Actividad enzimtica Unidad internacional de actividad enzimtica (U): cantidad de enzima que produce un micromol de producto en un minuto. Dados los valores normales de actividad de muchas enzimas, es mucho ms comn usar miliunidades (1 mU = 0,001 U). Katal: cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo.

1 katal = 6x107 U

Definiciones importantes en un proceso de purificacin de enzimas. Actividad total (U): Cantidad absoluta de enzima en una

preparacin. Actividad especfica (U/mg): Actividad de la enzima por miligramo de

protena. Recuperacin (%): Fraccin de la actividad total que se conserva

tras cada paso de purificacin. Factor de purificacin: Nmero de veces que hemos aumentado la actividad especfica de nuestra enzima a lo largo de la purificacin.

Tabla de purificacin de una enzima

Paso de Protena A.T. A.E. R F.P. purificacin (mg) (U) (U/mg) (%)

Extracto crudo 3.000 0,10 3,3x10-5 100 1 Sulfato amnico 40% 300 0,07 2,3x10-4 70 7 DEAE-celulosa 50 0,05 1,0x10-3 50 30 Cromatoenfoque 10 0,04 4,0x10-3 40 121

Recuperacin (%): ATfinal /ATinic. X 100

Factor de purificacin: AEfinal / AEinic.

Problema 1 Se ha purificado una enzima a partir de hgado de rata. En la purificacin se parti de 500 ml de extracto crudo que contena 2 g de protena. 50 l de ese extracto crudo catalizaban, en condiciones ptimas de ensayo, la produccin de 1 nmol de producto en 1 segundo. Tras varios pasos de purificacin se obtuvieron 2 ml de una preparacin de enzima pura que contena 3 mg de protena por mililitro y presentaba una actividad total de 120 U.

a) Calcular la concentracin de la enzima en el extracto crudo en U/ml y katales/ml.

b) Determinar la actividad especfica, en U/mg protena, en el extracto crudo.

c) Calcular la recuperacin del proceso de purificacin y el nmero de veces que se ha purificado la enzima.

a) 1 nmol/seg = 0,001 moles/seg x 60 seg/min = 0,06 moles/min = 0,06 U en 50 l. 0,06 U/50 l x 1000 l/ml = 1,2 U/ml 1 katal = 1 mol P/seg = 106 moles/seg x 60 seg/min = 6x107 U => 1,2 U/6x107 U/katal = 2x10-8 katales = 0,02 katales/ml

b) Actividad total E.C.= 1,2 U/ml x 500 ml = 600 U Protena total E.C.= 2 g = 2.000 mg Actividad especfica = 600 U/2.000 mg = 0,3 U/mg protena

c) Recuperacin = AT final/AT inicial (x100) = = 120 U / 600 U (x100) = 0,2 (x100) = 20% Purificacin = AE final / AE inicial = = 20 U/mg / 0,3 U/mg = 66,7 veces

Protena final = 3 mg/ml x 2 ml = 6 mg AT final = 120 U AE final = 120 U/6 mg = 20 U/mg

Problema 1

Problema 2

S = -cetocido 1 ml de mezcla de reaccin

vo [cetocido] (moles CO2 /2min) (M)

0,588 2,500 x 10-3 0,500 1,000 x 10-3 0,417 0,714 x 10-3 0,370 0,526 x 10-3 0,252 0,250 x 10-3

A partir de estos datos calcular Vmx y KM de esta reaccin.

Cuidado!

1/vo 1/[S]

(min/moles) mM-1 3,4 0,4 4,0 1,0 4,8 1,4 5,4 1,9 7,9 4,0

La descarboxilacin enzimtica de un -cetocido, ensayada en 1 ml de mezcla de reaccin, procede con las siguientes velocidades iniciales a las concentraciones de sustrato que se citan:

vo [S]

(moles/min) (mM) 0,294 2,5 0,250 1,0 0,208 0,714 0,185 0,526 0,126 0,250

Regresin lineal y = ax + b r2 = 0,996 a = 1,27 = pendiente = KM/Vmx b = 2,885 = corte en Y Corte en X = -(a/b)

1/vo (min/mol )

1/[S] (mM-1) -2 -1 0 1 2 3 4 5

8,0"

4,0"

-1/KM = -2,3

1/Vmx = 2,9

6,0"

2,0"

La KM y la Vmx las obtenemos de la representacin de dobles inversos de Lineweaver-Burk.

