cuerpo de la tesis

Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias

ABREVIATURAS

- Aβ: péptido beta-Amiloide

- ApoE: Apolipoproteína E

- BSA: Albúmina Bovina Sérica

- CV: Coeficiente de Variación

- DCL: Deterioro cognitivo leve

- DSM: Manual Estadístico y Diagnóstico de los Trastornos Mentales (The

Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)

- EA: Enfermedad de Alzheimer

- ELISA: Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay

- hk6: human Kallikrein 6

- HUCA: Hospital Universitario Central de Asturias

- Da: Daltons

- LCR: Líquido Cefalorraquídeo

- MBP: Proteína Básica de la Mielina

- NIA: Instituto Nacional del Envejecimiento, USA (National Institute on Aging)

- PARs: Receptores Activados por Proteasas (Protease-activated receptors)

- PPA: Proteína Precursora del Amiloide

- PSA: Antígeno Prostático Específico, hk3 (Prostate specific antigen)

- RM: Resonancia Magnética

- RR: Riesgo Relativo

- ROC: Curva de Rendimiento Diagnóstico (Receiver Operating Characteristic

curve)

- SNC: Sistema Nervioso Central

- STARD: Standards para la precisión diagnóstica (Standards for Reporting

Diagnostic Accuracy)

1


2


I. INTRODUCCIÓN:

1. El “Síndrome Demencia”

1.1 Definición y prevalencia

Las demencia es un síndrome clínico caracterizado por deterioro cognitivo

adquirido. De acuerdo con los Criterios DSM IV [1], para su diagnóstico requiere la

presencia de deterioro mnésico y al menos otra alteración cognitiva (afasia,

apraxia, agnosia o disfunción ejecutiva) con repercusión significativa de estos

trastornos en la vida social y/o laboral del paciente. La demencia es un síndrome

común en los adultos de más edad, afectando al 10% de los individuos mayores de

65 años. Además la prevalencia se duplica cada cinco años hasta alcanzar casi al

50% de los individuos mayores de 85 años. Se estima que en la actualidad más de

24 millones de personas en el mundo padecen demencia, cifra que previsiblemente

se duplicará cada 20 años hasta superar los 80 millones en el año 2040 [2].

Este síndrome puede ser de origen secundario o neurodegenerativo. Las

demencias de origen secundario son debidas a causas metabólicas, vasculares o

estructurales. En las demencias de origen neurodegenerativo el depósito cerebral

de ciertas proteínas da lugar a pérdida neuronal y disfunción sináptica.

En muchos casos las alteraciones histológicas y fisiopatológicas comienzan

tiempo antes de la aparición de los síntomas clínicos, pero el diagnóstico en fases

presintomáticas es difícil de alcanzar. El deterioro cognitivo leve (DCL) es una

condición considerada como un estadio transicional desde el estado de salud al de

demencia, en el que el paciente presenta un mayor deterioro cognitivo que el

esperado para su edad, pero sin ser de suficiente intensidad aún como para alterar

su capacidad funcional [3].

1.2 Diagnóstico y Diagnóstico diferencial de las Demencias

La información clave para diagnosticar una demencia procede de la historia

clínica, a través de la cual se trata de determinar de si existe o no deterioro

cognitivo de intensidad tal capaz de interferir con las actividades habituales del

paciente. Ello implica evaluar detenidamente la evolución clínica del caso

basándose, además de en los síntomas referidos por el paciente, en la información

que puedan aportar los acompañantes. También es fundamental realizar una

evaluación neuropsicológica adecuada para determinar las funciones alteradas y el

grado de deterioro existente y una exploración neurológica y general completa.

Una vez alcanzado el diagnóstico de “Síndrome demencia” el siguiente

objetivo es tratar de determinar qué enfermedad o proceso es la causa del mismo.

Para ello, la fase de anamnesis y exploración debe completarse con la realización

de una serie de pruebas complementarias con el fin de descartar en primer lugar

3


las denominadas “demencias secundarias” o “demencias tratables” que, en

ocasiones, disponen de tratamiento específico que puede resultar curativo.

La Demencia Vascular, o Demencia con Componente Vascular tal como

últimamente ha convenido en denominarse, puede considerarse una forma de

demencia secundaria, en este caso a un proceso isquémico de una o varias

regiones cerebrales que puede cursar con déficits cognitivos de muy diversa índole

por lo que a pesar de poseer unos factores de riesgo, curso evolutivo y hallazgos de

neuroimagen sugestivos suele ser causa frecuente de diagnóstico diferencial con las

demencias de origen neurodegenerativo.

También es importante identificar cuadros de origen psiquiátrico con

síntomas cognitivos. En estos pacientes los síntomas cognitivos, como pérdida de

memoria, pueden constituir el motivo de consulta. Por tanto, a este diagnóstico se

llega cuando en el contexto de un cuadro psiquiátrico se ha excluido la existencia

de un verdadero deterioro cognitivo de origen orgánico; son las denominadas

“Pseudodemencias”.

Cuando se han descartado causas secundarias el siguiente paso es tratar de

determinar qué proceso degenerativo puede ser la causa subyacente. La

Enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa de demencia más frecuente y la mejor

conocida, aunque existen otras enfermedades neurodegenerativas que pueden

causar demencia. Así, puede plantearse el diagnóstico diferencial entre las

siguientes demencias de origen neurodegenerativo: EA, Demencia por Cuerpos de

Lewy o Complejo Parkinson-Demencia, Demencia Frontotemporal, Enfermedad de

Huntington, Afasia Progresiva Primaria y Degeneración Córticobasal. Para tratar de

distinguirlas es clave la información de la historia clínica y disponer de una buena

evaluación neuropsicológica, ya que el perfil neuropsicológico de las distintas

demencias neurodegenerativas suele diferir (Tabla 1). La Enfermedad de

Creutzfeldt-Jakob es una enfermedad muy infrecuente causada por priones, de

curso rápidamente progresivo y de clínica muy variada, por lo que en su inicio

también puede plantear diagnóstico diferencial con otras causas de demencia.

Para apoyar los hallazgos clínicos sería muy beneficioso poder contar con

pruebas diagnósticas que más allá de descartar causas secundarias puedan ayudar

a identificar los procesos neurodegenerativos. Estas pruebas se denominan

biomarcadores. Los marcadores biológicos o biomarcadores son por tanto

parámetros mensurables, ya sean bioquímicos, fisiológicos o morfológicos, que se

asocian a un determinado proceso mórbido y que por tanto pueden resultar de

utilidad para su diagnóstico. Aunque en el momento actual no existen aún pruebas

diagnósticas estandarizadas que se puedan aplicar en la práctica clínica rutinaria

para diferenciar fiablemente las distintas formas de demencia, en los últimos años

4


se han multiplicado los esfuerzos por encontrar biomarcadores, tanto de

neuroimagen, como bioquímicos, para la EA y otras demencias. Destacan los

estudios de neuroimagen, tanto volumétricos como de neuroimagen funcional

mediante RM y pruebas de Medicina Nuclear, en los que se ha logrado demostrar

asociación con algunas formas de demencia. No obstante, por su complejidad

técnica o por falta de disponibilidad de equipos, su aplicación permanece aún

restringida al ámbito de la investigación.

Respecto a la búsqueda de marcadores bioquímicos, su búsqueda se ha visto

marcada por el hecho de que la neuropatología de estas enfermedades afecta

fundamentalmente al SNC, por lo que el fluido en el que se han encontrado datos

más significativos es el LCR, que si bien puede obtenerse mediante punción lumbar,

no es el fluido ideal para el estudio sistemático de los pacientes con deterioro

cognitivo. Es prioritario, por tanto, hallar una molécula cuyos niveles medidos en

fluidos periféricos (sangre u orina), se asocien con alguno de los procesos

neurodegenerativos.

De acuerdo con el Informe de Consenso del Grupo de Trabajo para la

búsqueda de biomarcadores para la EA (Molecular and Biochemical Markers of AD)

de [4], el marcador ideal de la EA debería “detectar una característica fundamental

de la neuropatología de la enfermedad, ser validado en casos confirmados mediante

estudio neuropatológico, tener una especificidad superior al 80% para detectar EA y

una especificidad superior al 80% para distinguir los casos de EA de otras

demencias. Además debería ser fiable, reproducible, no invasivo, fácil de

determinar y económico.” Algunos de estos biomarcadores ya han comenzado a

proponerse como apoyo diagnóstico para la realización de ensayos clínicos en la EA

[5] y en los criterios diagnósticos más recientes de la EA [6].

5


Entidad clínica

Historia clínica (inicial) Exploración neurológica Exploración neuropsicológica

Alteración en la memoria reciente. Desorientación espacial.

Bradicinesia, hipertonía, mioclonías (tardío).

Demencia tipo Alzheimer

Pérdida de memoria para hechos reciente con preservación de la memoria remota.

Reflejos de liberación: prensión, palmomentoniano, glabelar... (tardío).

Lenguaje alterado por dificultad para encontrar las palabras.

Cambios en la personalidad. Síntomas psiquiátricos.

Alteración de la autoconciencia.

Síntomas conductuales.

Reflejos de liberación frontal: Alteración prominente en las pruebas atencionales y en las funciones ejecutivas que requieran planificación, secuenciación, abstracción y flexibilidad mental.

Demencia Frontal

Síntomas principales: Pérdida de la higiene y cuidado personal, transgresión de las normas sociales, conducta desinhibida, sexualidad incontrolada, esterotipias, vagabundeo, hiperoralidad, falta de flexibilidad mental, distractibilidad, impulsividad.

Signos de liberación piramidal Parkinsonismo rígido-acinético (tardío). Alteración en la mirada vertical. Apraxia de la apertura palpebral. Alteración de la

autoconciencia.

Alteración en la comprensión del significado de las palabras.

Acinesia, rigidez, temblor (tardío)

Se alteran los componentes semánticos con preservación inicial de los aspectos fonológicos y gramaticales.

Afasia Progresiva Fluente o Demencia Semántica

Lenguaje espontáneo aparentemente normal o con pausas y circunloquios. Parafasias semánticas. Agnosia visual.

Acinesia, rigidez, temblor (tardío)

Se alteran los componentes fonológicos y gramaticales con preservación inicial de los aspectos semánticos.

Suele comenzar con tartamudeos o dificultar para pronunciar alguna palabra y pausas en el lenguaje oral.

Afasia Progresiva No Fluente

Anomia y Parafasias fonémicas. Anomia.

Repetición alterada. Dificultad creciente para la lectura y escritura. Alexia, agrafia.

Mutismo tardío. Relativa preservación funcional.

Signos parkinsonianos: rigidez, bradicinesia, amimia, trastornos posturales y de la marcha. Hipofonía y temblor.

Fluctuaciones acusadas en el rendimiento cognitivo.

Complejo Demencia-Parkinson y Demencia con Cuerpos de Lewy

Déficit atencional. Lentitud de pensamiento.

Cuadros confusionales. Defectos ejecutivos. Alucinaciones (visuales), ideas de perjuicio.

Defectos visuoespaciales. Defectos visuoconstructivos.

