1 1

ORLA-3

‘NOHBRE:

TELEFONO :

MATRICULA :

CLAVE :

JCARRERA :

TRIMESTRE : - HORAS A LA SEMANA:

LUGAR DONDE SE LLEVO A CABO:

FECHA DE IN IC IO :

J FECHA DE TERMINACION:

/NOMEIRE DEL TUTOR:

TITULO:

ALUMNA:

TUTOR:

MARIA DEL C ~ N PERALOZA PEIMBERT

784-37-49

82235409

23.3 .&O .87

INGENIERIA BIOQUIWICA INDUSTRIAL

LABORATORIO NACIONAL DE SALUD PUBLICA

10 - MARZO - 1987

10 - SEPTIEMBRE - 1987 J Q.B.P. MARIA CRISTINA PARRILLA CERRILLO JEFE DEL DEPARTAMENTO DE EVALUACION DE RIESGOS MICROBIANOS Y PARASITARIOS DEL LABORATORIO NACIONAL DE SALUD PUBLICA DE LA SECRETARIA DE SALUD

INVESTIGACION DE INHIBIDORES WICROBIANOS EN PRODUCTOS CARNICOS

. MARIA C- CERRILLO

.-

P

. -

A) T I T ü 1 , O : I N V E S T I G A C I O N DE I N f i I E I D O R E S M I C R O B I A N O S E N PRODUCTOS C A R M I C O S .

B) I N T R O D U C C I O N :

E 1 constente incremento de la población y la necesida6 de - elevar el nivel de vida, han hecho que la producción de más

y mejor carne y una mayor eficiencia en su conservacióii, se consideren objetivos importantes.

Una vía para lograr dichos objetivos, ha sido:

1. mediante l a industrialización de la carne, para obtener

lo:; productos cárnicoc y,

2 . mediante ei empleo de conservadoras que se asaden con e1 f i n de controlar el Crecimiento microbiano, e l cual,

es responsable de l a alteración de las propiededes or@

nolépticas y nutrici.onales.

Los productos carnicos se obtienen industrializando 12 carne

fresca, y se pueden conservar manejando los factorss que - interviénen en el crecimiento de los microorganismos altera-

dores d e la calidad de dichos y>roductos cárnicos.

De entre los factores más importantes tenenos: la temperatu- ra, la humedad y la acomposición del medio que l o s rodea.

Así manipulando la temperatura, l o s productos cárnicos se pueden conservar manteniéndose a temperaturas inferiores en procesos llamados de refrigeración y congelamiento, o en - temperaturas superiores, por medio de procesos de pasteuriza

ción, esterilización o cocción. -

._

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2

Manejando la humedad, podemos conssrvar los productos cárni- cos sea deshidratados, liofilizados o mediante la adición de sal o azúcar.

Otro mBtodo de conservacien es por medio de la utilización

de inhibidores nicrobianos. los cuales son agentes que inter - fiere'n en el crecimiento y actividad de los microorganismos.

Algunos inhibidores tienen un alto grado de especificidad

contra cierto tipo de microorganismos. mientras que otros - presentan un espectro de acci5n muy amplio y pueden inhibir

una gran medida de ellos.

Los inhibidores actúan dafiando la pared celular de los micro - organismos, otros alterando la permeabilidad celular, inhi--

biendo ya sea la activldad enzimática o la síntesis deácidos

nucleicos, pueden ejercer su acción inhibitoria modificando

las aioléculas de proteina y de ácidos nucleicos o simplemen-

te su presencia en la célula actúa como un antirnetabolito.

La acción de un inhibidor está condicionada a v a r i o s factores

como son: la temperatura, el estado fisiológico de los riicro - organismos, el medio ambiente por ejemplo; presencia de mate .-

ria orgánica, nivel de contaminación inicial y acidez o alra - linidad.

Hay muchas clasificaciones de los inhibidores, todas ellas

son arbitrarias, y una sencilla es la siguiente:

a. Fenoles, y compuestos fenólicos. como el ácido fénico. el cual se emplea en soluciones acuosas entre 2 y 5%.

cresoles y el hexilresorcinol.

b.

c.

d.

e.

f.

g.

h.

i.

5

Alcoholes, por ejemplo: alcohol etílico que es efectivo

contra celulas vegetativas y no productoras de esporas,

los alcoholes superiores como el propílico. butílico. - amílico que son más germicidas que el etílico.

Halógenos como el yodo, este elemento se usa como agente

germicida en forma de tintura de yodo, y el cloro, que s e utiliza en compuestos como el hipocloritos Ca (0CLI2

y cloraminas.

Metales pesados: mercurio, plata y cobre.

Colorantes: en esta clasificación hay 2 compuestos colo - ranees que junto con sus derivados del triienilmetano. el que incluye el verde de malaquita. verde brillante J”

el cristal violeta, y los colorantes de la acridina - como es la acriflavina y la proflavina.

Detergentes.

Compuestos de amonio cuaternario.

Acidos y alcalis: ácido benzoico, sórbico. acético y

propiónico.

Quimioestabi’izadores gaseosos: óxido de etileno. propi

leno, betapropiolactona y formo1 ( 1 ) .

En la industria alimentaria se utilizan algunos de los mencio nados por su poder bactericida y10 bacteriostático y/o germi cida. .llam&ndoseles conservadores. Sin embargo, el descubri -

- -

miento de los antibióticos hizo posible otro métocio de consec

vación en los alimentos. siendo de 100 a 1000 reces más efi-

caces que Pos conservadores químicos admitidos. Suelen - utilizarse porque conservan las propiedades organolépticas

de Pos productos cirnicos, sin causar modificaciones químicas o bioquimicas ( 9 ) .

A l a feoha, s e han aislado e identificado varios miles de - antibióticos, muchos, sin importancia practica todavía. y

otros s e están utilizando para controlar el crecimiento de

muchos microorganismos. Desde 1945 a 1960 se realizaron ensayos de los antibióticos como conservadores en los alimen tos, sin embargo, a medida que se incremento el miedo a los microorganismos antibióticos-resistentes9 fueron disminuyen-

do su empieo como conservadores. Los dos antibióticos más utilizados son l a natamicina y la nisina.*

En los alimentos no debe existir residuos de antibióticos. - sin embargo, dado que é s t o s agentes terapeúticos se emplean

mucho como promotores del crecimiento y para el control de

enrermedades animales, a veces s e encuentran residuos en la

carne y en la leche.

La Organización Mundial de la Salud, ha señalado.que una con

5

centración de 20 p.p.m. es suficiente para promover el creci - miento, mientras que closis de 100 - 200 p-p.m. constituyen

niveles profilácticos Que pueden dejar residuos en la carne,

leche y huevos (14).

