cultivo de bacillus en bioreactor.pdf
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
Centro de Desarrollo de Productos Bióticos
Departamento de Biotecnología
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Cultivo de Bacillus subtilis cepa 105 en biorreactor y su actividad antagonista contra
Sclerotinia sclerotiorum
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T E S I S
Que para obtener el grado de:
Maestría en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos
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Florencio Ramos Gómez
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Directores de Tesis:
Dra. Melina López Meyer
Dr. Mario Rodríguez Monroy
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El presente trabajo se llevó a cabo en el Departamento de Biotecnología del
Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo
la dirección de la Dra. Melina López Meyer y el Dr. Mario Rodríguez Monroy. Para
la realización de los estudios se contó con el apoyo económico de la beca
CONACyT (415303), beca del Programa Institucional de Formación de
Investigadores (20110311, 20120914 y 20131007). La realización del proyecto
conto con el financiamiento económico del proyecto de la Secretaria de
Investigación y Posgrado del IPN, SIP 20120914 y SIP20131007 del Proyecto en
Red de Biotecnología del IPN "Obtención de bacterias benéficas para el cultivo del
frijol".�
AGRADECIMIENTOS
A mis directoras la Dra. Melina López Meyer y al Dr. Mario Rodríguez Monroy
por los consejos, orientación, sugerencias y asesoría en el trabajo. A los demás
integrantes de la comisión revisora, la Dra. Gabriela Sepúlveda Jiménez, la
Dra. Kalina Bermúdez Torres, el Dr. Luis Arturo Bello Pérez y la Dra. Perla
Osorio Díaz por los comentarios, observaciones, consejos y correcciones con
la finalidad de mejorar y reforzar este trabajo de tesis.
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ÍNDICE
Página
Índice I
Índice de cuadros II
Índice de figuras III
Abreviaturas V
Resumen VI
Abstract VII
1. INTRODUCCIÓN 1
2. REVISION DE LITERATURA 3
2.1 Sclerotinia sclerotiorum 3
2.2 Ciclo de la enfermedad del moho blanco 5
2.3 Tratamientos de control del moho blanco 6
2.3.1 Bacillus subtilis como alternativa de control biológico 6
2.4 Formación de esporas de B. subtilis 8
2.5 El efecto del oxígeno en el desarrollo de B. subtilis 9
2.6 Cultivo de B. subtilis en biorreactor 10
2.7 Usos de medios de cultivo de origen industrial para el cultivo de microorganismos
12
2.8 Bacillus subtilis cepa 105 13
3. JUSTIFICACIÓN 15
4. OBJETIVOS 16
4.1 Objetivo general 16
4.2 Objetivos específicos 16
5. METODOLOGÍA 17
5.1 Microorganismos 17
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5.2 Medios de cultivo 17
5.3 Mantenimiento de las cepas 18
5.4 Determinación del crecimiento y esporulación de l a bacteria 18
5.5 Crecimiento en matraz de B. subtilis 105 en el medio soya y LB
19
5.6 Crecimiento en biorreactor de B. subtilis 105 20
5.7 Ensayos de antagonismo 21
5.8 Análisis estadístico 22
6. RESULTADO Y DISCUSIÓN 23
6.1 Crecimiento y esporulación de B. subtilis cepa 105 a nivel de matraz
23
6.2 Crecimiento de B. subtilis cepa 105 bajo una TOD mayor y menor al 20%
26
6.3 Evaluación del efecto antagonista de B. subtilis cepa 105 in
vitro. 31
7. CONCLUSIÓN 34
8. LITERATURA CITADA 35
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ÍNDICE DE FIGURAS Número Página
1 Lesión causada por S. sclerotiorum. 4
2 Ciclo biológico de la enfermedad del moho blanco
causado por el hongo S. sclerotiorum.
5
3 B. subtilis, microorganismo usado para control biológico. 7
4 Ciclo de esporulación de B. subtilis 9
5 Compuestos producidos por B. subtilis: surfactina (a),
iturina (b) y fungicina (c).
10
6 B. subtilis 105 (a), y S. sclerotiorum (b). 17
7 Ensayo de antagonismo in vitro. 21
8 Crecimiento (A) y esporulación (B) de B. subtilis cepa 105
a nivel de matraz, evaluando los medios LB y soya.
24
9 Perfiles de tensión de oxígeno (TOD), durante el cultivo
de B. subtilis 105, en el medio LB (A) y el medio soya (B),
bajo una TOD<20% y una TOD>20%. Línea límite de
20% de TOD.
26
10 Crecimiento (A) y esporulación (B), de B. subtilis 105 a
nivel de biorreactor en medio LB, evaluando la TOD < 20
% y TOD > 20%.
27
11 Crecimiento (A) y esporulación (B), de B. subtilis 105 a
nivel de biorreactor en medio soya, evaluando la TOD <
20 % y TOD > 20%.
28
12 Porcentaje de inhibición micelial de S. sclerotiorum,
evaluando el sistema matraz, biorreactor bajo una TOD
por arriba y por abajo del 20%.
32
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ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro Página
1
2
Clasificación taxonómica de S. sclerotiorum sp.
Crecimiento y esporulación de B. subtilis 105 en biorreactor,
para los medios LB y soya, evaluando TOD < 20 % y TOD >
20 %.
3
29
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ABREVIATURAS �
Símbolo Significado
vv Volumen sobre volumen
vvm Volumen de aire por volumen de líquido por minuto
rpm Revoluciones por minuto
Cel Célula
LB Luria agar Broth
UFC Unidades formadoras de colonias
TOD Tensión de oxígeno disuelto
DMCT Diámetro micelial con tratamiento
DMST Diámetro micelial sin tratamiento
���
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RESUMEN �
Bacillus subtilis es una bacteria con actividad antagonista contra el hongo
Sclerotinia sclerotiorum, el cual es un patógeno que afecta cultivos agrícolas de
importancia comercial, tales como el frijol, la papa y el jitomate, entre otros. B.
subtilis 105 cultivada en medio microbiológico LB bajo condiciones de matraz
Erlenmeyer es una cepa sobresaliente por su capacidad de crecimiento y
actividad antagonista contra el hongo. Por lo tanto, es deseable lograr su
producción masiva en medios de cultivo con componentes industriales a nivel de
biorreactor. Considerando que el oxígeno disuelto es un factor determinante para
el crecimiento, esporulación y actividad antagónica de la bacteria durante su
cultivo en biorreactor el objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la
limitación de oxígeno a nivel de biorreactor y de la substitución del medio de
cultivo, en el crecimiento de B. subtilis cepa 105 y en su actividad antagónica
contra S. sclerotiorum.
