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COPIA NO CONTROLADA

INSTRUCTIVO DE ENSAYO PARA DBO5

I-LFQ-42 Revisión: 05

Fecha: 18-08-2015 Página 1 de 9

TODA COPIA EN PAPEL DE ESTE DOCUMENTO ES UNA COPIA NO CONTROLADA A EXCEPCIÓN DEL ORIGINAL, A MENOS QUE HAYA SIDO

SELLADO COMO COPIA CONTROLADA

1. OBJETIVO:

Conocer las instrucciones para realizar el método de ensayo de Demanda Bioquímica de Oxígeno en muestras de agua para consumo humano, residual, natural y salina.

2. CAMPO DE APLICACIÓN: Este método de ensayo es aplicable para la medición de concentraciones 2 – 4 000 mg/L de la Demanda Bioquímica del Oxígeno en agua.

3. FUNDAMENTO DEL MÉTODO: Este método consiste en llenar con muestra hasta rebosar en un winkler de tamaño especificado e incubarlo a la temperatura estable durante 5 días. El oxígeno disuelto se mide antes y después de la incubación, y el DBO se calcula mediante la diferencia entre el OD inicial y el final.

4. INTERFERENCIAS:

4.1. Verificación del pH: Si la muestra no está entre 6.0 y 8.0 ajustar a temperatura de 20±3 C luego ajustar pH de 7.0 a 7.2 usando solución de ácido sulfúrico 1N o hidróxido de sodio 1N. La cantidad de reactivo añadido no debe diluir la muestra por más que el 0.5 ٪.

4.2. Muestras que contienen compuestos de cloro residual: Si es posible evítense todas las muestras

que contienen cloro residual. Se eliminara el cloro residual con exposición a la luz en un lapso de 1 a 2 horas, para las muestras en que el cloro no se disipa en una tiempo corto destruir el cloro residual añadiendo solución de Na2SO3. Determinar el volumen requerido de solución de Na2SO3 en una

fracción de 100 a 1000 ml de muestra neutralizada añadiendo 10 ml 1 +1 ácido acético o 1+50

ácido sulfúrico, 10 ml de solución de yoduro de potasio (10 g/100 ml) y titulando con Na2SO3

hasta el punto final del almidón-yodo para el residuo. Añádase a la muestra neutralizada el

volumen proporcional de solución de Na2SO3 determinado por la prueba anterior, mezclar y

después de 10 a 20 minutos verificar el cloro residual de la muestra. (Nota: el exceso de

Na2SO3 ejerce un requerimiento de oxígeno y reacciona lentamente con ciertos compuestos

de cloraminas orgánicas que pueden estar presentes en las muestras cloradas).

4.3. Muestras sobresaturadas con OD (Oxígeno disuelto): en aguas frías o en aguas donde se produce la fotosíntesis es posible encontrar muestras encima de la saturación a 20 ˚C Para evitar la pérdida de OD durante la incubación de tales muestras reducir el OD hasta la saturación llevando la

muestra a 20 ± 3 °C en botellas parcialmente llenas mientras se agita vigorosamente.

Redactado por: Revisado por: Aprobado por:

DEMANDA BIOQUÍMICA DEL OXÍGENO

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4.4. Muestras que contienen peróxido de hidrógeno: peróxido de hidrógeno restante en muestras de

algunos procesos industriales de blanqueamiento tales como los utilizados en fábricas de

papel y plantas textiles pueden causar niveles de oxígeno sobresaturados en muestras

recogidas para la prueba de DBO. Mezclar la muestra vigorosamente en recipientes abiertos durante un tiempo suficiente para

permitir que el peróxido de hidrógeno se disipe antes de la prueba del DBO. Compruebe la

eliminación del peróxido mediante la observación de concentraciones de oxígeno disuelto

en el tiempo durante el mezclado.

5. EQUIPOS Y MATERIALES: 5.1. Winklers. 5.2. Minicompresora. 5.3. pH metro. 5.4. Pipetas volumétricas: 1, 2, 5, 10, 15, 25, 50, 100 ml. 5.5. Pipetas graduadas 5, 10 ml. 5.6. Vasos 50, 100, 250 y 600 ml. 5.7. Bagueta 5.8. Matraz 250 ml, 300 ml. 5.9. Bureta 25 ml 5.10. Agitador magnético. 5.11. Probeta 250 ml. 5.12. Oxigenador pequeño.

