colágeno a partir de crestas de pollo

8/18/2019 Colágeno a Partir de Crestas de Pollo

1/49

1

OBTENCIÓN DE COLAGENO A PARTIR DE CRESTAS DE POLLOS.

CHRISTIAN DAIVID CASTRO VARGAS

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS

ESCUELA DE QUÍMICA

BUCARAMANGA

2012


2/49

2

OBTENCIÓN DE COLAGENO A PARTIR DE CRESTAS DE POLLOS.

CHRISTIAN DAIVID CASTRO VARGAS

Proyecto de Grado Modalidad Investigación presentado como requisito para optar

por el título de Químico.

DIRECTOR:

Herminsul de Jesús Cano Calle, Ph.D.

DIRECTOR:

Cristian Blanco Tirado, Ph.D.

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS

ESCUELA DE QUÍMICA

BUCARAMANGA

2012


3/49

3


4/49

4


5/49

5

DEDICATORIA

A mis padres, Maritza y Pedro por todo el amor y cariño que me han brindado todala vida, por el apoyo incondicional en cada proyecto que tomo y los buenos

consejos, los AMO.

A mi abuela Oliva que ha sido mi segunda madre toda mi vida, eres un amor de

mujer ojala todas las personas te conocieran y siguieran tus consejos.

A mi hermanita Angie que me enseña día a día como los tiempos cambian y que a

pesar de las alegrías, tristezas y rabietas siempre olvida todo rápido y muestra esa

linda sonrisa que alegra mis días, siempre contaras conmigo hermanita.

A July Gómez, por brindarme su compañía, cariño y comprensión durante gran

parte de mi vida universitaria, por ser mi apoyo durante momentos difíciles, por

enseñarme muchas cosas bonitas de la vida, gracias por aportar tantas cosas

positivas en mi vida; logramos crear una historia que nunca olvidaré.

A la familia Gómez Pereira, por abrirme las puertas de su casa en una etapa muy

importante en mi desarrollo como persona y profesional, siempre los llevo

presentes y nunca los olvidare.

A todos mis amigos, William, Carlos, Jose, Oscar, Jesica, Cindy, Julieth, Lina,

Marisol, Mafe, Javier, Camila, Jhon, Johana, Hernan, Diego, Carlos, Cesar y Juan


6/49

6

Carlos, todos personas especiales que llevaran un lugar en mi corazón por todos

los momentos compartidos, mil gracias por todo.

A los profesores, Herminsul, Cristian y Yajaira por el apoyo y confianza para

alcanzar esta meta.

Finalmente y no menos importante a Dios por darme la fe, la fortaleza y la

esperanza para culminar esta etapa.


7/49

7

AGRADECIMIENTOS

Al Doctor Herminsul Cano, por las enseñanzas recibidas, la dedicación, confianzay apoyo incondicional, un nuevo amigo en este juego de la vida.

Al Doctor Cristian Blanco, por la codirección del proyecto y ser siempre eje

fundamental del desarrollo del mismo, gracias por las correcciones y aportes.

A la Doctora Stelia Carolina Méndez, por tomarse el tiempo de calificar este

trabajo y aportar con su conocimiento al desarrollo del mismo.

A Jessika Hernández, por el tiempo y dedicación en compartir sus conocimientos

en electroforesis, también por ser un gran apoyo en momentos difíciles y ser una

gran amiga siempre dispuesta a ayudar.

A Johanna Flórez, por convertirse en una gran amiga y compañera de laboratorio,

sacar tiempo para leer y corregir este proyecto, también por sacar tiempo para

sacarme sonrisas en tiempos difíciles.

A César Ariza por su gran colaboración al momento de liofilizar las muestras,eternamente agradecido.


8/49

8

A los Doctores, Rodrigo Torres y Claudia Ortiz, por abrirme las puertas del

laboratorio de Bioquímica y permitirme desarrollar el proyecto.

A todos los compañeros del laboratorio de Bioquímica por compartir conmigo

largas jornadas de trabajo y momentos de esparcimiento.

A la Doctora Yajaira Combariza, por los análisis de espectrometría de masas y

aportes al desarrollo de la investigación.

A Martha Liliana Chacón por su gran aporte de conocimientos en el área analítica

de esta investigación.

Por último a todas las personas que directa o indirectamente estuvieron vinculadas

de una u otra forma a este proyecto, colaborando para sacarlo adelante a pesar de

los contratiempos.


9/49

9

CONTENIDO

INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 15

1. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA ...................................................................... 17

1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................................... 17

1.2. JUSTIFICACIÓN ....................................................................................... 18

2. OBJETIVOS .................................................................................................... 19

2.1. OBJETIVO GENERAL .............................................................................. 19

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................... 19

3. MARCO DE REFERENCIA ............................................................................. 20

3.1. PROCESO DE EXTRACCIÓN .............................................................. 20

3.2. MARCO TEÓRICO ................................................................................... 21

3.2.1. Estructura del colágeno ...................................................................... 21

3.2.2. Usos y aplicaciones del colágeno ...................................................... 22

3.2.3. Fuentes de obtención ......................................................................... 23

3.2.4. Técnicas Analíticas ............................................................................ 23

3.2.7.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio(SDS) ........................................................................................................... 24

3.2.7.2. Espectrometría de Masas - MALDI/TOF ........................................ 24

3.2.7.3. Espectroscopia Ultravioleta-Visible ................................................ 25

4. METODOLOGÍA ............................................................................................. 26

4.1. DISEÑO EXPERIMENTAL .......................................................................... 26

4.1. PREPARACIÓN DE LA MATERIA PRIMA ............................................... 27

4.2. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL COLÁGENO ............................... 29

4.3.1. Diálisis ................................................................................................ 30

4.3.2. Liofilización ......................................................................................... 30

4.4. CARACTERIZACIÓN DEL COLÁGENO .................................................. 32

4.4.1. Perfil Proteico - Electroforesis ............................................................ 32

4.4.2. Espectroscopia UV-Vis ....................................................................... 34

4.4.3. Espectrometría de Masas .................................................................. 34

5. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS ........................................... 36


10/49

10

5.1. EXTRACCIÓN DE COLÁGENO .................................................................. 36

5.2. DETERMINACIÓN DEL PERFIL PROTEICO DE LAS EXTRACCIONES DECOLÁGENO ....................................................................................................... 38