Utilizando matraces Erlenmeyer y biorreactor, el medio denominado de soya
compuesto por componentes de bajo costo: proteína de soya (10 g L-1), extracto
de levadura (5 g L-1) y cloruro de sodio (5 g L-1), mostró resultados favorables
para el crecimiento y esporulación de B. subtilis cepa 105. Por lo que se considera
adecuado para substituir al medio microbiológico LB. Adicionalmente, usando el
medio de soya en biorreactor y bajo una condición sin limitación de oxígeno
(tensión de oxígeno disuelto (TOD) > 20%), el crecimiento de la bacteria alcanzó
218 x 106 UFC mL-1, con una esporulación del 21.4 ± 3.63 %. Mientras que bajo
una limitación de oxígeno (TOD < 20 %), se redujo el crecimiento en 43 % y la
esporulación a solo el 15 ± 2.14 %. Sin embargo, los caldos de B.subtilis cepa 105
obtenida bajo la TOD < 20%, tuvieron una actividad antagonista contra S.
sclerotioum del 41.4 ± 2.8 % de inhibición, que resultó superior a la obtenido bajo
el TOD > 20 % (29.5 ± 7.3 % de inhibición). Lo cual sugiere que la limitación de
oxígeno en el cultivo de B. subtilis cepa 105 en el biorreactor, favorece la
producción de compuestos activos que incrementan su actividad antagónica
contra el hongo.
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ABSTRACT
Bacillus subtilis105 is a bacterial strain with antagonistic activity against the fungus
Sclerotinia sclerotiorum, which is a pathogen that affects agricultural crops of
commercial importance, such as common beans, potatoes and tomatoes, among
others. B. subtilis 105 grown in microbiological LB medium in Erlenmeyer flask has
shown to be an outstanding strain due to its growth and antagonistic abilities.
Then, in order to obtain mass production, it is desirable the use of a culture media
formulated with industrial components in bioreactor. Since dissolved oxygen
tension (DOT) is a determining factor for growth, sporulation, and antagonistic
activity of bacteria during its cultivation in a bioreactor, the main objective of this
work was to evaluate the effect of oxygen limitation in bioreactor and the
substitution of culture medium on the growth of B. subtilis strain 105 and its
antagonistic activity against S. sclerotiorum.
Erlenmeyer flasks and bioreactor assays using the soy medium which is
composed of low-cost components [protein from soy (10 g L- 1), extract of yeast (5
g L-1) and sodium chloride (5 g L-1)], showed favorable results for growth and
sporulation of B. subtilis strain 105. So, this growth medium is considered suitable
to replace the microbiological LB medium. Additionally, using the soy medium in
bioreactor and under a condition without oxygen limitation (DOT > 20%), bacterial
growth reached 218 x 106 cfu mL-1 and 21.4 ±3.63 % sporulation; whereas in
condition of oxygen limitation (DOT < 20%), growth was reduced to 43% and
sporulation to 15 ± 2.14 %. On the other hand, the culture broth obtained under
DOT < 20% showed and stronger effect on S. sclerotium (41.4 ± 2.8 % inhibition),
compared to the effect of the broth obtained under DOT > 20% (29.5 ± 7.3 %
inhibition). This suggests that oxygen limitation during the cultivation of B. subtilis
strain 105 in bioreactor promotes the production of active compounds that
enhance the antagonistic activity against the fungus.
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I. INTRODUCCIÓN �
Actualmente existe demanda por cultivos comestibles de calidad, así como libres de
pesticidas de origen químico, ya que estos últimos puedan llegar a ser peligrosos
para la salud humana. En México, el frijol es un cultivo agrícola de importancia
económica y social, por lo que existe el interés de adoptar estrategias para reducir o
reemplazar parcial o completamente los agroquímicos utilizados para la prevención y
control de algunas de las enfermedades que lo atacan (Erental et al., 2008; SIEA-
SAGARPA, 2011).
El frijol, es el cultivo agrícola que ocupa el segundo lugar a nivel nacional en
superficie sembrada. En el 2012, se sembraron 1,700,513.50 ha en todo el país con
un valor de producción de 13,784 MDP (SIAP-SAGARPA www.siap.gob.mx/ ). La
importancia social de este cultivo radica en que existen alrededor de 650 mil
productores de frijol en todo el país. El rendimiento de frijol en 2012 fue de 0.69
Ton/Ha, este valor se encuentra por debajo del rendimiento potencial obtenido en
otras partes del mundo, como Estados Unidos, donde se reportan un rendimiento
promedio de 1.92 Ton/Ha (SIEA-SAGARPA, 2011).
Una de las enfermedades principales que causa disminuciones en los rendimientos
del cultivo de frijol es el moho blanco�del frijol causada por el hongo S. sclerotiorum.
Este patógeno tiene un rango de hospederos muy amplio, ya que además del frijol
afecta a más de 400 especies de plantas (Zeng et al., 2012). En los últimos años, la
presencia de esta enfermedad ha sido reportada en los estados de Jalisco, Nayarit y
Sinaloa, causando reducciones significativas en el rendimiento (López-Rodríguez,
2010).
La presente tesis se inició en 2011 dentro del proyecto “Fortalecimiento de la
Rentabilidad del Sistema Producto Frijol mediante el uso de Herramientas
Biotecnológicas” perteneciente de la Red Biotecnología de IPN; particularmente
dentro de la meta de “Desarrollar productos biotecnológicos con actividades
biofertilizantes, bioestimulantes y antagonistas a fitopatógenos”. Posteriormente, en
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el 2012 el proyecto continuó con el nombre de “Obtención de bacterias, benéficas
para el cultivo del frijol”.
La selección y utilización de agentes de control biológico, particularmente de
antagonistas a plagas y enfermedades, ha tenido un desarrollo importante en las
últimas décadas, ya que esto microorganismos representan potenciales sustituyentes
o alternativas a los pesticidas de origen químico. Los agentes de control
microbiológicos usualmente tienen efectos letales o inhibidores de la fisiología o la
bioquímica de la agente infeccioso, interrumpiendo el crecimiento y desarrollo del
mismo, ya sea por parasitismo, antagonismo o alelopatía (Thakore, 2006; Bailey et
al., 2010).
La cepa de B. subtilis 105 fue aislada de suelos agrícolas de Sinaloa y seleccionada
por su efecto antagonista contra S. sclerotiorum. B. subtilis tiene la habilidad de
producir compuestos bioactivos, los cuales han mostrado capacidades antifúngicas y
baja toxicidad para el ser humano, así como una alta biodegrabilidad en el medio
ambiente. La bacteria tiene la capacidad de formar endosporas, las cuales son
estructuras muy resistentes a condiciones ambientales adversas. Las pruebas de
antagonismo con la cepa de B. subtilis cepa 105 fueron llevadas a cabo con cultivos
a nivel de matraz. Ya que uno de los fines de la selección de este tipo de
microorganismos es su aplicación en campos de cultivos, es indispensable llevar su
producción a nivel de biorreactor para su producción masiva, por lo que es
importante optimizar las condiciones de crecimiento y producción de esporas, sin
afectar su capacidad bioactiva (Carvalho y Lacerda, 2010; Kwon et al., 2011).
Se ha reportado que en cultivos de B. subtilis en biorreactor, una condición de
limitación de oxígeno, estimula la síntesis de sustancias bioactivas, pero disminuye
el crecimiento de la bacteria (Schisler et al., 2004; Berry et al., 2010; Zeng et al.,
2012). En el presente trabajo se tuvo como objetivo evaluar el efecto de la limitación
de oxígeno en biorreactor y de la sustitución del medio microbiológico en el
crecimiento de B. subtilis cepa 105 y en su capacidad antagonista contra S.
sclerotiorum.
