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Cómo investigar sobre la visión
Salón de Actos. Colegio Paseo Rosales. Molina de Segura
24 de abril, 2012. 18.00h-20.30h
Fundación de Estudios Médicos
de Molina de Segura
Manuel Vidal-Sanz Laboratorio de Oftalmología Experimental
Departamento de Oftalmología Universidad de Murcia,
Murcia, España
Modelos de lesión retiniana como herramientas para estudiar la plasticidad
neuronal
Modelos de lesión retiniana como herramientas para estudiar la plasticidad
neuronal
Caracterización de la vía retino-colicular
Regeneración en el sistema visual del mamífero adulto
Neuroprotección en la retina
Degeneración en la retina
Superior Colliculus
Modelos de lesión retiniana como herramientas para estudiar la plasticidad
neuronal
Caracterización de la vía retino-colicular
Regeneración en el sistema visual del mamífero adulto
Neuroprotección en la retina
Degeneración en la retina
La población de ganglionares, y amacrinas desplazadas
La población de conos S y de conos LM
El espesor de las capas de la retina
Laboratorio de Oftalmología Experimental, Universidad de Murcia
En la vía visual del roedor adulto hemos desarrollado técnicas para
estudiar cuantitativamente
El volumen de la proyección retino-tectal
METHODS: (1) Labeling of RGCs with FG
Fluorogold
METHODS: Counting FG-labeled RGCs
s
•P1-od-12-2wks
S
Vidal-Sanz et al., Exp Neurol 1988; 102:92; Villegas-Pérez et al., J Neurosci 1988; 8:265. Peinado-Ramón et al., IOVS 1996; 37:489
0
15.000
30.000
45.000
60.000
75.000
90.000
n = 37 n = 27
Total number of FG-labelled RGCs
81,486±4,340
Area = 45.24 mm2
FG-labelled RGCs = 76,390
Mean density = 1,689 cells/mm2
Salinas-Navarro et al., Vision Res 2009; 49:115-126,
S
T N
I
Adult SD rats
82,818±3,949
SCi ON
Vision Res. 2009; 49:637-647
Adult Swis mice Adult C57 mice
0 6250 Salinas-Navarro et al., Vision Res (2009) 49:637-647
0
10.000
20.000
30.000
40.000
50.000
n = 43 N = 18
Total number of FG-labelled RGCs (Swiss)
48,733±3,954 49,493±3,936
SC ON
Total number of Brn3a+-RGCs
Total nubmer of FG+-CGR
84,682±7,601
Nadal-Nicolás et al, Invest Opththalmol Vis Sci 2009;50:3860-3868; Galindo-Romero et al, Exp Eye Res 2011;92:377-387
S
T N
I
Brn3a AS A MARKER FOR NAÏVE AND LESIONED RAT RGCs
80,252±2,210
Brn3a FG
0 3.500
0
15.000
30.000
45.000
60.000
75.000
90.000
n = 14 n = 14
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
n= 9 n= 9
Total number of Brn3a+-RGCs
Total number of OHSt+-RGCs
34,627±1,821
Nadal-Nicolás et al, Invest Opththalmol Vis Sci 2009;50:3860-3868; Galindo-Romero et al, Exp Eye Res 2011;92:377-387
S
T
N
I
Brn3a AS A MARKER FOR NAÏVE AND INJURED MICE RGCs
40,437±3,196
Brn3a OHSt
0 4.800
Brn3a+RGCs Brn3a+RGCs isodensity map
DAPI DAPI Isodensity map
96,061 Brn3a+RGCs RE control
240,345 DAPI nuclei Vidal-Sanz et al., Progr. Ret Eye Res. 2012:1-27
S
T N
I
Brn3a+-RGCs and ipRGCs in SD rat retina
0 3.500
Right eye Left eye
S
T N
I
0-2 >21
Brn3a+-RGCs 78,423 ± 2,957 (n=10)
ipRGCs 2,046.50 ± 309.04 (n=10)
Morphometric and
Microscopic analysis
•P7
•P5 •P4 •P3
•P1
•P2
•P21
•P20 •P19 •P18
•P17
•P16
•P15
•P14
•P13
•P12
•P11
•P10
•P9
•P8
•Magnificación x20
•Nervio óptico
•P6
•150 μm
•150 μm
•500 píxeles
Total
ONL
INL
OPL
Authomatic detection of retinal layer limits to determine
its mean width
CNE automática
CNE manual
CNI automática
CNI manual
CPE automática
CPE manual
Histogram of the mean value of the width in several retinal
layers obtained manually and authomatically.