5.3. ESPECTROSCOIA UV-VIS ...................................................................... 42 5.4. ESPECTROMETRÍA DE MASAS ............................................................. 44

CONCLUSIONES .................................................................................................. 45

RECOMENDACIONES .......................................................................................... 46

BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................... 47


11/49

11

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estructura de las fibras de colágeno.. .................................................... 21Figura 2. Cambio en la estructura tridimensional del colágeno al reemplazar unresiduo de glicina por alanina. ............................................................................... 22Figura 3. Representación gráfica del diseño experimental. .................................. 27Figura 4. Crestas enteras y picadas ...................................................................... 28Figura 5. Crestas cortadas y listas para licuar.. .................................................... 28Figura 6. Muestra homogénea, lista para ser tratada.. .......................................... 29Figura 7. Liofilizador marca labconco lyph-lock. .................................................... 31Figura 8. Rampas de temperatura y tiempo programadas en el liofilizador. ......... 31Figura 9. Montaje utilizado para realizar electroforesis en geles de poliacrilamida

SDS.. ..................................................................................................................... 33Figura 10. Gel de SDS-PAGE al 7.5% sin tratar las muestras con pepsina;tratamiento 24 h -26ºC. .......................................................................................... 38Figura 11. Geles de SDS-PAGE al 10%: A) tratamientos de 12 horas y 24 h. B)tratamientos de 36 horas. ...................................................................................... 40Figura 12. Electroforesis (SDS-PAGE) de colágeno tipo I de diferentes especiesanimales ................................................................................................................ 41Figura 13. Espectros UV-Vis del colágeno extraído; tratamiento con pepsinadurante 36 horas. .................................................................................................. 43Figura 14. Espetros UV-Vis de colágeno tipo I de diferentes espécies animales. 43

Figura 15. Espectro de masas del colágeno tipo I, utilizando UV-MALDI-MS. ...... 44


12/49

12

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Variables a modificar. Fuente: el autor. ................................................... 26Tabla 2. Componentes y volúmenes para el gel de separación. ........................... 32Tabla 3. Composición del buffer de corrido. .......................................................... 32Tabla 4. Composición de la solución colorante y las decolorantes. ....................... 34Tabla 5. Cantidades tratadas y cantidad de colágeno obtenido. ........................... 36Tabla 6. Rendimientos y desviaciones estándar de las extracciones. ................... 37


13/49

13

RESUMEN

TÍTULO

OBTENCIÓN DE COLAGENO A PARTIR DE CRESTAS DE POLLO.*

AUTOR

CASTRO VARGAS, CHRISTIAN D. **

PALABRAS CLAVECOLAGENO, CRESTAS DE POLLO.

CONTENIDO: debido a la gran demanda de colágeno en la industria farmacéutica, cosmética yde biomateriales en la presente investigación se extrajo colágeno de las crestas de pollos,buscando dar un valor agregado a este subproducto de la industria avícola Santandereana. Elatelocolágeno es producido por la eliminación del telopéptido de colágeno por acción de enzimas.El propósito de este estudio fue evaluar el efecto de la digestión con pepsina a diferentes tiempos ytemperaturas; adicionalemente, se logró la caracterización de la proteína obtenida por diferentesanálisis fisicoquímicos y espectroscópicos. Por medio del análisis de electroforesis se determinó

que el atelocolágeno de las crestas de pollo estaba compuesto principalmente por colágeno tipo I.El espectro de absorción UV presenta un perfil en forma de campana que muestra un pico deabsorción entre los 215 a 220 nm. La caracterización por espectrometría de masas demostró lapresencia de 3 bandas correspondientes a las tres cadenas que conforman el colágeno la α1 a93.26 kDa, la α2 a 140.37 kDa y la β a 283.76 kDa.

Mediante los procesos de extracción implementados en este trabajo se obtuvo un rendimiento del2.44% logrando superar los presentados por Lin y Liu [8] en el 2006. Con base en esto se sugiereque las crestas de pollo son una fuente de colágeno tipo I, lo que genera un valor agregado a unode los subproductos de la industria avícola.

__________________________*Trabajo de Investigación** Facultad de ciencias básicas. Escuela de Química. Director: Herminsul de Jesús Cano Calle.Director: Cristian Blanco Tirado.


14/49

14

ABSTRACT

TITLEOBTAINING COLLAGEN FROM CHICKEN COMBS

AUTHOR

CASTRO VARGAS, CHRISTIAN D. **

KEYWORDS

COLLAGEN, CHICKEN COMBS

CONTENT: due to the high demand of collagen in the pharmaceutical, cosmetics andbiomaterials industry in this investigation was extracted collagen from chicken combs, looking toadd value to the product of the poultry industry Santandereana. The atelocollagen is produced byremoval of the telopeptides of collagen by enzymes. The purpose of this study was to evaluate theeffect of digestion with pepsin at different times and temperatures; Also being achieved

characterization of the protein obtained by different physico-chemical and spectroscopic analysis.By means of analysis of electrophoresis was determined that the crests of atelocollagen wascomposed mainly of chicken collagen type I. The UV absorption spectrum has a bell-shaped profilewhich shows an absorption peak between 215 to 220 nm. The characterization by massspectrometry showed the presence of three bands corresponding to the three collagen chainscomprising the α1 to 93.26 kDa, α2 to 140.37 kDa and β to 283.76 kDa.

By means extracting processes implemented in this paper yield was obtained of 2.44% able toovercome those presented by Lin and Liu [8] in 2006. Based on this it is suggested that the crests ofchicken are a source of type I collagen, creating added value to one of the byproducts of the poultryindustry.

__________________________*Work Degree** Faculty of Basic Sciencies. Director: Herminsul de Jesus Cano Calle. Director: Cristian BlancoTirado.


15/49

15

INTRODUCCIÓN

El colágeno es una de las proteínas más abundantes en tejidos de animales.

Estas proteínas hacen parte la matriz extracelular y le brindan propiedadesmecánicas, tales como la elasticidad, a los tejidos conectivos. [12] Estructuralmente

el colágeno tipo I está constituido por tres cadenas polipeptídicas denominadas

α1, α2 y β. [20] Estas cadenas se entrelazan para construir unidades de proteínas

de hasta 280 kDa.