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II. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 Sclerotinia sclerotiorum
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S. sclerotiorum (Lib.) de Bary es un hongo Ascomycete (Cuadro 1) que causa daños
severos en cultivos de importancia agrícola. Este patógeno exhibe poca especificidad
y un rango amplio de hospedaros incluyendo a 408 especies, 278 géneros y 75
familias de especies de plantas, principalmente dicotiledóneas (Boland y Hall 1994;
Duncan et al., 2005).
Cuadro 1. Clasificación taxonómica de S. sclerotiorum sp.
Las condiciones frescas y de alta humedad favorecen el desarrollo de S. sclerotiorum
no solamente en cultivos agrícolas, sino también en malezas susceptibles, lo cual
aumenta la producción de esclerocios en el suelo y por lo tanto del inóculo
potencialmente infectivo en un siguiente ciclo de cultivo (Erental et al., 2008; Zeng et
al., 2012).
En condiciones de campo húmedo, S. sclerotiorum es capaz de invadir por completo
una planta huésped, colonizando casi todos los tejidos de la planta con el micelio. La
temperatura óptima para su crecimiento es de 15 a 21 oC. Bajo condiciones de lluvia
S. sclerotiorum produce gran cantidad de micelios y esclerocios (Rodriguez et al.,
2006).
Reino Fungi Filum Ascomycotina Clase Ascomycetes Orden Helioteliales Familia Sclerotiniaceae Género Sclerotinia Especie S. sclerotiorum
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S. sclerotiorum afecta de manera importante al cultivo de frijol en México. En los
últimos años, el moho blanco del frijol ha tenido incidencia en los estados de Jalisco,
Nayarit y Sinaloa, causando reducciones significativas en el rendimiento. Los
síntomas que causa este patógeno son la formación de lesiones oscuras y acuosas
en las hojas y tallos de la planta infectada, en las cuales se desarrolla tejido necrótico
con la aparición de micelio blanco (Figura 1) y la subsecuente formación de
esclerocios, el cual es el síntoma más evidente de que la planta está infectada por S.
sclerotiorum (Abawi y Grogan, 1975).
Figura 1. Lesión causada por S. sclerotiorum.
Tomada de Campa et al. (2009).
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2.2. Ciclo de la enfermedad del moho blanco
El ciclo de la enfermedad del moho blanco causado por S. sclerotiorum sobre la
planta de frijol inicia en el suelo, con la germinación de las estructuras de resistencia
o esclerocios (Figura 2). Los esclerocios pueden germinar de dos maneras: a)
carpogénicamente, produciendo apotecios, los cuales son estructuras que forman
ascosporas, mismas que son dispersadas por el viento y son fuente de infección al
germinar sobre tejidos senescentes tales como tejidos florales y b)
miceliogénicamente, en la cual el esclerocio produce micelio algodonoso que infecta
directamente tejidos vegetativos como tallos y hojas (Erental et al., 2008).
Figura 2. Ciclo biológico de la enfermedad del moho blanco causado por el hongo S.
sclerotiorum. (Campa et al., 2009) �
Esclerocios
Liberación de las ascosporas
Germinación de ascosporas en
las flores
Hongo colonizando
flores
Formación de los apotecios en la
superficie del suelo
Formación de esclerocios en vainas y tallos
Germinación en el suelo
Planta de frijol marchita
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2.3 Tratamientos de control del moho blanco �
Existen diferentes tratamientos químicos utilizados para el control de S.sclerotiorum,
pero existen normas cada vez más rigurosas para su aplicación, debido a los efectos
tóxicos sobre la salud humana, el medio ambiente y otros microorganismos
benéficos. Ante esta problemática, se han investigado algunas estrategias
alternativas como la utilización de diferentes extractos de plantas, que han mostrado
resultados positivos para el control de esta enfermedad (Homans y Fuchs, 1970;
Cutler, 1999; Rodríguez et al., 2006), aunque en estos casos no se determinó su
factibilidad ni su toxicidad. Otra alternativa para el control de esta enfermedad, es la
utilización de microorganismos antagonistas que puedan ser utilizados como agentes
de control biológico (Thakore, 2006; CESAVEG, 2011).
2.3.1 B. subtilis como alternativa de control biológico �
El control biológico contra S. sclerotiorum comprende el uso de hongos
micoparásitos y bacterias antagonistas (Schisler et al., 2004; Berry et al., 2010).
Coniothyrium minitans es un ejemplo de un hongo micoparásito de esclerocios de S.
sclerotiorum (Gerlagh et al., 1999). C. minitans es la base del producto comercial
CONSTANS® WG mismo que ha sido utilizado principalmente en Europa y el norte
de Estados Unidos (McQuilken y Chalton, 2009).
De igual manera, en el mercado existen productos comerciales a base de B. subtilis
que presentan un efecto antagonista contra el moho blanco del frijol. Probac BS® es
un producto comercial formulado con B. subtilis en México. El producto tiene un
efecto antagonista y compite por espacio y nutrientes con patógenos en los nichos
donde es aplicado (Schisler et al., 2004; Horbach et al., 2011).
B. subtilis es una bacteria gram positivo, aerobio o anaerobio facultativo, con
capacidad de formar endosporas (Figura 3). Las esporas son estructuras
termotolerantes, resistente a la sequía, radiación ultravioleta y solventes orgánicos
(Fritze, 2004; Schisler et al., 2004; Ongena et al., 2005). Además, B. subtilis es
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conocido por sintetizar varios compuestos con actividad antibacterial y antifúngica,
tales como: la subtilina y la iturina que inhiben el crecimiento de patógenos (Pérez-
García et al., 2011).
Figura 3. B. subtilis, microorganismo usado para control biológico Modificado de Chamberlain, 2010.
El suelo es el hábitat natural de B. subtilis. En el suelo, existen microambientes
anaerobios, así como abundantes fuentes de nitratos, los cuales inducen a los genes
involucrados en la formación de estos compuestos antibióticos (Nakano et al., 1997).
Por el contrario, bajo condiciones aerobias no se producen estos compuestos
activos (Yeh et al., 2006). Esto se debe a que los microorganismos crecen rápido
cuando existe una fuente de nutrientes abundante y la producción de antibióticos
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toma lugar cuando el crecimiento termina (Marazioti et al., 2003; Carvalho y Lacerda,
2010). Además de producir compuestos antibióticos, estos microorganismos
producen enzimas degradadoras de la pared celular como quitinasas, glucanasas,
proteasas y otras moléculas orgánicas volátiles que contribuyen a su efecto
antagonista sobre microorganismos patógenos (Carvalho y Lacerda, 2010). Todas
estas características hacen de B. subtilis un microorganismo factible de ser utilizado
como alternativa de control para algunas enfermedades de plantas.
