detecciÓn de los niveles de expresiÓn de p/caf y p21 en
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATÍA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
“DETECCIÓN DE LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE P/CAF Y p21 EN CANCER DE MAMA INVASIVO NO
HEREDOFAMILIAR”
TÉSIS
Q U E P R E S E N T A E L
M é d i c o C i r u j a n o y P a r t e r o
ERNESTO RAÚL PAZ MURGA
P A R A O B T E N E R E L G R A D O D E
MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR
DIRECTOR DE TÉSIS: DR. JOSÉ EFRAÍN GARRIDO GUERRERO
CINVESTAV-IPN
CO-DIRECTOR DE TÉSIS: DR. DAVID GUILLERMO PÉREZ ISHIWARA
ENMyH-IPN
México, D. F. Diciembre 2007
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AGRADECIMIENTOS
Agradezco de manera especial al Dr. J. Efraín Garrido Guerrero, jefe del Laboratorio No.1 del Departamento de Genética y Biología Molecular del CINVESTAV, por haber dirigido este trabajo y sobretodo por haberme permitido formar parte de su grupo de investigación. Agradezco al Dr. David Guillermo Pérez Ishiwara, a la Dra. Consuelo Gómez García, al Dr. Juan Santiago Salas Benito y a la Dra. Maria Esther Ramírez Moreno sus criticas y sugerencias durante la realización de este trabajo. Agradezco al Biólogo Pedro Chávez Olmos el gran apoyo que me proporcionó durante la realización de este trabajo, gracias por su amistad, por su enseñanza y asesoría. Agradezco al Dr. Antonio Gómez Díaz Jefe del Servicio de Patología Quirúrgica del Hospital General “Dr. Salvador Zubirán Anchondo” de los Servicios de Salud del Estado de Chihuahua por su apoyo al proporcionarme el material biológico necesario para realizar este trabajo. Agradezco al Hospital General “Dr. Salvador Zubirán Anchondo” y al Centro Estatal de Cancerología de los Servicios de Salud del Estado de Chihuahua por haberme permitido utilizar el material biológico del servicio de Patología Quirúrgica necesario para realizar este trabajo. Agradezco a la Dra. Elizabeth Ortiz Sánchez por su amistad y el apoyo que me proporcionó durante la realización de este trabajo. Agradezco a todos y cada uno de los compañeros del Laboratorio No.1 del Departamento de Genética y Biología Molecular del CINVESTAV que durante todo el tiempo que me tomó hacer este trabajo tuve el privilegio de conocer y hacer mis amigos. Agradezco a la Dra. Esther Orozco Orozco su amistad y su visión para difundir y desarrollar la investigación científica mas allá del centro del país. Agradezco a las pacientes que sin saberlo contribuyeron en la realización de este trabajo, proporcionando un fragmento de tejido enfermo para hacer esta investigación. Gracias a DIOS…….
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DEDICATORIAS
A MIS PADRES
A MIS HERMANOS
A MI ESPOSA
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La ciencia esta orgullosa de saber muchas cosas; la sabiduría siente la humildad de no saber mas. Hannah Cowley
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INDICE Página Acta de revisión de tesis 1 Carta cesión de derechos 2 Agradecimientos 3 Dedicatorias 4 Reflexión 5 Índice general 6 Índice de tablas 8 Índice de figuras 9 Índice de cuadros 10 Índice de gráficas 11 RESUMEN 12 ABSTRACT 14 1. INTRODUCCION 15
o 1. 1. Cáncer 15 o 1. 2. Epidemiología 16 o 1. 3. Aspectos moleculares del cáncer 17
2. CANCER DE MAMA 18 o 2.1. Definición 18 o 2.2. Epidemiología 19 o 2.3. Factores predisponentes del cáncer de mama 29 o 2.4. Diagnóstico 31
• 2.4.1. Examen clínico 31 • 2.4.2. Mamografía 31 • 2.4.3. Ultrasonido mamario 33 • 2.4.4. Resonancia magnética nuclear 33 • 2.4.5. Citología 33 • 2.4.6. Biopsia 34 • 2.4.7. Diagnóstico molecular 34
o 2.5. Clasificación 38 o 2.6. Tratamiento 44
3. ANTECEDENTES 45
o 3.1. P/CAF y P300/CBP participan en la transcripción por su actividad HAT 45
o 3.2. p53 46 4. JUSTIFICACION 48 5. HIPOTESIS 49 6. OBJETIVO GENERAL 50 7. OBJETIVOS ESPECIFICOS 50 8. MATERIAL Y METODOS 51
o 8.1. Material Biológico 51
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o 8.2. Extracción de RNA total 51 o 8.3. RT (Obtención de cDNA) 52 o 8.4. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 52 o 8.5. Pacientes 54
9. RESULTADOS 55
o 9.1 Obtención de RNA total 55 o 9.2 RT-PCR 56
10. ANALISIS DE RESULTADOS 59 11. DISCUSIÓN 60 12. CONCLUSIONES 62 13. PERSPECTIVAS 62 14. REFERENCIAS 63
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INDICE DE TABLAS Página Tabla 1. Defunciones generales por principales causas de la defunción 17 INEGI 2004. Tabla 2. Agrupación por estadios del cáncer de mama 39 Tabla 3. Clasificación histopatológica del cáncer de mama de acuerdo a la OMS. 42 Tabla 4. Muestra el concentrado de todos los resultados obtenidos con respecto a la expresión (RT-PCR) de GAPDH, p21 y P/CAF en todas las muestras analizadas. 60
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INDICE DE FIGURAS Página Fig. 1. Esquema que muestra la unidad ducto-lobular terminal que se abrevia en inglés TDLU. 40 Fig. 2. Corte microscópico de la unidad ducto-lobular terminal que se abrevia en inglés TDLU 40 Fig. 3. Carcinoma ductal in situ con necrosis tipo comedo. 43 Fig. 4. Carcinoma ductal invasivo asociado con un componente de carcinoma intraductal extenso. 43 Fig. 5. Carcinoma lobular invasivo. 45 Fig. 6. Análisis de la calidad del RNA obtenido de las muestras de cáncer de mama. 56 Fig. 7. Análisis de la expresión de el gen control GAPDH en muestras de cáncer de mama. La imagen corresponde al corrimiento electroforético del producto de PCR en un gel de agarosa. 57 Fig. 8. Análisis de la expresión de p21 en muestras de cáncer de mama. 58 Fig. 9. Análisis de la expresión de P/CAF en muestras de cáncer de mama. 59
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INDICE DE CUADROS Página Cuadro 1. Muestra la evolución natural del cáncer de mama. 19 Cuadro 2. Muestra el panorama mundial del cáncer mama. 20 Cuadro 3. Muestra la mortalidad por cáncer de mama en el Reino Unido. 21 Cuadro 4. Muestra la mortalidad por cáncer de mama en diferentes países de nuestro continente. 21 Cuadro 5. Muestra las gráficas comparativas de la tasa de mortalidad del cáncer cervico-uterino y el cáncer de mama de 1991 a 2004 en la población derechohabiente del IMSS. 22 Cuadro 6. Muestra las gráficas comparativas de la mortalidad por cáncer de mama entre población derechohabiente del IMSS y la no derechohabiente. 23 Cuadro 7. Muestra los porcentajes de mortalidad por cáncer de mama, por grupos de edad en la población derechohabiente del IMSS. 24 Cuadro 8. Análisis de la tasa de mortalidad por cáncer de mama por grupos de mujeres de diferentes periodos de tiempo de fecha de nacimiento en la población Mexicana desde 1931 a 1975. 25 Cuadro 9. Análisis de la tasa de mortalidad por cáncer de mama por grupos de mujeres de diferentes edades y diferentes periodos de año de nacimiento en la población Mexicana. 26 Cuadro 10. Muestra las gráficas comparativas de la tasa de mortalidad por cáncer por año en diferentes Estados del Norte de la Republica Mexicana de 1981 a 2004. 27 Cuadro 11. Muestra las causas de egresos por defunción en el Hospital Morelos del IMSS de la Ciudad de Chihuahua en el 2004. 28 Cuadro 12. Mortalidad por tumor maligno de mama según grupo de edad en mujeres. México -2001. 28 Cuadro 13. Análisis de la relevancia de diferentes factores de riesgo para cáncer de mama. 31 Cuadro 14. Algunas de las características de c-erb-B-2. 37
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INDICE DE GRAFICAS Página Gráfica 1. Estadísticas de mortalidad general de 1990 a 2004 de las cuatro principales causas según datos del INEGI. 15 Gráfica 2. Estadísticas de mortalidad general en hombres de 1990 a 2004 según datos del INEGI. Se observa que el cáncer ocupa el segundo lugar. 16 Gráfica 3. Estadísticas de mortalidad general en mujeres de 1990 a 2004 según datos del INEGI. 16 Gráfica 4. Análisis densitométrico comparativo entre GAPDH y p21 61
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RESUMEN El cáncer ocupa el segundo lugar como causa de mortalidad general, el tipo varía de acuerdo al sexo. En la mujer predominan el cérvico-uterino y el de mama. El cáncer implica la proliferación celular descontrolada que conduce a la invasión de tejidos vecinos y la metástasis a distancia. Las células afectadas sufren transformación maligna y con ello la inmortalización debido a un ambiente de inestabilidad genómica producida por alteraciones en los genes supresores de tumores o en los proto-oncogenes que al modificarse por mutación, amplificación, etc. se convierten en oncogenes. Sabemos que a pesar de encontrarse un gen presente sin mutaciones, puede no funcionar adecuadamente, debido a que su producto protéico debe sufrir cambios como metilaciones, fosforilaciones, acetilaciones, etc., por proteínas codificadas por otros genes. Este es el caso de p53 que necesita ser acetilada en ciertos residuos de lisina por P/CAF. p53 participa en la regulación de la expresión de genes como p21 que es un inihibidor de cinasas dependientes de ciclinas, proteínas indispensables para la progresión del ciclo celular. Trabajos realizados en nuestro laboratorio y otros publicados han indicado que P/CAF no se expresa en cáncer invasivo de mama, lo que nos condujo a plantear como hipótesis de trabajo que la ausencia de expresión de P/CAF en cáncer mamario podría traer como consecuencia que no haya expresión de p21 independientemente del estado del gen p53. De esta forma nuestro principal Objetivo fue evaluar en muestras frescas de cáncer de mama invasivo no heredofamiliar por RT-PCR los niveles de expresión de P/CAF y p21. Analizamos el producto de la PCR del cDNA obtenido por retrotranscripción del RNAm de17 pacientes con cáncer invasivo de mama y una sana como control, además incluimos el cDNA de la línea celular MCF-7 como control positivo. En todas las muestras se observó la expresión el gen constitutivo GAPDH, indicándonos que la metodología fue correctamente realizada. Doce de las muestras expresaron p21 y cinco no lo expresaron, es decir la mayoría (70%) expresaron p21. Cuatro muestras expresaron P/CAF y trece no lo expresaron, es decir la mayoría (76%) no expresó P/CAF, confirmando previas observaciones de nuestro grupo de investigación. Así mismo realizamos un análisis densitométrico comparativo encontrando que aunque todas las muestras expresaron p21, dicha expresión fue menor en aquellas muestras en las que P/CAF no se expresa, en relación a aquellas que si lo expresaban. Por lo encontrado en la literatura, lo obtenido previamente en nuestro laboratorio y los resultados del presente trabajo podemos concluir que en la evolución natural del cáncer de mama existe una disminución gradual de la expresión del coactivador transcripcional P/CAF, llegando prácticamente a la falta casi total de su expresión en el carcinoma invasivo. Por otro lado también podemos concluir que la expresión de p21 no es afectada de manera exclusiva por la expresión de P/CAF, pero que la presencia de p21 es mantenida en estas lesiones muy posiblemente debido a que su expresión esta siendo estimulada por otras vías independientes de p53. Es necesario estudiar un número mayor de muestras para corroborar las conclusiones a las que llegamos en este trabajo y utilizar metodologías que nos
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permitan medir el grado de expresión de cada uno de los genes estudiados (RT-PCR cuantitativa).