Puntos de muestreo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NO 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Es
pe
so
r d
e l
as
ca
pa
s (
m)
0
10
20
30
40
50
CNE automática
CNE manual
CNI automática
CNI manual
CPE automática
CPE manual
Ortín-Martínez et al., (2010) Invest. Opthahlmol. Vis. Sci. 51:3171-3183
Ortín-Martínez et al., (2010) Invest. Opthahlmol. Vis. Sci. 51:3171-3183
0
25.000
50.000
75.000
100.000
125.000
150.000
175.000
200.000
225.000
250.000
Cones LM Cones S Cones LM Cones S
231,736
±14,51
41,028
±5,074
27,316
±2,235
239,939
±6,494
SD
(n=14)
PVG
(n=12)
Total number of LM- and S-cones in SD or PVG rats
N T
S
I
OI OD
Sprague-Dawley Piebald Virol Glax
OI OD
S
I
T
S-cones LM-cones
0 6500 0 1300 0 900
Piebald Virol Glaxo
Sprague Dawley
RGCs LM Cones
RGCs LM Cones
0 3,500 cells/mm2 0 6,500 cells/mm2 0 1,300 cells/mm2
FG-RGCs Conos-LM Conos-S
N
OD
S
I
T
Sprague Dawley
78.514 243.394 41.820
TRAZADO ANTERÓGRADO DE LA PROYECCIÓN RETINO-TECTAL
1. Inyección intravítrea de la subunidad B de la toxina colérica (CTB)
2. Transporte anterógrado de la CTB a lo largo de la proyección retino-tectal 3.- Corte seriado del cerebro medio. Inmunocitoquímica para revelar la CTB
4.- Análisis densitométrico de áreas intensamente marcadas con CTB
CTB
Avilés-Trigueros et al., Exp Neurol 2003;184:767-777; Mayor-Torroglosa et al., IOVS 2005; 46:3825-3835
Control
Avilés-Trigueros et al., Exp. Neurol. 2003;184:767-777; Mayor-Torroglosa et al., IOVS 2005; 46:3825-3835
Con 11 Vol = 2.350 mm3
r2 = 0.985
depth (mm)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
are
a (
mm
2)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Volume of the retino-tectal projection
Avilés-Trigueros et al., Exp. Neurol. 2003;184:767-777; Mayor-Torroglosa et al., IOVS 2005; 46:3825-3835
Estas técnicas modernas permiten la cuantificación de parámetros biológicos.
Vidal-Sanz et al., Exp Neurol 1988; 102:92-101
Villegas-Pérez et al., J. Neurosci. 1988; 8:265-80. Vidal-Sanz et al., J Neurosci 1987; 7:2894-2909.
Vidal-Sanz et al., Progr Brain Res 2002; 137: 441-450.
Avilés-Trigueros et al., Exp Neurol 2003; 184:767-777
Mayor-Torroglosa et al., IOVS 2005; 46:3825-3835
Vidal-Sanz et al., Eye 2007; 21:S42-S45
Sobrado-Calvo et al., J Comp Neurol 2007; 501:866-78.
