centro de investigación en alimentación y desarrollo a.c
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Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C.
DETERMINACIÓN DE LINFOCITOS T REGULADORES EN SUJETOS CON Y SIN
OBESIDAD Y SU ASOCIACIÓN CON LA DIETA
POR:
ERIKA GUADALUPE SALCIDO ROMERO
TESIS APROBADA POR LA:
COORDINACIÓN DE NUTRICIÓN
COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRÍA EN CIENCIAS
HERMOSILLO, SONORA OCTUBRE DEL 2011
ii
DECLARACIÓN INSTITUCIONAL
Se permiten y se agradecen las citas breves del material contenido en
esta tesis sin permiso del autor, siempre y cuando se dé el crédito
correspondiente.
Para la reproducción parcial o total de este manuscrito con fines
académicos, se deberá contar con la autorización del director general del
Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C. (CIAD
Las publicaciones en comunidades científicas o de divulgación de los
datos contenidos en esta tesis deberá dar créditos al CIAD, previa
aprobación escrita del manuscrito en cuestión, del director de tesis.
ATENTAMENTE
Dr. Ramón Pacheco Aguilar
iv
Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Inmunología del Centro de
Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C., bajo la dirección del Dr.
Jesús Hernández y con el apoyo económico del Consejo Nacional de
Ciencia y Tecnología (CONACyT), Fondo Sectorial SALUD-CONACYT
127013.
v
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer a las instituciones que permitieron que se llevara a cabo
esta investigación. Al Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo
(CIAD) por permitirme estudiar en su institución y también al Consejo
Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el apoyo económico
brindado.
Quiero agradecer a mi director de tesis Dr. Jesús Hernández por todo su
apoyo, paciencia y comprensión, por tener siempre el tiempo para escuchar
mis dudas a lo largo de este proyecto, pero sobre todo por brindarme la
oportunidad de pertenecer a su grupo de trabajo, ¡muchas gracias Doc!
A mis asesoras, Dra. Mary Montalvo: gracias por tu apoyo y por enseñarme
tus conocimientos en el laboratorio. Dra. Verónica Mata: por sus comentarios
y observaciones en las juntas de comité. Maestra Adriana Bolaños por
checar mis presentaciones y por los comentarios para mejorar este trabajo y
Dra. Graciela Caire por ayudarme en todo lo referente a estadística y
cuestionarios de frecuencia. ¡Muchas gracias asesoras!
También quiero agradecer el valioso apoyo técnico de Mónica Resendiz en
la realización de este trabajo. También muchas gracias a la Q.B. Bertha
Pacheco Moreno, Q.B. René Valenzuela Miranda y M.C. Ana Cristina
Gallegos por su apoyo brindado con los voluntarios y en el laboratorio. Al Sr.
Fernando Leyva por conseguirme los artículos casi inmediatamente.
A mis compañeras Karina Chávez, Melisa Campa, Diana Luna y a la M.S.P
Socorro Saucedo por su paciencia y su tiempo para enseñarme lo de los
cuestionarios de frecuencia, así como su participación en la aplicación de los
mismos, muchas gracias chicas.
A mis compañeros del laboratorio, los que ya no están Lily, José Luis, Anita,
Elí y los que siguen, Era, Lupita, Edgar, Alexel. Muchas gracias chicos por
vi
sus consejos y muestras de cariño, disfrute mucho el tiempo que pase con
ustedes entre risas y decepciones pero al final siempre mirando hacia al
frente. Era, fuiste una excelente maestra y amiga, muchas gracias por todo.
Anita Teresa, fuiste y serás siempre una gran amiga, te agradezco mucho
las risas y todo el cariño que me brindaste, te quiero mucho Teresa (a ti y
chicharito). Edgar, a pesar de tener poco tiempo en el laboratorio me has
alegrado el día con tus ocurrencias, muchas gracias por hacerme reír, te
estimo mucho y espero contar siempre con tu amistad.
A la generación de maestría en ciencias 2009-2011 a cada uno de los casi
40 que fuimos, por el compañerismo, por las risas en clase, pero sobre todo
por su amistad.
A las muchachas del área de nutrición, somos un grupo muy unido y a pesar
de que muchas pronto nos separaremos, los lazos de amistad formados no
se romperán. Las quiero mucho muchachas y gracias por todo.
A mis dos grandes amigas de la UNI, Gaby y Daniela. Gracias muchachas
por estar siempre conmigo en las buenas y en las malas tanto en lo personal
como en lo académico, por echarme porras y darme siempre ánimos para
seguir adelante, las quiero mucho chicas.
A los Sres. Rosa María Mendívil y José de la Luz Navarro por su apoyo
recibido desde el comienzo de mi maestría y por impulsarme siempre a
seguir adelante, muchas gracias a los dos, los quiero mucho.
vii
DEDICATORIA
Este trabajo se los dedico a mis padres Oscar Salcido Martínez y Rosa
Amelia Romero Pacheco. Muchas gracias por todo su amor y apoyo
brindado, pero sobre todo por el ejemplo de honestidad y responsabilidad,
¡los amo papas!
A mis hermanos Patricia y Oscar por su cariño y ejemplo de lograr sus
objetivos, los quiero mucho hermanos.
También te la dedico a ti César, por ser mi pilar y no dejar que me vaya
abajo, por tu amor, paciencia y comprensión. ¡Te amo!
viii
ÍNDICE TEMÁTICO
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................................... x
LISTA DE TABLAS ...................................................................................................................... xi
RESUMEN ................................................................................................................................ xii
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 1
ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN ............................................................................................ 3
Linfocitos T ........................................................................................................................... 3
Clasificación y función ...................................................................................................... 3
Linfocitos T cooperadores ……………………………………………………………………………….…..…4
Linfocitos T citotóxicos …………………………………………………………………………………………..5
Linfocitos T reguladores …………………………………………………………………………………………5
Obesidad .............................................................................................................................. 7
Epidemiología................................................................................................................... 7
Obesidad y su impacto en la respuesta inmune .............................................................. 9
Efectos de algunos nutrimentos de la dieta en la población celular de linfocitos .............. 9
Vitamina A ...................................................................................................................... 10
Vitamina D ...................................................................................................................... 11
Vitamina D y obesidad …………………..…………….……………………………………………………..12
Vitamina D y respuesta inmune…………………………..………………………………………………12
Vitaminas A, D y linfocitos T reguladores………………….………………………………………..13
Ácidos grasos .................................................................................................................. 13
HIPÓTESIS ............................................................................................................................... 14
OBJETIVO GENERAL................................................................................................................ 15
OBJETIVOS PARTICULARES ..................................................................................................... 15
MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................................... 15
Diseño experimental y marco muestral ............................................................................. 15
Muestras de sangre............................................................................................................ 16
Separación de células mononucleares ............................................................................... 16
ix
Cuantificación de citocina IL-10 por ELISA ......................................................................... 17
Determinación de células T reguladoras ........................................................................... 18
Cuestionario de frecuencia de consumo de alimentos ..................................................... 19
Análisis Estadístico ............................................................................................................. 20
RESULTADOS .......................................................................................................................... 20
Características de la población .......................................................................................... 20
Determinación de la frecuencia de linfocitos T CD4+ y CD8+ totales ................................. 21
Distribución de linfocitos T reguladores ............................................................................ 23
Determinación de IL-10 ...................................................................................................... 26
Asociación entre células T reguladoras y consumo de vitaminas A, D y ácidos grasos ..... 27
DISCUSIÓN ............................................................................................................................. 31
CONCLUSIÓN .......................................................................................................................... 38
REFERENCIAS .......................................................................................................................... 39
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Presentación de antígenos en los linfocito T cooperadores y
linfocitos T citotóxicos……………………………………………………………...4
Figura 2. Poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ en sujetos sin y con
obesidad………………………………………………………………………..….22
Figura 3. Análisis de células Tregs…………………………………………….23
Figura 4. Porcentajes de células Tregs en sujetos sin y con obesidad……25
Figura 5. Determinación de IL-10 por ELISA en suero de sujetos sin y con
obesidad…………………………………………………………………………...26
xi
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Grupos de alimentos presentes en el cuestionario de frecuencia de
consumo de alimentos……………………………………………………………19
Tabla 2. Características antropométricas de la población de estudio………21
Tabla 3. Consumo de alimentos de vitaminas A, D y ácidos grasos en
sujetos con y sin obesidad……………………………………………………….28
Tabla 4. Asociación de Tregs con Vitaminas A, D y grasas………………….30
xii
RESUMEN
La obesidad se ha relacionado con la disfunción inmune, lo que se traduce
en una inadecuada respuesta a patógenos y/o alteraciones en el estado de
salud. El control de la respuesta inmune y autoinmune depende de un buen
balance entre células T efectoras y células T reguladoras (Tregs). Se ha
observado que la vitamina A, D y ácidos grasos, tienen la capacidad de
promover la generación de células Treg. El objetivo de este trabajo fue medir
los niveles de linfocitos Tregs en individuos sin y con obesidad, y su
asociación con el consumo dietario de vitaminas y ácidos grasos. Se realizó
un estudio de tipo transversal en individuos sin y con obesidad. Se
analizaron las poblaciones de linfocitos T CD4+, CD8+ y Tregs por citometría
de flujo. Se evaluó la producción de IL-10 por ELISA y se aplicaron
cuestionarios de frecuencia de consumo de alimentos. A partir de ellos se
realizó un análisis de regresión múltiple. Los resultados muestran que la
población de linfocitos T CD4+ tuvo una media de 51.6 ± 1.9% y 54.5 ± 1.4%
en sujetos sin y con obesidad, respectivamente. Para CD8+ la media fue de
33.5 ± 1.8% y 33.4 ± 1.7% en los grupos sin y con obesidad,
respectivamente. En los análisis de poblaciones de linfocitos
CD4+CD25TotalFoxp3+, CD4+CD25AltaFoxp3+, CD8+Foxp3+ y producción de
IL-10, no se observaron diferencias significativas (p>0.05) entre los grupos.
