砷生物偵測物種分析研究 - kun shan...

IOSH88-A303

砷生物偵測物種分析研究砷生物偵測物種分析研究砷生物偵測物種分析研究砷生物偵測物種分析研究

Arsenic Speciation in Biological Monitoring

行政院勞工委員會勞工安全衛生研究所行政院勞工委員會勞工安全衛生研究所行政院勞工委員會勞工安全衛生研究所行政院勞工委員會勞工安全衛生研究所編印編印編印編印

IOSH88-A303

砷生物偵測物種分析研究砷生物偵測物種分析研究砷生物偵測物種分析研究砷生物偵測物種分析研究

Arsenic Speciation in BiologicalMonitoring

研究主持㆟研究主持㆟研究主持㆟研究主持㆟：謝俊明：謝俊明：謝俊明：謝俊明

計畫主辦單位計畫主辦單位計畫主辦單位計畫主辦單位：行政院勞工委員會勞工安全衛生研究所：行政院勞工委員會勞工安全衛生研究所：行政院勞工委員會勞工安全衛生研究所：行政院勞工委員會勞工安全衛生研究所

研究期間研究期間研究期間研究期間：㆗華民國八十七年十月㆒日至八十八年五月：㆗華民國八十七年十月㆒日至八十八年五月：㆗華民國八十七年十月㆒日至八十八年五月：㆗華民國八十七年十月㆒日至八十八年五月㆔十㆒日㆔十㆒日㆔十㆒日㆔十㆒日

印製日期印製日期印製日期印製日期：㆗華民國八十八年十㆓月：㆗華民國八十八年十㆓月：㆗華民國八十八年十㆓月：㆗華民國八十八年十㆓月

行政院勞工委員會勞工安全衛生研究所行政院勞工委員會勞工安全衛生研究所行政院勞工委員會勞工安全衛生研究所行政院勞工委員會勞工安全衛生研究所編印編印編印編印

I

摘要摘要摘要摘要

砷是㆒種非必須而且會累積的毒性元素，其化合物的毒性會隨化

學型態、攝入體內的途徑、劑量以及暴露期間不同而有極大的改變。

食入無機㆔價砷因為對 SH 基有極大的親和力進而破壞酵素的作用，

所以毒性比無機五價砷大。而砷化合物其毒性大小依序是 arsine

(AsH3) > arsenite (As(III)) > arsenate (As(V)) > monomethylarsonic

acid (MMAA) > dimethylarsinic acid (DMAA) > arsenobetaine (AsB)。

本研究乃利用高效能液相層析法 (HPLC)分離尿㆗不同砷物種，再

以麩氨基硫 (Glutathione)當作前還原劑 (pre-reductant)將所有砷物種

先前還原，全部還原成 AsH3 氣體的狀態，最後導入流動注入式氫化

物產生原子吸收光譜儀 (flow injection – hydride generation atomic

absorption spectrometry， FI-HGAAS)做分析。

本研究選擇新的還原劑 Glutathione (GSH)，由結果發現比過去

使用 L-cysteine 當作前還原劑可以得到更高的感度，並且在低酸、低

NaBH4 濃度㆘進行砷物種分析。 GSH 是由 glutamate、 cysteine、

glycine ㆔種胺基酸所組成的，存在於體內，所以對㆟體來講是無毒

的。如此㆒來，GSH 不僅可以得到更高的感度，也可以減少對儀器損

害的程度，並且對操作者及環境㆖的危害都可減至最低。此種方法有

很好的準確度、精密度、回收率和偵測極限。研究結果顯示，採樣瓶

內砷汙染的情形並不嚴重，㆕種砷物種的偵測極限 As(III)，As(V)，

MMAA，DMAA 分別為 0.015 ppb，0.045 ppb，0.024 ppb，0.015 ppb。

以㆖整個方法經品管驗證其可行性很高，可運用於砷之生物偵測物種

分析。

II

Abstract

Arsenic is a nonessential cumulative toxic element to human. The

toxicity of arsenic compounds varies greatly with the chemical forms,

route of entry into the body, dose, and duration exposure. Inorganic

As(III) is more toxic than inorganic As(V) following ingestion, due to

the greater affinity and enzymatic damage. The rank order of arsenical

toxicity is as follow: arsine (AsH3) > arsenite > arsenate >

monomethylarsonic acid > dimethylarsinic acid > arsenobetaine.

In the present study, we use high performance liquid chromato-

graphy (HPLC) to separate arsenic species in human urine. Glutathione

(GSH) is used as a prereducing agent. An optimal condition for

determination of arsenic species in human urine by flow injection

hydride generation atomic absorption spectrophotometry (HGAAS) is

also established.

In this study, we used a new prereductant (glutathione) to replace

L-cysteine. GSH is composed of glutamate, cysteine, and glycine. The

GSH is much less corrosive, higher sensitive, and easier to handle by

the operator. The methods developed showed good accuracy, precision,

and recovery. The detection limits are for As(III), As(V), MMAAand

DMAA are 0.015 ppb, 0.045 ppb, 0.024 ppb and 0.015 ppb, respectively.

The method can be used to determine arsenic species for biological

monitoring of works exposed to arsenic.

III

目錄目錄目錄目錄

摘要摘要摘要摘要 ................................................................................... I

Abstract ............................................................................ II

第㆒章第㆒章第㆒章第㆒章前言前言前言前言 .................................................................... 1

第㆒節研究背景 .............................................................................. 1第㆓節研究目的 .............................................................................. 2第㆔節先進國家砷之生物偵測指標 ......................................... 3

第㆓章第㆓章第㆓章第㆓章材料與方法材料與方法材料與方法材料與方法 .......................................................... 5

第㆒節儀器設備裝置 ..................................................................... 5第㆓節試藥與試劑配製 ................................................................ 6第㆔節最適分析方法研究 ............................................................ 8

第㆔章第㆔章第㆔章第㆔章結果結果結果結果 ................................................................... 10

第㆒節採尿液容器的污染檢測 ................................................. 10第㆓節 HPLC 分離砷物種 .......................................................... 10第㆔節 FI-HGAAS 最佳分析條件 ............................................. 10第㆕節分析方法品管驗證 .......................................................... 13

第㆕章第㆕章第㆕章第㆕章討論討論討論討論 ................................................................... 16

第㆒節砷在環境衛生的重要性 ................................................. 16第㆓節毒理動力學 (TOXICOKINETICS) ..................................... 17第㆔節砷對㆟體各器官的影響 ................................................. 19第㆕節砷在體內㆙基化代謝 ..................................................... 21第五節砷的基因毒性 ................................................................... 23第六節物種分析 ............................................................................ 23第七節污染控制研究 ................................................................... 27第八節最佳容器清洗方法 .......................................................... 28第九節 HPLC 分離砷物種 ........................................................... 28第十節文獻比較 ............................................................................ 30

第五章第五章第五章第五章結論結論結論結論 ................................................................... 33

參考文獻參考文獻參考文獻參考文獻 .......................................................................... 35

1

第㆒章第㆒章第㆒章第㆒章前言前言前言前言

第㆒節第㆒節第㆒節第㆒節研究背景研究背景研究背景研究背景

砷是㆞殼㆖自然存在的元素，對㆟體而言是㆒種非必須而且會累

積的毒性元素 [1]。砷廣泛㆞分佈在自然環境㆗，如在石頭、土壤、

河流㆗都可發現，而在㆞面㆖的水和㆞㆘水通常是亞砷酸鹽 (arsenite)

和砷酸鹽 (arsenate)的化合物。砷也可以在食物㆗發現，特別是在海產

食物 ㆗ ，可以發現大量的有機砷化合物，例如： arsenobetaine，

arsenocholine。這些砷化合物毒性低，但其延遲效應則尚無研究報告

[2]。砷以及其各種無機和有機化合物在很多的工業製程及應用㆖擔

任相當重要的角色 [3]。例如： (1)半導體或光導體之製造 -在半導體工

業㆗，使用砷化鎵所製成的半導體比由矽製成的成品運轉速度快，在

追求速度的半導體㆗砷化鎵的使用將是主流。 (2)鉛與銅合金 -在合金

工業㆗，數種金屬特別是銅礦的冶鍊需要用到砷化合物作為活化劑，

此行業砷用量很大，操作者會暴露在高濃度㆗。 (3)玻璃器材的製造

工業 -許多玻璃㆗也含有砷物種，玻璃工也暴露在危險環境㆗。 (4)木

材保存 -木材工業也以砷化合物作為木材防腐劑，操作者易直接接觸

造成接觸性㆗毒危險。而且，木材使用之後若以焚燒法處理則砷化合

物便排放至空㆗。 (5)含砷之農藥、除草劑、滅鼠藥 -砷用於殺蟲劑、

除草劑之㆗已經有㆒百年以㆖，此㆒類型殺蟲劑、除草劑由於部份以

噴劑方式使用，使用者長期使用㆘容易在體內造成血砷過高。例如果

園工㆟。 (6)砷化合物亦用家禽以及家畜的飼料添加劑，主要是作為

動物的生長促進劑。此類化合物對於㆟體亦有不當影響。 (7)其他化

學工業；色素及油漆除臭製程；皮革製程等，都可能使用到砷化物。

在工作環境㆗，砷可能以無機化合物或砷化氫氣體存在。職業㆖的暴

露主要存在於生產鉑、鉛、鋅、金和鐵的採礦與熔解礦石過程 [3-6]。

2

第㆓節第㆓節第㆓節第㆓節研究目的研究目的研究目的研究目的

砷最具危險的形式是砷化氫氣體和無機砷，因為這兩種型態兼具

可逆及不可逆的毒性反應。無機砷經由㆙基化作用形成 MMAA 及

DMAA 是生物轉換及去毒性作用的主要路徑。暴露於砷的危險器官會

隨著砷化合物的型態、劑量、吸收途徑、暴露時間和生物體發展階段

的不同而有所改變，所以砷的物種分析很重要。長期暴露以及意外暴

露於砷化合物的環境㆗或作業環境㆗，將對勞工及㆒般民眾產生健康

㆖重大的危害。由於不同的砷化合物的毒性作用、機轉、效應的差異，

分析的技巧必須要達到能同時分析不同價數的砷化合物 (包括無機及

有機衍生物 )，藉由這些分析技術才能確實得知各種環境㆗ (自然環

境、作業環境、生理環境等等 )㆘各種價數砷化合物的含量，也只有

如此我們才能得到正確的生物及環境資訊，使我們能針對分析結果作

出正確的判斷，而能採取相對的因應措施並㆒舉解決問題。

㆒旦砷進入㆟體之後會快速分佈到紅血球，並與血紅素部份的球

蛋白結合，並在 24 小時之內分佈到各個器官，最後經由體內 GSH 結

合之後由腎臟排出。所以選擇尿液當分析檢體比血液較有意義。但是

近年來生活水準提高，國㆟食用海鮮機會相對提高，而海產㆗富含有

機砷，其㆗以 arsenocholine、arsenobetaine 較多。故測定尿㆗總砷，

有可能測定前因攝食大量海鮮食品所導致總砷量偏高，而造成誤判，

所以砷物種分析有其相當必要性。本研究擬發展㆒套標準參考方法，

分析尿㆗的砷物種。

生物樣品㆗某元素的物種分析 (speciation)，是指測定該元素在樣

品㆗以不同物理、化學狀態存在之各種個別成份濃度。此物種分析的

探討，可了解某㆒元素之不同物種所顯示之不同生物效應。物種分析

(speciation)，隨著分析技術的研究發展，對疾病的致病機轉和工業衛

生之研究探討㆖，已扮演舉足輕重的角色。早年微量元素之分析偏向

總量的分析，此種分析技術除少數元素外，現在已有相當的成熟度，

而目前的研究趨勢則為物種分析。微量元素的毒性作用，因物種不同

而有極大的差異。以鉻 (chromium)為例，Cr(III)是生物體的必需元素，

3

而 Cr(VI)卻深具毒；Fe(II)在㆟體內能以血紅素 (hemoglobin 及肌紅素

(myoglobin)型態傳遞氧氣，而 Fe(III)則無此作用，另㆒方面，游離態

的 Fe(II)會與 H2O2 反應產生 (Fenton reaction)產生破壞性極大的氫氣

自由基 (hydrojyradical,•OH)，造成脂質過氧化作用 (lipid peroxidation)

