NOMBRE :

. .

! z . ''" k G U E Z ENRIQUEZ ,SIwA :: / ' i

TELEFONO PARTICULAR: 5 37 18 55

MATRICULA: 87344949

UNIDAD : UNIVERSX2.W AUTONOMA METROFOLITANA-IZTAPALAFA

DIVISION : CIENCIAS SXCLOGICAS Y DE LA SALUD

LICENCIATURA: BIOLOGIX ZXi'ERIMENTAL

TRIMESTRE LECTIVO :

HORAS A LA SEMANA:

TITULO DEL TRABAJO:

9 4 - 1

20

"AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE MITOCONDRIAS DE

PANCREAS"

Noi'4BRE DE LOS ASESORES:

QFB AXLA CUELLAR IBmEZ

INVESTIGADOR ASOCIADO "C"

DR RAFAZL MORENO-SANCHEZ

IhVCTISADCR TITULAR 'IC"

LUGAR DONDE SE F W U I Z O EL TRABAJO:

DEPARTAMENTO 3iOQUIMICA DEL INSTITUTO

NACION-U EZ CiG.DI3LOGIA "IGNACIO CHAVEZ"

Juan Badiana ?:2.1, Sección XVI, Tlalpan.

FECHA DE INICIO:

FECHA DE TERMINACION:

CLAVE :

2 DE JUNIO DE 1993

2 DE JUNIC DE 1994

DR RAFAEL MORENO-SANCHEZ

"AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE MITOCONDRIAS DE PANCREAS"

INDICE . . . . - . . ..I.

Pág.

1. INTRODUCCION.

1.1.Páncreas ...........................................,..l

1.2. Fosforilación Oxidativa ..............................5

1.2.1. Sistema Oxidante ..............................6

1.2.2. Sistema Fosforilante.........................ll

1.2.3. Regulación de la vía de Fosforilación

Oxidativa ..................t.........;.......i4

1.2.3.1. El Ca2+ como regulador de la vía.. . . . . .16 1.3. Fosforilación Oxidativa en mitoccndrias de páncreas.18

2. OBJETIVOS.

2.1. Objetivo General ...............................21

2.2. Objetivos específicos .......,..................21

3. MATZRIAL Y METODOS.

3.1. Preparación mitocondrial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22

3.2. Determinación de proteína ...,..................23

3.3. Micrografias electrónicas. .....................23

3.4. Enzimas Marcadpras

3.4.1. Citocromo Oxidasa....... ............ 24

3.4.2. Monoamino oxidas? ....................24

3.4.3. Glutamato deshidiogenasa ............ 24 3.4.4. Glucosa-6 fosfataca ................. 25 3.4.5. 5’-Nucleotidasa ..................... 25

3.5. Consumo de Oxígeno .............................26

3.6. Actividad de la 2-Oxogluturato deshidrogenasa .. 26 3.7. Consumo de Oxígeno en presencia de Caz+ ........ 27 3.8. Potencial de membrana y GradFente de pH ........ 27 3.9. Captación de Ca2+ .............................. 27

3.10.Amortiguadores de Ca2+/EGTA .................... 28

4 . RESULTADOS . 4.1. Micrografías electrónicas ...................... 29

4.2. Actividad de las enzimas mgrcadoras .... ; ....... 31 4.3. Oxidación de sustratos por las mitocondrias .... 32 4.4. Modulación de la 2-OGDH por Ca2+ ............... 33 4.5. Transporte de Ca2+ ..... ...................... 40

4.6. Respiración del Estado 3 inducida por Ca2+ ..... 42 4.7. Gradiente electroquímico de Protones ........... 45

. .

5.DISCUSION Y CONCLUSIONES ............................... 48

6.PER8PECTIVAS ........................................... 51

7 . B I B L I ~ ~ I A ........................................... 52

Y

\ e... . ..--v.. . .. -I -. .........

1 . INTRODUCCION.

1.1 .PANCREAS.

El páncreas es una glándula acinar, constituida por

una parte exócrina, que secreta dilriamente de 1200 a 1500 ml de jugo pancreático esencial para la

digestión de carbohidratos, grasas Y proteínas

provenientes de los alimentos; y una parte endócrina,

constituida por acúmulos de células que secretan hormonas

esenciales para el control del metabolismo de carbohidratos

[Fawcett, 1992; Ganong, 19891.

La porción exócrina del páncreas (figura 1) , se

encuentra constituida por células acinares de forma

piranidal, en cuyo citoplasma se encuentran contenídos-

gránulos de secreción muy refringentes, también llamados

gránulos acidófilos de zimógeno, porque contienen a l os

precursores de las abundantes enzimas que constituyen al jugo

pancreático y cuya función principa:. es la digestión de

hidratos de carbono, lípidos y proteínas de los

alimentos [Fawcett, 19921. Las enzimas más importantes son: " I

la a-amilasa pancreática (degrada glucógeno y almidón) y la

lipasa pancreática (hidroliza la grasa a glicerol y a

ácidos grasos). También se encuentran enzimas proteolíticas

como la tripsina, la quimiotri&qa, la carboxipeptidasa,

la ribonucleasa y la desoxirribonucleaza, las cuales al ser

liberadas al exterior en forma de gránulos de zimógeno, se

activan por las enzimas duodenales en La luz del intestino

[Ganong, 1989; Ham, 19691.

Si estas enzimas se activaran antes de llegar al

intestino, el páncreas se destruiría as í mismo (pancreatitis

aguda) por tanto, los acinos pancreáticos sintetizan al mismo

tiempo, un inhibidor de la tripsina para impedir la

activación prematura dentro de las células . La porción endócrina está constituida por grupos de

células endócrinas de tamaño diminuto, que forman los

llamados islotes de Langerhans que se encuentran distribuidos

en toda la glándula (figura 1).

Dentro de los islotes se localizan tres tipos distintos

de células cuya función principal es la secreción de hormonas

diferentes : las células a (6 A) las células B (6 B) y las

células 6 (6 D) que secretan glucagon, insulina y

somatostatina, respectivamente.

Estas hormonas controlan el nivel de glucosa sanguínea

del organismo [Fawcett, 1992; Ganong, 1989; Ham, 19691.

Cuando la glucosa sanguínea cae ppr debajo de un nivel

óptimo [60-100 mg/dl (humano normal en ayuno)], las células a

secretan glucagon, para elevar la glucosa sanguínea.

Cuando el nivel de glucosa se eleva demasiado, las células B

secretan insulina que disminuye ese nivel. La somatostatina

producida por las células 6 es capaz de suprimir la secreción

tanto de insulina como de glucagun y así, modular la

actividad de estas células, para mantener los niveles de

glucosa normales [Fawcett,1992].

2

t

3

Fig. 1 . Miorografía

muestra las

electrónica de1,páncreas humano, que

porciones exocrlna y endocrina. 4,

>T L b

I

, [Tomado de Ganong, 19891.

4

La elevación de la glucosa sanguínea no es el único

factor que provoca la liberación de insulina por las células

B. Este evento también puede ser estimulado por

neurotransmisores como epinefrina y acetilcolina, y por

cantidades elevadas de ATP extracelular [Wollheim y

Sharp,l981; Geshind et al, 19891. Se ha determinado que en

presencia de glucosa se eleva la concentración citosólica

de Ca2+, lo que provoca la apertura de los canales de Ca2+

dependientes de voltaje y la liberación de Caz+ del retículo

endoplásmico. Este evento parece ser l a señal de transducción

para la liberación de insulina en e1 páncreas [Prentki y

Matschinsky,l987; Aschcroft y Rorsman, 19901.

Al elevar la concentración de Ca2+ citosólico, se

estimula la vía de fosforilación 3xidativa que provee

energia necesaria para que se lleve a cabo el proceso

exocitótico.

Existe evidencia que sugiere 'in enlace entre el

metabolismo mitocondrial y la secreción de insulina:

1. La velocidad respiratoria [Lonyo et a1,1991] y la

actividad de las deshidrogenasas mitccondriales sensibles a

Ca2+ [McCormack et al, 1990; Sener et a1,1990] se incrementa

cuando se eleva la concentración de glucosa en las células B.

2. La rotenona, un potente inhibidor de la cadena

respiratoria mitocondrial, induce la activación de canal'es

de K+ sensibles a ATP presentes en las células 8 , sobretodo

cuando disminuye el suministro de ATP celular [Ashcroft et

al, 19873; estos canales de K+-ATP mantienen un potencial

4

A

transmembranal muy alto, lo que produce un cierre de l o s

canales de Ca2+ [Ashcroft y Rorsman et al, 19931, y en

consecuencia un bloqueo de la s-creción de insulina

[Aschcroft et al, 1987; Duchen et al, 19931.

