ccf plantas

CURSO DE CONTROL DE CALIDAD DE FITOFARMACOS, DICIEMBRE 3 AL 7, 2001

Gloria Amparo Valencia P., y Alejandro Martínez M.

1

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA

DEPARTAMENTO DE FARMACIA

GUIA PARA EL RECONOCIMIENTO DE DROGAS VEGETALES POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Elaborado por:

GLORIA AMPARO VALENCIA P. ALEJANDRO MARTINEZ M.

Medellín, Diciembre de 2001



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Práctica 1 RECONOCIMIENTO CROMATOGRÁFICO DE PLANTAS MEDICINALES

APROBADAS EN COLOMBIA

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE AJENJO, Artemisia absinthium L., Asteraceae

Introducción La droga la constituyen las hojas y flores. Las hojas contienen 0.3% de principios amargos (absinthina y anabsinthina), mientras que las flores contienen un 0.15%. Extracción 1 g. de droga pulverizada se extrae durante 10 minutos con 10 ml de Metanol a 60°C sobre un baño de agua. La mezcla se filtra y el filtrado se evapora hasta un volumen aprox. de 2 ml. Fase estacionaria: Sílica gel 60F-254 Fase móvil: Cloroformo:Metanol 95:5 Revelador: Liebermann-Burchard/UV 365 nm Rf SIJSTANCIA COLOR 0.3-0.4 Absinthina amarillo ocre

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DEL AJO, Allium sativum, Liliaceae

Introducción El bulbo o diente contiene cisteína, cistina, sulfóxido de metionina, cicloaliína, aliína (= sulfóxido de S-alilcisteína), y deoxialiína (=S-alil-cisteína), junto con otros aminoácidos azufrados y sulfóxidos de cisteína. Extracción 25 g. de dientes frescos finamente desmenuzados se extraen en frío (con ayuda de hielo seco) con 2 porciones de 100 ml de metanol al 80%. Se purifica por cromatografía en columna, controlando las fracciones con Reactivo de Ninhidrina.



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Fase estacionaria: Sílica gel 60 Fase móvil: n-Butanol : n-Propanol : Acido acético glacial : Agua 30 : 10 : 10 : 10 Revelador: Ninhidrina Rf SUSTANCIA COLOR 0.5 Alicina Naranja

0.7 Aliína Azul-violeta

RECONOCIMIENTO DE LA ALCACHOFA POR

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Introducción La droga la constituyen las hojas, las cuales contienen sesquiterpenlactonas como cinaropicrina, grossheimina y cinarina; ácidos fenolcarboxilicos como 1,3-dicafeoilquínico, clorogénico y neoclorogénico; y luteolina-7-O-glucósido, un flavonoide. Extracción 1 g. de droga pulverizada se extrae durante 10 minutos con 10 ml de metanol a 60°C sobre un baño de agua. La mezcla se filtra y se evapora hasta un volumen de aprox. 2 ml Fase estacionaria: Sílica gel 60F-254 Fase móvil: Acetato de etilo:Acido fórmico:Acido acético:Agua 100 : 11 : 11 : 27 Revelador: Polietilénglicol para productos naturales/UV 365 nm

Rf SIJSTANCIA COLOR 0.7 Cinarina Azul fluorescente

0.6 Luteolina-7-0-gluc. Amarillo

0.45 Acido clorogénico Azul fluorescente

0.4 Rutina Amarillo



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RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE LA

ALBAHACA, Ocimum basilicum, Lamiaceae Introducción La droga la constituyen las hojas, las cuales contienen 0.1-0.45% de aceite esencial. El aceite esencial contiene principalmente metilchavicol 55% y linalool. Extracción a) Por arrastre con vapor de agua Método oficial de la Farmacopea Europea III, pág. 62. b) Con Diclorometano 1 g. de droga pulverizada se extrae por agitación durante 15 minutos con 10 ml de diclorometano. El filtrado obtenido se evapora a sequedad. El residuo se disuelve en 1 ml de Tolueno, y se aplican 50-100 µL. en la placa cromatográfica. Fase estacionaria: Sílica gel 60 Fase móvil: Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Revelador: Vainillina- Acido sulfúrico

Rf SUSTANCIA COLOR 0.3 Linalool Azul intenso

0.9 Metilchavicol Rojo violeta

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE LA HIERBABUENA, Mentha viridis L., Lamiaceae Introducción La droga la constituyen las hojas y ramas jóvenes, las cuales contienen 1.2% de aceite esencial. El aceite contiene principalmente L-carvona 42-67%, mentol, acetato de dihidrocarveol, alcohol dihidrocuminílico, pineno, limoneno y felandreno.