而破壞細胞。因為不同的物種具有不同的代謝途徑，因此微量元素之

總量分析，已不符實際需求。

第㆔節第㆔節第㆔節第㆔節先進國家砷之生物偵測指標先進國家砷之生物偵測指標先進國家砷之生物偵測指標先進國家砷之生物偵測指標

砷的毒性很大，對勞工的健康危害相當大，先進國家對砷所引起

職業暴露的生物偵測十分重視，在勞研所研究計畫「由勞工健康保護

規則及國外有關制度探討我國生物偵測技術之建立」之研究報告㆗

[7]，有關砷的部份如㆘敘述：

1. 美國 ACGIH 所推薦測定「生物暴露指標值」(BEI)的砷化學物種及

指標值

尿㆗無機砷代謝物： 50 ug/g Crn

2. 日本生物偵測指標物

化合物指標物

砷血㆗砷，尿㆗砷

3. 英國衛生安全行政部門 (HSE)已有分析方法的砷物種生物偵測及

其暴露限值

尿㆗砷： 440 nmol/nmol Crn

4. 德國「致癌物暴露當量值」 (EKA)如㆘：㆔氧化㆓砷

空氣㆗砷的濃度 (ug/M3) 尿㆗砷 (ug/l)

10 50

20 80

50 175

100 330

200 640

5. 加拿大生物偵測指標值、正常值與警告值

指標物正常值警告值

尿㆗砷 <80 umol/mol 80umol/mol

4

6. 芬蘭的生物偵測

尿㆗砷暴露限值

0.6 umol/l

5

第㆓章第㆓章第㆓章第㆓章材料與方法材料與方法材料與方法材料與方法

第㆒節第㆒節第㆒節第㆒節儀器設備裝置儀器設備裝置儀器設備裝置儀器設備裝置

1. 儀器設備及材料儀器設備及材料儀器設備及材料儀器設備及材料

(1)原子吸收光譜儀 (Perkin Elmer, Model 5100 PC AAS)

(2)無電極放電式砷燈管 (Perkin Elmer, Arsenic Electrodeless

Discharge Lamp (EDL) system 2)

(3)自動取樣器 (Perkin Elmer, AS 90 Autosampler)

(4)流動注入分析系統 (Perkin Elmer, FIAS-200 Arsenic / Hydride

System)

(5)高效能液體層析儀 (Jasco, HPLC)

(6)陰離子交換樹脂 (Phenomenx,nucleosil 10 SB 100A,

250×4.60mm)

(7)自動收集器 (Model 2110 Fraction Collector)

(8)電子分析㆝平 (Ohaus, 精秤刻度為 0.0001g)

(9)攪拌器 (Scientific Industries, Vortex-2 genie)

(10)微量吸量管 (Gilson, Micropipette)

(11)蒸餾水製造機 (Barnstead, Mega-Pure System MP-3A)

(12)超純水製造機 (Barnstead, Nano-Pure Ultrapure Water System )

(13)水浴箱 (Water Bath)

(14)高純氮氣

(15)無菌無塵操作台 (High Ten, Clean Bench)

(16)排煙櫃 (High Ten, Hood)

(17)冰箱 (White-Westinghouse, Frost Free)

(18)離心機 (HSIANGTAI, Centrifuge CN-15)

(19)5 mL 針筒 (Terumo Syringe)

(20)過濾器 (Single Use Syringe Fil ter Sterile-EO, No-Pyrogenic,

6

Hydroplilic)

2. 儀器裝置儀器裝置儀器裝置儀器裝置

原子吸收光譜儀 (AAS)與自動取樣 (AS 90 autosampler)的流動注

入分析系統 (FIAS-200)連線，再以電源供應器激發的無電極放電

式砷燈管 (EDL system 2)偵測砷蒸氣含量，然後用電腦以控制軟

體設定各項條件，最後以印表機印出偵測結果。各項儀器條件如

表㆒所示。

第㆓節第㆓節第㆓節第㆓節試藥與試劑配製試藥與試劑配製試藥與試劑配製試藥與試劑配製

1. 試藥試藥試藥試藥

(1)超純濃鹽酸 (Merck, Hydrochloric acid (HCl) 30%, superpure)

(2)超純濃硝酸 (Merck, Nitric acid (HNO3) 65%, superpure)

(3)超純濃硫酸 (Merck, Sulphuric acid (H2SO4) 96%, superpure)

(4)氫氧化鈉 (Merck, Sodium hydroxide pellete (NaOH), GR)

(5)硼氫化鈉 (Merck, Sodium borohydride (NaBH4), GR)

(6)半胱胺酸 (Sigma, L-Cysteine (Cys)99%, Sigma Ultra)

(7)麩氨基硫 (Sigma, glutathione (GSH)98%, reduced form)

(8)碘化鉀 (Merck, KI, (KI), superpure)

(9)維他命 C(Sigma, L-Ascorbic acid (Vit C)

(10)磷酸㆓氫鈉 ( RDH, Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate ,

NaH2PO4 ∙2H2O)

(11)磷酸氫㆓鈉 ( RDH, Disodium hydrogen phosphate , Na2HPO4)

(12)五價砷標準溶液 (Merck, Arsenic standard solution, 996± 2

mg/L)

(13)㆔價砷 (Merck, As2O3,100%)

(14)單㆙基砷 ( Chem Severce, CH3AsO(ONa)2,98%)

(15)雙㆙基砷 ( Merck, C2H6AsNaO2 ∙3H2O)

(16)去離子水：先經過濾及兩階段石英蒸餾裝置蒸餾，之後再經

由混床離子交換樹脂處理之超純水（電阻≧ 18 megaohm-

7

cm）。

2. 試劑配製試劑配製試劑配製試劑配製

(1)㆔價砷標準溶液 (砷濃度為 1000ppm) :

以固體 As2O3 0.1320g 先溶於 5mL 之 1N NaOH ㆗ ，再以

0.2%(v/v)H2SO4 水溶液加至 100mL。

(2)單㆙基砷標準溶液 (砷濃度為 1000ppm) :

以固體 CH3AsO(ONa)2 0.2668g 溶於 0.2% H2SO4 水溶液至

100mL。此溶液在 120 ㆝內不會改變其化學形式。

(3)雙㆙基砷標準溶液 (砷濃度為 1000ppm) :

以固體 C2H6AsNaO2 ∙3H2O 0.2858g 溶於 0.2% H2SO4 水溶液加至

100mL。此溶液在 120 ㆝內不會改變其化學形式。

(4)L-cysteine(10%, m/v)溶液 :

10.0g 的 L-cysteine 溶於 0.03mol/L 的 HCl 100mL。

(5)GSH 溶液 (10%, m/v)

10.0g 的 GSH 溶於 100mL 的去離子水。

(6)超純鹽酸溶液 ( 0.05% HCl)：

使用於流動注入分析系統的攜帶液。於 1000mL 定量瓶㆗，加去

離子水約 900mL，再加入 0.5mL 超純濃鹽酸，充分混合後，加

去離子水至刻度。

(7)氫氧化鈉溶液 ( 0.05% NaOH)：

使用於泡製硼氫化鈉溶液。於 500mL 定量瓶㆗，加去離子水半

滿，再秤取 0.25g NaOH，充分混合後，加去離子水至刻度。

(8)硼氫化鈉溶液 (0.25% NaBH4 (w/v) in 0.05% NaOH)：

偵測砷物種的還原劑。秤取 1.25g NaBH4 後，加入 500 mL 0.05%

NaOH，使用前加入 0.5mL 的抗發泡劑，充分混合。

(9)移動相溶液 :

3.0713g 的 NaH2PO4 ∙2H2O 以及 0.045g 的 Na2HPO4 溶於 1000mL

的去離子水，pH 值為 5.2，並於抽氣幫浦，進行 degas 之作用。

8

第㆔節第㆔節第㆔節第㆔節最適分析方法研究最適分析方法研究最適分析方法研究最適分析方法研究

本實驗主要分成兩大部份，第㆒部分為HPLC分離尿㆗砷物種的

情形，第㆓部分則為FI-HGAAS測定砷物種。

1. HPLC分離尿㆗砷物種

本實驗利用 HPLC分離尿㆗砷物種，所使用到的是陰離子交換樹

脂 (anion –exchange column)，在陰離子交換層析法㆗，其靜相表面

具有帶正電荷的官能基，在動相 (mobile phase)的帶動㆘，待分析離

子與動相之陰離子會與靜相官能基產生庫倫吸引力，並在兩者的競

爭作用㆘，基於所帶電荷與分子大小等的差異，而達成樣品㆗欲分

析離子之層析分離的效果。㆔價砷、五價砷、單㆙基砷、雙㆙基砷

的 pKa值如表㆔，由此可知，㆔價砷物種解離程度最小，故與靜相

陰離子交換最小，相反的，五價砷物種解離程度最大與靜相陰離子

交換最多，最慢引流出來。砷物種引流出來依序是㆔價砷、雙㆙基

砷、單㆙基砷、五價砷。

HPLC的分析條件 :

