cátedra de inmunología inmunopatología de la infección por vih-1 · (ccr5+, memoria efectora)...

Inmunopatología de la Infección por VIH-1

Prof. Edwin Escobar [email protected]

Universidad Central de Venezuela

Facultad de Medicina

Escuela de Medicina “José María Vargas”

Cátedra de Inmunología

Tema 24 2018-2019

• Recuento Histórico •Primeros Reportes •Grupos de Riesgo •Vías de Transmisión •Aislamiento del Virus

• Aspectos Clínicos •Curso Clínico de la Infección •Diagnóstico

•ELISA •Western Blot

•Seguimiento •Carga Viral •Subpoblaciones de Linfocitos T

• Inmunopatogénesis •Afección del Sistema Inmunitario •Resultados en Nuestros Pacientes

• El Virus •Proceso de Invasión Celular •Células Susceptibles a la Infección •Ciclo de Replicación •Tratamiento •Cuasiespecies

Inmunopatología de la

Infección por VIH-1

• Epidemiología •Global •Latinoamérica •Venezuela

RECUENTO HISTÓRICO Infección por VIH-1

1er. Reporte de la Inmunodeficiencia

5 de Junio de 1981

Gottlieb et al; Mor Mrt Wkly Rep 1981; 30(21): 250-252

Isolation of a T-Lymphotropic Retrovirus from a Patient

at Risk for Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) Barré-Sinoussi et al, Science 1983; 220:868-871

20 de Mayo de 1983

1er. Reporte del

Aislamiento del Virus

EPIDEMIOLOGÍA Infección por VIH-1

América Latina

1,9 millones [1,6 – 2,4]

Caribe 340.000

[290.000-390.000]

Europa Oriental & Asia Central

5,9 millones [5,1 – 7,1]

Asia & El Pacífico

[160.000 – 390.000] 240.000

Medio Oriente & África del Norte [1,9 – 2,4]

2,2 millones

Norteamérica & Europa Centro-occidental

África Suroriental 20,6 millones

[18,2 – 23,2]

37,9 millones [32,7 – 44,0]

Año 2018

África Centro-occidental 5,0 millones

[4,0 – 6,3]

1,7 millones [1,5 – 1,9]

Venezuela 120.000

Personas Infectadas por el VIH-1

Nuevas Infecciones: 1,7 millones Muertes: 770.000

Nuevas Infecciones: 6.500 Muertes: 2.500 https://aidsinfo.unaids.org/

http://www.unaids.org/en/resources/documents/2017/2017_data_book

https://aidsinfo.unaids.org/


Trabajadores Sexuales

Adictos a

Drogas Intravenosas

Contacto

Homosexual Masculino

Transgénero

Parejas Sexuales

De Grupos en Riesgo

Resto de

La Población

Población en Mayor Riesgo de Infección por VIH-1 A Nivel Mundial


Excluyendo a África Sub-Sahariana

EL VIRUS Infección por VIH-1

Estructura del VIH-1

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:HIV_Virion-en.png

Familia: Retroviridae Subfamilia: Lentivirinae Género: Lentivirus


Células Susceptibles

• Interacción Virus-Célula Blanco – Molécula Receptora: CD4

– Moléculas Co-receptoras: CCR5, CXCR4

• Células Susceptibles

–Linfocitos T CD4+

–Monocitos/Macrófagos

–Células Dendríticas

Ciclo de Replicación del VIH-1

Barré-Sinoussi F et al.; Nat Rev Microbiol 2013; 11:877–883

CD4

CCR5 CXCR4

Variabilidad Genética del VIH-1

Cuasiespecies

Secuencia Consenso

Ciclo de

Replicación

Secuencia Consenso

Ciclo de

Replicación

Secuencia Consenso

Microbio Mol Biol Rev 2012; 76(2):159-216

Microbio Mol Biol Rev 2012; 76(2):159-216

Enorme Reto

• Sistema Inmunitario: Evasión de la respuesta

• Tratamiento Anti-Retroviral: Resistencia

Variante Viral

Predominante

(Fitness)

Variabilidad Genética del VIH-1

Cuasiespecies

ASPECTOS CLÍNICOS Infección por VIH-1

Curso Clínico de la Infección por VIH-1

Modificado de: Fauci AS et al.: Harrison: Principios de Medicina Interna, 17ª Edición


Diagnóstico y Seguimiento • Diagnóstico: confirmar la infección por VIH-1

– Detección de Anticuerpos* Específicos

• ELISA (1ra, 2da, 3ra y 4ta Generación): *4ta. también detecta Ag virales (p24)

• Western Blot (Prueba Confirmatoria, hacia el desuso)

• Seguimiento: evaluar la progresión de la infección

– Carga Viral: cantidad de virus en circulación

• PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa): cuantificación de ARN Viral