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Extracción 1) Destilación por arrastre con vapor de agua Se utiliza el método oficial de la Farmacopea Europea III pág. 62 con 50 g de muestra, 500 ml de agua, 2 horas de destilación a un flujo de 3-3.5 ml /min. 2) Extracción con diclorometano Como se describió para la albahaca Fase estacionaria: Sílica gel 60 Fase móvil: Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Revelador: Vainillina-Acido sulfúrico

Rf SUSTANCIA COLOR 0.25 Alcohol dihidrocumínico Azul intenso

0.46 Carvona Rojo-Violeta

0.7 Acetato de dehidrocarveol Azul intenso

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE HINOJO, Foeniculum vulgare, Apiaceae

Introducción La droga la constituyen los frutos, los cuales contienen 2-7% de aceite esencial. El aceite esencial contiene principalmente anetol (50-80% en la variedad dulce, 60-80% en la variedad vulgare), metilchavicol, safrol, anisaldehído y fenchona (0.4-0.8% en la variedad dulce, 12-22% en la variedad vulgare). Extracción 1) Destilación por arrastre con vapor de agua Según el método oficial de la Farmacopea Europea III, pág. 62, utilizando 10 g. de muestra, 200 ml de agua, 2 horas de destilación a una rata de 2-3 ml /min. 2) Extracción con diclorometano Tal como se describió para la albahaca. Fase estacionaria: Sílica gel 60 Fase móvil: Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Reveladores: 1.Vainillina-Acido sulfúrico 2. PMA-Permanganato de potasio 3. Acido sulfúrico concentrado



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Rf SUSTANCIA REVELADOR COLOR 0.6 Fenchona 3 Azul oscuro

0.9 Anetol 1 2 3

Rojo-Violeta Rojo-Pardo Azul oscuro

Nota: La fenchona no se detecta en estas condiciones para el anís, lo que permite diferenciar las dos plantas.

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE LA MALVA, Malva sylvestris, Malvaceae

Introducción La flor contiene la malvina, un pigmento que le confiere el color característico. Extracción 1 g. de droga pulverizada se extrae por agitación durante 15 minutos con 6 ml de Metanol:Acido Clorhídrico (9 partes de metanol, 1 parte de ácido al 25%). Se utilizan 25 µl del filtrado para la cromatografía. Fase estacionaria: Sílica gel 60F-254 Fase móvil: n-Butanol : Acido acético glacial : Agua 40 : 10 : 20 Reveladores: Ninguno

Rf SUSTANCIA COLOR 0.4 Malvina (=Malvidin-3,5-di-

glucósido Violáceo

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE LA MANZANILLA MATRICARIA, Matricaria chamomilla, Asteraceae

Introducción La droga la constituyen las flores, las cuales contienen 0.5-1.5% de aceite esencial. El aceite esencial a su vez contiene chamazuleno 0-15%, bisabolol 10-25%, bisabolol óxidos A y B (ambos 10-25%), poliínas 1-40%, farneseno 15%.