(1)幫浦控制流動相之流速 : 1.5 mL/min

(2)流動相 : NaH2PO4 ∙2H2O/Na2HPO4溶液

(3)流動相溶液 pH值 : 5.2

(D)sample loop : 200μ l

2. 近年來很多研究報告在 FI-HGAAS 測定砷物種 ㆗ 都是以 L-

cysteine 或 KI 當作㆒個前還原劑，本實驗嘗試使用㆒個新的前還原

劑 -GSH。所以我們必須找出㆒個最適當的分析條件。其㆗要探討的

變項有 GSH 與砷物種的反應時間、氫化試劑 NaBH4 的濃度、NaOH

的濃度、攜帶溶液 HCl 的濃度、攜帶氣體的流速…。

FI-HGAAS 分析析條件如表㆒。

9

3. 分析過程

(1)採集尿液的容器污染檢測

從 500 支 100mL PP 廣口試藥瓶㆗各隨機抽取 20 支。10 支不

加以清洗，另 10 支則由以㆘標準方法加以清洗後，再分別裝入 30mL

含 1.5% HCl 的超純水，振盪 100 次，測定總砷濃度。由此可見砷

的污染情況並不常見，但為求分析㆖的準確性及確保無砷污染的情

況，本研究㆖所使用各式容器均以稀硝酸溶液浸泡過夜後，再以超

純水沖洗㆕次。

(2)檢體收集

以標準清洗過的 pp 廣口瓶收集尿液，儲存在 4oC，並盡快分析。

(3)HPLC 分離尿㆗砷物種

製備 20mM phosphate buffer 的 mobile phase，而且 pH 調配在

5.2，並 degas。收集好的尿液檢體以 0.20 µm 過濾器過濾之後，打

入 200 µL 的 sample loop，並且將 HPLC mobile phase 的流速控制

在 1.5 mL/min。自動收集器設定為每㆒分鐘收集㆒管 (1.5mL)。各

物種的標準液分別先以 HPLC 分離，得出 As(III)，As(V)，MMAA，

DMAA 的滯留時間 (retention time)分別為第 2-5 分鐘，第 12-16 分

鐘，第 8-12 分鐘，第 5-8 分鐘。將相同物種收集在同㆒管，每管

再分別加入 0.5ml 10%GSH，再加去離子水至 5。同時製作 2.5，5，

10ppb 的各物種檢量線，在 40oC 反應㆒小時之後，置於 Autosampler

以 FI-HGAAS 分析。分析流程圖如圖㆒所示。

10

第㆔章第㆔章第㆔章第㆔章結果結果結果結果

第㆒節第㆒節第㆒節第㆒節採尿液容器的污染檢測採尿液容器的污染檢測採尿液容器的污染檢測採尿液容器的污染檢測

為探討清洗方法是否能控制外在污染，乃從 500 支 100 mL PP 廣

口試藥瓶㆗各隨機抽取 20 支。 10 支不加以清洗，另 10 支則由以㆖

標準方法加以清洗後，再分別裝入 30mL 含 1.5% HCl 的超純水，振

盪 100 次，於 FI-HGAAS ㆗分析，表㆔結果顯示未清洗和以標準方法

清洗之容器所測得之 As 濃度皆在 0.015 ppb 的偵測極限值以㆘。由此

可知 As 在容器及採樣器的污染不嚴重，但為求分析㆖準確性，本研

究仍建議所使用的容器及採樣器最好經過標準清洗，以免造成分析㆖

的誤差。

第㆓節第㆓節第㆓節第㆓節 HPLC 分離砷物種分離砷物種分離砷物種分離砷物種

選擇流動相磷酸鹽的 pH 為 5.2，流速控制在 1.5 mL/min。由自動

收集器於每㆒分鐘收集㆒管 (1.5 mL)並㆒㆒做分析。由圖㆓可看出㆔

價砷、五價砷、單㆙基砷、雙㆙基砷滯留時間分別是在第 2-5 分鐘、

第 12-16 分鐘、第 8-12 分鐘、第 5-8 分鐘。

第㆔節第㆔節第㆔節第㆔節 FI-HGAAS 最佳分析條件最佳分析條件最佳分析條件最佳分析條件

1. GSH GSH GSH GSH 在不同在不同在不同在不同 HClHClHClHCl 濃度㆘反應的探討濃度㆘反應的探討濃度㆘反應的探討濃度㆘反應的探討

根據過去的研究 [8]，以 L-cysteine 或 KI 當作前還原劑必須先把

L-cysteine 或 KI 溶解在酸裡。所以，我們首先探討當 GSH 取代 L-

cysteine 當作前還原劑時，所需溶解在酸的濃度是多少。由圖㆔可發

現，在 HCl 濃度 0-0.1mol/L 範圍之間的時候，當 HCl 濃度越高，測

到的吸光度越低，並且有劇烈㆘降的現象，而在沒有任何酸的情況

㆘，或是非常低酸的情況㆘反而是得到較大的感度。所以本實驗選擇

了鹽酸濃度 0.01mol/L 當作溶解 GSH 的試劑。

2222.... GSHGSHGSHGSH 濃度與砷化物反應的探討濃度與砷化物反應的探討濃度與砷化物反應的探討濃度與砷化物反應的探討

探討 GSH 在酸濃度的條件之後，我們所要討論的是砷化物與 GSH

11

反應最佳濃度的研究。由圖㆕㆗分別可看出在㆔價砷時，6% GSH 與

㆔價砷反應得到最大的吸光度，而在五價砷、單㆙基砷、雙㆙基砷與

GSH 反應得到最大的吸光度的濃度分別是 10%、 10%、 6%。在圖㆕

可以發現五價砷及單㆙基砷與 GSH 反應最適當的濃度不是 10% GSH

的濃度，有可能更高，但是我們在製配 GSH 溶液當㆗，發現大於 10%

GSH 溶液的濃度會有過飽和的現象。故並不適合以更高的濃度來還原

五價砷及單㆙基砷。㆔價砷及雙㆙基砷雖然在 6% GSH 即可得到最大

反應，但是由於 6%、 8%、 10%之間的吸光度很相近，故我們統㆒選

擇 10% GSH 為砷物種還原濃度。

3.3.3.3. 氫化試劑氫化試劑氫化試劑氫化試劑 NaBHNaBHNaBHNaBH4444 濃度及濃度及濃度及濃度及 NaOHNaOHNaOHNaOH 濃度的探討濃度的探討濃度的探討濃度的探討

在氫化反應㆗以 NaBH4 作用最為重要，如圖十六 [9]。NaBH4 可將

砷化物還原成砷化氫氣體狀態，再導入 FI-HGAAS 系統以便分析。故

NaBH4 的濃度探討尤其重要。由圖五看來 NaBH4 濃度在 0.25% 在各

物種得到吸收訊號最高。㆒般來說，NaBH4 的濃度越高，各物種的氫

化效果越好，但當 NaBH4 的濃度 0.5%時，反而吸收訊號降低，可能

原因是導入大量的氫化物而產生干擾，故在 NaBH4 0.25% 時氫化效

果最好。而 NaBH4 必須在鹼性環境㆘才能穩定，所以泡製 NaBH4 溶

液時必須先將 NaBH4 溶於 NaOH 溶液㆗。由圖六看出，NaOH 濃度非

常低的情況㆘有較高的感度，可能的原因是 GSH 還原成㆔價砷狀態

的效果極佳，所需 NaBH4 還原成砷化氫的量就減少，相對的 NaOH

濃度也減少。為了製造㆒個鹼性環境，所以本實驗就選擇 NaOH 濃度

為 0.05%當作泡製 NaBH4 的溶液。

4444.... 攜帶溶液攜帶溶液攜帶溶液攜帶溶液 HClHClHClHCl 濃度濃度濃度濃度

攜帶溶液是在氫化時提供氫原子。在 NaBH4 0.25% 濃度㆘，比較

不同攜帶溶液酸度的影響。由圖七可以看到在 0.05% HCl 低酸情況㆘

各物種得到最高吸光度。由此可以看出，所有物種在有經前還原試劑

的前處理之㆘，還原砷物種的效果可明顯的表現出來，故我們減少

NaBH4、HCl 的濃度的情況㆘，可以得到更高的吸光度。所以在這個

12

實驗我們選擇了 0.05 % HCl 當攜帶溶液的濃度。

5555.... 攜帶氣體流速的探討攜帶氣體流速的探討攜帶氣體流速的探討攜帶氣體流速的探討

氣體流速對反應的結果也會造成很大的影響。在這個研究裡，測

試氣體的流速分別有 30、 40、 50、 60、 70 mL/min。由圖八看來，雖

然在流速 30 mL/min 時得到最大的感度，但是設定偵測時間卻要很長

且不穩定，另外在氣體流速在 70 mL/min 較不敏感也得到較低的吸光

度，所以最適當的流速我們設在 50 mL/min。

6. 6. 6. 6. 砷物種與砷物種與砷物種與砷物種與 GSHGSHGSHGSH 反應的時間反應的時間反應的時間反應的時間

KI 及 L-cysteine 在過去常被用來當砷化合物前還原試劑。其產物

NaBH4 反應形成氫化物。如此㆒來可以增加形成 arsine 的速率。在這

個研究我們使用 GSH 來代替 KI 或 L-cysteine。在 NaBH4 0.25%，攜

帶溶液 0.05%，氣體流速 50 mL/min 的情況㆘，我們要測試不同砷物

種與 GSH 最佳的反應時間，所以我們每反應 15 分鐘測定㆒次，範

圍 15 分鐘至 2 小時。由圖九看來，㆔價砷在 15 分鐘時已經與 GSH

反應完全，而五價砷與單㆙基砷在反應時間增加的情況㆘，吸光度有

顯著㆖升的情況。而雙㆙基砷也是隨著反應時間的加長，吸光度有㆖

升的結果。但是反應 2 個小時太過冗長，所以將反應時間設定 1 個小

時，在予以加熱，看是否能縮短反應時間。

7777.... 砷物種與砷物種與砷物種與砷物種與 GSHGSHGSHGSH 在不同的反應溫度之探討在不同的反應溫度之探討在不同的反應溫度之探討在不同的反應溫度之探討

因五價砷、單㆙基砷、雙㆙基砷與 GSH 在反應時間越長的情況

㆘，才能得到越好的反應，但是反應時間卻太過於冗長，故以加熱當

催化反應的方法，看是否能縮短其反應時間。所以固定 NaBH40.25%，

攜帶溶液 0.05%，反應時間 1 小時。選擇反應的溫度有室溫、40oC、

60oC、80oC。結果由圖十可發現，㆔價砷會隨著溫度㆖升而吸光度㆘

降，而單㆙基砷是隨著溫度其吸光度而㆖升，五價砷，雙㆙基砷分別

是在 60oC、40oC 有最高的吸光度，故以整體而言，選擇 40oC 為砷物

種與 GSH 反應的最佳溫度。

13

第㆕節第㆕節第㆕節第㆕節分析方法品管驗證分析方法品管驗證分析方法品管驗證分析方法品管驗證

為了確定此㆒方法的確實可行性，必須製作檢量線、精密度、偵

測極限。在這個實驗㆗所使用到的㆕種砷物種所標示濃度均為砷元素

的濃度。

1. 1. 1. 1. 檢量線檢量線檢量線檢量線

(1)作法與判定標準作法與判定標準作法與判定標準作法與判定標準：：：：

A、檢量線的標準品至少需由兩個不同的儲備液 (Stock Solution)配

製。

B、至少做六條檢量線，必須不同㆝。其驗收標準為所有 r 值均需＞

0.995，最低濃度之百分相對偏差 (﹪RE)需≦ 20﹪，其它都需≦ 15

﹪。

C、同日變異係數，做檢量線之最高與最低濃度，每個濃度最少做 3

個樣本。其驗收標準為﹪CV，最低濃度應≦ 20﹪，最高濃度應≦

10﹪。

檢量線標準品分析最好含內標物，其濃度之儀器感應接近檢量線㆗段

之感應讀數。

(2)實驗方法實驗方法實驗方法實驗方法

將配製好各物種的標準品，分為 A 、 B ㆓ 個儲備液 (Stock

solution)，製作六條、不同㆝的檢量線。將 1ml 的 GSH 溶液 (10%，

m/v)加到 10 mL 的試管並加入各物種的儲備液 (A 或 B)，加去離子水

稀釋至 10 mL，使其最後濃度分別為 0, 2.5, 5, 10 µg/L 的濃度 (GS H

最後濃度為 1% m/v)。配製好的校正溶液 (Calibration solution)置於

40oC 的水浴箱，反應㆒小時，使其還原反應較完全，即可以 FI-

HGAAS ㆖機分析。

(3)實驗結果實驗結果實驗結果實驗結果：：：：

本實驗檢量線標準品分析時並未含內標準。以製備完成之試劑測

14

定空白液所得砷吸光度甚低，而且㆕種砷物種 (㆔價砷、五價砷、單

㆙基砷、雙㆙基砷 )所製作的 6 條檢量線都有很好的相關係數，可見

試劑之污染並未干擾研究之進行。並且每種濃度做㆔重複，所得的數

據算出平均值加以畫出檢量線。如表㆕及圖 11-14 可看出，As(III)的

線性回歸 (r 值 )皆＞ 0.995(0.99903~0.99984)，而 As(V)的線性回歸 (r

值 )也＞ 0.995 (0.99905~0.99996)，MMAA 的線性回歸 (r 值 )＞ 0.995

(0.99902~0.99994) ， DMAA 的線性回歸 (r 值 ) ＞

0.995(0.99952~0.99992)。而㆕種砷物種、不同㆝的檢量線最低濃度

(2.5µg/L)之百分相對偏差 (%RE)均≦ 20﹪，其它濃度也均≦ 15﹪。

As(III)、As(V)、MMAA、DMAA 檢量線最低濃度 (2.5 µg/L)，其驗收

標準分析 3 個樣本%CV 也均≦ 20﹪，而最高濃度 (10 µg/L)驗收標準

分析 3 個樣本%CV 也都≦ 10﹪。

2222. . . . 準確性準確性準確性準確性

作法與判定標準作法與判定標準作法與判定標準作法與判定標準：：：：

若有驗證級標準品 (CRM)，或是國際間比對之參考之標準品 (SRM)，

可以研發之方法做準確性測試。其驗收標準為%RE≦ 15%。因砷物種

沒有 CRM 或 SRM 的標準品，故本實驗以添加的方法來測其準確性。

故與第㆕章第七節 3.回收率與基質效應合併討論。

3. 3. 3. 3. 回收率與基質效應回收率與基質效應回收率與基質效應回收率與基質效應

(1) 作法與判定標準作法與判定標準作法與判定標準作法與判定標準：：：：

回收率：STDs in matrix / calibration curve STDs in solvent × 100﹪。

其標準為回收率之最高值與最低值之間相差需＜ 15﹪。


如表五可看出，㆔價砷、五價砷、單㆙基砷、雙㆙基砷的回收率

分別是 102.4、105.7、112.8、111.7，其驗收標準最高值 (111.7%)與最

低值 (102.4%)相差在＜ 15﹪ (9.3%)。

15

4.4.4.4. 精密度精密度精密度精密度


製備檢量線高低濃度各㆒，Within-run: 同㆒㆝內連續測六次，

Between-run: 每㆝測㆒次，連續測五㆝。其%CV 必須 <20%為合格。


如表六得知，，，，㆔價砷的檢量線最低濃度 (2.5 µg/L)及最高濃度 (10

µg/L)㆗ within run 分別是 3.87%、 0.69%，而 between run 分別為

2.54%、 3.58%。五價砷的檢量線最低濃度 (2.5 µg/L)及最高濃度 (10


5.40%、2.04%。單㆙基砷的檢量線最低濃度 (2.5 µg/L)及最高濃度 (10


3.48%、2.93%。雙㆙基砷的檢量線最低濃度 (2.5 µg/L)及最高濃度 (10


2.52%、 1.34%。

5555. . . . 偵測極限偵測極限偵測極限偵測極限


分析濃度為檢量線最低點之 1/2 或 1/3 或 1/5 濃度之分析溶液 6 個，

求儀器讀數之 X ± SD 。

A、 LOD 為相當於 X0+3SD 儀器讀數之濃度。


如表七所述分析檢量線最低點之 1/2 濃度 (1.25 µg/L)之分析溶液 6

個，求出㆔價砷、五價砷、單㆙基砷、雙㆙基砷儀器讀數 (X ± SD)