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ABSTRACT Cancer is considered the second cause of death worldwide and the specific type varies depending the sex. In women cervical and breast cancer are the most common types. Cancer initiates with the uncontrolled proliferation of cells that invades neighbor tissues leading to metastasis. Cells are transformed and immortalized due to alterations in tumor suppressor genes or/and proto-oncogenes that are modified by mutation, amplification, etc., becoming to oncogenes. Even a specific gene is not mutated or altered, its proteic product could not adequately work since several postranslational modifications could be required, such as methylation, phosphorylation and acetylation. This is the situation for p53 that needs to be acetylated by P/CAF to be fully activated as transcriptional regulator. P53 regulates the expression of p21, a cyclin-dependent kinase inhibitor that participates in the regulation of cell cycle progression. Several published works and observations from our research group indicate that P/CAF is poorly expressed in invasive breast cancer, leading to our hypothesis that the absence of P/CAF in breast cancer should correlate with the absence of p21, independently to the status of p53 in the tumor. For this reason, the main objective of our work was to evaluate in fresh samples of invasive non-hereditary breast cancer, the expression level of p/CAF and p21 by RT-PCR. We analyzed the PCR product from the cDNA obtained by retrotranscription from the mRNA of biopsies of 17 patients with invasive breast cancer and one healthy donor. Additionally we included as a positive control, cDNA obtained from mRNA of MCF-7 cells (derived from a breast adenocarcinoma). All the samples were tested for GAPDH expression (a constitutively expressed gene) obtaining the corresponding amplicon in all of them, indicating that the mRNA quality obtained was high and the methodology correctly performed. Twelve of the seventeen samples expressed p21 (70%). Four samples were positive for P/CAF, while thirteen did not. It means that most of the samples (76%) did not express P/CAF, confirming previous observations in our research group. Additionally, a comparative densitometric analysis showed that even most of the samples expressed p21, the mRNA level of this gene was lower in those samples where P/CAF was not expressed. Considering the published reports, the previous observations from our research group and the results obtained in this work, we conclude that in the natural evolution of the breast cancer there is a gradual diminishing of the expression of the coactivator P/CAF, reaching almost the absence in invasive breast carcinoma. By the other hand, we can conclude that p21 expression is not exclusively affected by P/CAF, but the presence of p21 is sustained in these lesions possibly because its expression is induced by p53-independent pathways. It is necesary to expand our study including a higher amount of samples to corroborate the conclusions obtained in this work, and additionally to use a specific methodology to precisely evaluate the expression level of the studied genes (quantitative RT-PCR).
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DETECCION DE LOS NIVELES DE EXPRESION DE PCAF Y P21 EN
CANCER DE MAMA INVASIVO NO HEREDO FAMILIAR I. INTRODUCCION I. I. Cáncer La palabra cáncer es un término genérico para malignidad de cualquier origen embriológico. Sin embargo el publico en general y desafortunadamente también muchos profesionales de la salud usan el termino “cáncer” intercambiablemente con el de “carcinoma”, una malignidad de origen epitelial y ocasionalmente neuroepitelial (Dictionary of modern medicine. Segen J. C. 1992 Roche). El cáncer afecta a seres humanos de todas las edades, sin embargo se considera una enfermedad relacionada al envejecimiento pues 66 % de todas las muertes por cáncer ocurren después de los 65 años de edad (Holleb A. I. 1991). Diversos factores como son: el mejor control de las enfermedades infecciosas, el avance en la tecnología aplicada a la medicina, la mayor accesibilidad a los servicios médicos, la mejor nutrición y la mejor urbanización en general, han contribuido a un incremento en la esperanza de vida y por lo tanto a un incremento en el numero de personas de mayor edad susceptibles de presentar neoplasias. Por otro lado, si a lo anterior sumamos el incremento de la contaminación ambiental y los cambios en el estilo de vida, todo en conjunto ha causado que en países como México, las enfermedades crónico-degenerativas presentaran un aumento gradual y continuo durante el siglo pasado y lo que va del presente. Dentro de ellas los tumores malignos ocupan los primeros lugares como lo muestra la siguiente grafica (1) tomada del reporte de las estadísticas de mortalidad del INEGI:
Gráfica 1. Estadísticas de mortalidad de 1990 a 2004 de las cuatro principales causas según datos del INEGI.
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1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004
Años de estudio
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je Enf. CorazónDiabetes M.Tumores MAccidentes
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I. 2. EPIDEMIOLOGIA El cáncer es la segunda causa de defunción general en México solo precedido por las enfermedades cardiovasculares (INEGI 2004) (Registro Histopatológico de Neoplasias Malignas RHNM 2001). Su incidencia y tipo varía de acuerdo al sexo. En los últimos años la diabetes mellitus le disputa el segundo lugar, como se puede apreciar en las siguientes gráficas (2y3) tomadas del INEGI:
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1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004
Años de estudio
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je Enf. CorazónTumores MDiabetes MAccidentes
Gráfica 2. Estadísticas de mortalidad en hombres de 1990 a 2004 según datos del INEGI
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1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004
Años de estudio
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Enf. CorazónDiabetes MTumores MEnf.C-V *Accidentes
Gráfica 3. Estadísticas de mortalidad en mujeres de 1990 a 2004 según datos del INEGI
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Las gráficas anteriores muestran las estadísticas de mortalidad general a nivel nacional, aunque en el estado de Chihuahua las estadísticas muestran un comportamiento similar, como se puede ver en la siguiente tabla. Tabla 1. Defunciones generales por principales causas de la defunción INEGI 2004 Causa Nacional Estructura % Chihuahua Estructura % Total 473 417 100.0 16 277 100.0 Enfermedades del corazón
77 445 16.4 3 183 19.6
Tumores malignos
61 248 12.9 2 040 19.6
Diabetes mellitus
62 243 13.1 1 851 11.4
Accidentes 34 872 7.4 1 608 9.9 El cáncer es una enfermedad que se caracteriza por proliferación celular descontrolada y ausencia de apoptosis; las células cancerosas forman tumores que crecen e invaden tejidos vecinos destruyéndolos y por lo tanto afectando la función del órgano donde se origina. Además las células cancerosas atraviesan las paredes vasculares y viajan a través de los vasos sanguíneos o linfáticos a sitios distantes donde se implantan y crecen alterando la función de los tejidos u órganos afectados, esto se conoce como metástasis. Si el órgano afectado es vital termina con la vida del individuo. El cáncer afecta una extensa variedad de órganos y tejidos (Rosai and Ackerman´s 2004). La evolución clínica del cáncer toma varios años. Inicialmente las células cancerosas crecen pero respetan la membrana basal, conociéndose a esta etapa como carcinoma in situ, pudiendo permanecer así por un periodo variable de tiempo para posteriormente después, atravesar la membrana basal e invadir el tejido vecino, conociéndose a esta etapa como carcinoma invasor (Rosai and Ackerman´s 2004). I. 3. ASPECTOS MOLECULARES DEL CÁNCER. Las células normales crecen y proliferan solo cuando reciben señales o estímulos provenientes de otras células del organismo (hormonas, factores de crecimiento, etc.). Sin embargo, las células cancerosas ignoran los controles normales de proliferación y en general crecen respondiendo a señales internas estimuladoras de la proliferación celular (Orozco E. y Gariglio P., 2000). Otra característica de las células neoplásicas es la capacidad de evadir los sistemas de vigilancia que el sistema inmunológico tiene para detectarlas y destruirlas (De Vita 1997, Bonadonna 1998). El cáncer se considera un trastorno genético a nivel somático (Orozco E. y Gariglio P., 2000). En el inicio y desarrollo de una neoplasia intervienen básicamente dos clases de genes: Los oncogenes y los genes supresores de tumor o antioncogenes. Los primeros son las versiones alteradas de los proto-
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oncogenes, los cuales regulan positivamente el crecimiento y la división de las células, en tanto los antioncogenes inhiben estos procesos. Alteraciones en otros genes como los que controlan la expresión de enzimas encargadas de la replicación o reparación del DNA, de las proteínas del aparato mitótico encargadas de la distribución correcta de los cromosomas en las células hijas, o de las proteínas que controlan el ciclo celular, así como la sobre-expresión de factores de crecimiento o la mutación en los receptores de estos últimos que permiten la activación aun en ausencia de ligandos, todo esto lleva a un estado de inestabilidad genómica que predispone a la transformación e inmortalidad celular. Para que un tumor maligno se desarrolle, deben mutar 5 o mas genes que controlan el crecimiento; incluso el proceso de metástasis y angiogénesis están controlados genéticamente, es decir la transformación celular para completarse requiere de múltiples eventos (el cáncer no es un proceso de un solo evento) (Orozco E. y Gariglio P., 2000). Existen formas heredofamiliares de cáncer, pero no son las más frecuentes. 2. CÁNCER DE MAMA 2. 1. Definición Como ya lo mencionamos anteriormente la palabra cáncer es un término genérico para malignidad de cualquier origen embriológico. Sin embargo el publico en general y desafortunadamente también muchos profesionales de la salud usan el termino “cáncer” intercambiablemente con el de “carcinoma”, una malignidad de origen epitelial y ocasionalmente neuroepitelial (Dictionary of modern medicine. Segen J. C. 1992 Roche). En este trabajo utilizamos la palabra cáncer de mama para referirnos a la neoplasia que se origina en el epitelio de los conductos o lóbulos de la unidad ducto-lobulillar terminal de la glándula mamaria femenina (Figs. 1 y 2). La evolución del cáncer de mama sin tratamiento desde su etapa in situ hasta invasor toma varios años como se puede ver en la cuadro 1.
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CARCINOMA CARCINOMA
IN SITUIN SITU
DUCTAL DUCTAL
GRADO 2GRADO 2
Carcinoma medular 1.2 aCarcinoma medular 1.2 aññosos
DUCTAL DUCTAL
GRADO 3GRADO 3DUCTAL DUCTAL
GRADO 1GRADO 1
2.2 a2.2 aññosos2.9 a2.9 aññosos4.8 a4.8 aññosos
* Carcinoma ductal invasor 70* Carcinoma ductal invasor 70--80% del c80% del cááncer mamarioncer mamarioFuente: CFuente: Cááncer 1999;86:449ncer 1999;86:449--62.62.
El tiempo de progresiEl tiempo de progresióón disminuye cuando la mujer es mayor de 50 n disminuye cuando la mujer es mayor de 50 aañños y aumenta a menor edad y con el tamaos y aumenta a menor edad y con el tamañño del tumoro del tumor
Cuadro 1. Muestra la evolución natural del cáncer de mama. Tomado de Detección y Atención Integral del Cáncer de Mama – Epidemiología del Cáncer de Mama del IMSS. Junio del 2005. 2. 2.Epidemiología El carcinoma de mama es la causa de muerte de mas de 1,000,000 de mujeres en el mundo. En los Estados Unidos cada año aproximadamente 100,000 nuevos casos son diagnosticados y aproximadamente 30,000 pacientes mueren de esta enfermedad. La incidencia es alta en Norteamérica y norte de Europa (91.4 nuevos casos por 100,000 mujeres/año), intermedia en países de Europa del sur y América Latina y baja en la mayoría de los países asiáticos y africanos (Rosai and Ackerman´s 2004) (Cuadro 2, 3 y 4).
20
Fuente: OMS, base de datos GLOBOCAN 1995
5.9-20.543.1-67.820.6-31.131.2-35.4
35.5-43.0 No reporta*Tasa estandarizada por edad, por 100 mil mujeres mayores de 25 años
66 PAISES REPORTAN
Cuadro 2. Muestra el panorama mundial del cáncer mama. Tomado de Detección y Atención Integral del Cáncer de Mama – Epidemiología del Cáncer de Mama del IMSS. Junio del 2005. Cada año en el mundo ocurren alrededor de un millón de casos nuevos de cáncer de mama. Esta enfermedad constituye de 20 a 25% de todos los casos de cáncer en la mujer, contribuye con un 15 a 20% de la mortalidad por cáncer y con un 2 a 5% de la mortalidad por cualquier causa en el mundo occidental. (IMSS Guía Técnica 2004 para Detección y atención integral del cáncer de mama).
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0 1.1 4.9 11.2 21.335.6
53.267.5
81.6 91121.5
148.4169
276.6
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300
<25 25-29 30-34 35-39 40-44 45-49 50-54 55-59 60-64 65-69 70-74 75-79 80-84 85+
TASA
EDAD
Fuente: OMS, base de datos GLOBOCAN 1999, *Tasa estandarizada por edad, por 100 mil mujeres
Cuadro 3. Muestra la mortalidad por cáncer de mama en el Reino Unido. Tomado de Detección y Atención Integral del Cáncer de Mama – Epidemiología del Cáncer de Mama del IMSS. Junio del 2005.