2.4 Formación de esporas de B. subtilis
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Al terminar el crecimiento exponencial de un cultivo de B. subtilis se llevan a cabo
una serie de cambios en las células tanto estructurales como metabólicos, los cuales
culminan con la formación de esporas. Los principales estímulos para el inicio de la
esporulación, es una densidad celular alta y la limitación por algún nutriente. El
proceso de esporulación comprende varios estadios (Figura 4). El estadio cero se
inicia con una respuesta al agotamiento de nutrientes y a la producción de péptidos
que detecta y responden a una alta concentración celular (Schneider et al., 2002). El
inicio de la esporulación es regulado por la proteína de unión a DNA Spo0A, la cual
actúa como regulador maestro del proceso y tiene influencia directa o indirectamente,
sobre la expresión de más de 500 genes durante los estados tempranos de
desarrollo de B. subtilis (Molle et al., 2003). En el estadio II se producen enzimas
hidrolíticas, como las proteasas y amilasas, y el estadio termina con la formación de
un septo en un polo de la célula. En el estadio siguiente (III) ocurre el engullimiento
de la preespora. Del estadio IV al VII, hay la formación de la corteza y de la cubierta,
la maduración de la espora y la lisis celular. La duración de cada etapa es de
aproximadamente una hora (Errington, 1993).
Durante esta serie de eventos de la esporulación se forman dentro de un mismo
cuerpo dos células; la célula madre y la preespora, las cuales mantienen una
comunicación para poder, en conjunto y de una forma metabólica ordenada, formar
la espora. La transición de un estado al otro es gobernada por seis proteínas
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reguladoras llamadas factores sigma, que se unen a la ARN polimerasa y determina
qué promotores serán reconocidos para su posterior transcripción (Errington, 1993).
Figura 4. Ciclo de esporulación de B. subtilis (Errintong, 2003).
2.5 El efecto del oxígeno en el desarrollo de B. subtilis
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B. subtilis fue considerado un aerobio estricto, pero se demostró que puede crecer
bajo condiciones anaeróbicas. B. subtilis puede crecer anaeróbicamente mediante la
reducción de nitratos o nitritos en amonio, mediante la utilización de la enzima nitrato
reductasa, codificada por el gen narGHJI. El mecanismo de regulación de esta
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enzima se encuentra mediado por la condición de oxígeno generada dentro de un
medio de cultivo en fermentación. En ausencia de oxígeno, el nitrato o nitrito
funcionan como un aceptores de electrones en el proceso respiratorio de B. subtilis
(Nakano et al., 1997; Carvalho y Lacerda, 2010).
Una condición de limitación de oxígeno, puede inducir la expresión de algunos
genes, como los relacionados con la reducción de los nitratos (narGHJI), así como
los genes involucrados en la producción de compuestos bioactivos, tales como:
surfactina, iturina y fungicina (Figura 5). La producción de este tipo de sustancias
permite a B. subtilis colonizar diferentes nichos ecológicos, dándole ventajas
competitivas. Por ejemplo, la surfactina se conoce que tiene un efecto destabilizador
de la membrana lipídica de otro tipo de microorganismo (Ongena et al., 2005; Pérez-
García et al., 2011).
Figura 5. Compuestos producidos por B. subtilis: surfactina (a), iturina (b) y fungicina
(c).
2.6 Cultivo de B. subtilis en biorreactor
La función principal de un biorreactor es la de proveer un ambiente controlado para
que los microrganismos alcancen el máximo crecimiento y la óptima formación de
un producto deseado (Frioni, 1999). La aireación y agitación son las operaciones
más importantes en el biorreactor y con ellas se busca mantener la homogeneidad
a b c
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en los parámetros fisicoquímicos, además de proporcionar el oxígeno a los
microorganismos aerobios (Galindo et al., 2011).
Los biorreactores están equipados con varios sensores para la medición y el control
de la temperatura, de la velocidad de agitación, la concentración de oxígeno disuelto
(DO2), el pH, el potencial redox y la concentración de dióxido de carbono (CO2). El
principal inconveniente para el desarrollo de este tipo de tecnología, radica en que no
existe un diseño de biorreactor que se adapte a todas las aplicaciones (Preil, 1991).
La concentración de oxígeno disuelto (DO2) en el medio de cultivo, es descrita como
uno de los parámetros más importantes y de mayor influencia. Debido a que la
solubilidad del oxígeno en el agua es baja, solamente 7 mgL-1. Por otro lado, cuando
el aire es suministrado al medio, el oxígeno debe vencer varias resistencias físicas,
antes de alcanzar a la célula.
En cultivos de B. subtilis se conoce que la concentración de oxígeno es importante
debido a que influye en su metabolismo. En condiciones de limitación de oxígeno las
células vegetativas entran en un proceso de esporulación y se favorece la formación
de compuestos activos (Carvalho y Lacerda, 2010; Kwon et al., 2011). Por otro lado,
si el oxígeno no es limitante, se favorece la proliferación de células, obteniendo
cultivos más concentrados. La transición de una condición aerobia a una anaerobia,
se presenta cuando la concentración de oxígeno en el cultivo, alcanza niveles
menores al 10% de la TOD. En ésta condición se induce la expresión de algunos
genes, como el de la nitrato reductasa (Tseng et al., 1996).
Diversos autores han evaluado en cultivo a nivel de biorreactor el efecto de la
condición del oxígeno sobre el crecimiento, esporulación y formación de productos.
Por ejemplo: Kwon et al. (2011), con la cepa B. subtilis DMJ maximizaron la
producción de biomasa (77g L-1) controlando la TOD � 20%. Carvalho y Lacerda
(2010), con la cepa B. subtilis R-14. Obtuvieron una concentración celular de 1 x 108
UFC mL-1 bajo una condición de exceso de oxígeno y observaron la formación de
sustancias bioactivas en condiciones de limitación de oxígeno. Nakano et al (1997)
reportaron la formación de sustancias bioactivas utilizando la cepa de B. subtilis
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JH642 bajo crecimiento anaerobio. Mientras que Yáñez-Mendizábal et al (2012),
utilizando la cepa de B. subtilis CPA-8, obtuvieron altas concentraciones de células
(3 x 109 UFC mL-1), bajo una condición de no limitación de oxígeno y el uso de medio
a base de soya.
2.7 Usos de medios de cultivo de origen industrial para el cultivo de microorganismos
En la producción de Bacillus para el control biológico, un factor clave a considerar es
el desarrollo de un medio de cultivo económico y la definición de las condiciones
adecuadas de aireación, de tal manera de mantener los costos de producción bajos
conservando la máxima eficacia del sistema para ser utilizado en control biológico
(Matsumoto et al., 2010; Yánez-Mendizábal et al., 2012).
Los constituyentes de bajo costo en el medio deben de satisfacer los requerimientos
nutrimentales de las células y proveer la energía necesaria para la biosíntesis y el
mantenimiento celular (Galindo et al., 2011).