– Subpoblaciones de Linfocitos T: determinación de

Linfocitos T CD4+ y T CD8+

• Citometría de Flujo

– Clínica: evaluación general, signos y síntomas del paciente

ELISA Diagnóstico de la Infección por VIH-1


http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf


p24 de VIH-1

ARN de VIH-1 Anticuerpos

anti-VIH-1

Días de Infección

Infección Aguda Infección Crónica

Ventana de

Seroconversión

Período de

Eclipse

Diagnóstico de Infección por VIH-1

ELISA de 4ta. Generación


Revelado

Reacción de Color Sustrato Apropiado

Fase de

Captura

Anti-p24

Ag de VIH-1/VIH-2 Péptidos Sintéticos

Proteínas Recombinantes

Marcador

Identificado

Ag p24

IgM e IgG anti-VIH-1/VIH-2

Ac y Ag en

Sangre del Paciente

VIH-1, VIH-2

Detecta Antígeno Viral (p24)

Detecta IgM e IgG

Detección más Temprana

Fase de

Detección

Anti-p24

Ag Virales Conjugados a Enzima

E


anti-VIH-1


p24 de VIH-1


anti-VIH-1

Días de Infección

Infección Aguda Infección Crónica

Ventana de

Seroconversión

Período de

Eclipse

Acs: IgG anti-VIH-1 ELISA 1G

Acs: IgG anti-VIH-1 / VIH-2 ELISA 2G

Acs: IgM / IgG anti-VIH-1 / VIH-2 ELISA 3G

Acs: IgM / IgG anti-VIH-1 / VIH-2; Ags: p24 ELISA 4G

Carga Viral PCR

Diagnóstico de la Infección por VIH-1

http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf Neonatos

de madres infectadas

WESTERN BLOT Diagnóstico de la Infección por VIH-1

http://images.slideplayer.es/1/121053/slides/slide_53.jpg

Diagnóstico de la Infección por VIH-1

Algoritmo Recomendado – CDC 2014


CARGA VIRAL Seguimiento de la Infección por VIH-1

• Cuantificación del virus presente (Copias de ARN de VIH-1)

– PCR Cuantitativo (<2 x 102 – 1 x 106)

• Más sensible para bajos valores de Carga viral

• Requiere 200 ul de muestra

– ADN de Cadena Ramificada (<5 x 102 – 1 x 106)

• Más preciso para altos valores de Carga Viral

• Requiere 2 ul de muestra

– NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) (<4 x 103 – 1 x 106)

• Interpretación Clínica – Tomar en cuenta el tipo de ensayo utilizado

– Diferencias inter-ensayo de hasta 0,5 Log

Seguimiento de la Infección por VIH-1

Determinación de la Carga Viral

SUBPOBLACIONES DE LINFOCITOS T CITOMETRÍA DE FLUJO

Seguimiento de la Infección por VIH-1

FSC

m

Población de Leucocitos Sangre Periférica

Granulocitos

Linfocitos

Monocitos

Monocito

Laser (Fuente de

Luz)

SSC

FSC

Citometría de Flujo

http://www.bdbiosciences.com

Dreamstime.com

Análisis de Datos Selección de Regiones

Histograma

CD3 Intensidad de Fluorescencia (FL1 Log)

Análisis de Datos Intensidad de Fluorescencia

72%

Células Positivas para FL-1 (CD3)

Linfocitos T

Análisis de Datos Intensidad de Fluorescencia

Gráficos de Dos Parámetros

CD4 Vs. CD3

CD8 Vs. CD3

Subpoblaciones de Linfocitos T

Porcentaje (%)

Recuento (Cél./µL)

Valores de Referencia

Leucocitos 7.400 4.100 – 10.900

Linfocitos Totales 25 1.850 2.200 – 4.200

Linfocitos T Totales 72 1.332 1.500 – 3.000

Linfocitos T CD4+ 12 222 800 – 1.900

Linfocitos T CD8+ 57 1.055 500 – 1.000

Relación CD4/CD8 0.21 1.5 – 2.4

INMUNOPATOGÉNESIS Infección por VIH-1

Cómo el Virus Causa la Inmunodeficiencia

VIH-1 afecta al Linfocito T

Activación Celular HLA-DR, CD38

Señales de Supervivencia IL-7Rα

Virgen / Memoria CD45RA / CD45RO

Funciones Efectoras Perforina

Coestimulación Negativa PD-1

Apoptosis CD95 Proliferación Celular

Producción de Citoquinas IFN-, IL-2

Linfocitos T Funcionalidad

• Destrucción de Células por Efectos Citopáticos • Destrucción Masiva de Linfocitos T CD4+ en Mucosas (CCR5+, Memoria Efectora)

• Disminución de la Vida Media de Linfocitos T (Turnover)

• Menor Producción de Linfocitos T (Timo, M.O., Ganglios)

• Aumento de Apoptosis (CD95)

• Menos Receptores de Supervivencia (IL-7, IL-7Rα)

• Aumento de Co-estimulación Negativa (PD-1)

• Activación Crónica (CD38, HLA-DR)

• Estimulación Antigénica Persistente • Daño a la mucosa intestinal – LPS Bacteriano

• Proteínas Virales (gp120, gp41)

• Agotamiento Funcional / Desacoplamiento Linf. T CD4 / T CD8

Inmunopatología de la Infección por VIH-1

Diferentes Respuestas a Infecciones Virales

Boasso & Shearer; Clin Immunol 2008; 126(3): 235–242

Estudio de la funcionalidad de los linfocitos T en pacientes infectados con el VIH-1