En la naturaleza se encuentran 28 tipos de colágeno que se diferencian por su

secuencia aminoacídica y sus diferentes funciones.[20] El colágeno tipo I es el más

abundante de todos los colágenos y es de gran importancia en el campo de los

biomateriales, la industria farmacéutica y cosmética lo que ha impulsado la

investigación para encontrar nuevas fuentes de obtención de esta proteína.

En los últimos años se han realizado diversos estudios para la obtención de

colágeno tipo I de las diferentes partes del pollo como las patas, la piel y las

crestas.[3, 11] Se ha demostrado que el colágeno de las patas de los pollos es una

mezcla de de los tipos I y II, lo cual no es apetecido en la industria; [3] por otro lado

el colágeno proveniente de la piel del pollo se encuentra en una proporción muy

baja, solo 860g de proteína por cada 100kg de materia prima son obtenidos de

esta fuente, lo cual explica el poco interés por la utilización de esta materia prima.[4] Como consecuencia, las crestas, subproducto del sacrificio de pollos, son una

fuente importante de colágeno tipo I, pues se sabe que contienen alrededor del 1.6

% de colágeno en relación w/w.[11]

Las diversas aplicaciones industriales del colágeno crea la necesidad de tener una

fuente de esta proteína que permita su fácil extracción y que su rendimiento sea lo

suficiente alto para reducir costos de producción y abastecer parte de la demanda

de esta fuente de proteína.


16/49


17/49

17

1. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Gran parte del colágeno utilizado en las industrias farmacéutica, cosmética y de

biomateriales es importado del continente europeo, lo cual se ve reflejado en los

altos costos de los productos que utilizan esta proteína como principio activo.

Debido a que estas industrias están en constante desarrollo y expansión es de

gran importancia tener un proveedor a nivel nacional que permita la reducción de

costos y tiempos de entrega del colágeno. Esto sería posible si se lograra obtener

una fuente importante de colágeno que sea de fácil acceso y de constante

producción en Colombia.

La industria avícola genera varios residuos que pueden ser aprovechados para la

obtención de colágeno tipo I como se ha demostrado en diferentes

investigaciones. [12, 20, 3, 11] En el 2011, el sector avícola santandereano produjo

300.000 toneladas de pollo, representando el 26% de la producción nacional.[18]

Estos índices de producción presentan a Santander como una opción para el

desarrollo de este tipo de industria. Por esta razón se busca optimizar una

metodología de extracción de colágeno tipo I, aprovechando las crestas de pollo

criado en el departamento de Santander.


18/49

18

1.2. JUSTIFICACIÓN

La producción de carne de pollo, en Santander, genera una gran cantidad de

subproductos los cuales se utilizan para producir alimentos concentrados,

principalmente. Sin embargo estos subproductos son una alta fuente de proteína.

Por ejemplo, a partir de las crestas se puede extraer entre el 1 y 1.6% de colágeno

tipo I. [8] Con la extracción selectiva de este tipo de proteínas consideramos que es

posible generar valor agregado a la cadena productiva avícola del departamento.

Adicionalmente, el aislamiento y producción de estas nueva sustancias permite el

desarrollo de nuevas industrias como la farmacéutica y la de productos

cosméticos. La investigación en dichas áreas es de gran importancia, pues estos

centros se enfocan principalmente en temas como: el envejecimiento, la

desaparición de cicatrices y manchas en la piel. Estas investigaciones dependen

en parte de la disposición de colágeno ya que este es uno de los principios activos

en los productos utilizados en la regeneración celular.

El colágeno es ampliamente utilizado en la medicina como un sistema

biodegradable para la liberación de una gran variedad de drogas, incluyendo

anticonceptivos, antibióticos, insulina, hormonas del crecimiento entre otras. El

colágeno en forma de fibras se ha utilizado en el cierre de heridas quirúrgicas e

incisiones.[21] Se utiliza como material de sutura para modificar la velocidad de

absorción y para permitir la retención de la resistencia prolongada. Las suturas de

colágeno puro se utilizan en cirugía oftálmica, así como para otras aplicaciones. [18]

Debido a la posibilidad de utilizar los subproductos de la industria avícola para la

producción de colágeno tipo I, consideramos que este trabajo será de gran

impacto porque permite establecer las condiciones, a nivel de laboratorio, para el

posible escalamiento e industrialización de esta proteína.


19/49

19

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL

Optimizar un procedimiento de extracción de colágeno a partir de crestas de pollo,

producto del proceso de sacrificio avícola en Santander.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

2.2.1. Evaluar el efecto de la temperatura y el tiempo de incubación de la

pepsina para la obtención de colágeno tipo I.

2.2.2. Utilizar reactivos grado comercial y de fácil consecución para la

extracción selectiva de colágeno tipo I de las crestas de pollo

producido en las plantas de sacrificio de aves en el departamento de

Santander.

2.2.3. Caracterizar el colágeno por medio de diferentes técnicas

instrumentales con miras a certificar la calidad y pureza del colágeno

obtenido.

2.2.4. Cuantificar el rendimiento a escala de laboratorio de la producción decolágeno tipo I a partir de las crestas de pollo.


20/49

20

3. MARCO DE REFERENCIA

3.1. PROCESO DE EXTRACCIÓN

La primera investigación relacionada con la extracción de colágeno de fuentes

naturales fue realizada en Japón por Nagai y Suzuki, [13] los cuales obtuvieron

colágeno de diferentes especies de pescado utilizando la piel, el hueso y las

aletas. En esta investigación se analizó el perfil proteico de las cadenas α y β de

colágeno con un patrón de pesos moleculares.

Una de las propiedades a tener en cuenta según esta investigación es la

temperatura de desnaturalización de la proteína, que en la investigación realizada

por Nagai y Suzuki se encuentra en un rango de 25 a 26.5ºC para las diferentes

especies de pescado utilizadas.

Después de ser ampliamente investigado y de corroborar que el colágeno se

podía extraer de pieles de pescados, el mundo científico se abalanzó sobre otro

tipo fuentes de colágeno entre las que se encuentran: las patas de las aves, [11,8] la

piel bovina, [6,24] el tendón de los equinos [1], la piel del sapo [7,19], las escamas del

pescado

[14]

, las medusas

[15]

, la piel porcina

[16]

, la piel del tiburón

[17]

y la piel delos pollos [3]. Todas estas investigaciones se fundamentaron en el procedimiento

propuesto por Nagai y Suzuki en 1999; y Lin, Y. K. y Liu, D. C. en 2006

modificando levemente los tiempos y temperaturas de extracción.