Hipersensibilidad a neurolépticos.

Caídas frecuentes. Hipotensión ortostática. Trastorno del sueño REM.

Variable, deterioro subcorticofrontal

Parkinsonismo rígidoacinético asimétrico.

Degeneración córticobasal

Parkinsonismo rígidoacinético con distonía y mioclonías focales. Negligencia motora Hiperflexión distónica

espontánea con negligencia motora y apraxia.

Apraxias focales Deterioro cognitivo subcortical Desinhibición cortical Escasa respuesta a levodopa. Disminución de la fluencia verbal fonológica.

Temblor de actitud Mioclonías reflejas Alteración supranuclear de la mirada. Piramidalismo Discinesias bucolinguales. Síndrome pseudobulbar

Déficit atencional Enfermedad de Huntington

Lentamente progresiva Corea Disfunción ejecutiva Autosómica dominante Alteraciones de la motilidad

ocular Alteraciones visuoespaciales

Trastorno motor Deterioro cognitivo Distonía, rigidez, bradicinesia

Bradipsiquia Alteraciones psiquiátricas: cambio de la personalidad

Alteración de la marcha. Déficits mnésicos.

Trastorno del comportamiento: apatía, mutismo.

Tabla 1. Principales demencias de origen neurodegenerativo con sus características clínicas y

hallazgos en la exploración neurológica y neuropsicológica más típicos [7].

6


Biomarcador Fluido biológico Método

Factibles y Principales

Proteína Tau Fosforilada LCR ELISA

Aβ total 1-42 Plasma y LCR ELISA

Proteína C Reactiva Plasma y LCR ELISA

Factor del Complemento C1q Plasma y LCR ELISA

Complejo Receptor de la Interleukina 6 Plasma y LCR ELISA

Homocisteína Plasma ELISA

PPA LCR ELISA

Nitrotirosina LCR Cromatografía Líquida

Factibles y Secundarios

Anticuerpos anti-Aβ Plasma y LCR ELISA

Glutamina Sintetasa Plasma y LCR ELISA

Proteína Ácida Fibrilar Glial LCR ELISA

Sulfátidos LCR Espectrometría de Masas

Proteína de la Cadena Neural AD7C Plasma y LCR ELISA

Neurosina Plasma y LCR ELISA

Factibilidad incierta

Aβ 1-40 Plasma y LCR ELISA

CD59 Plasma y LCR ELISA

Melanotransferrina Plasma y LCR Inmunoblot

Isoformas plaquetarias de PPA Plaquetas Inmunoblot

Proteína S100 Plasma y LCR ELISA

Tabla 2. Clasificación de los biomarcadores bioquímicos para la EA en función del grado de evidencia propuesta para su utilización en ensayos clínicos. Se recoge el fluido fuente y el método analítico empleado. Realizada en el año 2003 por el grupo de estudio de la Agencia Americana para el Envejecimiento. La neurosina plasmática (flecha) se encuentra en el grupo de los biomarcadores “factibles secundarios”. Traducido de “Biological markers for therapeutic trials in Alzheimer’s disease Proceedings of the biological markers working group” [5].

7


2. Neurosina

2.1 La Familia de las Kalikreínas

La Kalikreína tipo 6 (hk6), también conocida como neurosina, zyme o

proteasa M, fue identificada en el año 1997 como una nueva serín-proteasa que se

expresa principalmente en el cerebro [8,9]. Esta molécula es una de las que está

aportando datos más prometedores como biomarcador de la EA ya que se ha

demostrado que su concentración tanto en tejido cerebral, como en LCR y sangre

se encuentra alterada en pacientes con EA. No obstante los estudios realizados

hasta el momento incluyen un número escaso de pacientes y no se han incluido

pacientes con otros tipos de demencia, por lo que no se ha podido estimar la

sensibilidad y especificidad de esta prueba, ni se ha estudiado su concentración

plasmática en individuos sanos, y por tanto, es aún desconocida su utilidad como

prueba diagnóstica.

Las Kalikreínas son una familia de serín-proteasas cuyo peso molecular

oscila entre 27 y 40 kDa. cuyo locus se está situado en el brazo largo del

cromosoma 19 en la región 13.4 [Figura 1]. Se dividen en dos grupos: las

plasmáticas y las tisulares, que difieren tanto en peso molecular como en

especificidad de substrato, características inmunológicas y estructura génica. Las

Kalikreínas plasmáticas son sintetizadas exclusivamente en el hígado y están

implicadas en coagulación, fibrinolisis, regulación de la presión arterial y reacciones

inflamatorias [10] y su centro activo adopta la conformación típica de la tripsina

[11]. Las Kalikreínas tisulares son una subfamilia de 15 serín-proteasas con un alto

grado de especificidad de substrato y variada expresión en diversos tejidos y fluidos

biológicos (Figura 2).

8


Figura 1. Características de la estructura del locus (a), gen (b) y proteína (c) de las kalikreínas. a. El locus KLK se expande ~300 kb en el brazo largo del cromosoma 19 en la región 13.4. Los genes de las Kalikreínas clásicas (KLK1, KLK2 y KLK3/PSA) están representados por flechas rojas, las Kalikreínas 4-16 por flechas azules y el pseudogen de la kalikreína 1 por una flecha amarilla. La dirección de transcripción es desde telómero a centrómero con excepción de KLK2 y KLK3. b. Los genes KLK tienen una longitud variable de entre 4 y 10 kb y en todos ellos consisten en 5 exons codificantes y 4 intrones con una fase patrón conservada (I, II, I, 0). La longitud de los exones codificantes (rectángulos amarillos) son similares en los distintos genes KLK si bien la longitud de los intrones varía considerablemente. Las posiciones de los codones para los residuos catalíticos del centro activo se encuentran muy conservadas, con el codón de la Histidina (H) próximo al final del segundo exón, el codón del ácido aspártico (D) en centro del tercer exón y el codón de la serina (S) al comienzo del quinto exón. La mayor parte de los genes KLK, con excepción de los genes de las kalikreínas clásicas, también tienen uno o dos exones no codificantes (rectángulos rojos) en la región 5’ no transcrita (UTR). La región no transcrita 3′ varía en longitud. c. Las kalikreínas son proteínas de cadena simple sintetizadas como pre-proenzimas que contienen una secuencia aminoterminal (Pre) que las dirige al retículo endoplásmico para su secreción y un propéptido (Pro) que las mantiene como precursores inactivos (zymógenos). Modificado de Borgoño [12].

9


Figura 2. Representación esquemática de la expresión tisular de las kalikreínas en varios tejidos humanos. Los niveles más altos se señalan en negrita. Tomado de Yousef [13].

10


2.2 Expresión de la neurosina

La neurosina es una serín-proteasa de 244 aminoácidos y un peso molecular

de 26856 Da “similar a tripsina” como demuestran los datos de cristalización [14]

[15] (Figura 3).

A B

Figura 3: Representación tridimensional de la neurosina. A. Los residuos catalíticos semuestran como bolas y barras. La histidina 57 en azul, el ácido aspártico 102 en rosa y laserina 195 en naranja. B. Regiones en bucle que rodean el sitio activo: 92–102 (azul), 141–152 (rosa) y 172–178 (verde). Tomado de Bernett [9].

11


El gen de la neurosina se

encuentra localizado en el cromosoma

19q13.3-q13.4, y está compuesto de 7

exones de los cuales los dos primeros

no se transcriben [16]. Tiene una pauta

abierta de lectura de 732 pares de

bases que codifican una proteína de

244 aminoácidos sintetizada como pre-

pro-hK6. Una vez el péptido señal es

liberado la pro-hK6 es secretada al

medio extracelular, donde un nuevo

corte produce la forma activa de 223

aminoácidos. Se ha señalado que la

propia neurosina puede provocar su

propia activación e inactivación [14, 17,

18] (Figura 4). Sin embargo la

capacidad de la propia neurosina de ejecutar estos pasos se ha puesto en duda y es

objeto de debate [14, 18, 19].

Figura 4. Representación esquemática de los 2 pasos autoproteolíticos que llevan a la maduración de pro-hk6 (activación) y la subsecuente autoinactivación de la misma (Modificado de Bayés).

La neurosina se expresa en el sistema nervioso central, epitelio glandular de

mama, próstata, riñón, endometrio, colon, apéndice, glándulas salivares, conductos

biliares y vejiga, intestino delgado, estómago, endocervix, trompa de Falopio,

epidídimo, bronquios, tracto respiratorio superior y en células endoteliales, nervios

periféricos y algunas células neuroendocrinas (incluyendo los islotes de Langerhans,

células de la porción anterior de la hipófisis y la médula adrenal) [20, 21] (Figuras

2 y 5). El órgano donde más neurosina se expresa es el cerebro; en concreto se ha

encontrado en el epitelio del plexo coroideo, en la corteza cerebral, en el cerebelo y

en el hipocampo [20].

12


Figura 5. Intenso inmunomarcaje de neurosina (cabezas de flecha) en el epitelio del plexocoroideo (A) y (B). Inmunoexpresión de neurosina en neuronas (C). Inmunoexpresión de neurosina en nervio periférico (D). Anticuerpo policlonal, magnificación x200. Tomado de Petraki [21].

13


2.3 Actividad enzimática de la neurosina

Como se ha dicho, la neurosina es una de las kalikreínas tisulares y por

tanto su presencia en los fluidos biológicos se debe a difusión a éstos desde los

tejidos. La neurosina presente en liquido cefalorraquídeo corresponde a la proteína

completa (proenzima) sin procesamiento de la región pro como lo demuestra el

hecho de que su secuencia N-terminal sea Glu-Glu-Gln-Asn-Lys y por lo tanto

presumiblemente inactiva [15, 22].

Algunas de las proteínas descritas como sustratos de la neurosina son la

proteína básica de la mielina (MBP) [19], el plasminógeno [17], la α1-antitripsina,

la proteína precursora del amiloide (PPA) [19] y el receptor ionotrópico del

glutamato [23].

La neurosina posee la actividad proteolítica propia de las kalikreínas. En las

secuencias de substrato existe exclusividad para la Arginina en P1 y alta

especificidad para Serina en P1’ [23]. Las principales secuencias sustrato de la

neurosina se recogen en la Tabla 3.

Sustrato Punto de Corte

Boc-Gln-Ala-Arg-NHMec Boc-Gln-Ala-Arg+NHMec

Boc-Phe-Ser-Arg-NHMec Boc-Phe-Ser-Arg+NHMec

Boc-Val-Pro-Arg-NHMec Boc-Val-Pro-Arg+NHMec

Bz-Arg-NHMec Bz-Arg+NHMec

Tos-Gly-Pro-Arg-NHMec Tos-Gly-Pro-Arg+NHMec

Tos-Gly-Pro-Lys-NHMec Tos-Gly-Pro-Lys+NHMec

Tabla 3: Secuencias de algunos de los puntos de corte conocidos de la neurosina. Fuente: MEROPS. Identificador Peplist PL00322.

La unión al sustrato se produce en la proximidad del centro activo de la neurosina.

