punto  de  que  el  detector  debería  estar  a  prueba  

de  la  impericia  de  operadores  inexpertos  § Respuesta   semejante  para   todos   los   solutos,  por  el   contrario,  una   respuesta   selectiva  y  

altamente  predecible  para  uno  o  más  tipo  de  solutos  § Volumen   interno   mínimo   a   fin   de   reducir   el   ensanchamiento   de   la   banda   y   no   es  

necesario  que  sea  sensible  en  un   intervalo  tan  grande  de  temperaturas,  como  es  el  caso  de  los  detectores  para  cromatografía  de  gases.  

§ Insensible   a   cambios   ambientales:   presión,   caudal,   temperatura,   etc.   Es   importante  también  que  sea  insensible  al  cambio  de  composición  de  la  fase  móvil  en  la  modalidad  no  isocrática  

§ Operación   continua   durante   largo   tiempo   y   su   empleo   debe   ser   fácil   y   cómodo   para   el  analista  

§ Automatización.   Su   funcionamiento   debe   ser   asequible   a   la   automatización   para  incorporarlo  a  los  instumentos  CLAR  comandados  por  un  único  microprocesador.  

 Para  evitar  que  se  ensanchen   los  picos,  el  volumen  del  detector  debe  ser  menor  que  el  20%  

del  volumen  de  la  banda  cromatografica.  Las  burbujas  que  puedan  existir  en  el  detector  producen  ruido,   y   por   eso   se   debe   aplicar   una   contrapresión   al   detector,   para   impedir   que   se   formen  durante  la  despresurización  del  eluyente  (Harris,  Daniel  C.  2001).  

Los  errores  más  comunes  que  surgen  de  la  detección  se  refieren  a  la  falta  de  estabilidad,  sensibilidad  o  linealidad.  Estos  problemas  son  poco  frecuentes  con  los  detectores  UV  debido  a  la  simplicidad  de  la  detección  ultravioleta  y  al  desarrollo  que  los  mismos  han  experimentado.  A  pesar  de   ello,   estos   factores   deben   estudiarse   adecuadamente,   especialmente   si   se   desean   analizar  trazas.  La  linealidad,  o  rango  lineal,  es  una  condición  imprescindible  en  todo  método  cuantitativo  en  el  cual  se  calcula  la  concentración  de  analito  en  la  muestra  comparándola  con  un  solo  estándar.  

En  general  la  falta  de  linealidad  se  soluciona  reduciendo  la  masa  de  soluto  inyectado.  Sin  embargo,   es   posible   operar   con   sistemas   no   lineales   siempre   y   cuando   se   utilice   una   curva   de  calibración  como  referencia  cada  vez  que  se  realice  el  análisis.  

 3.  Detectores  en  cromatografía  de  líquidos.  Clasificación    

Los   detectores   en   cromatografía   de   líquidos   son   de   dos   tipos   básicos.   Una   serie   de  clasificaciones  de  los  detectores  según  diferentes  criterios  y  aspectos  de  la  detección  se  encuentra  en   la  tabla  1.  La  distinción  generalmente  más  empleada  diferencia  dos  grupos  de  detectores,   los  que   se   basan   en   la  medida   de   una   propiedad   de   la   disolución   responden   a   una   propiedad   del  efluente,  tal  como  el  índice  de  refracción,  la  constante  dieléctrica,  o  la  densidad,  que  se  modifica  por  la  presencia  de  analitos.  Por  el  contrario,  los  detectores  basados  en  una  propiedad  del  soluto  

4    

responden  a  alguna  de  las  propiedades  del  soluto,  como  la  absorbancia  en  el  UV,  fluorescencia,  o  corriente  límite,  que  no  son  inherentes  a  la  fase  móvil.    

Los  principales  detectores  a  tener  en  cuenta  en  cromatografía  de  líquidos  se  muestran  en  la   tabla   2,   de   los   cuales   los   detectores   ultravioleta-­‐visible,   fluorescencia,   índice   de   refracción   y  electroquímicos   son   los  más   comunes.   En   la  mayoría   de   los  métodos   relacionados   con   HPLC   el  detector  utilizado  es  el  detector  de  absorbancia  UV-­‐Vis  de  longitud  de  onda  variable  o  de  diodos  (DAD).   Este   hecho   se   debe   a   que   éste   detector,   tiene   la   mejor   combinación   de   sensibilidad,  versatilidad   y   fiabilidad..   Sin   embargo   en   el   caso   de   especiación   orgranometálica,   se   pueden  emplear  distintas  técnicas  espectrométricas  atómicas  como  detectores  y  en  muchas  ocasiones  se  utilizan  técnicas  de  derivatización  para  aumentar  el  grado  de  detectabilidad  en  absorción  en  UV-­‐Vis,  fluorescencia  o  electroquímcia  (Reyes  &  Walton,  2003)    

   

Tabla  1.  Clasificación  de  los  detectores  empleados  en  cromatografía  de  líquidos  .  