Fuente: OMS, base de datos GLOBOCAN 1995
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Belice
Colombia*
México
Brasil
Venezuela*
Chile*
Costa Rica
Cuba
EUA
Canadá
Argentina
TASA**
PAISES
* Año 1994 **Tasa estandarizada por edad, por 100 mil mujeres mayores de 25 años
Cuadro 4. Muestra la mortalidad por cáncer de mama en diferentes países de nuestro continente. Tomado de Detección y Atención Integral del Cáncer de Mama – Epidemiología del Cáncer de Mama del IMSS. Junio del 2005.
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En México el cáncer de mama es la neoplasia mas frecuente después del cáncer cervico-uterino y aunque la mama es un órgano externo fácil de explorar y de que los métodos de diagnóstico han mejorado mucho, la mortalidad femenina por esta neoplasia sigue siendo muy alta (Cuadro 5) (IMSS Guía Técnica 2004 para Detección y atención integral del cáncer de mama) A nivel nacional, la tendencia tiene un comportamiento marcadamente ascendente con un tasa de 9.8 por 100 mil mujeres de 25 y más años en 1980 a 14.5 en el 2001. En este ultimo año se registraron 3,565 defunciones, es decir, alrededor de 10 muertes por día de las cuales tres corresponden a población derechohabiente del IMSS (IMSS Guía Técnica 2004 para Detección y atención integral del cáncer de mama; Cuadro 6)
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91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02 03 04
* Tasa por 100 mil DHAMF mujeres de 25 años y más. Fuente: SISMOR
CACU
CAMA
TASA*
AÑO
Cuadro 5. Muestra las gráficas comparativas de la tasa de mortalidad del cáncer cervico-uterino y el cáncer de mama de 1991 a 2004 en la población derechohabiente del IMSS, donde se aprecia que la detección oportuna del cáncer cervico-uterino ha logrado una disminución de su mortalidad mientras el cáncer de mama tiende a aumentar. Tomado de Detección y Atención Integral del Cáncer de Mama – Epidemiología del Cáncer de Mama del IMSS. Junio del 2005.
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TASA*
AÑOFuente: Certificados de defunción. Base de mortalidad INEGI
Derechohabiente IMSS
No derechohabiente
IMSS
* Tasa por 100 mil DHAMF mujeres de 25 años y más Cuadro 6. Muestra las graficas comparativas de la mortalidad por cáncer de mama entre población derechohabiente del IMSS y la no derechohabiente, donde se puede observar que la población de menos recursos, con mayor numero de embarazos, menor uso de hormonas anticonceptivas, mas tiempo de lactación, etc., tiene una prevalencia menor de esta enfermedad.
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<25 25-29 30-34 35-39 40-44 45-49 50-54 55-59 60-64 65-69 70-74 75-79 80-84 85+
Fuente: SISMOR
44644634.7%34.7%
84184165.3%65.3%
DEFUNCIONES
EDAD
Total de defunciones
1,287
Cuadro 7. Muestra los porcentajes de mortalidad por cáncer de mama, por grupos de edad en la población derechohabiente del IMSS, con un número mayor de casos después de los 50 años de edad. Tomado de Detección y Atención Integral del Cáncer de Mama – Epidemiología del Cáncer de Mama del IMSS. Junio del 2005. El riesgo de padecer cáncer de mama se eleva con la edad y se ha triplicado para las mujeres nacidas después de 1950 comparadas con aquellas nacidas al inicio del siglo XX (IMSS Guía Técnica 2004 para Detección y atención integral del cáncer de mama) (Cuadros 7, 8 y 9)
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25-29 30-34 35-39 40-44 45-49 50-54 55-59 60-64 65-69
1931-19351936-19401941-19451946-19501951-19551956-19601961-19651966-19701971-1975
Fuente: INEGI y Dirección General de Información y Evaluación del Desempeño, SSA
*Tasa por 100,000 mujeres
TASA*
EDAD
Año de nacimiento
Cuadro 8. Análisis de Cohorte de la mortalidad por cáncer de mama (grupos de mujeres de diferentes periodos de tiempo de fecha de nacimiento)en la población Mexicana desde 1931 a 1975. Tomado de Detección y Atención Integral del Cáncer de Mama – Epidemiología del Cáncer de Mama del IMSS. Junio del 2005.
26
Fuente: INEGI y Dirección General de Información y Evaluación del Desempeño, SSA*Tasa por 100,000 mujeres
19.314.01951-1955
28.519.110.91946-1950
12.21956-1960
30.127.915.39.41941-1945
30.230.420.712.97.81936-1940
32.335.120.917.412.26.51931-1935
65-6960-6455-5950-5445-4940-44Año de nacimiento
Cuadro 9. Análisis de Cohorte de la mortalidad por cáncer de mama (grupos de mujeres de diferentes periodos de año de nacimiento) en la población Mexicana que muestra como se ha incrementado la tasa en general y en especial en grupos de mujeres más jóvenes. Tomado de Detección y Atención Integral del Cáncer de Mama – Epidemiología del Cáncer de Mama del IMSS. Junio del 2005.
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* Tasa por 100 mil DHAMF mujeres de 25 años y más. Fuente: SISMOR
TASA*
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91 92 93 94 95 96 97 98 99 '00 '01 '02 '03 '04
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91 92 93 94 95 96 97 98 99 '00 '01 '02 '03 '04
Tams
NL
Coah
Dgo
Chih
AgsSLP
Zac
Cuadro 10. Muestra las graficas comparativas de la tasa de mortalidad por cáncer por año en diferentes Estados del Norte de la Republica Mexicana de 1981 a 2004. Tomado de Detección y Atención Integral del Cáncer de Mama – Epidemiología del Cáncer de Mama del IMSS. Junio del 2005. En el Estado de Chihuahua la frecuencia del cáncer cervico-uterino y del cáncer de mama es similar o ligeramente superior este último (Fuente INEGI 1999). El 6 de agosto del 2005 el Centro Estatal de Cancerología, informó en un medio de comunicación electrónico que el tres por ciento de las mujeres en el estado sufren de cáncer de mama y que por año mueren 170 mujeres por esta causa (Cuadros 10 y11).
28
0
20
40
60
80
100
120
140
MASC FEM. TASA * TOTAL
1 E.11 Diabetes MellitusNo Insulinodependiente
2 J 33 Infarto Agudo delmiocardio
3 E 14 EnfermedadesObstructivas Crónicas
4 N 18 Diabetes MellitusNo Especificada
5 I 18 Insuficiencia Renalcrónica
6 I 61 HemorragiaIntrraencefalica
7 C 34 Tumor malignoBronquios - Pulmón
8 I 50 Insuficienciacardiaca
9 J 18 Neumonía org. Noespecificada
10 I 67 Otrasenfermedadescerebrovasculares11 I 12 Enfermedad renalhipertensiva
12 C 50 Tumor Malignode mama
Cuadro 11. Muestra las causas de egresos por defunción en el Hospital Morelos del IMSS de la Ciudad de Chihuahua en el 2004. Información proporcionada por el departamento de Epidemiología del Hospital General de Zona 1 “Unidad Morelos” del IMSS de la Ciudad de Chihuahua, Chihuahua. Rara vez se observa este tumor antes de los 25 años (aunque se esta incrementando el número de casos en mujeres jóvenes), su incidencia aumenta con la edad, siendo la edad media de diagnóstico 64 años, como se puede ver en el cuadro12.
CUADRO NO. 12 MORTALIDAD POR TUMOR MALIGNO DE MAMA SEGÚN GRUPO DE EDAD EN MUJERES. MÉXICO -2001
* Tasa por 100,000 mujeres del grupo de edad. ** Mujeres de 25 y mas años. Fuente: SEED/DGE, SSA, 2001, preliminar. Las conclusiones a las que se llegó en la ponencia titulada Detección y Atención Integral del Cáncer de Mama – Epidemiología del Cáncer de Mama del IMSS en Monterrey N. L. presentado en el 2005 son las siguientes:
• La mortalidad del cáncer de mama tiene una tendencia ascendente • La región con la mayor magnitud en mortalidad es la norte
Gpo. De edad Fem. Tasa* 15 a 24 7 0.1 25 a 34 144 1.6 35 a 44 620 9.6 45 a 64 1634 24.4 65 y mas 1139 42.8 Se ignora 1 0.0 Total 3545 14.4**
29
• Los efectos de periodo y de cohorte indican que la incidencia y mortalidad aumentaran en los próximos años, en la medida en que las nuevas generaciones envejezcan
• Se conocen los factores de riesgo principales, pero no es suficiente para predecir que mujeres tendrán cáncer
• Es indispensable desarrollar programas efectivos de detección que puedan detener y disminuir el comportamiento ascendente de la mortalidad
2.3. Factores predisponentes del cáncer de mama. El cáncer de mama es una enfermedad multifactorial y a diferencia del cáncer de cervix donde existe una fuerte relación con la presencia de un virus (el VPH), en el cáncer de mama existen múltiples factores que predisponen a que una mujer lo presente de lo cuales podemos mencionar los siguientes: Edad avanzada: Como lo mencionamos anteriormente, el cáncer es un padecimiento cuya incidencia aumenta a medida que aumenta la edad y en el caso del de la glándula mamaria no es la excepción, observándose el mayor numero de casos entre los 45 y 64 años de edad como se aprecia en el cuadro 12.(RHNM: Registro Histopatológico de Neoplasias Malignas SEED/DGE, SSA, 2001) Enfermedad mamaria proliferativa: La posible relación con la enfermedad fibroquistica ha sido sugerida durante muchos años. Ciertos hallazgos del análisis de lesiones de mastopatías fibroquísticas por microscopia, permiten considerar su asociación con un riesgo subsecuente de desarrollar cáncer. (Rosai and Ackerman's, 2004) Existe una variación muy amplia en el grado de proliferación epitelial en la enfermedad fibroquística, por lo que el Colegio Americano de Patólogos recomendó agrupar a los pacientes con “enfermedad fibroquistica” en las siguientes categorías: I.- Sin hiperplasia epitelial o hiperplasia leve: No hay incremento en el riesgo para carcinoma invasivo subsecuente. II.- Hiperplasia moderada o florida: incrementa el riesgo 1.5 o 2 veces. III.- Hiperplasia ductal o lobular Atípica: tienen 5 veces más riesgo. IV.- Carcinoma in situ ductal o lobular: 8 a 10 veces más de riesgo (Rosai and Ackerman's, 2004). Bilateralidad: Las posibilidades de que una paciente con carcinoma de mama invasivo desarrolle cáncer en la mama contralateral es de casi cinco veces mas que la población general y es aun mayor si hay una historia familiar de carcinoma de mama (Rosai and Ackerman's, 2004). Exposición a radiación: La exposición a radiación ionizante es un factor de riesgo, especialmente si la exposición ocurrió en el tiempo de desarrollo de la glándula mamaria o antes de los 35 años (Rosai and Ackerman's 2004. De Vita 1997. Holleb A. I.1991) Factores geográficos o raciales: La relación del cáncer de mama con el país de origen o grupo étnico se ha comentado en párrafos anteriores (Rosai and Ackerman's, 2004) Historia menstrual y reproductiva: Menarquia temprana, menopausia tardía, nuliparidad y primer embarazo en edad tardía están asociados con una mayor incidencia de cáncer de mama, así mismo es raro observarlo en mujeres que
30
han sido castradas; la ooforectomía antes de los 35 años de edad reduce el riesgo a un tercio. Una reducción en el riesgo se ha documentado entre mujeres premenopáusicas que han lactado, no así en las posmenopáusicas. El riesgo se incrementa en mujeres posmenopáusicas con un perfil hormonal hiperandrogénico (De Vita 1997. Rosai and Ackerman's, 2004) Factores dietéticos: Existe controversia en cuanto a la importancia de este factor en el desarrollo del cáncer de mama (De Vita 1997). Factores ambientales: El alto consumo de alcohol y el tabaquismo, así como el incremento en la contaminación ambiental pudieran ser factores de riesgo. (De Vita 1997) Factores hormonales: Auque controversial, la evidencia es a favor de que tomar anticonceptivos no predispone al desarrollo de cáncer de mama, hay ciertos grupos (cuando se ha usado por demasiado tiempo, grupos seleccionados por edad, ingesta de anticonceptivos con altas dosis de estrógenos) en los que se puede incrementar el riesgo. El uso de terapia estrogénica de reemplazo posmenopáusico es también controversial, aunque ha habido evidencia reciente de que el uso a largo plazo de terapia hormonal de reemplazo esta asociada con un incremento en el riesgo de carcinoma de mama, particularmente del tipo lobular (Rosai and Ackerman's, 2004). Historia familiar: Una mujer que tenga un familiar en primer grado con carcinoma de mama tiene un riesgo dos o tres veces mayor que la población en general, el riesgo aun es incrementado si el familiar fue afectado a una edad temprana y/o tuvo enfermedad bilateral (Rosai and Ackerman's, 2004). Mujeres quienes han tenido cáncer de colon, tiroides, ovario o endometrio tienen un riesgo mayor de desarrollar cáncer de mama (Holleb A. I.1991). Factores genéticos: Aunque la mayoría de los canceres de mama son esporádicos, entre el 5 y 10 % son familiares o hereditarios y forman parte del cuadro asociado a diferentes síndromes de cáncer familiar. Las mutaciones hereditarias de los genes BRCA 1 y BRCA 2 (BReast CAncer) incrementan el riesgo de desarrollar cáncer de mama y ovario. Otros síndromes genéticos relacionados con el desarrollo de tumores ginecológicos son el síndrome de Li-Fraumeni, relacionado con el carcinoma de mama, y el síndrome de Linch tipo II, con el desarrollo de cáncer de endometrio y ovario. Las causas de susceptibilidad genética son diversas, aunque, efectivamente, aquellos que cubren una mayor frecuencia son las mutaciones de los genes BCRA1 y BCRA2 (Garcia-Fonsillas, 2003). Otros: Los estudios hechos hasta el momento en mujeres sometidas a mamoplastía de aumento, no han mostrado una incidencia mayor de cáncer de mama que la población general. Una asociación peculiar entre el carcinoma de mama y el meningioma se ha notado repetidamente. Pacientes con el síndrome de ataxia – telangiectasia y con el síndrome de Cowden tienen un gran riesgo de padecer cáncer de mama (Rosai and Ackerman's, 2004). Cerca del 70 % de las pacientes con cáncer de mama no tienen un factor de riesgo evidente (Holleb AI, 1991) (cuadro 13).