Actualmente la utilización de antibióticos con fines no médi - cos, se ha prohibido pare evitar que se produzcan infecciones

humanas p o r microorganismos que han adquirido resistencia.

El uso ile inhibidores microbianos se remonta a años prehistó

ricos donde se utilizaban sustancias químicas. al ahumar y

curar la carne. y en la salazón del pescado.

-

En el proceso de ahumado, el ilumo- no sólo imparte sabor a l

producto. sino que por su contenido en fenoles, formaldehido

y derivados del fenantremo ejerce acción conservadora 7 re--

tarda l a oxidación de las &rasas : 9 ) . En este proceso, lo más importante es la absorción üe vapor PO:- el agua de l a su - perTicie, y por eñ agua intersticial del producto.

\.

En el caso del curado, la eficacia de est * proceso para imp?

dir el crecimiento microbiano, se debe principalmente a que se incrementa la presión osmótica de estos productos, y así,

ejerce su acción inhibitoria.

Zn las salmueras para el curado se utiliza N a C 1 , nitrato só-

dico o gotásico y azúcar.

y p. I

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6

El empleo de inhibidores microbianos en los productos cárni- cos se ha incrementado '>or varias razones:

1 . "Cuando las ireas donde se producen, están alejadas de

las áreas en donde se concertra la población consumido ra ,, creando la necesidad ¿e transportarlos o almacenar - lo:; bajo condiciones que aseguren su conservación.

2 . Cuando un producto provie.ie de un animal enferzo que

ecii:uvo bajo tratamiento antiinfeccioso.

3 . Cuando se quiere disminuir la cuenta de microorganis--

mo:; mesófilos aerobios. para encubrir pricticas antihi - giiinicas de manufacturas (16).

Su presencia en los productos cárnicos e s objetable porque:

1. Pueden ser tóiricos para la población que los conscme.

2. Pueden favorecer el desarrollo de cepas resistentes.

3 . Como no esterilizan, sino que solo retardan l a altera-. ciiin, inhiben a los microorganismos responsables de di

chzi alteración sin afectar a los patógenos. producien- do riesgos de infecciones alimentapias (9).

-

En el caso de que un inhibidor sea un antibiótico resi

dual, puede sensibilizar al consumidor, produciendo - reacciones alérgicas cuando haya necesidad de aplicai--

le entibióticos.

- 4.

Su determinación es important pues sirve para establecer los riesgos a la salud y las medidas de control que resultan

de un análisis positivo.

7

0

Por :o anterior, desde la antisredad hasta nuestros días, - ha existido gran interés por la seguridad de nuestros ali--

mentos, particularmente por lo que se refiere a los conser- vadores químicos que se añaden can el fin de controlar el

crecimiento de microorganismos, es decir, inhibidores micro

bianos. y para evaluar la presencia de un inhibidor. hay

varias técnicas de laboratorio. en las más comunes, cada in - hibidor es probado contra un mocroorganismo seleccionado al

que se Le llama microorganismo de prueba (11). El inhibi- dor puede ser líqujdo, sólido o gaseoso. así:

1.

2 .

3 .

Lo:: inhibidores líquidos solubles en agua a diferentes

concentraciones, se ponen en tubos de ensayo estériles

y se les agrega cantidades medidas del microorganismo

de prueba. A intervalos se hacen resiembras de estos

tu!oos.con medio de cultivo estéril, las resiembras se

incuban y se observa si hay desarrollo.

Si el inhibidoF es sólido, se resiembra una placa con

el microorganismo de prueba y se pone en el inhibidor

con este medio. Se incuba y se observa si la placa tiene zonas de inhibición (sin desarrollo) alrededor

del inhibidor.

Para evaluar inhibidores gaseosos, es necesario impreg

nail tiras de papel con cantidades conocidas de esporas

bacterianas, después las tiras se exponen al gas culti vándose posteriormente para investigar si hay supervi-

vencia.

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En las ténicas anteriores, se observa l a zona inhibitoría,

I

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8

pero ha:? otros métodos donde se egrecia un cambio de color

en el medio de cultivo 18). A q u í se utilizan cultivos - . iniciadores lácticos que son fuertemente reductores de colo

..

rantes, como el zzúl de metileno o la resazurina, donde la

falta de reducción por parte del cultivo, implica la presen

cia del inhibidor.

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P

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En este trabajo, el objetivo que se desea, es validar o --- comprobar los parámetros más importantes que afectan al m6-

todo de difusión en placa, como son: concentración de inbcu - lo, volumen vaciado en placa. cantidad de muestra impregnada en los idiscos, parámetros establecidos en (lo), para as:, - disponer de un método sencillo y rápido pais la detección de inhibidores microbianos y realizar una investigación so- bre sus frecuencia en los productos cárnicos.

En esta investigación s e u-Liliza como microorganismo de - prueba a Bacillus stearothermophilus, - ATCC 12 ,980 , el cual

es un microorganismo de metabolismo respiratorio, aerobio y

termoresistente ( 2 ) .

C) QBJETIVOS :

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I ;- , .. c

I ,

I --

c.1 Validar !.'I método sencillo y rápido para la de-

tección de inhibidores microbian08 en productos

cárnicos.

c.2 Investigar la frecuencia de inhibidores micro--

bianos en los productos cárnicos.

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D) MATERIAL, METODOS Y TECNICAS O ACTIVIDADES A DESARROLLAR:

D.1 MATERIAL : - Horno para esterilizar a 18OOC. - Autoclave con termómetro y manómetro.

-- Baño maría con termóstato y termómetro. - Licuadora de una o dos velocidades controladas.

por un reóstato con vasos estériles.

- Balanza de una capacidad no mayor de 2500g. y de una sensibilidad de 0.lg.

- Balanza analítica. - Incubadora con termóstato que evite variaciones

de + O.IoC. - - Utensilios estériles para l a preparaci5n de mues

tras: Cuchillos, Pinzas de disección, Tijeras,

Cucharas y Espátulas.

- Pipetas bacteriólogicas estériles de 10 y l m l . ,

graduadas en 0.1 y 0.01ml. respectivamente y - protegidas con tay5n de algodón.

- Fpascos de vidrio de boca angosta de 2501111. de capacidad. con tapón de rosca.

- Contador manual. - Contador de colonias Quebec o equivalente.

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’F” l -

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i r I .-

Cajas de Petri estériles de 100 * 3.5 !am.

Centrifuga.

Medidor de haltos.

Botellas de Roux. . Discos de papel Sil’cro de 6mm. de diámetro.

Perlas ¿e vidrio estériles.

k3echeros. Gradi 112.