Se encontró una asociación del consumo de vitamina D y ácidos grasos
saturados y monoinsaturados con el aumento de las poblaciones de
linfocitos CD4+CD25TotalFoxp3+, CD4+CD25AltaFoxp3+ y CD8+Foxp3+
(p<0.05), así como los ácidos grasos saturados y monoinsaturados (p<0.05).
En conclusión no se encontraron diferencias en las células Tregs en los
sujetos sin y con obesidad. Los Tregs no tuvieron asociación con la vitamina
A a pesar de que el consumo en sujetos con obesidad fue mayor. En la
población total del estudio, la vitamina D y ácidos grasos se asociaron con
xiii
un aumento en los porcentajes de Tregs por lo que podrían estar
interviniendo con los niveles circulantes de estas células.
1
INTRODUCCIÓN
La respuesta inmune celular involucra a células especializadas como los
linfocitos T cooperadores (CD4+), T citotóxicos (CD8+) y T reguladoras
(Tregs). Las células T CD4+ producen citocinas que promueven la
producción de anticuerpos por las células B, mejoran y mantienen la
respuesta de las células T CD8+ (Abbas y cols., 2002). Las células T
citotóxicas eliminan células T infectadas con virus y células tumorales,
mientras que las Tregs mantienen la tolerancia y la homeostasis (Jonuleit y
cols., 2003). De esta manera, una persona sana puede hacer frente a la
infección, sin embargo, algunos individuos pueden ser más susceptibles a
infecciones virales y una de las causas es una inadecuada respuesta celular
mediada por linfocitos.
La obesidad se ha relacionado con una disfunción de la respuesta inmune.
En estudios realizados en ratones con obesidad inducida por dieta, se
encontró que la población de células CD4+ se encuentra elevada, pero hay
una disminución de células CD8+ (Smith y cols., 2009). Esto se explica por
una migración tardía de estas células al sitio de la infección, ya que la
presentación de antígeno por las células presentadoras de antígeno (CPA)
se encuentra deteriorada. Se conoce que uno de los principales grupos de
riesgo para enfermedades infecciosas son las personas con obesidad
(Marcos y cols., 2003). Algunos estudios han observado que la población de
Tregs en sujetos con obesidad se encuentran disminuidas; sin embargo
otros estudios no han encontrado diferencias en los porcentajes de Tregs
(Švec y cols., 2007; Yun y cols., 2010), por lo que aún se necesitan más
estudios para saber qué determina que los sujetos con obesidad presenten
cuadros clínicos más graves que sujetos sin obesidad.
2
Existe evidencia de que ciertos nutrimentos son importantes y promueven el
buen funcionamiento del sistema inmune. Diferentes estudios han
demostrado la capacidad anti-inflamatoria que poseen la vitamina A, D y
ácidos grasos en la promoción de células Tregs en enfermedades
autoinmunes (Kim y cols., 2010; Mora y cols., 2008). Sin embargo, no se han
realizado asociaciones de los porcentajes de los Tregs con el consumo
dietario de estos nutrimentos. El objetivo de este trabajo fue medir los
niveles de linfocitos T reguladores en sujetos con y sin obesidad, y su
asociación con el consumo dietario de vitaminas y ácidos grasos.
3
ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN
Linfocitos T
Los linfocitos T son células del sistema inmune que se generan en médula
ósea y migran al timo para continuar con su desarrollo hasta células T
maduras (Roitt y cols., 2001).
Los linfocitos T se dividen en dos subpoblaciones, linfocitos T cooperadores
(Th, T helper por sus siglas en inglés) que expresan en su membrana el
marcador de superficie CD4 y citotóxicos (CTL citotoxic T lymphocyte) que
expresan CD8. Se ha postulado un tercer tipo de células T, conocidas como
células T reguladoras (Treg) que pueden ser CD4+CD25+Foxp3+ y
CD8+Foxp3+ o con capacidad supresora y anti-inflamatoria (Roitt y cols.,
2001).
Clasificación y función
Los linfocitos CD4+ y CD8+ reconocen distintas moléculas del complejo
mayor de histocompatibilidad (MHC), CD4 une al MHC de clase II y CD8 al
MHC de clase I. Durante el reconocimiento del antígeno, dependiendo del
tipo de célula T, las moléculas CD4 ó CD8 asociadas al receptor de células T
se unen a sitios invariantes en la porción MHC del compuesto péptido
ligando:MHC. Esta unión es requerida por la célula T para realizar una
respuesta efectiva, en la cual CD4 y CD8 funcionan como correceptores
(Janeway y cols., 2001).
4
Linfocitos T cooperadores. Las células Th secretan citocinas que ayudan a
las células B a generar anticuerpos. Las Th mejoran y mantienen la
respuesta de las células T CD8+, regulan la función de macrófagos
proporcionando las herramientas necesarias para tener una respuesta
inmune eficiente frente a varios microorganismos (Zhu y cols., 2010).
Los linfocitos necesitan reconocer antígenos a través de células
presentadoras de antígeno (como células dendríticas y macrófagos
principalmente) para poder convertirse en células efectoras (Figura. 1). Esta
población celular se divide en células T Th1 y Th2, que se distinguen entre sí
de acuerdo a las citocinas que producen. Las células Th1 producen
interferón IFN-γ y factor de necrosis tumoral (TNF-α). En cambio, las células
Th2 producen interleucina (IL)-4, IL-5 e IL-13 y algunas células producen IL-
9 en casos de asma (Zhu y cols., 2010).
Figura.1 Presentación de antígenos en los linfocitos T (Abbas y cols., 2002).
5
Linfocitos T citotóxicos. El linfocito T citotóxico (CTL) controla a una variedad
de bacterias intracelulares e infecciones virales. Estas células circulan a los
sitios periféricos donde ocurre una infección y se dirigen específicamente a
las células blanco infectadas (Williams y cols., 2007). Las funciones
efectoras, por las cuales las células T CD8 interfieren con la replicación viral,
incluyen la secreción de mediadores solubles tales como el TNF-α e IFN-γ y
actividad citolítica por exocitosis de perforinas/granzimas o contacto
dependiente vía interacciones Fas-FasL (Frebel y cols., 2010). Con la célula
Th, el CTL no suele secretar muchas citocinas y, por el contrario muestra
una actividad citotóxica (Goldsby y cols., 2004).
Los linfocitos CTL tienen una función vital en la vigilancia de las células del
cuerpo y la eliminación de cualquiera que muestre antígeno, como células
infectadas por virus, las células tumorales y las células de un injerto de tejido
extraño (Goldsby y cols., 2004).
Linfocitos T reguladores. Tanto la respuesta inmune y autoinmune son
controladas por un buen balance entre células T efectoras y Tregs. Las
células Tregs pueden suprimir la respuesta inmune por un mecanismo
dependiente de contacto célula-célula o por la secreción de citocinas anti-
inflamatorias IL-10 y TGF-β. Estas células son una subpoblación de baja
frecuencia, representando del 5 al 10% del total de linfocitos (Belkaid y cols.,
2009).