Según  el  tipo  de  medida   Absoluta  (Solute  property)  Relativa  (Bulk  property)  

Según  propiedad  general  del  soluto   Detectores  de  concentración  Detectores  de  masa  

Según  generalidad  de  la  respuesta   Universal  Selectivo  

Según  el  tipo  de  salida  de  señal  Normal  Integral  

Diferencial    

   Tabla  2.  Detectores  más  comunes  en  HPLC  

 Espectrométricos  

Detector  de  absorción  UV-­‐Vis        Detector  de  longitud  de  onda  fija  UV        Detector  de  onda  variable  UV        Detector  de  fotodiodos  en  serie  (DAD)  

Detector  de  fluorescencia  Detector  de  espectrometría  de  masas  

Electroquímicos      Detector  electroquímico  (ECD)      Detector  amperométrico      Detector  potenciométirco      Detector  culombimétrico      Detector  conductimétrico  

Otros  Detector  de  índice  de  refracción  

Detector  de  dispersión  de  luz        

También  uno  de   los  detectores    más  populares   de   todos   es   el   detector   de  absorción   UV-­‐Vis,   aunque   su   uso   esta  limitado  porque  no  es  un  detector  universal.  Por   el   contrario,   el   detector   de  espectrometría   de  masas   si   es   universal   por  lo   que   se   está   utilizando   cada   vez   más  aunque   todavía   es   caro   su   mantenimiento.  Del  detector  utilizado  dependen  la  exactitud,  la   precisión   y   el   límite   de   detección  conseguidos   en   la   separación   de   distintos  componentes  (Gómez.  &  Valcárcel,  1988).    

     

5    

4.   Detectores  espectrométricos    La  detección  en  cromatografía  de  líquidos  en  su  mayoría  se  lleva  acabo  en  celdas  de  flujo  en  forma  de   “Z”.   La   miniaturización   de   la   celda   de   flujo   de   detección,   en   HPLC,   disminuye   el   volumen  interno,  lo  que  implica  que  disminuye  la  dispersión  de  los  analitos  y  favorece  el  estrechamiento  de  las  zonas  en  que  se  encuentran  una  vez  separados:  los  picos  cromatográficos  son  más  estrechos  y  menos   solapados   entre   sí   (Valcárcel   &   Cárdenas,   2000).   En   su   mayoría   los   detectores   de  absorbancia  son  dispositivos  de  doble  haz,  en  los  que  uno  de  los  haces  pasa  por  la  celda  de  flujo  y  el  otro  a   través  de  un   filtro.  En  cualquier  caso,  el  cromatograma  consiste  en  una  representación  del  logaritmo  del  cociente  de  las  dos  señales  detectadas  en  función  del  tiempo  (Skoog,  2001).    4.1   Detector  UV-­‐Vis    Es  el  detector  más  empleado  en  HPLC.  Posee  buena  sensibilidad  y  rango  lineal,  y  permite  detectar  analitos  en  el  orden  de   los  nanogramos.  No  es  destructivo  y  puede  emplearse  con  gradiente  de  disolventes,   con   la   única   limitación   de   que   éstos   sean   transparentes   en   la   longitud   de   trabajo  (Skoog,  2001).  En  general  permiten  cambiar  el  volumen  de  su  celda,  típicamente  con  volúmenes  de   1   a   12  mL.   Es   un   detector  muy   poco   sensible   a   los   cambios   de   caudal   y   de   temperatura.   El  detector  UV  opera  en  el  rango  de  190  a  350  nm,  y  suele  extenderse  a  la  zona  visible  del  espectro  350-­‐700   nm   recibiendo   así   el   nombre   de   detector   UV-­‐Vis.   La   concentración   del   analito   en   la  muestra  se  determina  por  la  aplicación  de  la  ley  de  Beer  A=abc,  donde  A  es  la  absorbancia,  a  es  la  absortividad   molar   del   analito,   b   es   el   camino   óptico   de   la   celda   medido   en   cm   y   c   es   la  concentración  del  analito  en  la  muestra  expresado  en  mol/L.  

Existen  dos  tipos  de  detectores  UV:  los  detectores  de  onda  fija  y  los  de  longitud  de  onda  variable  (Skoog,  2001).  