Para ello, la Arginina forma puentes de Hidrógeno con los residuos Asp189, Ser190 y Asn217

[14, 23, 24] (Figuras 6 y 7).

14


Figura 6. Diagrama propuesto mediante simulación para la unión de la neurosina al sustrato alrededor del centro activo. A. La Arginina es responsable de realizar puentes de Hidrógenocon los residuos Asp189, Ser190 y Asn217 que constituyen el principal dominio activo de laneurosina. A. Tomado de Li [23]. B. Tomado de Bernett [9].

B A

Figura 7. Unión del péptido al sustrato en orientación standard. A, sitio activo de corte junto a un sustrato hexapeptídico (P4-Val-P3-Ala-P2-Arg-P1-Arg- -P1'-Ala-P2'-Ala). B, sitio activo de corte, representado como superficie sólida coloreada de acuerdo con lospotenciales electroestáticos de superficie (azul estremo positivo y rojo extremo negativo),junto al hexapéptido VARRAA que se une a los sitios S4 a S2'. Tomado de Debela [24]

15


2.4 Neurosina y PARs

Recientemente se ha descubierto la relación de las Kalikreínas con los PARs

(receptores activados por proteasas). Los PARs constituyen una familia de

receptores acoplados a proteína G que funcionan a través de un mecanismo único

de activación mediante corte proteolítico de su extremo amino terminal exponiendo

así un ligando peptídico [25] (Figura 8). Se sabía que los PARs 1-4 son activados

por hidrólisis de la trombina (PAR-1 y PAR-3), de la tripsina (PAR-2) o tanto por la

tripsina como por la trombina (PAR-4) [26], pero recientemente se ha demostrado

que las kalikreínas también activan los PAR [27, 28] y por tanto deben considerarse

como importantes reguladores “hormonales” de la función tisular.

Figura 8. Estructura y mecanismo de activación de los PARs por las tripsinas cerebrales. Los PARs tienen siete dominios transmembrana en hélice y una hélice adicinal C-terminal intracelular. El corte proteolítico mediante serín-proteasas, tales como la neurosina, se expone un nuevo dominio N-Terminal que actúa como ligando proteico (segmento en caja) que puede intereactuar con el segundo bucle extracelular (línea de puntos) alterando la conformación del receptor, lo que facilita el acoplamiento de los bucles intracelulares 2 y 3 del PAR con la proteína G que transmite las señales intracelularmente. Tomado de Wang [29].

La neurosina hidroliza PAR 1 y 2 en una secuencia de su extremo amino

terminal [19] produciendo su activación o inactivación dependiendo del punto

exacto de corte [26].

Los PARs 1-4 se expresan ampliamente en el SNC y de forma similar a lo

que sucede con la neurosina, las mayores densidades de PAR-2 se encuentran en

hipocampo, córtex, amígdala, tálamo, hipotálamo y estriado [26] asociada en

ocasiones a áreas de neurodegeneración [30].

16


La PAR2 se ha implicado en la inflamación mediante mecanismos

neurogénicos [31, 32] y contribuye a la regulación del tono vascular [32, 33]

siendo

rodegenerativas

iversos estudios han estudiado los mecanismos fisiopatológicos por los que

la neur :

de Lew

un potente mecanismo vasodilatador en las arterias cerebrales mediante la

producción endotelial de óxido nítrico [34, 35].

2.5 Implicación de la neurosina en las enfermedades neu

D

osina podría estar implicada en algunas enfermedades neurodegenerativas

Sinucleínpatías: La acumulación de agregados de alpha-sinucleína en el

cerebro es característica de la Enfermedad de Parkinson, la Demencia con cuerpos

y y la Atrofia multisistema. En estas enfermedades la neurosina parece

colocalizarse con la sinucleína (Figura 9) [36]. En condiciones basales la neurosina

se localiza intracelularmente en las mitocondrias y microsomas, siendo la

localización nuclear y citosólica baja. Se ha demostrado que cuando las células son

expuestas a estímulos estresantes se produce una liberación de fragmentos de

alpha-sinucleína y neurosina hacia el citosol [36]. Estudios in vitro muestran que la

neurosina previene la polimerización de esta proteína gracias a que reduce la

cantidad de monómeros y genera fragmentos con capacidad de inhibir la

polimerización [36, 37]. Mas interesante aún, otro estudio in vitro muestra que

ciertas formas mutantes y fosforiladas de la alpha-sinucleína que se expresan en la

Enfermedad de Parkinson son resistentes a la actividad de la neurosina [38].

Figura 9. Colocalización de inmunoreactividad para neurosina y alpha-sinucleína en el cerebro de ratón en la región azonal terminal. Las flechas señalan uno de los muchos puntos de colocalización de ambas proteínas. Bar=20 µm Tomado de Iwata [36].

17


Amiloidopatías: Cuando el gen de la neurosina se coexpresa con el de la PPA

(Proteína Precursora del Amiloide) en células de la línea 293 (riñón de embrión

humano), se detectan fragmentos amiloidogénicos y las células liberan gran

cantidad de péptido Aβ truncado con disminución de los residuos 17-42 [8] (Figura

10).

Además, la neurosina es capaz de

cortar el dominio N-terminal de la PPA

en tres sitios distintos [18], por lo que

podría contribuir a la acumulación

cerebral de Aβ en la EA.

Parece confirmado que existe

disminución de la expresión de neurosina

en las áreas parénquima cerebral con

neuropatología EA [37, 38]. De acuerdo

con los estudios de Zhang [40] la

prekalikreína6 está aumentada en el LCR

de pacientes con EA (el doble que en

controles de la misma edad), y no así en

pacientes con PD ni con Demencia por

cuerpos de Lewy, lo que podría indicar

que en la EA puede existir una alteración

de la conversión de prehk6 a hk6 [41,

42], ya que la hk6 está disminuida en

LCR [22].

Figura 10. Detección de fragmentos amiloidogénicos en células transfectadas con fragmentos de cDNAs de PPA y neurosina. Western blot: línea a, control; línea b, neurosina; línea c, PPA 695; línea d, PPA 695 y neurosina, línea e, PPA 751 y línea f, PPA 751 y neurosina. Tomado de Little [8].

18


3. Justificación del tema

A la luz de lo expuesto en las páginas precedentes es evidente el beneficio

que supondría poder contar con pruebas diagnósticas que puedan asistir en el

diagnóstico de alguna de las enfermedades que causa demencia y/o predecir la

progresión de DCL a demencia.

Como marcadores bioquímicos han sido muchas las moléculas ya

estudiadas, algunas con resultados favorables (Tabla 2). Sin embargo, por diversos

motivos ninguna de ellas ha sido trasladada aún del ámbito de investigación a la

práctica clínica rutinaria. Hasta el momento actual el marcador bioquímico que

mayor utilidad ha demostrado para el diagnóstico de una enfermedad causante de

demencia es la cuantificación conjunta de proteína Aβ y proteína tau fosforilada en

LCR; que ofrece una sensibilidad y especificidad próxima al 90% para el diagnóstico

de EA. Sin embargo, la necesidad de realizar una técnica cruenta como es una

punción lumbar ha condicionado que este método no sea de uso rutinario en la

práctica clínica habitual. Otras moléculas cuantificadas en plasma u orina no

disponen de estudios completos de validación como prueba diagnóstica para el

diagnóstico diferencial de las demencias, ya que no disponen de resultados en un

número suficiente de controles y de pacientes con demencias de diverso origen.

Éste era el caso de la neurosina.

El planteamiento de este estudio parte de un escenario real, en el que el

screening de los pacientes se realiza a partir de la detección de la clínica que tienen

en común todos estos ellos: la presencia síntomas cognitivos. Es a partir de la

detección de estos síntomas cuando se plantea el problema del diagnóstico

diferencial de la enfermedad subyacente y la situación donde se percibe el vacío

actual de pruebas diagnósticas que sirvan de apoyo para lograr este objetivo.

Animados por los resultados de estudios previos, nos propusimos evaluar la

utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial del

deterioro cognitivo. Como hemos visto, la neurosina es una proteasa de expresión

tisular, preferentemente cerebral, a la que tanto los estudios de investigación

básicos como los estudios clínicos iniciales adjudican un papel en las demencias

neurodegenerativas. De este modo otros grupos señalan diferencias en la

concentración de esta proteína en tejido cerebral, sangre y LCR de pacientes con EA

respecto a controles. En todo caso permanecían sin estudiar la variación con la

edad de la concentración plasmática de neurosina en individuos sanos, las

diferencias de concentración en las distintas entidades causantes de deterioro

cognitivo y la validez de la medición de concentración de neurosina como prueba

para la predicción evolutiva de pacientes con DCL y para el diagnóstico diferencial

de las demencias.

19


Tomando como hipótesis de trabajo que la cuantificación plasmática de

neurosina podría variar entre algunas de las enfermedades causantes de demencia

investigamos de modo prospectivo la correlación entre los niveles de esta molécula

y el diagnóstico final de un grupo de pacientes con síntomas cognitivos con diversos

diagnósticos clínicos.

Los conocimientos derivados de estas investigaciones determinarán en qué

situaciones clínicas la cuantificación plasmática de neurosina puede ser de utilidad

en el diagnóstico diferencial entre entidades causantes de deterioro cognitivo y por

tanto si puede ser una variable más a añadir en los protocolos diagnósticos del

síndrome demencia.

20


II. OBJETIVOS

En el presente trabajo de investigación y una vez analizado en profundidad

el estado actual del problema, nos hemos planteado los siguientes objetivos:

Objetivos generales

1. Estudiar la utilidad de la medición de la concentración plasmática de

neurosina en el diagnóstico diferencial del deterioro cognitivo de

origen vascular, degenerativo o psiquiátrico.

2. Estudiar la utilidad de la medición de la concentración plasmática de

neurosina como factor pronóstico en pacientes con Deterioro

Cognitivo Leve.

Objetivos específicos

Objetivos específicos para el objetivo general número 1

a. Determinar si la concentración plasmática de neurosina varía con la

edad en individuos sanos.

b. Determinar si la concentración plasmática de neurosina difiere entre

pacientes con deterioro cognitivo de distinto origen y controles.

c. Determinar si la concentración plasmática de neurosina difiere entre

pacientes con deterioro cognitivo de distinto origen.

d. Determinar si la concentración plasmática de neurosina varía en las

distintas fases evolutivas de la Enfermedad de Alzheimer.

e. Determinar en qué situaciones clínicas la cuantificación plasmática de

neurosina puede ser de utilidad en el diagnóstico diferencial entre

entidades distintas causantes de deterioro cognitivo.

Objetivos específicos para el objetivo general número 2

a. Determinar si una única medición de la concentración plasmática de

neurosina es de utilidad como factor pronóstico en pacientes con

Deterioro Cognitivo Leve.

b. Determinar si la evolución de la concentración plasmática de

neurosina es un parámetro de utilidad para establecer el pronóstico

de pacientes con Deterioro Cognitivo Leve.