El término de células T reguladoras se refiere a poblaciones de linfocitos T
con propiedades reguladoras/supresoras y están dedicadas a mantener la
tolerancia y homeostasis en la respuesta inmune. Se conocen tres
subgrupos de células T reguladoras CD4+CD25+ con distintos mecanismos
supresores las cuales se diferencian por su fenotipo, secreción de citocinas y
el tejido de origen (Jonuleit y cols., 2003). Estas son las células T
6
reguladoras tipo 1 (Tr1), células T cooperadoras 3 (Th3) y las Tregs
dependiente de contacto célula-célula, en donde cada población tiene la
capacidad característica de inhibir activamente la proliferación y la función
efectora de otras células T (Fukaura y cols., 1996; Groux y cols., 1997). Otro
subgrupo pertenece a las células T CD8+ con propiedades reguladoras, sin
embargo se conoce muy poco acerca de su ontogenia, regulación y función
(Smith y cols., 2008).
Las células Tr1 fueron caracterizadas inicialmente en enfermedades
inflamatorias en el intestino de ratón, como un potente supresor de la
respuesta inmune mediada por la síntesis de IL-10 (Groux y cols., 1997).
Las células Th3 fueron descubiertas en ratones como mediadores de la
tolerancia oral, la cual actúa para inhibir la inducción de la inmunidad por
medio de la secreción del factor transformante del crecimiento β (TGF-β)
(Weiner, 2001). De las tres poblaciones celulares, las células Tregs se han
convertido quizás, en la línea celular supresora más estudiada del sistema
inmune. Las células Tregs son caracterizadas por tener altas cantidades del
factor de transcripción forkhead box P3 (Foxp3), el cual es esencial para el
desarrollo y función de las células T reguladoras CD4+CD25+ (Zheng y cols.,
2007).
Los mecanismos de acción de los Tregs se pueden dividir en: interacciones
célula-célula, secreción local de citocinas inhibidoras y competencia local por
factores de crecimiento (Belkaid y cols., 2009).
Las interacciones célula-célula se dan cuando el antígeno asociado a
linfocitos T citotóxicos 4 (CTLA-4) presente en las Tregs induce la expresión
de la enzima indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO). Ésta degrada el triptófano
(importante para la activación de la célula T) y promueve la apoptosis de la
célula T (Belkaid y cols., 2009). Otro mecanismo es la secreción local de
citocinas inhibitorias como IL-10 y TGF-β. La IL-10 puede inhibir la
7
proliferación de células T CD4+ vírgenes y TGF-β está relacionado con el
mantenimiento de la tolerancia a antígenos propios y prevención de
enfermedades autoinmunes. (O'Garra y cols., 2004; Wahl y cols., 2004). Por
último, la competencia local por factores de crecimiento como IL-2. Se ha
comprobado que las Tregs pueden actuar como una “esponja” de esta
citocina y así prevenir la activación y proliferación de las células T (de la
Rosa y cols., 2004; Scheffold y cols., 2005).
Obesidad
El sobrepeso y la obesidad son factores de riesgo para numerosas
enfermedades crónicas, como la diabetes, las enfermedades
cardiovasculares y cáncer. Existen estudios que la relacionan también con la
susceptibilidad en procesos infecciosos. La obesidad y el sobrepeso se
caracterizan por una acumulación anormal o excesiva de grasa que puede
ser perjudicial para la salud. Una persona con un índice de masa corporal
(IMC) igual o superior a 30 es considerada con obesidad, mientras que una
persona con IMC igual o superior a 25 es considerada con sobrepeso (OMS,
2011).
Epidemiología
La obesidad es un problema mundial, con serias dimensiones sociales que
afecta a individuos de todas las edades y grupos socioeconómicos. Su
incidencia va en aumento y se estima que existe más de un billón de adultos
con sobrepeso de los cuales al menos, 300 millones son obesos. Esto ha
tenido un impacto importante en la contribución del aumento de
enfermedades crónicas (OMS, 2011).
8
La aparición de una epidemia de obesidad en México ha surgido en la última
década. Con una población de casi 110 millones de personas, México tiene
la tercera población más grande en el Hemisferio Occidental (Ford y cols.,
2008).
Entre las mujeres mexicanas de 15-49 años de edad, la prevalencia de
obesidad en 1987 fue de 10.4% (Ford y cols., 2008). En 1999 se realizó un
estudio que incluyó 567 hombres y 1018 mujeres de las ciudades de México,
Hermosillo, Ciudad Juárez, Guadalajara, Veracruz, Puebla, León y Mérida.
La prevalencia de obesidad fue de 31.7% entre hombres y 26.7% entre las
mujeres resaltando la alta prevalencia de obesidad entre los mexicanos que
viven en centros urbanos. La prevalencia de la obesidad también se
encuentra influida por la variación geográfica, ya que las ciudades del norte
presentan mayor prevalencia que las del sur del país (Arroyo y cols., 2000).
Un estudio realizado en el periodo 2001-2002 publicó una prevalencia de
53.6% de obesidad en participantes de 18-100 años de las ciudades de
México, Guadalajara, Monterrey, Puebla, León y Tijuana. Se observó que la
prevalencia de obesidad aumentó con la edad en Brasil, Canadá, México y
Estados Unidos. En hombres de 20-29 años de edad la prevalencia de
obesidad fue de 16.9%, entre hombres de 50-59 años fue de 32.1% y
disminuyó en hombres de 80 años o más a un 9%. Entre mujeres la
prevalencia aumenta desde 20.5% entre edades de 20 a 29 años hasta
44.3% entre edades de 50-59 años y disminuye al 16.3% entre las edades
de 80 años o mayores. (Ford y cols., 2008).
9
Obesidad y su impacto en la respuesta inmune
Los cambios inmunológicos que se producen en la obesidad afectan a la
inmunidad humoral en la secreción de anticuerpos y, a la inmunidad celular
en el número de leucocitos y proliferación de linfocitos en respuesta a
mitógenos. Estas alteraciones en la respuesta inmune se han observado en
modelos animales, pero investigaciones en humanos confirman una baja
capacidad de los linfocitos para proliferar en respuesta a un mitógeno
(Lamas y cols., 2002). En un estudio se demostró que después de que los
pacientes con obesidad pierden peso, se producen resultados favorables en
respuesta a estímulos, a esto se le atribuye las condiciones de salud del
sujeto con obesidad (Marcos y cols., 2003).
Los individuos con obesidad presentan respuestas inmunes ineficientes. En
la obesidad las evidencias hasta la fecha indican que las células Tregs se
encuentran disminuidas en número y función (IL-10 disminuida) en
comparación con los sujetos sin obesidad (Yun y cols., 2010).
Efectos de algunos nutrimentos de la dieta en la población celular de
linfocitos
Las vitaminas y sus metabolitos son esenciales para un gran número de
procesos fisiológicos. Pueden actuar como hormonas y antioxidantes,
reguladores de crecimiento y diferenciación de tejido, en el desarrollo
embrionario, metabolismo de calcio entre otros (OMS, 1998)
Además se ha descrito que las vitaminas participan en la modulación del
sistema inmune, tanto en la respuesta innata y adaptativa. Ejemplo de esto
son las vitaminas A y D que pueden influenciar la respuesta de manera
altamente específica (Chambers y cols., 2011; Lu y cols., 2010; Mora y
cols., 2008). Por otra parte, los ácidos grasos, sobre todo los poliinsaturados
10
han demostrado tener una capacidad inmunosupresora y ejercer ciertos
efectos benéficos en enfermedades de inflamación activa (Kim y cols.,
2010)
Vitamina A
La vitamina A (retinol) es un nutriente esencial para el funcionamiento
normal del sistema visual, crecimiento, desarrollo y mantenimiento de la
integridad del epitelio celular, función inmune y reproducción. Las
necesidades alimenticias de vitamina A se proporcionan normalmente por el
retinol preformado (ésteres de retinol) y por provitamina A (carotenoides)
(OMS, 1998).
La vitamina A es obtenida de la dieta, ya sea como trans-retinol, retinol o
ésteres de β-caroteno. Todo trans-retinol es convertido a éster de retinol y se
almacena en el hígado en las células estrelladas. Un metabolito relacionado
al trans-retinol es el 9-cis ácido retinoico que puede ser formado por
isomerización espontánea del trans-ácido retinoico por medio de la oxidación
del 9-cis-retinal por retinal dehidrogenasas (Mora y cols., 2008).
Una de las fuentes de vitamina A son alimentos de origen animal como leche
entera, queso, mantequilla, yema de huevo e hígado. La ingesta de
provitamina A (compuestos que pueden ser convertidos a vitamina A en el
cuerpo a partir de caroteno) se obtiene a partir de vegetales de hojas verdes
oscuras, zanahorias, además de ciertos frutos rojos y amarillos (Shekelle y
cols., 1981). Los requerimientos diarios recomendados de ingesta de
vitamina A son de 2081.25 unidades internacionales (UI) ó 625 μg/día de
equivalentes de retinol (Bourges, 2005).