3. Un aumento en el flujo del ciclo de los ácidos

tricarboxílicos inducido por el ácido 2-cetoisocaproico

aumenta la secreción de insulina, así como la respiración

mitocondrial [Hutton y Malaisse, 19801 y provoca una

disminución en la actividad de los canales de K+-ATP

[Aschcroft et al, 1987; Duchen et al, 19931.

4 . La glucosa y el ácido 2-cetois~~íaproico junto con la

actividad disminuida de los canales de K+ATP provocan un

aumento de NAD(P)+ mitocpdrial reducido, de potencial

transmembranal y de calcio citosólico [Duchen et al, 19931

1.2. FOSFORILACION OXIMTIVA. El alto suministro de ATP

requerido para que la célula parcreática realice sus

funciones estímulo-secretoras es proporcionada por la vía de

fosforilación oxidativa que tiene lugar en la mitocondria. En

este proceso, la oxidación de sustratos provenientes del

ciclo de los ácidos tricarboxilicos (llamado sistema

oxidante) está acoplada a la síntesis de ATP (llamado sistema

fosforilante) , a través del potencial transmembranal generado por la cadena respiratoria [ver Moreno-Sánchez et al, 1991 (a) ;

Moreno-Sanchez, 1991 (b) J .

5

6

1.2.1 Sistems Oxidante.

Para ser oxidados completamente hasta COZ y agua, l os

sustratos provenientes de la degradación de carbohidratos,

lípidos y proteínas deben ser transportados a la mitocondria

a través de acarreadores específiccls localizados en la

membrana interna mitocondrial. Una vez en la matriz

mitocondrial, estos sustratos son oxidados por el ciclo de

los ácidos tricarboxílicos (CAT) (fig 2).

Los equivalentes reductores (NACH y FADH2I producidos

por el CAT ceden sus electrones a los complejos enzimáticos

de la cadena respiratoria, siendo el aceptor final el oxígeno

molecular [Williamson y Cooper, 19801 . El 2-oxoglutarato, succinato, y los tricarboxilatos

(citrato e isocitrato) entran a la matriz mitocondrial en

intercambio con malato [LaNoue y Schooiwerth, 19791.

El piruvato y probablemente el glutamato son

transportados en un proceso dependiente del gradiente

electroquímico transmembranal. El glutamato también puede ser

transportado en intercambio con aspxtato (fig 2 ) .

Los ácidos grasos una vez transportados al interior de

la mitocondria, por medio de la aci! carnitin transferasa,

son oxidados por un ciclo de reacciones que elimina dos

átomos de carbono de su estremo carboxilo. De esta manera se

genera una molécula de acetil COA er. cada vuelta del ciclo

de la B-oxidación de los ácidos graso:; (Fig. 2 ) .

, -

I 7

I

!

Fig. 2 Esquema de la Foiforilaoión Oxidativa y del Cialo CAT eon los diferente8 tipo. de rcrrrerdore8: A, Transportador de dicarboxilatos; B, acilcarnitintransferasa; C, Transportador de piruvato; D, Transportador de 2- Oxoglutarato; E, Lanzadera de Clutpmato; F, Transportador de Glutamato; O, Transportador de los tricarboxilatos; H, Uniportador de Ca2' ; H'. Transportador de Ca2' (En higado y rrñ6n, el intercambio es con, H-, en corazón es con Na+).

[Modificado de Moreno-Sánchez,l991 y LaNoue,1979].

7

8

El piruvato, proveniente de la glicólisis es

transformado dentro de la mitocondria en Acetil-COA por el

complejo de l a piruvato deshidrogenasa.

Los sustratos transportados al interior de la

mitocondria sufren una serie de oxidaciones catalizadas por

diferentes deshidrogenasas dependientes de NADt, excepto el

succinato que es oxidado por una deshidrogenasa dependiente

de FADt.

Otro componente del sistema oxidativo es l a cadena

respiratoria mitocondrial (figura 3 ) que puede verse como

una serie de reacciones de oxido-reducción acopladas de tal

manera, que los electrones transferidos desde los sustratos

de la cadena respiratoria hasta el oxígeno molecular

conllevan a una translocación de protones que genera una

diferencia de potencial electroquímico, y ésta a su vez es

utilizada para la síntesis ,de f.'TL. De acuerdo a la

clasificación propuesta por Hatefi, la cadena respiratoria

consta de 5 complejos enzimáticos:

El Complejo I Ó NADH:Ubiquinona Oxidoreductasa está

compuesto por 25 polipéptidos dispuestos en tres fracciones

denominadas HP Ó fracción insoluble; IP Ó fracción

ferroproteínica y FP Ó fracción flavoproteínica [Hatefi y

Stigga11,1976,; Peach,1982]. Este complejo cataliza la

transferencia de dos electrones desde el NADH hasta la

ubiquinona y es inhibido por rotenona [Nicholls, 19821,

piericidina A y rhein (inhibidor natural de l a NADH

deshidrogenasa) [Singer, 19795

9 I

El Complejo I1 ó succinato:ubiquinona oxidoreductasa

está compuesto por 4 polipéptidos- dos subunidades de

succinato y dos subunidades de citocromo b560. [Hatefi, 19851 . Cataliza la transferencia de electrones del succinato a la

ubiquinona,

El Complejo I11 ó ubiquino1:citocromo c oxidoreductasa

tiene un peso molecular de 250 kD y está constituido por 11

polipéptidos diferentes. Tres de las subunidades de este

complejo contienen grupos prostéticos: un citocromo b, un

citocromo c1 y un centro Fe-S. A este; complejo también se le

conoce como complejo bcl mitocondrial ya que ambos citocromos

y el centro Fe-S son los que intervienen en el transporte de

electrones. Cataliza la oxidación de ubiquinona a ubiquinol

y la reducción del citocromo c; es inhibido por antimicina

A (que actúa a nivel del citocromo b y evita la reducción de

la ubiquinona), mixotiazol y bA¿/ 2,3-dimercaptopropanol

(destruye el centro Fe-s) [Hatefi, 19851.

El Complejo IV ó Ferrocitocromo C :oxígeno

oxidoreductasa, es el último paso de ia cadena respiratoria y

presenta dos grupos prostéticos importantes: un grupo hem0 y

dos Cu2+. Esta enzima reduce al oxígeno molecular hasta agua

y es inhibido por DCCD (inhibe la translocación de protones),

cianuro, azida de sodio, CO y polilisina [Hatefi, 19851.

Fig.3 Esquema de l a Caden? Transportadora de Electrones

[Tomac:, de Nicholls, 19891.

11 I

El transporte de electrones a través de tres de estos

complejos (1,111 y IV) genera un potexial transmembranal al

inducir la salida de protones al citosol.

1 . 2 . 2 . Sistema Fosforilante.

La ATPsintetasa mitocondrial, catalogada por Hatefi

como el complejo V, es una enzima multimérica que contiene

18 polipéptidos divididos en dos fracciones: una fracción

soluble (F1) que es periférica donde se encuentran los

sitios catalíticos de la enzima en ties de sus subunidades

denominadas "í3"; y otra fracción insoluble (Fo) que es

transrnembranal . La ATPsintetasa mitocondrial cataliza la hidrólisis Ó

síntesis de ATP sin que se produzca un intermediario

fosforilado a diferencia de ATPasas presentes en otros

organelos como la ATPasa de Caz+ y de Na+/K+. La síntesis de

ATP está acoplada a l a energía del Zradiente electroquímico

de protones generado por la cadena respiratoria

[Mitchell, 19851.

Se han propuesto varias teorías para explicar este

acoplamiento:

I) La teoría del Acoplamiento directo, (propuesta por

Mitchell) postula que los protones translocados a través de

Fo intervienen de manera directa en las reacciones que se

llevan acabo en el sitio catalítico de F1 (interacciones de

tipo molecular entre los protones y los sustratos) para la

síntesis de ATP. El ADP y el fosfato se unen a la subunidad 13

11

en su sitio catalítico y liberan uno Ó dos protones a la

matriz mitocondrial. Los oxígenos que rodean al fosfato

interactúan con la subunidad catalítica formándose una

especie muy reactiva que es capaz de interactuar con el ADP y

formar ATP. Por cada tres protones que atraviesan la enzima,

se forma una molécula de ATP [Vásquez-Laslop,l989]. 11) La

teoría del Acoplamiento indirecto !propuesta por Boyer)

postula la existencia de un ciclo para la síntesis de ATP en

el que la energía del potencial transmembranal da como

resultado una serie de cambios conformacionales en las

fracciones Fo y F1 de l a ATPsintetasa. El ADP y el Pi se

unen débilmente a un sitio catalítico en l a subunidad B,

cuando los protones atraviesan Fo y provocan un cambio

conformacional en F1 que permite que el ADP y el Pi se unan

espontáneamente en un ambiente con una baja polaridad para

formar ATP. El ATP permanece fuertemonce unido a este sitio

catalítico hasta que otra molécula de ADP se une al mismo

sitio.. Esto ocurre de manera simultánea en las tres

subunidades í3 de la fracción F1.

