Instrumentacin en Cromatografa Lquida

Instrumentacin en Cromatografa LquidaSi bien es cierto que para realizar un CL tan solo es necesario disponer de las dos fases implicadas en el proceso y de la columna, la moderna HPLC, debido al pequeo dimetro de las partculas de FE que se utilizan, requiere de la utilizacin de unos dispositivos que constituyen el cromatgrafo.1Clasificacin de la cromatografa lquida:

AdsorcinRepartoIntercambio inicoExclusinAfinidad

Clasificacin

Componentes bsicos de un cromatgrafo de lquidos:

Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de mezclado de eluyentes) Dispositivo de inyeccin.Conducciones y conexiones.Detector y registrador.Columna.Esquema de cromatografa Lquida

Adems de los componentes anteriores, se pueden incorporar otros que pueden simplificar el trabajo o mejorar el aspecto de la tcnica:Inyectores automticos.Colectores de fracciones.Hornos termostatizados para las columnas.Sistema de tratamiento de datos.Sistema de suministro de fase mvilLa BombaLa misin de la bomba es la de suministrar un caudal constante y libre de pulsos de la fase mvil a travs de la columna.

Requisitos para las bombasTipos de bombasLas bombas se pueden clasificar de acuerdo a su fuerza motriz:Bombas neumticasBombas de desplazamiento directo.Bombas amplificadoras de aire.

Bombas de motor elctricoBombas de jeringa.Bombas alternantes (pistn o membrana)

Bombas neumticas

Bomba amplificadora de aireBomba de desplazamiento directoBombas de motor elctricoBomba de jeringaBomba alternante (membrana)

En la actualidad las bombas ms utilizadas son las de tipo alternante.En toda bomba alternante se distinguen tres partes:El motor El mecanismo de transmisin.La cabeza de bomba.

Sistema de mezcla de fase mvilEn CL es posible trabajar en dos modalidades;Isocrtico: Cuando la fase mvil mantiene la misma composicin durante la elucinEn gradiente: Cuando la composicin de la fase mvil vara segn una funcin dependiente del tiempo.

Para trabajar en la modalidad de gradiente, es necesario que el equipo cromatogrfico tenga un dispositivo capaz de realizar mezclas de disolventes con un control preciso y reproducibleMezclado a alta presinEste sistema de mezclado utiliza una bomba para cada uno de los disolventes que se va a mezclarMtodos de mezclado

Mezclado a baja presinEl mezclado de los diferentes componentes se lleva a cabo antes de que estos entren a la bomba

Sistemas de inyeccinEl mtodo de introduccin de la muestra en HPLC es de suma importancia, pues un mal sistema de inyeccin puede dar lugar a ensanchamientos de la banda cromatogrfica que deterioren la eficacia del sistema cromatogrfico.

Un inyector ideal debe poseer las siguientes caractersticas:Ser de fcil manejo.Dar lugar a resultados reproducibles, tanto en la cantidad de muestra inyectada como en el ensanchamiento que origina a la banda cromatogrfica.Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.Inyectores de jeringa:La introduccin de la muestra en la columna se realiza por medio de una jeringa cuya aguja entra en el sistema cromatogrfico a travs de una membrana, lo que permite depositar la muestra en la cabeza de la columna.

Fundamentalmente existen dos tipos de inyectores manuales: los de jeringa y los de vlvula

Ventajas: facilidad de construccin y permiten aprovechar al mximo la eficacia de la columna.Desventajas: Baja reproducibilidad, presin de trabajo limitada y gran dificultad de manejo

18Inyectores de vlvulaEste sistema de inyeccin consiste en una vlvula de 6 vas, dos de las cuales estn conectadas entre s por medio de una espira (loop)

La introduccin de la muestra se lleva a cabo en dos etapas: la primera se realiza a presin atmosfrica y consiste en cargar la muestra en la espira con una jeringa, en la segunda; mediante un giro de la vlvula, se hace pasar el eluyente a travs de la espira hacia la columna.19Conducciones y conexionesdetectoresUn detector en cromatografa es un dispositivo que permite medir, a la salida de la columna, una propiedad fsica del eluyente, que deber depender de la composicin de ste.

Detector de difusin de luz21Las caractersticas de un detector para cromatografa son:Caractersticas que no afectan a la eficacia de la separacinRespuesta: Es la seal ofrecida por el detector ante una determinada variacin de la propiedad fsica del eluyente que es medida.

Ruido: Es cualquier perturbacin de la seal generada por el detector y que no es originada por la salida de un soluto de la columna.

Deriva: Es la variacin de la seal de base a lo largo del tiempo, que origina una variacin lenta y progresiva de la lnea de base.

Sensibilidad: Es la mnima concentracin de soluto que debe pasar por el detector para que la seal a que ste da lugar sea dos veces mayor que la del ruido de fondo.

Rango dinmico: Es el rango de concentraciones de soluto entre las cuales el detector produce una respuesta dependiente de la concentracin de soluto a la salida de la columna.Clasificacin de los detectoresSe puede hacer una divisin de los detectores en dos grandes grupos: los que aportan informacin estructural de las sustancias eluidas y aquellos que no la aportan.Detectores que no aportan informacin estructural:Detector de ndice de refraccinDetector de UV/VISDetector de fluorescenciaDetector de conductividad elctricaDetector electroqumico

ColumnasLa columna es el elemento fundamental en un cromatgrafo de lquidos, por lo tanto, resulta fundamental una correcta eleccin de la columna adecuada para cada separacin, ya que con una columna inadecuada o de mala calidad nunca se obtendrn buenos resultados aunque se disponga de la mejor instrumentacin.

Caractersticas de la columna que influyen sobre su capacidad de separacin:Dimetro internoLongitudConexiones RellenoTamao de partcula del relleno

Tipos de columna HPLCTres tipos de columnas de HPLC estn en uso comn hoy enda, pero difieren en la naturaleza de la capa de material que recubre la columna e interacta con la muestra.Columna de intercambio inicoColumna de adsorcinColumna de exclusin por tamao

La cromatografa lquida de altaresolucin(HPLC) es untipode cromatografa en columna diseada para separar y clasificar los componentes de una muestra sobre labasede sus interacciones con una columna especfica.27Columna de intercambio inico

Se utiliza para separar muestras ionizables, o muestras que se puede cargar.

Mientras ms cargadas estn las partculas de la muestra, ms atradas estarn por la fase estacionaria, lo que resulta en un tiempo de elucin ms lento. El tiempo de elucin representan la intensidad de la carga de las partculas, y por lo tanto es el medio principal de clasificacin de los distintos compuestos dentro de la muestra.

Columna de adsorcin

La adsorcin implica la unin temporal de las partculas de la muestra a la fase estacionaria de la columna.

Mientras la partcula se mueve hacia abajo en la columna, se adsorbe y re-adsorbe en diversos grados en funcin del nivel de polaridad que posee. Los tiempos de elucin proporcionan una medida del nivel de polaridad de las partculas de la muestra.

Columna de exclusin por tamao

La fase estacionaria se compone de partculas no cargadas, que son de tamao controlado y porosas. La fase estacionaria est diseada de manera que cuanto ms pequea sea la partcula, ms profundamente penetra en el recubrimiento de la columna, lo que significa que a las partculas ms pequeas les tomar la mayor cantidad de tiempo para volver a la superficie y eluir.

Cromatgrafo Hplc