11
Vitamina D
La principal fuente de vitamina D es la exposición a la luz solar y representa
del 80-90% de la vitamina D circulante en el organismo, mientras que el
consumo dietético de vitamina D proporciona del 10-20% restante (Prietl y
cols., 2010). La forma activa de la vitamina D 1,25-dihidroxivitamina D (1,25
[OH]2D3), es una hormona secoesteroidea que se genera por la biosíntesis
catalizada por la luz del sol que comienza en la piel. La radiación ultravioleta
(UVB) es absorbida por las células epidermales y dermales y dividen el anillo
β del 7-dehidrocolesterol, conduciendo a la producción de pre-vitamina D3.
Ésta es rápidamente convertida a vitamina D3 la cual deja a la piel y entra al
hígado donde es convertido a 25-hidroxivitamina D por la citocromo p450
(25-hidroxilasas).
La 25-hidroxivitamina D es el metabolito circulantes que luego es convertido
a la forma activa 1,25 [OH]2D3 utilizando la enzima mitocondrial 25-
hidroxivitamina D 1α-hidroxilasa. Se pensaba que esta conversión ocurría
principalmente en células de riñón. Sin embargo, existe evidencia de otras
fuentes extrarenales por células como macrófagos, células epiteliales y
células dendríticas (DC por sus siglas en inglés) las cuales son una fuente
importante de vitamina D para acciones inmunomoduladoras en tejidos
(Chambers y cols., 2011).
La síntesis en la piel de vitamina D es difícil de estimar, siendo afectada por
componentes como la edad, estación del año, latitud, hora del día,
exposición de la piel y el uso de bloqueadores. En sujetos con niveles
normales de vitamina D, se estima una síntesis de alrededor de 10 μg/día
con un consumo total estimado de 15 μg/día (WHO/FAO, 1998). Por otra
parte, se reporta que un nivel sanguíneo de 30-50 ng/mL es necesario para
una óptima salud y en ausencia de una inadecuada exposición al sol, se
requiere una ingesta de 1000 UI de vitamina D diariamente para niños y
adultos (Grant y cols., 2005).
12
Vitamina D y obesidad. Estudios previos han reportado que los individuos
con obesidad tienen concentraciones séricas de 1,25 [OH]2D3 más altas
comparados con sujetos sin obesidad (Al-Sultan y cols., 2011). Esto es de
particular interés debido a que recientes reportes han sugerido que la 1,25
[OH]2D3 participa en la predisposición al sobrepeso en adultos. Así como a
una ganancia de peso por la habilidad de la vitamina D de aumentar las
concentraciones de calcio intracelular, particularmente en los adipocitos,
estimulando la lipogénesis e inhibiendo la lipólisis (Shi y cols., 2001). Se ha
identificado que la vitamina D es clave importante para estimular la
acumulación de triglicéridos en los sujetos con obesidad (Parikh y cols.,
2004).
Vitamina D y respuesta inmune. El receptor de la vitamina D (VDR por sus
siglas en inglés) se ha encontrado en varias células del sistema inmune
como macrófagos, DCs y linfocitos T y B principalmente después de su
activación. La función del VDR en las DC es que mejora su tolerogenicidad
en las respuestas inmune adaptativa. Las DCs tolerogénicas inducidas por
un corto tratamiento con agonistas de VDR, promueven la inducción de
células Tregs CD4+CD25+FoxP3+ las cuales son capaces de mediar la
tolerancia a trasplantes y detener el desarrollo de enfermedades
autoinmunes. Además se ha comprobado que la vitamina D inhibe procesos
pro inflamatorios por supresión de la actividad de células Th1, Th2 y Th17 y
la producción de citocinas como IL-2, IFN-, TNF-α (Toubi y cols., 2010).
La mayoría de las propiedades inmunomoduladoras de 1,25 [OH]2D3 en las
DCs se propone que ocurre en las DC mieloides (mDC) y no en las
plasmocitoides (pDCs). Varios estudios han mostrado que un pretratamiento
con 1,25 [OH]2D3 en mDCs y cocultivadas con células T no únicamente
inhiben la producción de citocinas de T efectoras sino también inducen la
diferenciación a células CD4+Foxp3+ con actividad supresora (Chambers y
cols., 2011).
13
Vitaminas A, D y linfocitos T reguladoras. En un estudio se encontró que la
vitamina D es un promotor importante de la regulación de la célula T in vivo
en pacientes con esclerosis múltiple. Se demostró que los niveles de 1,25
[OH]2D3 están asociados con la función supresora de Tregs (Smolders y
cols., 2009).
El ácido retinoico y la vitamina D son miembros de la misma familia de
hormonas nucleares y comparten un receptor de señalización común RXR.
No se ha esclarecido si el ácido retinoico y la vitamina D tiene funciones
redundantes o complementarias en la inducción de Tregs, o si tienen un
papel comparable en ratones y humanos (Chambers y cols., 2011).
Ácidos grasos
Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA por sus siglas en inglés), son
importantes para la estructura y función de las proteínas de la membrana
plasmática, incluyendo receptores y enzimas. El ácido eicosapentanoico
(EPA, 20:5n-3) y el ácido docosahexanoico (DHA, 22:6n-3) son productos de
la elongación del ácido linolénico alfa (ALA, 18:3n-3) (Kim y cols., 2010). La
obtención de estos ácidos es a través del consumo de pescado y aceite de
pescado.
Los ácidos grasos, sobre todo los poliinsaturados han demostrado tener una
capacidad inmunosupresora y ejercer ciertos efectos benéficos en
enfermedades de inflamación activa. El EPA tiene efectos anti-inflamatorios
como son la inhibición de linfocitos, estabilización de citocinas y lípidos de la
membrana (Ye y cols., 2010). Se sabe que este ácido puede interrumpir el
balance entre las Tregs y las células Th17 en un modelo murino, ya que
cantidades micro molares pueden activar a PPAR- el cual es un antagonista
de la respuesta Th17 y un agonista en la inducción de Tregs in vitro (Iwami y
cols., 2010; Ye y cols., 2010). Por tales motivos, es interesante evaluar el
14
consumo de este ácido graso y determinar si existe un efecto en la población
de los Tregs.
El cuestionario de frecuencia de consumo de alimentos (CFCA) es un
modelo que nos permite conocer información del consumo habitual a largo
plazo de una población, (Rodríguez Trinidad I., 2008). A través de este
método se pueden obtener datos cualitativos y descriptivos de los patrones
alimentarios, así como datos semicuantitativos del consumo de nutrientes.
Para ello, se utiliza un cuestionario con información sobre la ingesta de
ciertos alimentos ó grupo de ellos y la frecuencia con la que se consumen en
un determinado tiempo (día, semana, mes, año) (Berganza, 2003).
En un estudio realizado por Yun y cols., se encontró que en la obesidad las
Tregs se encuentran disminuidas en número y función (IL-10 disminuida) en
comparación con el grupo sin obesidad. Por ello, se pretende evaluar los
linfocitos Tregs en sujetos sanos con y sin obesidad, así como su asociación
con el consumo de vitaminas y ácidos grasos. Esta información, podría
explicar uno de los mecanismos del porqué las Tregs se encuentran
disminuidas en los sujetos con obesidad y por qué los cuadros de
inflamación son más severos al no contar con este sistema de regulación
inmune.
HIPÓTESIS
Los niveles de linfocitos T reguladores varían en individuos con y sin
obesidad, y son afectados por el consumo dietario de vitaminas y ácidos
grasos.
15
OBJETIVO GENERAL
Determinar los niveles de linfocitos T reguladores en sujetos con y sin
obesidad, y su asociación con el consumo dietario de vitaminas y ácidos
grasos.
OBJETIVOS PARTICULARES
a) Determinar los porcentajes de linfocitos T reguladores, CD4+ y CD8+ en
los sujetos con y sin obesidad.
b) Cuantificar por ELISA la producción de la citocina IL-10 en suero de los
sujetos de estudio.
c) Asociar la población de linfocitos T reguladores con el consumo de
vitaminas y ácidos grasos de la dieta.
MATERIALES Y MÉTODOS
Diseño experimental y marco muestral
El diseño experimental fue de tipo transversal. Se incluyeron hombres y
mujeres entre 18 y 50 años de edad que asistieron a consulta en la clínica
de obesidad del hospital Ignacio Chávez ISSTESON, así como voluntarios
que fueron invitados y reclutados personalmente en su centro de trabajo o
16
domicilio. Se excluyeron a aquellos participantes que presentaron patologías
crónicas e inmunosupresoras (cáncer, sida) y en el caso de mujeres,
embarazo. El tamaño de muestra calculado fue de 44 sujetos (22 casos con
obesidad, IMC ≥ 30 kg/m2 y 22 casos sin obesidad, IMC <25 kg/m2).
