GENÉTICA MOLECULAR

Mgtr. Bettina L. Brusés

AÑO 2012

¿QUE ES LA PCR?

COMPONENTES DE LA PCR

REQUERIMIENTOS DE LA PCR

ADN, Templado, Molde o Target

Cantidad y calidad de la muestra de ADN no

necesita ser alta.

Una sola célula o un lisado celular con una

longitud promedio de unos pocos cientos de pares

de bases son adecuados para una amplificación

exitosa.

Criterio La muestra contenga al menos una

cadena

de ADN intacta que abarque la

región que

se va a amplificar.

Las impurezas estén lo

suficientemente

diluidas como para no inhibir la

reacción

Tipo de Muestra

Fresca

Archivo

Antigua

Componentes de la PCR

Primers, Cebadores o Iniciadores

§ Fragmentos complementarios que se van a unir a una de las dos cadenas separadas del templado de ADN.

Tamaño: 20- 25 nucleótidos de longitud. Generalmente es entre 18- 30 nt.Temperatura de Fusión: 50- 65º C.Contenido GC: 40- 60%.

Auto- complementariedad

Debe ser evitada para minimizar la formación de estructuras secundarias y los dímeros de primers

Similaridad: Debe tener el 100% de apareamiento con el molde

DNA Polimerasa

Concentración Recomendada: entre 1 y 2.5

unidades por 100 ul de reacción.

Si la concentración de la enzima es muy alta, se

acumulan productos no específicos, y si es muy baja se

formará una cantidad insuficiente del producto deseado

1983: Se usó ADN polimerasa de la bacteria E.

coli.

Se desactiva a elevadas temperaturas

necesarias

para desnaturalizar la doble cadena de

ADN.

1988: Reemplazo por ADN polimerasa de bacteria

“termófila” Thermus aquaticus (Taq). Actúa entre 75- 80º

C.

Concentración de Magnesio

Afecta

Alineamiento de los primers

Temperatura de disociación de las cadenas de

ADN

Especificidad del producto

Formación de dímeros de primers

Actividad y fidelidad de la enzima

Desoxinucleótidos trifosfatos, dNTP´s

dATP, dCTP, dGTP, dTTP.

Deben ser usados en concentraciones

equivalentes para minimizar errores de

incorporación de bases.

Buffers y Sales (KCl)

Buffer recomendado para PCR: Tris- HCl

(pH 8.3- 8.8).

KCl: arriba de 50 mM inhibe la actividad de la

enzima Taq polimerasa.

TERMOCICLADOR DE ADN

AMPLIFICACIÓN EXPONENCIAL DE LA PCR

PCR

Diagnóstico de Enfermedades Hereditarias y

Cáncer Diagnóstico de Infecciones

Aislamiento de Genes

Investigación Forense

Aplicaciones de la PCR

Estudios de Evolución

Estudios de Identidad y Filiación

Ventajas de la PCR

Alta especificidad

Alta sensibilidad

Rapidez en la obtención de los resultados

Amplio rango de muestras biológicas

Se puede estimar la carga parasitaria

(cuantitativo)

La caracterización molecular del amplicón

permite generar información genotípica útil: -

Estudios Clínicos (respuesta a tratamientos,

resistencia a drogas).

-

Epidemiología molecular

Limitaciones de la PCR

Contaminación por arrastre de

amplicón – falsos positivos.

Inhibidores de la muestra-

falsos negativos.

Controles de PCR

Control Positivo de Extracción Muestra que contiene el ADN blanco preparado con los mismos reactivos de extracción y amplificación que muestras problema Control Negativo de Extracción Muestra negativa preparada con los mismos reactivos de extracción y amplificación que muestras problema Control Positivo de PCR Cocktail de reactivos con dilución de ADN en el límite de corte y/o límite de detección del método ( control fuerte y control débil ) Control Negativo de PCR Cocktail de reactivos sin DNA.

SIEMBRA Y CORRIDA ELECTROFORÉTICA EN CUBA HORIZONTAL

VISUALIZACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR

Siembra del gel

Electroforesis en geles de agarosa

Bromuro de Etidio

VARIANTES DE LA PCR

Se somete el ADN purificado a la amplificación por PCR de

la manera anteriormente descripta en presencia del par de

primers dirigidos contra el kinetoplasto.

Con los productos de amplificación de la primer PCR, se

realiza una segunda reacción de PCR en condiciones de baja

astringencia: elevadas concentraciones de enzima (Taq ADN

polimerasa), baja temperatura de annealing, y solamente un

único primer.

LOW STRINGENCY SINGLE SPECIFIC PRIMER PCR (LSSP-

PCR)

LOW STRINGENCY SINGLE SPECIFIC PRIMER

PCRBajo estas condiciones, el oligonucleótido se hibridiza

con elevada especificidad a su extremo complementario

y con baja especificidad a múltiples sitios dentro del

fragmento generando un patrón electroforético

altamente específico para cada clon del parásito

(Andrade et al., 1999).