 4.2   Detector  UV  onda  fija    Este  detector  opera  a  longitudes  de  onda  prefijadas,  determinadas  por  las  líneas  de  emisión  de  su  lámpara,   habitualmente   de   mercurio   de   baja   presión.   Como   longitudes   de   onda   de   trabajo   se  utilizan  las  bandas  de  emisión  de  la  lámpara  de  mercurio,  especialmente  la  fuerte  línea  de  254  nm.     El   verdadero   monocromador   del   instrumento   es   la   propia   emisión   de   la   lámpara   pero,  para  eliminar  líneas  de  otras  longitudes  de  onda  lejanas  a  la  línea  de  trabajo  se  utilizan  filtros  de  interferencia   (fig.   2).   Además   de   la   longitud   de   onda   de   254   nm,   suelen   emplearse   filtros   que  permiten  trabajar  a  313,  334,  365  nm.  El  empleo  de  filtros  de  óxidos  de  fósforo  permite  trabajar  incluso  a  280  nm.  La  lámpara  de  mercurio  emiten  a  esa  longitud  de  onda.     El  cambio  de  lámpara  permite  incluso  trabajar  a  otras   longitudes  de  onda,  por  ejemplo  a  214  nm  con  una  lámpara  de  Zn,  a  229  nm  con  una  lámpara  de  Cd.  

   

Fig.  2.  Esquema  de  un  detector  de  UV  de  onda  fija    4.3   Detector  onda  variable  

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 Este  detector  es  simplemente  un  espectrofotómetro,  en  el  cual   se   reemplaza  el  compartimiento  de  cubetas  por  una  celda  de  flujo.     Es  mucho  más   versátil   que   el   detector   de   longitud   de   onda   fija   ya   que   al   tener   red   de  difracción  permite  seleccionar  libremente  la  longitud  de  onda  de  trabajo.  Se  puede  escoger  así  la  longitud   de   onda   de   máxima   absorción   del   analito   para   aumentar   la   sensibilidad   de   medición.  Emplea   una   lámpara   de   emisión   continua,   de   Deuterio   o   Xenón   (fig.   3).   La   luz   emitida   por   la  lámpara  se  enfoca  en  un  monocromador,  habitualmente  una  red  halográfica  de  difracción,  y  la  luz  monocromática   escogida   se   dirige   hacia   la   celda   de  medida   y   de   allí   hacia   el   fotomultiplicador  (Quattrocchi,  et  al  1992).    

 Fig.  3.  Esquema  de  un  detector  de  UV  de  onda  variable  

   4.4   Detector  de  ordenamiento  de  diodos      Uno  de  los  últimos  adelantos  en  los  detectores  UV  es  el  denominado  ordenamiento  de  diodos  (fig.  4).   En   los   dispositivos   “convencionales”,   la   red   de   difracción   se   ubica   antes   de   la   celda,   la   que  recibe   luz  monocromática  seleccionada  por   la  red.  En   los  detectores  de  ordenamiento  de  diodos  se   emplea   un   sistema   óptico   invertido:   la   celda   se   ilumina   con   luz   “blanca”,   es   decir,   no  monocromada  y  la  luz  emergente  de  la  celda  llega  a  la  red  de  difracción  y  allí  es  dispersada  hacia  el   elemento   fotosensible.   En   lugar   de   una   fotocelda   se   emplea   un   conjunto   de   fotoceldas   o  fotodiodos  montados  en  un   chip  de   sílicio   (Quattrocchi,   et   al   1992).  De  esta   forma,   se   consigue  medir  no   solo   la   luz   transmitida  a  una   longitud  de  onda,   sino   todo  el  espectro  de  absorción  del  eluído  en  tiempo  real  (ventaja  multiplex).    

 Fig.  4.  Detector  de  ordenamiento  de  diodos  compuesto  por  (1)   lámpara  de  Deuterio;  (2)  Sistema  de  lentes;  (3)  Chopper;  (4)  celda;  (5)  red  de  difracción;  (6)  ordenamiento  de  fotodiodos    

Es   el   detector   ideal   para   realizar   el   desarrollo   de   los   métodos   analíticos   por   HPLC,   ya   que  permite   asegurar,     dentro   de   ciertos   límites,   la   integridad   de   un   pico   cromatográfico.   El   único  problema   que   presenta   es   que   no   es   un   detector   universal,   ya   que   solamente   detecta   aquellos  

7    

compuestos  que  presentan   la  absorción  en  esta   zona  del  espectro.  Afortunadamente  existe  una  amplia  gama  de  compuestos  que  tienen  ésta  propiedad.  En  él   se   incluyen  todos   los  compuestos  aromáticos,  los  alquenos  y  todos  aquellos  compuestos  que  presentan  enlaces  múltiples  entre  C,  N,  O  y  S.  Únicamente  se  elije  otro  detector  cuando:    

§ El  analito  presenta  poca  o  ninguna  absorción  en  el  UV  o  Visible  § El   analito,   a   las   concentraciones   en   las   que   se   encuentra   en   la  muestra,   presenta   poca  

absorción  en  el  UV  o  Visible  § Existen  interferencias  en  la  muestra  § Se  necesita  información  estructural  cualitativa  