Muestras de sangre
Se extrajeron 30 mL de sangre y se distribuyeron en 5 tubos: tres con 5mL
sin anticoagulante para la obtención de las células mononucleares y 2 con 5
mL para obtención de suero.
Separación de células mononucleares
Las células mononucleares (CMN) se obtuvieron a partir de gradientes de
densidad de Ficoll-Hystopaque (GE Healthcare systems) en una proporción
2:1 sangre:ficoll, centrifugándose por 30 min a 1600 rpm a 4ºC.
Posteriormente se tomó únicamente la capa de células localizada entre la
capa de ficoll y el plasma. Éstas se lavaron dos veces con medio RPMI
suplementado con [L-glutamina (2 mM), penicilina (200 IU/mL),
estreptomicina (100 μg/mL), 2-mercaptoethanol (5 x10-5 μM)]. Los eritrocitos
se lisaron con cloruro de amonio (0.15 M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1 mM
EDTA) por 5 min a temperatura ambiente. Las CMN fueron lavadas según se
describió anteriormente. Finalmente, se resuspendieron en medio RPMI
suplementado con antibióticos y suero fetal bovino (SFB) al 10%. Las células
se contaron en cámara de Neubauer, utilizando azul de tripano (Sigma)
como colorante de exclusión, y se ajustó a una concentración de 1 x 106
células/mL.
17
Cuantificación de citocina IL-10 por ELISA
La presencia de la citocina IL-10 se determinó mediante ELISA (kit human
IL-10 cytosetTM, Invitrogen, Carsbland, CA), en suero de los diferentes
grupos de individuos. El suero se colocó directamente en una placa de 96
pozos y se realizaron las mediciones por duplicado. Primero, se incubó la
placa de 96 pozos con 100 µl por pozo de anticuerpo de captura por 18
horas a 4°C a una concentración de 2 µg/mL diluidos en buffer de
carbonatos pH 9.6. Después de incubar toda la noche se desechó la
solución y se bloqueó la placa con 300 μl de gelatina de pescado diluida en
buffer de fosfatos (PBS 1x) durante 1 hora a 37°C. Después, se lavó con
buffer de lavado y se añadieron 100 µl de los estándares de citocina por
duplicado de concentraciones seriadas de 1000, 500, 250, 125, 62.5 y 31.25
pg/mL. Al mismo tiempo se agregaron 100 µl de suero sin diluir en los pozos
por duplicado junto con 50 µl de anticuerpo de detección a una
concentración de 0.5 µg/mL. Se incubaron durante 2 horas a 37°C. Se lavó
con buffer de lavado 4 veces y se agregó 100 µl de solución de
estreptavidina-HRP con una concentración de 1/1250 por una hora a 37°C.
Se lavó 4 veces con buffer de lavado y se agregó 100 µl de 3,3’,5.5’-
tetrametilbencidina (TMB) por pozo y se incubó por 15 minutos en oscuridad.
Para finalizar, se detuvo la reacción con 100 µl de H2SO4 a una
concentración 1.8 N. Se midió la absorbancia en un lector de ELISA
(Microplate reader modelo 680 BIORAD) a 450 nm. Los datos fueron
analizados en el software Graph-Pad PRISM versión 5.0 con un modelo de 4
parámetros log-log.
18
Determinación de células T reguladoras
La frecuencia de células T reguladoras se evaluó por medio de citometría de
flujo para lo cual se utilizaron CMN obtenidas según se describió
anteriormente.
Se determinó el porcentaje de células CD4+CD25+FoxP3+ utilizando
anticuerpos específicos marcados con fluorocromos. Los anticuerpos que se
utilizaron fueron anti-CD4-APC (aloficocianina), anti-CD8-APC, anti-CD3-
PerCP Cy5 (proteína clorofila peridinina), anti-CD25-APC CY7 (BD
Biosciences) y anti-Foxp3-PE (ficoeritrina) (eBiosciences). El análisis de
citometría de flujo se realizó en un citómetro de flujo FACSCanto II™ (BD
Biosciences). El análisis de datos se llevó a cabo utilizando el programa
FACSDiva.
Marcaje extracelular. Se añadieron 2x105 células en los tubos marcados
como CD3+, CD4+, CD8+, CD25+ y Foxp3+. Para los tubos marcados como
sin teñir (ST) y control de isotipo se colocaron 5x105 células. Para el
cuádruple marcaje (CD3+CD4+CD25+Foxp3+ y CD3+CD8+CD25+Foxp3+), se
tomaron 1x106 células y se homogeneizaron. Se les añadió 3 mL de PBS
(solución amortiguadora de fosfatos) con SFB al 1% y se centrifugaron a
1400 rpm por 7 minutos. Después se decantaron los tubos y se
homogeneizaron. Se les añadieron 3 μL del anticuerpo correspondiente; al
control de isotipo se le añadió solo 2 μL de anticuerpo. Para el marcaje
cuádruple se utilizaron 10 μL de anticuerpo con sus respectivas diluciones.
Se dejaron incubar por 1 hora a 4°C en oscuridad. Se lavaron con 2 mL de
PBS con SFB en las mismas condiciones antes mencionadas. Se
decantaron los tubos y se volvieron a homogenizar las células para
posteriormente realizar el marcaje intracelular para Foxp3.
19
Marcaje intracelular para Foxp3. Los tubos con marcaje intracelular fueron
fijados utilizando el buffer de fijación comercial (eBioscience) por 1 h a 4 °C.
Después de la fijación, las células fueron permeabilizadas con el buffer de
permeabilización (eBioscience). Posteriormente se agregó 5 μL de
anticuerpo anti-Foxp3 (eBiosciensce) a los tubos correspondientes y 2 μL al
tubo marcado como control de isotipo (IgG1-PE). Se dejaron incubar por una
hora a 4°C en oscuridad. Por último, se lavaron con buffer de fijación y PBS.
Se ajustó el volumen total a 300 μL con PBS.
Cuestionario de frecuencia de consumo de alimentos
El cuestionario que se utilizó en esta investigación cuenta con 133 alimentos
los cuales fueron divididos en 11 secciones (Tabla 1). Personal de CIAD con
entrenamiento en la aplicación de los cuestionarios, entrevistó a los
voluntarios para obtener información sobre los tamaños de las raciones
(chicas, medianas o grandes), así como la frecuencia del consumo (día,
semana, mes, año y rara vez).
Tabla 1. Grupos de alimentos evaluados en el cuestionario de frecuencia de
consumo de alimentos.
Sección Tipo de alimentos
I Frutas y jugos
II Verduras y leguminosas
III Productos lácteos y huevo IV Platillos preparados
V Carnes y embutidos
VI Aceites, salsas, aderezos y sazonadores
VII Cereales, tortillas, panes y botanas VIII Pescados y mariscos
IX Dulces y postres
X Bebidas XI Frutos secos y semillas
20
Análisis Estadístico
Se llevó a cabo un análisis descriptivo de las variables utilizando la media
geométrica y el intervalo de confianza al 95% para las variables dietarias, así
como la media y el error estándar para los porcentajes de las poblaciones
celulares. Para hacer las comparaciones entre el grupo personas sin y con
obesidad, se realizaron pruebas de t para muestras independientes en los
datos con distribución normal y la prueba de U Mann-Whitney para los no
paramétricos. Para evaluar las asociaciones entre dieta y Tregs se llevó a
cabo una regresión lineal múltiple. Se realizaron varios modelos tomando
como variables dependientes CD4+CD25TotalFoxp3+, CD4+CD25AltaFoxp3+ y
CD8+Foxp3+ y como variables independientes la vitamina A, D y ácidos
grasos. Se utilizaron como variables de ajuste en todos los modelos, el IMC,
sexo, consumo de energía y edad. Todos los análisis se hicieron tomando en
cuenta una significancia de 0.05. El análisis se llevó a cabo en los
programas GraphPad Prisma versión 5.0 y en el programa STATA versión
8.0.
RESULTADOS
Características de la población
En este estudio se incluyeron 44 sujetos, los cuales se dividieron en dos
grupos de acuerdo a sus características antropométricas, 22 sujetos sin
obesidad y 22 sujetos con obesidad. En el grupo sin obesidad hubo 11
hombres y 11 mujeres con una media de edad de 32.7 ± 10.8 años; para el
grupo con obesidad fueron 12 hombres y 10 mujeres con una media de edad
de 34.2 ± 9.6 años (Tabla 2). Para las variables de talla se encontró una
media de 1.69 ± 6.3 y 1.67 ± 9.2 cm en el grupo sin y con obesidad
respectivamente. En el peso e IMC se encontraron diferencias significativas
21
entre grupos (p<0.05) con 65.4 ± 10.3 Kg y 22.7 Kg/m2 en los sujetos sin
obesidad, y 108 ± 22.5 Kg y 38.4 Kg/m2 en sujetos con obesidad.