Producción de Citoquinas in vitro


Diseño Experimental

• Población Estudiada

– Grupo Control (C): individuos no infectados con VIH-1, asintomáticos (n=14)

– Pacientes: infectados con VIH-1, sin tratamiento anti-retroviral

• PA: Recuento de Linfocitos T CD4+ >350/μL (n=13)

• PB/C: Recuento de Linfocitos T CD4+ <350/μL (n=19)

• Muestra: Células Mononucleares de Sangre Periférica

• Condiciones de Cultivo: 72 horas

– Medio: Condiciones basales, sin estimulación

– PHA (Fitohemaglutinina): estimulación policlonal

– Env (gp41): estimulación específica con antígeno viral

• Determinaciones: IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ

Producción de IL-6(CMSP Cultivadas por 72 Horas)

Co

nc

en

tració

n d

e IL

-6 (

pg

/ml)

0

1500

3000

4500

6000

7500

C (VIH-) (n=14)

PA (VIH+; CD4>350/uL) (n= 13)

PB/C (VIH+; CD4<350/uL) (n=19)

PHA EnvMedioCondiciones de Cultivo

(Estímulos)

p<0.05:

: vs. Medio

: vs. C

IL-6 Citoquina Pro-Inflamatoria

Producción de TNF-(CMSP Cultivadas por 72 Horas)

Co

nc

en

tra

ció

n d

e T

NF

- (

pg

/ml)

0

10

20

500

1000

1500

2000

2500

C (VIH-) (n=12)

PA (VIH+; CD4>350/uL) (n=9)

PB/C (VIH+; CS4<350/uL) (n=17)


(Estímulos)

p<0.05:

: vs. Medio

: vs. C

TNF-α Citoquina Pro-Inflamatoria

Producción de IFN-(CMSP Cultivadas por 72 Horas)

Co

ncen

tració

n d

e IF

N-

(pg

/ml)

0

100

200

300

400

500

10000

20000

30000

40000

50000

60000

C (VIH-) (n=12)

PA (VIH+; CD4>350/uL) (n=11)

PB/C (VIH+; CD4<350/uL) (n=17)


(Estímulos)

p<0.05:

: vs. Medio

: vs. C

: vs. PA

IFN-γ Respuesta Citotóxica Antiviral

Producción de IL-10(CMSP Cultivadas por 72 Horas)

Co

nc

en

tra

ció

n d

e IL

-10

(p

g/m

l)

0

25

50

75

100

125

500

1000

1500

2000C (VIH-) (n=10)

PA (VIH+; CD4>350/uL) (n=10)

PB/C (VIH+; CD4<350/uL) (n=17)


(Estímulos)

p<0.05:

: vs. Medio

: vs. C

: vs. PA

IL-10 Citoquina Inmunomoduladora

Estimulación Policlonal

Pacientes tienen capacidad de Producir IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ

¿Es posible recuperar la Respuesta Antiviral?

Producción Espontánea

TNF-α: Efecto Pro-Inflamatorio

¿Activación Crónica?

IL-10 : Efecto Inmunomodulador

¿Inhibición de la Respuesta Antiviral?

Estimulación Específica

TNF-α, IL-6 e IL-10: Efectos Antagónicos

IFN-γ: No hay producción

Respuesta Antiviral Comprometida la Respuesta Antiviral

Producción de Citoquinas

Conclusiones


Una compleja combinación de citoquinas en la respuesta anti-VIH-1 en pacientes puede asociarse a:

– Un ambiente pro-inflamatorio que podría relacionarse con el estado de activación crónico del sistema inmunitario observado en pacientes

– Una respuesta antiviral no eficiente para controlar la progresión de la infección

– Es relevante que los pacientes mantienen la capacidad funcional de producción de citoquinas, lo cual abre la posibilidad de intervención terapéutica para generar una respuesta anti-VIH-1 efectiva

• Laboratorio de Inmunofisiología Celular - Escuela “JM Vargas”, UCV

– Dr. Miguel Alfonzo (Investigador Principal, Director de la Tesis)

– Miembros del Laboratorio:

• Laboratorio de Fisiopatología – IVIC

– Dra. Mercedes Fernández (Tutora de la Tesis)

• Servicio de Infectología - Hospital “José Ignacio Baldó”, El Algodonal

– Dra. Yhajaira Roldán: pacientes referidos

• Servicio de Inmunología - Instituto de Medicina Tropical, UCV

– Dra. Belkisyolé Alarcón de Noya: pacientes referidos

• Laboratorio Clinifar – Escuela “JM Vargas”, UCV

– Dra. Mélida Bermúdez: citómetro de flujo

•Gustavo Rico •Ydelys Fuentes •José Abelardo Carrero •Wolfgang Vivas •Eduardo Navarro

•Alexandra Díaz •Josibel Camacho •Riward Campelo •Alexandra Díaz

Reconocimientos

cátedra de inmunología inmunopatología de la infección por vih-1 · (ccr5+, memoria efectora)...

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