5.13. Manguera delgada de 30 cm aproximadamente.

5.14. Difusor de oxígeno pequeño.

6. REACTIVOS

6.1. Solución de sulfato manganoso: Disolver 480 g MnSO4.4H2O, 400 g MnSO4.2H2O o 364 g MnSO4.H2O en agua desionizada. Filtrar si es necesario o ayudarse con el agitador magnético y diluir a 1L.

6.2. Reactivo de álcali ioduro azida: Disolver 500 g de NaOH (o 700 g KOH) y 135 g NaI (o 150 g KI) en agua desionizada y dilúyase a 1 L. Añádase 10 g NaN3 disueltos en 40 mL de agua desionizada.

6.3. Ácido sulfúrico H2SO4 conc. 6.4. Almidón: disolver 2 g de almidón soluble, calidad de laboratorio en 100 mL de agua desionizada

caliente, agregar 0,2 g de ácido salicílico para preservarlo, Refrigerar. 6.5. Titulante de tiosulfato sódico: disolver 6,205 g de Na2S2O3.5 H2O en agua desionizada. Añadir 0,4

g de NaOH sólido y diluir a 1L. Estandarizar con solución de biyodato, para estandarizar seguir los pasos que se describen en el formato F-LFQ-56 “ESTANDARIZACIÓN DEL TIOSULFATO DE SODIO (Na2S2O3.)”.

6.6. Solución tampón fosfato: disolver 8,5 g de KH2PO4, 21,75 g de K2HPO4, 33,4 g de Na2HPO4. 7H2O y 1,7 g de NH4Cl en unos 500 mL de agua desionizada y diluir a 1 L, el pH en eta solución debe ser de 7,2, sin ajustes adicionales.

Nota: Los pesos deben ser exactamente como se indican para obtener el pH deseado.

6.7. Solución de sulfato de magnesio: Disolver 55,5 g de MgSO4.7H2O en agua desionizada y diluir a

1L. 6.8. Solución de cloruro de calcio: Disolver 27,5 g de CaCl2 en agua desionizada y diluir a 1L. 6.9. Solución de cloruro férrico: Disolver 0,25 g de FeCl3.6H2O en agua desionizada y diluir a 1L. 6.10. Solución ácida y básica, 1N, para neutrailzar muestras residuales básicas o ácidas

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a) Solución ácida H2SO4 1N: A un volumen de agua, añádase lentamente y con agitación suave, 28 mL de ácido sulfúrico conc. Y diluir a 1 L con agua desionizada. . La dilución debe hacerse dentro de un baño de agua fría, ya que la reacción es exotérmica. b) Solución básica de NaOH 1N: Disolver 40 g de hidróxido de sodio en agua desionizada y disolver a 1 L. La disolución debe hacerse dentro de un baño de agua fría, ya que la reacción es exotérmica.

6.11. Solución de sulfito de sodio: disolver 1,575 g Na2SO3 en 1000 ml de agua desionizada. Esta

solución no es estable; preparar diariamente.

6.12. Fuente de agua para preparar el agua de dilución:utilizar agua desionizada para realizar las

diluciones de las muestras.

6.13. Suspensión de inóculo comercial: mezcla de bacterias diseñado como una semilla de inóculo

para la prueba de demanda bioquímica de oxígeno.

6.14. Kit de determinación de cloro: permitirá determinar la presencia de cloro en una determinada

muestra.

7. DESARROLLO: 7.1. Limpieza del material: todo el material utiliado en el análisis debe ser lavado como indica el instructivo:

I-LFQ-12. 7.2. Recepción de las muestras:

7.2.1. En la oficina de recepción y toma de muestras ingresan según el procedimiento P-RTM-02 “Procedimiento para manipulación de muestras de ensayo”.

7.2.2. Las muestras se trasladan de la Oficina de Recepción y Toma de Muestras al Laboratorio de Físico-Química según el procedimiento P-RTM-02 “Procedimiento para manipulación de las muestras de ensayo”.