De esta manera el efecto del potencial electroquímico

transrnembranal es un efecto "a distancia" sobre los sitios

catalíticos de F1 el cual promueva la síntesis de ATP

[Vásquez-Laslop, 19891 . Entre los inhibidores de la ATPsintetasa se encuentra el

DCCD que se une a la enzima en la fracción Fo e inhibe la

translocación de protones; aurovertina, NBF-C1 (4-cloro-7

nitrobenzofurazano), efrapeptina (que reaccionan con la

12

13

subunidad B, bloqueando el sitio actilm); y oligomicina (que

inhibe la translocación de protones, así como la hidrólisis

de ATP). Algunos compuestos mercuriales así como la

venturicidina inhiben la hidrólisis de ATP [Hatefi,1985].

Dos componentes mas de la membrana interna mitocondrial

forman parte del sistema fosforilante: el translocador de

adenin nucleótidos (acarreador ATP/ADP) que intercambia una

molécula de ADP citosólico por una de ATP sintetizada en el

interior de la mitocondria, durante la fosforilación

oxidativa. El otro componente es el acarreador de fosfato que

transporta Pi inorgánico del citosol a la matriz mitocondrial

en intercambio con iones hidroxilo (Fig 2)[LaNoue y

Schoolwerth, 19791 . La actividad tanto del sistema oxidante como del

sistema fosforilante está acoplada al gradiente

electroquímico de protones generado por la cadena

respiratoria. Este gradiente es utilizado por la ATPsintetasa

para la sintesis de ATP y consta de dos componentes:

z

1. Un gradiente de p H .

2. Un gradiente eléctrico

Ambos forman parte del potencial electroquímico que está

dado por la siguiente expresión:

ApH+ = Acp - 2.3 RT/F ApH

13

14

Donde A ~ H + es el potencial electroquímico, Av es el

potencial eléctrico generado por la translocación de cargas

eléctricas y ApH es la diferencia en concentración de

protones a ambos lados de la membrana. El valor de 2.3 RT/F

se obtiene multiplicando R (cte. de l os gases, con un valor

de 8.314 Julios/mol°K) por T (temperatura absoluta) , entre F (cte. de Faraday, que equivale a 96.67 Julios/mol mV). Por lo

tanto a 25, 30 y 37oC, 2.3RT/F tiene un valor de 59, 60 y

62 mV, respectivamente.

1.2.3 Regulación de la vía de Fosforilación Qxidativa. El flujo a través de la vía de fosforilación oxidativa

depende de varios factores entre 1.0s que se incluyen. la

concentración de sustratos (ADP, Pi, 02) , cofactores (NADH) , y reguladores positivos (Caz+).

En la última década se han propuesto diferentes teorías

que tratan de explicar los sitios posibles de regulación.

Una de las primeras teorías fue l a propuesta por Chance

y Williams (1956), donde se propone que en condiciones in

vivo, la velocidad de síntesis de ATP está controlada por la

disponibilidad del ADP 6 por la relación ATP/ADP. Por tanto,

el intercambiador ATP/ADP es un paso limitante de la vía ya

que existe existe una competencia entre el ATP y el ADP

externos por los sitios de enlace en el acarreador. Esto ha

sido documentado en mitocondrias de diferentes tejidos

[Chance y Williams,1956; Moreno-Sánchez.l991(a)J.

15 < . 1.

4

Otros autores (Erecinska y Wilson, 1982), a diferencia

de Chance y Williams, proponen ' que l a s enzimas que actúan

cerca del equilibrio como el acarreador de ATP/ADP, no

pueden ser pasos limitantes de la via por que catalizan

reacciones rápidas, en cambio, las eri&imas que actúan lejos

del equilibrio como la citocromo c. oxidasa y el complejo I de

la cadena respiratoria pueden regulas el flujo de la vía ya

que catalizan reacciones lentas; así si un regulador

determinado afecta su actividad, tendrá un efecto sobre la

velocidad total de la via. A esta tecría se le conoce como

"teoría del equilibrio cercano" [Erecinska y Wilson,1982].

Posteriormente se describió la teoría del Control

Multiple por Kacser y Burnst (1973, 1979) y Heinrich y

Rapoport (1976). Esta teoría propone que el control total de

la vía de fosforilacibn oxidativa no se da en un solo paso

enzimático sino en toda la vía, donct todas las reacciones

están conectadas y el control varía de acuerdo a las

condiciones experimentales. Se

limitantes en la vía son el acarzeador de ATP/ADP, la

citocromo oxidasa, el acarreador de dicarboxilatos, la ATP

sintetasa y el complejo I de la cadena respiratoria. Para

llegar a tal deducción realizaron un análisis cuantitativo de

la actividad de cada enzima de l a vía para evaluar su

contribución en el flujo total ,[,:;r~en et a1,1990]. Se

hicieron curvas de titulación con inhibidores específicos

competitivos, no competitivos e irreversibles para determinar

el coeficiente de Control de Fluj-, [Ci], que permite

15

16

cuantificar las variaciones que tiene el flujo si se cambia

la actividad de la enzima.

Gracias al uso de inhibidores y al descubrimiento de

estos puntos de regulación se pueden proponen soluciones

atractivas a modelos como el de la citocromo oxidasa, y

acarreador ATP/ADP, que no habían podido ser explicados

cuantitativamente.

1.2.3.1. El Calcio c a e regulador de la vía de Eosforilacfón

QKids tfva.

Denton y McCormack (19801, Hansford (1980,1985),

Moreno-Sanchez (1985, 1990,1991) y Murphy (1990) han

desmostrado que la fosforilación oxidativa está controlada

por los niveles de Caz+ intracelular, el cual es capaz de

activar a tres deshidrogenasas componentes de la vía: la

piruvato deshidrogenasa-fosfatasa la isocitrato

deshidrogenasa y la 2-oxoglutarato deshldrogenasa.

La activación de estas enzimas a concentraciones

fisiológicas de calcio (0.1-1 pM1, ha sido demostrada en

numerosos tejidos de mamíferos [para referencia ver Hansford,

1985; McCormack et al, 19901. El calcio es introducido a la

mitocondria por un uniportador.elecuoforético [Puskin et al,

19761 que utiliza la energía del gradiente electroquímico de

protones generado por la cadena resrlratoria y por tanto

16

17

compite con el sistema fosforilante por la utilización de

esta fuente de energía [Moreno-Sánchex et a1,1983].

La entrada de Ca2+ puede ser inhibida por

concentraciones fisiológicas de Mg2+ (ImM), y por otros

inhibidores no fisiológicos como rojo de rutenio y iones

lantánidos [McCormak et a1,1990]. El mecanismo de salida al

citosol es principalmente por int,rrambio electroneutro con

Na+, en el caso de corazón y con H+ en el caso de hígado y

riñón [Akerman y Nicholls, 19831.

Una manera para determinar el eLecto máximo del calcio

(K0.5) en la vía de fosforilación oxidativa es evaluando la

actividad de cada enzima a concentraciones fisiológicas del

ión donde se asegura la máxima activación de la enzima, es

decir, en el intervalo de 0.05 a lpM de Ca2+. [Moreno-Sánchez

y Hansford, 1988; Reers, 19891.

La estimulación sobre la enzima inducida por Caz+ puede

ser modificada por los iones Mg2+, por Na+ ó H+ y por

poliaminas naturales (espermina), esta última actúa como

activador del transporte de Ca2+ [Lenzen et a1,1986;

Nicchitta et al, 19841. La capacidad del Mg2+ para inhibir la

actividad del uniportador de Ca2+ puede ser un mecanismo de

protección de la mitocondria contra una sobrecarga de Ca2+

[Lenzen et al, 19861.

La regulación de la síntesis de ATP por Ca2+ ya ha sido

demostrada en mitocondrias de corazón y riAón incubadas a

bajas concentraciones del sustrato ;Moreno-Sánchez et al,

1990,1991 J .

17

18

Por lo anterior, la posible activación de la vía de

fosforilación oxidativa por Ca2+ en páncreas requeriría de

una concentración de Ca2+ dentro de &a mitocondria en el

rango submicromolar de (0.1-1.0 pM) , y esto sucede cuando la

concentración de Ca2+ citosólica se aumenta como consecuencia

de una elevada concentración de glucosa.

1 3 . Fosforilación Oxidativa en mitocondrias de pancreas.