Salinas-Navarro et al., Vision Res 2009; 49:115-126
Salinas-Navarro et al., Vision Res 2009; 49:637-647
Nadal-Nicolás et al., IOVS 2009; 50:3860-3868
Ortín-Martínez et al., IOVS 2010; 51:3171-3183
Galindo-Romero et al., Exp. Eye Res. 2011; 92:377-87
Sánchez-Migallón et al., Exp. Eye Res. 2011; 92:260-267
Vidal-Sanz et al., Prog. Ret. Eye Res. 2012; 1-27
Estudios anatómicos de la vía retino-tectal
Modelos de lesión retiniana como herramientas para estudiar la plasticidad
neuronal
Caracterización de la vía retino-colicular
Regeneración en el sistema visual del mamífero adulto
Neuroprotección en la retina
Degeneración en la retina
músculo médula espinal
•http://faculty.washington.edu/chudler/chreflex.html
axón células gliales
Degeneración
anterógrada
Degeneración
retrógrada
Sistema nervioso periférico
Sistema nervioso central
Sistema nervioso periférico
Sistema nervioso central
Regeneración axonal
Re-extensión y arborización terminal
Diferenciación y sinaptogénesis
Reinervación funcional
Vidal-Sanz et al., J. Neurosci. 1987; 9:2894-2909
Keirstead et al., Science 1989; 246:255-257
Vidal-Sanz et al., J. Neurocytol. 1991; 20:940-952
Whiteley et al., Exp. Neurol. 1998; 154:560-572
Avilés-Trigueros et al., J. Neurosci. 2000; 20:361-372
Vidal-Sanz et al., Prog. Brain Res. 2002; 137:443-452
Modelos de lesión retiniana como herramientas para estudiar la plasticidad
neuronal
Caracterización de la vía retino-colicular
Regeneración en el sistema visual del mamífero adulto
Neuroprotección en la retina
Degeneración en la retina
Axón Células gliales
Degeneración
Anterógrada
Degeneración
Retrógrada
Degneración retiniana
Villegas-Pérez et al., J. Neurosci. (1988) 8:265-280
Villegas-Pérez et al., J. Neurobiol. (1993) 24:23-36
Axotomía
Efectos de la seción del nervio óptico (SNO) en la supervivencia de las CGR
Sobrado-Calvo et al., J. Comp. Neurol. (2007) 501: 866-878
Peinado-Ramón et al., IOVS (1996) 37:489-500
0
500
1000
1500
2000
2500
Control n=20 4 días n=11 5 días n=6 7 días n=6 9 días n=6 12 días n=6
Supervivencia de CGR tras la SNO Densidades (CGR/mm2) de CGR marcadas con FG (media±DS)
Control
SNO *
Peinado-Ramón y cols., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996; 37:489-500
Aplastamiento intraorbitario del nervio óptico
Efectos del aplastamiento del nervio óptico (ApNO) en la supervivencia de las CGR
0
500
1000
1500
2000
Control n=41 5 días n=8 7 días n=5 9 días n=8 12 días n=5
Control
ApNO
*
Parrilla –Reverter et al., Exp Eye Res. 2009; 89:32-41.
Supervivencia de CGR tras el aplastamiento del NO (ApNO) Densidades (CGR/mm2) de CGR marcadas con FG (media±DS)
0
20
40
60
80
100
Control n=20 5 días n=6 7 días n=6 9 días n=6 12 días n=6
0
20
40
60
80
100
Control n=41 5 días n=8 7 días n=14 9 días n=8 12 días n=11
Parrilla–Reverter et al., Exp Eye Res 2009;89:32-41 Peinado-Ramón y cols, IOVS 1996;37:489-500
SUPERVIVENCIA DE LAS CÉLULAS GANGLIONARES TRAS APLASTAMIENTO DEL NERVIO ÓPTICO (ApNO)
SUPERVIVENCIA DE LAS CÉLULAS GANGLIONARES TRAS SECCIÓN DEL NERVIO ÓPTICO (SNO)
SECCIÓN DEL NERVIO ÓPTICO (SNO)
DEGENERACIÓN DE LAS CÉLULAS GANGLIONARES INDUCIDA POR AXOTOMÍA REALIZADA A LA MISMA DISTANCIA DEL DISCO ÓPTICO
APLASTAMIENTO DEL NERVIO ÓPTICO (ApNO)
EFECTO DEL MECANISMO DE LESIÓN (1 semana y 3 meses)
Parrilla –Reverter et al., Vision Res. 2009; 49:2808-2825.
Parrilla –Reverter et al., Vision Res. 2009; 49:2808-2825.
Axotomía 14 días, Ax14d1oi40 Parrilla –Reverter et al., Vision Res. 2009; 49:2808-2825.
30 días después 90 días después
SECCIÓN NERVIO ÓPTICO (SNO)
APLASTAMIENTO NERVIO ÓPTICO (ApNO)
Parrilla –Reverter et al., Vision Res. 2009; 49:2808-2825.
Cronología de los cambios degenerativos según el tipo de lesión
Discretas variaciones en la distancia a la que se produce la axotomía, resultan en diferencias sustanciales en el inicio, curso y severidad de la degeneración de las células ganglionares.
El curso de la muerte inducida por axotomía depende, además de la distancia y del tiempo transcurrido, del mecanismo de lesión inflingida, esto es de si se ha producido sección o aplastamiento.