7.2.3. Todas las muestras deben ingresar con el formato F-RTM-05 “Orden de ensayo”. 7.2.4. todos los ingresos y salidas de las órdenes de ensayo se registran en el formato F-GGTC-22

“Control de entrega de reporte de resultados”. 7.2.5. Para todas las muestras de ensayo debe cumplirse las especificaciones de la tabla:

Tabla Nº 01 Recepción y almacenamiento de muestras 7.3. Preparación de patrones y blancos:

7.3.1. Preparación del agua de dilución: Transferir el volumen de agua desionizada deseada a un

recipiente de tamaño adecuado comprobar que la concentración de oxígeno disuelto es

de al menos 7,5 mg/L, antes de usar el agua para las pruebas de DBO, saturar con OD aireando por más de una hora con la mini compresora, cuya manguera debe estar libre de materia orgánica. Añadir 1 ml de cada uno de tampón fosfato, MgSO4, CaCl2 y la solución

de FeCl3 / L de agua de la fuente preparada.

Mezclar bien y llevar a temperatura de 20 °C ± 3 °C. Preparar el agua de dilución

inmediatamente antes de su uso.

7.3.2. Preparación de la glucosa y el ácido glutámico: séquese glucosa de calidad para reactivo y ácido glutámico de calidad para reactivo a 103 º C durante 1 hora. Añádase 0,15 g de glucosa y 0,15g de ácido glutámico a agua desionizada, disolver y diluir a 1L. Preparar siempre inmediatamente antes de usarla.

Condiciones de recepción de muestras

Frasco completamente lleno sin burbujas y conservado a una temperatura ≤ 6ºC.

Preservantes Ninguno

Min. cantidad de muestra 1L

Pre-tratamiento de la muestra Ninguno

Máximo tiempo para analizar 48 horas

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7.4. Tratamiento de la muestra: 7.4.1. Ajustar la temperatura de la muestra: llevar las muestras a 20 °C ± 3 °C antes de realizar

las diluciones.

7.5. Uso de inóculo: Algunas muestras (por ejemplo, algunos residuos industriales no tratados,

residuales desinfectados, residuales de alta temperatura, residuales que tienen valores de

pH inferior a 6 o superior a 8 y muestras cloradas) no contienen una población microbiana

suficiente. Sembrar tales muestras mediante la adición de una población de

microorganismos apropiados. Para ello se empleará la suspensión de inóculo comercial.

7.6. Preparación de la muestra: 7.6.1. preparación de las diluciones: usando el agua de dilución preparada realizar como

mínimo tres diluciones de muestra preparada estimada para producir una concentración de

OD residual de al menos 1,0 mg/L y un consumo de OD de al menos 2 mg/L después de los

5 días de incubación. Son recomendadas cinco diluciones si la experiencia con una muestra

particular no produce al menos en tres botellas que contengan un mínimo aceptable y una

depleción mínima de OD. Se pueden realizar diluciones primaras de 5/100, 10/100, 20/100,

50/100 para aguas residuales duras, sólidas y crudas así como para efluentes tratados

biológicamente antes de realizar la dilución final en las botellas o se puede sembrar

directamente en las botellas volúmenes pequeños para este tipo de aguas. Para agua de

ríos contaminados emplear porcentajes de 25% hasta 100% .

Preparar las diluciones en recipientes volumétricos (Clase A de vidrio o equivalente) y

transferirlos a las botellas de DBO.. Para ello, usando una pipeta volumétrica de punta

ancha, añadir el volumen de muestra deseado para las botellas individuales de DBO.

Llenar cada botella aproximadamente dos tercios de su capacidad con agua de dilución

DBO. Añadir cantidades apropiadas de inóculo en las botellas individuales de DBO.

Cuando una botella contiene más del 67% de la muestra después de la dilución, los

nutrientes pueden ser limitados en la muestra diluida y posteriormente reducir la actividad

biológica. En tales muestras añadir las soluciones o nutrientes, minerales y de

amortiguamiento directamente a la muestra diluida a una razón de 1ml / L (0,3 ml / botella

300 ml). Para diluciones mayores que 1:100 hacer una dilución primaria antes de realizar la

dilución final en la botella.

7.6.2. Adición del inóculo: de usarse la siembra añadir el volumen de inóculo a las botellas de

DBO individuales antes de la dilución final.