Tabla 2. Características antropométricas de la población de estudio.
Características Sin obesidad Con obesidad valor de p
Género (M/F) 11/11 12/10 NA
Edad 32.7 ± 10.8 34.2 ± 9.6 0.6
Talla (cm) 169 ± 6.3 167 ± 9.2 0.09
Peso (Kg) 65.4 ± 10.3 108 ± 22.5 0.0008*
IMC (Kg/m2) 22.7 ± 2.5 38.4 ± 6.6 0.0001*
Los valores representan la media y desviación estándar. NA = no aplica.
* Prueba t (p<0.05).
Determinación de la frecuencia de linfocitos T CD4+ y CD8+ totales
Se determinó el porcentaje de linfocitos T CD4+ y CD8+ en los dos grupos de
estudio. Se encontró que los linfocitos T CD4+ en el grupo sin obesidad
presentó una media y error estándar de 51.65 ± 1.95% en comparación con
los sujetos con obesidad que fue de 54.50 ± 1.48%. Para los linfocitos T
CD8+ se obtuvo en el grupo sin obesidad una media y error estándar de
33.51 ± 1.85% y, en el grupo con obesidad fue de 33.45 ± 1.70%. Tanto para
CD4+ y CD8+, no se encontraron diferencias significativas entre los dos
grupos (p>0.05) (Figura 2).
22
Figura 2. Poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ en sujetos sin y con
obesidad. Las barras blancas representan a los sujetos sin obesidad y las
barras rosas sujetos con obesidad. A) Se presenta un histograma en donde
se encuentran seleccionada la región de los linfocitos T CD4+. B) Las barras
representan el porcentaje de CD4+ en sujetos con y sin obesidad. C)
histograma de la población de linfocitos T CD8+. D) las barras representan al
porcentaje de CD8+ de los sujetos de estudio. La muestra fue de 22 sujetos
del grupo sin obesidad y 22 sujetos en el grupo con obesidad. Las líneas
representan el error estándar SEM. Las diferencias entre grupos fueron
analizados mediante una prueba de t con un nivel de significancia de 0.05.
23
Distribución de linfocitos T reguladores
Para el análisis de las células Tregs CD4+ con fenotipo CD25AltaFoxp3+, se
identificaron los linfocitos CD3+ y a partir de esta región se analizó la
población CD4+. Posteriormente, se elaboró un diagrama de puntos para
analizar la expresión de CD4 y CD25 siguiendo lo descrito por Liu y cols., el
cual fue dividido en cuatro regiones, la negativa (sólo CD4+), total
(CD4+CD25+), el intermedio o bajo (CD4+CD25Intermedio) y alta (CD4+CD25Alta)
(Liu y cols., 2006) (Figura 3). De cada región se analizó la expresión de
Foxp3. Para las células CD8+Foxp3+ se determinaron los linfocitos CD3+ y a
partir de esta población los CD8+, se realizó un diagrama de puntos de CD8
vs Foxp3 donde se determinó el porcentaje de estas células.
Figura.3. Análisis de células Tregs. A) Se muestra una gráfica de puntos en
la que se encuentra seleccionada la población de linfocitos. B) Se realiza
24
una región en la gráfica de puntos seleccionando a los linfocitos CD4+. C) A
partir de los linfocitos CD4+ (B) se realiza otro gráfico de puntos de CD4 vs
CD25 en donde se determinaron 4 regiones: negativa, total, intermedia y alta
expresión de CD25. D) De cada una de las regiones antes mencionadas se
realizó un histograma para conocer la expresión de Foxp3+.
El factor de transcripción Foxp3+, se expresa en un porcentaje significativo
de las células T CD4+ y se relaciona con la expresión del marcador de
superficie CD25 (Sakaguchi y cols., 1995). Se determinó el porcentaje de
células Tregs en los sujetos de estudio (Figura 4). Las barras representan el
promedio del porcentaje de Foxp3+ en las células CD4+CD25Total,
CD4+CD25Alta y SEM. Para el fenotipo de células T reguladoras
CD4+CD25total se encontró una media y error estándar en el grupo sin
obesidad de 13.85 ± 2.51% y para los sujetos con obesidad de 11.89 ±
2.53%. Para las células CD4+CD25Alta los porcentajes son del 33.2 ± 4.78%
y 35.67 ± 6.26% en el grupo sin y con obesidad, respectivamente. Para el
fenotipo de células T reguladoras CD8+Foxp3+ fue de 0.35 ± 0.05% y 0.31 ±
0.05% en el grupo con y sin obesidad. No hubo diferencias entre grupos
(p>0.05) en los tres fenotipo de Tregs.
25
Figura 4. Porcentajes de células Tregs en sujetos sin y con obesidad. Las
barras blancas representan a los sujetos sin obesidad y las rosas a los
sujetos con obesidad. A) Células Tregs fenotipo CD4+CD25TotalFoxp3+. B)
Células Tregs fenotipo CD4+CD25AltaFoxp3+. C) Tregs fenotipo CD8+Foxp3+
en obesos y no obesos. El número de la muestra fueron 44 sujetos, 22
sujetos del grupo sin obesidad y 22 sujetos en el grupo con obesidad. Las
barras representan el porcentaje de Foxp3 en las células CD8+Foxp3+. Las
líneas representan el error estándar SEM. Las diferencias entre grupos se
analizaron por la prueba de U Mann-Whitney a un nivel de significancia de
0.05.
26
Determinación de IL-10
Los resultados mostraron que en el caso de los sujetos que presentaron
obesidad, no fue posible detectar la producción de citocina en 18 sujetos, 2
sujetos se eliminaron debido a que tuvieron valores fuera del límite de
detección que fue de 31.2 pg/mL. Sin embargo se encontraron valores de
101 y 285 pg/mL en 2 sujetos de éste grupo. En cuanto a los sujetos sin
obesidad, no fue posible la detección en 17 y solo 5 sujetos se detectaron
con valores que van entre 88-412 pg/mL. No se encontraron diferencias
significativas en las concentraciones séricas de los grupos con y sin
obesidad (p>0.05) (Figura.5).
ELISA IL-10
31.2
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Sin obesidad Con obesidad
Co
ncen
tració
n (
pg
/mL
)
Fig. 5. Determinación de IL-10 por ELISA en suero de sujetos sin y con
obesidad. Los datos son representativos de 44 sujetos; 22 sujetos sin
obesidad y 20 sujetos con obesidad. La línea sólida representa la media. La
comparación entre grupos se realizó por prueba de U Mann-Whitney a un
nivel de significancia de 0.05.
27
Asociación entre células T reguladoras y consumo de vitaminas A, D y
ácidos grasos
Utilizando un cuestionario de frecuencia de consumo de alimentos (CFCA)
se obtuvo el consumo habitual de la vitamina A, D y de ácidos grasos
(saturados, monoinsaturados y poliinsaturados) en los sujetos de estudio
(Tabla 2). Se observó que el consumo de vitamina A sobrepasa el
requerimiento diario recomendado de 2081.25 UI tanto en los sujetos sin
obesidad como en los sujetos con obesidad. Para la vitamina D se
encontraron valores por debajo del requerimiento diario recomendado que
son 1000 UI en ambos grupos. No se obtuvieron diferencias significativas
(p>0.05) en cuanto el consumo de grasas (monoinsaturadas y
poliinsaturadas), ni vitamina D entre ambos grupos. Sin embargo, si hubo
diferencias (p<0.05) en el consumo de vitamina A en donde el grupo con
obesidad presentó un mayor consumo de este nutrimento. La muestra para
el CFCA fue de 22 sujetos sin obesidad y 19 sujetos con obesidad (3 sujetos
no contestaron el CFCA debido a que no se pudieron localizar) (Tabla 3).
Se realizó también un análisis de regresión lineal múltiple para ver posibles
asociaciones entre linfocitos T CD4+, CD8+ y Tregs (CD4+CD25TotalFoxp3+
y CD4+CD25AltaFoxp3+ y CD8+Foxp3+) con los nutrimentos antes
mencionados. Para este análisis se tomó la población de sujetos sin
distinción entre sujetos sin y con obesidad para ver la asociación de las
28
Tabla 3. Consumo de alimentos de vitaminas A, D y ácidos grasos en
sujetos con y sin obesidad.