 5.   Detector  de  fluorescencia    La  fluorescencia  es  un  proceso  de  emisión  en  el  cual  las  moléculas  son  excitadas  por  la  absorción  de  radiación  electromagnética.  Las  especias  excitadas  se  relajan  al  estado  fundamental,  liberando  su   exceso   de   energía   en   forma   de   fotones.   Una   de   las   características   más   atractivas   de   los  métodos  de   fluorescencia   es   su   sensibilidad   inherente,   la   cual   es,   con   frecuencia,   de  uno   a   tres  órdenes  de  magnitud  mejor  que  las  de  la  espectroscopia  de  absorción,    porque  la  sensibilidad  de  los   primeros   se   puede   reforzar,   sea   aumentando   la   energía   del   haz   de   excitación   o   por  amplificación   de   la   señal   del   detector.   Es   de   destacar   que   ninguna   de   estas   opciones  mejora   la  sensibilidad  de  los  métodos  basados  en  los  procesos  de  absorción  porque  el  parámetro  en  la   ley  de  Beer  basado  en  la  concentración  es  el  logaritmo  de  una  proporción:    

− log𝑃!𝑃= 𝑎𝑏𝑐  

 Al  aumentar   la  energía  P0  se   incrementa  proporcionalmente  P  y  no  tiene  efecto  sobre   la  

sensibilidad.   De   manera   parecida,   incrementando   la   amplificación   de   la   señal   del   detector   se  influye   en   las   dos   magnitudes   medidas   de   forma   idéntica,   lo   que   evita   cualquier   mejoría.   No  obstante,   los  métodos  de   fluorescencia   se   aplican  mucho  menos  que   los  métodos  de   absorción  debido  al  número  relativamente  limitado  de  sistemas  químicas  que  se  pueden  hacer  fluorescer.  En  general,   los  métodos  de  fluorescencia  son  de  uno  a  tres  órdenes  de  magnitud  más  sensibles  que  los  métodos  basados  en  la  absorción.  Existen  dos  tipos  de  instrumentos:  

 § Fluorómetros:  utilizan  como  fuente  una  lámpara  de  Hg  a  baja  presión,  que  funciona  a  254,  

546,   691,   793   nm,   estas   longitudes   de   onda   se   aíslan   con   filtros   y   un   tubo  fotomultiplicador  es  el  detector.  

§ Espectrofluorómetros:   la   fuente   empleada   es   una   lámpara   de   arco   de   xenón,   de   alta  presión,   se  necesita   radiación  continua  de  300  a  1300  nm,  son  de  doble  haz,   tienen  dos  sistemas   de   monocromación   para   aislar   la   longitud   de   onda   deseada,   la   otra   radiación  obtenida   se   divide   en   dos,   una   al   fotomultiplicador   de   referencia   y   la   otra   para   por   la  muestra  (fig.  5).  

 

8    

   

Fig  5.  Esquema  de  un  detector  de  fluorescencia    

La   fotoluminiscencia  está   limitada  a  un  número   relativamente  pequeño  de   sistemas  que  incorporan  características  estructurales  y  ambientales  que  hacen  que  la  velocidad  de  los  procesos  de   desactivación   sin   radiación   se   reduzcan   hasta   el   punto   que   la   reacción   de   emisión   puede  competir   cinéticamente.   Para   analitos   que   no   poseen   fotoluminiscencia   nativa   se   utiliza   la  derivatización.  Este  tratamiento  puede  ser  necesario  para  reducir  la  polaridad  de  las  especies  y  de  este   modo   poder   usar   columnas   de   reparto   y   no   de   intercambio   iónico,   para   aumentar   la  respuesta   del   detector   para   todos   los   componentes   de   la   muestra   o   bien,   para   aumentar  selectivamente  la  respuesta  del  detector  para  determinados  componentes  de  la  muestra  (Skoog,  2001).    

Los  procedimientos  de  derivatización  se  dividen  en  precolumna  y  postcolumna.  La  derivatiazación  postcolumna   involucra   los   siguientes  pasos:   separación  de   los  analitos  

en   la   columna   cromatográfica,   introducción   de   un   reactivo   de   de   derivatización   en   el   sistema  efluente   de   la   columna;   paso   de   los   líquidos   combinados   a   través   de   un   colector   mezclador  seguido  por  un  espiral  de  reacción  y  finalmente  bombeo  de  los  analitos  derivatizados  a  través  del  sistema  de  detección.  