Preparar la solución de inóculo de la siguiente manera:

- Colocar todo el contenido de una cápsula (desechar la cápsula de gelatina)en 500 ml de agua

de dilución.esta agua de dilución se denominará como la “suspensión de inóculo”. Nota: el

salvado actúa como un portador para los microorganismos, ni se disolverá ni inhibirá la

actividad microbiana; debe ser colocada fuera de la solución antes de su uso.

- Airear y agitar la solución durante 1 hora, luego dejar que la solución sedimente por 5 a 15

minutos.

- Decantar el sobrenadante con cuidado dejando fuera de la solución biológica el salvado.

- Verter la solución decantada en un vaso limpio de 500 ml y agitar suavemente durante el resto

de la prueba.

- La solución debe utilizarse dentro de las 6 horas de la rehidratación de la cápsula.

- Elegir de 3 a 4 alicuotas de inóculo para sembrar.

- Luego sacar cuidadosamente una alícuota de la solución; las alícuotas pueden ser de 15, 20 y

25 ml, El OD consumido por la adición de inóculo medido en cada botella generalmente debería

estar entre 0.6 y 1.0 mg/L pero la cantidad añadida de inóculo debe ser ajustada desde este

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rango a aquel requerido para proporcionar la verificación de resultados de glucosa-ácido

glutámico 198 ± 30,5mg/L

7.6.3. Sellado de botellas: llenar completamente cada botella mediante la adición de suficiente

agua de dilución de tal manera que la inserción de la tapa no deje burbujas en la botella,

luego cubrir con para film, las botellas que van a incubarse durante 5 días, por

precaución en contra del aire que pudiera ingresar dentro de la botella durante su

incubación.

7.6.3. Proceso de titulación OD inicial: Modificación azida del método iodométrico 7.6.3.1. A la muestra recogida en el winkler de 300 ml agregar 1 ml de MnSo4 seguidamente 1

ml de reactivo de álcali ioduro azida de. Si las pipetas se mojan con la muestra lávese antes de volver al frasco de reactivos.

7.6.3.2. Tapar con cuidado para excluir las burbujas de aire y mezclar invirtiendo varias veces. 7.6.3.3. Esperar hasta que el precipitado se deposite hasta la mitad o menos de la mitad del

tamaño del winkler. En el caso de agua marina es posible que el precipitado sobrepase la mitad del tamaño del winkler.

7.6.3.4. Agregar 1 ml de H2SO4 cc, tapar y mezclar invirtiendo varias veces hasta disolución completa.

7.6.3.5. Titular 201 ml de muestra (volumen correspondiente a 200 ml de muestra original tras corregir la perdida por deslazamiento con los reactivos).

La corrección se realiza de la siguiente manera: Para un total de 2 ml (1 ml por cada reactivo álcali ioduro azida, y MnSO4) en un winkler de 300 ml:

200×300÷ (300-2)=201 ml 7.6.3.6. Titular con solución 0,025 M de Na2S2O3.5 H2O hasta un color paja pálido, añadir unas

gotas de almidón y continuar valorando hasta la primera desaparición del color azul. 7.6.4. Proceso de incubación de la muestra:

7.6.4.1. Incubar a 20˚C ± 1˚C los winklers taponados y (X) cubiertos con parafilm que contienen las diluciones deseadas, los controles y los blancos de agua de dilución. Excluir la luz para evitar el crecimiento de algas en las botellas durante la

incubación. 7.6.5. Determinación del OD final:

7.6.5.1. Luego de 5 días ± 6h de incubación determinar el OD en las diluciones de las muestras blancos y controles. Usando la modificación Azida del método titulométrico (ver 7.6.3.).

8. CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS:

8.1. Para cada botella que tenga como mínimo una depleción de 2,0 mg/L y un mínimo de OD

residual de 1,0 mg/L, calcular el DBO como sigue:

��,��

�,=

{�� − �� − �� }

��x��

��,��/�, =�� ×� × ! �

��

Donde:

OD: Oxígeno disuelto

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G : Vol. gastado de Na2S2O3 (ml) MT: Molaridad corregida del Na2S2O3

VM: Volumen total de muestra usada para titular = 201 ml Vm: Alícuota de la muestra (ml) OD0: Oxígeno disuelto inicial, mg/L OD5: Oxígeno disuelto al quinto día, mg/L DBO5: Demanda Bioquímica de Oxigeno al quinto día Fd: Factor de dilución. (De la dilución primaria)

S: Oxígeno consumido del inóculo por ml suspensión del inóculo agregada a cada

botella. (S=0 si las muestras no son inoculadas).