Condición Media geométrica
Intervalo de confianza al
95%
valor de p
Energía (Kcal) SO 2101 1731-2549 CO 2298 2020-2613 0.2690
Vitamina A (UI) SO 10510 6750 - 16364
CO 26081 14817 - 45908 0.0145*
Vitamina D (UI) SO 153.9 115 - 205.9
CO 150.3 121.1 - 186.5 0.8038
Grasa (g) SO 73.51 56.63 - 95.44
CO 68.37 55.84 - 83.72 0.8038
Grasa saturada (g)
SO 22.64 17.68 - 29
CO 21.82 17.73 - 26.85 0.9896
Grasa monoinsaturada (g)
SO 24.94 19.32 - 32.2
CO 21.48 17.85 - 25.83 0.4721
Grasa poliinsaturada (g)
SO 15.19 11.46 - 20.14
CO 14.13 10.81 - 18.45 0.7143
SO= Sin obesidad; CO=Con obesidad.
* Prueba de U Mann-Whitnney (p<0.05).
vitaminas A, D y ácidos grasos en el aumento de células Tregs.
Para el fenotipo CD4+CD25TotalFoxp3+ se encontró una asociación con la
vitamina D, ácidos grasos saturados y ácidos grasos monoinsaturados. Por
cada unidad de cambio en la vitamina D, ácidos grasos saturados y
29
monoinsaturados hay un aumento de 0.069, 1.184 y 0.549 % en las Tregs
respectivamente (p<0.05). En las células CD4+CD25AltaFoxp3+ hubo una
asociación con la vitamina D (β=0.173, p<0.01) y grasas saturadas (β=1.184,
p=0.051). Por último, para los linfocitos CD8+Foxp3, la vitamina D tuvo
efecto, ya que por cada unidad de cambio de la vitamina D aumenta 0.001%
estas Tregs (p<0.05) y también los ácidos grasos monoinsaturados ya que
cada unidad cambio provoca un aumento de 0.010% de los Tregs (p<0.05).
Para las poblaciones de CD4+ y CD8 no se encontró ninguna asociación con
estos nutrimentos (p>0.05). Estos datos son representativos de toda la
población en estudio (41 sujetos) (Tabla 4).
30
Tabla 4. Asociación de CD4+, CD8+ y Tregs con Vitaminas A, D y grasas.
Células Nutrimento β Valor de p
CD4+ vitamina A 4x10-05 0.972
vitamina D 0.018 0.298
grasa saturada 0.279 0.122
grasa moninsaturada
0.111 0.520
grasa poliinsaturada
0.024 0.881
CD8+ vitamina A 7.69x10-06 0.834
vitamina D -0.027 0.134
grasa saturada -0.253 0.175
grasa moninsaturada
-0.030 0.864
grasa poliinsaturada
0.098 0.548
CD4+CD25TotalFoxp3+ vitamina A -0.0002 0.141
vitamina D 0.069 0.011*
grasa saturada 1.184 0.041*
grasa moninsaturada
0.549 0.038*
grasa poliinsaturada
-0.407 0.450
CD4+CD25AltaFoxp3+ vitamina A -0.0002 0.141
vitamina D 0.173 0.003*
grasa saturada 1.184 0.051*
grasa moninsaturada
0.892 0.123
grasa poliinsaturada
-0.406 0.450
CD8+Foxp3+ vitamina A 1.68 X 10-06 0.123
vitamina D 0.001 0.037*
grasa saturada 0.001 0.087
grasa moninsaturada
0.010 0.045*
grasa poliinsaturada
-0.001 0.860
Variables de ajuste: IMC, sexo, edad y energía consumida.
* Prueba de U Mann-Whitnney (p<0.05).
31
DISCUSIÓN
La obesidad es un problema grave de salud pública ya que con ello
aumentan las enfermedades crónicas como diabetes tipo 2, hipertensión,
enfermedades coronarias, entre otras. En Estados Unidos el Centro de
Control y Prevención de Enfermedades (CDC) encontró que en el 2009 se
gastaron 147 billones de dólares al año en atención médica en sujetos con
obesidad. Además de su relación con el síndrome metabólico, se ha notado
que la obesidad presenta respuestas inmunes deterioradas frente a las
infecciones. Todo este conjunto de efectos de la obesidad en la salud, hace
que ésta tenga un fuerte impacto económico.
En este estudio se analizaron las CMN de sujetos sin y con obesidad y se
determinaron los porcentajes de CD4+, CD8+ y células Tregs. Los linfocitos
Tregs son muy importantes para mantener la homeostasis, ya que cuentan
con propiedades inmunosupresoras y constituyen del 5-10% de las células
CD4+ de la periferia (Cools y cols., 2007). En este trabajo se determinaron
los Tregs con fenotipo CD4+CD25TotalFoxp3+, CD4+CD25AltaFoxp3+ y
CD8+Foxp3+. Además, se midieron los niveles séricos de IL-10. Es conocido
que la IL-10 es una citocina anti-inflamatoria producida por diferentes tipos
de células, entre ellas las células Tregs Tr1 son una importante fuente
(McKinstry y cols., 2009). Se realizaron asociaciones entre células CD4+,
CD8+, CD4+CD25TotalFoxp3+, CD4+CD25AltaFoxp3+ y CD8+Foxp3+ con la
vitamina A, D y ácidos grasos para ver si su consumo tenían algún efecto en
el aumento de éstas células en circulación.
Al realizar la comparación entre los dos grupos sin y con obesidad, no se
encontraron diferencias significativas en los porcentajes de CD4+ y CD8+.
Se ha encontrado altas cantidades de CD4+ en sujetos con sobrepeso u
obesidad y cuentas altas de células CD8+ en sujetos con obesidad mórbida
(IMC>40 Kg/m2) en un estudio realizado en Estados Unidos (Womack y
32
cols., 2007). Sin embargo, de nuestros 22 sujetos, solamente 7 presentaron
obesidad mórbida, por lo que puede ser la razón de que no se encontraran
diferencias entre ambos grupos. Otros estudios han encontrado altos
porcentajes de linfocitos T CD4+ en tejido adiposo, por lo que es probable
que en sangre periférica no se puedan notar esas diferencias entre los
porcentajes de estas células (Kintscher y cols., 2008). Mientras que un
estudio realizado por Rocha y cols., encontraron un aumento de células
CD4+ y CD8+ en ratones obesos que ingirieron una dieta alta en grasas,
apoyando la teoría de la obesidad como un estado de inflamación
persistente. Las razones por las que no encontramos diferencias podría ser
que en nuestros sujetos de estudio el consumo de grasa no fue diferente
entre los grupos sin y con obesidad, además de que no todos nuestros
sujetos presentaron obesidad mórbida.
Las Tregs CD4+CD25AltaFoxp3+ suprimen la activación y proliferación de
linfocitos T CD4+ y CD8+ (Ribeiro Rodrigues y cols., 2006). Su función se
lleva a cabo a través de interacciones de larga duración con DCs poco
después de entrar a ganglios linfáticos, provocando que se deteriore la
habilidad de las DCs para activar a células T efectoras. Otro mecanismo es
la inhibición por contacto célula-célula o por producción de citocinas anti-
inflamatorias como IL-10 y TGF-β (Belkaid y cols., 2009). Se ha reportado
que en sujetos con obesidad, los valores de Tregs se encuentran
disminuidos en comparación con sujetos delgados de raza caucásica (De
Rosa y cols., 2007; Yun y cols., 2010).
En el tejido adiposo también hay una alta secreción de adipocitocinas y
leptina. Se ha encontrado que las Tregs tienen un tropismo preferencial
hacia el tejido adiposo y que presentan los receptores largos de leptina lo
que puede explicar la atracción hacia el tejido adiposo (Matarese y cols.,
2010). En la obesidad, altos niveles de leptina pueden influenciar
negativamente la expansión y proliferación de células Tregs, lo que podría
33
explicar porqué se encuentran reducidas en número y con función
deteriorada (De Rosa y cols., 2007).
En nuestra investigación no se encontraron diferencias (p>0.05) en los
niveles de CD4+CD25AltaFoxp3+ entre los grupos sin y con obesidad. Existen
datos controversiales en cuanto a los niveles de células Tregs en sujetos con
obesidad. Se ha encontrado que en sujetos con obesidad las células Tregs
se encuentran disminuidas en comparación con un grupo sin obesidad
(Matarese y cols., 2010; Yun y cols., 2010). Sin embargo, en un estudio
realizado en niños con y sin obesidad no se encontraron diferencias en los
porcentajes de Tregs al compararlos con el grupo sin obesidad (Švec y
cols., 2007). Además, datos no publicados por Gómez y cols., observaron
que los porcentajes de Tregs en sujetos con obesidad mórbida no
presentaron diferencias con los sujetos sin obesidad (Gómez y cols., 2010).