Tubos de ensaye de 16 * 150 mm.. con tapón de

roscen Matraz Erlenmeyer con capacidad de 1000 y 250 ml.

D.2 MEDIOS DE C U L T I V O Y IIEACTIVOS:

D.2.1 Medio #2 para antibióticos (difco). Utilizado en

la preparación de las placas de ensayo.

Extracto de carne 1.5 g.

Extracto de levadura 3 . 0 g.

Peptona U.0 g .

Agar 15.0 g .

Agua 1000 ml.

Disolver 25.5 g . en 1000 ml. de agua destilada - fría. Calentar a ebullición para disolver el me-

dio completamente. Vertir en frascos con 100 y

30 ml. respectivamente. Esterilizar en el auto-

clave a 15 libras (121°CPdurante 15 min. El pH final del medio debe ser 6.5 - + 0.1 a 25OC.

D.2.2 Agar nutritivo. adicionado con 0.05% de dextrosa y 50 ppm. de :fin++ Utilizado para propagar la

cepa.

Extracto de carne 3.0 g .

Peptona 5 .0 g.

Agar 15.0 g.

Agua 1000 m l .

Disolver 23 g. en 1000 nl. de agua destilada - fría. Se adiciona l a sal y la dextrosa* Calentar

a ebullición para disolver el medio. Vertir en botellas de Roux 250 el. Esterilizar en e0 auto-

clave a 15 libras (121°C) durante 15 min.

D.2.3 Rledio Agar-triptona-extracto de levadura. Para

?.a cuenta de microorganismos mesófilos aerobios.

Extracto de levadura 2.5 g .

Triptona 5.0 g.

Dextrosa (d-glucosa} 1 .0 g.

Agua destilada 1000 nl.

Agar 15.0 g.

Disolver los ingredientes en 1 It. de agua. Her-

vir hasta total disolución. Distribuir en frascos

un volumen de 200 ml. Esterilizar a 15 libras (121OC) durante 15 niin. E1 pH del medio debe ser

7.0 + 0.1 a 2 5 O C . -

* El cálculo se encuentra en el apendice APl

12

D.2.4 Solución salina estéril al 0.85%:

Cloruro de sodio Agua destilada

0 . 8 5 g . 100 ml .

Disolver y distribuir en volúmenes de 100 ml. Esterilizar u 121OC durante 20 minutos.

D.2.5 Solución buffer diluyente pH=6:

Se prepara una solución stock:

34.0 e" I<H2

Agua destilada 1000 m2.

Disolver el fosfato en agua destilada y ajustar cl pH a 6 con HC1 o NaOH, según sea el caso.

Llevar a 1 litro con agua destilada. Esterilizar

durante 20 minutos a 121OC.

Conservar en refrigeración. Tomar 1.25mP. de s o - lución stock y llevar a 1 litro con agua destila - da, ésta e s l a solución d ? trabajo.

Distribuir en porciones de 100 ml.en frascos de vidrio con tana de rosca.

Esterilizar a 121OC durante 20 minutos.

D.2.6 Solución buffer diluyente pH=7:

De l a misma forma que en D.2.5 sólo que ajustan- do el pH a 7 y distribuyendo en frascos con 99 y 90ml. cada uno.

Esterilizar a 12l0C durante 20 minutos.

13

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D.3 ACTIVIDADES .A DESARROLLAR:

0.3.1 Obtensión de la sus9ensión de esporas. de Bacillus Stearothermophilus, ATCC 12,980.

Inocular con 1 m l . de la solución de esporas dis - ponibles, las botellas de Roux, las ci-ales tienen

ya solidiIicado previamente el medio de propaga-

ción D.2.2.. se distribuye el inoculo sobre la

superficie del medio, con al ayuda de perlas de

vidrio estériles.

Incubar u 5 3 ° C duranre 43 horas. Lavar el crecimiento d e l microorganismo con 10ml.

de solución salina D.2.4

Vertis en un tubo de ensayo estéril.

Pasteurizar a 92O7. durance 10 minutos, para des

truir el crecimiento vegetntivo.

Centrifugar a 3 , 0 0 0 r.p.m. durante 20 min. Decantar el líquido sobrenadante.

Resuspender el sedimiento con 1 3 ml. de solución salina D.2.4

Refrigerar a 4-6OC hasta utilizarse.

-

D.3.2 Determinación de la Concentración de esporas ob-

tenidas, de - Bacillus Stearothermophilus, ATCC 12.980:

Fundir el medio de cultivo, los frascos con 100ml.

, .<

D.3.3 Preparación de las placas de ensayo:

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Fundir %?l --..dio de cultivo (frascos de 30ml.D.2.1

como en la forma anterior D.3.2, al alcanzar ia

temperatu-a de 60 - + lo C, se procede a inocular

con la concentración de esporas deseada.

A l inocular es necesario hacer notar que para - cumplir con el primer objetivo, se deben manejar 3 variables, por lo cual, el esquema de trabajo fue el siguiente:

m m R E ; p D w A c o G (u>) ~ ~ P r w A w A L I z s R M D ~ ~ TImm PXCI.O)~+I P(I.O)~*I NIP)% 7 ZWO) *I

7 ~~

El cálculo para inocular con l a concentración de-

seada. se encuentra en el apéndice (AP ) .

Una vez inoculados los frascos del medio, con las concentraciones propuestas, se vacia a l a s placas

con los volúmenes mencionados. A l solidificar,

s e invierten y se guardan en refrigeración a 4 o 6OC. El almacenaje no debe exceder de 1 semana

2

(LO).

fl Esporas/ml. de medio. ' 2 Variaciones más pequeiias de la cantidad de muestra impregnada en el disco,

no se pudieron realizar, pues no se dispuso de micropipetas, por lo que. - sin ellas ~ es díficil controlar la variable.

de medio D.2.1 con un calentamiento rápido y ho-

mogeneo. Cuando se alcanza la temperatura de

12l0C en el autoclave, cesar el calentamiento.

Sacar los medios ai- ambiente hasta alcanzar una

temperatura de 60 2 5" C.

Introducir los medios en un baño de agua a 60 2 l o C para mantenerlos fundidos.

Distribuir las cajas de Petri estériles. en la

mesa de trabajo sobre una superficie lisa y bien

nivelada. Marcar les cajas con los datos necesarios para

su identificación, clave, dilución, fecha y medio

empleado.