Cuestiones: a) Cuntas unidades de enzima hay en la mezcla de reaccin? b) Cul es la concentracin de la enzima en dicha mezcla? c) Podemos calcular la actividad especfica de la enzima? d) Y la kcat (o nmero de recambio)?

Constantes: -1/KM = -2,3 mM-1 => KM = 0,44 mM 1/Vmx = 2,9 min/mol => Vmx = 0,346 moles min-1

Problema 2

Un extracto crudo enzimtico contiene 20 mg de protena/ml. 20 l de ese extracto crudo catalizan la produccin de 3 moles de producto en 1 min, en condiciones ptimas de trabajo. Calcular: a) La concentracin de la enzima en el extracto crudo en U/ml. b) La actividad especfica de esta enzima en el extracto en U/mg de

protena. c) La actividad total del extracto si tenemos 100 ml del mismo.

Los 20 l de extracto crudo contienen 3 U.

[Enzima] = 3U/20l = 3U/0.02 ml = 150 U/ml

A.E. = [E] (U/ml) / [protena] (mg/ml) = 150 U ml-1 / 20 mg ml-1 = 7,5 U/mg

A.T. = 150 U/ml x 100 ml = 15.000 U

Problema 11

X X

Glutamina sintetasa de Anabaena cylindrica M = 600 kDa Extracto crudo Preparacin purificada

Protena 4.200 mg 4 mg A.T. 186 U 37,5 U Calcular: Recuperacin del proceso de purificacin

Nmero de veces que se ha purificado la enzima Nmero de recambio

1 mol E pesa 600.000 g => 1 mol pesa 600 mg => 4 mg E = 6,67 x 10-3 moles de E

A.T. (pura) 37,5 Recuperacin = x 100 = x 100 = 20%

A.T. (E.C.) 186

A.E. (pura) 37,5 U / 4 mg Factor de purificacin = = = 211,7

A.E. (E.C.) 186 U / 4200 mg

A.T. (pura) 37,5 moles S min-1 N de recambio = = = 5625 min-1

n moles E 6,67 x 10-3 moles de E

Problema 12

Problema 7

Dos inhibidores diferentes. [I] = 1,5 mM [S] v va vb (mM) (mol l-1 min-1) (mol l-1 min-1) (mol l-1 min-1)

0,2 1,67 0,625 0,83 0,4 2,86 1,176 1,43 0,8 4,44 2,11 2,22 1,6 6,15 3,48 3,08 3,2 7,62 5,16 3,81

Decir qu tipo de inhibidor es cada uno y determinar todos los parmetros cinticos.

La KM y la Vmx las obtenemos de la representacin de dobles inversos.

-1 0 1 2 3 4 5

1,0

0,5

1/v (mol-1 l min)

0,1!-0,33!

0,2!

1/[S] (mM-1)

Clculo de Ki: Kia KM= KM (1 + [I]/Kia); 3 mM = 1 mM (1 + 1,5 mM/Kia); Kia = 0,75 mM

Kib Vmx= Vmx / (1 + [I]/Kib) 5 moles min-1 l-1 = 10 moles min-1 l-1 /(1 + 1,5 mM/Kib) => Kib = 1,5 mM

a: competitivo"b: no competitivo"

[Ib] = 1,5 mM Vmx= 5 moles min-1 l-1 KM= 1 mM

[Ia] = 1,5 mM Vmx= 10 moles min-1 l-1 KM= 3 mM

[I] = 0 Vmx= 10 moles min-1 l-1 KM= 1 mM

Problema 7

a"

b"