Probablemente, la generación de Tregs no se encuentre afectada en sangre
periférica en los sujetos con obesidad debido a la ingesta de vitaminas como
la A, D y ácidos grasos, que se han asociado con el incremento de Tregs.
Las células Tregs CD8+Foxp3+ son un grupo que ha sido muy poco
estudiado. Se ha encontrado una alta producción de IL-10 y TGF-β en
sujetos infectados con virus de inmunodeficiencia humana y virus de la
hepatitis C, lo que ha llevado a pensar que este grupo de células tenga
capacidad de suprimir la producción de citocinas y proliferación de células T,
probablemente para limitar el daño al tejido (Billerbeck y cols., 2009). No se
conoce el efecto que tienen estas Tregs en la obesidad. Los resultados que
obtuvimos sugieren que no hay un efecto de la obesidad, ya que no
obtuvimos diferencias significativas (p>0.05), contra el grupo sin obesidad.
En condiciones sin estimulación, el porcentaje de células Tregs es muy
pequeño, por lo que es necesario estimular las células para incrementar ese
porcentaje. En nuestro estudio los sujetos fueron sanos, ya que se pretendía
34
conocer los valores circulantes debido a la obesidad y no por un agente
externo como sería la estimulación de las células
En nuestros datos no encontramos diferencias significativas entre sujetos sin
y con obesidad, en las concentraciones de IL-10 (p>0.05) ya que los
resultados obtenidos estuvieron abajo del límite de detección. Sin embargo,
en los casos donde se pudo detectar, se observó que los sujetos con
obesidad presentaron menor cantidad de IL-10 respecto al grupo sin
obesidad. Al revisar el cuestionario de salud, los sujetos informaron que no
cursaban con ninguna enfermedad al momento de la toma de muestra; sin
embargo dado los resultados obtenidos es posible que los sujetos hayan
cursado con un proceso infeccioso asintomático.
La adiponectina es una hormona sintetizada por el tejido adiposo que
además tiene función de citocina. En la obesidad, esta citocina se encuentra
disminuida ya que se ha observado una relación inversa entre adiponectina
e IMC (Buechler y cols., 2011). La adiponectina tiene un efecto sobre la IL-
10 ya que activa vías de señalización en macrófagos como la de NF-κβ y
proteína cinasa A. La activación de estas vías culmina en la expresión de
mediadores anti-inflamatorios como IL-10. Por tal razón, los sujetos con
obesidad tienden a sintetizar menos IL-10 que los sujetos sin obesidad.
En la obesidad, se encuentra un desbalance entre ingesta y gasto de
energía. Esto se asocia con efectos adversos como son la diabetes mellitus
tipo 2, resistencia a insulina, inflamación, enfermedades cardiovasculares,
tumores, así como respuestas inmunes deterioradas frente a diversos
patógenos (Balistreri y cols., 2010). Por tal razón, en este estudio se vió la
asociación de vitamina A, D y ácidos grasos en la promoción de células
Tregs en los sujetos de estudio.
35
La vitamina A tiene varios efectos benéficos en la respuesta inmune. Se ha
visto que el ácido retinoico contribuye a la tolerancia inmunológica ya que
mejora la estabilidad y expresión de Foxp3 en el ratón (Lu y cols., 2010). En
células CD4+ humanas, se ha reportado que promueve la acetilación del
promotor del gen Foxp3 (Kang y cols., 2007). A pesar de haber tenido un
alto consumo de vitamina en nuestros sujetos de estudio, este consumo no
se asoció con la frecuencia de las poblaciones de Tregs
(CD4+CD25TotalFoxp3+, CD4+CD25AltaFoxp3+ y CD8+Foxp3+). Esto se puede
explicar ya que se ha observado que para que haya un efecto de la vitamina
A en la diferenciación de células Tregs, se necesita TGF-β e IL-2.
Otra vitamina que es importante para el sistema inmune es la vitamina D, la
cual es capaz de inhibir respuestas de tipo Th1, Th17 y promover Th2 y
células Tregs (Smolders y cols., 2009).
El receptor de la vitamina D, está presente en células T y B activadas, así
como en monocitos y células dendríticas. En las células dendríticas, se ha
encontrado que otro metabolito de la vitamina D (calcitriol) disminuye
moléculas de presentación de antígeno y moléculas coestimuladoras,
además de disminuir la producción de IL-12 y favorecer la producción de IL-
10. Como consecuencia, se suprime la síntesis de la respuesta Th1. Por otra
parte, 1,25(OH)2VD3 tiene la capacidad de inhibir la producción de IL-6 e IL-
2 por lo que induce la diferenciación y/o expansión de células Tregs
(Chambers y cols., 2011; Dimeloe y cols., 2010; Mora y cols., 2008) La
vitamina D ha sido un nutrimento muy documentado en la promoción de
células Tregs. Un estudio realizado por Prietl y cols., encontraron que la
suplementación con vitamina D en un grupo de sujetos sanos, aumentó
significativamente el porcentaje de Tregs (Prietl y cols., 2010). Otro estudio
realizado por Goreishi y cols., observaron un aumento de los Tregs en
nódulos linfáticos de ratón cuando fueron tratados con aplicación tópica de
un análogo de la vitamina D (calcipotriol) tras la exposición a rayos
36
ultravioleta (Ghoreishi y cols., 2009). También se ha demostrado que esta
vitamina tiene un impacto en el desarrollo de células dendríticas
tolerogénicas que tienen la capacidad de inducir células Tregs (Adorini y
cols., 2009).
En los resultados se obtuvo un consumo menor al requerimiento diario de
vitamina D que es de 1000 UI por día (153.9 y 150.3 UI en sujetos sin y con
obesidad respectivamente). Sin embargo, el 90% de la síntesis de vitamina
D es por exposición al sol y en Sonora (que es donde se llevó a cabo este
estudio), la mayoría de los días son soleados. Aunque el consumo de
vitamina D no haya sido el recomendado, la síntesis de esta vitamina es
compensada por la exposición al sol, por lo que no podemos hablar de
deficiencia tomando en cuenta solo su consumo. Las asociaciones de
vitamina D se realizaron en base a su consumo en todos los sujetos de
estudio (sin y con obesidad) y se encontró que para los tres fenotipos de
Tregs había asociación significativa (p<0.05), en donde entre mayor fue el
consumo de vitamina D hubo un incremento en las Tregs. Esto nos confirma
la importante función que tiene esta vitamina en la respuesta inmune y nos
puede explicar por qué los porcentajes en los sujetos con obesidad no se
ven afectados.
Los ácidos grasos saturados suprimen la proliferación en linfocitos humanos
y aumenta la producción de citocinas inflamatorias (TNF-α, IL-6) (Han y
cols., 2002). Sin embargo, nuestros datos indican que existe una asociación
significativa (p<0.05), entre ácidos grasos y Tregs. Esto nos indica que un
consumo de ácidos grasos saturados y monoinsaturados tienen una
aportación en la generación de Tregs. Se esperaba que los PUFAS tuvieran
una mayor asociación, ya que se ha reportado que el EPA tiene efectos
inmunosupresores al activar receptores activados por el proliferador de
peroxisomas (PPAR-) que funge como antagonista del factor nuclear κβ
(NF- κβ) (Ye y cols., 2010). También se ha encontrado que la ingesta de
37
EPA ayuda en la reducción de la obesidad disminuyendo el riesgo a
enfermedades (Makhoul y cols., 2011). En un estudio realizado en población
sonorense por González y cols., encontraron que el consumo de grasa total
y saturada fue mayor que el consumo de grasa monoinsaturada y
poliinsaturada. Esto se debió a que hubo una disminución en el consumo de
pescado que es el principal aportador de los PUFAS (González, 2008). Es
probable que debido al bajo consumo de pescado, no haya sido posible
detectar la asociación que tienen los ácidos grasos poliinsaturados en el
aumento de los Tregs.
38
CONCLUSIÓN
No se encontraron diferencias entre los sujetos sin y con obesidad en las
poblaciones celulares de linfocitos T CD4+, CD8+ y Tregs fenotipo
CD4+CD25Total+Foxp3+, CD4+CD25AltaFoxp3+, CD8+Foxp3+ y la citocina IL-
10. Se encontró que el consumo de vitamina A no tuvo efecto en la
generación de Tregs, sin embargo, en la vitamina D y ácidos grasos sí se
encontró una asociación con el aumento en los tres fenotipos de Tregs. Por
lo tanto, estos nutrimentos podrían estar promoviendo la generación de las
células Tregs en ambos grupos de manera que no se vean afectados los
niveles circulantes de estas células.
39
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