Tomar 1 ml. de la suspensión de esporas obtenida en D.3.1. y diluiria en la solución buffer pH=7

D.2.6 es un frasco con 99 ml.. así tenemos una

dilución de lo-' esporas / ml. Se homogeniza agitando el frasco con movimientos

de arriba hacia abajo. De la dilución anterior

se transfiere 10 ml. a otro frasco, el cual con-

tiene 90 ml. de la solución diluyente D.2.6 y se

obtiene la dilución

Las próximas diluciones se realizan siguiendo el

esquema #i.

Una vez inoculadas las cajas, se les agrega de - 10 a 15 ml. del medio que se encuentra fundido,

moviendose la caj. para distribuir el inoculo.

,

Volumen del

.&z& log. diluyente:

Volumen I inoculado : 1 r n l .

I Dil.uci6n

Directa

ESQUEMA # 1. 1 6 I

90 m l . 90 m l .

i m l .

I , -1 10

1 m l . i m l .

b I -2 10

1 ml.

1 1 mi.

!?

a -5 10

A l s o l i d i f i c a r , se incudban en p o s i c i ó n inve i t ida

a 53O C , durante 48 ho ras . Transcur r ido e s t e

t i empo , se hace e l r e c u e n t o de c o l o n i a s , con ,-l.

a u x i l i o d e l con tador manual y d e l con tador de co

l o n i a s Quebec. M u l t i p l i c a r por l a i n v e r s a de - l a d i l u c i ó n p a r a '7btener # de esporas/ml. de sus

pens ión .

-

D.3.4. Preparación de la solución testigo:

El antibiótico utilizado en la solución testigo

fue penicilina G sódica, cuya potencia es de --- 1,680 U/mg *l.

Preparar la solución stock a una concentración

de 100 ü / m l . (10) rip3.

Pesar y disolT,er en el buffer fosfatos pH=6

D.2.5 Refrigerar a 4 o 6 O C.

Al utilizarse, se diluye a la concentración de-- seada en el buffer D.2.5.

D.3.5 Construcción de la curva, concentración de anti-

biótico Vs. diámetro del halo de inhibición:

Se preparan diluciones del antibistic0 penicili-

na G sódica, y se prueba con el microorganismo

para obtener el díametro del halo de inhibición. El cálculo para preparar las diluciones se encuen - tran en el apéndice ( A P 4 ) . Se ensaya con las si - guientes diluciones: [ J de antlbiótico, U/mP.;

desde 0.01 hasta 0.2

"1 Dato proporcionado en el departamento de análisis de antibióticos del Laboratorio Nacional de Referencia de la Secretaria de Salu- bridad.

D.4 TE C ¡U I C W S :

D . 4 . 1 . P r o c e d i m i e n t o r e c o m e n d a d o e n (10) :

Las ? l a c a s d e e n s a y o SI s a c a n 1 h o r a a n t e s d e u t i - l i z a r s e , para q u e a d q u i e r a n la t e m p e r a t u r a ambien

t e .

Una v e z q u e s e r e c i b e n l a s m u e s t r a s a a n a l i z a r ,

se i d e n t i f i c a n c o n e l nombre d e l p r o d u c t o y su - p r o c e d e n c i a .

E n f r a s c o s e s t é r i l e s , pesar log. de la . m u e s t r a ,

( t e j i d o d- cap;?e F r e s c a o p r o d u c - t o c á r n l c o ) .

C o i t a r e n p e q u e ñ o s t r o c i t o s , c o n l a a y u d a d e p i n -

z a s y t i j e r a s e s t é r i l e s . R o c i a r l a mcestra c o n

201111. d e b u f f e r d i l u y e n t e pH6= D.2.5.

Hornogenizar .

I i e f T i g e r a r a J ' " 6 O C d u r a n t e i h o r a .

C e n t r i f u g a r a 43630 r . p . m . d u r a n t e 10 minu-Los.

D i s c o s de p a p e l f i l t r o e s t é r i l e s , s e i m p r e g n a n

coa e l e x t r a c t o c e n t r i f u g a d o , 0.1, 0.2 y " , . 3 m l .

r e s p e c t i v a m e n k e . y s e c o l o c a n c o n p i n z a s s o b r e La

s u p e r f i c i e d e l a s d i f e r e n t e s p lacas d e e n s a y o .

L a s p l a c a s se i n v i n i - t e n y se i n c u b a n a G 5 O C d u r a n - t e 2X 3 h o r a s .

Leer y m e d i r los d i á m e t r o s de 13s z o n a s de inhibi -

c i ó i i a i t é r m i n o d e l t i e m p o d e i n c u b a c i ó n .

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D.4.2 Técnica para la cuenta de Bacterias Mesofilas A e r o -

bias "1:

Fundis el medio de cultivo, D.2.3 con un caleritn- miento rápiao y homogeneo.

Cuando se alcanza la temperatura de 12l0C, cesar el calentamiento.

Sncar los medios al ambiente, hasta alcanzar Lma

temperatura de 4 5 + l0C e introducir en un bauo de agua a 45 + l0C para mantenerlos fundidos. Hartar las cajas de Petri con los datos necessdos

para su identificación.

En zona estéril, pesar log. de muestra íprodi;ci:o

cárnico o tejido de carne fresca), y transferirla

a una licuadora estéril.

Añadir 90ml. de la solución buffer dilujente ?i!=i'

D.2.6 y licuar por 1 minuto para obtener una GUS--

pensión completa y homogenea.

Continuar las diluciones de la muestra siguiendo

el esquema #l. Una vez inoculadas las p!.acas,agre gar 12 o 151111. del medio de cultivo. A l solj.Sifi:-

car, invertir las placas e incubar a 21"Y por 43

horas. Contar todas las colonias (excepto ias de hongos 1. Rultiplicar por la inversa de l a dilución para - obtener el # de colonias/g de mues-kra.

- -

*1 : Este análisis a practicar, se propuso para comparar la cuenta de microorganismos mesófilos aerobios de las muestras con inhibición positiva, de las que tienen inhibición negativa.

E.

E.l

RESULTADOS CBTENIDOS:

Resultados de las variaciones en los parámetros que afectan l a sensibilidad del método de difu--

sión en placa.

E.l.l Diámetro de la zona inhibida en relación a la - concentración del inhibidor.

Para comenzar se ensaya con los valores óptimos reportador (10) y se toma una solución estándar

de penicilina D.3.4 como sustancia inhibidora.

1) Concentración de inoculo = 2(lOI5 esporas/ml. (10)

2) Volumen vaciado a la placa = 6ml. (10)

3) Cantidad de muestra impregnada = 0.1 ml. (10)

4) Temperatura de incubación = 65OC (10)

5) Tiempo de incubación = a - 3 horas. (10)

--

CONCENTRACION DE INOCULO.

CONCENTRACION DEL ANTIBIOTI CO ü/ml.