El uso de subproductos de la industria alimentaria puede servir como sustratos
comerciales de costo más económico al de los productos de grado microbiológico. La
harina de soya, melaza, extracto de levadura, peptona y harina de maíz son materias
primas probadas para proveer de fuente de nitrógeno y carbono a los
microorganismos durante su crecimiento en biorreactor. El uso de subproductos para
formular medios de cultivo puede reducir los costos de producción de sistemas que
reproducen B. subtilis para usarse como agente de control biológico (Chen et al.,
2009; Matsumoto et al., 2010; Yánez-Mendizábal et al., 2012)
Hay antecedentes para la producción de Bacillus en medios formulados con sales
industriales o con subproductos de la industria. Yánez-Mendizábal et al (2012)
probaron medios de cultivo a base de extracto de levadura, peptona y harina de
soya, encontrando que el medio con la harina de soya ( 20 g L-1) generó una
biomasa de 3 x 109 UFC mL-1 y un producto fermentado con un efecto antagonista
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contra Monilinia fructicola. Matsumoto et al (2010) comparó el uso de la harina de
soya y un medio definido formulado con sales químicas y observó que la producción
de biomasa en B.subtilis fue favorecida en el medio formulado con soya. Chen et al
(2009) observó que B. subtilis cepa WHK-Z12 cultivada en harina de soya favoreció
el crecimiento de la bacteria, alcanzando una producción de 1.52 x 1010 UFC de
esporas mL-1. De esta maneta la harina de soya coincide en varios trabajos como
una fuente de nitrógeno, favorable para el crecimiento de bacilos.
Por otro lado, la sustitución de peptona del medio LB (Sigma) por harina de soya de
origen industrial en el cultivo de la cepa 105 de B. subtilis no causó diferencias
significativas en el crecimiento (Sarmiento, 2012).
2.8 B. subtilis cepa 105 �
En el CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa, se llevó a cabo un estudio a partir de una colección
de 114 microorganismos aislados de suelos agrícolas del norte de Sinaloa con el fin
de identificar cepas capaces de inhibir el crecimiento in vitro de S. sclerotiorum. A
partir de este estudio se seleccionaron diez aislados que presentaron inhibición de
germinación miceliogénica de esclerocios, de entre las cuales B. subtilis 105 mostró
un porcentaje de inhibición de la germinación micelial del 100% y presentó también
inhibición de la infección en hojas desprendidas de frijol (Sotomayor-García, 2008).
Las pruebas in vitro y en hoja desprendida de frijol con el aislado de B. subtilis 105 se
realizaron con cultivos celulares crecidos en matraces Erlenmeyer de 250 mL con
medio LB grado microbiológico (Sigma) y que contenían. Después de 16 h de cultivo
2.89 X 108 UFC mL-1 (Sotomayor-García, 2011). Sin embargo, en este trabajo no se
determinó la viabilidad ni la producción de esporas.
En el CeProBi-IPN, se evaluó el crecimiento de B. subtilis 105 a nivel de biorreactor
en donde se substituyó la peptona del medio LB (Sigma) por un medio con harina de
soya de origen industrial. El monitoreo de TOD a lo largo del ciclo de cultivo mostró
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que este parámetro cayó a 0% durante la hora dos de cultivo recobrando un nivel
apenas mayor al 20% a la hora cuatro del cultivo, lo cual indica que el cultivo estuvo
limitado por oxígeno. Bajo estas condiciones de crecimiento no se observaron
diferencia significativa en el rendimiento de biomasa (8.3 x 108 células mL-1), ni en su
efecto antagonista (50% de inhibición micelial) entre las dos condiciones de
crecimiento (Sarmiento, 2012). Con el objeto de reducir la limitación de oxígeno, se
probó una condición de agitación de 700 rpm, pero aun así, el cultivo mostró una
baja de TOD por un periodo de 2 horas al inicio del cultivo (Sarmiento, 2012).
Tomando en cuenta estos antecedentes, éste trabajo se realizó con la intención de
definir el efecto de la TOD sobre cultivos de B. subtilis 105 crecidos en biorreactor.
Se considero, una TOD por encima y por debajo del 20 % y se determinó su efecto
sobre el crecimiento y esporulación de la bacteria, además de determinar su
capacidad antagonista contra el hongo S. sclerotiorum en ensayos in vitro.
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III. JUSTIFICACIÓN
B. subtilis 105 es una bacteria autóctona aislada de suelos agrícolas de Sinaloa. Esta
bacteria sobresale por su actividad antagonista sobre S. sclerotiorum, que es un
hongo que ataca a cultivos de importancia agrícola, particularmente al frijol. Como
parte del proyecto “Obtenidas de bacterias benéficas para el cultivo del frijol” que se
desarrolla dentro de la Red de Biotecnología de IPN. Se tiene antecedentes del
crecimiento de la cepa 105 de B. subtilis a nivel de matraz, así como biorreactor. Los
caldos de cultivo obtenidos muestran actividad antagónica contra el hongo S.
sclerotiorum. Dado que el crecimiento de la bacteria y la producción de sus
compuestos antifúngicos se pueden ver afectados por el suministro de oxígeno, es
deseable entender el efecto que puede generar una condición de limitación de
oxígeno y una no limitada, en el crecimiento celular y la actividad antagonista del
caldo contra el hongo.
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IV. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Evaluar el efecto de la limitación de oxígeno a nivel de biorreactor y de la sustitución
del medio de cultivo en el crecimiento de B. subtilis cepa 105 y en su capacidad
antagonista contra S. sclerotiorum.
4.2 Objetivos específicos
• Evaluar el crecimiento y esporulación de B. subtilis cepa 105 a nivel de matraz
en los medios de soya y LB.
• Evaluar en biorreactor el efecto de una TOD mayor y menor al 20 %, en el
crecimiento y esporulación de B. subtilis cepa 105, utilizando los medios de
cultivo de soya y LB.
• Determinar el efecto antagonista de los caldo de B. subtilis cepa 105,
obtenidos en matraz y biorreactor contra el hongo S. sclerotiorum en pruebas
in vitro.
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V. METODOLOGÍA
5.1 Microorganismos
Las cepas utilizadas en el presente trabajo fueron B. subtilis cepa 105 y S.
sclerotiorum (Figura 6). Las cepas pertenecen a la colección del CIIDIR Sinaloa y
fueron aisladas en campos agrícolas de jitomate en Guasave, Sinaloa, México.
Figura 6. B. subtilis 105 (a), y S. sclerotiorum (b).
5.2 Medios de cultivos
Se utilizó el medio de soya propuesto por Sarmiento (2012). La composición del
medio soya fue la siguiente: 10 g L-1de proteína de soya, 5 g L-1 de extracto de
levadura y 5 g L -1 de cloruro de sodio. Las muestras de los componentes del medio
fueron proporcionadas por el Biol. Carlos Roberto Gutiérrez y corresponden a
sustratos utilizados para la formulación de medios de cultivo microbiológico e
industrial por la compañía de fermentaciones Fermic, S. A. El medio microbiológico
Luria Broth LB (Sigma-Aldrich) fue utilizado como el cultivo de referencia. S.
sclerotiorum fue crecido en medio PDA (papa-dextrosa-agar) 40 g L-1 y para la
realización de la cuenta de unidades formadoras de colonias se utilizó el medio luria
agar 40 g L-1.
a) b)
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5.3 Mantenimiento de las cepas
La cepa 105 de B. subtilis se conservó mediante resiembras en el medio Luria Agar
(Sigma-Aldrich). El medio se preparó disolviendo 16 g en 400 mL de agua
desionizada en un matraz Erlenmeyer de 500 mL. Los medios se esterilizaron en un
autoclave (AESA modelo CV. 250) a una temperatura de 121 ºC durante 15 minutos
a una presión de 1 Kg/cm². Cuando la temperatura del medio alcanzó 30 a 35 ºC, se
realizó el vaciado en cajas Petri (SYM Laboratorios) de 100 X 15 mm a un volumen
25 a 30 mL.