Villegas-Pérez et al., J. Neurosci. 1988; 8:265-80
Villegas-Pérez et al., J Neurobiol. 1993; ;24:23-36
Peinado-Ramón et al., IOVS. 1996; 42:2074-84
Vidal-Sanz et al., Neurotox Res 2000; 2:215-227.
Salvador-Silva et al., J Comp Neurol. 2000; 417:431-447.
Sobrado-Calvo et al., J Comp Neurol. 2007; 501:866-78.
Agudo et al., Mol. Vis. 2008; 4:1050-1063
Agudo et al., IOVS. 2009; 50:424-31.
Parrilla –Reverter et al., Exp Eye Res 2009; 89:32-41.
Parrilla –Reverter et al., Vision Res. 2009; 49:2808-2825.
Galindo-Romero et al, Exp Eye Res 2011;92:377-387
Sánchez-Migallón et al., Exp Eye Res 2011;92:260-267.
Degeneración Retiniana
Caracterización de la vía retino-colicular
Regeneración en el sistema visual del mamífero adulto
Neuroprotección en la retina
Degeneración en la retina
Modelos de lesión retiniana como herramientas para estudiar la plasticidad
neuronal
(Villegas-Pérez et al., J. Neurosci. 1988; 8:265-280)
SECCIÓN DEL NERVIO ÓPTICO
SECCIÓN DEL NERVIO ÓPTICO E INJERTO DE NERVIO PERIFÉRICO
Neuroprotección en la retina
(Villegas-Pérez, MP., Vidal-Sanz M. et al., J. Neurosci. 1988; 8:265-280)
La población de CGR que sobrevive a la
sección del nervio óptico es mayor (2-4 veces)
cuando tras la sección se apone un injerto de
nervio periférico autólogo
GRAFTED
AXOTOMIZED
SURVIVERS
¿Cuál es el concepto de neuroprotección?
Se entiende por neuroprotección la posibilidad de prevenir, ralentizar o disminuir el proceso de muerte neuronal inducida por lesión o enfermedad.
Neuroprotección: Estudios experimentales
¿Qué evidencia tenemos sobre la neuroprotección?
Parrilla-Reverter et al., Exp Eye Res 2009; 89:32-41 Peinado-Ramón et al., IOVS 1996;37:489-500
0 días 2 días 4 días 6 días 8 días 10 días 12 días 14 días
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 días 2 días 4 días 6 días 8 días 10 días 12 días 14 días
0%
20%
40%
60%
80%
100% Degeneración secundaria Degeneración secundaria
Neuroprotección
Lesión Lesión
Neuroprotección
SUPERVIVIENCIA DE CÉLULAS GANGLIONARES TRAS SECIÓN DEL NERVIO ÓPTICO (SNO) + BDNF
SUPERVIVENCIA DE CÉLULAS GANGLIONRES TRAS APLASTAMIENTO DEL NERVIO ÓPTICO (ApNO) + BDNF
Peinado-Ramón et al., IOVS 1996;37:489-500
SUPERVIVIENCIA DE CÉLULAS GANGLIONARES TRAS SECIÓN DEL NERVIO ÓPTICO (SNO) + BDNF
0
20
40
60
80
100
Control
n=14
ApNO-7d
n=14
BDNF-7d
n=7
ApNO-9d
n=8
BDNF-9d
n=7
ApNO-12d
n=11
BDNF12d
n=5
Control
ApNO
BDNF
0
20
40
60
80
100
Control
n=14
Axot-7d
n=6
BDNF-7d
n=7
SNO-7d
n=6
BDNF-9d
n=5
SNO-12d
n=6
BDNF-12d
n=4
Control
SNO
BDNF
Parrilla-Reverter et al., Exp Eye Res 2009; 89:32-41
SUPERVIVENCIA DE CÉLULAS GANGLIONRES TRAS APLASTAMIENTO DEL NERVIO ÓPTICO (ApNO) +
BDNF
BDNF
Una semana tras la aplicación de FG
MÉTODOS: Sección intraorbitaria del NO
Supervivencia de CGR tras la axotomía Densidades de CGR marcadas con FG o Brn3a-(media ±SD)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
7 d (n=8) 9 d (n=8) 12 d (n=8)
BDNF+IONT FG+RGCs
BDNF+IONT Brn3a+RGCs
VEHI+IONT FG+RGCs
VEHI+IONT Brn3a+RGCs
Sanchez-Migallón et al., Exp Eye Res 2011; 92:260-267
FG
Brn3a 81,639
83,891 0 3.500
SNO+BDNF
80,406
40,388
7 days 9 days
61,923 48,454
SNO+VEH
21,475 16,856
Brn3a+RGCs
Sanchez-Migallon et al., Exp Eye Res 2011; 92:260-267 0 3.500
