Laboratorio de Anatoma e Histologa Vegetal Julio Iranzo. Jardn Botnico de Valencia

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Deteccin de quitina en paredes fngicas

Aplicaciones:

Aplicable a secciones de muestras frescas o secciones obtenidas por congelacin. Microscopa de campo luminoso, epifluorescencia (cubos U-MWV2, UV) y Confocal.

Mtodo para microscopa de campo luminoso.

1. Preparacin de las muestras: a. Decoloracin de las hojas afectadas. Tratar con un solucin de 0.15% (p/v) de cido

tricloroactico en una mezcla 3:1 (v:v) de etanol y cloroformo, durante 12 horas. b. Tincin de las hojas decoloradas. Tratar las muestras con una solucin 0.025% (p/v) de azul

de anilina en lactofenol, durante 2 h. c. Montar y observar al microscopio de campo claro y Nomarski.

Soluciones:

Solucin 0.15% de cido tricloroactico (TCA): Disolver 0.15 g TCA en 100 mL de una mezcla 3:1 (v/v) de etanol:cloroformo.

Solucin de anilina al 0.025%: Disolver 25 mg de azul de anilina en 100 mL de lactofenol.

Reactivos:

cido Tricloroactico (Trichloroacetic Acid; PANREAC: 151067) Azul de anilina (Aniline Blue; MERCK: 1275). Lactofenol (Lactophenol; PANREAC: 251837) Etanol Cloroformo (Triclorometano; PANREAC: 363101)

Mtodo para microscopa de epifluorescencia y Confocal.

1. Para hifas endofticas: a. Se tratan, bajo vaco, trozos de hojas afectadas con una solucin de Isotiocianato de

Fluorescena conjugada con Aglutinina de Trigo (WGA-FITC), diluida a 100 g/mL con PBS, pH 7,3. Tratar durante 10 min.

b. Lavar 3 veces con PBS (1 h cada vez) c. Montar con 0.1% (p/v) de p-fenilendiamina (solucin antifade). d. Observar con epifluorescencia (cubo U-MWB2) o con Confocal (Blue Diode).

2. Para hifas superficiales: a. Sumergir (5 min) los trozos de hoja afectada en una solucin acuosa al 0.01% (p/v) de

primulina. b. Lavar y montar con una solucin antifade. c. Observar con epifluorescencia (cubo U-MWB2) o con Confocal (Blue Diode).

3. Observacin en el Confocal: a. Usar un objetivo Planapo x83, AN 1.2, wter inmersin. b. Usar laser de Argn 488 para excitacin.

Protocolos de Tincin Deteccin de quitina en paredes fngicas

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Laboratorio de Anatoma e Histologa Vegetal Julio Iranzo. Jardn Botnico de Valencia

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Soluciones:

Solucin de Isotiocianato de Fluorescena conjugada con Aglutinina de Trigo (WGA-FITC) diluida a 100 g/mL con PBS, pH 7,3

Solucin acuosa al 0.01% (p/v) de primulina. Solucin antifade de 0.1% (p/v) de p-fenilendiamina.

Reactivos:

Isotiocianato de Fluorescena conjugada con Aglutinina de Trigo (WGA-FITC); (WGA FITC conjugate; SIGMA L4895)

Primulina (Primuline; SIGMA 206865). p-fenilendiamina (p-Phenylenediamine; MERCK: 807246). PBS (Phosphate buffered saline; SIGMA P4417)

Referencias:

Latunde-Dada, A. O. OConnell, R. J., Nash, C.& Lucas, J. A. (1999). Stomatal penetration of cowpea (Vigna unguiculata) leaves by a Colletotrichum species causing latent Anthracnose. Plant Pathology 48: 777785