Durante la resiembra se tomó una asada de B. subtilis cepa 105, las cajas se
incubaron a 37 °C en una estufa durante 24 horas. Las cepas crecidas en las placas
de agar se almacenaron a 4 °C.
El mantenimiento del hongo S. sclerotiorum se realizó mediante resiembras en
placas con medio PDA (Sigma). La preparación del medio se realizó disolviendo 16 g
en 400 mL de agua desionizada en un matraz Erlenmeyer de 500 mL. Los medio se
esterilizaron en un autoclave (AESA modelo CV. 250) a una temperatura de 121°C
durante 15 minutos a una presión de 1 Kg/cm2. Cuando la temperatura del medio
alcanzó 30 a 35°C, se realizó el vaciado en cajas Petri (SYM laboratorios) de 100 X
15 mm a un volumen de 25 a 30 mL.
Durante la resiembra se cortó un trozo de agar de una placa con el hongo
previamente crecido con un sacabocados. El fragmento de agar fue colocado sobre
una caja fresca con medio PDA, las cajas se incubaron a 27°C durante 72 horas.
5.4 Determinación del crecimiento y esporulación de la bacteria
La cuantificación del crecimiento celular y de las esporas se realizó por medio del
conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC), que se describe a
continuación.
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Para la cuantificación por UFC de células vegetativas se tomaron 10 mL de muestra
del caldo de fermentación cada 30 minutos. Se hicieron diluciones en tubos
eppendorf de 1 mL y alícuotas de 0.1 mL, y de los caldos diluidos fueron usadas
para la siembra en cajas Petri con medio Luria Agar (Sigma-Aldrich). Los cultivos se
incubaron durante 24 h a 37°C y se contó el número de colonias. Para determinar
la concentración celular se utilizó la ecuación siguiente:
Ec. 1
La cuantificación de esporas se realizó después de la aplicación de un choque
térmico al cultivo, siguiendo la técnica reportada por Cristiano (2012). Las muestras
diluidas de los caldos de fermentación se sometieron a un calentamiento a una
temperatura de 85°C durante 15 min en un Thermomixer eppendorf. De esta manera
se eliminan las células vegetativas del cultivo. Las muestras fueron sembradas en
cajas de Petri con el medio Luria Agar. Los cultivos se incubaron durante 24 h a
37°C. El número de colonias fue contado y utilizado para determinar la
concentración de esporas utilizando la ecuación 1.
5.5 Crecimiento en matraz de B. subtilis 105 en el medio soya y LB
El crecimiento de B. subtilis se llevó a cabo en medio de soya y LB en matraces
Erlenmeyer de 500 mL. Los matraces se inocularon con una asada de B. subtilis 105
y se incubaron a 37 °C, con agitación orbital de 150 RPM Rotabit (HHI-08) durante
12 horas. Se tomaron muestras de 1 mL, cada 60 minutos. Se determinó el
crecimiento celular y la esporulación por medio del conteo de UFC.
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5.6 Crecimiento en biorreactor de B. subtilis 105
Se utilizó un biorreactor tipo tanque agitado de 2 L con un impulsor Rushton
(Applikon, Schiedam, Holanda). El volumen de trabajo del biorreactor fue de 1 L con
el medio comercial soya y LB (Sigma-Aldrich). El biorreactor se inoculó con 100 mL
de un cultivo crecido durante 3 horas en matraces Erlenmeyer de 500 mL y se
agregó al biorreactor en una relación 10% (v/v). Las condiciones establecidas fueron
una aireación del sistema de 0.1 vvm, una temperatura de 30°C, y una velocidad de
agitación de 700 rpm, la medición de pH y oxígeno disuelto se realiza en línea con un
controlador Applikon, ADI 1030 (Applikon, Schiedam, Holanda).
El crecimiento de B. subtilis en biorreactor se realizó inicialmente en una condición
sin control de TOD, es decir, manteniendo constante el suministro de aire a lo largo
del cultivo.
El crecimiento en biorreactor bajo las dos condiciones de oxígeno se llevaron a cabo
en el biorreactor tipo tanque agitado de 2 L, bajo las condiciones descritas
anteriormente y utilizando el dispositivo de control Proporcional Integral Derivativo del
controlador Applikon, ADI 1030 (Applikon, Schiedam, Holanda). El dispositivo cuenta
con válvulas solenoides independientes que permiten la entrada de oxígeno o
nitrógeno, de acuerdo a la necesidad que presenta el cultivo, con relación a la
desviación que se presenta en el valor de “set-point” dado para la TOD. Para la
condición de limitación de oxígeno, el “set-point” de la TOD fue establecido por
debajo de una TOD de 20%; mientras que la condición de no limitación de oxígeno el
“set-point”, se mantuvo por encima del 20 %. Los resultados de crecimiento de los
cultivos se obtuvieron de dos corridas independientes.
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5.7 Ensayos de antagonismo
Las pruebas del efecto antagonista de los caldos de B. subtilis 150 sobre S.
sclerotiorum se realizaron en ensayos in vitro y utilizando los caldos de los cultivos
obtenidos a las 10 h, en la fase estacionaria del cultivo. En cajas de Petri con medio
PDA (Sigma-Aldrich), se colocó una porción de 0.5 mm de diámetro de micelio del
hongo crecido previamente a 27°C por 7 días en PDA. En uno de los extremos de la
caja se agregó 0.1 mL de caldo de cultivo. La muestra se incubó durante tres días a
37°C y se midieron los diámetros de crecimiento del micelio. El efecto antagonista se
reporta como el porcentaje de inhibición de B. subtilis sobre S. sclerotiorum,
calculado mediante la ecuación 2.
Ec. 2
Figura 7. Ensayo de antagonismo in vitro.
Donde DMST es el diámetro micelial sin tratamiento y DMCT es el diámetro miceliar
con tratamiento. Los ensayos se realizaron por triplicado.
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5.8 Análisis estadístico
Los resultados se expresaron como promedios ± desviación estándar (D.E). Las
diferencias entre los grupos se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA)
de una vía utilizando el Software Sigmaplot 11. Posterior se realizó una comparación
múltiple por medio de una prueba de Tukey, considerando una diferencia
estadísticamente significativa de P � 0.001.
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VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Crecimiento y esporulación de B. subtilis 105 a nivel de matraz.
La caracterización del cultivo de B. subtilis 105, comparando los medios LB (Sigma) y
soya, se realizó primeramente a nivel de matraz. La figura 8 muestra la cinética de
crecimiento; para el medio LB el crecimiento máximo fue de 75.3 x 106 ± 3.47 x 106
UFC mL-1 y se alcanzó a las 7 h, mientras que para el medio soya se obtuvo 113 x
106 ± 10.8 x 106 UFC mL-1 a las 8 horas. Lo anterior implica que, el medio de soya
generó 0.5 veces más bacterias que el medio LB y la diferencia de crecimiento fue
significativa. De forma consistente, la producción de esporas obtenidas en el medio
de soya (58.3 x 106 ± 5.78 x 106 UFC mL-1) fue 0.8 veces superior a la obtenida en el
medio LB (31.6 x 106 ± 7.62 x 106 UFC mL-1), lo cual indica que el medio de soya
también favorece la formación de las esporas.