-

0.2 0.19 o. 1.8 0.17 O. 1.6 0.15

21

E.1.2 Diametro de l a zona i n h i b i d a en r e l a c i ó n a l a COG

centracicín de i n o c c l o :

Constantes :

1 ) Volumen vac i ado a l a p l a c a = 6011.

2) Cant idad de muestra impregnada = O.lml.

3) Temperatura de incubac ión = 60°C

4 ) Tiempo de incubac ión = 18 horas

2( io i *I

- DIAMETRO DE LA ZONA DE INHIBICION 1 cm.

Zonas de inhl muy grandes ma no d e f i n l d i f i c u l t a S I

TABLA NO . 2

'2

ción ? for

nedida.

- i , que

1.7 1.43 1.27 1.2 1.15 1.08 0.9 0.8

--- -

V a l o r medio x = 1.385 Desv i ac ión e s tánda r C n = 0.509

'1 = esporas/ml. *2 = Diámetro de l a zona de inhibición. cm.

12

2.19 2.15 1.92 1.89 1.75 1.68 1.62 1.59 1.53 1.42 1.38 1.25 1.29 1.22 1.17 1.1 0.92 0.85 0.72 O

12

1.31 1.28 1.22 1.19 1.14 1.0 0.94 0.9 0.83 0.77 0.7 0.65 O O O O O O O O

+2

1.71 1.62 1.5 1.33 1.25 1.1 0.93 0.82 0.73 0.62 O O O O O O O O O O

- X = 0.596 = 0.522

K n = 0.516 Gk = 0.6058

22

E.1.3 Diámetro de la zona de inhibición en relación al volumen de medio vaciado a la placa.

Constante-: 5 i) Concentración de inoculo = 2(iO) esporas/ml.

2) Cantidad de muestra impregnada = 0.1 ml.

3) Temperatura de incubación = 55OC

4) Tiempo de incubación = 18 horas

VOLWEN ml.

CONCENTRACION DEL ANTIBIOTI CO U/ml.

-

0.2 0.19 O. 18 0.17 0.16 0.15 0.14 0.13 0.12 0.11 0.10 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01

TABLA NO. 3

DIAMETRO DIAMETRO DE LA 20 DE LA ZO NA DE IF NA DE 1% HIBICIOÑ HIBICIOÑ

*1

2.1 1.9 1.88 1.8 1.75 1.7 1.63 1.59 1.3 1.0 0.8 0.7 O O O O O O O O

I 1.99 1.82 1.78 1.66 1.59 1.56 1.51 1.45 1.42 1.36 1.31 1.29 1.28 1.20 1.13 0.92 0.85 0.73 0.69 O

7 ml.

DIAMETRO DE LA 20 NA DE IÑ

cm . HIBICIO~

1 .ea 1.80 1.78 1.72 1.68 1.60 1.53 1.47 1.39 1.33 1.28 1.22 0.9 0.7 O O O O O O

Valor medio ;=O. 923 ;=l. 257 ;=l. O09

Desviación estándar q4.8305 qd.4512 c=0.7136

8 ml.

DIAHETRO DE LA 20 AA DE 1%

cm . HIBICIOM

1.66 1.58 1.52 1.47 1.41 1.33 1.28 1.1 0.9 0.85 0.75 0.7 O O O O O O O O

=0.7875

6, =O. 6304

23

V0LüMF.M , m l . CONCENTRACIOM DEL ANTIBIOTI CO ü/mT.

-

E.1.3 Diametro de la zona de inhibición en relación a la

0.01 ml.

DIARPETRO DE LA ZONA DE IMHIBI - CION, cm.

cantidad de muestra impregnada.

Constantes:

1) Concentración de inoculo = 2(10)5 esporas/ml. 2) Volumen vaciado a la placa = 6ml.

3) Temperatura de incubación = 53OC 4) Tiempo de incubación = 18 horas

TABLA NO. 4

0.2 0.19 0.18 0.17 0.16 0.15 O. 14 0.13 0.12 0.11 0.10 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01

'3

0.1 ml.

*2

2.33 2.27 2.15 1.98 1.81 1.73 1.71 1.67 1.6 1.53 1.42 1.40 1.38 1.34 1.28 1.2 0.97 0.91 0.75 0.6

0.2 nil.

"2

2.47

2.23 2.1 1.96 1.85 1.81 1.79 1.72 1.66 1.55 1.51 1.49 1.43 1.39 1.32 1.21 0.99 0.83 0.7

2.38

0.3ml.

32

"4

Valor medio = 1.49

Desviación estándar & = 0.469

"2 Diémetro de la zona de inhibición, cm. *3 Volumenes más pequeños de O.lml., como el de 0.01ml.. no

se pudo ensayar. pues no se dispusó de mocropipetas o pi - petas bacteriológicas con mayor graduación.

14 Ensayar con 0.31111. del extracto centrifugado es demasia- da cantidad.

ln

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O O O 5

4 I l l + I + + + + I I l l + I I + I + v)

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43

F

F . 1

42

DISCUSION UE LQS RESULTADOS OBTENIDOS: I

Diámetro de la zona ici.i->ida en función de la COII- I

centración del. inhibidor (solución de penicilina).

Constantes:

1) Concentración de inoculo = 2 ( 1 0 ) esporas/ml.

2) Volumen vaciacio en placa = 6ml .

39 \Tolumen de muestra impreanada = O.iml.

5

~

SE Tiempo de inciibación = 2% - 3 horas. I I!

5) Temperatura de incubación = 65OC.

43

TABLA NO. 1

CONCENTRACION DE ANTIBIOTIC0 ü/ml . - 0.2

0.19

0.18

0.17

0.16

0.15

0.14

0.13

0.12

o. 11 0.10

0.09

0.08

0.07

0.06

0.05

0.04

0.03

0.02

0.01

x x = xy =

x =

y "

b =

r n =

Corr =

1.33

0.1

O. 4003

O. 0621)

O. 8446

4.8532

0.7522

DIAMETRO DE LA ZOMA DE IN- HIBICION, Cm.

-

2.26

2.1

1.93

1.84

1.73

1.62

1.59

1.54

1.48

1.40

1.36

1-33

1.28

1.21

1.19

1.15

]..O

0.9

0.7

0.6

4 4

En la gráfica número 1, se expresa una reiación directamente

proporcional de la zona inhibida y la concentración del inhi- bidor.

Respecto al tiempo de incubación, se observa que a las 3 horas no existe una germinación, ni crecimiento adecuado. ni zonas

de inhibirión. El tiempo de incubación establecido en ( 1 0 )

como 211 - 3 horas es el primer parámetro que se modifica.