No existen estudios de la regulación de la vía de

fosforilación oxidativa en mitocondr:-;s de tejido glandular

mixto, Las preparaciones mitocondrlales de tejidos como

hígado, riñón y corazón se obtienen fácilmente debido a su

homogeneidad celular. Sin embargo, el páncreas que presenta

un tejido muy heterogéneo, dificulta la obtención de

mitocondrias libres de otros organrlos subcelulares. Los

gránulos de zimógeno que sedimentan a la misma velocidad que

las mitocondrias son el contaminante más frecuentemente

observado. Debido a lo anterior existe11 pocos estudios de la

fosforilación oxidativa en este tipo de mitocondrias.

Lieber reportó por primera vez l a obtención de

mitocondrias de páncreas utilizando irhibidores de proteasas

como dibucaína [Lieber et al, 1987 y 19891. El uso de esta

Última que es también un inhibidor del transporte de calcio y

de las deshidrogenasas dependientes de NAD puede explicar la

baja actividad de fosforilación oxidat,va en esta preparación

[Rottenberg, 1989; Lieber, 19863.

18

19

Tomando en cuenta estos antecedentes, nuestro interés

fue obtener mitocondrias funcionalmedte intactas y libres

de gránulos de zimógeno para dilucidar varios aspectos, que

desde el punto de vista bioenergéticcj se desconocen en este

tipo de mitocondrias.

Para la obtención de las mitocandrias de páncreas se

hicieron algunas modificaciones a Aas técnicas convencionales

de centrifugación diferencial, tomando en cuenta

procedimientos descritos por otros autores [Lieber,1984;

Clark, 19701.

La metodologia propuesta en esto trabajo se basa en el

principio de centrifugación dife.iencia1 con gradiente

discontinuo de Percoll [Thénevod et ,2l,19921.

El Percoll, que consiste en una silica coloidal

recubierta por polivinil pirrolidona. ha sido empleado para

remover los contaminantes de preparaciones y fracciones

celulares, incluidas las mitocondrias de hígado y cerebro en

rata [Sims,1990; Clark y Nicklas,’97C; Lai y Clark,1979] y

de placenta en humano (Gasnier et a1,1993].

Existen otras sustancias utilizadas para formar los

gradientes de separación, entre lac que se encuentra la

sacarosa y el ficoll [Lai y Clarck, 19761, sin embargo se ha

demostrado que el Percoll, a diferencia de los anteriores,

no somete a las mitocondrias a cmdiciones marcadamente

hipertónicas lo que provoca un empobrecimiento de sus

propiedades metabólicas.

19

20

Aspectos de la fosforilación oxidativa como la oxidación

de sustratos, control respiratorio, actividad de

deshidrogenasas y efecto del calcio sobre l a actividad de la

vía no han sido estudiados en mitocondrias de ningún tejido

glandular, por lo que nuestro principal objetivo fuC

caracterizar estos aspectos en la preparación mitocondrial de

páncreas, libre lo más posible de otros organelos

subcelulares.

20

21

2. OBJETIVOS.

2.1. Objetivo General.

Desarrollar una metodología para el aislamiento y

purificación de mitocondrias intactas de páncreas normal.

Caracterizar l a actividad de 1.a vía de fosforilación

oxidativa en esta preparación y deterrlinar si el Caz+ ejerce

un papel regulador sobre la misma.

2.2. Objetivo8 específicos.

1. Evaluar la pureza de la preparación mitocondrial

ensayando la actividad de diferentes erizimas marcadoras.

2. Medir el consumo de oxígeno en presencia de

diferentes sustratos como ácidos grasos e intermediarios del

CAT.

3. Evaluar l a actividad de la 2-oxoglutarato

deshidrogenasa en presencia y ausencia de Ca2+.

4 . Evaluar el potencial transarmbranal generado por

estas mitocondrias y el efecto del ea2'+ sobre este parámetro.

5. Evaluar el efecto del Caz+ sobre el consumo de

oxígeno.

1

22

3. MATERIAL Y METODOG.

3.1 Preparación mitocondriai. Las mitocondrias fueron

aisladas de pancreas de perro normal, El perro se sacrificó

por choque eléctrico 6 por sobredosis de pentobarbital

sódico (0.5ml/kg de peso) .Se obtuvo el páncreas y se colocó

en un medio (MA) que contenía 0.25M de sacarosa, lOmM

HEPES, 0.3% de albúmina bovina libre de ácidos grasos y

1mM de EGTA ajustado a pH 7.4 co:, KOH. El homogenado

obtenido se centrifugó a 750 x g durante 8 minutos, dos

veces. Los sobrenadantes se centrif cjaron una vez a 10800 x g durante 10 minutos. La pastilla obtenida se resuspendió en

4 ml de MA, que contenía 12% de Percoll. Esta suspensión fue

aplicada a un gradiente discontinuo de Percoll consistente

en 10 ml al 20% y 12 rnl al 40%. Se centrifugó a 16000 x g

durante 5 minutos. Los gránulos de zimógeno sedimentan en el

fondo del tubo mientras que las mitocondrias se recuperan

de la porción que queda en la interfase de Percoll

correspondiente a las diluciones de 20 y 40%. Las

mitocondrias se lavaron con MA al triple de su volumen y se

centrifugaron a 10800 x g durante 10 minutos. La pastilla de

mitocondrias se resuspendió con 3-4 IT., de MA, se añadió 1mM

de MgC12 y 2mM de ADP; se incubarm por 5 minutos con

agitación suave a 4OC.

I

Se realizó la Última centrifugación a 10800 x g, 10

minutos y se resuspendieron en el mismo medio.

22

, ----.e-- - I-. . -

23

Se obtienen de 1-1.5 ml de preparación mitocondrial con

una concentración de proteína alrededor de los 15 mg/ml.

3.2 Determinación de proteína. E.1 método empleado fue el

de Lowry-Folin [Lowry et a1,1951]. A 5-10 p1 de la muestra

mitocondrial, se adicionaron 4 ml de solución D, 1 ml de

agua y 0.4 ml de rectivo de Folin, se agitó y se incubó en

baño maría hirviendo durante 1 minutc. Se ieyó a 640-670 nm,

contra un blanco de solución D-react:vo de Folin y agua. La

curva estandar se preparó con albúmina sérica de bovino libre

de ácidos grasos cristalizada 1 mg/ml.

solución D: 9.8 ml de solución A, 0.3 ml de solución B y

0.3 ml de solución C.

solución A: NasC03 al 2% en NaOH 0.1 N

solución B: Tartrato de sodio-potasio al 2%

solución C: CuSOq-SH2O al 1%

3 . 3 Microqrafias electrónicas. La Ixieparación mitocondrial

fue fijada en glutaraldehído 2% (vol/vol) en l O O m M de

amortiguador de fosfato, pH 7.2 y procesada para microscopía

electrónica como se ha reportado previamente [Carabez-Trejo y

Possani, 1982).

1 23

24

3.4. Enximas marcadoras

3.4.1. Citocromo Oxidasa. Las mitocondrias y las

diferentes fracciones (1 mg/ml) fueron incubadas en un medio

con 7mM ascorbato, 25mM tris-acetato, 5 m citocromo C, 1pM

antimicina; a 25%. Después de un minuto de actividad se

adicionó 1pM de CCCP, se esperó un minuto más y se marcó la

línea base. Posteriormente se adicionó 1.41104 de TMPD, para

iniciar la reacción [Moreno-Sánchez et al, 19911.

3.4.2. Monoamino-oxidasa. Las mitocondrias y las

diferentes fracciones (0.1 mg/ml) fueron incubadas en un

medio con 50mM de amortiguador de fosfatos ajustado a pH 7.5,

con NaOH y benzilamina 5 mM. La reacción fue iniciada por la

adición de la proteínam y se midio el incremento en l a

absorbancia a 250nm por la formación de benzaldehído. Se leyó

un espectrofotómetro de doble ray- AMINCO DW-2.. La

actividad específica fue calculada ucilizando el coeficiente

de extinción molar 13/mM/cm [Reagan et al, 19871.

3.4.3. Glutamato Deehidrogenasa. Las mitocondrias y

las diferentes fracciones (0.075pg) se incubaron en un medio

que contiene 0.1M amortiguador de fosfato, 2.5mg/ml NADH,

0.75M acetato de amonio y 30mM EDTA. La reacción se inició

por la adición de 0.15M 2-oxoglut5rato. Se leyó en un

espectrofotómetro de doble rayo Amirico DW-2 a 340 nm. La

actividad específica fue calculada utilizando el coeficiente

de extinción molar de 6.22/mM/cm a 349 nm del 2-oxoglutarato

[Plummer, 1978 J .