Se hace una corrida electroforética en gel de

poliacrilamida al 6% en buffer TBE utilizando la cuba

vertical, y posteriormente se tiñe el mismo con NO3Ag.

100bp

200bp

300bp

MPM C-C+

MPM C-C+

LSSP - PCR

elevada cc de taq, 1 solo primer y baja Tº de annealing

LSSP-PCR

11 12 13 14 Mn IG C- 14 MPM

RT- PCR

RNA Una sola hebra Sensible al calor

Transcripción Reversa antes de la PCR

a partir de una copia de la hebra de RNA

cDNA (DNA complementario) estable al calor resistir PCR

PASOS DE LA RT- PCR

1)Unión del primer a la secuencia de ARN

objetivo.

2)La polimerasa cataliza la extensión del

primer mediante la incorporación de

nucleótidos complementarios.

3)Fin de la transcripción reversa, se obtiene

la hebra de cADN complementario al ARN.

4)PCR

RT- PCR

NESTED PCR

Dos procesos de amplificación sucesivos.

En la segunda PCR se utilizan unos primers contenidos

en la secuencia amplificada en la primera reacción.

El producto de amplificación de la primera PCR es el

molde de la segunda.

Se aplica cuando se quiere mejorar la sensibilidad y

especificidad de la técnica, especialmente en el caso de

muestras de baja calidad o con un pequeño número de

copias de la secuencia a amplificar.

A veces 1 ronda de PCR no da un producto único a

partir de un templado complejo, apareciendo un

barrido.

Se puede resolver utilizando un segundo par de

primers que hibriden un poco más internamente que

los primeros.

Se obtiene un producto único porque solo el

fragmento correcto de ADN posee los sitios correctos

de hibridización para el segundo par de primers.

Nested pcr

Ventaja

Brindar alta sensibilidad y especificidad.

La especificidad aumenta porque como es

amplificación de un amplicón obtenido previamente,

los cebadores sólo van a hibridar en un sitio dentro

de la molécula y el resultado será una única banda.

Se evitan posibles hibridaciones inespecíficas de

los cebadores.

Desventaja

No permite cuantificar la muestra.

Nested pcr

NESTED PCR

NESTED PCR

PCR MULTIPLEX

Es una PCR en la cual hay múltiples pares de primers

(hasta 8) lo que da una serie de productos. Se

amplifica simultáneamente más de una secuencia.

Se combinan dos o más pares de primers en un

mismo tubo, junto con el resto de los reactivos, para

amplificar simultáneamente varios segmentos de ADN.

Éstos pueden verse como múltiples bandas en un gel

de agarosa.

Se usa frecuentemente en diagnóstico médico.

Ahorra templado, reactivos, tiempo y gastos.

Requiere una cuidadosa optimización

PCR MULTIPLEX

PCR TIEMPO REAL

La PCR en tiempo real da resultados cuantitativos.

Una ventaja adicional de la PCR en tiempo real es la

relativa facilidad y conveniencia de su uso comparadas a

algunos métodos más viejos.

Los productos de amplificación se observan a medida

que transcurren los ciclos de la PCR.

PCR TIEMPO REAL

Está basado en:

• La detección y cuantificación de un reportero

fluorescente, cuya señal aumenta en proporción

directa a la cantidad de producto de PCR en la

reacción.

• El empleo de un termociclador que tiene acoplado un

sistema de detección que es capaz de adquirir y

cuantificar la señal emitida por el reportero al final de

cada ciclo para cada muestra.

Técnicas basadas en fluorocromos: el ADN, que

ve multiplicada su cantidad con cada ciclo, se une al

fluorocromo (generalmente SYBER Green)

produciendo fluorescencia que es medida por el

termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite

cuantificar sólo una secuencia por reacción. Es mucho

más económica que la que usa sondas específicas.

APLICACIONES DE LA PCR EN TIEMPO REAL

Monitoreo post transplante.

Genotopificación:

- Trisomías

- Microdeleciones

- Haplotipos

- Análisis cuantitativo de micosatélite

- Diagnóstico prenatal de células fetales en sangre

materna

VENTAJAS DE LA Real-time PCR

* No está influenciada por amplificaciones no específicas

* La amplificación es monitoreada en tiempo real

* No se realiza ningún proceso post PCR de los productos ( disminuye los riesgos de contaminación)

* Rápida (30 minutos a 2 hours)

* requirement of 1000-fold less RNA than conventional assays(3 picogram = one genome equivalent)

* detection is capable down to a 2-fold change

* confirmation of specific amplification by melting point analysis

* Más específica, sensible y reproducible

* No es mucho más costosa que la PCR convencional(excepto por los costos del equipamiento)

REAL TIME PCR

Nigel Walker, NIEHS (www)

(www)

BioRad iCycler(www)

Corbett Research Rotor-Gene 3000(www)

MUCHAS GRACIAS!!