Grado de inhibicin

KM = 75 M. Cuando [S]0 = 50 mM consume el 30% en 15 min.

a) Calcular Vmx

En presencia de un inhibidor ([I] = 50 M) la representacin tiene pero la ordenada en el origen es .

b) Qu tipo de inhibicin se ha producido? Calcular Ki

[S]0 50 mM >>> KM (0,075 mM) => v = Vmx 0,3 x 50 mM 15 mM Vmx = = = 1 mM min-1

15 min 15 min

30%

El comportamiento corresponde a un inhibidor incompetitivo. Vmx Vmx Vmx = = (1+[I]/Ki) 2 1+[I]/Ki = 2 => [I]/Ki = 1 => [I] = Ki = 50 M

Problema 6

c) Calcular el grado de inhibicin (i) cuando el ensayo se hace a [S] = 150 M, en presencia de 100 M del inhibidor anterior.

vi Grado de inhibicin: i = 1 - v

0,285 mM min-1 i = 1 - = 0,57 = 57% 0,667 mM min-1

Problema 6

Vmx [S] 1 mM min-1 x 150 M v = = = 0,667 mM min-1 KM + [S] 75 M + 150 M Vmx [S] 1 mM min-1 x 150 M vi = = = 0,285 mM min-1 KM + [S] (1+[I]/Ki) 75 M + 150 M (1+100 M/50 M)

Muermasa

Representacin dobles inversos:

X= 0 => Y = 0,8 (M/min)-1

Y= 0 => X = -0,02 (M)-1

Se ensayan dos inhibidores: muermirulina y -muermol

En ambos casos el corte en Y= 1,6 (M/min)-1

La pendiente: mm= 40 min mmr= 80 min

a) Cules son la KM y Vmx de la reaccin sin inhibidor?

KM = -(1/-0,02) (M)-1 = 50 M Vmx = 1/0,8 (M/min)-1 = 1,25 M/min

Problema 10

Problema 10 b) Qu tipo de inhibidores son el -muermol y la muermirulina?

muermirulina: Vmx = 0,625 M min-1 m = 80 min = KM/Vmx => KM = 80 min x 0,625 M min-1 = 50 M = KM

Es un inhibidor no competitivo

-muermol: Vmx = 1/1,6 (M/min)-1 = 0,625 M min-1 m = 40 min = KM/Vmx => KM = 40 min x 0,625 M min-1 = 25 M

Es un inhibidor incompetitivo

c) Si [I] = 5 mM, determinar Ki para ambos inhibidores.

Vmx = 1/2 Vmx => (1+[I]/Ki) = 2 => [I] = Ki = 5 mM

Vmx Vmx = (1+[I]/Ki)

Problema 10

d) Calcular el grado de inhibicin a [S] = 0,1 mM para el -muermol. [I] = 5 mM

Calculamos con la ecuacin de Michaelis-Menten la vo y la v'o en estas condiciones:

vo = 0,83 M min-1 v'o = 0,5 M min-1

i = 1-(v'o / vo)= 1-(0,5/0,83) = 1-0,6 = 0,4 (40%)

Indicar qu ocurre con la constante de Michaelis-Menten y la velocidad mxima en el ensayo de una enzima en las siguientes condiciones: a) Se duplica la concentracin de enzima.

La KM no se altera. La KM es una constante de la enzima (a una temperatura dada) para un sustrato especfico y no depende de ningn otro factor.

Al duplicar la cantidad de enzima, duplicaremos la velocidad mxima en el ensayo.

Vmx = k2 [Et]

b) Se aade un inhibidor no competitivo a una concentracin igual a dos veces la Ki.

La KM no se altera en presencia de un inhibidor no competitivo. La Vmx disminuira hasta 1/3 de su valor en ausencia del inhibidor.

Vmx Vmx Vmx = = = 1/3 Vmx 1 + ([I]/Ki) 1 + (2Ki/Ki)

Cuestiones

c) Se aade un inhibidor acompetitivo a una concentracin equivalente a la Ki.