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• Edad• Edad a la menarca• Embarazo después de los 30 años • Edad a la menopausia• No lactación
•• Antecedentes familiares directosAntecedentes familiares directos•• Enfermedad benigna mamariaEnfermedad benigna mamaria•• SobrepesoSobrepeso•• Anticonceptivos orales (uso actual)Anticonceptivos orales (uso actual)•• Reemplazo hormonal por Reemplazo hormonal por >> 10 a10 aññosos•• SedentarismoSedentarismo•• Dieta baja en fibraDieta baja en fibra•• Tabaquismo y consumo de alcoholTabaquismo y consumo de alcohol
¿?
Cuadro 13. Análisis de la relevancia de diferentes factores de riesgo para cáncer de mama. Tomado de Detección y Atención Integral del Cáncer de Mama – Epidemiología del Cáncer de Mama del IMSS. Junio del 2005. 2. 4. Diagnóstico. 2.4.1. Examen Clínico El diagnóstico clínico se hace por medio de la elaboración de una historia clínica completa que incluye interrogatorio dirigido a la investigación de factores de riesgo, una exploración física completa especialmente de la región y específicamente la palpación de la glándula por la paciente y por el medico, incluyendo la búsqueda de ganglios linfáticos axilares. Sin embargo tanto su sensibilidad y su capacidad discriminatoria son limitadas. Solo 60 % de los tumores detectados por mamografía son palpables. La impresión clínica es incorrecta en aproximadamente 15 % de los casos que se piensa que son benignos y en aproximadamente 10 % de los casos que se piensa que son malignos. La evaluación clínica de los ganglios linfáticos axilares esta también cargada de errores. Ganglios que clínicamente se piensan que son positivos serán encontrados libres de metástasis microscópicamente en 15 % de los casos (Rosai and Ackerman's, 2004). Por lo anterior, la exploración clínica se debe complementar con diversos estudios de gabinete como la mamografía y sonografia entre otros. 2.4.2. Mamografía Constituye actualmente la mejor herramienta para la detección oportuna del cáncer de mama con una efectividad en la reducción de la mortalidad de 35 % en mujeres de 50 a 69 años. Se estima que la sensibilidad es del 75%, los
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falsos positivos son alrededor del 6% y la especificidad cercana al 94 %, sin embargo estas varían según la edad de la mujer y la habilidad del radiólogo en la interpretación. El éxito de la mamografía o mastografía depende del buen funcionamiento del equipo radiológico, de la experiencia del técnico radiólogo, de la cooperación de la mujer y de la interpretación del médico radiólogo (IMSS Guía Técnica 2004 para Detección y atención integral del cáncer de mama). El amplio uso de la mamografía ha cambiado radicalmente el abordaje diagnóstico del cáncer de mama. Tumores extremadamente pequeños (1 a 2 mm) pueden ser detectados con esta técnica, la cual descansa primariamente en la presencia de calcificación. La incidencia de calificación en carcinoma de mama es de aproximadamente 50 a 60 % y la incidencia de calcificación en enfermedad mamaria benigna es de 20 %. También hay importantes diferencias cuantitativas en la apariencia de la calcificación (Rosai and Ackerman´s 2004). Los hallazgos mamográficos en los Estados Unidos y en nuestro país son ahora reportados universalmente usando el sistema Breast Imaging Reporting and Data System (BI-RADS) que traducido al español se llamaría Sistema de Imagen Radiológica para el Cáncer de Mama:
• BIRADS 0. Estudio no concluyente, insuficiente o técnicamente deficiente. Se requieren de estudios de imagen adicionales para una interpretación adecuada (proyecciones adicionales, amplificaciones, vistas especiales). Siempre que sea posible las mamografías deben compararse con estudios previos.
• BIRADS 1. Mama normal. Estudio normal o negativo. Se dará seguimiento con otra mamografía en dos años. Las mamas son simétricas, no hay masas, disturbios arquitectónicos o calcificaciones sospechosas.
• BIRADS 2. Hallazgos benignos. Estudio negativo sin imágenes sugestivas de cáncer en el que se observa lesión o lesiones de naturaleza benigna específica como quistes, lipomas, galactoceles, hamartomas, fibroadenomas, etc. que requieren seguimiento o tratamiento ocasional según indicación clínica.
• BIRADS 3. Hallazgos probablemente benignos. Un resultado en esta categoría debe tener una alta probabilidad de ser benigno, lo cual es cierto en el 97-100 % de las ocasiones. No es un resultado concluyente, por lo que debe tener evaluación posterior (es conveniente el seguimiento radiológico cada 6 meses durante dos años o biopsia con aguja de corte).
• BIRADS 4. Hallazgos probablemente malignos en lesión no palpable. Estudio que presenta una imagen con apariencia de malignidad no contundente, debe tener evaluación con biopsia escisional o con marcaje previo para la confirmación histopatológica de la lesión detectada por imagen.
• BIRADS 5. Hallazgo maligno. Estudio que mostró imágenes altamente sugestivas de malignidad (microcalcificaciones pleómorficas en grupo mayor de 5, imagen nodular irregular, distorsión de la arquitectura mamaria, etc.). En estos casos se recomienda la realización de una biopsia en forma inmediata para corroborar el diagnóstico y llevar a cabo el tratamiento oportuno.
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(Norma Oficial Mexicana NOM-041-SSA2-2002, Para la prevención, diagnóstico, tratamiento, control y vigilancia epidemiológica del cáncer de mama. IMSS Guía Técnica 2004 para Detección y Atención Integral del Cáncer de Mama). Debe mantenerse en mente que una mamografía negativa no descarta la posibilidad de la presencia de carcinoma ya que aproximadamente 20 % de los tumores palpables no son detectables con esta técnica. La incidencia de falsas positivas es de aproximadamente 1%(Rosai and Ackerman´s 2004). El manejo adecuado de las lesiones de mama detectadas por mamografía requiere una estrecha relación entre el patólogo, el radiólogo y el cirujano que debe incluir un análisis radiológico de los cortes histológicos del espécimen extirpado para corroborar una adecuada correlación microscópica y radiológica; y asegurar la extirpación adecuada del área sospechosa en la mamografía(Rosai and Ackerman´s 2004). 2.4.3. Ultrasonido mamario Complementa la exploración imagenológica, solo o en combinación con la mamografía es básico para la evaluación de la patología mamaria, no sustituye a la mamografía y no se utiliza como método de detección. Permite diferenciar si una masa es sólida o quística y es útil para determinar el tamaño de la lesión. Es útil como guía de procedimientos intervencionistas. De elección si se requiere evaluar a pacientes jóvenes con lesiones palpables. Puede utilizarse para buscar ganglios en región axilar y tomar biopsia (IMSS Guía Técnica 2004 para Detección y atención integral del cáncer de mama). 2.4.4. Resonancia magnética nuclear Actualmente se esta usando la resonancia magnética nuclear con el mismo fin y puede complementar el diagnostico en los casos que lo ameriten como por ejemplo en la detección de carcinoma multicentrico, especialmente la técnica contrastada. Sin embargo no ha logrado desplazar a la mamografía como la técnica imagenologica de elección (Rosai and Ackerman's, 2004). 2.4.5. Citología Los dos métodos que han sido usados para obtener material citológico de las lesiones de mama son aspiración de secreción del pezón y aspiración de la lesión con aguja fina. La citología de secreción de aspiración del pezón tiene un uso limitado por el gran numero de falsas positivas y aun mas importante una falsa negativa puede dar una sensación de falsa seguridad y retraso en el diagnostico de un carcinoma. La citología de aspiración con aguja fina en manos experimentadas es altamente confiable. El promedio de sensibilidad es de aproximadamente el 87 %, la especificidad cerca del 100 %, el valor predictívo de un diagnostico positivo es de cerca del 100 % y el valor predictívo de un diagnostico negativo esta entre un 60 % y 90 %. La distinción entre hiperplasia ductal atípica y
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carcinoma intraductal, así como entre carcinoma ductal in situ e invasor no es posible por este método. Hallazgos negativos o inconclusos en la citología por aspiración con aguja fina no se pueden tomar como diagnósticos definitivos si hay la sospecha clínica de malignidad (Rosai and Ackerman's, 2004). 2.4.6. Biopsia La biopsia con aguja fina, la biopsia con aguja Tru-cut o aguja de corte (Needle core biopsy) y la biopsia excisional son procedimientos que ayudan a hacer el diagnostico en masas palpables o mamograficamente evidentes de la glándula mamaria (De Vita 1997). La biopsia con aguja Tru-cut o aguja de corte (Needle core biopsy) y la biopsia excisional son las mas ampliamente usadas. La biopsia insicional que se usaba para grandes masas ha sido substituida por la primera. La biopsia con aguja Tru-cut es superior a la citología con aguja fina en el hecho de que permite la evaluación de ambas características citológicas y arquitecturales, que pueden proveer un diagnostico definitivo de carcinoma invasivo por un lado y una lesión benigna por otro y esto permitido por la fácil identificación de microcalcificaciones. Un diagnostico definitivo por este procedimiento es posible en cerca del 90 % de los casos. Puede haber también falsos negativos y caracterización incompleta de la lesión (De Vita 1997.Rosai and Ackerman's, 2004). El procedimiento mas preciso es la biopsia abierta insicional o exicional y el estudio transoperatorio por congelación, cuya información le permite al cirujano guiar el criterio quirúrgico a seguir. Las biopsias abiertas de lesiones de mama son usualmente de tipo exicional cuando el tumor mide 2.5 cm. o menos y la de tipo insicional para grandes neoplasias. Efectuar una biopsia abierta seguida por estudio transoperatorio por congelación y mastectomía (si el diagnostico es de carcinoma), ha sido el abordaje estándar para los nódulos mamarios por décadas. El procedimiento es altamente preciso la tasa de falsas positivas es prácticamente cero, la tasa de falsas negativas es menor al 1 % y el número de diagnósticos diferidos es menor al 5 % (Rosai and Ackerman's, 2004). 2.4.7. Diagnostico molecular Actualmente en la Ciudad de Chihuahua cuando el médico tratante lo solicita se investiga por medio de inmunohistoquímica los siguientes antígenos: Receptores de Estrógenos Receptores de Progesterona C-erb-B-2 p53 Ki67 En la actualidad se usa la evaluación de la presencia o ausencia de receptores hormonales (estrógenos y progesterona) en el tejido tumoral lo cual se relaciona bien con la respuesta a terapia hormonal y quimioterapia (Rosai and Ackerman's, 2004).