Por  otro   lado,   en   la  derivatización  precolumna,   la  mezcla  de  analitos   se  hace   reaccionar  con   el   agente   derivatizante   antes   de   ser   separados.   Las   técnicas   difieren   principalmente   de   las  condiciones  de  reacción.  Para  este  proceso,  se  deben  satisfacer  los  siguientes  requerimientos:  

 § Reacciones   rápidas  bajo   condiciones  moderadas  para  dar   rendimientos   cuantitativos  del  

derivado  § Los  derivados  deben  ser  estables  por  varios  días,  de  preferencia  a  temperatura  ambiente  

para  permitir  el  análisis  automatizado  de  varias  muestras.  § No  debe  haber  interferencias  del  reactivo,  productos  de  ruptura  o  reacciones  secundarias.  § Debe  haber  una  respuesta  lineal  a  los  intervalos  de  concentración  típicos  de  la  mayoría  de  

las  aplicaciones.  § Los  derivador  deben  tener  factores  de  respuesta  molar  razonablemente  similares.  

 6.   Detector  de  índice  de  refracción    

9    

Los  detectores  de   índice  de  refracción  son  universales  y  responden  a  todos   los  solutos,  son  muy  sensibles   a   los   cambios  de   temperatura,  pero  no  así   a   la  de   concentración.   Son  diferenciales,   el  disolvente  que  va  hacia  la  columna  pasa  a  través  de  la  cubeta  y  el  eluyente  de  la  columna  pasa  por  la  otra  mitad.  

Los  compartimientos  están  separados  por  una  placa  de  vidrio  montada  con  un  ángulo  tal  que  si   las  dos  disoluciones  tienen  índices  de  refracción  diferentes,  se  produce  una  desviación  del  haz  incidente.  La  desviación  del  haz  es  amplificada  y  registrada  (Skoog,  2001)..  El  esquema  de  este  detector  se  presenta  en  la  figura  6.    

 Fig.  6.  Esquema  de  un  detector  de  índice  de  refracción  

 No  puede  utilizarse   con  programación  de  disolventes  porque  el   cambio  de   la   composición  de   la  fase  móvil   se   acompaña   del   cambio   de   su   índice   de   refracción.   Como   consecuencia,   no   puede  estabilizarse   la   línea   base.   Existen   tres   tipos   diferentes   de   detectores   de   índice   de   refracción:  Fresnel,  Deflexión  e  Interferométrico  (Remington,  2003)    6.1    Detector  IR-­‐Fresnel      Es  un  detector  diferencial  que  utiliza  dos  celdas,  una  de  medición  que  es  atravesada  por  el  eluído  de  la  columna,  y  una  celda  de  referencia  por  la  cual  fluye  la  fase  móvil  pura.  Opera  según  la  ley  de  Fresnel,  que  establece  que  “la  cantidad  de  luz  reflejada  en  una  interfase  líquido/vidrio  varía  con  el  ángulo   de   incidencia   y   con   el   índice   de   refracción   del   líquido”.   Posee   una   celda   de   medición  pequeña,  del  orden  de  3  mL  que  está  constituida  por  un  prisma,  una  base  de  acero  pulida  y  un  sello  de  teflón  entre  ambos.  Para  cubrir   todo  el  rango  de   índice  de  refracción  (h=1.33  a  1.63)  se  utilizan   dos   prismas,   el   primero   se   utiliza   con   disolventes   de   fase   reversa   y   el   segundo   con  disolventes  de  fase  normal.  Para  evitar  el  calentamiento  de  la  celda  por  radiación  entre  ésta  y   la  lámpara  se  coloca  un  filtro  infrarrojo  (Quattrocchi,  et  al  1992).    6.2    Detector  de  deflexión      Es  un  detector  diferencial  que,  a  diferencia  del  Fresnel,  sólo  usa  un  prisma  para  todo  el  rango  de  índices  de  refracción,  pero  empleando  celdas  de  mayor  tamaño,  del  orden  de  los  8  a  10  mL.  Una  celda  contiene  la  fase  móvil  pura,  y  a  través  de  otra  celda  fluye  el  eluído  de  la  columna.  Cuando  se  produce  un  cambio  de   índice  de   refracción  en   la   celda  de  muestra,   se  produce  un  cambio  en   la  trayectoria  del  haz  luminoso  que  es  registrado  por  el  sistema  óptico  (Quattrocchi,  et  al  1992).    6.3    Detector  interferométrico      En   este  detector   la   luz   emitida  por   la   fuente   luminosa   se  polariza   y   divide   en  dos  haces  por   un  divisor  de  onda.  Luego  se  focalizan  ambas  ondas  y  atraviesan  la  celda  de  referencia  y  la  de  medida.  Finalmente   se   recombinan   por   una   segunda   lente   y   por   un   divisor   de   onda   para   llegar   al  