Tanto KM como Vmx disminuyen de la misma forma en presencia de un inhibidor acompetitivo. La disminucin de ambos parmetros los llevara a 1/2 de su valor en ausencia del inhibidor.

1 + ([I]/Ki) = 1 + (Ki/Ki) = 2

K'M = KM / (1 + ([I]/Ki)) = KM/2

Vmx = Vmx / (1 + ([I]/Ki)) = Vmx/2

Se est caracterizando una enzima recin purificada. Para determinar su peso molecular se ha hecho una electroforesis en SDS, siendo la movilidad relativa de la nica banda igual a 0,51. Las movilidades relativas del patrn de pesos moleculares se resumen en la siguiente tabla:

Masa molecular (kDa) 63 43 20 12 Rf 0,29 0,45 0,72 0,9

La concentracin de la enzima en el extracto crudo es de 4,2 mg ml-1. Se toman 50 l de dicho extracto y se ensayan en 1,5 ml de mezcla de reaccin, resultando la siguiente tabla:

[Sustrato] (M) 2 4 8 16 vo (moles min-1 ml-1) 6,26 10,00 13,33 16,66

Calcular la KM y la kcat (nmero de recambio) de la enzima.

Problema fuera de serie

La KM la obtenemos de la representacin de dobles inversos:

-0,2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

0,16

0,08 1/v (moles-1 min ml)

1/[S] (M-1)

0,045 -0,20

Corte en Y= 1/Vmx= 0,045 => Vmx= 22 moles min-1 ml-1

Corte en X= -1/KM= -0,20 => KM= 5,0 M

Problema fuera de serie

El PM de la enzima, necesario para calcular el nmero de recambio, lo obtenemos de la representacin de los logaritmos de pesos moleculares frente a la movilidad.

2,0 1,5 1,0 0,5

0 0,25 0,5 0,75 1,0

Log PM = 1,54 => PM = 35.000

Rf de la protena problema

Rf

log PM

Problema fuera de serie

1 mol de enzima pesa 35.000 g => 1 mol pesa 35 mg => => 1 mg = 0,0286 moles de enzima 157 moles S min-1 N.R. = = 5490 min-1 0,0286 moles E

Tiempo de un ciclo cataltico = 1 / N.R. = 1,82 x 10-4 min = 10,9 ms

Para calcular la kcat (N.R.), tenemos que conocer la actividad especfica: Nmero de unidades en el ensayo = 22 moles min-1 ml-1 x 1,5 ml = 33 U 33 U / 0,05 ml = 660 U/ml 50 l es el volumen ensayado!! A.E. = 660 U ml-1 / 4,2 mg ml-1 = 157 U / mg de protena

Problema fuera de serie

Problema de examen

La velocidad del enunciado es Vmx, ya que [S] > 100 KM. Vmx = 0,2 moles min-1 ml-1, es decir 0,2 U ml-1 Volumen de ensayo = 2 ml La cantidad total de enzima en el ensayo ser de 0,2 U ml-1 x 2 ml = 0,4 U

Se ensayan 30 l de una preparacin de enzima pura en un volumen de ensayo de 2 ml que contiene 0,1 M de sustrato, obtenindose una velocidad de 0,2 moles min-1 ml-1. Qu cantidad de enzima hay en el ensayo? Calcula la actividad total de la preparacin enzimtica si su volumen es de 10 ml. KM = 0,1 mM.

Si 30 l de preparacin pura contienen 0,4 U de enzima y el volumen total de preparacin es de 10 ml:

A.T. = 0,4 U/0,03 ml x 10 ml = 133,3 U

Problema de examen

Sabemos que KM no vara, puesto que el corte en abcisas es el mismo. Para que aumente la pendiente, que es KM/Vmx, tiene que disminuir Vmx, as que se trata de inhibicin no competitiva. Si la pendiente aumenta 3 veces quiere decir que Vmx ha disminuido 3 veces. Como Vmx = Vmx / (1+[I]/Ki), eso implica que 1+[I]/Ki = 3. De aqu podemos despejar el valor de Ki = 50 M.