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Es sabido que los estrógenos al igual que el resto de los glucocorticoides (incluyendo hormona tiroidea, retinoides y vitamina D) difunden directamente a través de la membrana plasmática de las células blanco y se unen a proteínas receptoras nucleares. Los receptores para estrógenos pertenecen a esta gran familia de proteínas. Cuando se une el ligando (estrógeno) a su receptor, se activa este último, uniéndose a secuencias especificas en el DNA para regular la transcripción de varios genes (Alberts, 2002). Todos estos receptores tienen un dominio central para unión al DNA que reconoce una secuencia consenso específica, el elemento de respuesta a glucocorticoides (GRE), el cual se localiza generalmente en un enhancer que puede estar varias kb en dirección 5’ o 3’ del promotor (Lewin, 2000) y un dominio carboxi-terminal que se une a la hormona (ligando), activando al receptor. La unión del receptor al ligando causa que este se una también a proteínas coactivadoras que inducen la transcripción del gen (Alberts, 2002). La expresión de receptores de estrógenos (ER) y progesterona (PR) en los carcinomas de mama se correlaciona con las neoplasias bien diferenciadas (bajo grado) y respuesta favorable al manejo con inhibidores de la aromatasa; no deben ser considerados como marcadores pronósticos. El 60% de las pacientes cuyo tumor primario es ER (+), responde a la terapia hormonal; el 77% de los ER (+) y PR (+) también lo hace; esto solo ocurre en 27% de los ER (+) y PR (-) y en el 46% de los ER (-) y PR (+). Su presencia no garantiza una respuesta favorable; 33% de los pacientes con marcadores positivos no responden a la terapia (IMSS Guía Técnica 2004 para Detección y Atención Integral del Cáncer de Mama). Los marcadores moleculares son estudiados porque potencialmente actúan como factores pronósticos o predictívos. Un factor pronóstico influye en el resultado clínico independientemente del tratamiento, mientras que un factor predictívo se correlaciona con el pronóstico porque esta ligado a la respuesta a una terapia particular. HER2 puede funcionar como ambos factores pronóstico y predictívo; además HER2 puede ser diana o blanco para tratamiento (Fornier et al., 2002). HER2/neu es una Oncoproteína que se expresa en los carcinomas de mama, que tienen un comportamiento agresivo y metástasico. En Estados Unidos, entre el 20 y 30 % de las pacientes sobre-expresan dicha proteína. Este fenómeno se ha utilizado como parámetro pronóstico y como factor predictivo y de indicación para tratamiento con anticuerpos monoclonales dirigidos contra esta proteína. En México se ha reportado la sobre-expresión hasta en 36.1 % de los tumores estudiados (Brück P. et al., 2006). El oncogen HER2/neu, también referido como c-erB-2/neu, codifica una proteína con un peso molecular de 185,000 daltones (p185). El producto del gen es un receptor transmembranal tirosin-cinasa perteneciente a la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFRs) que están estructuralmente relacionados al EGFR humano. Los otros miembros de esta familia son HER1 (también conocido como EGFR), HER3 y HER4. Esta familia de receptores es conocida como el tipo 1 de receptor de tirosin-cinasas (Fornier et al., 2002).
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Ligandos para esta familia de receptores incluyen al factor de crecimiento epidérmico (EGF) y a neuregulinas, también conocidas como factores de diferenciación neu o heregulinas. Al menos seis diferentes ligandos parecidos a EGF, activan el receptor EGF y causan la formación de homodímeros, un evento que se cree activa la tirosin-cinasa intrínseca, resultando en trans-autofosforilación de residuos de tirosina. Los ligandos pueden también inducir heterodimerizacion con otros miembros de la familia HER, formando heterodimeros como HER1/HER2, HER1/HER3 y HER1/HER4. El receptor HER2 es parcialmente homologo al EGFR, sin embargo, a la fecha, a diferencia de EGFR, HER3 y HER4, no se ha identificado ligando para HER2. La segunda clase de ligandos para los receptores HER, colectivamente llamadas neuregulinas, se unen directamente a HER3 y HER4 pero no a HER2 o al EGFR. Se ha hipotetizado que el principal papel de HER2 puede ser dimerizar con otros miembros de la familia de receptores. Interesantemente, HER2 es el socio preferido para heterodimerización y es frecuentemente transactivado por ligandos parecidos al EGF o neuregulinas resultando en la formación de heterodimerizaciones con otros miembros de la familia HER. Esta heterodimerización permite la participación de HER2 en transducción de señales, aun en la ausencia de ligando conocido (Fornier et al., 2002). El producto del gen HER2 esta sobre-expresado o amplificado en aproximadamente el 20 a 25 % de los canceres de mama humanos. El producto del gen HER2 esta compuesto de un dominio citoplásmico con actividad tirosin-cinasa, un dominio transmembranal y un dominio extracelular que puede desprenderse de la superficie de las células del cáncer de mama. La amplificación del proto-oncogen HER2 y la sobre-expresión de su producto proteico en pacientes con cáncer de mama se ha ligado a un pronostico pobre, es decir a un curso clínico mas agresivo y sobrevida acortada. Aunque aun inconclusos, los datos también sugieren que la sobre-expresión de HER2 puede utilizarse como factor predictívo, originando la posibilidad de una selección pretratamiento de pacientes quienes puede beneficiarse de estrategias terapéuticas particulares, específicamente de la quimioterapia adyuvante que contiene el trastuzumab (Herceptina®, anticuerpo monoclonal contra HER2). La evaluación de HER2 puede hacerse por hibridación in situ fluorescente o por inmunohistoquímica (Fornier M. et al., 2002).
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Cuadro 14. Algunas de las características de c-erb-B-2. La identificación de defectos heredados en genes somáticos tiene también un importante papel en el diagnóstico de la enfermedad. Uno de los primeros genes con estas características es el gen supresor de tumores p53, el cual se encuentra con mutaciones en el cáncer de mama hereditario y en el síndrome de Li-Fraumeni. Se han descrito mutaciones en este gen también en el contexto de la progresión de cáncer de mama esporádico (no heredofamiliar). La sobre-expresión de p53 en su forma mutada, le confiere pobre pronóstico y la probabilidad de pobre respuesta a terapia endocrina y quimioterapia (De Vita y col 1997). Ki-67 es una proteína nuclear de gran tamaño con numerosos dominios repetidos que interviene en el mantenimiento del ciclo celular. El antígeno Ki-67 es considerado como un marcador de la proliferación de células neoplásicas, ya que existe una elevada correlación entre el índice Ki-67 y el grado histológico de malignidad (Diccionario ilustrado de términos médicos). Ki-67 es una molécula que puede ser fácilmente detectada en células en crecimiento en biopsias y muestras de tejido, dando indicios del porcentaje de células tumorales que están dividiéndose activamente dentro del tumor y que dan origen a más células cancerosas (Encyclopedia de Cancer-Ki67). El resultado que se obtiene a través de este examen es llamado la fase S, o bien la fracción proliferativa o de crecimiento del tumor. Esta información puede tener un peso muy importante en la decisión sobre el mejor tratamiento en pacientes con cáncer. La proliferación es un signo clave de la progresión de los tumores y ahora es ampliamente estimada por la evaluación
ErbB-2 • También conocido como HER2/neu
• No se le conocen ligandos
• La activación se sabe que ocurre por medio de la heterodimerización con otros miembros de la familia ErbB.
• ErbB-2 es el socio preferido para heterodimerización con otros miembros de la familia
• Es mas resistente a la degradación intracelular, lento para inactivar comparado con otros miembros de la familia
• La sobreexpreción de ErbB-2 en tumores se correlaciona con pobre pronóstico y disminución del tiempo de sobrevida.
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inmunohistoquímica del antígeno nuclear Ki-67. La expresión de Ki-67 se correlaciona con otras medidas de proliferación, incluyendo la evaluación de la fase S y la captación de bromodeoxiuridina por las células. Ki-67 alto es un signo de pobre pronóstico asociado con una buena oportunidad de respuesta clínica a quimioterapia, sin embargo su aplicación como marcador intermediario farmacodinámico de la efectividad de la terapia médica mantiene una gran promesa para la evaluación rápida de drogas nuevas (Urruticoechea, et al 2005). Ki-67 fue identificado por Gerdes et al en 1991 como una proteína nuclear no histona, poco tiempo después el anticuerpo correspondiente fue descrito por el mismo grupo. La ausencia de esta proteína en células en reposo y su expresión universal en tejidos proliferantes despertó gran interés como marcador de proliferación celular. El gen de Ki-67 se encuentra localizado en el brazo largo del cromosoma humano 10 (10q25). Dos especies de RNAm resultan de procesamiento alternativo (“splicing”) que codifican dos isoformas de la proteína, la forma “grande” con una masa aproximada de 359 kD y la forma “pequeña” de 320 kD (Urruticoechea, et al 2005). La vida media de la proteína Ki-67 ha sido estimada de alrededor de 60 a 90 minutos. Su localización varia durante el ciclo celular, en G1 temprana se encuentra en el nucleoplasma, en G1 tardía en grandes gránulos perinucleolares, durante la fase S y G2 se encuentra principalmente asociada con la región nucleolar y luego desaparece en anafase-telofase. Poco se conoce de su función mas allá de que es una proteína fosforilada vía serina y treonina con papel critico en la división celular (Urruticoechea, et al 2005). Niveles altos de Ki-67 están asociados con mejor respuesta quimioterapia, pero es importante aclarar que también niveles altos están asociados con pobre pronóstico. Los niveles de Ki-67 disminuyen importantemente con la supresión estrogénica acompañado de un incremento en la apoptosis, esto resulta en un regresión tumoral; la reducción con tamoxifeno es menor. La disminución de Ki-67 ocurre tanto con tratamiento de quimioterapia como con tratamiento quimiohormonal mezclado (Urruticoechea, et al 2005). 2. 5. Clasificación. El cáncer de mama se puede clasificar de varias maneras. Para clasificar clínicamente el estadio en que se encuentra el paciente se usa la estadificación TNM que de acuerdo al tamaño del tumor (T), al tipo y localización de ganglios linfáticos involucrados (N) y la presencia o no de metástasis (M) permite clasificar en estadios o etapas clínicas la gravedad del caso con lo cual se puede seleccionar el tratamiento apropiado y también permite dar un pronostico aproximado. El Comité Americano Conjunto sobre el Cáncer (AJCC, por sus siglas en inglés American Joint Commitee on Cancer Clasification) referido en la Norma Oficial Mexicana NOM-041-SSA2-2002, para la prevención, diagnóstico, tratamiento, control y vigilancia epidemiológica del cáncer de mama, ha designado las etapas o estadios mediante la clasificación TNM de la siguiente manera:
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ESTADIO TUMOR GANGLIO METASTASIS 0 Tis N0 M0 I T1* N0 M0 IIA T0 N1 M0 T1 NI M0 T2 NO M0 IIB T2 N1 M0 T3 NO M0 IIIA T0 N2 M0 T1 N2 M0 T2 N2 M0 T3 N1,N2 M0 IIIB T4 N0, N1,N2 M0 IIIC Cualquier T N3 M0 IV Cualquier T Cualquier N M1 * T1 incluye T1mic Tabla 2. Agrupación por estadios del cáncer de mama (También referido en IMSS Guía Técnica 2004 para Detección y atención integral del cáncer de mama). Microscópicamente las dos determinaciones claves para hacer el estudio morfológico del carcinoma de mama son: (1) si el tumor esta confinado al componente glandular del órgano (carcinoma in situ) o si ha invadido el estroma (carcinoma invasor) y (2) si es del tipo ductal o lobular. El termino carcinoma ductal puede ser tomado para implicar que el tumor se origina o compromete un ducto y lo mismo puede asumirse del carcinoma lobular. La evidencia obtenida de varios estudios indica que ambos tipos de tumores se originan del mismo segmento de la glándula mamaria (la unidad ducto-lobular terminal que se abrevia en ingles TDLU) (Figs.1 y 2) y que el tipo de tumor se define por las características de su citoarquitectura que establecen su identidad más que su localización precisa en la mama (Figs. 3, 4 y 5).