A las 6 horas, s e comienza a distinguir zonas de inhibición - ?obremen-te definida, y el crecimiento no es homogéneo.

La siguiente curva corresponde a 18 horas de incubación. donde la gerninación y crecimiento es mayor y uniforme, s e pueden - distinguir halos de inhibición bie:i definidas, 6e forma circu

Zar. La anterior observación indica qce s í existe una ade-- cuada d.ifusi6n de Pa muestra - problema hacía el medio de -- cul-tivc,.

A las 24 horas de incubation no se observa algún cambio signi

faicativo, respecto a las observaciones hechas en las 18horas.

-

-

! ,.- I / ! .-

I ”,..

I

, .-

En el intervalo de 6 I 10 horas, no s e pudo seguii el curso del crecimiento, debido a razones de horario, pues nadie debe

permanecer después en el laboratorio.

Respecto a la temperatura de 65O C , parece ser alta, pues las

placas se observan deshidratadas, e incluso el medio se ha - roto y se encuentra levantado.

, Por lo mterjor, se propone disminuir a 60°C para evitar la

deshidratación, e incluir frascos con agua destilada para hu-

medecer la incubadora.

De acuerdo a los resultados expresados en la gráfica número 1, s e seguirá incubando hasta 18 horas.

4 5

i .- -i

I I i -

F.2 Diámetro de la zona inhibida en función de la con- centración de inoculo.

Constantes;

1) Volumen vaciado, en placa = 6ml.

2) Volumen de muestra impregnada = 0.1 ml.

3) Tiempo de incubación 18 horas.

4) Temperatura de incubación = 60°C

GRAFICA NO. 2

r 4 6

En la gráfica número 2 se observa una relación inversamente - proporcional de la zona inhibida con la concentración de ino-

culo, de tal manera @.?e u mayor inoculo, menor diámetro de la

zona de inhibición.

En este caso, se volvió a comprobar que antes de 6 horas de - incubación no existe un crecimiento homogéneo del Bacillus - Stearothermophilus. ATCC 12,980.

Respect,o a la temperatura de 60°C. sigue deshidratando las - placas, por lo que se ensayará a 53O C, que es la temperatura

que se utiliza en la propagación de la cepa.

De acuerdo a los resultados expresados en la grafica número 2, la concentración de inoculo = 2 ( 1 0 ) esporas/ml., es la que

nos ofrece una menor variación en los diámetros de la zona - inhibida, respecto a los diámetros de la gráfica níamero 1.

5

Por ello, se mantendrá como constante.

i

I

F.3

47

Diámetros de In zona inhibida en función del volu- men vaciado en placa. (grosor de la placa).

Constantes:

1) Concentración de inoculo = 2(10) esporas/ml.

2) Volumen de nuestra impregnaüa = 0.1 r n l .

3) Temperatura de incubación = 5 3 O C.

43 Tiempo de incubación = 18 horas.

5

GRAPICA 130. 3

S e o b s e r v a u n a r e l a c i ó n i n v e r s a m e n t e p r o p o r c i o n a l , es d e c f r .

a menor v o l u m e n v a c i a d o a l a p l a c a , mayor es l a z o n a d e i n h i -

b i c i ó n . E s t e p a r á m e t r 7 . . v o l u m e n v a c i a d o e n p l a c a , es muy

i m p o r t a n t e , p u e s e s q u i e n d e t e r m i n a e l g r o s o r de l a p l a c a y

l a f o r m a e n q u e s e d i f u n d e e l i n h i b i d o r . Por lo q u e l o s re- -

s u l t a d o : ; , c u a n d o se t i e n e un volumen m a y o r , como e s 8 m l . , el

g r o s o r d e l a p l a c a tarnbi i in es m a y o r , p o r lo que s e t i e n e u n a

d o b l e d i f u s i ó n d e l i n h i b i d o r , d i f u n d e r a d i a l m e n t e s o b r e l a sg

p e r f i c i e y v e r t i c a l m e n t e a t r a v é s d e l g r o s o r d e l a p l a c a . por

e l l o e s que s e o b s e r v a un menor h a l o d e i n h i b i c i ó n , p o r q u e de

c i e r t a m a n e r a p a r t e d e l i n h i b i d o r e s l á a c t u a n d o donde n o s e

puede c u a n t i f i c a r .

R e s p e c t o a d ml. d e medio v a c i a d o , é s t e no s i r v e , p u e s en --- c u a n t o s e v i e r t e a l a p l a c a , se e s t á s o l i d i l i c a n d o . d e m a n e r a

que n o s e p u e d e d i s t r i b u i r u n i f o r m e m e n t e e n l a p l a c a , f o r m á n -

d o s e s u p e r f i c i e s o n d u l a d a s , y ; e n c o n s e c u e n c i a , a l c o l o c a r - l o s d i s c o s i m p r e g n a d o s c o n l a m u e s t r a . no e x i s t e u n a a d e c u a d a

d i f u s i ó n d e l i n h i b i d o r , o r i g i n á n d o s e g r a n d e s z o n a s d e i n h i b i -

c i ó n siii f o r m a s , l o es d i f í c i l d e m e d i r ,

A d e m á s c o n 4 ml. de volumen v a c i a d o , s e forma u n a placa q u e - t i e n e un g r o s o r a p r o x i m a d o manor a 1 m m . y c o n 53' C como -- t e m p e r a t u r a d e i n c u b a c i ó n , é s t a s e e n c u e n t r a t o t a l m e n t e d e s h i

d r a t a d a e i n c l . u s o l e v a n t a d a d e l a c a j a P e t r i . -.

Con un mayor vo lumen ( 5 . 6 . 7 y 811111. n o s s o b s e r v a d e s h i d r a -

t a c i ó n a 5 Y C , y c o n 6 mi. d e volumen v a c i a d o , o b t e n e m o s u n a

menor v a r i a c i ó n e n los d i á m e t r o s d e l a z o n a i n h i b i d a , respec-

t o a l a s 2 g r á f i c a s a n t e r i o r e s , p o r e l l o , s e m a n t e n d r á c o n s - -

t a n t e .

F.4 Diámetros de la zona inhibida en función de la can - tidad de muestra impregnada.

Constantes-

1) Concentración de inoculo = 2(10) esporas/mi.

2) Volumen vaciado en placa = 6 m l .

3) Temperatura de incubación = 53OC 4) Tiempo de incubación = 18 horas

5

GRAFICA NO. 4

50

CONCENTRACION DE INOCULO

~

VOLUMEN VACIADO EN PLACA.

CANTIDAD IMPREGNA NADA EN DISCO.