21


METODOLOGÍA

1. Diseño:

No experimental (observacional), prospectivo, cuantitativo, casos y controles

no pareados. Se han seguido los estándares y recomendaciones de la iniciativa

STARD [43, 44] para la validación de pruebas diagnósticas.

2. Sujetos de estudio:

2.1 Muestreo, reclutamiento y selección de pacientes:

Se siguió un método de muestreo y reclutamiento consecutivo; en el que a

partir de la fecha de inicio del estudio (Enero 2003) a todos los pacientes

estudiados por Unidad de Demencias del Hospital Universitario Central de Asturias

(HUCA) que cumplían el criterio de screening y ningún criterio de exclusión se les

propuso participar en el estudio (Tabla 4). El periodo de reclutamiento fue de 36

meses.

2.2 Criterio de screening:

Pacientes con síntomas cognitivos en los que se sospecha origen vascular,

degenerativo o psiquiátrico.

2.3 Criterios de inclusión:

Se incluyeron directamente tras el screening todos los pacientes con

Deterioro Cognitivo Leve sin criterios de exclusión. Pacientes en los que tras al

menos un año de seguimiento se establece el diagnóstico de EA, Demencia por

Cuerpos de Lewy o Parkinson-Demencia, Demencia Frontotemporal, Enfermedad de

Huntington, Afasia Progresiva Primaria, Degeneración Córticobasal, Enfermedad de

Creutzfeldt-Jakob o Enfermedad Psiquiátrica con síntomas cognitivos.

2.4 Criterios diagnósticos y de estadiaje:

El diagnóstico de las enfermedades se estableció según los siguientes

criterios: Criterios NINCDS-ADRDA [45] para la enfermedad de Alzheimer, criterios

del Consortium on Dementia with Lewy Bodies [46] para la demencia por cuerpos

de Lewy, criterios de Manchester y Lund [47] para la demencia frontotemporal,

Criterios NINCDS-AIREN [48] para el diagnostico de Demencia Vascular (Demencia

con Componente Vascular), criterios de la OMS para Enfermedad de Creutzfeldt-

Jakob [49], Criterios DSM-IV para el diagnóstico de los cuadros psiquiátricos con

síntomas cognitivos (Pseudodemencia) [1], criterios de Petersen para DCL [3]. El

diagnóstico de enfermedad de Huntington se realizó por confirmación genética.

22


El estadiaje de la enfermedad de Alzheimer (1-6) se realizó según los

criterios GDS-FAST-BCRS [50]. Controles: GDS1, DCL: GDS3, EA leve: GDS4, EA

moderada: GDS5, EA severa: GDS6.

2.5 Criterios de exclusión:

• Pacientes con algún tipo de “demencia tratable” (tumoral,

hidrocefalia, carencial, tóxica o asociada a otras enfermedades).

• Pacientes con enfermedad oncológica conocida.

• Pacientes con alteración de la función hepática o renal (en los que

puede alterarse la metabolización o aclaramiento de proteínas

plasmáticas).

• No obtención del consentimiento informado por el paciente o tutor del

mismo.

2.6 Muestras procedentes de otros centros:

Ante la previsión de reclutar un número muy escaso de muestras de

Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, y conscientes de que se trata de un

procedimiento de reclutamiento con menor validez metodológica ya que estos

sujetos no siguieron el protocolo general del estudio, solicitamos a un centro de

referencia (Hospital Clinic i Universitari de Barcelona) muestras de sujetos con esta

enfermedad, de las que nos facilitaron 29 muestras procedentes de pacientes que

habían sido diagnosticados con Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob probable (n=11) o

definitiva (n=18).

2.7 Fuentes de controles

Los controles se obtuvieron de dos fuentes distintas: a) individuos sanos o

pacientes estudiados en consulta de Neurología del HUCA por patología del sistema

nervioso periférico, sin evidencia de patología del sistema nervioso central o

acompañantes sanos (esposos) de los pacientes de edad superior a 60 años, b)

muestras procedentes del Centro Comunitario de Sangre y Tejidos (HUCA), de edad

entre 18 y 60 años.

23


Controles Consulta de Neurología (HUCA) (> 60 años) 70 Centro Comunitario de Sangre (< 60 años) 158

Total de controles incluidos 228 Pacientes Screening en consulta de neurología (HUCA) 633

- Perdidos / No reclutables 186 Pacientes incluidos desde consulta (HUCA) 418 Muestras del Hospital Clinic 29

Total de pacientes incluidos 447 Tabla 4. Resumen de las fuentes y número de controles y pacientes reclutados.

24


3. Metodología clínica:

Para el estudio de pacientes con deterioro cognitivo se siguieron las

recomendaciones de la Academia Americana de Neurología [51]. El diagnóstico se

estableció en todos los casos, excepto en los pacientes con DCL, a los 12 meses de

la inclusión del sujeto en el estudio. En los pacientes con DCL el diagnóstico se

estableció en cuanto se realizó la evaluación y las pruebas complementarias.

3.1 Estudio clínico de los pacientes

Se empleó un protocolo que incluye: anamnesis completa, exploración física

general y neurológica, evaluación neuropsicológica con Test Generales (MMSE de

Folstein [52], Subtest de Memoria del Test Barcelona Abreviado [53]) y específicos

(orientados en función de la sospecha diagnóstica); evaluación funcional: Escala de

Blessed [54]; test de despistaje de enfermedad psiquiátrica: Inventario

Neuropsiquiátrico de Cummings [55] y Escala de depresión geriátrica de Yesavage

[56].

3.2 Pruebas complementarias realizadas

A todos los pacientes se les realizaron las siguientes pruebas

complementarias: hemograma, bioquímica general, TSH, acido fólico, vitamina B12,

serología lúes y Lyme (realizados en los servicios de Bioquímica, Microbiología del

HUCA) y prueba de neuroimagen: Tomografía computerizada y/o Resonancia

Magnética Craneal (en el Servicio de Radiología del HUCA).

En casos seleccionados se realizaron otras pruebas que se consideraron

necesarias para alcanzar el diagnóstico, tales como genética para Enfermedad de

Huntington, medición de niveles de homocisteína, vitamina A, ceruloplasmina y

electroencefalografía.

A todos los pacientes con el diagnóstico de EA se les determinó el genotipo

ApoE en el laboratorio de Genética Molecular del HUCA.

3.3 Seguimiento de pacientes con DCL

Los pacientes con DCL fueron seguidos durante 18 meses con visitas cada 6

meses en las que se realizaba una reevaluación funcional. Al final del seguimiento

se repitió el estudio de neuroimagen y evaluación neuropsicológica completa. Con

todos estos datos, junto a la valoración clínica, se reconsideró el diagnóstico del

paciente.

25


4. Obtención de muestras y metodología de laboratorio para la

cuantificación de neurosina:

La obtención de las muestras de sangre y las condiciones de

almacenamiento fueron idénticas para todos los sujetos incluidos en el estudio

excepto para las muestras remitidas desde el Hospital Clinic de Barcelona. Las

muestras de sangre se obtuvieron en el servicio de extracciones del Hospital

Universitario Central de Asturias, en tubo de tapón rojo (sangre coagulada) y en

cantidad de 10 ml. Las muestras se procesaron para obtener el suero en el

laboratorio de nuestro hospital del modo siguiente: se permitió la coagulación

durante 30 minutos, se centrifugó la muestra durante 10 minutos a 3,500 g. Se

recogió el sobrenadante y se hicieron varias alícuotas de la muestra de 5 ml que se

congelaron a -80º C. Se obtuvo una segunda muestra a los 18 meses de la primera

en 36 pacientes con DCL de los 66 a los que se les realizó seguimiento.

La determinación de las concentraciones séricas de neurosina se realizó en el

Servicio de Inmunología del HUCA. Se utilizó un inmunoensayo comercializado (Kit

para hk6) de IBEX (human kallikrein 6 research ELISA, IBEX, Canada) con dos

anticuerpos monoclonales de ratón siguiendo las instrucciones del proveedor. Este

inmunoensayo no presenta inmunoreactividad cruzada con otras kallikreínas y tiene

una precisión con un margen de error inferior al 4%. El kit está basado en un

inmunoensayo previamente descrito por Diamandis y cols. [57]. Consiste en un

inmunoensayo tipo “sandwich” en el que se utiliza neurosina recombinante

standard, un anticuerpo monoclonal antineurosina de ratón y un segundo

anticuerpo monoclonal antineurosina conjugado con biotina; ambos dentro de una

matriz estabilizante con BSA. La unión del anticuerpo biotinilado se detectó

mediante la unión de un conjugado de estreptavidina con el enzima peroxidasa y la

adición de tetrametilbenzidina. Los dos anticuerpos monoclonales de neurosina de

ratón usados en este inmunoensayo son específicos para la neurosina y no

muestran inmunoreactividad cruzada contra las kalikreínas recombinantes humanas

purificadas 2, 3 (PSA), 5, 8, 10 y 13. La precisión intra-ensayo de este ELISA es

CV<3.97 y la precisión interensayo es CV< 7.22. La curva standard se generó con

diluciones standard de neurosina recombinante entre 0.2 y 20 ng/ml.

5. Recogida de Datos y Variables

Los datos de los pacientes se ordenaron consecutivamente por orden de

inclusión en forma de doble registro anonimizado mediante bases de datos

disociadas: una con número de historia y código y otra con código y datos.

26


Los datos de los resultados de laboratorio se recogieron inicialmente en cuaderno y

posteriormente se introdujeron en el programa informático SPSS 14.1 junto al

código del paciente.

5.1 Variables Primarias:

• Diagnóstico: para todos los individuos incluidos en el estudio se

realizó un diagnóstico (único y excluyente) que representa una

variable cualitativa nominal que se codificó numéricamente. En los

pacientes con DCL además del diagnóstico inicial se recogió el

diagnóstico a los 18 meses de seguimiento.

• Valor de la concentración sérica de neurosina: variable cuantitativa

continua. Se ha recogido su valor incluyendo dos decimales

5.2 Variables Secundarias:

• Edad: variable cuantitativa discontinua, su valor se ha recogido en

números enteros (sin decimales ni fracciones).

• Sexo: variable dicotómica que se codificó: 1:hombres, 2:mujeres

• Genotipo ApoE: es el genotipo Apo E, que representa una variable

cualitativa nominal que permite 6 posibilidades genotípicas como

combinación de 2 alelos de 3 tipos, se codificó: 1:2,2; 2:2,3; 3:2,4;

4:3,3; 5:3,4 y 6:4,4

6. Análisis estadístico

Para el análisis estadístico se ha utilizado el programa informático SPSS,

versión 14.1 bajo el asesoramiento de la unidad de investigación y estadística de la

Oficina de Investigación Biosanitaria del Principado de Asturias.

Mediante T de Student para comparación de medias se comparó la edad

media de controles y pacientes con EA. Se realizaron test Chi-cuadrado para

evaluar las diferencias en la distribución por sexo en controles y pacientes con EA.

Mediante el test de Kolmogorov-Smirnov se comprobó que la concentración

plasmática de neurosina sigue una distribución normal en pacientes y controles.