~ 23

25

3.4.4, Glucosa 6 Foefatasa. Las mitocondrias y las

diferentes fracciones (0.5mg) se adicionaron a 0.80 ml de

solución de mezcla con 5OmM glucosa 6-fosfato, 0.1 M MES, pH

6.5 cdn NaOH y lOmM EDTA, pH 6.5. Se jncubaron a 37OC en baño

maría, con agitación suave durante 6C minutos. Se detuvo la

reacción adicionando 1 ml de TCA al 10%. Se centrifugaron en

una centrífuga clínica durante 5 minutos y se recuperaron los

sobrenadantes. Se adicionaron 2 ml de reactivo de Fiskie-

Soubarrow, para la determinacih de fosfato. Se cuantificó el

fosfato liberado con un espectrofot4ntetro Beckman a 660 nm y

se comparó contra una curva estandar de fosfato 5mM en 0.5%

de TCA a diferentes concentraciones uue equivalen a O, 125,

250, 375 y 500 nmoles de fosfato [Plwmer 19781.

3.4.5. 5'-Nucleotidasa. Las mitocondrias y las

diferentes fracciones (20pg) se adicionaron a O. 80ml de

solución de mezcla que contiene 5OmM Na-AMP, pH 7.0, 0.5M

glicina, ajustado a pH 9.1 con YaOH y 0.1M MgC12. Se

incubaron a 37OC en baño maría, con agitación suave durante

60 minutos. Se detuvo la reacción a'dicionando 1 ml de TCA al

10% y se recuperaron los sobrenadantes. Se adicionaron 2 ml

de reactivo de Fiskie-Soubarrow para la determinación del

fosfato liberado. El procedimiento para determinar el fosfato

es igual al de la técnica anterior [Nathan,1974].

3.5. Consumo de oxfgeno. Fue medido polarográf icamente con un

electrodo tipo Clark utilizando como medio base 125 mM KC1,

10 mM HEPES, lOmM amortiguador de losfatos y 0.5 mM EGTA

I 25

26

ajustado a pH 7.2 con KOH. Los sustratos utilizados fueron

glutamato, citrato, isocitrato, 2-oxoglutarato a lOmM,

piruvato y succinato 5mM, malato 2mM, palmitil LD-Carnitina

20pM y octanil LD-Carnitina 50pM. Se inició la reacción con

260mM de ADP. Los sustratos dependientes de NAD fueron

acompañados con 2mM de malato.

3 . 6 . A c t i v i dad de l a 2-Chroglutarato deshidrogenasa (2-ffiDH) . Las mitocondrias (0.7-1.3 mg/ml de proteína) fueron

incubadas en un medio estandar cGn 12OmM KC1, 25mM K-MOPS,

0.5mM EGTA, [KME] pH 7.2 a 30OC, con adiciones de 0.3mM de 2-

Oxoglutarato. La toma de O2 fue medida en un electrodo tipo

Clark. La solubilidad del O2 en equil'.brio con aire se tornó

de 200 nmol/ml a 3OoC.

Determinación de la actividad de la enzima: a) se

incubaron las mitocondrias en el amortiguador KME, en

presencia y ausencia de 0.5mM espermina y en presencia de ImM

Mg2+, 2mM Pi y 0.2mM ADP. La reacción se inició con 0.3mM de

2-oxoglutarato y b) se incubaron las mitocondrias en el

mismo amortiguador en presencia de diferentes concentraciones

de espermina (0.lmM y 0.3mM) ; y diferT2ntes concentraciones de

Mg2+ (1mM y 0.4mM). En ambos casos se disparó la reacción con

0.3mM de 2-oxoglutarato y se hicieron adiciones subsecuentes

de los amortiguadores de Ca2*k'EGTA a diferentes

concentraciones.

27

base se adicionó 0.3mM 2-oxoglutarato y amortiguador de

Ca2+/EGTA (0 .65 ) La reacción se inició añadiendo ADP 0.4pM.

3.8. Potencial de ¡&mbrarra y Gradiente de pH. Para calcular

el potencial de membrana se utilizá la distribución de 3H-

TPPt dentro de la mitocondria y La ecuación de Nerst. El

cálculo se corrigió por el enlace inespecífico del 3H-TPP+ a

las membranas mitocondriales, determinado en presencia de

0.25 pM de CCCP + 0.25 pM rotenona. El potencial de membrana

se calculó siguiendo l a formulación propuesta por Rottenberg

(1983), el cual involucra la corrección del enlace

inespecífico tanto de la face externa como de la fase interna

de l a membrana mitocondrial. El gradiente de pH fue

determinado midiendo l a distribucion de l4C-DMO (5, 5-

dimetiloxazolidina-Z,$-diona) I 3H20 y 14C-Sacarosa de acuerdo

a Rottenberg (1979).

3.9. Captacidn de Cazi.. Este parámetro fue medido siguiendo

los cambios de absorbancia a 675-685 nm de mitocondrias

incubadas con 50 pM de arsenazo I11 a 3OOC. [Scarpa et a l ,

19791 en un espectrofotómetro dual. El contenido de Ca2+

intramitocondrial fue determinado en estas mitocondrias,

incubando con amortiguadores de 45Ca2+/EGTA (actividad

específica 3473-698229 cpm/nmol) en 0.5 r n l de medio estandar

(KME) + 1mM Mg2+ a 30OC. La reacción fue iniciada por l a

adición de las mitocondrias (0.6-0.8 mg de proteína) y un

27

28

específica 3473-698229 cpm/nmol) en 0.5 ml de medio estandar

( W E ) + 1mM Mg2+ a 3OoC, La reacción fue iniciada por la

adiciGn de las mitocondrias (0.6-0.8 mg de proteína) y un

minuto más tarde la adición de 0.6 mM de 2-oxoglutarato. Las

mitocondrias se llevaron al equilibrio con 45Ca2+ durante 5

minutos; la reacción fue detenida por filtración (Millipore

Filters 0.45pM diameter). Los filtros fueron lavados con

lOml de solución fría que contiene KC1 0.15M y HEPES l O m M a

pH 7 . 4 . La radiactividad fue medid3 en un contador de

centelleo Beckman LS-7800.

3.10. Amortiguadores de Ca2+/EGTA. Las soluciones de los

diferentes amortiguadores de Ca2+/EGTA se hicieron en

presencia de MOPS O.lM, guardando la concentración final de

EGTA a 0.25M y el valor de pH a 7.22 [Moreno-Sánchez et al,

19881. Alicuotas de estos amortiguadores fueron adicionados a

las mitocondrias incubadas en el medio estandar (EGTA 0.5 mM,

pH 7.2) para estabilizar las diferences concentraciones de

Caz+ extramitocondrial libre. Los cálculos de las

concentraciones de Cazt fueron hechas utilizando el programa

de computadora Chelator [Schoenrnakers,l9?11

29

4 . RESULTADOS . 4.1. Micrografias electrónicas. La figura 3 muestra

micrografías electrónicas de transmisión de la preparación

mitocondrial. Antes de que Ea fracción mitocondrial sea

p u r i f i c a d a por el gradiente discontinuo de percoll (A) se

observan tanto mitocondrias condensadas como una gran

cantidad de gránulos de zimógeno. Después del gradiente de

percoll (B) se disminuye importantemente la contaminación p o r

estos gránulos.

Aún cuando se observa en la preparación

mitocondrial (B) gran cantidad de retl.culo endoplásmico

rugoso, mantienen intactas sus membrano externa e interna.

29

A. Fracción mitocondrial obtenida por s,mple centrifugación muestra numerosas partículas electrodensas que diferencial

corresponden a los gránulos de zimógeno.

de los gránulos contaminantes.

, ’C” @

B, Fracción mitocondrial obtenida después de la centrifugación con una gran disminución gradiente discontinuo de Percoll, muestra

I. f ? & -

Fig. 4 , Micrografias electrónicas da mitocondrias de “i 3 A

pancreas normal. , bir&

30

30

31

4.2. Actividad de l a s enziznas marcadoxas.

Para evaluar el grado de pureza de la fracción

mitocondrial, se hicieron ensayos con diferentes enzimas

marcadoras. En la tabla 1 se observa que la actividad de la

Glucosa-6 fosfatasa y S'-Nucleotidasa disminuye en la

fracción mitocondrial después dw ser purificada con el

gradiente de Percoll, mientras que la actividad de la

citocromo C oxidasa, monoamino oxidasa y glutamato

deshidrogenasa se ve incrementada. Esto indica que l a

fracci6n mitocondrial después del gradiente de percoll ha

sido enriquecida, y sin embargo aún presenta contaminación

por retículo endoplásrnico y membrana plasmática. _ _ Los valores obtenidos para la actividad de las enzimas

marcadaras son mayores que los reportados por otros autores

en mitocondrias de cerebro [Lai y Clark, 19761.