En la gráfica n6mero 4 . se observa una relación directamente

proporcional de l a zona inhibida y la cantidad de muestra i m -

pregnada, es doqde se omprueba que a mayor volumen demuestra

impregnada en el disco, mayor-halo de inhibición y. por lo -- tanto, mayor detección del agente inhibidor.

2(10) esporas/mi. 1.385 0.509 5

2(lo)6 " 0.596 0.516

2(10f " 0.522 0.6058

0.923 O. 8305 1.257 0.4512

5 m l . 6 ml. 7 ml. 1.009 O. 7136 8 ml. O. 7875 O. 6304

0.1 m l . 1.a9 O. 469 0.2 m l . I 1.619 O. 468

Respecto al volumen de 0 .05 m l . , este no se pudo ensayar,pues

no se dispuso de mocropipetas o pipetas bacteriológicas con - mayor graduación, para controlar un volumen tan pequeño.

Con 0 . 3 ml. de muestra, ésto es demasiado. y al aplicarlos - sobre el disco de 6mm. de diámetro, este se,satura, no tiene

mayor rapacidad de absorción y parte de l a muestra se derrama;

por lo cual, tampoco se ensaya.

De acuerdo con los datos obtenidos, se tiene una menor varia- ción en los diámetros de la zona inhibida con un volumen apl'

cado de 0.1 n i l .

De los resultados obtenidos. con base en el valor medio arit- mético (;)..se tiene el siguiente cuadro:

Se observa que existe menor variación con las variables;

5 Concentración de inoculo = 2 (10)

Volumen vaciado en placa = 6 ml.

Cantidad impregnada en placa = O.¡ ml.

esporas /d.

Por lo anterior, se toman como constantes y se decidió inc!

bar a 53OC por 18 horas. Con estos parámetros se investi-

gó la frecuencia de los inhibidores microbianos en los pro- ductos cárnicos.

F.5 Frecuencia de Inhibidores microbianos en Produc

tos Cárnicos y/o en Carne Fresca:

Total de muestras analizadas

Total de muestras con resultado

positivo de inhibidores

% de muestras positivas De las 284 muestras analizadas.

tenemos l o s siguientes productos:

Tipo de Producto # de muestras Analizadas

% Diámetro Promedio (cm. 1

LOO

100

100 - - 27 0.86 -

100

85

77

O O

- - - - - 45 0.81

66 - - - 82 0.83

20

33

O

O

66

60

- - - -

__ 100

66

100

93

40 0.91

- - - - -

62 0.83

92 __.

-

I ~

1 I

I

I

TABLA # 5

Butifarra blanca

Camarones

Carne de res

Chorizo * Chuleta de cerdo

Entrecot ahumado - Fiambre de cerdo -

- - -

Hígado de ganso - Hígado de r e s

Longaniza + - Lomo ahumado

Jamón +

Moronga

Mortadela

Panza de r e s

-

-

Pastel c/pimiento

Pastel de po l lo - Pathé

Pescado fresco

Pierna de cerdo

Po l lo crudo

Queso de puerco

salami +

Salmón

Salchicha +

Tocino

T O T A L :

- -

# de muestras Positivas

*

O

O

1

1

7

37

1

13

13

1

1

27

3

64

5

3

1

4

3

5

3

6

14

16

10

4

29

14

284

27

O 7

O

O

O 73

O

15

23

100

100'

- - _.

- - - _.

- 55

33

18

80

66

100

100

33

40

O

33

O

7

60

O

38

8

- _.

- - - -

- - -

- -

~

- -

14

1

1

7

10

1

11

10

O

O

13

2

52

1

1

O

O

2

3

3

4

14

15

4

4

18

13

190

12

4

1

O

1

6

11

96

Negativas

53

j

I< ..

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: p. , .,._

I$

% De Muestras

P o s i t i v a s

ESQUEHA # 2

100 - 90 - 80 -

Chorizo Longaniza Salami Salchicha Jamón

De l a T a b l a # 5 . s e cons ide ró que l a s muestras r e p r e s e n t a t i -

v a s son a q u e l l a s que t i enen un a s t e r i s c o ( * I en l a p a r t e de-

r echa d e l r e n g l ó n , y s e r ep resentan en e l esquema #2. donde

s e o b s e r v a que e l producto que tuvo una mayor cant idad de - muestras con i n h i b i d o r p a r a l a cepa de B a c i l l u s stearothemo-

phitigs ATCC 12 ,980 , fue e l c h o r i z o . con 75% de muestras . y

que e l p roducto que tuvo menor p o r c e n t a j e fue e l jamón.

_________________--__

._ i

r . ..

Tambidn se observa en la Tabla # 5, que en promedio, el diá- metro-de inhibición mñs grande se vio en los salamis. con- - - 0.91 c.m.

- Una-consecuencia inmediata a la presencia de inhibidores, se -

refleja en la cuenta de microorganismos mesófilos aerobios

(C.M.A.) . la cual disminuye considerablemente. A s í . en las muestras con inhibición positiva. se observa que su C.M.A., generalmente fluctúa entre 100 - 80.000 colonias/g., lo que

es considerado como una escasa población contaminante. *1.

por otro lado, hay muestras con inhibiciun positiva. que tu-

vieron una mayor contaminación. alrededor de 620,000'65,000,000

colonias/g., aúnque aquí intervienen 2 factores de considera- ción:

e * b

1. Son muestras que proceden de tiendas de autoservicio,

donde están expuestas a un elevadSsimo grado de conta

minación *2 y.

2. Se trata de productos como longaniza, moronga e híga- do, que tienen un escaso procesamiento industrial 23.

Respecto a los análisis físico-químicos que en los Resultados se presentan, éstos fueron realizados en el Departamento de

Evaluación de Riesgos físico-químicos, y me los proprociona- ron para correlacionarlos con las muesras de inhibición posi- va.

55

Así. de las 94 muestras positivas, éstas se han agrupado en:

GRUPO I: Nuestras positivas que tienen colorantes.

GRUPO 11: Muestras positivas que tienen conservadores.

GRUPO 111: Muestras positivas que tienen colorantes y con- , servadores.

GRUPO I V : Muestras positivas que no tienen colorantes ni

conservadores. GRUPO V : Muestras positivas que no tienen resultados de

análisis físico-químico.

GRUPO I : '4:

Se encontraron 26 muestras con inhibición positiva, las cua-

les presentaron l o más tipos de colorantes en su respectivo análisis físico-químico.

= 27.65 % % = -26-1 100

94

amari- y r o j o s . r o j o 4 e encontrándo-

3' Entre los colorantes identificados están: amarillo

110 4 . amari 1 lo se en mezclas de 2, 3 6 4 diferentes colorantes.

amarillo 5'

GRUPO 11: *5:

Aquí se tienen 17 muestras positivas con conservadores.