21/49

21

3.2. MARCO TEÓRICO

3.2.1. Estructura del colágeno

Estructuralmente, el colágeno está constituido de una hélice triple de tres cadenas

polipeptídicas diferentes, las cuales se mantienen unidas por enlaces de

hidrogeno.[20] En 1994 se reportó por primera vez la estructura cristalina del

colágeno (Figura 1) mostrando que es una proteína rica en prolina, glicina e

hidroxiprolina; aminoácidos que le confieren su estructura característica. Cualquier

cambio en la secuencia de aminoácidos, cambia la conformación espacial de la

proteína, como se observa en la figura 2 en la cual se ha reemplazado un residuo

de glicina por alanina.

.

Figura 1. Estructura de las fibras de colágeno. Fuente:http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=4 consultada 10 de agosto de2012.


22/49

22

Figura 2. Cambio en la estructura tridimensional del colágeno al reemplazar unresiduo de glicina por alanina. Fuente:http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=4 consultada 10 de agosto de2012.

3.2.2. Usos y aplicaciones del colágeno

El colágeno posee propiedades únicas que le permiten ser utilizado en diferentesaplicaciones industriales, e.g. como materiales biomédicos, la industria

farmacéutica, cosmética y en alimentos. [21]

Un biomaterial es una sustancia farmacológicamente inerte diseñada para ser

implantada o incorporada dentro del sistema vivo. [22] Los biomateriales más

usados son las aleaciones metálicas, polímeros, cerámicos y sustancias

biológicas. Entre las sustancias biológicas, el colágeno ha sido uno de los más

empleados y más comerciales.


23/49

23

La principal aplicación del colágeno en la industria farmacéutica y cosmética es el

tratamiento de arrugas, desaparición de manchas de la piel y el encapsulamiento

de medicamentos lo que facilita la administración y dosificación del mismo. De

igual manera, se ha utilizado en la fabricación de productos cosméticos para elfortalecimiento del cabello y la reducción de horquilla. [22]

3.2.3. Fuentes de obtención

Los residuos de la piel, huesos y cartílagos bovinos y porcinos representan hoy

día la principal fuente de extracción de colágeno en la industria. Pero una de las

dificultades que presenta este tipo de colágeno es que no puede cubrir todos losmercados debido a limitaciones socio-culturales. Además el costo de obtención de

colágeno a partir de los bovinos y porcinos es elevado, debido al alto valor que

tiene la cría de este tipo de animales y la baja productividad que se puede obtener

de colágeno. [3]

La problemática anterior ha obligado a la búsqueda de fuentes alternativas de

materia prima para la obtención de colágeno, entre las estudiadas se encuentran

las patas de las aves, [11,8] la piel bovina, [6,24] el tendón de los equinos [1], la piel del

sapo [7,19], las escamas del pescado [14], las medusas [15], la piel porcina [16], la piel

del tiburón [17] y la piel de los pollos [3].

3.2.4. Técnicas Analíticas

Para la caracterización del colágeno se realizaron tres técnicas analíticas

diferentes, la electroforesis, la espectroscopia UV-VIS y la espectrometría demasas.


24/49

24

3.2.7.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio(SDS)

La electroforesis es una técnica de separación de moléculas gracias a la acción deun campo eléctrico. Las moléculas disueltas se desplazan en un campo eléctrico a

una velocidad determinada por su relación carga-masa. Para llevar a cavo la

electroforesis se prepara el gel de electroforesis en medio de dos láminas de vidrio

y mediante la polimerización de una solución de monómeros de acrilamida en

cadena de poliacrilamida. Para poder determinar el rango del peso molecular de

las moléculas se utiliza un marcador de peso molecular. Finalmente el revelado se

realiza con azul de coomassie. [12]

3.2.7.2. Espectrometría de Masas - MALDI/TOF

Para la caracterización espectrométrica se utilizó la técnica MALDI-TOF, la cual

utiliza una matriz para proteger a la biomolécula y facilitar la vaporización,[5] en

esta investigación se empleo el acido cinámico dopado con un 1% de ácido

trifluoroacético como matriz de soporte. La muestra es entonces irradiada con unláser pulsado, como un láser de Nd:Yag de 355 nm. La energía del láser expulsa

iones de la matriz electrónicamente excitados, cationes y macromoléculas

neutrales, que crean una densa nube de gas por encima de la superficie de la

muestra. La separación de las moléculas se da por su relación masa-carga en un

analizador de tiempo de vuelo.


25/49

25

3.2.7.3. Espectroscopia Ultravioleta-Visible

El principio de la espectroscopia involucra la absorción de radiación ultravioleta-

visible (desde 160 hasta 780nm) por una molécula, causando la promoción de unelectrón de un estado basal a un estado excitado. [23]

La absorción de radiación UV-visible por una especie se da en 2 etapas:

1. La Excitación electrónica: corresponde a los electrones involucrados en los

enlaces

2. La Relajación. que puede ser por:

- Emisión de calor

- Reacción fotoquímica

- Emisión de fluorescencia / fosforescencia

Las bandas que aparecen en un espectro UV-visible son anchas, a causa de la

superposicion de transiciones vibracionales y electrónicas.

[23]


26/49

26

4. METODOLOGÍA

4.1. DISEÑO EXPERIMENTAL

Para poder evaluar la repetitividad, precisión, desviación estándar y demás

parámetros estadísticos se realizó un diseño experimental para determinar

cuántos experimentos se debían hacer, teniendo en cuenta que solo se iban a

modificar dos variables la temperatura y el tiempo de acción de la pepsina sobre la

materia prima (crestas), los tiempos y temperaturas a evaluar se registran en la

tabla 1.

Tabla 1. Variables a modificar. Fuente: el autor.

Temperaturas (°C) Tiempo (h)4 1226 2436 36

Debido a que fueron solo dos variables el diseño resultante es cuadrático como se

observa en la figura 3.