T-LA 1

Fraccrón Celular

Homoqcnado

Sobrenadante Antes Percol

I'r .Mi tocondria 1 Ancas Peccoll

Cobrenadante despuas Parco11

Fr.Mitocondria1 despuer Percoll

Cit ox MA0 GDH G6asa 5-Nasa

( 4 1 ( 3 ) (3) (3) ( 3 )

30.8i1.3 12.3i5.3 4.2i0.5 153.2IS 1 4 9 . 0 m

8.5f0.6 O 1.9f0.1 38.3f5.4 7.4f2 .I

126 .21 i5 .7 50.4f11.2 5.410.6 LjS.315.2 80.3f3.4

9.lf0.005 O 2.210.4 24.lfi. 6 4 . 6 I 1 . 3

236.9f0.7 125.6i8.2 12.4f0.9 149.4f3.1 32.2fl. 6

Los valores representan l a inedia f error eotandar. El número de experimentos se indrca

La actrvrdad de l a C i t Ox se ?xpresa en rAQ/min/rng ptct, MA0 y GDH se expresan en entre parbntesis.

nmolfmin/m$ prot ¿ 2SoCj 56aaa y 5 Nasa se expresan er nmol de Pi/rnq prot a 37OC.

Abreviaciones: Cit Ox, citocromo oxidas&; W, iibibonin.c$ oxidasa; GDH, qlutamaco < .

deshrdroqenasa: G6asa, qlucosa 6 fosfatasa: j-Nasa, 5-N~cleotrdasa.

-___ UUI "--

32

4.3. Oxidación de sustratos por las mitocondrias de pancreas.

Las mitocondrias obtenidas son capaces de oxidar

diferentes sustratos (tabla 2), tanto ácidos grasos como

intermediarios del CAT. Interesantemente se observó la

oxidación de citrato e isocitrato, indicando la presencia del

acarreador de tricarboxilatos en cstas mitocondrias, a

diferencia de las mitocondrias de múscuio esquelético y

cerebro [Lai y Clark,1976] que no lo presentan.

El sustrato que oxidan con maycr velocidad es el 2-

oxoglutarato (Tabla 2 ) seguido del succinato e isocitrato. El

glutamato, piruvato y LD-palmitil carnitina son oxidados

mucho más lentamente. Esto sugiere que la 2-OGDH es más

activa que las otras deshidrogenasas 5 bien, que el sistema

de transporte de glutamato y piruvato en estas mitocondrias,

es más lento que el acarreador de 2-oxoglutarato.

Aunque hay una oxidación signi €icante de palmitil-LD-

carnitina no hay oxidación de octanil-1.n-carnitina.

El control respiratorio calculado para estas

mitocondrias oscila entre 3 y 10, dependienck del sustrato, y

la relación ADP/O oscila entre 1.5 y 2.9. El empleo de

albúmina sérica de bovino y EGTA en el medio de resuspensión

permitió que se conservara la integridad de las membranas aún

después de 18 hrs a 4OC. El control respiratorio después de

este tiempo fué so lo ligeramente menor ó igual. I En el caso de l o s sustratos dependientes de NAD, los

~ ensayos se hicieron en presencia de malato 2mM. Sin embargo,

~ utilizando solamente este último como sustrato, la velocidad

32

33

respiratoria fue similar a l a obtenida ccn otros sustratos

exceptuando al succinato lo cual evidencía la presencia de

gran cantidad de sustratos endógenos en nuestra preparación.

TAI)XA 2

Oxtdaoi6n d. Los diferentes iustratos por l+a mitoaondxraa de pinoxera n o d .

9 f l llfl 17f1 :Gf2 17f2 1 5 . 5 f i 16fl ED0 4 1 3 i l 28f4

6 f 0 . 5 4 i 0 . 2 3f0.05 5f0.2 10f0.2 6:') 1 5 f 0 . 1 3.3f0.05 4 f 0 . 8 l I I

ADP/O, 2.910.2 2.9fO.3 2.8iO.1 2.3f0.2 2.6f0.2 2.7IO.2 2.5f0.2 2.6f0.1 1.7i0.1

I

I -

Los valores representan la media f error estandar E l n h e r o de experimentos se indica entre parentes is . Los resultados da l o s Edos 3 y 4 estan dados en .íAO/min/mg prot io 25OC.

Abreviaturas: CR, control r e sp i r a to r l o .

33

34

4 4 Modulación de l a enzima 2-Cbcoglutarato deshidrogenasa

(Z-WDH) por caz+.

La activación de la 2-OGDH por Caz+, puede ser

monitoreada por el incremento en el nivel de NAD(P)H de la

matriz mitocondrial, cuando son incubadas a bajas

concentraciones de 2-oxoglutarato lhansford y Castro,l981;

McCormack, 1985; Moreno-Sánchez et al, 19911.

La señal de fluorescencia del NAD(P)d se calibró con

valores mínimos y máximos para cada c.ondición experimental.

El valor mínimo [O% NAD(P)Hl se obtuvo después de una larga

incubación (8-10 minutos) en ausencia del sustrato oxidable.

No hubo cambio significativo de la fluorescencia cuando se

adicionó ADP 6 CCCP. El valor máxiiiio [lo08 NAD(P)Hl fue

generado por la adición de rotencria 3 1 final de cada

experimento (Fig. 5 ) .

Para bloquear l a actividad de l a 2-OGDH sensible a Ca2+

se utilizó rojo de rutenio -I- Na+ lo 1'12 nos confirmó que el

incremento en l a concentración de Ca2i en la matriz [ (Ca2+)m]

es un factor de modulación en las mitoconcrias de páncreas

(figura no mostrada).

La figura 6 muestra la sensibilidad de la 2-OGDH al Caz+

externo bajo diferentes condiciones experimentales. Si se

Y se incuban las mitocondrias en presencia de 1mM Mg2+

adiciona ADP y Pi no se modifica 1-3 concentración media

máxima (K0.5) requerida para estimular a l a enzima. Sin

embargo, si se incuban en presencia de espermina (0.5mM) el

I

-

35

-l

Fig 5. Estimulación de la actividad do la 2-OGDfl por Ca2+ en mitocondrias de páncreas normal. Mitocondrias de páncreas (0.77 mg prot.) fueron incubadas a 3OoC en medio estandar + 1mM de Mg2+ por algunos minutos, hasta alcanzar la línea basal.La fluorescencia intrínseca de los piridin nucleótidos fue medida como se decribe en métoao,s.Después de la adición de 0.4mM de 2-oxoglutarato, se adicionaron diferentes amortiguadores de Ca2+/EGTA para estabilizar la[Ca2+]ex. Para obtener l a máxima fluorescencia se adicionó rotenona a l final de cada experimento.

35

36

3 Y r Y .- > Y o U

.-

I P r3 O

I -Spe 0 . 6 6 0.66 0 . 6 6 I SPS (1.20 0.25 0 - 2 4 J

r~ 100

8 0 .

8 0 .

# I I 1

7.0 6.5 6.0 5.8 7.3

01rnM Mg2+ WlmM Mg2++0.2mM ADP AlmM Mg2++2mM Pi

p ca2*

t'

OimM Mg2'+0.5mM sper OlmM Mcj2++0. 2mM ADPtO. 5mM sper AlmM Mg2++2mM .Pi+O. 5mM sper

I

F i g 6.Modulrción de l a actividad do la P-OGDH por Ca2+,Mg2+, P i , ADP y rmprrmina en mitocondrias de phcrroas normal. El

porciento de actividad de la enzima fue determinado como se describe en métodos. La K0.5 para Caz+ de la 2-OGDH fue calculada bajo las condiciones qiit se muestran e n - los recuadros.

36

37

la matriz, la actividad de las desh..drogenasas sensibles a

Ca2+ y por lo tanto l a síntesis de ATP. Así una variación eri

~

I

~ fosforilación oxidativa a una [ C ' a 2 + l externa constante.

la relación espermina/Mg2+ puede tener relevancia fisiológica I

I I en l a actividad de l a 2-OGDH , y en la velocidad de I

38

En l a figura 7 se observa el etecto del Ca2+ externo

sobre la actividad de la 2-OGDH a diferentes relaciones

espermina/Mg*+. Un incremento en esta relación, ya sea

aumentar-do ?a corizentra :ión de espermina Ó disminuyendo la

concentración de MgZt, rrovoca un descenso en los valores de

K0.5 para Ca2+ de esta enzima. El experimento se realizó en

presencia (fig 7Ai y eii ausencia (713) de Pi 2mM, donde se

observan resultados idinticos, a excepción de la relación

espermina/Mg2+ 0.1 dond,: el valor de K0.5 fue mas alto en

presencia de Pi (0.713lA-4) que en ausencia del mismo (0.44pM).