Mediante el coeficiente de correlación de Pearson se estudió la correlación de la

concentración plasmática de neurosina y la edad de pacientes y controles. Mediante

test T de Student se comparó si existen diferencias en la concentración media de

neurosina entre controles mayores y menores de 60 años y entre sexo masculino y

femenino tanto en controles como en pacientes con EA, también se comparó la

media en pacientes con EA portadores de un alelo E4 con los no portadores de alelo

27


E4. Mediante test ANOVA y corrección de Bonferroni se compararon las medias de

las concentraciones plasmáticas de neurosina entre todos los grupos.

Se calculó la sensibilidad, especificidad y valores predictivo positivo y

negativo de la prueba en el diagnóstico diferencial entre aquellos grupos

diagnósticos cuyas medias mostraron diferencias significativas. El valor de corte

óptimo se ha determinado hallando el punto con mejor valor promedio de

sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de EA. Se crearon curvas ROC con

ayuda del programa Rockit 09.1beta y se calculó el área bajo la curva de esta

prueba para la EA.

Mediante test ANOVA y corrección de Bonferroni se compararon las medias

de concentración de neurosina entre los distintos grupos de DCL tras el

seguimiento. Se realizaron tests Chi-cuadrado con dos grados de libertad para

determinar si hay relación entre la existencia de progresión clínica y los niveles

plasmáticos de neurosina dicotomizados en “altos” y “bajos”. Se realizó un análisis

de regresión logística para determinar la probabilidad de cada diagnóstico en

función de los niveles dicotomizados de neurosina corrigiendo los resultados para

las variables demográficas sexo y edad.

Finalmente se correlacionó, mediante el coeficiente de correlación de

Pearson, los niveles de neurosina con el estadio evolutivo de EA.

7. Consideraciones éticas y legales

Este proyecto de investigación fue aprobado por los Comités de

Investigación y Ético del Hospital Universitario Central de Asturias (HUCA).

Este estudio se ha regido por las bases éticas del Convenio de Oviedo

siguiendo sus normas de información y consentimiento informado, y por los

principios de la Declaración de Helsinki, del Consejo de Europa relativo a los

derechos humanos y la biomedicina, de la Declaración Universal de la UNESCO

sobre los derechos humanos y los requisitos de la legislación española incluyendo la

“Ley de investigación con seres humanos”.

Los datos se han tratado con carácter confidencial. La identidad de los

pacientes se ha salvaguardado mediante la creación de un registro disociado y se

ha cumplido la normativa de la Ley de Protección de Datos.

28


29

II. RESULTADOS

1. Descripción de la muestra

1.1 Características de los individuos incluidos

Inicialmente se incluyeron 633 individuos en el screening del estudio, de los

cuales 186 no cumplieron finalmente los criterios de inclusión o fueron perdidos

durante el seguimiento inicial (Tabla 4). Además se incluyeron las muestras de 228

controles y muestras de 27 pacientes con Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob

procedentes del Hospital Clínico de Barcelona. Por lo tanto se estudiaron muestras

de 675 individuos, 423 mujeres y 252 hombres repartidos en los grupos

diagnósticos descritos en la Tabla 5.

Tabla 5. Distribución de la muestra en grupos diagnósticos y variables demográficas.

En el grupo “otras” se incluyen 6 pacientes en los que inicialmente se había

diagnosticado enfermedad psiquiátrica pero cuyo curso evolutivo fue hacia

demencia que no se ha podido clasificar en el momento de finalizar el estudio.

Frecuencia Edad Sexo

Femenino Masculino N % Media

Desviación

Standard N % N %

Controles 228 33.8 50.24 17.77 143 21.18 85 12.59

• Mayores de 60 años 70 10,3 77,84 7,88 41 6,07 29 4,29

• Menores de 60 años 158 23,4 38,05 21,54 102 15,11 56 8,29

Enfermedad de Alzheimer 199 29.4 80.01 6.76 130 19.25 69 10.22

• EA leve 84 12.4 79.02 6.99 48 7.11 36 5.33

• EA moderada 79 11.7 80.50 6.57 58 8.59 21 3.11

• EA severa 36 5.3 81.25 6.50 24 3.55 12 1.77

Deterioro Cognitivo Leve 68 10.1 76.30 8.30 47 6.96 21 3.11

Demencia con comp. Vasc. 80 11.8 75,36 8,67 38 5,62 42 6,22

• Demencia mixta 28 4.1 77.14 7.97 18 2.66 10 1.48

• Demencia vasc. 52 7.7 74.40 10.72 20 2.96 32 4.74

Demencia Frontotemporal 20 3.0 75.00 9.52 10 1.48 10 1.48

Pseudodemencia 18 2.7 73.11 9.00 13 1.92 5 0.74

Afasia Progresiva Primaria 6 0.9 73.83 6.79 4 0.59 2 0.29

Demencia con C. de Lewy 18 2.7 75.72 12.56 11 1.62 7 1.03

Enfer. de Creutzfeldt-Jakob 29 4.3 64.89 10.89 21 3.11 8 1.18

Degeneración Corticobasal 2 0.3 74.00 15.55 1 0.14 1 0.14

Enfermedad de Huntington 1 0.1 70.00 0 1 0.14 0 0

Otras 6 0.8 80.33 6.47 4 0.59 2 0.29

Total 675 100.0 67.85 17.92 423 62.66 252 37.33


1.2 Diferencias de edad y sexo entre controles y pacientes

Para evaluar si existen diferencias en la edad y el sexo de pacientes con EA

y controles comparamos en ellos la distribución de estas variables. Los resultados

demuestran que no hay diferencias significativas en el sexo entre controles y

ningún tipo de demencia (para grupos diagnósticos con n≥25). Sin embargo, sí hay

diferencias significativas en la edad entre controles y todos los grupos de pacientes

(p=0.014) lo que podría ser fuente de sesgos. Por ello, para las comparaciones de

niveles de neurosina entre casos y controles, se tomaron como controles el grupo

de controles mayores de 60 años.

1.3 Evolución diagnóstica de los pacientes con DCL

De los 68 pacientes con DCL incluidos se consiguió seguir a 66 hasta 18

meses tras el diagnóstico. Se mantuvieron estables 30 casos (45,4%). Veintitrés

pacientes (34,8%) desarrollaron EA (de acuerdo con los criterios NINCDS-ADRDA

[45]) y 13 (19,7%) desarrollaron Demencia con Componente Vascular (de acuerdo

con los criterios NINCDS-AIREN [48]). Por tanto, la tasa global de conversión anual

(porcentaje de pacientes que evolucionan de DCL a demencia en un año) fue

36,4%.

2. Neurosina en controles

2.1 Correlación de los niveles de neurosina con la edad en controles

El valor medio de neurosina en el grupo control fue 4,44 ng/ml. Dado que las

demencias son un trastorno asociado a la edad, valoramos si en los sujetos sanos

la concentración de neurosina también variaba con la edad. Efectivamente, existe

una correlación positiva entre estas variables (Factor de correlación de Pearson:

0,362, RSQ= 0,131, significación bilateral p<0,001). Tal como se muestra en la

Figura 12, a mayor edad de los controles, mayor nivel de neurosina. Las diferencias

en los niveles de neurosina en los controles mayores de 60 años (valor medio de

neurosina 5,52 ng/ml) y en los menores de 60 años (valor medio 3,97 ng/ml)

difieren significativamente (p=0,027) (Figura 11).

30


Figura 11. Diagrama de cajas representando la comparación de valores medios de neurosina entre el grupo de controles menores de 60 años y el de controles mayores de 60 años. Existen diferencias significativas (p=0,027).

2.2 Influencia del sexo sobre los niveles de neurosina

Los valores medios de neurosina en controles, tanto en mayores como en

menores de 60 años fueron muy similares en hombres y mujeres (Tabla 6) y no

existieron diferencias significativas (p=0,681 para menores de 60 años y p=0,772

para mayores de 60 años), por lo que el sexo no es una variable que influya sobre

los niveles de neurosina en controles en ningún rango de edad.

Menores de 60 años Mayores de 60 años Sexo n media Desv. Std. n media Desv. Std. Masculino 56 4,01 2,06 29 5,55 1,01 Femenino 102 3,95 2,01 41 5,48 1,23

Total 158 3,97 2,02 70 5,52 1,21 Tabla 6. Valores medios de neurosina en los controles en función del sexo.

31


Figura 12. Correlación entre los niveles de neurosina y la edad en controles. Correlación significativamente positiva con (Correlación de Pearson= 0,362 RSQ=0,131).

Figura 13. Correlación entre los niveles de neurosina y la edad en pacientes con Enfermedad de Alzheimer. No hay correlación significativa (Correlación de Pearson = 0,137, RSQ=0,019).

32


3. Neurosina en pacientes con EA

3.1 Correlación de los niveles de neurosina con la edad en pacientes con EA

Al contrario de lo que sucede en controles, en los pacientes con EA no hay

correlación entre los niveles de neurosina y la edad. Factor de correlación de

Pearson= 0,137, RSQ=0,019, significación bilateral=0,231 (Figura 13). Este dato

puede interpretarse como que la natural tendencia ascendente de los niveles

plasmáticos de neurosina se rompe en caso de iniciarse un proceso

neurodegenerativo tipo EA.

3.2 Influencia del sexo sobre los niveles de neurosina en pacientes con EA

Tal como cabía esperar, dado que se sabe que la incidencia de EA es

superior en mujeres que en hombres, nosotros también encontramos diferencias

significativas en el número de pacientes de cada sexo: 69 hombres, 130 mujeres

(p=0,017). Sin embargo, el valor medio de neurosina en cada grupo no difiere

significativamente: 4,93 en mujeres y 4,87 en hombres (p=0,834) por lo que el

sexo no es una variable que influya sobre los niveles de neurosina en pacientes con

EA.

3.3 Influencia del genotipo ApoE en los niveles de neurosina en pacientes

con EA

Dado que la presencia genotipo ApoE4 es un conocido factor de riesgo de la

EA determinamos si el genotipo ApoE es un factor que pueda influir sobre los

niveles plasmáticos de neurosina en pacientes con EA. Todos los pacientes con EA

fueron genotipados y divididos en a) portadores de 1 o 2 alelos ApoE4 y b) no

portadores del alelo E4. Ochenta y seis pacientes (43,21%) eran portadores de al

menos un alelo E4. La media en el grupo a) fue 5,04 ng/ml, mientras que en grupo

b) fue 4,76 ng/ml. La comparación de medias no resultó significativa (p=0,453),

con lo que puede concluirse que el genotipo ApoE no afecta los niveles plasmáticos

de neurosina en pacientes con EA.

33


4. Valor diagnóstico de la cuantificación plasmática de neurosina

4.1 Diferencias de los niveles de neurosina entre los distintos grupos

diagnósticos

Una vez conocidos los valores de neurosina en los dos grupos más

importantes –controles y EA-. El paso siguiente fue evaluar las diferencias en la

concentración plasmática de neurosina entre grupos diagnósticos (Tabla 7).

Diagnóstico Media Des. Std.