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Fig. 1.- Esquema que muestra la unidad ducto-lobular terminal que se abrevia en inglés TDLU.
Fig. 2.- Corte microscópico de la unidad ducto-lobular terminal que se abrevia en inglés TDLU
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Sin embargo la nomenclatura más convencionalmente usada es la de lobular y ductal con diferentes formas de morfología histológica, que podemos agruparlas de la siguiente manera (Rosai and Ackerman's, 2004):
La Organización Mundial de la Salud (OMS) utiliza una clasificación histopatológica de los carcinomas mamarios más simple, y es la que aparece en la Norma Oficial Mexicana NOM-041-SSA2-2002, para la prevención, diagnóstico, tratamiento, control y vigilancia epidemiológica del cáncer de mama. En la tabla siguiente se muestra dicha clasificación:
CARCINOMA IN SITU
Carcinoma ductal in situ
- Comedocarcinoma - Carcinoma Papilar - Otras formas: sólido, cribiforme, micropapilar, etc.
Carcinoma lobular in situ
Carcinoma ductal invasivo
- Carcinoma ductal invasivo clásico - Carcinoma tubular - Carcinoma cribiforme - Carcinoma mucinoso - Carcinoma medular - Carcinoma papilar invasivo - Carcinoma apócrino - Carcinoma juvenil (secretorio) - Carcinoma con características neuroendocrinas (incluyendo el llamado tumor carcinoide) - Carcinoma metaplásico - Carcinoma de células escamosas y tumores relacionados - Carcinoma inflamatorio - Enfermedad de Padget
CARCINOMA INVASIVO
- Carcinoma de tipo clásico - Carcinoma histiocitoide - Carcinoma lobular pleomorfico - Carcinoma en anillo de sello - Carcinoma tubulolobular - Otros tipos
Carcinoma lobular invasivo
Carcinoma lobular y ductal mixto Carcinoma indeterminado (no clasificado) Carcinoma microinvasivo
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Tabla 3. Clasificación histopatológica del cáncer de mama de acuerdo a la OMS (Tomada de IMSS Guía Técnica 2004 para Detección y atención integral del cáncer de mama).
TIPO DE TUMOR
No infiltrante Carcinoma lobulillar in situ Carcinoma ductal in situ
Invasor Carcinoma ductal invasor no especifico (NST)
Carcinoma ductal invasor con extenso componente intraductal Carcinoma ductal invasor con enfermedad de Padget
Carcinoma lobulillar invasor Carcinoma medular Carcinoma mucinoso o coloide Carcinoma papilar Carcinoma tubular Carcinoma adenoideo quístico Carcinoma secretor (juvenil) Carcinoma apócrino Carcinoma con metaplásia
Tipo escamoso Tipo células fusiformes Tipo cartilaginoso y óseo Tipo mixto
Carcinoma inflamatorio Otros
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Fig. 3. Carcinoma ductal in situ con necrosis tipo comedo.
Fig. 4. Carcinoma ductal invasivo asociado con un componente de carcinoma intraductal extenso.
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Fig. 5. Carcinoma lobular invasivo. 2. 6. TRATAMIENTO Las decisiones terapéuticas del cáncer de la mama se deben formular de acuerdo con las categorías del sistema de clasificación, condiciones generales de la paciente, etapificación de la enfermedad, estado hormonal de la mujer, recursos humanos y materiales con que se cuente, considerando la voluntad y libre decisión de la paciente. Los métodos terapéuticos que en la actualidad se emplean para tratar el cáncer mamario son: Cirugía, Radioterapia, Quimioterapia y Hormonoterapia (Norma Oficial Mexicana NOM-041-SSA2-2002, Para la prevención, diagnóstico, tratamiento, control y vigilancia epidemiológica del cáncer de mama. IMSS Guía Técnica 2004 para Detección y atención integral del cáncer de mama).
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3. ANTECEDENTES 3.1. P/CAF y p300/CBP PARTICIPAN EN LA TRANSCRIPCIÓN POR SU ACTIVAD HAT Los coactivadores transcripcionales son moléculas proteicas que juegan importantes papeles en la regulación génica, ya que catalizan la acetilación reversible de histonas modificando la estructura de la cromatina (Lewin, 2000). Esta función es conocida como histona-acetiltrasferasa (HAT) y afecta a varias histonas como la H-4 y la H-3. Hasta el momento se han descrito varios de estos coactivadores como GCN5, P/CAF, TAFII250, p300 y la estrechamente relacionada proteína de unión a CREB (CBP). CBP y p300 pueden formar grandes complejos proteicos que incluyen otras acetilasas (por ejemplo P/CAF) que sirven como coactivadores de otros factores de trascripción (Hecht, 2000). CBP y p300 tienen una gran similitud en varios dominios por lo que se les ha considerado proteínas funcionalmente homólogas y generalmente se les refiere como p300/CBP, aunque también tienen diferencias funcionales (Hecht, 2000). Estos dos factores estructuralmente relacionados están involucrados en el control del ciclo y la diferenciación celular, co-actúan con numerosos activadores transcripcionales incluyendo a p53. Ambos coactivadores se unen a la oncoproteína del adenovirus E1A y a transactivadores como CREB, c-Jun/c-Fos, c-Myb/vMyb, MyoD, Stat1, Stat2 y a p53 (Liu et al., 1999). p300 y CBP asociados a P/CAF (factor asociado a p300 y CBP) han sido implicados en la progresión del ciclo y la diferenciación celular. Existe evidencia suficiente para sugerir que CBP/p300 y P/CAF funcionan como coactivadores transcripcionales de p53 para activar completamente la expresión del gen p21/waf1/cip1 (Liu et al., 1999). Si bien cada una de las proteínas P/CAF y p300/CBP, tiene función HAT independiente, algunas veces es necesario que funcionen las tres unidas formando un complejo coactivador que afecta a las histonas de los nucleosomas en diferentes sitios permitiendo la relajación o “aflojamiento” del core del nucleosoma facilitando la transcripción. La acetilación de los residuos de lisina en las colas amino-terminal de las histonas facilita la activación de genes, quizá reduciendo la afinidad de la cola de las histonas por el DNA, y por este medios promover la unión del factor transcripcional al DNA nucleosomal. CBP/p300 y P/CAF tienen poca similitud en la secuencia dentro de sus dominios HAT y de acuerdo a esto exhiben diferencias en la especificidad de su substrato: CBP/p300 recombinantes acetilan por igual las cuatro histonas (H3, H2A, H2B y H4) aún incorporadas en los nucleosomas mientras que P/CAF preferentemente acetila H3 y principalmente cuando está libre, en estado no nucleosomal. También se ha demostrado que p300 y P/CAF acetilan p53 en el extremo C-terminal sólo que en un residuo de lisina distinto, incrementando su actividad de unión a DNA, aumentando sinergicamente la activación transcripcional del gen p21. Se ha reportado que P/CAF específicamente acetila el residuo 320 de lisina de p53 mientras que p300 la lisina 373 (Liu et al., 1999). La compleja maquinaria de transactivación que media la regulación por receptores de estrógenos, requiere de la interacción de varios cofactores y coactivadores como los antes mencionados, y además de algunos co-represores. Se han encontrado dos tipos de receptores de estrógenos, ERα y
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ERβ los cuales se expresan de diferente manera durante el desarrollo y progresión del cáncer de mama y la expresión de los mismos va relacionada directamente a diferentes coactivadores para cada uno de ellos. Es de llamar la atención en el estudio hecho por Kurebayashi, et al la baja expresión de los coactivadores A1B1, CBP y P/CAF en los carcinomas intraductales invasivos (Kurebayashi J. et al., 2000). 3.2. p53 En los mamíferos existen moléculas que se encargan de vigilar la aparición de mutaciones durante el ciclo celular e inducir la corrección de las mismas o la apoptósis de la célula portadora; cuando estos mecanismos fallan se perpetúa la mutación e incrementa la posibilidad de la transformación celular. Una de tales moléculas es la proteína p53, llamada así por su masa molecular que es de 53 kDa y que es codificada por el gen supresor de tumores que lleva el mismo nombre, que está localizado en el brazo corto del cromosoma 17 y que contiene 11 exones que codifican para 393 aminoácidos. La proteína p53 es una fosfoproteína nuclear capaz de reconocer una secuencia especifica de DNA y actuar como factor de transcripción (Orozco E. y Gariglio P., 2000). La proteína supresora de tumores p53 es un factor de transcripción secuencia-específico que modula la respuesta de las células al daño al DNA, diminuyendo el crecimiento celular y promoviendo la muerte celular programada por su acción como activador transcripcional que se une al DNA, para inducir la expresión de genes blanco corriente abajo, como son p21/waf1/cip1, GADD45, ciclina G, bax, IGF-BP3 y mdm2, cuyos productos están relacionados con la detención del ciclo celular, apoptósis y regulación de la función de p53 en células expuestas a agentes que dañan el DNA (Liu et al., 1999). Se han identificado tres dominios funcionales en p53: un dominio de transactivación amino-terminal, un dominio central de unión a DNA secuencia específico y un dominio carboxi-terminal de oligomerización, en el que existen dos regiones que regulan negativamente su actividad de unión a DNA. Algunas modificaciones como la fosforilación de estos dominios afectan la función de p53 por medio de la modulación de su unión al DNA. Para funcionar como factor de transcripción, p53 requiere a los coactivadores p300/CBP (también usados por otros muchos factores de transcripción, por ejemplo los ER) (Lewin B., 2000). Existen varios procesos epigenéticos necesarios para la funcionalidad de esta molécula, uno de ellos es la acetilación, para lo cual es necesario la presencia de varios coactivadores con función de histona-acetiltrasferasa (HAT) como P/CAF y p300/CBP, como ya se mencionó antes con sus diferencias en el residuo de lisina que acetilan, lo cual sinergíza su acción, incrementando la afinidad de p53 para unirse a los promotores de los genes blanco. Por otra parte, una vez que se une a los genes blanco, p53 produce un reclutamiento del complejo coactivador CBP-P/CAF acetilando las histonas nucleosomales y de esta manera promueve el acceso al DNA de la RNA-polimerasa II y otros factores basales de transcripción. El factor p53 actúa como un tetrámero y se ha postulado que asume dos estados dinámicos, uno de alta afinidad y otro de baja afinidad para unirse al DNA. Estos estados están en relación con los dominios regulatorios negativos RD1 y RD2 del extremo c-terminal y que son blanco de agentes que dañan el DNA (como la radiación UV) y que de esta manera regulan la expresión de p53, incrementándose esta en situaciones de daño al DNA (Liu et al., 1999).
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Es ampliamente conocida la función de la proteína p53 como vigilante del genoma durante la replicación del DNA en el ciclo celular y en la transcripción de algunos genes blanco de esta oncoproteína siendo uno de los mas conocidos p21/waf1/cip1. p21 es un inhibidor universal de cdk, uniéndose a todos los complejos cdk (cinasas dependientes de ciclinas) 2,4,6. Esto bloquea la progresión del ciclo celular de G1/S (Lewin B., 2004). Es decir p21 normalmente se encuentra unido en proporción 1:1 a una cdk; cuando hay daño celular y p53 es activado se incrementa la cantidad de p21 bloqueándose la actividad de las cdk mencionadas e inhibiendo el ciclo; pero si p53 no funciona, este bloqueo no se produce, el ciclo continúa y el daño se perpetúa. Las mutaciones del gen p53 se encuentran presentes en muchos cánceres humanos, lo que indica que esta molécula no está involucrada en procesos tejidos específicos, y que la presencia de p53 silvestre es indispensable para evitar la proliferación celular descontrolada. Es decir las células tienen niveles basales de esta molécula, pero se ha visto que cuando se produce daño al DNA se incrementan las cantidades de la misma. La activación de p53 puede desencadenar dos tipos de acontecimientos: inhibición de crecimiento (para que se repare el daño) o apoptósis dependiendo de la etapa del ciclo celular en que se encuentre la célula. En pacientes con carcinoma de mama invasivo se ha detectado ausencia o disminución de P/CAF, por lo que supusimos que la función de p53 en referencia a la estimulación de la transcripción de p21, se encuentra afectada. Por lo anterior nos propusimos evaluar en biopsias de cáncer de mama invasivo no heredofamiliar, los niveles de expresión de p53, P/CAF y p21.