Vs= volumen de inóculo en la botella respectiva de prueba, ml.

Si la reducción de OD es menor de 2,0 mg/L y la concentración de la muestra es 100 % (no hay dilución

excepto para el inóculo, nutriente mineral y soluciones tampón) el inóculo corregido actual en la

reducción de OD puede ser reportado como el DBO incluso si éste es menor que 2,0 mg/L.

Cuando todas las diluciones resultan en un residual de OD < 1,0, seleccione la botella que tiene la más

baja concentración de OD (dilución más grande) y reporte:

��,��

�,>

{�� − �� − �� }

��x��

En todos los cálculos anteriores no hacer correcciones sobre la absorción de oxígeno disuelto por el

blanco de agua de dilución durante la incubación, esta corrección es innecesaria si la dilución con

agua cumple los criterios estipulados para el blanco de agua de dilución.

Si el agua de dilución no cumple con los criterios, las correcciones adecuadas son difíciles; no

registrar los resultados o como mínimo registrar que no cumplieron con los criterios de control de

calidad.

Promedie los resultados para todas las botellas de prueba en cada serie de dilución.

Las muestras que presentan grandes diferencias entre la DBO calculada para las diferentes diluciones,

por ejemplo, mayor que el 30% pueden indicar la presencia de una sustancia tóxica o problemas

analíticos. Cuando el efecto se vuelve repetitivo, investigar para identificar la causa.

8.2. Los resultados se reportarán en el formato F-LFQ-09 “RESULTADOS DE ENSAYO DE DBO5”. El formato F-LFQ-123 “CÁLCULO DE LA PENDIENTE PARA EL INÓCULO EN LA PRUEBA DE DBO5”, se deberá imprimir y adjuntar al reporte de resultados de la prueba de DBO5.

9. CONTROL DE CALIDAD

9.1. Se utilizaran los criterios establecidos en el P-GGTC-08 “PROCEDIMIENTO PARA

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD” y en el F-GGTC-73 “PROGRAMA PARA EL

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS”.

9.2. Estandarización: 9.2.1. Se realiza la estandarización de la sal de tiosulfato de sodio Na2S2O3.5 H2O que se emplea en el control de calidad. 9.2.2. Se procede a realizar la estandarización según el formato F-LFQ-56 “ESTANDARIZACIÓN DEL TIOSULFATO DE SODIO (Na2S2O3.5)”. 9.2.3. Se calcula la concentración corregida de la solución su frecuencia es trimestral o cada vez que se prepara el titulante.

9.3. Blanco del método: 9.3.1. Es la verificación del agua de dilución. 9.3.2. Se llena el winkler (300 ml) solamente con el agua de dilución

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9.3.3. Calcular el OD inicial siguiendo los pasos a partir del punto (7.6.3.1.) 9.3.4. Su frecuencia es cada vez que se realiza el ensayo y debe cumplirse que el consumo después de los 5 días de OD ≤ 0,2 mg/L, de lo contrario descartar todos los datos para la prueba que utilizan esta agua de dilución.

9.4. Blanco Fortificado: 9.4.1. Se realizara un blanco fortificado por cada 15 muestras. 9.4.2. Se prepara 1L de solución patrón ( ver 6.3.2) que equivale 198 ± 30,5 mg/L 9.4.3. Se Procede a tomar una alícuota de 6 mL y llevada a un winkler (300 mL), se

analiza como una muestra, seguir los pasos a partir del punto 6.5.1.3 9.4.4. Los criterios de aceptación se describen en el registro F-GGTC-73 “PROGRAMA

PARA EL ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS”. 9.4.5. De emplearse el inóculo ser realizará la verificación de la glucosa-ácido

glutámico con su respectivo duplicado; sembrándose con el volumen

determinado de inóculo cuyo resultado debe ser 198 ± 30,5mg/L

9.5. Duplicado:

9.5.1. Se realizará un duplicado de muestra por cada lote de muestra, cada lote está

conformado por 15 muestras.