A una [Ca2+]ex coistante , por ejemplo 0.3w (pCa2+

6.52), la actividad de la 2-OGDH,aunienta considerablemente

del 2-8% al 65-7!51~1, ciando existe un incremento en la relación

espermina/Mg2+ de 3 . 1 a . ) , 75 en presencia y ausencia de Pi.

39 I

p c t '

0 0.lmM sper/lmM Mg2+

A 0.lmM sper/0.4mM Mg2+

' o 0.3mM sper/lmM Mg2+

A 0.3mM sper/O.rimM Mg2+

Fig. 7 .Modul&ci¿n de l a aatividad de &I) 2-000H por Caz+ a diferentes rrlaciones emprrMna/b4qZ+. Las mitocondrias de páncreas se incubaron en presencia (A) y en ausencia ( 8 ) de 2mM P i . La act iv idad de l a 2-OGDH estimulada por d i f e rentes amortiguadores de Ca2+/EGTA fue calculada como se descr ibe en métodos.

39

40

4 . 5 Transporte de Ca2+ en las mitocondrias de pancreas.

La estimulación de entrada de Ca2+ al interior de la

mitocondria inducida por espermi.ia, ha sido descrita en

mitocondrias de diferentes tejidos [Nicchitta Y

Williamson,l984; Lenzen et a1,1986;1992] . Por tanto cuando se preincuban las mitocondrias con altas concentraciones de

espermina se induce un incremento en la velocidad de entrada

de Ca2t (fig 8A); esta reacción pudo ser bloqueada con rojo

de rutenio y con el desacoplante CCCP (fig. no mostrada)

Observamos que l a cantidad de Caz+ en la matriz aumentó

en presencia de espermina cuando las mitocondrias fueron

incubadas a concentraciones submicramolares de Ca2+ (fig 8B) . A 0.27 pM de Ca2+ externo, el contenido de Ca2+ en la matriz

fue significativamente más ait? (pCO.01) cuando los

expermientos se hicieron en presencia de expermina,

obteniendose una concentración interna de 1.5010.15 nmol

Ca2+/mg prot contra 0.9310.17 nmol Caz+/mg prot en ausencia

de espermina.

Estos valores del contenido de (:a2+ en la matriz estan

en el intervalo donde las deshidrDGenasas mitocondriales

pueden ser moduladas y correlacionadas con valores

reportados en otras mitocondrias de rnamífero, incubadas en

las mismas condiciones [Hansford, 198.<; McCormack et a l , 19891.

Una acumulación masiva de Caz+ file obtenido a [Ca2+lex

' ~ criticas de 0.59pM (pCa2" 6.22) en piesencia y de 0.93 pM I

I (pCa2+ 6.031 en ausencia de espermina (fig 8B).

40

41

A

Fig.8 captura dr. C.*+ en mitocondrirs de pinateas normil. Las mitocondrias (0.95mg prot) fueron incubadas a 3OoC como se describe en métodos. (A) La captura cie Caz' fue medida a diferentes concentraciones de espermina; O(a) , 0 . 2 ( b ) , 0.3(c) y O.SmM(d).Se adicionó también 4 1.iM A-23187 (A-23),60 nmol EGTA y una segunda adición de 50 nmol Ca2'. (R) La medición del Ca2+ intramitocondrial fue medido como se describe en métodos a diferentes adiciones de Ca2+/EGTA.

1 5 3 8 1 2

41

42

4.6 Respiración del Estado 3 inducida por ea2+.

El efecto del Ca2+ en la velocidad respiratoria del

estado 3 (fosforilación) inducida por bajas concentraciones

de 2-oxoglutarato fue examinada en estas mitocondrias. De

acuerdo con los datos de la actividaa de la 2-OGDH, el Ca2+

externo también estimula marcadamente l a velocidad de

respiración en el estado 3 (fig 9A); el valor de K0.5 para la

respiración fue comparable a los val.-)res abtenidos para la

actividad de la 2-OGDH, bajo l a s mismas condiciones de Mg2+,

Pi y ADP.

La presencia de espermina incremantó la sensibilidad por

Ca2+ en la velocidad de respiración del estado 3 ,

disminuyendo el valor de K0.5 de 0.49 a 0.25pM. La velocidad

del estado 4 y la relación ADP/O permanecieron constantes

aunque se utilizaron diferentes concentraciones de [Ca2+l ex.

Las velocidades absolutas de respiracihn fueron 60f14 (Edo 3)

y 9st03 (Ed0 4 ) ausencia de espermina; 67+12 (Edo 3) y 12f3

(Ed0 4 ) ng A 02/mg/min en presencia de espermina. La relación

ADP/O para las mismas condiciones fueron 2.07kO.09 y

1.97Sr0.13, respectivamente. Esto nos indica que el efecto

estimulatorio del Caz+ en la velocidad respiratoria del

estado 3 no aumentó la permeabilidad membranal. Estas

observaciones son semejantes a las obszrvadas en mitocondrias

de corazón de rata [Moreno-Sanchez et al, 1990; 19911, donde la

2-OGDH juega un papel limitante en 12 sintesis de ATP.

Se encontró que una variacion en la relación

espermina/Mg2+ a [Ca2+] ex constante también ejerce un control

42

.

en la velocidad de respiración del estado 3 (fig 9B). Te

manera similar a los resultados obtenidos para la a c t i v i d a d

de l a 2-OGDH, el incremento en la reiación espermina/MgZ+ (de

0.4a 0.75) a una [CaS+]ex constante de 0.2W (pCa2+ 6 . 7 ) ,

induce una estimulación del 40% (d.el 184 al 224%) en la

velocidad de respiración del estado 3 (fig 9 C ) .

43

2%

C Q .- c1

iI! n n 200 .- * oc m

U

* 170

130

100

j; s

8 7

8

/

8.5 6.0 5-B

pca2+

4, I 1 I 1 a l 1 I 1

8 7 &3 e.2 pCa2' M

O ImM Mg2+ t2mM Pi 0 1mM MgZt t2mM Pi t 0.5mM sper.

Fig.9 Control del Estado 3 rcngaratorio (fo8forilación) por Caz+, e' y espezmina en mitocondrian de píncrcra normal. Las mitocondrias de páncreas fueron incubadas en el medio estandar y con diferentes concentraciones de Ca2+/EGTA, bajo las condiiones que aparecen en los recuadros. Después de 1 min se adicionaron 0.3mM 2- oxoglutarato, seguido de 0.6-1.8 mMADP, 2 min más tarde. La velocidad de respiracibn del Edo. 3 fue corregido restando la velocidad de Edo 4 antes de :a adicTók, del sustrato y normalizado al v a l o r obtenido con Ca2+ contaminante (10 nM) .

44

45

potencial transmembranal acompañado de una elevación

significante del gradiente de pH a 692 y 1023 nM de Ca2+

4 7 eradiente eiectroquimico & jWtdhds

Cuando se estimula la actividad de l a 2-OGDH por Caz+,

se tiene en consecuencia un incremento en la velocidad de

I externo; la fuerza protón motriz resultante fue más alta en I

I

I presencia de Ca2+ en una orden de 6 mV a 1023 nM de Ca2+

(tabla 3) .

45

46

hpn ApH+

ICaZ+lax Ed0 4 Edo 3 Edo 4 Edo 3 Edo 4 Edo 3 --

361nM 197*3.6(4) 154.5f1.614) 20.5f6(5) 18.6t417) í144f1.8 (41 ílOStl(41

1023nM 197i2 (4) 162flí43 29f5143 32f6 6) I147f4 ( 4 1 I113f1(41

218 188 (1691 (1391

217.5 173 (16C.51 [1241

232.5 [l80.51 [

226 [1761

183 331

194 1451

PCO.01 contra lOnM de Caz+ externo. Los valnrer entre paréntesis cuadrados es la aproximación segun Rottenberg, 1 9 8 4 .

POTMCIAL ELtCTRICO

Re l a c i ón

Sper O.ImM/Mq+2lmM (0.11

Sper 0.3mM/Mg+21mM (0.31

Sper O.lmM/Mg+20.4mM í0.251

Sper 0.3mM/Mg+20.4mM (0.751

Estado 3(mVl Estado 4imVi

173.3f6.5143 193.5f4.314)

170.2f9.3 ( 4 I 188.2i5.6(4 I

Los valores entre parentes is son e l numero de experimentos rea l izados . Lor va lores entre parbntesis cuadrados es l a re lac ion espemna/Mg2+ u t i l i z ada , que se obtzene de d i v i d i r l a concentracion de espernuna entre l a concentracion de Mg2'.

Abreviaturas: spar, cspernuna.