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Extracción a) Destilación por arrastre con vapor de agua Según método oficial de la F. Eur. III pág. 62 con: 50 g de muestra, 500 ml de agua destilada de una solución de cloruro de sodio al 1%, 4 horas de destilación a 3-4 ml/minuto. b) Extracción con Diclorometano Tal como se ha descrito para la albahaca. Fase estacionaria: Sílica gel 60 Fase móvil: Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Revelador: Vainillina-Acido sulfúrico

Rf SUSTANCIA COLOR 0.2 Oxidos A y B de bisabolol Amarillo/Verde

0.25 Alcohol terpenoide Violeta

0.35 Bisabolol Violeta

0.5-0.6 Poliínas Pardo

0.95 Azuleno Rojo violeta

0.99 Farneseno Azul-Violeta

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DEL ROMERO, Rosmarinus officinalis, Lamiaceae

Introducción Las hojas contienen 1-2% de aceite esencial, el cual contiene principalmente 1,8-cineol 15-30%, borneol 10-20%, acetato de bornilo, camfeno 5-10%, alfa- y beta-pineno. Extracción a) Destilación por arrastre con vapor de agua Según método oficial de la Farm. Eur. III pág. 62. b) Extracción con diclorometano Tal como se describió para la albahaca. Fase estacionaria: Sílica gel 60 Fase móvil: Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Revelador: Vainillina-Acido sulfúrico



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Rf SUSTANCIA COLOR

0.25 Borneol Azul oscuro

0.45 Cineol Azul intenso

0.7 Acetato de bornilo Azul intenso

0.99 Alfa- y beta-pineno Violeta

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE LA SABILA, Aloe vera, Liliaceae

Introducción La droga la constituye el jugo desecado de las hojas el cual contiene 14-28% de principios antracénicos tales como aloína, aloesinas A y B, aloinósidos A y B, etc. Extracción 0.5 g. de droga pulverizada se extraen con 5 ml de Metanol, calentando durante 5 minutos sobre un baño de agua. El filtrado se aplica directamente sobre la placa cromatográfica. Fase estacionaria: Sílica gel 60F-254 Fase móvil: Acetato de etilo : Metanol : Agua 100 : 13.5 : 10 Reveladores: 1) Hidróxido de potasio/UV 365 nm 2) Poiietilénglicol PN/UV 365 nm

Rf SUSTANCIA REVELADOR COLOR 0.3 Aloinósidos A y B 1 y 2 Amarillo

0.47 Aloína 1 y 2 Amarillo

0.95 Aloé-emodina 1 Rojo

--- Aloesinas A y B

1 Azul fluorescente



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RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE FLORES DE SAUCO, Sambucus nigra, Caprifoliaceae

Introducción La droga la constituyen las flores, las cuales contienen glicósidos de quercetina 1.5-3% como hiperósido, isoquercitrina y rutina. Extracción 1 g. de droga pulverizada se extrae con 10 ml de metanol durante 5 minutos sobre un baño de agua a aproximadamente 60 °C. El filtrado se utiliza para la cromatografía.

Fase estacionaria: Sílica gel 60F-254 Fase móvil: Acetato de etilo : Acido fórmico : Acido acético : Agua 100 : 11 : 11 : 27 Reveladores: 1) R. productos naturales/UV 365 nm 2) Polietilénglicol para productos naturales/UV 365 nm

Rf SUSTANCIA COLOR 0.4 Rutina Amarillo

0.7 Isoquercitrina Amarillo

0.9 Acido cafeico Azul fluorescente

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE HOJAS DE TORONJIL, Melissa officinalis, Lamiaceae

Introducción Las hojas contienen 0.01-0.25% de aceite esencial, el cual está constituido principalmente de citronelal 39%, citral 30%, citronelol, linalool, geraniol y cariofileno. Extracción a) Por arrastre con vapor de agua Según el método oficial de la Farmacopea Europea III pág. 62, con: 40 g. de muestra, 400 ml de agua, destilando a 2-3 ml/min durante 2 horas.