Controles 4,450 1,630

• Controles mayores de 60 años 5,523 1,215

• Controles menores de 60 años 3,972 2,020

Deterioro Cognitivo Leve 5,965 1,890

Enfermedad de Alzheimer 4,909 2,011

• EA leve 5,191 2,252

• EA moderada 5,082 1,858

• EA severa 3,882 1,786

Demencia con componente vascular 5,772 2,453

• Demencia mixta 5,721 2,886

• Demencia vascular 5,806 1,713

Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob 4,779 1,494

Pseudodemencia 6,517 2,833

Otras demencias neurodegenerativas 5,704 1,253

• Demencia frontotemporal 5,342 2,348

• Afasia Progresiva Primaria 4,975 1,813

• Demencia con Cuerpos de Lewy 6,039 1,116

• Enfermedad de Huntington 0,486 0

• Degeneración Córticobasal 8,818 3,132

Tabla 7. Valores medios de la neurosina y desviación standard por grupo diagnóstico. Unidades: ng/ml.

Los niveles más altos fueron encontrados en pacientes diagnosticados de

Degeneración corticobasal (8,818 ng/ml), Pseudodemencia (6,517 ng/ml), y

demencia con cuerpos de Lewy (6,039 ng/ml). Resulta interesante que en el único

paciente diagnosticado con Enfermedad de Huntington, la concentración de

neurosina resultó muy disminuida (unas 10 veces) respecto a los controles (0.486

ng/ml respecto a 4.44 ng/ml), si bien este dato no puede tomarse en consideración

por proceder de un único paciente.

La comparación de las medias de concentración de neurosina entre los

distintos grupos arrojó varios resultados remarcables. La ANOVA muestra que

existen diferencias significativas entre algunos de los grupos (p=0,042). Las

34


significaciones estadísticas recogidas en la Tabla 8 muestran que hay diferencias

estadísticamente significativas entre los niveles de neurosina encontrados en

pacientes con EA respecto a controles mayores de > 60 años (p=0.042). Sin

embargo la comparación de los datos procedentes de otros tipos de demencia o

deterioro cognitivo con el grupo control (mayor de 60 años) no mostraron

diferencias significativas. Sí se encontraron diferencias significativas entre los

pacientes con EA y Pseudodemencia (p=0.039) y entre los pacientes con EA y

Demencia con Componente Vascular (p=0.040). No hubo diferencias significativas

entre los controles mayores de 60 años y la Demencia con Componente Vascular

(p=0,277) ni entre los controles mayores de 60 años (p=0,140) la

Pseudodemencia. No hubo diferencias significativas entre DCL y controles o entre

DCL y cualquier tipo de demencia.

DCL EA EA leve

Controles 0,461 0,359 0,512

Controles >60 años 0,348 0,042 0,372

DCL 0,724 0,212

Demencia Frontotemporal 0,313 0,197 0,497

Demencia con Cuerpos de Lewy 0,157 0,097 0,251

Afasia Progresiva Primaria 0,462 0,308 0,652

Pseudodemencia 0,092 0,039 0,241

Demencia Mixta 0,452 0,143 0,351

Demencia con componente

vascular 0,451 0,040 0,244

Enfermedad de Creutzfeldt-

Jakob 0,234 0,245 0,292

Tabla 8. Diferencias entre grupos (con n>25) en la media de concentración plasmática de neurosina. Los datos indican el valor p. Se han incluido los grupos diagnósticos con más de 25 individuos. En negrita los valores significativos.

Las muestras de pacientes con Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob,

procedentes de otro centro, tampoco mostraron diferencias significativas con

controles (p=0,241), pacientes con DCL (0,341) o EA (0,195).

Para la Degeneración Córticobasal aunque las diferencias parecen

importantes, el bajo número de individuos en estos grupos no permite hacer

comparaciones estadísticas.

Cuando se comparó selectivamente el grupo de pacientes con EA en grado

leve no se encontraron diferencias significativas entre los niveles de neurosina en

estos pacientes respecto a controles o respecto a cualquier otro tipo de demencia

(Tabla 8). Como se aprecia en la Figura 14, las diferencias entre controles y el

conjunto global de pacientes con EA se debe a las diferencias existentes entre los

35


primeros y los pacientes con EA en estadio severo (p=0,022). Sin embargo, como

se muestra mejor en el apartado 5.4 de los resultados, los niveles de neurosina sí

presentan una clara tendencia descendente a lo largo de toda la evolución de la

enfermedad.

Figura 14. Diagrama de cajas con la comparación de valores medios de neurosina entre el grupo de controles mayores de 60 años y los tres estadios de la EA. Las diferencias sólo son significativas entre controles y EA en estadio severo (p=0,022).

4.2 Evaluación de la cuantificación de neurosina como prueba para el

diagnóstico diferencial de la Enfermedad de Alzheimer

Dado que existen diferencias en la concentración plasmática de neurosina

entre pacientes con EA y controles mayores de 60 años, pacientes con

Pseudodemencia y Pacientes con Demencia con Componente Vascular; tratamos de

evaluar la validez de este parámetro como prueba para el diagnóstico diferencial de

la EA con estas entidades.

Para ello, en primer lugar determinamos el mejor punto de corte de

neurosina para detectar EA. Calculamos la sensibilidad y la especificidad de la

prueba en varios puntos y seleccionamos el que ofrecía mejor valor promedio, que

resultó 5,25 ng/ml (Tabla 9).

36


Punto de corte Sensibilidad Especificidad Sens. + Espe.

5,21 0,62 0,65 1,27

5,23 0,66 0,62 1,28

5,25 0,70 0,59 1,29

5,27 0,73 0,54 1,27

5,29 0,75 0,52 1,27

Tabla 9. Valores de sensibilidad y especificidad de la prueba en varios puntos para el diagnóstico de EA y suma de ambos valores.

A continuación clasificamos los sujetos como “bajos” cuando tenían valores

≤5,25 ng/ml o como “altos” cuando eran >5,25 ng/ml. El paso siguiente fue

calcular la sensibilidad, especificidad, valor predictivo negativo (aceptando la

prueba como negativa cuando resulta >5,25) y valor predictivo positivo (aceptando

la prueba como positiva cuando es ≤5,25) en el diagnóstico diferencial entre los

grupos que mostraron diferencias significativas (EA frente a controles,

Pseudodemencia y Demencia con Componente Vascular) (Tabla 10). En todos los

casos la sensibilidad y especificidad mostró datos modestos (entre 0,59 y 0,70) y

los valores predictivos negativos fueron bajos en todos los casos. Sin embargo, los

valores predictivos positivos fueron altos (entre 0,85 y 0,95). Estos resultados

sugieren que en casos de duda en la práctica clínica, la obtención de un resultado

positivo (≤5,25 ng/ml) ante un paciente que consulta por deterioro cognitivo orienta

el diagnóstico más hacia EA que hacia Pseudodemencia o Demencia con

Componente Vascular.

EA frente a controles

mayores de 60 años

EA frente a

Pseudodemencia

EA frente a Demencia

con Comp. Vascular

Valor

estimado

Intervalo

confianza

del 95 %

Valor

estimado

Intervalo

confianza

del 95 %

Valor

estimado

Intervalo

confianza

del 95 %

Sensibilidad 0,59 0,53-0,65 0,59 0,53-0,65 0,59 0,53-0,65

Especificidad 0,70 0,65-0,75 0,66 0,59-0,73 0,59 0,52-0,66

VPP 0,85 0,80-0,90 0,95 0,92-0,98 0,85 0,79-0,91

VPN 0,38 0,30-0,46 0,13 0,09-0,17 0,28 0,22-0,34

Tabla 10. Valores de sensibilidad, especificidad y predictivos para el diagnóstico de EA frente a controles mayores de 60 años (tomando el resultado como positivo si ≤5,25 ng/ml), EA frente a Pseudodemencia (tomando el resultado a favor de EA si ≤5,25) y de EA frente a Demencia con componente vascular (tomando el resultado a favor de EA si ≤5,25). VPP: valor predictivo positivo. VPN: valor predictivo negativo.

37


Finalmente, para proporcionar información dirigida a la toma de decisiones,

se obtuvieron curvas ROC de los niveles plasmáticos de neurosina en el diagnóstico

de EA frente a controles, Pseudodemencia y Demencia Vascular (Figura 15).

Figura 15. Curvas ROC para la determinación de la neurosina plasmática como prueba en el diagnóstico diferencial de EA frente a controles, Pseudodemencia y Demencia con Componente Vascular.

Las áreas bajo las curvas fueron: 0,677 (con un intervalo de confianza

0,582-0,719 para una probabilidad del 95%) en EA frente a controles, 0.703

(0,591-0,799) para EA frente a Pseudodemencia y 0,691 (0,583-0,752) para EA

frente a Demencia con Componente Vascular.

38


5. Valor pronóstico de la cuantificación de neurosina

5.1 Diferencias de los niveles de neurosina en pacientes con DCL en función

de la evolución diagnóstica.

El análisis retrospectivo de datos del grupo de pacientes con DCL (n=66) en

el que se realizó seguimiento durante 18 meses muestra resultados de interés

(Tabla 12). Existen diferencias significativas entre los grupos (p=0,024). Los

valores iniciales de neurosina plasmática fueron significativamente distintos en el

grupo de DCL que convirtió a Demencia con Componente Vascular (media: 7,17

ng/ml, intervalo de confianza 95%: 6,12-8,22) respecto al grupo que convirtió a EA

(media: 4,96 ng/ml, intervalo de confianza 95%: 4,08-5,84) (p=0,015) y al del

grupo que se mantuvo en el diagnóstico DCL (media: 5,03 ng/ml, intervalo de

confianza 95%:4,06-6,00) (p=0,036) (Figura 16). No hubo diferencias entre los que

se mantuvieron en DCL y los que convirtieron a EA (p=0,617). Dicho de otro modo,

en función de los intervalos de confianza, los pacientes con DCL que presentan un

valor de neurosina superior a 6,1 probablemente evolucionarán a Demencia con

Componente Vascular, mientras que los que presentan niveles entre 4 y 6 pueden

no convertir a demencia o convertir a EA.

Figura 16. Diagrama de cajas representando la comparación de valores iniciales de neurosina en los grupos diagnósticos de pacientes con DCL tras el seguimiento.

39


5.2 Valor pronóstico de los niveles neurosina en pacientes con DCL

Para calcular el riesgo de conversión de pacientes con DCL en función de su

concentración plasmática inicial de neurosina clasificamos a los pacientes en

aquellos con concentración baja (≤5,25) o alta (>5,25) (Tabla 11) y calculamos si

existe asociación entre los grupos por niveles y los grupos diagnósticos así como la

probabilidad de cada diagnóstico en función de los niveles de neurosina.

P (χ2 test) ≤5.25 >5.25 DCL 12 (40%) 18 (60%) 0.437 EA 7 (30%) 16 (70%) 0.004

DCV 12 (93%) 1 (7%) <0.001 Tabla 11. Asociación entre los niveles dicotomizados de neurosina en pacientes con DCL y su diagnóstico a los 18 meses.