46

Corno 13 ve-ocidac de síntesis de ATP es dependiente tie

I I (igr i tuci 9e.I grad,, rite electroquímico de protones [Azzoiie

e + . -1,1978;Aoelders e' al, 19881 resulta difícil ensayar con

1 I:; t é c n i c , . ~ > i t i l i z a !as si hay un ligero cambio en c i 1

qr:i(i:ente a( pr3z;nes < i 3 mV ó menos.

Se ob:( rvó c ? n las n-tocondrias de páncreas una tendencia

5 toi CIS I i t I O : ( ! ( i t ,lo .cncial de neinbrana en el estado :3

I :o se i.i-icrE'nieritG la relación espermina/Mg*+ a uria

[ 1; ' le:.: d e :i.L<p:.I ( * i.l)la 3) a pesar de que existe ur.a

e +:i.-iulciciijr si(jtlif.Lcal :va en la actividaa de la 2-OGDH y c.e

1 : v~clocidnc: r e s p : r a t c r i a del estado 3.

4:'

--.--.- . I .. * .- 1,11-, , ,# ,,.*. ._,#. , , ,,,,. -.,. - ,I ._,--- --.#w- * .I .,..--ai--

48

5. DISCUSION Y CONCLUSIONES.

Un paso simple y crítico de ceqtrifugación diferencial

con gradiente discontinuo de Percoll, fue necesario para

obtener mitocondrias sin los contaminantes gránulos de

zimógeno y con una actividad enzimática superior a la

observada en otras mitocondrias.

Pese a que estan contaminadas con retículo endoplásmico

y membrana plasmática, presentan contrcles respiratorios y

relaciones ADP/O muy altos. El sustrato más preferentemente

oxidado por estas mitocondrias es el 2-oxoglutarato, por

encima del piruvato y del glutamato, :.U que sugiere que el

acarreador de 2-oxoglutarato o bien la enzima 2-OGDH pueden

ser puntos críticos en l a vía de F:sforiiación oxidativa

encontrada en este tipo de mitocondrias.

Se han descrito numerosos reportes que explican la

modulación de las diferentes deshidrogenasas por Caz+ Y la

relacibri de este suceso con el aumento de actividad celular

[Hansford, 1985; McCormack et al, 1991 I . Así, cuando se

incrementa la [Ca2+lc se incrementa tmbién la actividad de

algunas funciones celulares como son la contracción y la

secreción, eventos acompañados de una eievación en la

actividad de las deshidrogenasas, partic.llarmente la piruvato

deshidrogenasa y la 2-oxoglutarato deshidrogenasa. Este

aumento de trabajo celular obviamente requiere de un

concomitante suministro de ATP.

Una hipótesis atractiva del control de l a fosforilación

oxidativa i n vivo postula que un incremento en la [Ca2+]c

48

49

trae como consecuencia un incremento en ia [~a2+]m necesario

para que se activen las deshidrogerasas sensibles a Ca2+,

dependientes de NAD. A l llevarse a cabo este evento, habrá un

incremento en la relación NADH/NAD+ y por tanto una elevación

del gradiente electroquímico de protones y en la velocidad de

síntesis de ATP [Denton y McCormack,l985]. Sin embargo, en

el caso de las mitocondrias de páncreas este suceso no se

llevó a cabo, aunque se encontró c? sumento en la actividad

de l a 2-OGDH y del flujo de fosforilación. Lo anterior puede

ser explicado de la siguiente manera: se ha demostrado que el

Ca2+ aparte de estimular reacciones que producen energía

(deshidrogenasas) también estimula reacciones que consumen

energía (p. ejemp. ATPsintetasa, el acarreador ATP/ADP, el

acarreador de Pi) por ende, a l estar activadas ambas reacciones mantienen constante a su intermediario: el

gradiente de protones.

Además, se ha sugerido que existen otros sitios en la

fosforilación oxidativa !aparte de las deshidrogenasas) que

son sensibles a Caz+, como son el acarreador ATP/ADP [Moreno-

Sánchez,1985], la ATPsintetasa [Yamada y Huze1,1988], el

citocromo bcl de la cadena respiratoria [Murphy et a1,1989];

por tanto no se debe excluir un incremento en la actividad de

estos sitios, cuando aumenta la [Ca2+1r.

Debido a la heterogeneidad celular, la preparación de

mitocondrias de páncreas utilizadas en cste estudio no puede

extrapolarse a los estudios hechos en células B pancreáticas.

Sin embargo, la observación de que el Caz+ extramitocondrial

50

(citosólico) puede modular la actividad de la 2-OGDH y la

velocidad de síntesis de ATP, implica que un incremento en

la [Ca*+]c provocado por algún estímulo fisiológico en

páncreas, como por ejemplo la elevacitn de glucosa, participa

en las reacciones rnitocondriales.

La fosforilación cxidativa puede ser modulada por

diferentes mecanismos, uno de ellos es variando la relación

espermina/Mg2+ que se explica de la siguiente manera: el

uniportador de Cazt puede activarse cl inhibirse dependiendo

de la concentración de espermina y Mg2+ citosólicos, de esta

manera se controla el influjo de Ca2+ y por tanto se modifica

l a [Ca2']m [Lenzen et a l , 1992;Moreno-:3ánchez y Hansford, 1988;

McCormack,l989] Ó bien puede ser que l a espormina y el Mg2+

interactúen con algunas enzimas de la vía. Se ha descrito que

el Mg2+ p e r se regula la actividad del acarreador ATP/ADP y

la ATPsintetasa cuando se varía su co;,centración citosólica.

Interesantemente el AMPc y el ADP inducen una salida de Mg2+

celular y mitocondrial en hígado, la cual es bloqueada por

inhibidores del acarreador ATP/ADP [Romani et a1,1991]. De

hecho, la [Mg2+1c 'es modificada por un incremento de glucosa

y carbacol en las células B del páncreas [Gylfe,1991].

Aunque no existe evidencia de que la concentración de

esperrnina cambia en presencia de estimulos fisiológicos, es

concebible postular que la relaciói espermina-Mg2+ puede

controlar l a velocidad de fosforilación oxidativa sin que

haya un cambio en la concentración de Ca2+, como se muestra

en este estudio.

1 I

51

6 . PERSPECTIVAS.

Como se ha mencionado, una ae las señales de disparo

para la secrecibn de insulina por las células B del páncreas,

es el incremento de Ca2+ intracelular [Théler et a1,19902;

Duchen et a1,1993], lo que provoca a su vez un incremento en

[Caz+], y por tanto la modulación de la vía de fosforilación

oxidativa; sin embargo, no se conoce a que concentración

intramitocondrial en mitocondrias de páncreas, el Caz+ es

capaz de activar a estas deshidrogenasas sensibles al catión.

Por tanto, es interesante determinar cuantitativamente la

concentración de Ca2+ intramitocondrial libre para esclarecer

a qué concentración real del catión son activadas las

enzimas.

La técnica empleada sería la fluorimétrica, utilizando

indicadores fluorescentes sensibles a Caz+ con alta

eficiencia cuántica, como son el Fluo-3, Fura-2 Ó Indo-1,

disueltos preferencialmente en DMSO (dimetilsulfóxido) para

mantener la homeostásis del Ca2+. El punto de interés en esta

técnica es lograr l a internalizacjón de los indicadores

flourescentes en la mitocondria y evitar su salida [Moreno-

Sánchez et al, 19931.

Hemos demostrado en este estudio, que una manera de

modular el influjo de Ca2+ a la mitocondria es variando l a

relación espermina/Mg*+ extramitocondrial; sin embargo parte

de esta espermina total (encontrada en el citoplasma en

condiciones fisiológicas) entra a la mitocondria y se ha

"-.-I---- --

52

demostrado que afecta a una de las enzirnas importantes de la

vía, la piruvato deshidrogenasa-fosfataEa.

Se ha descrito que la concentración total de espermina

en el citoplasma sólo cambia durante la etapa de

diferenciación celular [Lenzen et al, 19861 pero cuando la

célula está totalmente diferenciada la concentración de

espermina permanece constante; poi tanto para que la

espermina sea un modulador de la vía, su transporte al

interior de la mitocondria debe ser muy rápido, lo que

implica la presencia de un transportador regulable que sería

interesante caracterizar.

Además, si una determinada concer.traci6n c de espermina

modula la piruvato desh idrogenasa- fos fa tasa , sería factible

que al variar su concentración se afectaran otros sitios de

la vía. La técnica empleada para tal caso sería seguir el

desplazamiento de espermina marcada radiactivamente.

Ahora bien, se demostró que en presencia de Ca*+, las

deshidrogenasas aumentan su actividad, sin embargo faltó en

este estudio llevar a cabo una medición de la síntesis de

ATP, para ver si realmente el Caz+ estimula a toda la vía.

52

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