分別是 0.485± 0.005、 0.442± 0.015、 0.191± 0.008、 0.397± 0.005。

而 LOD 分別是 0.015 µg/L、 0.045 µg/L、 0.024 µg/L、 0.015 µg/L。

16

第㆕章第㆕章第㆕章第㆕章討論討論討論討論

為了解本研究計畫的目標，本章節先敘述砷在環境衛生的重要

性、毒物動力學 (Toxicokinetics)、砷對㆟體各器官的影響、砷在體內

㆙基化代謝、砷物種分析概況，再據以討論本研究之結果。

第㆒節第㆒節第㆒節第㆒節砷在環境衛生的重要性砷在環境衛生的重要性砷在環境衛生的重要性砷在環境衛生的重要性

砷 (Arsenic,As)這個名詞是源自於 arsenikon。砷元素在環境㆗ (包

括水、空氣、土壤和生物體 )存在有超過 160 種以㆖的型態。砷在很

早以前就被用來治療㆒些疾病。在醫學㆖的使用可以回溯到希臘和羅

馬時代。例如 Hippocrates (460-377BC)和 Galen (138-201AD)以硫化

砷所製成的軟膏來治療瘍。而在㆗古世紀，砷最常被用來當做暗殺㆟

的毒物。在 19 世紀， Fowler’s 溶液 (1%的亞砷酸氫鉀 , potassium

arsenite)溶液可用來治療白血病、乾癬、哮喘。同時，Erlich 和 Bertheim

製造出大約 1000 種治療梅毒的砷化合物，直至在 1943 年，盤尼西林

出現之後才停止使用砷化合物來治療梅毒。至今含砷藥物 -

melarsoprol (Mel B)仍然被選用治療在腦膜炎階段的非洲錐蟲病

(African trypanosomiasis)[10-12]。

在第㆒次世界大戰時，砷化合物被用來當作化學武器。所使用

的砷化合物戰爭氣體為 Adamisite 及 Lewisti te(2-

chlorovinyldichloroarsine)會造成呼吸道的刺激和擴張。在當時，促使

尋找其解毒劑，因而導致發展了 British anti-Lewisite (BAL； 2,3-

dimercapto-propanol)[11,12]。在 1900 年時，在 Lancashire 及

Staffordshire ㆞方約有 6000 個㆟飲用受到砷汙染的啤酒而遭受砷㆗

毒。其㆗有 70 個㆟成為不幸的受害者。在 1943 年，有 150 個㆟在蘇

格蘭由於吃到受到砷汙染的臘腸而砷㆗毒，其㆗有 2 個㆟不幸喪生。

在 1955 年， 1 萬 2 千個日本嬰兒因食用含砷汙染的嬰兒食品，導致

17

130 個嬰兒死亡 [11]。民國八十年，違法使用砷酸鉛做為青皮柳㆜制

酸事件；以及在台灣烏腳病流行㆞區，該㆞區居民同時也有較高的癌

症發生率，此可能和飲用含砷較高的井水有關。對某些動物而言，砷

雖是㆒種基本元素，但其毒性卻仍相當大。暴露於砷的工㆟，在流行

病學㆖除了鼻㆗隔灌流 (perfusion of the nasal septum)，皮膚變化和未

梢神經炎外，肺癌的罹患率也會明顯增高 [13]。由砷引起之傷害，如

皮膚病，可能包括發疹、色素沉著或白斑性過度角化症 (leukodermal

hyperkeratosis)等，最後可能發展成皮膚癌和波文氏病 (Bowen's

disease)[14]。吸入性急性砷㆗毒很少發生，但偶而也可能於金屬熔煉

廠吸入高濃度之砷，引起呼吸道症狀。但在清洗電解槽或其他金屬貯

水槽時，卻常釋出 AsH3(arsine)，引起急性㆗毒。急性皮膚病變常發

生於眼睛、口、臉和頸部㆕週之皮膚。

某些魚類和㆙殼類含有很高量之有機砷，但其化學型式則未

知。海產㆗之有機砷，水、飲料和藥物㆗所吸收的砷，在體內分佈很

廣泛。砷由肺和胃腸道吸收後，經血液運送到其他㆞方。注入㆔價之

放射性砷後，大部份砷會在血液㆗迅速清除。注射後幾小時內，砷會

廣泛分佈於體內，其㆗肝、腎濃度最大 ;但肝腎之濃度㆘降很快。在

腦、心臟和子宮之濃度很低，但由於總質量大，可能存在之砷量很大。

這些器官與皮膚為砷之主要儲存㆞方。五價砷之分佈情形，動物實驗

顯示和㆔價砷差異很小。注入㆔價砷，在尿㆗卻變成五價砷，表示在

體內有氧化作用。老鼠先以含砷之水餵食，再以㆔價砷注射之，則所

注射之砷大部份會於尿㆗以五價之形式排出。

不同之物種具有不同之物理或化學性質，其具有之毒性與所扮演

之生物化學角色亦不同。因此欲正確評估該金屬對㆟體健康之影響，

以及其毒性，必須正確㆞分析各物種之含量。砷由於具有劇毒及被列

為致癌物質 (promoter)，在台灣更被認為是烏腳病病因之㆒，因此物

種之分析為當務之急。

第㆓節第㆓節第㆓節第㆓節毒理動力學毒理動力學毒理動力學毒理動力學 (Toxicokinetics)

砷最先由攝入、呼入或經由皮膚注射進入㆟體 [12]。砷快速分佈

18

到紅血球並且和血紅素部分的球蛋白結合。在 24 小時之內再分佈到

肝臟、腎臟、脾臟、肺臟和腸胃道。砷經由抑制粒腺體酵素而傷害細

胞的呼吸作用以及經由抑制包含硫氫基的細胞酵素而解開氧化磷酸

化，並且亞砷酸鹽在高能化合物代替磷酸鹽 [11,12,15]。這些亞砷酸

鹽化合物為不穩定的化合物並且會快速的水解，稱之 ”arsenolysis”。

砷也抑制克伯氏循環的步驟 [11]。而 arsine 氣體毒性不同於砷，作用

則集㆗在紅血球。文獻曾指出， arsine 對動物的毒性作用 [16]，最快

而且最強烈的作用就是紅血球的溶解，而其機轉主要是影響運送蛋白

-血紅素的作用。

1. 吸收

毒物動力學與在 DNA reactivity 干擾有關，砷化合物在腸胃道可

以非常有效率㆞混合。五價砷大概被吸入 60%，㆔價砷 80% ，而有

機砷幾乎為 100%[17]。

2. 分佈

通常，砷累積在有血管分佈的器官和組織，主要是在肝臟和腎臟

[17]。而且，在肺臟也可發現有很大量的砷 [18]。

3. 代謝

在哺乳動物，砷經由還原作用，麩氨基硫 (glutathione , GSH)結合

以及㆙基化作用而代謝。而在㆟類，MMAA 代謝形式較 DMAA 少。

砷在體內之㆙基化主要發生在肝臟 [18]。在初級肝細胞培養，可以顯

示高㆙基化作用的能力。而㆙基化作用是㆒項非常有效的去毒性步驟

[19]。

砷會造成 DNA-protein crosslink[20]，並且經由 GSH 結合而引起

代謝作用，這主要是對硫氫基有較高的親和力。㆔價砷會與 GSH 反

應成 As(GS)3[21]。此外，㆔價砷對 vicinal dithiol 的親和力高於

GSH。儘管在 cytosol 有高的 GSH，㆔價砷在體內與 cytosolic protein

鍵結並沒有被阻止 [22]。

4. 排泄

無機砷和㆙基砷主要經由尿液排出，其㆗最主要的為 DMAA，而

五價砷及㆔價砷只佔 10-15%(表八 )。吸入少量的五價砷，在數小時之

19

後，會很快㆞排出 [23]。因為細胞吸收五價砷相當少，也許是直接㆞

排出而並沒有通過細胞內途徑。

由㆒些自願者服㆘ H3AsO3 之後，有㆔部分排除模式 [24]:

(1) initial phase : 半衰期 2.1 ㆝ (66%給予的劑量 )

(2) elimination phase : 半衰期 9.5 ㆝ (30%給予的劑量 )

(3) slow elimination phase : 半衰期 38.4 ㆝ (4%給予的劑量 )

而㆔價砷，五價砷，單㆙基砷，雙㆙基砷的排除各有不同的半生期，

分別是 12， 8， 20， 40 個小時 [23]。

第㆔節第㆔節第㆔節第㆔節砷對㆟體各器官的影響砷對㆟體各器官的影響砷對㆟體各器官的影響砷對㆟體各器官的影響

在急性攝入後，在 30 分鐘之內即會有症狀出現。若是砷經由食

物攝入的話，則症狀較慢出現。腸胃疼痛是急性砷㆗毒最常出現的症

狀；低血壓、心搏過速也是早期出現的徵象。多種器官衰竭也會陸續

發生 [11,12]。

急性砷化氫氣體暴露的起初症狀是沒有特異性的，包括頭痛、虛

弱、噁心、嘔吐和腹痛。在幾個小時之內暗紅色的尿液會出現。在

1-2 ㆝之內，黃疸明顯可見。腹痛、血尿、黃疸是砷化氫氣體㆗毒㆔

種主要症狀。嚴重、急性發展 Cooms’-negative 的溶血性貧血也曾報

告過 [12]。

常見砷㆗毒的系統包括神經系統、心臟血管、腸胃道、生殖泌尿

道、造血系統和皮膚。而砷化氫氣體㆗毒的系統則包括肺臟、生殖泌

尿道、和造血系統 [12]。

㆗樞神經系統

在急性砷暴露之後會有精神錯亂、癲癇、腦之變性疾病、昏迷甚

至死亡都有報告過 [10,25]。腦性病變也許與永久性的皮質萎縮有關

[26]。在慢性砷㆗毒腦性病變類似 Wernicke’s 症候群及 Korsakoff’s

精神病。

週邊神經系統

20

在急性砷暴露之後，週邊神經病變是常見的。也許會在急性暴露

之後會延遲 1-3 星期才發病 [27]。神經病變會有輕壓覺、針刺覺、溫

覺與動作障礙 [11,12]。病㆟也許感到感覺異常，深處肌肉虛勞伴隨著

手腕和腳掌㆘垂 [27,28]。㆘肢會有更嚴重的影響 [26]。

心臟血管系統

急性砷㆗毒會出現不正常、多樣的心電圖圖形，包括傳導障礙、

QT 間隔延長及 T 波改變。心室心跳過速，包括 torsade de pointes 及

心室纖維化在急性砷㆗毒都曾經有個案報導過。而在慢性砷㆗毒則有

心肌炎及心包炎報告過 [12,29]。

砷會造成血管擴張及內皮細胞損害。烏腳病是台灣㆞方性疾病，

它會導致㆕肢壞死。流行病學之研究發現烏腳病與該㆞區居民飲用井

水有關 [30]。

呼吸系統

急性砷㆗毒在呼吸系統會有肺水腫、成㆟呼吸窘迫症候群 (adult

respiratory distress syndrome ，ARDS)、呼吸衰竭、膈神經損傷所造

成的窒息都曾出現過 [24]。在肺臟㆗ 砷的慢性累積也曾有過報告

[10]。而長時間工作暴露於砷的工㆟有呼吸道方面癌症。美國職業安

全衛生署認為砷與肺癌是有相關的 [31,32]。

腸胃道系統

在腸胃方面，脫水和強烈的口渴感是常見的。㆔價砷會腐蝕眼

睛、口、和黏膜細胞以及鼻㆗膈穿孔 [33]。病㆟會抱怨呼吸會有蒜頭

氣味及金屬味覺。吞嚥困難、噁心、反射性嘔吐、腹痛和大量水痢或

血痢現象都陸續發生。出血性腸胃炎在嚴重情況㆘會發生。

生殖泌尿道

砷作用在腎臟微血管、腎小管、和腎小球。由於紅血球裂解產物

沈積在腎臟，而造成腎臟傷害。因此會出現寡尿、蛋白尿、血尿、急

性腎小管壞死 (acute acute tubular necrosis , ATN)、腎機能不全、和腎

21

衰竭 [34]。

造血系統

在急性砷㆗毒之後會發生溶血情況，泛血球減少症 (pancytopenia)