9.5.2. Los criterios de aceptación se describen en el registro F-GGTC-73 “PROGRAMA PARA EL ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS”.

9.6. Oxígeno disuelto residual y depleción de Oxígeno disuelto: OD residual debe ser al menos 1 mg/L luego de 5 días y la Depleción (diferencia) OD mínima de 2 mg/L, esto se considera para

producir datos válidos, porque al menos 2,0 mg de Oxígeno/L de captación se requiere para

dar una medida significativa de la absorción de oxígeno y por lo menos 1,0 mg/L debe

permanecer durante todo el ensayo para garantizar que el oxígeno disuelto insuficiente no

afecta la tasa de oxidación de los componentes de desecho. Las excepciones se dan para

propósitos de información solamente cuando los agotamientos para pruebas usando

muestras no diluidas en todas las botellas caen por debajo de 2,0 mg/L y cuando el oxígeno

disuelto residual en todas las diluciones es menor que 1,0 mg/L. 9.7. Control de inóculo: determinar el DBO de incóculo como para cualquier otra muestra. Esto

es el control de inóculo, idealmente hacer tres diluciones de inóculo tal que la cantidad más

pequeña de al menos una reducción de 2,0 mg/L de OD y la cantidad más grande resulte

en al menos 1,0 mg/L de OD residual después de 5 días de incubación. Determinar el OD/ml

de inóculo añadido para cada botella usando el método de la pendiente trazar la reducción

de OD mg/L VS ml de inóculo para todas las botellas de control del inóculo teniendo una

reducción de 2,0 mg/L y un residual mínimo de 1,0 mg/L de OD.

El trazo debería presentar una línea recta para la cual la pendiente indica una depleción de

OD/ml de inóculo.

10. DOCUMENTO DE REFERENCIA • APHA-AWWA-WEF 5210 B 22 ND. Edition 2012 - . 5-Day BOD test

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Anexo N° 01: Diagrama de Flujo del Método de Ensayo

DEMANDA BIOQUIMICA DE OXIGENOAPHA -AWWA-WEF 5210 B. 22ND Edition. 2012.

BIOCHEMICAL OXYGEN DEMAND (BOD): 5-DAY BOD TEST

muestra

1º Preparacion del agua de

dilucion

2º Preparacion

de la muestra

3º Preparacion

de diluciones

4º Titulacion

de la muestra

Agregar tanto mL de nutrientes por

cada Litro de agua desionizada.

Ajustar la temperatura de la muestra por 1h a 20ºC ± 3ºC

Si el pH no está entre 6-8 ajustar el pH: 7,0-7,2 con

H2SO4 o NaOH

+ 1 mL MnSO4

+ 1 mL reactivo de

álcali ioduro azida

Mezclar invirtiendo varias veces

+ H2SO4 conc.

Tapar y mezclar hasta disolución

completa

Adicionar 201 mL de muestra a un

matraz Erlenmeyer

1-2 gotas de indicador almidón

Tampón fosfato

Sulfato de magnesio

Cloruro férrico

Cloruro de calcio

Airear por Más de 1h a 20ºC ±

3ºC

Tomar una alícuota Directamente De la

muestra o de la dilución, ésta va a

depender de la matriz.

Si la muestra es efluente se

utiliza una alícuota de :

2-25 mL

Para otras matrices utilizar alícuotas entre:

50 -200 mL

Agregar al winkler y enrasarlo con el agua de dilución, hasta el tope y sin burbujas.

Titular con

Na2S2O3.5 H2O 0,025M

Se obtiene OD inicial

Después de 5 días volver aplicar el

proceso de titulacion y obtener OD final

Adicionar nutrientes

Si la muestra está sobrecargada de materia orgánica, hacer una

dilución previa, recomendable factor de 10

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Anexo N° 02: Diagramas de Flujo del Patrón

PATRÓN DE LA DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXÍGENO APHA-AWWA-WEF 5210 B. 22ND Edition. 2012.

BIOCHEMICAL OXYGEN DEMAND (BOD): 5-DAY BOD TEST

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