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4. JUSTIFICACION Por todo lo expuesto anteriormente, es claro que el cáncer de mama es ya un problema de salud publica que seguramente se agravará en los próximos años, cuando mas mujeres alcancen la edad promedio de aparición de esta neoplasia. De ahí que deban implementarse todos los mecanismos necesarios que permitan el diagnóstico temprano y oportuno de esta enfermedad. En 1997 Scolnick D., et al. reportaron que CBP y P/CAF incrementan la habilidad de p53 para activar la expresión del gen p21/waf1/cip1. En 1998 en el Laboratorio 1 del Departamento de Genética y Biología Molecular del CINVESTAV-IPN se realizó un proyecto titulado “Análisis de la Expresión de los Coactivadores p300 y P/CAF en la regulación de la actividad transcripcional del factor TCF/β catenina en cáncer mamario”, en el que se encontró la ausencia de expresión del gen P/CAF en todos los tumores de cáncer de mama estudiados. En el estudio realizado por Kurebayashi, et al., en 2000, se aprecia una baja expresión de A1B1, CBP y P/CAF en los carcinomas mamarios invasivos. Por todo lo anterior supusimos que la función de p53 en referencia a la estimulación de la transcripción de p21 estaba afectada y decidimos investigarlo. Si esto fuera así, ayudaría a entender mejor los mecanismos de carcinogénesis del cáncer de mama y pudiera aportar otro marcador molecular con valor predictivo o pronóstico.
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5. HIPOTESIS La ausencia de expresión de P/CAF en células de cáncer mamario trae como consecuencia la ausencia expresión de p21, independientemente del estado del gen p53.
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6. OBJETIVO GENERAL
• Evaluar en muestras frescas de cáncer de mama invasivo no heredofamiliar, los niveles de expresión de P/CAF y p21
7. OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Evaluar los niveles de expresión de p21 como gen blanco de p53 por RT-PCR en células de cáncer de mama.
• Evaluar los niveles de expresión del co-activador P/CAF en células de
cáncer de mama por RT-PCR.
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8. MATERIAL Y METODOS 8.1. Material Biológico Se determinó utilizar muestras de tumores diagnosticados como cáncer de mama invasivo. Inicialmente utilizamos muestras incluidas en bloques de parafina, sin embargo observamos que la calidad del RNA obtenido no era la adecuada para el presente estudio, por lo que decidimos hacerlo en muestras de tejido fresco. En cuanto se presentaba un caso quirúrgico, de la pieza enviada para estudio transoperatorio se tomaba un fragmento, se procedía a congelarlo y almacenarlo en nitrógeno liquido hasta el momento de transportarlo en hielo seco (CO2) por vía aérea desde la Ciudad de Chihuahua al Laboratorio 1 del Depto. de Genética y Biología Molecular del CINVESTAV-IPN, donde se depositaba en un ultracongelador a -80ºC hasta iniciar su procesamiento. 8.2. Extracción de RNA total Todos los procedimientos se realizaron utilizando guantes de látex para evitar contaminación y/o degradación de las muestras. Se tomó un fragmento de cada muestra que se mantenía en el ultracongelador y se colocó en un mortero estéril. Se le agregó una pequeña cantidad de nitrógeno líquido, se pulverizó completamente el tejido utilizando el pistilo del mortero, se agregó un mililitro del reactivo Trizol® (GIBCO-BRL) y se homogenizó completamente. El homogenizado se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. luego se agitó vigorosamente en vortex, y se procedió a centrifugarlo durante 10 min. a 12000 rpm a una temperatura de -4ºC. Enseguida y con mucho cuidado se recuperó el sobrenadante en otro tubo de microfuga para incubarlo a temperatura ambiente durante 5 minutos, al final de los cuales se le agregaron 200 µl de cloroformo y se agitó vigorosamente en vortex hasta que el contenido presento una apariencia translucida. Se dejó incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos y posteriormente se centrifugó a 10000 rpm a una temperatura de – 4ºC durante 15 min. La fase acuosa se recuperó en otro tubo microfuga con cuidado de no tomar la interfase. Enseguida se precipitó el RNA con un volumen de 500µl de isopropanol por cada mililitro de trizol utilizado, para incubarlo luego a temperatura ambiente durante 10 min. Se procedió a centrifugarlo a 12000 rpm a una temperatura de –4ºC durante 10 minutos, después se eliminó el sobrenadante decantándolo para luego dejar secando el tubo en un papel absorbente libre de RNAasas, la pastilla así obtenida se lavó con 1 ml de etanol al 70% enfriado a -20ºC y de nuevo se centrifugó a 7500 rpm a una temperatura de – 4ºC. Con cuidado de no tirar la pastilla se decanto el contenido de los tubos y se dejaron secar durante 5 a 10 minutos. El RNA así obtenido se resuspendió en 20 µl de agua DEPC o miliQ. A los 20 µl se agregaron 3 µl de buffer para DNAasa mas 2 µl de DNAasa mas 5 µl de agua DEPC o mili-Q dando un total de 30 µl (Nota: Se adiciona primero el agua y después la enzima). Luego se incubó 1 hora a 37ºC y terminada la incubación se agregaron 20 µl de agua DEPC dando un total de 50µl de RNA. A esto se le agregaron 50 µl de fenol para RNA (pH 4) enfriado a una temperatura de – 4ºC y se agitaron en vortex por 30 segundos, luego se centrifugó por 2 minutos a
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14000 rpm para enseguida recuperar la fase acuosa y agregar en la campana de extracción 50 µl de cloroformo : isoamilico 24:1. Posteriormente se centrifugó a 14000 rpm por 2 minutos. La fase acuosa se recuperó en la campana de extracción con cuidado de no llevar cloroformo, enseguida se agregaron 100 µl de isopropanol frío y se dejó 10 minutos en hielo. Se decanto el isopropanol en otro tubo por si se perdía la pastilla poder recuperarla y se agregaron 50µl de etanol al 75 %, se centrifugó a 12000 rpm por 5 minutos y se decantó el etanol en otro tubo. Posteriormente se dejo secar a temperatura ambiente por 5 minutos y luego se resuspendió en 20 µl de agua DEPC. Al final se guardo a -20ºC que es lo que se recomienda si se va a usar antes de un mes o a -70 ºC si se va guardar por mas tiempo. 8.3. RT (Obtención de cDNA) Primeramente se preparó una solución que contuviera la mezcla de los cuatro nucleótidos (dNTP mix) de la siguiente manera: De una solución 10 mM de cada nucleótido se tomaron volúmenes iguales y se mezclaron para obtener una concentración 2.5 mM de cada uno de ellos. Posteriormente se procedió a obtener el cDNA a partir del RNA que se extrajo previamente, para lo cual en un tubo de microfuga estéril y libre de RNAasas se coloco la siguiente mezcla de reacción: 2.0 µl de RNA total (aproximadamente 2µg ) 1.0 µl de oligo dT- primer (0.5µg) 10.4 µl de agua DEPC o miliQ Nota: Los oligos dT se unen únicamente a RNAm poli (A+) La mezcla se incubó a 60ºC por 5 minutos y posteriormente se colocó en hielo para su enfriamiento rápido. Se agregaron los demás componentes de la mezcla de reacción: 5.0 µl de Buffer de primera cadena (M-MLV 5X Buffer de reacción) 5.0 µl de dNTP mix 0.6 µl de inhibidor de RNAasas (RNasin) 1.0 µl de enzima M-MLV RT (200 U/µl) Se agitó suavemente la mezcla de reacción y se incubó a 42ºC por 60 minutos. Posteriormente la enzima se inactivó incubando a 60ºC por 5 minutos. Se colocó inmediatamente en hielo por 5 minutos y se almaceno a -20ºC hasta realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 8.4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Se realiza una mezcla maestra (master mix) considerando 50 ul por cada reacción con los siguientes reactivos: 5 µl de Buffer Taq DNA polimerasa cuya concentración en la solución stock es 10X 1.5 µl de MgCl2 con una concentración inicial de 25mM 1 µl de dNTP mix 10 mM 1 µl Oligonucleótido F (Forward Primer) con concentración inicial de 10 pM 1 µl Oligonucleótido R (Reverse Primer) con la misma concentración 200 ng de cDNA
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2.5 Unidades de enzima Taq DNA polimerasa La cantidad de master mix a preparar es el necesario para el numero de reacciones que se van a trabajar, considerando un total de 50 µl por reacción, cambiando solamente el cDNA correspondiente a cada muestra y el juego de oligonucleótidos especifico (GAPDH, p21 o P/CAF). Los perfiles térmicos y los juegos de oligonucleòtidos utilizados fueron los siguientes: Para GAPDH: Paso 1: 94ºC 4 min. 1 ciclo Paso 2: 94ºC 1 min. 60ºC 45 seg. 30 ciclos 72ºC 45 seg. Paso 3 60ºC 1 min. 1 ciclo 72ºC 7 min. Al final la temperatura se mantiene a 4ºC. Secuencia de los oligonucleótidos: GAPDH-A 5-CAT CTC TGC CCC CTC TGC TGA-3 GAPDH-B 5-GGA TGA CCT TGC CCA CAG CCT-3 El tamaño del producto esperado es de aprox. 305 pb Para p21 Primer paso: 94ºC 5 min. 1 ciclo Segundo paso: 94ºC 30 seg. 55ºC 1.0 min. 35 ciclos 72ºC 90 seg. Tercer paso: 72ºC 5.0 min. 1 ciclo Al final la temperatura se mantiene a 4ºC. Secuencia de los oligonucleótidos: CIP-F 5′ AAG ACC ATG TGG ACC TGT CA 3′ CIP-R 5′ GGC TTC CTC TTG GAG AAG AT 3′ Tamaño esperado del producto = 170 pb Para P/CAF Paso 1 94ºC. 4 min. 1 ciclo Paso 2 94ºC 15 seg. 57ºC 15 seg. 40 ciclos 72ºC 15 seg. Paso 3 72ºC. 5 min. 1 ciclo
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Al final la temperatura se mantiene a 4ºC. Oligos usados y su secuencia: PCAF-F 5′ AGA ACA TTG CTT CGC TCG G 3′ PCAF-R 5′ TGC CTC AAG TCC AGA AGA GG 3′ Tamaño esperado del producto = 345 pb Se verifica que la molécula del control haya sido amplificada por medio de una electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1.5 % utilizando como amortiguador de corrida Tris - acetatos 1X (TAE) y un voltaje de corrida de 70 volts de manera constante durante 45 minutos. En todos los ensayos de PCR se utilizó en el primer carril del gel un marcador de pares de bases (100 bp DNA Ladder- Invitrogen®). 8.5. PACIENTES Durante el periodo de tiempo en el que se colectaron las muestras cambiaron los protocolos de tratamiento de los pacientes con cáncer de mama y antes de la extirpación quirúrgica del tumor son sometidos a algún tipo de tratamiento no quirúrgico como la radioterapia, lo cual, por el efecto conocido de la radiación en los tejidos, podría modificar la expresión, de algunas de las moléculas que nos proponíamos estudiar, por lo que el número de muestras de tumores de pacientes con cáncer de mama que no hubieran recibido tratamiento alguno fue menor al originalmente propuesto. En total fue posible incluir diecisiete pacientes del sexo femenino a las que se les diagnosticó, por estudio histopatológico, adenocarcinoma ductal infiltrante de la glándula mamaria en el Servicio de Patología del Hospital General “Dr. Salvador Zubirán Anchondo”, servicio que apoya al Centro Estatal de Cancerología de los Servicios de Salud del Estado de Chihuahua durante los años 2003 a 2005. Dichas pacientes deberían no tener antecedentes heredofamiliares de cáncer de mama, es decir, deberían no tener familiares de primer grado que hubieran padecido cáncer de mama o cáncer en la glándula mamaria contralateral. Además las pacientes deberían contar con expediente clínico completo y accesible. Se incluyo como control negativo una muestra de tejido mamario de una paciente sana, siendo en este caso una paciente a la cual se le redujo el tamaño de su glándula mamaria pero que no presentaba ninguna patología. Así se formaron dos grupos de estudio:
GRUPO 1: Diecisiete muestras de tumores provenientes de pacientes con diagnóstico histopatológico de carcinoma de mama.