12 days
Control ApNO SNO Control
LA LESIÓN DEL NERVIO ÓPTICO INDUCE CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN GÉNICA DE LA RETINA
0
500
1000
1500
2000
2500
-600
-400
-200
0
200
400
600
800
1000
Número total de genes y secuencias EST reguladas Número de genes sobre-regulados o infra-regulados
Num
ber
of genes
overe
xpre
ssed
Num
ber
of genes
dow
nre
gula
ted
Num
ber
of re
gula
ted s
equences
Genes regulados por ApNO Genes regulados por SNO
Genes regulados por ambas lesiones y específicos de cada tipo de lesión
SNO SNO &
ApNO
ApNO
Genes
ESTs
SNO SNO &
ApNO
ApNO
VS VS
Agudo et al., Mol. Vis. 2008;14:1050-63; Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2009;50:424-31
IONC regulated genes
IONC regulated ESTs
IONT regulated genes
IONT regulated ESTs
IONT&IONC regulated genes
IONT&IONC regulated ESTs
La SNO regula más secuencias que el ApNO
SNO induce principalmente la sobre-regulación mientras que el ApNO induce
principalmente la infra-regulación
Estos estudios documentan que el curso y magnitud de la muerte de CGR inducida por axotomía se puede modificar con factores neurotróficos.
Villegas-Pérez et al., J. Neurosci. 1988; 8:265-80.
Villegas-Pérez et al., J. Neurobiol. 1993; 20:940-952
Peinado-Ramón et al., IOVS. 1996; 37:489-500.
Vidal-Sanz et al., Neurotox Res. 2000; 2:215-227
Agudo et al., Mol. Vis. 2008; 4:1050-1063
Agudo et al., IOVS. 2009; 50:424-31.
Parrilla –Reverter et al., Exp Eye Res. 2009; 89:32-41.
Galindo-Romero et al, Exp Eye Res. 2011; 92:377-387
Sanchez-Migallon et al., Exp Eye Res. 2011; 92:260-267
Neuroprotección en la retina
Los estudios moleculares indican que tanto el aplastamiento como la sección del nervio óptico activan vías de muerte intrínsecas y extrínsecas.
Así, pues, las estrategias de neuroprotección deberían considerar agentes capaces de modificar todas estas vías, de forma individual o en combinación
Universidad de Murcia
Universidad de Murcia
María Paz Villegas Pérez
Jaime Miralles de Imperial
Mercedes Salvador Silva
Paloma Peinado Ramón
Inmaculada Sellés-Navarro
Ana Mª Gómez Ramírez
Paloma Sobrado Calvo
Román Blanco Velasco
Lidia Coll Alcaraz
María Elena Rodríguez Gzlez
Marcelino Avilés-Trigueros
Antonio García Avilés
Mª Elena Aguilera Meseguer
José Alía Benítez
Sergio Mayor Torroglosa
María Lafuente López-Herrera
Marco A. Marco Gomariz
José Martínez Morales
Natalia Hurtado Montalbán
Amanda Ortíz Gomariz
Jose Manuel Bernal Garro
Guillermo Parrilla Reverter
Manuel Salinas Navarro
Marta Agudo Barriuso
Isabel Cánovas Martínez
Maria Isabel Soro Martínez
Mª Cruz Pérez Marín
Luis Alarcón Martínez
Francisco M. Nadal Nicolás
Manuel Jiménez López
Diego García Ayuso
Fco. Javier Valiente Soriano
Arturo Ortín Martínez
Luis Montalbán Soler
Caridad Galindo Romero
Sergio Rodríguez Llarena
Cómo investigar sobre la visión
Salón de Actos. Colegio Paseo Rosales. Molina de Segura
24 de abril, 2012. 18.00h-20.30h
Fundación de Estudios Médicos
de Molina de Segura
Manuel Vidal-Sanz Laboratorio de Oftalmología Experimental
Departamento de Oftalmología Universidad de Murcia,
Murcia, España
Modelos de lesión retiniana como herramientas para estudiar la plasticidad
neuronal