En la figura 3 se señalaron los puntos en los cuales se trabajaron bajo la acción de

la pepsina, teniendo en cuenta que cada experimento se realizó por duplicado y

que el punto en el cual se encuentran todas las proyecciones de los experimentos

(experimento de 24 horas a 26ºC) se le realizaron tres extracciones más para

realizar la estadística de las extracciones, se reúnen un total de 21 extracciones.


27/49

27

Figura 3. Representación gráfica del diseño experimental.

4.1. PREPARACIÓN DE LA MATERIA PRIMA

Las crestas fueron seleccionadas de dos proveedores distintos, uno de pollos

criollos de los puestos de la plaza de mercado central y otro de una avicultora dela planta de campollo de Rionegro-Santander.

Las crestas fueron prelavadas con agua destilada y cortadas en trozos pequeños

de aproximadamente 1 cm (Figura 4), para luego ser licuadas (Figura 5)

obteniendo una masa más homogénea como se muestra en la figura 6. Las

muestras fueron almacenadas a -20 ºC en un congelador de laboratorio Thermo

Scintific forma Value FREF 2117A, para conservar la muestra y evitar su

descomposición.

Tem. (°C)

Tiempo (h)

36

26

4

12 24 36


28/49

28

Figura 4. Crestas enteras y picadas. Fuente: el autor.

Figura 5. Crestas cortadas y listas para licuar. Fuente: el autor.


29/49

29

Figura 6. Muestra homogénea, lista para ser tratada. Fuente: el autor.

4.2. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL COLÁGENO

Se siguió el procedimiento descrito por Lin y Liu [8] para aproximadamente 100

gramos de cresta, modificando los tiempos y la temperatura de acción de la

pepsina en la muestra.

En primer lugar se realizó la eliminación de las grasas y pigmentos mediante una

agitación constante en etanol al 20% durante 24 h a 4ºC. El paso siguiente fue

centrifugar la muestra a 10.000 g por 20 minutos y se desechó el sobrenadante en

el cual se encontraban todas la grasas presentes en el tejido tratado, este

procedimiento se realizó dos veces para asegurar la eliminación total de la grasa y

los pigmentos no deseados.

Posteriormente se eliminó la proteínas no colágenas mediante agitación constantecon NaOH 0.2 N por un tiempo de 24 h, para luego centrifugar nuevamente a

10.000 g durante 20 minutos y después se desechó el sobrenadante. A

continuación se agrego 5% p/p de pepsina (EC 232-629-3, P-7000, Sigma,

EE.UU.) y 500 mL de acido acético 0.5 M al precipitado. La mezcla se sometió a


30/49

30

diferentes temperaturas y tiempos de acción de la pepsina (tabla 2). La mezcla se

centrifugó a 13.000 g durante 40 minutos, el sobrenadante se ajusto a pH 7.0

mediante NaOH 1 N y se mantuvo en agitación durante 24 h para inhibir la

actividad de la pepsina, trascurridas las 24 h se ajustó nuevamente el pH a 3.5 conácido acético 0.5 M. Por último, se añadió NaCl lentamente hasta una

concentración final de 0.9 M para precipitar la proteína, esta mezcla se centrifugó

a 13.000 g durante 40 minutos, el precipitado resultante se disolvió en acido

acético 0.5 M. Se realizó diálisis frente a agua destilada con una membrana

(Spectra/ for Dialysis Membrane MWCO: 12-14,000). Finalmente la solución fue

liofilizada en un liofilizador labconco lyph-lock para obtener la proteína pura y seca.

4.3.1. Diálisis

Se utilizaron segmentos de 10 cm de longitud de una membrana para diálisis

marca Spectra con 20.4 mm diámetro. Estas bolsas formadas se sumergieron en

500 mL de agua destilada a 100ºC para activar los poros de la membrana, los

cuales permiten el intercambio iónico. Posteriormente se cerró en uno de los

extremos y se adiciono la solución de ácido acético 0.5 M que contenía la proteínadisuelta; se anudo el otro extremo de la bolsa y se sumergió en agua destilada

durante 6 horas realizando un cambio del agua cada 2 horas.

4.3.2. Liofilización

Para el proceso de liofilización se utilizó un liofilizador marca labconco lyph-lock

(Figura 7), inicialmente los recipientes se llenaron a la mitad de su capacidad y secongelaron en un refrigerador convencional durante 24 horas previas a la

liofilización. Se configuró el correspondiente proceso de liofilización ingresando las

rampas de temperatura y tiempo (Figura 8). Se encendió la bomba de vacío y se

esperó hasta alcanzar los 0.133 mbarr. Las muestras se mantuvieron congeladas


31/49

31

a -40ºC y al vacío durante 3 horas, luego a -10ºC durante otras 3 horas

conservando el vacío y finalmente a 25ºC durante 15 horas al mismo vacío

utilizado en los anteriores procesos. Cuando el equipo termino la etapa de secado

primario se procedió a realizar el cambio de manual a automático. Finalmente alterminar el proceso se retiraron los recipientes y se procedió a pesarlos para

calcular los rendimientos de cada extracción.

Figura 7. Liofilizador marca labconco lyph-lock.

Figura 8. Rampas de temperatura y tiempo programadas en el liofilizador.


32/49

32

4.4. CARACTERIZACIÓN DEL COLÁGENO

4.4.1. Perfil Proteico - Electroforesis

Para obtener el perfil proteico se realizó electroforesis en geles de poliacrilamida-

SDS, utilizando una cámara MiniProtean I marca Biorad. Se preparó una solución

acuosa de la proteína a 0.25 µg/µL de cada una de las extracciones realizadas; de

estas soluciones se tomaron 12 µL y se mezclaron con 3 µL de buffer de carga

para finalmente sembrarlas en geles al 10%. Estos geles se prepararon de

acuerdo al protocolo mostrado en la tabla 2. Después de realizado el montaje se

utilizó como buffer de corrida la solución mostrada en la tabla 4.

Tabla 2. Componentes y volúmenes para el gel de separación.

COMPOSICIÓNGEL DE CORRIDO

AL 10%

GEL DE STACKING

AL 5%

Agua destilada tipo I 1.9 mL 0.93 mL

Acrilamida-Bisacrilamida 1.7 mL 0.23 mL

Tris-HCl pH=8.8 y pH=6.8

para stacking1.3 mL 0.375 mL

Persulfato de Amonio 0.0025mL 0.015 mL

SDS al 10% 0.005 mL 0.03 mL

Temed 0.001 mL 0.0075 mL

Tabla 3. Composición del buffer de corrido.