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fotomultiplicador.   Cuando   se   produce   una   diferencia   entre   los   índices   de   refracción   de   ambas  celda   tiene   lugar   un   cambio   de   fase   entre   ambas   ondas   y   esto   origina   una   diferencia   en   la  intensidad  de  luz  que  llega  al  fotomultiplicador.    7.  Detector  de  dispersión  de  luz    Estos   detectores   han   demostrado   su   utilidad   en   la   determinación   de   pesos   moleculares   de  polímeros  y  péptidos.  Su  funcionamiento  es  el  siguiente:  el  efluente  de  la  columna  pasa  a  través  de  un  nebulizador  y  se  convierte  en  gotitas  finas  con  un  gas  N2,  que  se  conducen  a  un  tubo  donde  se  evaporan  y  se  origina  analito  sólido.  Las  partículas  de  analito  pasan  a  través  de  un  haz  láser.  La  radiación   dispersdada   se   detecta   de   forma   perpendicular   al   flujo,   con   un   fotodiodo   de   Si.   Su  respuesta   es   la   misma   para   todos   los   solutos   no   volátiles,   es   más   sensible   que   el   índice   de  refracción.  Su  representación  gráfica  se  observa  en  la  figura  7.  (Barquero  Quirós,  2004)        

   

Fig  7.  Diagrama  de  las  etapas  de  detección  por  dispersión  de  luz      8.      Incertidumbre  en  los  detectores  IR,  UV,  Fluorescencia    El  ruido  de  fondo  producido  por  el  detector  de  índice  de  refracción  (IR)  se  ve  influenciado  por  los  cambios  en   la  composición  del  efluente  de   la  columna,  presión  y   temperatura.  La  concentración  de  1  ppm  corresponde  a  un  cambio  en  el  índice  de  refracción  de  aproximadamente  10-­‐7  unidades  IR,  debido  a  las  fluctuaciones  de  la  composición  de  la  fase  móvil.       La   temperatura  puede  causar  un  efecto  considerable  en   la   respuesta  del  detector.  Se  ha  reportado  que  un  cambio  en  1°C  puede  causar  un  cambio  de  6x10-­‐4  unidades  IR.  Con  respecto  a  la  

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presión,   ésta   puede   cambiar   la   densidad   del   líquido   y   como   consecuencia   el   IR,   sin   embargo   el  cambio   en   la   temperatura   afecta   más   que   la   presión,   aunque   ésta   última   compromete   la  estabilidad  de  la  línea  base.    

En  la  detección  por  fluorescencia,  el  pH,  composición  de  la  fase  móvil  (incluyendo  oxígeno  disuelto)  juegan  un  papel  importante,  por  ejemplo  la  longitud  de  onda  de  emisión  e  intensidad  de  fluorescencia   los   compuestos   aromáticos   ionizables   son   dependientes   del   pH.   La   respuesta   de  muchos  compuestos  es  dependiente  de  la  temperatura,  causando  una  disminución  en  intensidad  de  1-­‐2%  por  °C.  También  a  altas  concentraciones  la  fluorescencia  llega  a  ser  no  linear.  

En  la  detección  de  UV,  los  principales  errores  dependen  en  gran  medida  de  la  longitud  de  onda   seleccionada   y   general   se   observa   que   al   aumentar   la   longitud   de   onda   de   trabajo   la  incertidumbre  aumenta.  Los  gases  disueltos  alteran  la  línea  base  (N2  y  He  reducen  la  absorbancia  a  la  mitad)  y  en  algunos  casos  promueven  la  aparición  de  picos  fantasma  (V.  J.  Barwick,  1999).      9.  Sistema  de  toma  y  procesamiento  de  datos    El   resultado  del  ensayo  cromatográfico  es,  por  un   lado,   la  obtención  de   fracciones  separadas  de  los   componentes   de   la   muestra,   y   por   el   otro,   la   de   un   gráfico   o   cromatograma,   de   cuya  interpretación  pueden  extraerse  conclusiones  cualitativas  y  cuantitativas  (Quattrocchi,  et  al  1992).  Este  registro  y  la  eventual  manipulación  se  obtienen  a  partir  de  la  señal  proveniente  del  detector  por  medio  de  un  sistema  de  toma  y  procesamiento  de  datos,  entre  los  que  se  puede  citar  están:    

§ Registrador  gráfico:  convierte  la  señal  en  un  gráfico  del  tipo  X-­‐Y  § Integrador:  permite  no  sólo  obtener  un  registro  gráfico  (cromatograma)  sino  también  su  

tratamiento  matemático  para  el  cálculo  de  concentraciones.  § Computadora:  básicamente,  el  integrador  es  una  computadora  de  uso  muy  específico.  En  

este   punto,   se   puede   hablar   de   una   computadora   de   escritorio,   que   permite   con   el  software   apropiado   tanto   el   registro   gráfico   del   cromatograma   como   los   cálculos  apropiados,   la   manipulación   de   datos,   el   almacenamiento   de   ensayos,   generación   de  reportes,   e   incluso   el   manejo   global   de   varios   cromatógrafos.   Como   las   computadoras  necesitan  señales  digitalizadas,  se  necesita  una  interfase  analógica-­‐digital  que  convierta  la  señal  analógica  entregada  por  el  detector,  