En pacientes inicialmente diagnosticados de DCL existe asociación

significativa entre el desarrollo de Demencia con Componente Vascular y la

presencia de concentración plasmática de neurosina superior a 5,25 ng/ml

(p<0,001) así como entre el desarrollo de EA y una concentración plasmática

inferior a 5,25 ng/ml (p=0,004). La “no conversión” no se asocia significativamente

con ninguno de los grupos de niveles dicotomizados de neurosina.

La probabilidad o riesgo (Odds Ratio) de desarrollar Demencia con

Componente Vascular en pacientes con neurosina superiores a 5,25 ng/ml es 13,10

(con un intervalo de confianza 12,75-14,87 para una probabilidad del 95%) (Tabla

12).

Diagnóstico final Riesgo neurosina DC Vascular otros OR (95%CI) p ≤5.25 1 (7%) 34 (64 %) 1 >5.25 12 (93 %) 19 (36 %) 13.10 (11.92-14.32) 0.001 Tabla 12. Riesgo de desarrollar DCV en pacientes con DCL que presentan niveles altos de neurosina. La OR está corregida por sexo y edad.

El riesgo (Odds Ratio) de desarrollar EA en pacientes con DCL y niveles de

neurosina menores de 5,25 ng/ml fue 2,1 (con un intervalo de confianza 1,32-2,92

para una probabilidad del 95%) (Tabla 13).

Diagnóstico final Riesgo

neurosina EA otros OR (95%CI) p >5.25 7 (30%) 24 (56%) 1 ≤5.25 16 (70%) 19 (44%) 2.10 (1.32 -2.92) 0.013

Tabla 13. Riesgo de desarrollar EA en pacientes con DCL que presentan niveles bajos (≤5.25) de neurosina. La OR está corregida por sexo y edad.

40


5.3 Variación temporal de los niveles de neurosina en pacientes con DCL

durante el seguimiento.

Para determinar si existe variación en el tiempo de los niveles plasmáticos

de neurosina en pacientes diagnosticados con DCL y si tal variación tiene valor

predictivo del diagnóstico final, también se midió la concentración plasmática de

neurosina en 36 pacientes con DCL al final del periodo de seguimiento (Tabla 14).

Los resultados muestran que en tan sólo 18 meses los niveles de neurosina se

elevaron significativamente (desde 7,17 ng/ml a 8,79 ng/ml) en los pacientes que

progresaron a Demencia con Componente Vascular (p=0,043) mientras que el

descenso observado en este periodo en los pacientes que evolucionaron a EA (de

4,96 ng/ml a 4,87 ng/ml) no fue significativo (p=0,747). Por tanto, la elevación de

los niveles de neurosina en un paciente con DCL orienta a progresión hacia

Demencia con Componente Vascular.

Valor inicial (ng/ml) Valor final (ng/ml) Diagnóstico final

N media intervalo de N media intervalo de

confianza 95% confianza 95%

DCL 30 5,03 (4,06-6,00) 6 5,56 (4,69-6,43)

EA 23 4,96 (4,08-5,84) 19 4,87 (4,42-5,32)

Demencia con 13 7,17 (6,12-8,22) 11 8,79 (8,28-9,30)

Componente Vascular

Tabla 14: Valores (medios e intervalo de confianza) iniciales y tras el seguimiento en pacientes con DCL desglosados por diagnóstico tras el seguimiento.

5.4 Correlación entre el estadio evolutivo en Enfermedad de Alzheimer y los

niveles de neurosina

Finalmente nos propusimos hacer una estimación de cuál podría ser la

evolución teórica que seguirían los niveles de neurosina a lo largo de la evolución

de la EA, partiendo del estado de salud (controles) hasta la fase más avanzada de

la enfermedad. Para ello se tomaron los valores medios de neurosina en controles

mayores de 60 años (GDS 1), retrospectivamente se seleccionaron los pacientes

con DCL (GDS 3) que evolucionaron a EA (valor medio de neurosina 4,96) y se

añadieron los de la EA en sus distintos estadios evolutivos (GDS 4, 5 y 6) (Figura

17). Existe correlación significativa entre el grado de severidad y la concentración

de neurosina. (Factor de correlación de Pearson: -0,362, RSQ= 0,381, significación

bilateral p=0,041). Así puede decirse que a mayor severidad de la enfermedad,

menor concentración plasmática de neurosina. Como ya habíamos visto en el

apartado 4.1, la mayor caída en la concentración se produce en el estadio final

(GDS 6) de la enfermedad.

41


Por otro lado, en la Figura 17 puede observarse cómo el punto 5,25, que

previamente había sido seleccionado como el mejor punto de corte para el

diagnóstico de EA efectivamente parece separar los individuos aún sanos de los ya

enfermos.

Figura 17. Evolución de los niveles plasmáticos de neurosina en pacientes con EA a lo largo de los distintos estadios evolutivos. Se han tomado los valores medios de controles mayores de 60 años, pacientes con DCL que evolucionaron a EA y pacientes con EA en los distintos estadios. La línea discontinua en azul representa la correlación entre los niveles y el estadio evolutivo. La línea roja de puntos indica el nivel 5,25 ng/ml que previamente había sido seleccionado como el mejor punto de corte para el diagnóstico de EA.

42


V. DISCUSIÓN

Como hemos visto, la neurosina es una proteasa de expresión tisular,

preferentemente cerebral, a la que tanto los estudios de investigación básicos como

los estudios clínicos iniciales adjudican un papel en las demencias

neurodegenerativas. En todo caso permanecían sin estudiar la variación de la

concentración plasmática de neurosina en individuos sanos con la edad, las

diferencias de concentración en las distintas entidades causantes de deterioro

cognitivo y el comportamiento de la medición de neurosina en plasma como prueba

para la predicción evolutiva de pacientes con DCL y para el diagnóstico diferencial

de las demencias. Nuestro estudio abordó todos estos aspectos. Discutimos a

continuación los resultados más importantes.

La concentración plasmática de neurosina aumenta con la edad en individuos

sanos.

Si bien ya se había señalado que la expresión cerebral de neurosina

aumenta de forma fisiológica con la edad [40] se desconocía cuál era su

comportamiento en plasma. Nuestro estudio confirma que paralelamente a lo que

ocurre en el cerebro, la concentración plasmática de neurosina aumenta con la

edad en individuos sanos. Así, en números redondos, a los 20 años los valores son

próximos a 2 ng/ml mientras que a los 80 años tienden a situarse por encima de de

6 ng/ml.

La concentración plasmática de neurosina disminuye en pacientes con EA

Al contrario de lo que sucede en controles, en los pacientes con EA no hay

correlación entre los niveles plasmáticos de neurosina y la edad. De hecho, nuestro

estudio confirma que los niveles plasmáticos de neurosina descienden en pacientes

con EA paralelamente a lo que sucede en el cerebro de estos pacientes [39]. Este

resultado coincide con el resultado encontrado por otros grupos en plasma y LCR

[22, 58, 59] y parece indicar que la tendencia natural al aumento con la edad se

rompe en caso de aparición de EA.

Este hecho podría interpretarse como una de las causas -o una de las

consecuencias- de la fisiopatología de la EA. Si bien los mecanismos por los que la

neurosina puede estar implicada en la EA son desconocidos, la relación más directa

podría ser mediante la facilitación directa de formación de Aβ ya que a). en

condiciones normales el Aβ estimula la expresión de kalikreínas [22] y b) la

neurosina es una proteasa capaz de hidrolizar este péptido [32] favoreciendo su

eliminación. Así, un descenso en la expresión de neurosina podría contribuir a la

acumulación de Aβ en la EA.

43


La concentración plasmática de neurosina no difiere entre pacientes con EA y

pacientes con otras demencias neurodegenerativas, pero sí difiere entre EA y

demencia no neurodegenerativa.

Los pacientes con demencia de origen no neurodegenerativo

(Pseudodemencia o Demencia con Componente Vascular) tienen niveles más altos

de neurosina que los encontrados en pacientes con EA. Así, la medición de niveles

de neurosina puede resultar útil para diferenciar tanto entre individuos sanos y EA

como entre EA y pacientes con Pseudodemencia o Demencia con Componente

Vascular. No obstante, las curvas ROC de la neurosina plasmática revelan que la EA

puede ser distinguida de la Demencia Vascular y de la Pseudodemencia con una

precisión “regular” en términos generales aunque el valor predictivo positivo

alcanza cifras de 85-95%, por lo que una concentración plasmática disminuida en

un paciente con demencia apoya la opción de EA frente a Demencia con

Componente Vascular o Pseudodemencia (Tablas 15 y 16).

Los pacientes con enfermedad psiquiátrica pueden presentar clínica cognitiva

y trastorno del comportamiento similar al presente en pacientes con diversas

formas de demencia, como la Frontotemporal o la EA. En ocasiones resulta difícil

discernir si un paciente con quejas cognitivas y clínica psiquiátrica incluyendo

trastorno del comportamiento presentan una enfermedad puramente psiquiátrica o

una demencia con clínica psiquiátrica. La evaluación neuropsicológica suele arrojar

luz sobre este dilema. Como vemos, la determinación de la concentración de

neurosina también puede ser de utilidad, ya que en los pacientes con enfermedad

psiquiátrica (Pseudodemencia) la concentración es más elevada que en los

pacientes con EA.

En la Demencia con Componente Vascular, un daño isquémico, único o

múltiple, da lugar a los déficits neuropsicológicos. Si bien puede coexistir con un

proceso neurodegenerativo, detectar el componente vascular es importante dado

que supone una oportunidad de poder actuar sobre los factores de riesgo y permite

instaurar tratamientos farmacológicos dirigidos a la profilaxis secundaria. El

mecanismo fisiopatológico por el que la Demencia con Componente Vascular se

asocia con incremento de la concentración plasmática de neurosina tampoco es

conocido. Una posible explicación es la interacción de la neurosina con los PARs

(Receptores Activados por Proteasas). Los PARs comprenden una familia de

receptores acoplados a la proteína G que se activan por la trombina u otros factores

de la coagulación o proteasas inflamatorias liberadas en los puntos de daño tisular

[60]. Los PARs están ampliamente distribuidos en el SNC, y de forma similar a la

neurosina las densidades más importantes se encuentran en el hipocampo, córtex,

amígdala, tálamo, hipotálamo y estriado [26]. El PAR2 puede ser activado por la

44


neurosina [19, 27]. Entre otras acciones, PAR2 induce dilatación arterial y venosa

favoreciendo la desregulación de la presión arterial, que a su vez puede contribuir

de forma importante al desarrollo del daño vascular asociado a la Demencia con

Componente Vascular [61, 62].

Existe una clara superposición en la concentración de neurosina entre la EA

y otras demencias degenerativas (Demencia Frontotempolar, Demencia con

Cuerpos de Lewy y Afasia progresiva), lo que sugiere que la neurosina podría

participar en algún mecanismo común a varios procesos neurodegenerativos. Por

tanto, la medición de la concentración plasmática de neurosina no es un buen

parámetro para ayudar a discernir entre estos procesos (Tabla 15).