Cuando se ensaya la actividad de una enzima con distintas [S], en presencia de un cierto inhibidor a una concentracin de 100 M, y se representan grficamente los resultados mediante la representacin de dobles inversos, la pendiente de la recta obtenida es 3 veces mayor que cuando el experimento se hace en ausencia del inhibidor, pero la interseccin en el eje de abcisas es la misma. Qu tipo de inhibicin se ha producido? Calcula la Ki del inhibidor.

Problema 14

Una enzima tiene un peso molecular de 60.000 y 6 sitios activos por molcula. La actividad enzimtica de una preparacin pura es de 12 moles de sustrato transformado cada 2 min en presencia de 18 g de enzima. Calcula la actividad molar por centro cataltico de la enzima.

moles S / min 6 moles S / min N.R. = = = 2 x 104 min-1 moles E 0,018 mg E/ 60 mg mol-1

A.c.c. = N.R. / n sitios = 2 x 104 min-1 / 6 = 3.333 min-1

Problema 27

Cuando se ensaya la actividad de una enzima con distintas [S], en presencia de un cierto inhibidor a una concentracin de 100 M, y se representan grficamente los resultados mediante la representacin de dobles inversos, la pendiente de la recta obtenida es 4 veces menor que cuando el experimento se hace en ausencia del inhibidor, pero la interseccin en el eje de ordenadas es la misma. Corresponde este comportamiento a algn tipo de inhibidor? Calcula, si procede, la Ki del inhibidor.

Sabemos que Vmx no vara, puesto que el corte en ordenadas es el mismo. Para que disminuya la pendiente, que es KM/Vmx, tiene que disminuir KM. No hay ningn tipo de inhibidor reversible que disminuya KM dejando inalterada Vmx.

Problema 28

Se han determinado algunos parmetros cinticos de dos enzimas, A y B. As, sus valores de KM resultan ser de 100 M para A y 20 mM para B, mientras que los valores de kcat son de 20.000 min-1 y 60.000 min-1, respectivamente. Cul de las dos enzimas presenta mayor eficiencia cataltica? Justifica brevemente tu respuesta.

El parmetro que mejor define la eficiencia cataltica es el conciente kcat/KM. Cuanto mayor es este valor ms eficiente es la enzima. En nuestro caso:

kcat/KM de la enzima A = 20.000 min-1 / 10-4 M = 2 x 108 M-1 min-1 kcat/KM de la enzima B = 60.000 min-1 / 0,02 M = 3 x 106 M-1 min-1

Luego la enzima A es bastante ms eficiente que la B.

Problema 29

Completa esta tabla de purificacin: Paso de purificacin Protena A.T. A.E. Recuper. Factor de purif.

(mg) (U) (U/mg) (%) Extracto crudo 1000 0,030 SA 45% 100 0,024 CM-celulosa 17 0,017 Cromatoenfoque 3,4 0,013

3,0 x 10-5 100 1 2,4 x 10-4 80 8 1,0 x 10-3 56,7 33,3 3,8 x 10-3 43,3 126,7

Problema de examen Cuando se ensaya la actividad de una enzima con distintas [S], en presencia de un cierto inhibidor a una concentracin de 100 M, y se representan grficamente los resultados mediante la representacin de dobles inversos, la pendiente de la recta obtenida es 3 veces mayor que cuando el experimento se hace en ausencia del inhibidor, pero la interseccin en el eje de ordenadas es la misma. Qu tipo de inhibicin se ha producido? Calcula la Ki del inhibidor.

Sabemos que Vmx no vara, puesto que el corte en ordenadas es el mismo. Para que aumente la pendiente, que es KM/Vmx, tiene que aumentar KM, as que se trata de inhibicin competitiva. Si la pendiente aumenta 3 veces quiere decir que KM ha aumentado 3 veces. Como KM = KM x (1+[I]/Ki), eso implica que 1+[I]/Ki = 3. De aqu podemos despejar el valor de Ki = 50 M.