BUFFER DE CORRIDO

Tris Base 0.20%

Glicina 1.44%

SDS 0.10%


33/49

33

Figura 9. Montaje utilizado para realizar electroforesis en geles de poliacrilamida

SDS. El voltaje utilizado fue de 120 V y una corriente de 3 A durante 1 hora y 30

minutos. Fuente: el autor.

Los geles fueron teñidos con azul de Coomassie al 0.25% durante 1 hora, con el

fin de determinar el peso molecular de las proteínas presentes en el colágeno.Para conocer el respectivo peso molecular se utilizó como marcador de peso

FERMETAS, que contiene proteínas entre los 10 y 200 kDa. A continuación, se

sumergió el gel en una solución decolorante fuerte durante 30 minutos y

finalmente en una solución decolorante débil durante 1 hora. En la tabla 5 se

muestra la composición de la solución colorante y las decolorantes para la tinción

con azul de coomassie R250.

Fuente de

poderCámara de

electroforesis


34/49

34

Tabla 4. Composición de la solución colorante y las decolorantes.

SOLUCIÓN

COLORANTE

SOLUCI N

DECOLORANTE

FUERTE

SOLUCIÓN

DECOLORANTE DEBIL

Metanol 50% Metanol 50% Metanol 5%

Ácido acético 10% Ácido acético 10% Ácido acético 10%

Azul de Comassie 0.25% - -

4.4.2. Espectroscopia UV-Vis

Se prepararon soluciones de cada extracción a una concentración de 0.25 µg /µL

de proteína para ser caracterizadas por un espectrofotómetro UV-Vis marca

Shimadzu UV-1601-1601 PC con un ancho de rejilla de 0.5 nm. Se realizó un

barrido desde los 200 nm hasta los 500 nm y se determinó la longitud de onda

máxima característica para cada solución de las diferentes extracciones. La

solución se colocó en una cubeta de cuarzo y la absorbancia resultante se calculó

empleando la ley de Lambert-Beer.

4.4.3. Espectrometría de Masas

Para complementar la identificación del colágeno se empleo la técnica de

ionización suave denominada MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser

Desorption/Ionizatiom- Time of Fligth) que permite el análisis de biomoléculas y

moléculas orgánicas de gran tamaño.

La matriz empleada para este análisis fue el ácido cinámico utilizado por Klaus

Dreisewerd y colaboradores.[4] Se implementó la metodología de doble capa

siguiendo las recomendaciones del fabricante del equipo. Inicialmente se preparó


35/49


36/49

36

5. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

5.1. EXTRACCIÓN DE COLÁGENO

Los resultados de las diferentes extracciones se muestran en la tabla 5, en estetrabajo se contemplaron dos variables: el tiempo y la temperatura de acción de lapepsina sobre las crestas.

Tabla 5. Cantidades tratadas y cantidad de colágeno obtenido.

Tratamiento

Peso de crestas

(g)

Peso de pepsina

(g)

Colágeno

obtenido (g)12h - 4ºC

80.50 5.19 0.6534100.00 5.07 0.9845

12 h – 26ºC100.35 5.03 1.023570.00 4.88 0.8334

12h – 36ºC71.02 4.62 0.681799.95 4.99 1.6057

24h – 4ºC100.00 5.01 1.045380.06 5.05 0.7596

24h – 26ºC

80.51 5.04 1.129599.97 5.02 1.219399.76 4.96 1.220099.65 5.01 1.2412

100.35 5.05 1.2406

24h – 36ºC99.74 5.07 1.4533

100.98 4.96 2.1258

36h – 4ºC99.12 4.90 1.043888.19 5.02 0.8053

36h – 26ºC99.72 5.02 2.550388.22 4.98 2.0536

36h – 36ºC100.33 5.05 1.7671

88.11 4.94 1.7467

Los resultados obtenidos se promediaron, se calculó el rendimiento y desviaciónestándar mostrados en la tabla 6.


37/49

37

Tabla 6. Rendimientos y desviaciones estándar de las extracciones.

Tratamiento Rendimiento (%)Desviaciónestándar

Coeficientede Varianza

(%)12h – 4ºC 0.90 0,12 13,61

12h – 26ºC 1.11 0,12 10,9212h – 36ºC 1.28 0,46 35,6324h – 4ºC 1.00 0,07 6,84

24h – 26ºC 1.27 0,08 6,1324h – 36ºC 1.78 0,46 25,7336h – 4ºC 0.98 0,10 10,06

36h – 26ºC 2.44 0,16 6,6536h – 36ºC 1.87 0,16 8,35

Al comparar los resultados obtenidos, se aprecia que el rendimiento alcanzado en

los diferentes tratamientos son muy similares a los obtenidos por Lin y Liu, [8] entre

el 0.7 y 1.6%. En este trabajo se logró un rendimiento significativamente mayor a

los reportados en la literatura, empleando el tratamiento de 36 horas y 26ºC con el

cual se obtuvo un rendimiento del 2.44%, lo cual incrementa en un 0.84% lo

esperado según Lin y Liu.[8]

Por otro lado las desviaciones estándar obtenidas en cada uno de los

experimentos ejecutados muestran una alta reproducibilidad en las extracciones

realizadas. Los tratamientos de 24 horas – 4ºC y 24 horas - 26ºC presentan

desviaciones estándar por debajo de 0.1 y con coeficiente de varianza inferior al

10%, lo que indica que fueron los tratamientos con mayor reproducibilidad, estos

resultados se evidencian en la tabla 5.

Al analizar la desviación obtenida por el tratamiento que mostró mejores

resultados en cuanto al rendimiento de extracción (36h-26ºC), se observa que su

desviación estándar esta en un valor aceptable, ya que 0.16 no representa gran

incertidumbre en el proceso de extracción y siguen presentando menos del 10%

en su coeficiente de varianza, cumpliendo con las buenas prácticas de laboratorio.