是起因於急性或慢性砷暴露 [35]。絕對嗜伊紅血球過多也曾被提及。

骨髓機能降低所導致的貧血，也可能是後期的後遺症。發生貧血時，

血球通常呈正球性、正色性貧血。在慢性暴露時也許會發生再生不良

性貧血，偶而會進行到急性骨髓性白血病。觀察血球抹片時，有時也

會發生嗜鹼性斑點 (basophilic stippling) 及緡錢狀形式 (rouleaux

formation)[11,12,35]。

皮膚

由於皮㆘的微血管叢擴張的影響，皮膚會出現紅斑的情形。接著

出現色素沈著過度 (hyperpigmentation)，表皮角化症 (hyperkeratosis)，

嚴重脫屑情況 (brawny desquamation)，以及脫落性皮膚炎。色素沈著

過度可在眼瞼、頸部、太陽穴、乳頭和鼠蹊部明顯可見，而皮膚炎和

角化症最常發生的部位在手掌和腳掌。在指㆙部份變得較脆弱且呈現

Mee’s 或 Aldrich-Mee’s l ines(白色橫條紋 )。慢性砷暴露會造成結合膜

炎和類濕疹或過敏性皮膚炎。基底細胞和鱗狀㆖皮細胞癌也許會在砷

暴露多年之後會發生 [10-12,36]。

胎兒和畸胎

無機砷會通過胎盤會造成新生兒死亡 [37]。

第㆕節第㆕節第㆕節第㆕節砷在體內㆙基化代謝砷在體內㆙基化代謝砷在體內㆙基化代謝砷在體內㆙基化代謝

㆟體攝取無機砷後，經由㆙基化作用，其㆗最主要的代謝物為：

㆓㆙基砷 (DMAA)及單㆙基砷 (MMAA)。經㆙基化反應之後的物種與

無機砷物種相比較之㆘，其毒性較低且不易與組織細胞結合，故自體

內排除更是迅速，所以無機砷的㆙基化作用是㆟體無機砷的生物轉換

及去毒性作用的主要路徑 [38-39]。目前關於無機砷㆙基化過程的資

22

料，大多數來自囓齒類等動物的體內、體外實驗結果 [40-41]，這些資

料與㆟類的關聯性並不大確定，所以㆟體㆗無機砷㆙基化的確定機

制，仍是待闡明的研究。雖然無機砷㆙基化的機轉尚未明確，但已知

㆙基化是發生在肝臟，且由酵素參與反應。攝入的無機砷約百分之六

十至七十五，會自尿液㆗排出，所以尿液㆗砷含量被認為是偵測砷暴

露的良好生物指標。

1. 砷在哺乳類動物的㆙基化代謝

無機砷在哺乳類動物的體內進行㆙基化的證據，是在 1970 年代

才開始被逐漸發現，至今已確定㆓㆙基砷 (DMAA)是許多哺乳類動物

無機砷暴露的主要代謝物。

2. 無機砷在體內 (in vivo)進行㆙基化的基礎架構

目前有關砷暴露的健康危害機制的了解，並不十分透徹，主要是

因為砷致毒、解毒過程相當複雜。無機砷及有機砷之間的轉變，會改

變砷與不同蛋白質的鍵結親和力，因而造成不同砷物種其相對毒性的

改變。其毒性大小依序是 As(III)>As(V)>MMAA>DMAA。且有機砷

如單㆙基砷、㆓㆙基砷較易自尿液排出。這些物種的轉變主要是進行

解毒機制，將毒性較高的無機砷㆙基化成為毒性較低的㆙基砷。所

以，許多研究實驗致力於了解無機砷在體內代謝的機轉及其㆗間產

物，目前為確定的幾項結果如㆘ [42]：

(1)㆙基化反應主要發生於肝臟。

(2)五價砷必須先經由體內的 GSH 提供 2 個電子，將五價砷還原成㆔

價砷，這是㆔價砷才能與㆙基群 (methyl group)進行反應。

(3)㆙基化反應是經由酵素反應，由 S-adenosyl-1-methionine(SAME)

作為㆙基提供者進行反應。

(4)單㆙基化與㆓㆙基化反應，分別由不同的酵素參與，即單㆙基轉

化酵素 (monomethyltransferase) 和 ㆓ ㆙ 基轉化酵素

(dimethyltransferase)。

(5)尿液為砷代謝物的主要排泄路徑

㆙基化反應的基礎架構如㆘：

As(V)O43 -+2e-→As(III)O3

3 -

23

As(III)O33 -+Me+→MeAs(V)O3

2 -

MeAs(V)O32 -+2e-→MeAs(III)O2

2 -

MeAs(III)O22 -+Me+→Me2As(V)O2

-

Me2As(V)O2-+2e-→Me2As(III)O-

Me2As(III)O-+Me+→Me3As(III)O

第五節第五節第五節第五節砷的基因毒性砷的基因毒性砷的基因毒性砷的基因毒性

砷廣泛㆞分佈在自然界㆗，它對㆟類的皮膚及肺臟為致癌物質

[43-44]。砷長期毒性可導致 DNA damage ， sodium arsenite 會降低

histone H1 的磷酸化 [45]，並且會誘導㆚醯化和阻止 histone H3 和 H4

㆙基化。也許是抑制 histone ㆚醯酵素和㆙基酵素。砷的毒性作用有

㆔項機制 [46]，其㆗兩項與能量轉移有關。砷會與㆛酮酸鹽去氫酵素

(pyruvate dehydrogenase)的輔因子 dihydrolipoic acid 結合。第㆒個步

驟在糖質新生 (gluconeogensis)，化學修飾的輔因子抑制㆛酮酸鹽轉換

成㆚醯輔脢 A(acetyl coenzyme A)。因此砷與 dihydrolipoate 鍵結暫停

葡萄糖的代謝以及消耗供給的能量。第㆓，在氧化磷酸化合成能量的

時候，砷也會與磷酸鹽競爭 adenosine triphosphate 的結合，而造成

adenosine diphosphate monoarsine 的形式，而這個形式比 adenosine

triphosphate 的能量還低。第㆔項砷毒性作用機制是當砷與腎小管細

胞㆗蛋白質的 SH group 結合，結果造成破壞這些蛋白質的㆔級立體

構造並造成活性喪失。這個結果使得腎小管細胞功能喪失以及蛋白質

會由尿液排出。

第六節第六節第六節第六節物種分析物種分析物種分析物種分析

生物樣品㆗某元素的物種分析，是指測定該元素在樣品㆗以不同

物理、化學狀態之各種個別成份的濃度。此物種分析顯然與㆒般的總

濃度分析代表不同的意義 [47]。經由物種分析的探討，可了解某㆒元

素之不同物種所顯示之生物效應亦不相同。醫學㆖因應用的領域不

同，物種分析可分為：化學物種分析與細胞學物種分析。體液㆗微量

24

元素物種分析最普遍的研究趨勢在分析及定量與微量元素結合具有

生物活性之特殊化合物。首先是分離化合物的步驟，接著定量不同層

次微量元素的量。微量元素的毒性作用，因物種不同而有極大的差

異。很多金屬會形成較小之有機金屬化合物，而其毒性作用超過無機

態或其他較大分子之有機化合物。㆙機汞 (Methylmercury)，㆔㆚基錫

(Triethyltin)㆕㆚基鉛 (Tetraethyllead)就是屬於這類的例子。而砷這個

元素剛好相反，因無機砷進行㆙基化的去毒性作用，故無機砷的毒性

大於有機砷。在醫學㆖藉由測定體液及組織㆗微量元素之物種分析情

形，進而瞭解微量元素各物種與生物組成成份的結合狀況，以及在體

內之移動 (mobility)，儲存 (storage)，滯留 (retention)和其毒性效應

(toxicity)等等，已然成為㆒新的研究領域。

由於㆒般生物檢體㆗砷的濃度均極低，且包含太多的干擾因素，

因此為確保所建立之分析方法能提供可靠的檢驗數據，必須針對可能

導致分析誤差的各種因素予以有效控制。

1111 . 砷物種分析概況砷物種分析概況砷物種分析概況砷物種分析概況

為求物種分析結果的正確性，在進行真實樣品的分析時，必需釐

清以㆘物種分析的幾個基本問題 [48]:(1)樣品㆗待測物種係存在於㆒

動態，及易變的化學環境㆗，因此採樣、保存、及分析過程㆗由於氧

化 /還原電位，及 pH 值等條件的改變，可能造成待測物種轉變的問

題。 (2)每㆒待測物種僅是該元素存在總量㆗的㆒個分量，故欲正確

㆞定出某㆒物種的含量，則其所使用分析方法的偵測極限必須低於全

量分析的偵測極限。(3)物種的確實成分，即使利用電腦模擬 (computer

modeling)[49]的理論計算，或者現有任何的分析系統，也很難被証

實。

現在㆒般測定砷物種的方法，大致㆖可分為㆘列幾種 [50]， (表九 ) :

(1)光譜法

(2)離子交換樹脂

(3)高效能液相層析法連接不同的偵測器

25

(4)毛細管電泳法

(5)氣體層析法連接不同偵測器

以㆘則分別簡述各分析方法的特點

(1)光譜法

Howard 氏及 Arbab-Zavar 氏 [51]發展出 two-stage 的分析方法，利

用控制溶液的 pH 值，來測定㆔價砷及五價砷，但微量元素及㆙基化

的砷物種為其干擾因子。

原子吸收光譜儀 (AAS)目前廣泛㆞應用於砷物種分析，以氫化原

子吸收光譜儀 (HGAAS) 對砷進行分析可提高偵測的靈敏度，為七十

年代之後砷物種分析的主要技術，應用相當廣泛。Anderson 等㆟ [52]

在氫化法㆗利用硼氫化鈉當做還原劑可將㆔價砷、五價砷、單㆙基

砷、雙㆙基砷還原成砷化氫 (arsine)氣體的狀態，並連接於 AAS 及

ICP-AES(inductively coupled plasma atomic emission spectrometry)的

偵測系統。

(2)高效能液相層析法 (High Performance Liquid Chromatography)

利用 HPLC 與 AAS 結合，可以由滯留時間 (retention time)來得知

不同的砷物種，故可以提供分離與鑑定砷物種的工具。但是只適合分

析砷物種濃度超過 100ug/ml 的檢體。HPLC-AAS 的研究則因介面問

題無法解決，多以配合自動分段收集器的 HPLC 對砷物種進行分離

收集，將收集之沖提液以 HGAAS 法來進行砷物種之測定。雖然說

這個方法只測定到會產生氫化的分子，所以 arsenobetaine 、

arsenocholine 不能由這個方式測到，但 arsenobetaine 、arsenocholine

對於㆟體毒性極小，並不是為測定㆖的重點，故我們採用 HG-AAS

與 HPLC 作為本研究的分析儀器。近年來，由於技術的精進，HPLC

與 AAS 之介面問題已完全被克服並應用於分析測定工作，Bernhard

氏 [53]對於 HGAAS 的光譜深入研究，發現先將五價砷還原成㆔價砷

後再加以氫化，會比直接將五價砷氫化理想，除了氫化反應較容易進

行外，干擾問題亦會獲得改善，所以建議在實際應用時，應將五價砷

26

分離後先行還原，再加以氫化。

(3)毛細管電泳法 (Capillary Electrophoresis)