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b) Extracción con Diclorometano Como se describió para la albahaca. Fase estacionaria: Sílica gel 60 Fase móvil: Cloroformo Revelador: Anisaldehído/Acido sulfúrico

Rf SUSTANCIA COLOR 0.7 Citronelal Azul intenso

0.45 Citral Azul violáceo

0.25-0.4 Geraniol, linalool y Citronelol

Azul violáceo

RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE RAICES DE VALERIANA, Valeriana officinalis, Valerianaceae

Introducción La droga la constituyen las raíces o rizomas que contienen los valepotriatos como: valtrato, isovaltrato, IVDH_valtrato, didrovaltrato y acevaltrato, cuya concentración cambia de una variedad a otra. Además contiene 0.25% de aceite esencial en los rizomas frescos, el cual contiene valerenal, valeranona y ácido valerénico. Extracción 0.2 g. de droga pulverizada se extraen con 5 ml de diclorometano durante 5 minutos a unos 60 0C con agitación ocasional. El residuo de la filtración se lava con otros 2 ml de diclorometano. Los extractos combinados se evaporan a sequedad, y el residuo de disuelve en 0.2 ml de acetato de etilo. Se aplican en la cromatoplaca 10 microlitros de esta solución. Fase estacionaria: Sílica gel 60 Fase móvil: Tolueno : Acetato de etilo 75 : 25 Revelador: HCl concentrado : Acido acético glacial 2 : 8

Rf SUSTANCIA COLOR 0.73 Valtrato/Isovaltrato Azul

0.65 Didrovaltrato Pardo

0.55 Acevaltrato Azul

0.4 IVDH-Valtrato Azul

<0.4 Valtrahidrinas Azul

Origen Productos de degradación



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Bibliografía 1. Domínguez, X. A., Métodos de Investigación Fitoquímica, Edit. Limusa, Mexico,

1973. 2. Wagner, H., Bladt, S., Zgainski, E. M., Plant Drug Analysis. A Thin Layer

Chromatography Atlas, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York-Tokyo, 1984. 3. Evans, W. C., Farmacognosia Trease-Evans, 13 edic., Interamericana McGraw-Hill,

Madrid-Auckland-Bogotá, 1991. 4. Harborne, J. B., Phytochemical Methods. A Guide to Modern Techniques of Plant

Analysis, Chapman & Hall, London-Weinheim-New York, 1998. 5. Gattuso, M. A., Gattuso, S. J., Manual de Procedimientos para el Análisis de Drogas

en Polvo, UNR Editora, Cyted, Rosario (Argentina), 1999. 6. Ramírez, S., Fonnegra, R., Plantas Medicinales Aprobadas en Colombia,

Universidad de Antioquia, Medellín, 1999. 7. http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez/laboratorio/pagelab.html 8. http://muiscas.udea.edu.co/~amart/indice.html 9. http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez 10. Stahl, E., Thin Layer Chromatography 11. Martínez, A., Farmacognosia y Fitoquímica Experimental, Universidad de Antioquia,

Medellín, 1991. 12. Revistas especializadas: Phytochemistry, Planta Medica, Journal of Natural

Products, Journal of Food and Agricultural Chemistry, etc. 13. Bases de datos: Napralert 14. República de Colombia, Ministe rio de Salud, Decreto ley Nº 677, Ley del

medicamento de 1994. 15. Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials, World Health Organization,

Geneva, 1998. 16. Sharapin, N., Fundamentos de Tecnología de Productos Fitoterapeúticos, Roberto

Pinzón ed., Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo, Cyted, Santafé de Bogotá D. C., 2000.

17. CD Farmacognosia y Fitoquímica, versión 2.0, Alejandro Martínez y Gabriel J. Arango, Universidad de Antioquia, Medellín, 2001.



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Práctica 2 DESARROLLO DE UN METODO CUANTITATIVO

POR CCF-UV

CUANTIFICACION DE RUTINA EN FLORES DE SAUCO Y EN PARTES AEREAS DE PENSAMIENTO

Introducción La rutina es un glicósido flavonoide que se encuentra ampliamente distribuido en plantas y productos fitofarmacéuticos. Esta amplia distribución, junto con la facilidad en su detección a nivel de laboratorio mediante la cromatografía en capa fina (CCF) y la espectroscopia Ultravioleta (UV), la hacen un indicador adecuado para el reconocimiento y el control de calidad de productos fitofarmacéuticos terminados o sus materias primas vegetales correspondientes. Procedimiento

• Preparar una solución estándar de rutina en metanol de concentración 100 ppm • Tomar 1.2 ml de solución completar a 10 ml y determinar el espectro UV entre

200 y 400 nm. • Seleccionar la longitud de onda de trabajo. • Para obtener la curva de calibración, tomar alícuotas de la solución estándar y

llevar a 10 ml según la tabla siguiente. Leer absorbancias de cada solución a la longitud de onda de trabajo. Realizar una curva de Absorbancia vs. Concentración en ppm.