38/49

38

200

150

120

5.2. DETERMINACIÓN DEL PERFIL PROTEICO DE LAS EXTRACCIONES DECOLÁGENO

Inicialmente se realizó la extracción de colágeno de las crestas sin tratarlas con lapepsina, con el fin de evaluar la posibilidad de no implementar este reactivo y

reducir en gran parte los costos de la investigación. En la figura 10 se observan los

resultados obtenidos, donde se evidencian un gran número de proteínas por

encima de los pesos esperados. Esto indica la posible formación de dímeros y

trímeros de las cadenas alfa del colágeno y la presencia de otras proteínas no

colágenas, lo cual evidencia que las extracciones realizadas no cumplen con los

resultados esperados ni los reportados en la literatura. [9] Por esta razón se decidió

utilizar la pepsina con el fin de realizar la ruptura de estos enlaces y

adicionalmente eliminar las proteínas no colágenas que podrían contaminar la

muestra final.

Figura 10. Gel de SDS-PAGE al 7.5% sin tratar las muestras con pepsina;tratamiento 24 h -26ºC.


39/49

39

kDa

En la figura 11 se observan los resultados de la separación de proteínas en los

geles al 10% para cada método de extracción, las bandas de las cadenas alfa se

encuentran en el rango de los 100 y 120 kDa. Los perfiles de electroforesis solo

presentan 3 bandas de interés, las cadenas α1 y α2 se observan claramente entodas las extracciones realizadas en aproximadamente 100 kDa y 120 kDa, estas

dos bandas son las cadenas más representativas e importantes del colágeno tipo

I. Por otro lado, la cadena β aparece por encima de los 200 KDa lo que no permite

su plena identificación ya que este es el límite del marcador de peso molecular

utilizado.

Los anteriores resultados concuerdan con los obtenidos por Lin y Liu [8, 9], que

reportan bandas de 97 kDa y 120 kDa para estas cadenas alfa (figura 12). Este

tipo de detección se basa en la formación de complejos fuertes con las proteínas,

interaccionando electrostáticamente con los grupos aminos y se correlaciona mas

con la cantidad de aminoácidos básicos de las proteínas que con su masa total. [2]

Las masas moleculares de las proteínas se calcularon a partir de los geles SDS-

PAGE mostradas en la figura 11.

(A)


40/49

40

kDa

(B)

Figura 11. Geles de SDS-PAGE al 10%: A) tratamientos de 12 horas y 24 h. B)tratamientos de 36 horas.


41/49

41

Figura 12. Electroforesis (SDS-PAGE) de colágeno tipo I de diferentes especies

animales (M: marcador molecular; BF, patas de aves; BS, piel bovina; FS, piel derana; PS, piel de cerdo; SS, piel del tiburón, C II, colágeno tipo II de pollo Sigma).Tomado de: LIN, Y., LIU, D; “Comparison of physical –chemical properties of type Icollagen from different species”; Food Chemistry 99 (2006) 244–251.[9]


42/49

42

5.3. ESPECTROSCOIA UV-VIS

Otra de las técnicas utilizadas para caracterizar el colágeno extraído fue la

espectroscopia Ultravioleta – Visible, donde se obtuvieron los espectros que

confirmaron la presencia de colágeno tipo I (figura 13). El colágeno extraído

presenta un pico de absorción entre los 215 y 220 nm.

El espectro UV-Vis del colágeno se puede utilizar para detectar cualquier

contaminante y para verificar la integridad de los telopéptidos no helicoidales. En

este estudio, cada espectro presenta un perfil con tendencia a una campana

gaussiana con un pico de alta absorción en la región antes mencionada. Este pico

de absorción concuerda con la región obtenida en las investigaciones realizadas

por Lin, Tan y Liu, [9, 8] cuyos espectros mostraron un pico de absorción a los

218 nm para el colágeno tipo I de diferentes especies animales.

Lin y Liu [8] indicaron que los espectro de absorbancia de UV-Vis de las diferentes

especies de colágeno se veía desplazado asía longitudes de onda superiores a los

250 nm debido a los contaminantes proteicos. En este estudio, los espectros de

colágeno obtenido son más estrechos, lo que indica que el colágeno extraído tenía

menos contaminantes.


43/49

43

Figura 13. Espectros UV-Vis del colágeno extraído; tratamiento con pepsina

durante 36 horas.

Figura 14. Espetros UV-Vis de colágeno tipo I de diferentes espécies animales.Tomado de: LIN, Y., LIU, D.[9]

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350

A b s o r b a

n c i a

Longitud de onda (nm)

36h-4ºC

36h-26ºC

36h-36ºC


44/49

44

5.4. ESPECTROMETRÍA DE MASAS

El colágeno tipo I mostro tres señales en el espectro de masas (figura 15), se

observan las señales correspondientes a la cadena alfa 1 en 93.26 kDa, la alfa 2

en 140.37 kDa y la cadena beta que por medio de las electroforesis solo se podía

reportar por encima de los 200 kDa mostró que su peso esta en 283.76 kDa,

siendo este el primer reporte del peso exacto de esta cadena del colágeno.

Debido a que el espectrómetro de masas es un UV-MALDI-MS se pudo corroborar

al igual que el trabajo hecho por Klaus Dreisewerd[4] que este tipo de equipos no

alcanzan a generar la energía necesaria para que la muestra pase al estado

gaseoso para luego ser detectada obligando a la matriz a hacer todo el trabajo, a

diferencia de lo reportado por Dreisewerd con un IR-MALDI-MS donde las señales

son mucho más limpias y definidas.

Figura 15. Espectro de masas del colágeno tipo I, utilizando UV-MALDI-MS.


45/49

45

CONCLUSIONES

El colágeno obtenido de las crestas de pollo es tipo I como se pudo corroborar con

los análisis de electroforesis. Estos análisis muestran que las tres bandas que

componen este tipo de colágeno son la banda alfa 1 a ~100 kDa, la alfa 2 a ~120

kDa y la beta por encima de los 200 kDa.

En el espectro de absorcion UV-Vis se observó una banda en el rango de 215 a

220 nm, lo que permitió corroborar que la proteína extraída fue el colágeno tipo I,

al comparar los espectros con los reportados en la literatura.

El resultado más significativo en la caracterización fue el espectro de masasobtenido por MALDI-TOF, en el cual se observa que la cadena alfa 1 tiene una

masa de 93.26 kDa, la alfa 2 de 140.37 kDa y la cadena beta de 283.76 kDa.