Problema de examen Para purificar una enzima se parti de un extracto crudo que contena 8.400 mg de protena con una actividad total de 372 U. Al final del proceso se obtuvo una preparacin de la enzima pura, que contena 8 mg de protena con una actividad total de 75 U. Calcula la recuperacin en el proceso de purificacin y el nmero de veces que se ha purificado la enzima. Cul es el nmero de recambio de esta enzima sabiendo que su masa molecular es de 600 kDa?

Recuperacin = ATfinal/ATinicial x 100 = 75 U/372 U x 100 = 20,8 % Factor de Purificacin = AEfinal/AEinicial = (75 U / 8 mg) / (372 U / 8400 mg) = 213 veces N.R. = ATfinal / moles E = (75 moles S / min) / (0,0133 moles E) = 5639 min-1

Problema de examen Una enzima presenta una KM de 50 M y una Vmx de 1,25 M/min. Al estudiar el efecto de un inhibidor, a concentracin 5 mM, la representacin de los datos por el mtodo de dobles inversos daba como resultado una recta con una pendiente de 80 min y que cortaba al eje Y en 1,6 min/M. De qu tipo de inhibidor se trata? Calcula la Ki y el grado de inhibicin para [S] = 0,1 mM.

Problema de examen

Sabemos que Vmx es 0,625 M/min (el inverso del corte en Y), es decir, la mitad de Vmx. Como la pendiente, que es KM/Vmx, tiene un valor de 80, podemos deducir que el valor de KM en presencia del inhibidor es de 50 M. Puesto que KM no se altera y Vmx disminuye, podemos afirmar que se trata de una inhibicin no competitiva. Si Vmx ha disminuido a la mitad, y puesto que Vmx = Vmx/(1+[I]/Ki), eso implica que 1+[I]/Ki = 2. De aqu podemos despejar el valor de Ki = 5 mM. Para determinar el grado de inhibicin calculamos, mediante la ecuacin de M-M, v0 y v0 en las condiciones establecidas: Grado de inhibicin = 1- v0/ v0 = 1 0,42/0,83 = 0,5 (50 %).

Problema de examen Define la unidad internacional de actividad enzimtica (U). Qu cantidad de enzima habra en un ensayo de 1 ml de volumen del que se obtienen los siguientes parmetros cinticos: KM = 20 mM, pendiente de la representacin de dobles inversos = 40 min, kcat = 6.000 min-1.

Es la cantidad de enzima que produce un micromol de producto en un minuto en condiciones ptimas de ensayo. El parmetro que nos permite determinar la cantidad de enzima es la Vmx, en la que el S es saturante. Este dato lo podemos obtener puesto que conocemos KM y pendiente = KM/Vmx. En este ensayo Vmx = 0,5 mM/min, y como el volumen de ensayo es 1 ml, habra una cantidad de E capaz de transformar 0,5 moles S min-1 en condiciones ptimas, es decir, 0,5 U.

Problema de examen Cuando se ensaya la actividad de una enzima con distintas [S], en presencia de un cierto inhibidor a una concentracin de 60 M, y se representan grficamente los resultados mediante la representacin de dobles inversos, la pendiente de la recta obtenida es la misma que cuando el experimento se hace en ausencia del inhibidor, pero la ordenada en el origen aumenta cuatro veces. Qu tipo de inhibicin se ha producido? Calcula la Ki del inhibidor.

Las rectas paralelas nos permiten deducir que varan tanto KM como Vmx, y adems en el mismo factor, cosa que solo ocurre en la inhibicin incompetitiva. Si la ordenada en el origen aumenta 4 veces quiere decir que Vmx ha disminuido 4 veces. Como Vmx = Vmx/(1+[I]/Ki), eso implica que 1+[I]/Ki = 4. De aqu podemos despejar el valor de Ki = 20 M.