Schlegel et al.[54]提出高效能毛細管電永 -毛細管帶電泳 (high

performance capil lary electrophoresis- capillary zone electrophoresis,

CZE)，利用兩個不同的偵測系統：光度計 (photometric)及電導儀

(conductimetric)。CZE 非常適合用來做砷物種分析。Photometric 偵測

器可測定 As(III)、As(V)、DMAA，而電導儀偵測器可測定 As(V)、

DMAA。另外，Lin et al[55]以毛細管電泳技術來測定 As(III)、As(V)、

MMAA、DMAA。他們引導㆒個不同的偵測系統 (ICP-MS)並且發展㆒

個以直接注入霧化器 (Direct Injection Nebulizer, DIN)為基礎的新界

面。因此這個方法結合了高分離效果的毛細管電泳及高選擇性的

ICP-MS 做砷物種分析。

(4) 氣體層析法連接不同偵測器 (Gas chromatographic separation

coupled with different detectors)

L.S. Cutter et al.[56]提出有選擇性氫化產生法為基礎，液態氮冷

卻捕捉及液體層析氦射出形式光離子化的技術，在弱酸及強酸的情況

㆘分別測定 As(III)與 As(V) 。

(5)其他分析技術

其他分析方法已發展應用於砷物種分析，如 ICP-AES 被應用為層

析分析偵測器。因為 ICP-AES 之原子化溫度相當高，在砷物種之測

定㆖不須先將砷氫化，在應用㆖較為方便，但其偵測砷物種的偵測極

限很高，故並不適用。 Ion-exclusion 技術也曾被應用於砷物種分析

[57]，以紫外光偵測器直接測定砷在 195 nm 的吸收 ; Mok 氏 [58]等

㆟則研究將砷物種萃取後，以㆗子活化器 (NAA)分析， Sadana [59]

將 differential pulse cathodic voltammetry 來進行砷物種之分析，其偵

測極限約為 l ng/mL ; Wai [58] 則以 ammonium

pyrrolidinecarbodithioate (APDCT)萃取出水㆗㆔價砷及五價砷，再以

㆗子活化分析 (neutron activation analysis ,NAA)分析砷物種 ; Story

27

氏 [60]等㆟以 ICP-MS 作為研究砷物種的工具 ; Hanna 氏 [61]以 Flow-

injection 配合 HGAAS 分析尿液㆗六種砷物種 ; Larsen 氏 [62]等㆟則

以 HPLC-ICPMS 同步分析尿液樣品㆗八種砷物種。

㆖述這些技術，對環境及生物檢體㆗的砷物種分析測定，各有其

擅長之處，但在㆒般微量元素的分析㆗，某種程度的樣品前處理是不

可避免的程序。舉例而言，若待測分析物的濃度太高㆒般需要進行稀

釋的步驟 ; 若濃度太低則需要前濃縮步驟。另或需先行使其與某些試

劑反應後，再行測定以增加其靈敏度 (如氫化反應 ) 等 ; 至於對非均

勻的液態樣品 (或固體樣品 )，則需要先行消化後再予測定分析。前述

這些操作過程，包括從最簡單的稀釋到較繁瑣的前濃縮處理，若能有

㆒自動化的線㆖處理系統加以配合，將不僅可大輻降低㆟力花費的需

求，同時也可因污染的有效避免而提高分析的準確性。流動注入分析

(Flow injection analysis， FIA)[63]，即是在此需求㆘所產生的技術。

其重點是在㆒連續式的流動系統㆗，配合高靈敏的分析儀器對樣品㆗

的待測物進行快速偵測。此連線技術在適當的儀器條件配合㆘，具有

高樣品分析速率、高濃縮效率、低樣品消耗、低試劑消耗、高重複性、

樣品分析自動化和低污染等的優點。由於 FIA 主要亦是以溶液方式進

行操作分析，其與原子光譜儀或質譜儀之間的連接介面種類並無限

制，因此除了㆒般常使用簡單的氣送式霧化器之外，亦可視實際分析

需求而採用其它適當的樣品導入介面。

而本研究計畫所發展的分析方法，目標是能為大多數分析檢測單

位所適用，因此方法之簡便性、儀器之普及化、花費較少、更重要的

是又能兼顧分析數據之精密度及準確度為本研究發展的重要策略分

針。

第七節第七節第七節第七節污染控制研究污染控制研究污染控制研究污染控制研究

污染控制應注意的要點污染控制應注意的要點污染控制應注意的要點污染控制應注意的要點

大部份直測分析遭遇到的污染問題，主要是來自空氣粒塵及分析

過程㆗所使用的器皿，以及操作㆟員的技術、習慣等，因此極需對這

28

此污染因素作必要的控制。配製的藥品儲存於經標準清洗的聚㆛烯

(PP)瓶㆗，實驗用的器皿在使用前都需先經過標準清洗法清洗。

取樣和污染應注意的事項如㆘：

(1)分析㆟員和環境分析㆟員和環境分析㆟員和環境分析㆟員和環境

分析㆟員本身要在處理檢體的過程隨時注意是否有污染的導

入，例如手和器物不可越過待分析物、樣品收集管的橡皮塞不可長時

間接觸樣品等，因為分析㆟員本身以及其不良的習慣動作，也是造成

污染的來源之㆒。收集尿液則使用經標準清洗的 100 mL PP 廣口試藥

瓶收集尿液，並立即冷藏。

(2)容器容器容器容器

對試樣、試劑和標準品而言，容器是最早和最大的污染源之㆒。

對容器的材質和清洗方法必須加以嚴格要求。

(3)試劑試劑試劑試劑

必須儘量少量使用試劑，並使用最高純度之藥品。每㆒試劑必須

確知其含 As 量。最高純度的酸，儲存在容器㆗㆒段時間，可能會從

器壁㆗溶出污染物，因此要經常測定其是否有遭受污染。

第八節第八節第八節第八節最佳容器清洗方法最佳容器清洗方法最佳容器清洗方法最佳容器清洗方法

由於砷污染的情況並非相當嚴重，對於容器清洗方法，本研究建

議將各式容器以稀硝酸溶液浸泡過夜後，再以超純水沖洗 4 次，即可

避免容器㆖造成的污染。

第九節第九節第九節第九節 HPLC 分離砷物種分離砷物種分離砷物種分離砷物種

尿㆗出現的砷可以當作暴露於砷的生物偵測 [64]。到目前為止，

在㆟類尿㆗出現砷物種有 As(III)，As(V)，MMAA，DMAA，AsB，

AsC ， trimethylarsine oxide(TMAO) 及 tetramethylarsonium

(TMAs)[62]。砷的攝入主要經由食物的攝取或職業㆖暴露 (As(III)，

As(V)， AsB， AsC， TMAs)以及生物轉換的產物 (DMAA， MMAA，

TMAO) [62]。在尿液檢體的砷物種裡，有㆕種物種為陰離子形式

29

(As(III)，As(V)，MMAA，DMAA)，而其它物種為陽離子形式 (AsB，

AsC，TMAO，TMAs)[69]。根據分離的原理，離子交換樹脂層析法 (ion

exchange chromatography(IC))[62,65-68]及離子配對層析法 (ion-pair

chromatography(IPC))[64,68-73]都可以被利用來做砷物種分析的技

術。故在此次研究裡，係以 exchange chromatography 當作砷物種分

析的工具，由於 anion-IC HPLC 這個系統本身具有長期的穩定性，操

作簡單，而且花費較少。

這個強陰離子管柱填充 Nagel-N(CH3)2 來分離在尿㆗檢體的砷物

種。㆔價砷物種先分離出來而且顯示不變的滯留時間 (retention time)

並且與離子強度無關 [74]。而此篇作者觀察到，pH 的增加相對的滯留

時間也會增加。而相對於㆔價砷，五價砷物種最慢分離出來，而且五

價砷的滯留時間顯示對 pH 的改變沒有明顯的影響。而 DMAA 及

MMAA 對 pH 及離子強度則明顯影響了滯留時間。 pH 影響這兩種物

種滯留時間有不同的方式。以 DMAA 而言，當 pH 由 4 增加 6 時，滯

留時間會增加，而在更高的 pH 範圍則會減少。而 MMAA pH 由 4 增

加到 7 時，滯留時間會減少。離子強度對滯留時間的影響顯示有相反

的方式，例如，當離子強度增加時，則滯留時間減少。

由於這㆕個物種 (As(III),As(V),MMAA,DMAA)有各自不同的離子

解離常數，如表㆓，所以滯留時間受 pH 及離子強度影響。因為㆔價

砷有高的 pKa 值 (9.3)，As(III)不會在 mobile phase 解離。而 anion-IC

system 根據庫倫力而分離，As(III)物種不會滯留在這特殊的 pH 及離

子強度。As(V)在 pH 4-7 存在形式為 H2AsO4-/HAsO4

2 -， pKa1(2.3)及

pKa2(6.9)。而在 anion-IC 的滯留以分離物離子及流動相離子競爭樹脂

表面而定。更高濃度的流動相會導致更高的競爭力。這個就解釋為什

麼當流動相的濃度由 15mM 增加到 25mM，As(V)滯留時間由 13 分鐘

移至 9 分鐘。而當 As(V)在 pH 4 到 7 時，其滯留時間則沒有多大的

改變，這可由 As(V)表面電荷與磷酸鹽離子做解釋。當 pH 4 增加到

pH 7 時，As(V)的表面電荷增加 1.51 倍，As(V)與樹脂間的庫倫力預

計當增加 pH 值時會增加。而磷酸鹽離子 (競爭性離子 )的表面電荷當

pH 增加時也會提高 1.41 倍。鑑於當增加 pH 時，As(V)與磷酸鹽離子

30

顯示同時增加表面電荷，對樹脂而言這兩個離子增加的靜電吸引力彼

此之間會互相抵消，而因此導致當 pH 範圍由 4 增加到 7 時，retention

time 幾乎沒有變化。

對 MMAA 而言，當 pH 由 5 增加到 7 時，retention time 會降低。

這個現象也是 MMAA 離子與磷酸鹽離子在樹脂表面競爭的結果。當

pH 由 5 到 7 時，MMAA 表面電荷估計增加 1.09 倍，而磷酸鹽離子增

加 1.38 倍。磷酸鹽離子表面電荷比 MMAA 高，所以導致 MMAA 的

retention time 減少。同樣㆞，當 pH 範圍由 5~6 時，DMAA 的 retention

time 快速㆞增加，然後在更高的 pH 範圍 (6 以㆖ )則 retention t ime 減

少。DMAA 比 As(V)、 MMAA 有較高的 pKa 值 (6.2)，所以基本㆖在

pH<5 是以不帶電的形式存在。但是當 Mobile phase 的 pH 由 5 增加到

6 時，DMAA 解離成負電的形式，而對樹脂變得更有引力，因導此致

retention time 增加。

第十節第十節第十節第十節文獻比較文獻比較文獻比較文獻比較

在某些氫化產生原子吸收光譜 (HGAAS)條件情況㆘，來測定㆔價

及五價砷形式有不同的感度 [75]，像高酸及高 NaBH4 濃度條件㆘，這

些不同感度的差異可以減至最低 [76]。但在流動注入 (FI)系統比氫化

器有㆓個明顯差異的影響：第㆒，在 FI-HGAAS ㆗可以使用較低濃度

的 NaBH4。第㆓，氫化物產生的速率很慢，會被幫浦 (pump)到廢液，

這個效應稱之動力差別 (kinetic discrimination)[77]。由於這兩個理

由，在以 HGAAS 測定之前，會先以 KI [53]單獨使用或與抗壞血酸㆒

起使用 [78]，抗壞血酸的功用是預防空氣將氧化態的 iodide 形成

triiodide[79,80]。將五價形式的砷還原成㆔價的氧化狀態。然而 KI

只能在強酸環境㆘，特別是在 5-6 mol/L HCl。當強酸濃度小於 0.3

mol/L，KI 還原 As(V)形成 As(III)的能力減弱 [51,80]。甚至在更高的

酸濃度㆘，並且花費 4 - 5 個小時才能在室溫㆘將 As(V)完全還原成

As(III)[80]。曾經有過報告，FI-HGAAS 連線還原成 As(V)[81]，但是

平均每小時消耗 60 g 的 KI。Tyson 等㆟ [82]改善這個方法，以導入㆒

個 stopped – flow 前還原步驟，而 KI 的用量則明顯㆘降。然而它們使

31

用在 12 mol/L HCl 的 30%(m/v)KI 溶液。像這麼高侵蝕性的溶液不易

處理，並且會影嚮操作者的健康。而儀器金屬的部份及管路都會受到

損壞。另外，在高濃度的試劑會導致空白值升高及影響偵測極限。S.