La concentración plasmática de neurosina no difiere entre pacientes con DCL

y pacientes con demencia.

No se encontraron diferencias entre ninguna forma de demencia y el DCL,

por lo que este parámetro no resulta de ayuda para clasificar a los individuos en

sanos/DCL/demencia (Tabla 15).

Actualmente el DCL se entiende como un estado transicional, de duración

variable –varios años en general-, por el que pasan algunos pacientes al comienzo

de su enfermedad que finalmente les llevará a sufrir demencia, bien degenerativa

bien de otro origen como la vascular; aunque también incluye pacientes que no

padecen ninguna enfermedad progresiva y que por tanto nunca desarrollarán una

demencia. El paciente muestra alteraciones cognitivas de intensidad leve, no

suficientes para alterar su funcionamiento global [3]. Es lógico, por tanto, que la

media de neurosina en este grupo no difiera significativamente de la de controles ni

pacientes con EA leve.

La concentración plasmática de neurosina tiene valor pronóstico

Aún más interesantes fueron los resultados del seguimiento de un subgrupo

de pacientes con DCL durante un periodo de 18 meses, al final del cual se volvió a

medir la concentración plasmática de neurosina en alguno de ellos. El valor medio

de neurosina plasmática difiere significativamente entre los pacientes que

evolucionaron a Demencia con Componente Vascular y los pacientes que

evolucionaron a EA o que se mantuvieron en DCL, por lo que el valor de neurosina

en pacientes con DCL tiene valor pronóstico (Tablas 15 y 16). Además hemos

podido estimar el riesgo de conversión hacia los distintos trastornos en función de

los niveles de neurosina: así unos niveles inferiores a 5,25 ng/ml hacen muy

improbable la evolución hacia Demencia con Componente Vascular mientras que el

riesgo relativo de evolucionar a EA es 2; y viceversa, unos niveles superiores a 5,25

45


ng/ml elevan de forma muy importante la probabilidad de evolucionar a Demencia

con Componente Vascular (Odds ratio de 13). Por último, las mediciones seriadas

de la concentración plasmática de neurosina también son un buen indicador de la

evolución de la enfermedad, ya que un ascenso en las mismas se asocia con

evolución hacia Demencia con Componente vascular.

Estos resultados pronósticos tienen gran trascendencia clínica, ya que

ofrecen una oportunidad para instaurar medidas preventivas dirigidas a tratar de

limitar la evolución natural de la enfermedad. Por ejemplo, ante un paciente con

DCL y neurosina superior a 5,25 sería razonable indicar un control estricto de los

factores de riesgo vascular y quizás podría indicarse también profilaxis

farmacológica con antiagregantes.

Por otro lado, el hecho de que la concentración de neurosina se correlacione

con el grado de severidad en pacientes con EA supone que su determinación

seriada podría resultar de utilidad para ayudar a monitorizar la progresión de la

enfermedad, lo que a su vez podría ayudar a valorar, junto a los parámetros

clínicos, la respuesta a los medicamentos “anti-Alzheimer”.

La medición de la concentración plasmática de neurosina...:

srve para ayudar a: no sirve para:

Diferenciar entre demencia por EA e individuos sanos.

Diferenciar entre EA leve / individuos sanos / pacientes con DCL.

Diferenciar entre demencia por EA y Demencia con componente vascular.

Diferenciar entre demencias de origen neurodegenerativo.

Diferenciar entre demencia por EA y Pseudodemencia.

Diferenciar entre EA y Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob

Monitorizar la progresión de la enfermedad en pacientes con EA y pacientes con DCL.

Predecir la evolución de pacientes con DCL.

Estimar el riesgo de conversión a demencia en pacientes con DCL.

Tabla 15. Situaciones para las que puede resultar de utilidad la medición de la concentración plasmática de neurosina y situaciones para las que no es de utilidad.

46


En caso de Un valor de neurosina... Orienta a Valor estadístico

Duda entre EA – individuo sano

Menor de 5,25 ng/ml EA VPP: 0,85

Duda entre EA- Pseudodemencia


Tabla 16. Resumen de las principales situaciones clínicas de utilidad de la prueba y orientación diagnóstica en función del resultado.

Así pues, se puede concluir afirmando que la determinación plasmática de

neurosina no ofrece rendimiento en el diagnóstico diferencial de las distintas formas

de demencia de origen neurodegenerativo –incluyendo la Enfermedad de

Creutzfeldt-Jakob- pero sí es útil para diferenciar la EA de otras entidades no

degenerativas que también cursan con síntomas cognitivos –Demencia con

Componente Vascular y Pseudodemencia- y para estimar el riesgo de evolución a

algunas formas de demencia desde la fase de DCL. Se confirma, por tanto, la

utilidad de la prueba como parámetro de ayuda ante determinados diagnósticos

diferenciales en la práctica clínica habitual.

Duda entre EA- Demencia con componente vascular


Probabilidad 95%

DCL Mayor de 6,1 ng/ml Evolución a Demencia Comp. Vasc.

DCL Menor de 6 ng/ml Evolución a EA o No Conversión

Probabilidad 95%

DCL Elevación de los niveles respecto a valor previo

Evolución a Demencia Comp. Vasc.

p=0,043

Estimación de Riesgo de conversión en pacientes con DCL

Menor de 5,25 ng/ml conversión a EA

OR: 2,1

OR: 13,1 Estimación del Riesgo de conversión en pacientes con DCL

Mayor de 5,25 ng/ml Conversión a Demencia con Componente Vascular

47


VI. CONCLUSIONES

• Paralelamente a lo que ocurre en el tejido cerebral, los resultados de este

estudio demuestran que la concentración plasmática de neurosina se

incrementa de forma fisiológica con la edad.

• La concentración plasmática de neurosina disminuye significativamente en

pacientes con Enfermedad de Alzheimer respecto a controles.

• La disminución más importante en la Enfermedad de Alzheimer se produce

en fases avanzadas mientras que los niveles en fase leve no difieren

significativamente de los controles o de los individuos con Deterioro

Cognitivo Leve.

• La cuantificación de la concentración plasmática de neurosina puede resultar

de utilizad para ayudar a diferenciar entre demencia por Enfermedad de

Alzheimer y Demencia con Componente Vascular.

• La cuantificación de la concentración plasmática de neurosina puede resultar

de utilizad para ayudar a diferenciar entre demencia por Enfermedad de

Alzheimer y Pseudodemencia.

• La concentración plasmática de neurosina en pacientes con Deterioro

Cognitivo Leve es útil para estimar el riesgo de conversión a distintas formas

de demencia: un nivel alto (superior a 5,25 ng/ml) aumenta de forma

importante el riesgo de evolución a Demencia con Componente Vascular

(Odds Ratio: 13) mientras que un nivel bajo (inferior a 5,25) aumenta

moderadamente el riesgo de evolución a EA (Odds Ratio: 2).

• El seguimiento de los niveles de neurosina en un paciente con Deterioro

Cognitivo Leve tiene valor pronóstico: una elevación de los mismos orienta

la evolución hacia Demencia con Componente vascular.

48


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VIII. ENGLISH SUMMARY

Dementia is one of the most common causes of institutionalization,

morbidity, and mortality among the elderly. As life expectancy increases, the

number of people affected by dementia also increases. The diagnosis of the

different causes of dementia remains based on clinical criteria which allow a

“probabilistic” diagnosis once other causes of cognitive impairment have been

discarded. Furthermore, symptoms of different dementias overlap with each other

and even with some psychiatric disorders with cognitive symptoms thus

complicating differential diagnosis. It is estimated that by the time a patient is

diagnosed with any neurodegenerative dementia, the disease has been progressing

for many years. Mild Cognitive Impairment (MCI) is a disorder considered to be a

transitional stage from health to dementia. Diagnosis of dementias at these early

stages is always troublesome because the pathophysiologic events leading to

dementia precede clinical symptoms. For these reasons the search for molecular

biomarkers that allow classifying different types of dementias is of high importance.

During recent years the number of studies that describe the potential value

of several proteins to diagnose or predict outcome of different types of dementias

have increased exponentially. One of such markers is neurosin (Kallikrein 6).

Neurosin is a “trypsin like” serine-protease expressed mainly in the brain. Previous

studies suggested that neurosin is a potential biomarker for Alzheimer’s disease

(AD) since its levels in brain tissue, CSF, and blood appear to be altered in AD.

However, the sensitivity and specificity of plasmatic neurosin in AD and other

dementias remain to be determined.

To address this gap in knowledge and test the value of measuring the levels

of neurosin as a diagnosis tool for MCI, AD and other dementias, we investigated

the correlation between plasmatic levels of neurosin and the final diagnosis of

patients with cognitive symptoms. Thus we measured plasmatic levels of neurosin

in healthy individuals and patients with cognitive symptoms independently of what

the final diagnosis was.

We collected plasma samples from 228 controls and 447 patients diagnosed

with either AD, Mild Cognitive Impairment MCI), Dementia with Lewy Bodies or

Parkinson-Dementia, Frontotemporal Dementia, Huntington’s disease, Primary

Progressive Aphasia, Corticobasal degeneration, Creutzfeldt-Jakob’s disease and

Pseudodementia. Sixty six MCI patients were observed for 18 months and then

plasmatic neurosin was measured again in 36.

Plasmatic levels of neurosin increase with age in healthy individuals and

decrease in patients with AD. Plasmatic levels of neurosin differ significantly

between AD and Dementia with Vascular Component, Pseudodementia and the

57


control group. Analyses comparing any other form of neurodegenerative dementia

to the AD group did not show significant differences. The mean value of plasmatic

neurosin concentration differs significantly between MCI patients who converted to

Dementia with Vascular Component, those who converted to AD, and those who

remained at MCI stage. The risk of developing Dementia with Vascular Component

when neurosin levels are higher than 5.25 ng/ml is very high (Odds ratio 13) while

the risk of developing mild AD when neurosin levels are lower than 5.25 ng/ml is 2.

Increases in the levels of neurosin suggest progression to Dementia with Vascular

Component.

In conclusion, the measurement of plasmatic levels of neurosin is a useful

diagnostic tool to assist in distinguishing AD patients from subjects without

neurodegenerative dementia (either Pseudodementia, Vascular Dementia or

controls) although it is not useful to distinguish different types of

neurodegenerative dementias. The measurement of plasmatic neurosin

concentration in patients diagnosed with MCI may predict conversion from MCI to

Dementia with Vascular Component. A single measurement may be useful to

estimate the risk of developing AD and Dementia with vascular component. Finally,

repeated measurement of plasmatic neurosin might be a useful test to predict

outcome in patients with MCI.

58


IX. ANEXO

Los estudios de esta tesis doctoral han dado lugar a la publicación de dos

artículos científicos en revistas internacionales, centrados en las entidades donde

los resultados han mostrado mayor utilidad: la Enfermedad de Alzheimer y el

Deterioro Cognitivo Leve. Las referencias se citan a continuación:

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neurosin in the diagnosis of Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s

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59

cuerpo de la tesis

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