El conocimiento de la cinética de crecimiento de B. subtilis 105, permite identificar las
fases características del crecimiento de la bacteria. La comparación de las cinéticas
en los medios LB y soya, indican que el comportamiento del crecimiento de la cepa
es paralelo en ambos medios, pero el crecimiento y esporulación en un mismo
tiempo siempre es superior para el medio de soya. Se descarta que dicha diferencia
pudiera ser debida a un efecto de tamaño de inóculo, pues se utilizó la misma
concentración de células para ambos cultivos (8.5 x 103 UFC mL-1). No obstante, se
presentó una diferencia en el tiempo en que se alcanza la fase estacionaria, para el
medio de soya la fase estacionaria se alcanza una hora después al medio LB.
Sarmiento (2012), previamente realizó un estudio con la cepa de B. subtilis 105,
comparando el crecimiento de la cepa en ambos medios, pero utilizando un conteo
directo de las bacterias en cámara de Neubawer. Sin embargo, esa técnica no
permite discriminar entre las células vivas y las células muertas. Por lo tanto, en este
estudio se decidió caracterizar el crecimiento de la cepa mediante la técnica de UFC,
la cual descarta las células incapaces de formar una colonia.
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Figura 8. Crecimiento (A) y esporulación (B) de B. subtilis cepa 105 a nivel de matraz, en el medio LB (—) y soya (- - -).
A
B
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Comparando los resultados obtenidos por Sarmiento (2012), que obtuvo un
crecimiento en el medio de soya de 480 x 106 células mL-1 y para el medio LB de 480
x 106 células mL-1, contra los obtenidos mediante la técnica de UFC, se puede inferir
que el conteo directo sobreestima el crecimiento del cultivo, ya que no considera la
viabilidad de las células vegetativas. Sin embargo, se confirma que el medio de soya
favorece el crecimiento y esporulación de B. subtilis 105.
La utilización de un medio a base de harina de soya, como fuente de nitrógeno está
reportado por Yáñez-Mendizabal et al, (2012), quien observó para la cepa B. subtilis
CPA-8 un crecimiento máximo de 300 x106 UFC mL-1. Por otra parte Chen et al
(2009) reportaron que los medios formulados con harina de soya para el crecimiento
de la cepa de B. subtilis WHK-Z21 pueden generar una producción máxima de
esporas de 15 200 x 106 UFC mL-1. Esto sugiere que la utilización de soya como
fuente de nitrógeno asimilable en el medio de cultivo, favorece el crecimiento y
esporulación de cultivos de B. subtilis.
El momento en que los cultivos de bacterias alcanzan la máxima producción de
esporas, es considerado como el momento de la cosecha para formular productos
para control biológico (Galindo et al., 2011; Yáñez-Mendizábal et al., 2012).
Cristiano-Fajardo (2012) reporta para un medio definido, con glucosa como fuente de
carbono, que el inicio de la fase estacionario coincide con el agotamiento de la fuente
de carbono. En este sentido, estudios futuros podrían dirigirse a identificar el
nutriente que limita el crecimiento en el caso del medio de soya. Sin embargo, se
sugiere que entre las 7 y 8 horas de cultivo de B. subtilis 105, se podrían considerar
como el tiempo de cosecha para obtener los caldos con rendimiento de esporas
máximo.
Los resultados obtenidos a nivel de matraz mostraron que el crecimiento y la
esporulación, al utilizar el medio de soya aumentaron en comparación al medio de LB
(Sigma). Por lo tanto, se logró la sustitución de componentes de origen industrial
para continuar con el estudio de B. subtilis 105 en el biorreactor.
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6.2 Crecimiento de B. subtilis cepa 105 bajo una TOD mayor y menor al 20%. �
La figura 9a, muestra para la condición de TOD � 20% en el medio LB (sigma), cómo
la TOD del cultivo descendió desde 100 % a 0% en las primeras dos hora del cultivo.
A partir de las cuatro horas, la TOD se mantuvo por debajo del 20% mediante la
inyección de nitrógeno al sistema. Por otra parte, para el medio de soya, en la figura
9b, se observa que para el control de la TOD � 20%, sólo se requirió de la inyección
de nitrógeno a la hora seis.
Figura 9. Perfiles de tensión de oxígeno (TOD), durante el cultivo de B. subtilis 105, en el medio LB (A) y el medio soya (B), bajo una TOD�20% (—) y una TOD�20% (—). Línea límite
de 20% de TOD (---).
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Por el contrario, para mantener la condición de TOD � 20%, fue necesario enriquecer
la corriente de entrada de gas con oxígeno. Los perfiles con el cultivo del medio LB y
el medio de soya muestran que desde la hora dos, el sistema de cultivo empezó a
ejercer la acción de control.
A B
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El establecimiento de la condición TOD � 20% se consideró como una condición de
oxígeno limitante tomando en cuenta el reporte previo de Tseng et al. (1996). En
dicho reporte, cultivos de B. subtilis en una TOD � 10% (22 µM oxígeno) se indujo la
expresión de los genes de la nitrato reductasa respiratoria (narGHJI), indicando que
el metabolismo de la bacteria cambió de aerobiosis a anaerobiosis (Tseng et al.,
1996).
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A
B
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En la figura 10, se presenta el perfil de crecimiento y esporulación de B. subtilis
obtenidas en el medio LB. Para la condición de TOD � 20%, el crecimiento máximo
fue de 151.0 x 106 ± 60.3 x 106 UFC mL-1, mientras que para la condición de TOD �
20% las células alcanzaron 82.3 x 106 ± 5.61 x 106 UFC mL-1, a pesar de tener una
diferencia 0.83 veces mayor para la TOD � 20%, no se encontró diferencia
significativa (P<0.001). Por otro lado, en el medio de soya, para la condición de TOD
� 20% la concentración de células de B. subtilis máxima fue de 218.0 x 106 ± 10.6 x
106 UFC mL-1 y para la condición de TOD � 20% fue de 95.7 x 106 ± 4.12 x 106 UFC
mL-1, bajo esta condición la TOD � 20% favoreció un aumento (significativo, P<0.001)
de 2.27 veces con relación a la condición de TOD � 20%.
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Figura 11. Crecimiento (A) y esporulación (B), de B. subtilis 105 a nivel de biorreactor en medio soya, evaluando la TOD < 20 % (—) y TOD > 20% (- - -).
B
A
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Por otro lado, si se comparan los valores de crecimiento y esporulación obtenidos
bajo la misma condición de TOD, pero con diferente medio. Se observa que a una
TOD � 20% la producción de células de B. subtilis en el medio LB (151 X 106 ± 60.3 x
106 UFC mL-1) fue 30% menor a la que se obtiene con el medio de soya (218 x 106 ±
10.6 x106), esta diferencia resultó significativamente menor (P < 0.001). No obstante
la producción de esporas correspondientes a ambas condiciones (48.7 x 106 ± 4.25 x
106 UFC mL-1 y 46.7 x 106 ± 4.18 x 106 UFC mL-1, para el medio de LB y soya
respectivamente) no presentó diferencia significativa (P < 0.001).