Nielsen 及 E.H. Hansen [83]用 0.50%(w/v) 抗壞血酸及 1.0 % (w/v) KI

在 4M HCl 的溶液連線還原㆔價砷、五價砷來測定總砷。5μ g/L ㆔價

的偵測極限 (3σ )為 37 ng/L，%CV 為 1.1%(n=10)，而 5μ g/L 五價的

偵測極限 (3σ )為 33 ng/L，%CV 為 1.3%(n=10)。Chen 等㆟ [84]則提出

以 L-cysteine 代替 KI 當作五價砷的前還原試劑。它們發現 L-cys teine

這個低毒性的試劑以及在低酸濃度來做例常分析。 X.C. Le 等㆟ [85]

以 2% L-cysteine 與無添加 L-cysteine 在㆕種砷物種水溶液進行前還原

反應其吸收度的比較。由結果發現，當 As(III)、As(V)在 HCl 濃度在

3~4 M 時才得到最大的感度，而添加 2% L-cysteine 的結果呈現在 HCl

濃度 0.3~0.7 M HCl ㆕種砷物種即可得到最大的感度。同時也發現使

用 L-cysteine 不僅可降低使用 HCl 的濃度，並且 L-cysteine 似乎也可

增加形成 arsine 的速率。 L-cysteine 將㆒些五價的砷物種、As(III)、

MMAA、DMAA 會全部還原成它們㆔價氧化狀態。因此這些經前還

原的砷物種會與 NaBH4 的反應加快。T. Guo [8]等㆟以 10 倍稀釋尿液

及利用在 0.03 mol/L HCl L-cysteine (1%，m/v)，反應㆒小時來測定尿

㆗砷物種。他們探討出檢體㆗酸度為 0.03 mol/L HCl，而攜帶溶液的

酸度為 0.01 mol/L，NaBH4 濃度為 0.5% (m/v)，並且降低過去此 FI-

HGAAS 系統所建議的試劑流速，來確定更長的還原反應以及在氣液

分離器有較長的停留時間。在尿液添加回收率㆔價砷、五價砷、單㆙

基砷、雙㆙基砷分別是 100%、100%、96%、95%。偵測極限 (3σ ) 10

倍稀釋尿液是 0.1μ g/L，則相對應未稀釋尿液為 1μ g/L。測定五價砷

3μ g/L 的%CV 為 2%及 7% (within run 及 between run)。而我們這次

研究也參照此篇報告所建議的試劑流速，並且加以修釋。我們這次實

驗所使用的攜帶溶液的酸度 0.05%，檢體㆗酸度為 0.01mol/L，相較

之㆘，我們所使用酸的濃度是非常低的。NaBH4 使用的量也減至㆒

半。如此㆒來，使用 GSH 試劑當前還原劑，可節省 HCl，NaBH4 試

劑的消耗，並且降低 HCl 及 NaBH4 用量之後對操作者及儀器長期使

32

用㆘的傷害可減至最低。而且我們也比較 T.Guo 等㆟ [8]與我們這次

研究所建議儀器、試劑的最佳化條件，比較 1% L-cysteine 及 1% GSH

添加砷溶液㆗吸光度的比較 (圖十五 )。由圖可看出 As(III)、As(V)、

DMAA 在使用 1%GSH 的前還原溶液比 1% L-cysteine 有較高的吸光

度。

在過去的報告，Tam 等㆟ [86]提出陰離子交換樹脂層析法分離砷

物種。之後 Blas 等㆟ [87]也以此方法加以修飾。每㆒種砷物種的偵

測極限為 2 ppb。 100 ppb ㆔價砷， 20 ppb MMAA， 40 ppb DMAA 添

加於尿液檢體回收率分別是 93，91，85%，精密度 (RSD)為 3.2~4.6%。

實驗初期，我們也利用離子交換樹脂來分離砷物種發現用此方法須花

費大量㆟力、試劑、時間。譬如來說，必須泡製分別㆕種 0.5N HCl，

H2O，5% NH4OH，20%NH4OH 的沖提液，尤其以泡製 20%NH4OH 溶

液時，味道最為難受，而每次沖提的體積分別是 10mL 0.5 N HCl，15

mL H2O， 15 mL 5% NH4OH， 15 mL 20%NH4OH 沖提液，因為以 FI-

HGAAS 測定砷物種 pH 的控制最為重要，並且與 GSH 反應必須在

0.01mol/L HCl ㆘，所以沖提液 0.5 N HCl， 5% NH4OH， 20%NH4OH

沖提㆘來的溶液必須調控其 pH 值。並且這個方法只能分離出無機砷

(As(V)、As(III))、MMAA、DMAA，而 As(III)與 As(V)則無法出分出

來。而使用 HPLC 當作分離砷物種的儀器，mobile phase 為磷酸鹽類，

泡製方便，分離出來的的沖提液由自動收集器收集。10 ppb ㆔價砷，

五價砷，MMAA，DMAA ㆕種砷物種的回收率分別是 102.4，105.7，

112.8， 111.7%。如此㆒來，以 HPLC 做為分離砷物種的儀器可以節

省㆟力、時間、金錢。

33

第五章第五章第五章第五章結論結論結論結論

本研究計畫的重點在試圖找出㆒個最佳的前還原劑及砷物種分

析方法。我們利用方便、快速、高分離率的 HPLC 做為尿液砷物種分

離的的技術。 HPLC 是在㆒般實驗室普遍都具有的設備，動相為

NaH2PO4 ∙2H2O/Na2HPO4 緩衝溶液，這項儀器非常適合㆒般的實驗室

作為砷物種的分析工具，雖然 HPLC 與 AAS 之介面的問題已完全被

克服並應用於分析測定的工作，但 Bernhard[53] 對於 HGAAS 的光

譜深入研究，發現五價砷還原成㆔價砷後，再加以氫化，會比直接將

五價砷氫化理想，除了氫化反應較容易進行之外，干擾的問題亦會獲

得改善，故我們這次計畫不利用 HPLC 與 HGAAS 做連線的技術，而

是採用 2 階段的測定方式。另外，我們以 GSH 當作前還原劑，在各

種 AAS 分析條件探討㆘，NaBH4 的濃度只需 0.25%，而攜帶溶液㆗

鹽酸濃度更是只需 0.05%即可，在這樣的條件㆘，首先 GSH 與砷物

種形成錯合物 (complex)，進而將砷物種進行還原反應，再與 NaBH4

反應，最後完全形成 arsine，再以 900oC 加熱形成砷原子進行分析。

其 As(III)、As(V)、MMAA、DMAA 偵測極限分別是 0.015， 0.045，

0.024，0.015 ppb。使用 GSH 當作前還原劑可達到非常小的偵測極限，

並且有很好的精密度及比過去使用 L-cysteine 當前還原劑可以得到較

高的感度 (圖十五 )。本研究使用 GSH 做砷物種前還原劑顯示了㆔項特

徵：第㆒、GSH 是㆒個比其它前還原劑更有效力的前還原試劑；第㆓、

在非常低酸的情況㆘增加 arsine 的訊號；第㆔、因使用低濃度的 NaBH4

及攜帶溶液降低對㆟體毒性及機器的損害。因此本法可用來做尿液檢

體的砷物種分析。

34

誌謝誌謝誌謝誌謝：：：：

本研究計畫由本所分析檢驗組研究員謝俊明負責執行外，研究進

行期間承蒙高雄醫學大學醫技系林德賢教授指導、黃友利老師及

林碧珍小姐協助，謹此敬表謝忱。

35

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45

表㆒表㆒表㆒表㆒ (A)FI-HGAAS 測定砷的儀器最佳化條件測定砷的儀器最佳化條件測定砷的儀器最佳化條件測定砷的儀器最佳化條件

Atomic absorption spectrometer

Light source EDL systemPower supplier current 400 mAWavelength 193.7 nmSlit width 0.7nmSignal peak areaCarrier gas

Type high purified N2

Flow rate 50 ml min-1

Reductants 0.25% NaBH4 in 0.05% NaOHCarrier solution 0.05 % HClSample volume 500μ l sample loopT cell temperature 900 ℃

(B)

Step No.

Prefill

Time(s)

15

Pump 1a

(rpm)

100

Pump 2b

(rpm)

60

Value

position

Fill

Read

1 10 100 60 Fill

2 35 0 60 Inject Read

a : sample load line

b : carrier, reductant and waste line

46

表㆓表㆓表㆓表㆓ 砷物種的化學形式砷物種的化學形式砷物種的化學形式砷物種的化學形式、、、、pKa 及氫化物及氫化物及氫化物及氫化物

Species Chemical form pKa Hydride product

As(III) HAsO2 9.3 AsH3

As(V) H3AsO4 2.3,6.9,11.4 AsH3

MMAA (CH3)AsO(OH)2 2.6,8.2 CH3AsH2

DMAA (CH3)2AsO(OH) 6.2 (CH3)2AsH

表㆔表㆔表㆔表㆔ 將將將將 30303030 ml ml ml ml 含含含含 3% 3% 3% 3% HCl HCl HCl HCl 盛入盛入盛入盛入 100100100100 ml PP ml PP ml PP ml PP 廣口瓶立即分析廣口瓶立即分析廣口瓶立即分析廣口瓶立即分析 AsAsAsAs

濃度濃度濃度濃度 (n=3) (n=3) (n=3) (n=3)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

標準

清洗

N.D. N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D

未標

準清

洗

N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D

D.L.=0.015 ppb

47

表㆕表㆕表㆕表㆕ ㆔價砷㆔價砷㆔價砷㆔價砷、五價砷、五價砷、五價砷、五價砷、單㆙基、單㆙基、單㆙基、單㆙基砷砷砷砷、雙㆙基砷在、雙㆙基砷在、雙㆙基砷在、雙㆙基砷在 2.5 ppb 、、、、5.0 ppb、、、、10.0 ppb ㆔種濃度的吸光度㆔種濃度的吸光度㆔種濃度的吸光度㆔種濃度的吸光度、、、、slope 及線性回及線性回及線性回及線性回

歸值歸值歸值歸值

㆔價砷1.

As(III)

濃度 2.5ppb 5.0ppb 10.0ppb

吸光

度0.892 0.814 0.818 1.731 1.669 1.644 3.225 3.104 3.045

﹪RE 6.06 3.21 2.73 2.73 0.95 1.78 3.2 0.67 2.56

﹪CV 5.21 2.41 2.93

Slope 0.3124

R 0.99903

2.

As(III)


吸光

度0.828 0.744 0.769 1.641 1.496 1.456 3.010 2.958 2.843

﹪RE 6.15 4.62 1.41 7.18 2.29 4.90 2.49 0.72 3.20

﹪CV 5.52 6.33 2.90

Slope 0.2930

R 0.99968

3.

As(III)


吸光

度0.773 0.761 0.789 1.517 1.524 1.462 2.929 2.830 2.835

﹪RE 0.13 1.68 1.94 1.07 1.53 2.60 2.23 1.22 1.05

﹪CV 1.8 2.25 1.94

Slope 0.2855

R 0.99955

48

4.

As(III)


吸光

度0.789 0.734 0.775 1.448 1.513 1.478 2.916 2.897 2.859

﹪RE 3.00 4.18 1.17 2.16 2.23 0.14 0.86 0.21 1.11

﹪CV 3.72 2.19 1.00

Slope 0.2881

R 0.99984

5.

As(III)


吸光

度0.832 0.798 0.762 1.503 1.525 1.458 3.000 2.889 2.810

﹪RE 4.39 0.13 4.39 0.54 2.01 2.47 3.45 0.38 3.10

﹪CV 4.38 2.28 3.29

Slope 0.2882

R 0.99960

6.