El tratamiento con pepsina de 36 horas a 26ºC fue el que mostró mayor

rendimiento con un 2.44% en la extracción de colágeno.

El bajo costo y amplia disponibilidad de las crestas de pollo en Santander, hacen

que sea una alternativa viable para escalar a nivel industrial la producción de

colágeno.

El colágeno obtenido a partir de las crestas de pollo puede ser un buen sustituto

para el colágeno bovino o porcino que se encuentra en el mercado para el uso

biomédico.


46/49

46

RECOMENDACIONES

Durante el proceso de extracción se presenta una cantidad representativa de

grasa que es eliminada en la etapa de lavado. Es importante investigar alguna

aplicación que le pueda dar un valor agregado a este subproducto de la

extracción.

Es necesario identificar las operaciones unitarias y los equipos para escalar el

proceso de extracción a nivel industrial, ya que se demostró que las crestas son

una buena fuente de colágeno tipo I.

Se puede mejorar la señal del espectro de masas realizando variaciones en larelación matriz – muestra, ya que la cristalización de la muestra sobre el target es

un factor muy importante a la hora de impactar la muestra con el laser del

espectrómetro MALDI.


47/49

47

BIBLIOGRAFÍA

[1] Angele, P., Abke, J., Kujat, R., Faltermerier, H., Schumann, D., Nerlich, M., et

al. Influence of different collagen species on physico-chemical properties of

crosslinked collagen matrices. 2004, Biomaterials, 25, 2831 –2841.

[2] Brush, M. Dye Hard: Protein Gel Staining Products. The Scientist. Vol. 12, 10

(1998); p.16.

[3] Cliché S., Amiot J., Avezard C., and Gariepy C.. Extraction andCharacterization of Collagen with or Without Telopeptides from Chicken Skin.2003, Poultry Science 82:503 –509.

[4] DREISEWERD, Klaus., ROHLFING, Andreas. Characterization of Whole Fibril-

Forming Collagen Proteins of Types I, III, and V from Fetal Calf Skin by

Infrared Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Anal.

Chem. 2004, 76, 3482-349.

[5] GROSS Jurgen. Mass Spectrometry, primer edición. Berlin: Editorial Springer.,

2004., Pág. 1-3.

[6] Huang, L. H., & Nimni, M. E. Preparation of type I collagen fibrillar matrices and

the effect of collagen concentration on fibroblast contraction. 1993, Biomedical

Engineering-Applications Basis Communications, 5, 60 –71.

[7] Li, H., Liu, B. L., Gao, L. Z., & Chen, H. L. Studies on bullfrog skin collagen.

2004, Food Chemistry, 84, 65 –69.

[8] Lin, Y. K., & Liu, D. C. Effect of pepsin digestion at different temperatures and

time on properties of telopeptide-poor collagen from bird feet. 2006, Food

Chemistry, 94, 621 –625.


48/49

48

[9] LIN, Y., LIU, D; “Comparison of physical–chemical properties of type I collagen

from different species”; Food Chemistry 99 (2006) 244–251.

[10] LIN, Yen-Chih., TAN Fa-jui., MARRA Kacey G., LIU Deng-Cheng. Evaluation of

pepsin digestion of atelocollagen from different chicken combs at low

temperature, 2009 Food Chemistry.

[11] Liu, D. C., Lin, Y. K., & Chen, M. T. Optimum condition of extracting collagen

from chicken feet and its characteristics. 2001, Asian- Australasian Journal of

Animal Sciences, 14, 1638 –1644.

[12] Lodish Harvey; Berk Arnold. Biologia celular y molecular, 5a Edición. Buenos

Aires: Editorial medica Panamericana., 2005., Pág. 87.

[13] Nagai, T. and T. Suzuki. Isolation of collagen from fish waste material: (skin,

bone and fins). 1999, Food Chemistry68: 277-281.

[14] Nomura, Y., Sakai, H., Ishii, Y., & Shirai, K. Preparation and some properties of

type I collagen from fish scales. 1996, Bioscience Biotechnology and

Biochemistry, 60, 2092 –2094.

[15] Nagai, T., Worawattanamateekul, W., Suzuki, N., Nakamura, T., Ito, T., Fujiki,

K., et al. Isolation and characterization of collagen from rhizostomous jellyfish

(Rhopilema asamushi). 2000, Food Chemistry, 70, 205 –208.

[16] Nomura, Y., Toki, S., Ishii, Y., & Shirai, K. Improvement of the material property

of shark type I collagen by composing with pig type I collagen. 2000, Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 48, 6332 –6336.

[17] Nomura, Y., Yamano, M., Hayakawa, C., Ishii, Y., & Shirai, K. Structuralproperty and in vitro self-assembly of shark type I collagen. 1997, Bioscience

Biotechnology and Biochemistry, 61, 1919 –1923.


49/49

[18] Ordenanza N° 013 del 23 de Abril de 2012 Plan de Desarrollo, SANTANDEREN SERIO, EL GOBIERNO DE LA GENTE, 2012-2015. Disponible en:http://www.asambleadesantander.gov.co/Doc/Foro/pddsantander.pdf.

[19] Purna, K., & Babu, M. Studies on Rana tigerina skin collagen. 2001,Comparative Biochemistry and Physiology B, 128, 81 –90.

[20] Shoulders Matthew, Raines Ronald. Collagen Structure and Stability. 2009, Annual Review of Biochemistry 78:929 –58.

[21] Shu- Tung Li. Biologic Biomaterials: Tissue- Derived Biomaterials (Collagen).2003, CRC Press LLC. Cap. 6 pag. 117-135.

[22] SILVER FREDERICK; ATUL K. GARG. Collagen: Characterization, processing

and medical applications. Handbook of Biodegradable Polymers, Cap 17.

[23] VILLEGAS Wilbert; ACERETO Pablo; VARGAS Mimi. Analisis Ultravioleta-

Visible, primer edición. Merida: Universidad Autonoma de Yucatan., 2006., 4-1

a 4-7.

[24] Yoshimura, K., Hozan, D., Chona, Y., & Shirai, K. Comparison of the physico-

chemical properties of shark skin collagen and pig and bovine skins. 1996,

Animal Science and Technology, 67, 445 –454.

colágeno a partir de crestas de pollo

Documents