Los resultados correspondientes a la evaluación de la TOD, señalan que los medios
de cultivo no tuvieron efecto ni en el crecimiento ni en la producción de esporas.
Cuadro 2. Crecimiento y esporulación de B. subtilis 105 en biorreactor, para los medios LB y soya, evaluando TOD < 20 % y TOD > 20 %.
Los datos representan el promedio ± DS (n=2) letras diferentes por columna en el crecimiento indican diferencias estadísticas según la prueba de una vía y una comparación múltiple por medio de la prueba Tukey (P�0.001). TOD > 20% (tensión de oxígeno disuelto menor a 20%), TOD < 20% (tensión de oxígeno disuelto mayor a 20%).
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Medios TOD (%) Crecimiento
(UFC mL-1 x106) Esporas
(UFC mL-1 x106)Esporulación
(%)
LB TOD>20% 151 + 60.3 b 48.7 + 4.25 a 32.2 ± 6.63ª
TOD<20% 82.3 + 7.61 b 11.3 + 2.84 b 13.7 ± 1.32c
Soya TOD>20% 218 + 10.6 a 46.7 + 4.18 a 21.4 ± 3.63b
TOD<20% 95.7 + 4.12 b 14.4 + 9.67 b 15 ± 2.14c
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El cuadro 2, muestra la concentración de esporas de B. subtilis correspondientes a la
figura 10 y 11. Para el medio LB, la condición de TOD � 20% permitió una
producción de esporas 4.3 veces superior a la generada con la TOD � 20%. De igual
manera, se observó que la condición de TOD � 20%, favoreció la producción de
esporas en 3.2 veces con relación a la condición de TOD � 20%.
Como se puede observar en el cuadro 2, la TOD � 20% durante el cultivo de B.
subtilis en el biorreactor, favorece el proceso de esporulación de las células,
obteniendo porcentajes de esporulación de 32% para el medio LB y de 21% para el
medio de soya. Estos valores fueron superiores a los obtenidos con la TOD � 20%
(13 y 15 % para los medios LB y soya, respectivamente).
Es posible que la limitación de oxígeno impuesta a TOD � 20% favorezca el cambio
de metabolismo de la bacteria, pasando de una condición de aerobiosis a
anaerobiosis (Nakano et al, 2007; Ongena y Jacques, 2007). Bajo esta condición la
bacteria pudiera estar sintetizando algunas sustancias bioactivas, de manera análoga
a cuando los cultivos alcanzan su fase estacionaria por limitación de nutrientes.
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6.3 Evaluación del efecto antagonista de B. subtilis cepa 105 in vitro.
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La capacidad antagonista de B. subtilis cepa 105 es una característica muy
importante para que este pueda ser usado como un agente de control biológico; esta
capacidad se puede ver afectada por las condiciones de crecimiento, de esta manera
en la figura 13 se muestran los resultados de la capacidad antagonista de los caldos
de cultivo de B. subtilis cepa 105 contra el hongo S. sclerotiorum.
Los resultados mostraron que la mayor inhibición de crecimiento del hongo se obtuvo
con los caldos de B. subtilis 105 obtenidos en la condición de TOD � 20%,
independientemente del medio utilizado. El porcentaje de inhibición para el cultivo
crecido en el medio LB fue de 39.3 ± 2.5 % y para el cultivo creado en el medio de
soya 41.4 ± 2.8 %. Mientras que los caldos de B. subtilis cepa 105 generados bajo la
condición de TOD � 20%, produjeron inhibición micelial del 30.4 ± 5.8 % el medio
LB y 29.5 ± 7.3% con el medio de soya.
Finalmente, la menor actividad inhibitoria fue la obtenida con los caldos en los
matraces, donde la actividad fue menor al 25% menor. El análisis de varianza mostró
que los porcentajes de inhibición de los caldos obtenidos en condiciones de TOD �
20% fueron significativamente mayores (P<0.001) a las obtenidas bajo condiciones
de TOD � 20% (Figura 12).
Yeh et al. (2006) reportaron que en B. subtilis la anaerobiosis favorece la formación
de compuestos con propiedades antifúngicos. Muchos de estos compuestos son
regulados por genes que se activan en condiciones anaerobias parciales (Errington
et al., 1993). Este dato es consistente con lo reportado por Tseng et al. (1996), quien
encuentra la máxima expresión de la enzima nitrato reductasa respiratoria (narGHJI)
en B. subtilis cuando el oxígeno disuelto en el medio alcanza 22 µM L-1,
correspondiente a 10% de TOD, es decir en una condición de anaerobiosis parcial.
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Figura 12. Porcentaje de inhibición micelial de S. sclerotiorum, evaluando el sistema matraz, biorreactor bajo una TOD � 20%
y TOD � 20%. Los gráficos presentados muestran promedio ± DS (n=6), letras diferentes indican diferencias estadísticas
según la prueba de una vía y una comparación múltiple por medio de la prueba Tukey (P�0.001).
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El mantener el cultivo bajo limitación de oxígeno (por debajo del 20% TOD), después
de la fase exponencial de crecimiento pudo haber inducido la formación de
compuesto bioactivos tales como micosubtilina, surfactina y plispaspatina, entre otros
(Nakano et al., 1997; Ongena et al., 2005; Pérez-García et al., 2011).
Las diferencias significativa en los porcentajes de inhibición entre la condición de
limitación de oxígeno, respecto a la condición de no limitación de oxígeno, así como
a los demás sistemas evaluados, sugiere que la inhibición del crecimiento del hongo
patógeno pudo deberse a la formación de sustancias bioactivas en los caldos de
cultivo (caldo fermentado, células vegetativas y esporas), (Ongena y Jacques, 2007;
Pérez-García et al., 2011).
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VII. CONCLUSIÓN
• Tanto en matraces Erlenmeyer, como en biorreactor, el medio denominado de
soya compuesto por componentes de bajo costo: proteína de soya, extracto
de levadura y cloruro de sodio, mostró resultados favorables para el
crecimiento y esporulación de B. subtilis cepa 105, por lo que se considera
adecuado para substituir al medio microbiológico LB.
• El nivel de oxígeno durante el cultivo de B. subtilis cepa 105 en el biorreactor,
fue determinante para el crecimiento y esporulación de la bacteria. El cultivo
crecido en el medio de soya, sin limitación de oxigeno (TOD > 20%), alcanzó
valores de 218 x 106 UFC mL-1, con una esporulación del 21 %. Pero en la
condición de limitación de oxígeno (TOD < 20 %) mostró un 43% menos de
crecimiento y con un 15 % de esporulación.
• El nivel de oxígeno del biorreactor, también afectó la actividad antagonista de
los caldos de B.subtilis, bajo la TOD < 20% se obtuvieron valores de 41% de
inhibición una contra el hongo S. sclerotium, resultado 0.46 veces superior al
obtenido bajo la TOD > 20 %.
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