 10.  Aplicación.    Determination   of   metoprolol   in   human   plasma   and   urine   by   high-­‐performance   liquid  chromatography  with  fluorescence  detection    El  metoprolol  pertenece  al  grupo  de  medicamentos  llamados  b-­‐bloqueadores.  Los  b-­‐bloqueantes  son  antagonistas  de   las  acciones  endógenas  de   las  catecolaminas  adrenalina  y  noradrenalina,  en  particular  sobre  el  receptor  adrenérgico-­‐β,  parte  del  sistema  nervioso  simpático.  El  metoprolol  se  usa  para  tratar  la  presión  arterial  alta  (hipertensión).  También  se  usa  para  aliviar  la  angina  (dolor  de   pecho)   y   para   prevenir   que   se   presenten  más   ataques   al   corazón   en   aquellos   pacientes   que  hayan  padecido  anteriormente  uno  de  estos  ataques.  Su  estructura  se  presenta  en  la  figura  8  (a)  así  como  la  del  atenolol,  el  cual  es  el  estándar  interno  (b).    (a)  

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   (b)  

   Fig.  8.  Estructura  química  de  (a)  metoprolol  y  del  estándar  interno  (b)  atenolol    

En  la  literatura  se  han  sido  reportado  varios  métodos  para  la  determinación  de  metoprolol  en   plasma   humano   y   fluídos   biológicos:   GC-­‐MS,   HPLC,   LC-­‐MS   y   LC-­‐MS/MS.   B.   Yilmaz   y  colaboradores   proponen   un   método   sensible,   específico   y   rápido,   HPLC   con   detección   de  fluorescencia,  para  determinar  metoprolol  en  pacientes  con  hipertensión.  El  método  fue  validado  y  se  evaluó  linealidad,  estabilidad,  precisión  y  exactitud  de  acuerdo  a  los  requerimientos  de  la  guía  de   ICH.   Además   se   estableció   un   bajo   límite   de   detección   (LOD)   del   rango   de   ng/mL.   Al  mismo  tiempo   este   método   fue   utilizado   para   un   estudio   de   farmacocinética   en   plasma   y   orina   de  humano.   En   la   tabla   3   se   observan   las   características   del   sistema   cromatográfico   y   el  procedimiento  de  preparación  de  muestra  se  muestra  en  la  fig  9.  

 Tabla  3.  Condiciones  de  operación  para   la  determinación  de  metoprolol  por  HPLC  con  detección  de  fluorescencia    

 Características  del  sistema  cromatográfico:  

Ø HPLC  Perkin  Elmer  serie  200  Ø Detector  de  fluorescencia  276  nm  (excitación)  y  296  nm  (emisión)    Ø Fase  móvil,  metanol:agua  (50:50,  v/v)  +  0.1%  TFA  Ø Columna  C18  (5  mm,  4.65  mm  x  250  mm  id)  Ø Flujo  1  mL/min  

                   Fig  9.  Procedimiento  de  extracción  del  metoprolol    

Las   curvas  de   calibración   se  preparadon  a  partir  de  una   solución   stock  de  metoprolol   (1  mg/mL),   ésta   solución   fue  diluída  posteriormente  para  obtener  una   concentración  de  1  mg/mL,  para   plasma   el   rango   de   trabajo   fue   de   3-­‐200   ng/mL   y   5-­‐300   ng/mL   para   orina.   Las   muestras  biológicas   se   obtuvieron   de   pacientes   con   hipertensión   arterial   y   se   colectaron   a   diferentes  tiempos  para  poder  llevar  a  cabo  el  estudio  de  farmacocinética.  

 0.5 mL plasma + X mL IS

 

0.5 mL NaOH 1 M

Agitación 5s  

3 mL etilacetato: dietilét

Agitación 30s

Centrifugación 3000 rpm, 7 min.

 FO

Evaporación con N2, 40°C

 

1 mL MeOH

20 µL

HPLC

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La  mayoría  de  los  compuestos  farmacéuticos  pueden  ser  analizados  con  una  columna  C18,  debido  a  esto,  el  metoprolol  fue  analizado  satisfactoriamente  por  cromatografía  en  fase  reversa.  La  correcta  separación  se  logró  con  las  condiciones  de  la  tabla  3,  logrando  de  esta  forma  obtener  un   tiempo   corto   para   el   analito   (4.7  min).   Los   cromatogramas   típicos   de   esta   determinación   se  pueden  observar  en  la  fig.  10.  