Alícuota (ml) Volumen final

(ml) Absorbancia a

360 nm Concentración de rutina

(ppm) 0.6 10.0 0.9 10.0 1.2 10.0 1.5 10.0 1.8 10.0

La gráfica muestra una curva de calibración obtenida experimentalmente con una

solución estándar de rutina de concentración aproximada a 100 ppm.



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Curva de calibración de estándar de rutina

y = 0,0352x + 0,037R2 = 0,9906

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 5 10 15 20 25

Concentración en metanol (ppm)

Abs

orba

ncia

a 3

60 n

m

2. Extracción de la droga

• 1 g de droga seca y en polvo (pesar con balanza de precisión ± 1 diezmilésima de gramo), se extrae con 10 ml de metanol, con agitación, calentamiento en baño de agua a 60°C, durante 10 minutos. Filtrar, lavar el filtrado dos veces con 10 ml de metanol (preferiblemente caliente), evaporar a sequedad y pesar el extracto obtenido.

3. Separación mediante CCF

• Redisolver el extracto en 2 ml de metanol caliente y sembrar una banda en una cromatoplaca de sílica gel GF-254 (20x10 cm, 1 mm espesor de capa), colocando al lado una aplicación del estándar de rutina disuelto en metanol. Evaporar a sequedad el resto de extracto y pesar para determinar por diferencia el peso de extracto sembrado en CCF.

• Desarrollar en la mezcla Acetato de etilo/Acido fórmico/Acido acético/Agua 100:11:11:2.7.

• La rutina se observa con un rf aproximado de 0.3, de color amarillo. • Retirar la placa luego de desarrollar, dejarla secar en un extractor de vapores y

analizarla con una lámpara UV a 254 nm. • Demarcar la banda correspondiente a la rutina en la muestra, raspar y extraer

con metanol caliente 3 veces (porciones de 5 a 10 ml). Los filtrados se concentran a sequedad y se redisuelven en 3 ml de metanol, medidos con exactitud.



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4. Lectura espectrofotométrica y cuantificación • Leer absorbancia a 360 nm y determinar concentración mediante interpolación

con la curva de calibración. • Determinar el porcentaje de rutina en la muestra y comparar con lo reportado

para muestras auténticas.

CUANTIFICACION DE RUTINA EN UN JARABE DE SAUCO

Introducción La rutina es un glicósido flavonoide que se encuentra ampliamente distribuido en plantas y productos fitofarmacéuticos. Esta amplia distribución, junto con la facilidad en su detección a nivel de laboratorio mediante la cromatografía en capa fina (CCF) y la espectroscopia Ultravioleta (UV), la hacen un indicador adecuado para el reconocimiento y el control de calidad de productos fitofarmacéuticos terminados o sus materias primas vegetales correspondientes. En este caso se propone un método de cuantificación en un jarabe. Procedimiento

• Preparar una solución estándar de rutina en metanol de concentración 100 ppm • Tomar 1.2 ml de solución completar a 10 ml y determinar el espectro UV entre


llevar a 10 ml según la tabla siguiente. Leer absorbancias de cada solución a la longitud de onda de trabajo. Realizar una curva de Absorbancia vs. Concentración en ppm.


(ml) Absorbancia a

360 nm Concentración de rutina (ppm)

0.6 10.0 0.9 10.0 1.2 10.0 1.5 10.0 1.8 10.0


• A partir de la información dada en la etiqueta por el fabricante tomar un volumen equivalente a 1 g de droga seca y en polvo (medir exactamente con material volumétrico). Evaporar a sequedad con ayuda de vacío y calentando a 60°C. El residuo se extrae con 10 ml de metanol, con agitación, calentamiento en baño



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de agua a 60°C, durante 10 minutos. Filtrar, lavar el filtrado dos veces con 10 ml de metanol (preferiblemente caliente), evaporar a sequedad y pesar el residuo obtenido.