18.08% 17 100 = 94

% = ----- +

.

3. ; I ' '1

I

, .

5s

GRUPO 111: O 6 :

Tenemos 3 muestras con halo de inhibición positiva. que pre-

sentaron colorantes y conservadores.

GRUPO I V : 7:

Se encuentran 43 muestras con inhibición positiva que no - tienen colorantes ni conservadores.

GRUPO v: *a:

Se agrupan 5 muestras positivas, sin tener análisis f í s i c o -

químicos.

= 5.31 x 5 100 ----- O % = 94

*6: (C-205. 0243, C-252).

1 .. ..

Total de muestras con inhibición positiva:

G. CONCLUSIONES:

Varios parámetros afectan la sensibilidad y exac - titud del método de difusión en placa, al deter-

minar inhibidores microbianos en productos cárni - c o s . utilizando esporas de Bacillus stearothermo

E----- hilus 0 ATCC 12.980 como microorganismo de prue - ba.

Dichos parámetros son; concentración de inoculo,

volumen de medio vaciado a la placa y volumen de

muestras.

Al ensayar con una solución de Penicilina G sódi - ca. como sustancia inhibidora. se validó o --- comp-robó que los parámetros Óptimos fueron los -

i

58

previamente estalecidos (10) y son los siguien--

tes:

5 Concentración de inoculo = 2 (10)

Volumen de medio en placas = 6 ml.

Volumen de muestra = 0.1 ml.

esporas hl.

Fue en la temperatura y tiempo de incubación, - donde se encontro'una fuerte variación. siendo

respectivamente. 53OC y 18 horas, aúnque este ÚA

timo puede s e r menor, si se considera que en el intervalo de 6 8 horas no se pudo seguir el - curso del crecimiento p o r razones de horario.

Respecto a la frecuencia de inhibidores microbia

nos en productos cárnicos se encontro'que los - embutidos como son chorizos y longanizas, presen - tan con mayor frecuencia inhibidor para el micro organismo de prueba, y que productos como el ja- món y queso de puerco, mostraron una menor tenden - cia a tal inhibición, así tambien. como la carne

fresca, en este caso. pollo y pescado crudo.

La naturaleza del inhibidor, puede ser variada y

muy compleja, sin embargo, se encontró que

mezclas de colorantes identificados en dichos - productos, actúan como inhibidores, no siendo

igual el caso de l o s nitratos.

Independientemente del tipo de inhibidor del que

se trate, una consecuencia inmediata se observa en la disminución de la cuenta de microorganis-- mos mesófilos aerobios. lo cual proporciona mayor estabilidad al producto.

59

RESüüEN :

La aceptación de un alimento depende de varios factores. - entre 1.03 cuales los principales son: el sabor, la textura,

el color, el costo, el valor nutritivo, la vida de anaquel y

l a apariencia en general.

En la industria se requiere la adición de inhibidores micro-

bianos como conservadores, para mantener o prolongar las ca-

racterísticas y propiedades de los alimentos. Los más impor- tantes son: ácido benzoico, sórbico, acético, propiónico.ios nitratos y nitritos. los sulfitos, el dióxido de azufre, los epóxidos y las soluciones yodóforas.

De los inhibidores antes mencionados, en los productos cárn? cos s e utilizan el ácido acético, benzoico, y los nitritos y

nitratos. Sin embargo, el descubrimiento de los an'cibióti-

cos hizó posible otro método de conservación. siendo de 100 a 1000 veces más eficacez que los conservadores químicos ad-

mitidos. Suelen utilizarse porque conservan las propiedades

organolépticas de los productos cárnicos, sin causar modifi--

caciones químicas o bioquímicas.

Esta pi-áctica es objetable, por diferentes razones:

1) Pueden ser tóxicos para el consumidor de los productos

cárnicos

2 ) Pueden favorecer el desarrolla de cepas resistentes

3) Como no esterilizan. sino que sólo retardan la altera-

ción. inhiben a los microorganismos responsables de di- cha alteraeión sin afectar a los patógenos; produciendo riesgos de infecciones alimentarias.

, ..,..

I ._. - j. r. 1 -.

I P

i - I

~

I -'

60

4 ) En caso de que el inhibidor sea un antibiótico, puede - sensibilizar al consumidor. produciendo reacciones alé:

gicns cuando haye necesidad de aplicarle antibióticos.

El objetivo del estudio, es validar un método sencillo y rá-

pido para la detección de inhibidores microbianos en los pro

ductos cárnicos, y posteliormente realizar una investigación

de su frecuencia.

La determinación de inhibidores se reaiiza por medio del m g todo de difusión en placa, utilizando esporas de ______-__-- Bacilus ste arothermophilus, ATCC 12,980 .

EL fundamento del metodo se basa en la inhibición del creci- miento del rnicrooiganisno de prueba, por la >resencia del in

hi5 i dor .

______________-

k l realizar el ensayo se encontro que los parámetros óptimos

heron los previamente establecidos (10) a excepción de la temperatura y tiempo do Lncubación que son 53OC y 18 horas,-

respectivamente. Cabe seíialar que éste último pueoe ser me-

nor, ya que el intervalo de 6-8 horas no se pudo seguir o b - servando el cur so del crecimiento por razones de horario.

Los parámetros óptimos, y que se tomaron para investigar l a

frecuencia de los inhibidores er. los productos cárnicos son

los siguientes:

11 2) Volumen de meüio en placa = 6 ml.

3) .Volumen de-muestra impregnada = 0 . 1 ml.

concentración de inoculo = 2 ( 1 0 ) ~ esporas /mi.

Respecto a la frecuencia de inhibidores. se encontró que en los embutidos como el chorizo y la longaniza, se presenta -

61

con mayor frecuencia inhibición para el microorganismo de - prueba. alrededor de 70 y 50% en cada caso, lo contrario su-

cede con el jamón y carne fresca, como pollo y pescado crudo donde se observa un bajo procentaje de inhibición, 18 y 0%

respectivamente.

En promedio, el diámetro de la zona de inhibición más grande 0.91 cm., se vió en los salamis, que son productos con previa

maduración. Como Consecuencia, a la presencia de inhibidores, se observa una gran disminución de las cuentas de microorganismos mesó-

filos a.erobios, de los productos con inhibición positiva, - respecto a aquellos que presentaron inhibición negativa.

La deteiminación d e inhibidores microbianos, es importante pues sirve para establecer l o s riesgos a 1.a salud, y l a s me- didas de control que resulten de un análisis positivo, de di

chos inhibidores microbianos. -

j --.

F)

1.

2.

3.

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