En   los   cromatogramas   se   observa   que   el   proceso   de   extracción   permite   eliminar   en   su  mayoría  las  interferencias  endógenas  de  los  fluídos  biológicos.  Cabe  mencionar  que  el  metoprolol  no  necesito  de  una  reacción  de  derivatización  para  poder  realizar  su  detección,  esto  quiere  decir  que  pertence  al  reducido  grupo  de  sustancias  con  fluorescencia  nativa.  En   la  tabla  4  se  resumen  los  resultados  obtenidos  durante  la  validación  de  este  método  analítico.  

 Fig.  10.  Cromatogramas  representativos  de  plasma  (izquierda)/  orina  (derecha)  (a)  sin  fármaco;  (b)  fortificado   con   metoprolol   (100   ng/mL)   y   atenolol   (IS)   (200   ng/mL);   y   (c)   2   h   después   de   la  administración  del  fármaco  a  los  pacientes.            Tabla  4.  Resumen  de  la  validación  del  método  analítico    

Parámetro   Plasma   Orina  Linealidad   3-­‐200  ng/mL   5-­‐300  ng/mL  Precisión     0.97  %   1.16  %  Exactitud   4.88  %   5.28  %  LOQ   3  ng/mL   5  ng/mL  LOD   1  ng/mL   1.5  ng/mL  Recobro   95.6±1.53%   96.4±1.75%  

 Finalmente   el  método   descrito   en   el   artículo,   fue   utilizado   para   llevar   acabo   un   estudio  

farmacocinética   cuya   curva   se   observa   en   la   fig   11.   De   éste   gráfico   se   obtienen   importantes  parámetros  como  la  concentración  máxima  que  alcanza  el  metoprolol  en  plasma,  así  como  su  vida  media  entre  otros  parámetros.  La  utilización  de  detección  de  fluorescencia  permite   la  obtención  

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de   unos   bajos   LOD,   lo   cual   hace   que   este   método   de   análisis   sea   aplicable   a   estudios   clínicos  donde  las  concentraciones  de  fármacos  en  fluido  biológico  son  muy  bajas  (B.  Yilmaz  et  al,  2010)    

   

Fig.  11.  Concentraciones  plasmáticas  de  metoprolol  en  pacientes  con  hipertensión  arterial  después  de  una  dosis  única  de  100  mg      11.  Conclusiones    El   detector   es   un   dispositivo   electrónico   que   registra   una   propiedad   físico-­‐química   del  material  eluido   por   la   columna   en   función   del   tiempo.   Los   detectores   actuales   tienen   un   amplio   rango  dinámico  que,  normalmente,  permite  trabajar  en  las  escalas  analítica  y  preparativa  con  el  mismo  aparato.   Los   detectores   actuales   tienen   sensibilidades   que   permiten   la   detección   de  concentraciones  muy  pequeñas  y  admiten  rápidamente  el  cambio  de  una  fase  móvil  a  otra.  

Para  que  el   eluído  de   la   columna   cromatográfica  pueda   ser   evaluado,  debe  pasar  por   la  celda  de  un  detector,  la  cual  tiene,  naturalmente,  un  volumen  finito.  El  detector  puede  contribuir  de  dos   formas  al   ensanchamiento  de  banda,  en   función  de   su   componente  hidráulico   (tubos  de  ingreso  a  la  celda,  volumen  y  geometría  de  la  celda)  y  su  componente  electrónico  (la  velocidad  de  respuesta).  

Evidentemente  el  volumen  de  esta  celda  debe  ser  pequeño,  para  que  no  vuelva  a  mezclar  los   componentes   que   fueron   separados   en   la   columna.   Además   del   volumen   de   celda   debe  considerarse   su   diseño,   ya   que   celdas   que   induzcan   flujos   turbulentos   son   capaces   de   producir  dispersión,  independientemente  del  generado  por  su  volumen.      12.  Bibliografía    

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performance   liquid   chromatography  with   fluorescence  detection.   J.   Sep.   Sci.,  Vol.   33,  Pp.  1904–1908.  

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15    

§ Harris,  Daniel  C.  (2001).  Análisis  químico  cuantitativo.  Ed.  Reverté  S.A.,  Barcelona,  España.    Pp  707,726.  

 § Morante   Zarcero,   Sonia;   Sierra   Alonso   Isabel   &   Del   hierro   Morales,   Isabel.   (2007).  

Desarrollo   de  Métodos   analíticos   para   la   separación   quiral   y   su   aplicación   al   estudio   de  procesos  de  síntesis  asimétrica.  Universidad  Rey  Juan  Carlos,  Madrid,  España.  Pp  50-­‐51.  

 § Quattrocchi,   Oscar   Alberto   &   Cía.   (1992).   Introducción   a   la   HPLC,   aplicación   y   práctica.  

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 § Valcárcel   M   &   Cárdenas   Ma.   S.   (2000).   Automatización   y   miniaturización   en   química  

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