3. Separación mediante CCF

• Redisolver el residuo en 2 ml de metanol caliente y sembrar una banda en una cromatoplaca de sílica gel GF-254 (20x10 cm, 1 mm espesor de capa), colocando al lado una aplicación del estándar de rutina disuelto en metanol.

• Desarrollar en la mezcla Acetato de etilo/Acido fórmico/Acido acético/Agua 100:11:11:2.7.

• La rutina se observa con un rf aproximado de 0.3, de color amarillo. • Retirar la placa luego de desarrollar, dejarla secar en un extractor de vapores y

analizarla con una lámpara UV a 254 nm. • Demarcar la banda correspondiente a la rutina en la muestra, raspar y extraer

con metanol caliente 3 veces (porciones de 5 a 10 ml). Los filtrados se concentran a sequedad y se redisuelven en 3 ml de metanol, medidos con exactitud.

4. Lectura espectrofotométrica y cuantificación

• Leer absorbancia a 360 nm y determinar concentración mediante interpolación con la curva de calibración.

Figura 1. Espectro UV de rutina en metanol



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CUANTIFICACION DE ANETOL EN SEMILLAS DE ANIS E HINOJO

Introducción El anetol es un fenilpropano que se encuentra distribuido en varias plantas aromáticas. Esta amplia distribución, junto con la facilidad en su detección a nivel de laboratorio mediante la cromatografía en capa fina (CCF) y la espectroscopia Ultravioleta (UV), la hacen un indicador adecuado para el reconocimiento y el control de calidad de productos fitofarmacéuticos terminados o sus materias primas vegetales correspondientes. Procedimiento

• Preparar una solución estándar de anetol en metanol de concentración 100 ppm • Tomar 1.2 ml de solución completar a 10 ml y determinar el espectro UV entre


llevar a 10 ml según la tabla siguiente. Leer absorbancias de cada solución a la longitud de onda de trabajo. Las absorbancias deben estar en el rango de 0.3 a 0.8, si no es así se deberán preparar diluciones calculando absorbancias de 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 y 0.7. Realizar una curva de Absorbancia vs. Concentración en ppm.


(ml) Absorbancia a

360 nm Concentración de rutina (ppm)

10.0 10.0 10.0 10.0 10.0


• 1 g de droga seca y en polvo (pesar con balanza de precisión ± 1 diezmilésima de gramo), se extrae con 10 ml de diclorometano, con agitación, durante 15 minutos. Filtrar, lavar el filtrado dos veces con 10 ml de diclorometano, evaporar a sequedad y pesar el extracto obtenido.



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3. Separación mediante CCF • Redisolver el extracto en 1 ml de tolueno y sembrar una banda en una

cromatoplaca de sílica gel GF-254 (20x10 cm, 1 mm espesor de capa), colocando al lado una aplicación del estándar de anetol disuelto en tolueno ó diclorometano. Evaporar a sequedad el resto de extracto no sembrado y pesar. Por diferencia determinar el peso de extracto sembrado.

• Desarrollar en la mezcla Tolueno/Acetato de etilo 93:7. • Retirar la placa luego de desarrollar, dejarla secar en un extractor de vapores y

analizarla con una lámpara UV a 254 nm. El anetol se observa a un Rf aproximado de 0.95.

• Demarcar la banda correspondiente al anetol en la muestra, raspar y extraer con diclorometano 3 veces (porciones de 5 a 10 ml). Los filtrados se concentran a sequedad y se redisuelven en 3 ml de metanol, medidos con exactitud.

4. Lectura espectrofotométrica y cuantificación

• Leer absorbancia a 360 nm y determinar concentración mediante interpolación con la curva de calibración.

• Determinar el porcentaje de anetol en la muestra y comparar con lo reportado para muestras auténticas.

Figura 2. Espectro UV de anetol en metanol

ccf plantas

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