GRUPO CONTROL: Una muestra de tejido mamario proveniente de una paciente sana. En el diagrama siguiente se muestra la estrategia experimental que seguimos para realizar este trabajo:
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9. RESULTADOS 9.1. OBTENCIÓN DE RNA TOTAL
Para la obtención del RNA, se tomaron las muestras frescas del tejido tumoral y del normal las cuales fueron conservadas en nitrógeno líquido, transportadas y almacenadas como se describió previamente en la sección de “Material y Métodos”, y de ellas se tomo un fragmento y se procesó homogenizando el tejido y lisando las células como se describió en el mismo apartado. Se procedió a la obtención del RNA total mediante el uso del reactivo de Trizol ya descrito. Se aplicó DNAasa para eliminar completamente cualquier residuo de DNA genómico que pudiera contaminar. Se corroboró la presencia de RNA de buena calidad en cada una de las muestras por electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa al 1.2 %, en donde se observó un patrón de corrimiento que mostraba una banda superior correspondiente al RNA ribosomal 28S, una banda media del RNA ribosomal
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
Muestras de pacientes diagnosticadas como carcinoma de mama y tejido
normal
Extracción de RNA total
Copia a cDNA
PCR de GAPDH
PCR para PCAF PCR para P 21
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18S y una banda inferior correspondiente al RNA de transferencia. La figura 6 muestra una imagen de un gel representativo donde se aprecia el corrimiento electroforético del RNA obtenido.
Fig. 6. Análisis de la calidad del RNA obtenido de las muestras de cáncer de mama y una paciente sana. Se observa el patrón de corrimiento electroforético de las muestras referidas que muestra una banda superior correspondiente al RNA ribosomal 28S, una banda media del RNA ribosomal 18S y una banda inferior correspondiente al RNA de transferencia. 9.2. RT-PCR Una vez evaluada la calidad del RNA obtenido en cada muestra, se procedió a realizar la metodología correspondiente para obtener cDNA a partir de RNA poli A+. Esto se realizó utilizando Oligo dT y para la RT la enzima M-MLV RT (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase -Promega®). La calidad de estos reactivos biológicos (RNA y cDNA) es fundamental para obtener resultados confiables y poder realizar un análisis de los datos. Para corroborar que la integridad del RNA fuera la adecuada para evaluar la expresión de genes específicos, se realizó un primer ensayo evaluando la presencia de cDNA proveniente de la transcripción de un gen constitutivo, como es el de la enzima gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Se utilizó un par de oligonucleótidos específicos para este gen, y en todas las muestras analizadas se obtuvieron los amplificados esperados de 305 pb, lo que nos permitió comprobar que el cDNA obtenido era de buena calidad. Un gel representativo de las muestras analizadas se encuentra en la figura 7. Además se incluyó, como control positivo, cDNA obtenido a partir de RNA de la línea celular MCF7 de carcinoma mamario. Todas las muestras expresaron GAPDH. Confirmando la calidad del cDNA para los ensayos de PCR de los genes que estábamos investigando.
1.- E-1202-03 2.- G-01154 3.- Mama normal 4.- Q-2381 5.- Q-03-2543
1 2 3 4 5
RNA 28S RNA 18StRNA
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Fig. 7. Análisis de la expresión de el gen control GAPDH en muestras de cáncer de mama. La imagen corresponde a un gel (agarosa al 1.5%) de corrimiento electroforético representativo de las muestras analizadas. La banda de superior, de 305pb corresponde a GAPDH, la inferior a los oligonucleotidos utilizados. En seguida realizamos los ensayos de PCR con oligonucleótidos específicos para detectar el gen p21. La figura 8 muestra un gel representativo de la migración electroforética de los productos de la PCR en un gel de agarosa al 1.5%. La banda esperada de 170 pb correspondiente al gen estudiado se observa en todas las muestras analizadas, incluyendo en el control positivo de la línea celular MCF7. El resultado final de todas las muestras estudiadas se presenta mas adelante (ver Tabla 4).
1.- Marcador de 100 p b 2.- E-01-2022 (Paciente) 3.- G-01154 (mama normal) 4.- Q-03-2543 (Paciente) 5.- Q-03-2548 (Paciente) 6.- Q-2381(1) (Paciente) 7.- Q-3206 (Paciente) 8.- Q-2603 (Paciente) 9.- Control+ Células MCF-7 10.-Control (-) sin DNA
305 pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
300
100 200
400
pb
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Fig. 8. Análisis de la expresión de p21 en muestras de cáncer de mama. La figura muestra la imagen de un gel representativo de la migración electroforética de los productos de la PCR del gen p21 en un gel de agarosa al 1.5%. Una vez analizada la expresión de p21, realizamos el análisis de la presencia de mRNA de P/CAF utilizando oligonucleótidos específicos. La figura 9 muestra una imagen de un gel representativo del corrimiento electroforético de los productos de PCR obtenidos. Como se puede observar se obtuvo la banda esperada de 345 pb correspondiente al gen estudiado, aunque solamente en algunas muestras. En este gel particular, de nueve muestras (de pacientes) analizadas y el control positivo solamente en dos (carriles 2 y 6) se observó la banda correspondiente. El resultado final de todas las muestras se presenta mas adelante (ver Tabla 4). También se usó como control positivo a la línea celular MCF-7 (carril12) y el control negativo sin cDNA (carril13).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1.- Marcador de 100 pb 2.- G-01154 (mama normal) 3.- Q-2603 (Paciente) 4.- Q-2381 (Paciente) 5.- Q-03-2438 (Paciente) 6.- Q-03-2543 (Paciente) 7.- E-01-2022 (Paciente) 8.- Q-3206-03 (Paciente) 9.- Control+ Células MCF-7 10.- Control (-) sin DNA
200 pb 170 pb
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Fig. 9. Análisis de la expresión de P/CAF en muestras de cáncer de mama. La figura muestra una imagen de un gel representativo del corrimiento electroforético de los productos de PCR del gen P/CAF, de las nueve muestras estudiadas en este gel como se puede ver sólo se obtuvo la banda esperada en dos. 10. ANALISIS DE RESULTADOS En la siguiente tabla se presenta el concentrado de todos los resultados obtenidos con respecto a la expresión de GAPDH, p21 y P/CAF en todas las muestras analizadas:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1.- Marcador 100 p b 2.- 797 (a) 3.- 769 4.- 797 5.- 2071 6.- 1432 7.- 1455
345 pb
8.- 1414 9.- 1819 10.- 2278 11.- 6134 12.- Células MCF-7 13.- C (-) sin DNA
400 pb 300 pb
60
Tabla 4. Muestra el concentrado de todos los resultados obtenidos con respecto a la expresión (RT-PCR) de GAPDH, p21 y P/CAF en todas las muestras analizadas: p21 P/CAF GAPDH G-01154 + + + (mama normal) MCF-7 + + + E-01-2022 - - + Q03-2543 + + + Q03-2438 + - + Q-2381 + + + Q-3206-03 + - + Q-2603 + - + 1432 + + + 1414 - - + 2966 + - + 1819 + - + 769 + - + 797 + + + 1455 - - + 1876 - - + 2071 + - + 6134 + - + 2278 - - + Estos datos indican que:
• Se analizaron en total 17 muestras con cáncer mamario y una
muestra de una paciente sana. Se incluyó un control negativo (sin cDNA) y un control positivo (cDNA de la línea celular MCF-7)
• Todas las muestras estudiadas expresaron el gen constitutivo GAPDH, lo que nos permite afirmar que nuestra metodología fue la adecuada y obtuvimos un cDNA de buena calidad de todas las muestras.
• Doce de las muestras expresaron p21 y cinco no lo expresaron, es decir, la mayoría (70%) expresaron p21.
• Cuatro muestras expresaron PCAF y trece no lo expresaron, es decir la mayoría (76%) no expresó PCAF, confirmando previas observaciones de nuestro grupo de investigación.
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11. DISCUSION Después de analizar los resultados de la tabla anterior (tabla 4) tomamos un grupo de muestras en el que realizamos un análisis densitométrico comparativo. Esta densitometría se hizo ajustando o normalizando los resultados con GAPDH para obtener una medida semicuantitativa de la expresión de P/CAF y p21, encontrando que, aunque todas las muestras expresaron p21, dicha expresión fue menor en aquellas muestras en las que P/CAF no se expresa, en relación a aquellas que si lo expresaban (gráfica 4). El comportamiento de la mayoría de las muestras en este análisis fue similar o se mantuvo dentro de un rango parecido excepto la muestra con número de registro Q-3206-03, en la que la expresión de p21 fue mucho mayor en ausencia de P/CAF. Esta muestra corresponde a una paciente que tiene como características particulares el de pertenecer al grupo de las de mayor edad (76 años) y cuyo diagnóstico histopatológico fue de adenocarcinoma ductal infiltrante poco diferenciado, esta última característica le da un comportamiento más agresivo, ya que este tipo de lesiones presentan mayor cantidad de necrosis tumoral y tienen mayor permeación vascular linfática en relación a los bien o moderadamente diferenciados (com. pers. Dr. Antonio Gómez Díaz, Medico Patólogo del Hospital General “Salvador Zubirán Anchondo” de los Servicios de Salud del Estado de Chihuahua).
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Grafica 4. La grafica muestra el resultado del análisis densitométrico comparativo entre GAPDH y p21 tomando como referencia (la unidad) la expresión de GAPDH en la muestra G-01154 que corresponde a la paciente sana , también muestra cuales de estas muestras expresaron P/CAF. (ver análisis en el texto). De acuerdo a lo reportado por Kurebayashi, J. et al. (2000), a lo encontrado en nuestro grupo de investigación por Pérez-Herrera S. et al (1998) en donde en trece muestras no se encontró expresión de P/CAF por inmunohistoquímica ni por RT-PCR, y lo encontrado en el presente trabajo en el que la mayoría (76%) de las muestras no expresó P/CAF, podemos sugerir que en la evolución natural del cáncer de mama existe una disminución gradual de la expresión del coactivador transcripcional P/CAF, llegando prácticamente a la falta casi total de su expresión en el carcinoma invasivo. Por otro lado, indudablemente para el funcionamiento completo de la oncopotreina p53 es necesaria su acetilación por parte de P/CAF como lo demostró Scolnick D. et al. (1997), y siendo p21/waf1/cip1 un gen que requiere para su transcripción de p53 acetilado, era lógico suponer que su expresión debería estar afectada.
Expresión de p21 (ajustado con GAPDH)
0
1
2
3
4
5
6
7
G-01154
P/CAF+
Q-2603 P
/CAF-
Q-2381 P
/CAF+
Q-03-254
3 P/C
AF+
E-01-20
22 P/C
AF-
Q-3206-0
3 P/C
AF-
MCF-7 P/CAF-
C-neg
Muestra
Niv
el d
e ex
pres
iòn
63
Sin embargo nosotros encontramos que la mayoría de las muestras con cáncer de mama expresan p21, a pesar de que en la mayoría de ellas P/CAF no se expresa. Sin embargo, en aquellas muestras en las que P/CAF no se expresa, aunque p21 se encuentra expresada, sus niveles son menores que en aquellos casos en los que P/CAF se expresa. El incremento en la prevalencia e incidencia del cáncer de mama esporádico (no heredofamiliar) en el momento actual y aun mas el que se espera en el futuro, debe estimularnos a continuar en la investigación de los mecanismos moleculares que contribuyen a su desarrollo y la posibilidad de encontrar marcadores moleculares con valor pronostico y/o predictivo que nos ayuden a la identificación de mujeres con riesgo elevado de padecerlo, al diagnostico oportuno y a poder seleccionar las mejores alternativas de tratamiento en las que ya lo padezcan. Tal puede ser el caso de P/CAF cuya expresión evidentemente esta alterada en la evolución y progresión del cáncer de mama. 12. CONCLUSIONES Los resultados de nuestro trabajo nos permiten concluir que la expresión de p21 no es afectada de manera exclusiva por la expresión de P/CAF y que la presencia de p21 es mantenida en estas lesiones muy posiblemente debido a que su expresión esta siendo estimulada por otras vías independientes de p53. Saramäki A. et al (2006). 13. PERSPECTIVAS Es necesario estudiar un número mayor de muestras para corroborar las conclusiones a las que llegamos en este trabajo y utilizar metodologías que nos permitan medir el grado de expresión de cada uno de los genes estudiados (RT-PCR cuantitativa). Es indudable que la expresión de P/CAF esta afectada en el cáncer de mama invasivo por lo que se debe estudiar a fondo de que manera afecta al proceso de carcinogénesis y así mismo si tiene un valor predictívo o pronóstico el determinarla en los pacientes diagnosticados con esta patología.
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14. REFERENCIAS
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