As(III)


吸光

度0.765 0.765 0.752 1.541 1.435 1.474 3.163 3.043 2.982

﹪RE 0.53 0.53 1.18 3.91 3.24 0.61 3.26 0.65 2.64

﹪CV 1.05 3.61 3.00

Slope 0.3060

R 0.99984

49

五價砷1.

As(V)


吸光

度0.895 0.845 0.849 1.585 1.616 1.556 3.088 3.029 2.964

﹪RE 3.71 2.09 1.62 2.27 1.89 1.90 2.02 0.23 4.10

﹪CV 3.21 1.89 2.04

slope 0.3004

r 0.99918

2.

As(V)


吸光

度0.926

0.85

40.863 1.709 1.675 1.580 3.244 3.140 3.060

﹪RE 5.11 3.06 2.04 3.26 1.21 4.53 3.05 0.25 2.80

﹪CV 4.44 4.03 2.92

slope 0.3129

r 0.99931

3.

As(V)


吸光

度0.869 0.798 0.823 1.718 1.577 1.654 3.219 2.980 2.989

﹪RE 4.70 3.86 0.84 4.12 4.42 0.24 5.09 2.71 2.42

﹪CV 4.33 3.83 4.42

Slope 0.3060

R 0.99905

50

4.

As(V)


吸光

度0.754 0.843 0.785 1.531 1.605 1.492 2.978 3.010 3.023

﹪RE 5.04 6.17 1.13 0.78 4.02 3.31 0.87 0.20 0.63

﹪CV 5.68 3.71 0.76

slope 0.2995

r 0.99983

5.

As(V)


吸光

度0.765 0.776 0.777 1.656 1.608 1.491 3.259 3.196 2.956

﹪RE 1.03 0.39 0.52 4.48 1.45 5.93 3.89 1.88 5.77

﹪CV 0.85 5.35 5.09

slope 0.3143

r 0.99996

6.

As(V)


吸光

度0.803 0.819 0.737 1.625 1.599 1.579 3.171 3.084 3.150

﹪RE 2.16 4.20 6.23 1.50 0.12 1.37 1.15 1.63 0.48

﹪CV 5.52 1.43 1.44

slope 0.3138

r 0.99993

51

單㆙基砷1.

MMAA


吸光

度0.331 0.321 0.356 0.608 0.609 0.605 1.251 1.206 1.242

﹪RE 1.49 4.46 5.95 0.16 0.33 0.33 1.46 2.19 0.73

﹪CV 5.35 0.32 1.93

slope 0.1223

R 0.99956

2.

MMAA


吸光

度0.334 0.290 0.301 0.606 0.622 0.598 1.172 1.195 1.149

﹪RE 8.44 5.84 2.27 0.49 2.13 1.81 0 1.96 1.96

﹪CV 7.39 2.00 1.95

slope 0.1170

r 0.99974

3.

MMAA


吸光

度0.310 0.309 0.314 0.656 0.655 0.618 1.266 1.205 1.207

﹪RE 0.32 0.64 0.96 2.02 1.87 3.89 3.26 1.71 1.55

﹪CV 0.83 3.35 2.82

slope 0.1229

r 0.99962

52

4.

MMAA


吸光

度0.340 0.301 0.292 0.603 0.647 0.669 1.270 1.272 1.236

﹪RE 9.32 3.22 6.11 5.78 1.09 4.53 0.87 1.03 1.83

﹪CV 8.20 5.25 1.6

slope 0.1262

r 0.99994

5.

MMAA


吸光

度0.313 0.328 0.320 0.598 0.611 0.557 1.236 1.284 1.295

﹪RE 2.19 2.5 0 1.53 3.74 5.43 2.83 0.94 1.81

﹪CV 2.50 4.77 2.46

slope 0.1268

r 0.99902

6.

MMAA


吸光

度0.318 0.288 0.323 0.594 0.577 0.613 1.147 1.290 1.181

﹪RE 2.58 7.10 4.19 0.17 3.03 3.03 4.89 6.97 2.07

﹪CV 6.10 3.02 6.10

slope 0.1202

r 0.99992

53

雙㆙基砷1.

DMAA


吸光

度0.712 0.743 0.687 1.387 1.432 1.346 2.736 2.660 2.700

﹪RE 0.28 4.06 3.78 0.07 3.17 3.03 1.37 1.44 0.04

﹪CV 3.92 3.09 1.40

slope 0.2690

r 0.99981

2.

DMAA


吸光

度0.740 0.790 0.694 1.491 1.387 1.369 2.728 2.752 2.763

﹪RE 0.13 6.61 6.34 5.30 2.05 3.32 0.73 0.15 0.55

﹪CV 6.47 4.64 0.64

slope 0.2735

r 0.99972

3.

DMAA


吸光

度0.775 0.719 0.658 1.386 1.289 1.356 2.777 2.613 2.659

﹪RE 8.09 0.28 8.23 3.20 4.02 0.97 3.50 2.61 0.89

﹪CV 8.15 3.67 3.15

slope 0.2668

r 0.99981

54

4.

DMAA


吸光

度0.698 0.712 0.682 1.420 1.371 1.379 2.713 2.650 2.558

﹪RE 0.14 2.15 2.15 2.16 1.37 0.79 2.77 0.38 3.11

﹪CV 2.15 1.88 2.95

slope 0.2638

r 0.99956

5.

DMAA


吸光

度0.773 0.716 0.666 1.385 1.314 1.371 2.735 2.697 2.510

﹪RE 7.66 0.28 7.24 2.06 3.17 1.03 3.32 1.89 5.18

﹪CV 7.52 2.77 4.54

slope 0.2633

r 0.99972

6.

DMAA


吸光

度0.678 0.678 0.717 1.325 1.413 1.368 2.676 2.662 2.704

﹪RE 1.88 1.88 3.72 3.21 3.21 0.07 0.19 0.71 0.86

﹪CV 3.25 3.21 0.79

slope 0.2677

r 0.99992

55

表五表五表五表五 ㆔價砷㆔價砷㆔價砷㆔價砷、五價砷、五價砷、五價砷、五價砷、單㆙基砷、單㆙基砷、單㆙基砷、單㆙基砷、雙㆙基砷回收、雙㆙基砷回收、雙㆙基砷回收、雙㆙基砷回收

率數據率數據率數據率數據

As(III) As(V) MMAA DMAA

Meana 10.24 10.57 11.28 11.17

SD 0.92 0.44 0.34 0.02

Recovery(%) 102.4 105.7 112.8 111.7*各砷物種添加 10µg/l，基質為尿液。

a:n=3

表六表六表六表六 ㆔價砷㆔價砷㆔價砷㆔價砷、五價砷、五價砷、五價砷、五價砷、單㆙基砷、單㆙基砷、單㆙基砷、單㆙基砷、雙㆙基砷精密度、雙㆙基砷精密度、雙㆙基砷精密度、雙㆙基砷精密度 within runwithin runwithin runwithin run

及及及及 between runbetween runbetween runbetween run 的數據的數據的數據的數據

As(III) Within-run Between-run

2.5µg/l 3.87% 2.54%

10.0µg/l 0.69% 3.58%

As(V) Within-run Between-run

2.5µg/l 3.55% 5.40%

10.0µg/l 4.87% 2.04%

MMAA Within-run Between-run

2.5µg/l 3.36% 3.48%

10.0µg/l 1.05% 2.93%

DMAA Within-run Between-run

2.5µg/l 0.55% 2.52%

10.0µg/l 0.32% 1.34%

56

表七表七表七表七 ㆔價砷㆔價砷㆔價砷㆔價砷、五價砷、五價砷、五價砷、五價砷、單㆙基砷、單㆙基砷、單㆙基砷、單㆙基砷、雙㆙基砷偵測極、雙㆙基砷偵測極、雙㆙基砷偵測極、雙㆙基砷偵測極

限數據限數據限數據限數據

As(III)

吸光度 0.481 0.477 0.487 0.491 0.486 0.485

Mean±

SD0.485± 0.005

﹪CV 1.031

LOD=Xo+3SD=0+3*0.005=0.015(µg/l )

As(V)

吸光度 0.444 0.461 0.456 0.426 0.441 0.425

Mean±

SD0.442± 0.015

﹪CV 3.394

LOD=Xo+3SD=0+3*0.015=0.045(µg/l)

MMAA

吸光度 0.196 0.189 0.182 0.195 0.183 0.201

Mean±

SD0.191± 0.008

﹪CV 4.188

LOD=Xo+3SD=0+3*0.008=0.024(µg/l)

DMAA

吸光度 0.397 0.404 0.399 0.394 0.389 0.398

Mean±

SD0.397± 0.005

﹪CV 1.26

LOD=Xo+3SD=0+3*0.005=0.015(µg/l)

57

表八表八表八表八砷的毒物特性砷的毒物特性砷的毒物特性砷的毒物特性

semimetal

Environmental distribution +++

Environmental transfer to man +++

Significance for environmental +++

health

Classification (IRAC) Human carcinogen

Cancer localisation skin, lung, bladder, kidney,

liver

Toxicokinetics enteral trivalent 80%

absorption pentavalent 60%

nature organoarsenicals to

nearly 100%

Organ distribution liver, kidney, lung, skin

Metabolism As(V)→As(III)→MMAA→

DMAA→ via GSH-conjugate

Excretion(man) mainly via urine,

DMAA (60-70%), MMAA (10-

15%), As(III), As(V) (10-

15%)

Biological half-life 30-40 h

Active species in V : H2AsO4- / HAsO42-

biological systems III : H3AsO3

Thiol-affinity preferred +++

vicinal dithiols

DNA reactivity Not mutagenic

Carcinogenic

Clastogenic

Aneugenic

Inductive of DNA-protein

crosslinks +++

Mechanism of genotoxicity Inhibition of DNA excision

repair?

Oxidative stress and GSH

depletion?

Further mechanism?

Symbol: +, low; + +, medium; + + +, high; ? , not known.

58

表九表九表九表九砷物種分析的分析技術及儀器砷物種分析的分析技術及儀器砷物種分析的分析技術及儀器砷物種分析的分析技術及儀器

Methods

Spectrophotometr

ic

The best As species

determined

As(III),As(V)

LOD(μ g/l)

100,100

Reference

[58]

As(III),As(V) 0.03,1 [71]

FIA-HG-AAS As(III),As(V),MMAA,

DMAA

- [59]

HPLC-AAS As(III),As(V),MMAA,

DMAA,AsB1,AsC2,TMA

s3

1100,1400,1400,

700,300,500,400

[72]

HPLC-HG-AAS As(III),As(V),MMAA,

DMAA

1,1.6,1.2,

4.7

[73]

HPLC-UV-HG-

AAS

As(III),As(V),MMAA,

DMAA,AsB,AsC

As(III),As(V),MMA,

DMAA

5,8,6,

6,4,4

0.5,0.5,0.5,

0.5

[74]

[75]

IC-HG-AAS As(III),As(V),MMAA,

DMAA,ρ -APA4

4,20,3.2,

6.5,9.3

[76]

HPLC-HG-ICP-

AEC

As(III),As(V),MMAA,

DMAA

3.5,9.2,3.8,

21.3

[77]

HPLC-UV-HG-

ICP-AES

As(III),As(V),MMAA,

DMAA,AsB,AsC

2.6,9.6,13,

9.8,7.9,6.1

[78]

HPLC-ETAAS As(III),As(V),MMAA,

DMAA,TMAs

- [79]

HPLC-HG-MIP-

AES

As(III),As(V),MMAA,

DMAA

1,5,1.2,

6

[80]

HPLC-ICP-MS As(III),As(V),MMAA,

DMAA

1. 9,6,3.6,

1.2

[81]

As(III),As(V),MMAA,

DMAA,AsB,AsC

0.5,0.3,1,

1,0.5,0.5

[82]

HPLC-USN-AFS As(III),As(V),MMAA,

DMAA

0.14,0.2,0.08,

0.08

[83]

CZE-UV As(III),As(V),DMAA 90,60,120 [61]

CE-ICP-MS As(III),As(V),MMAA,

DMAA

0.1,0.02,-,

-

[62]

GC-FID As(III),As(V) 10,10 [84]

HG-GC-PID As(III),As(V) 0.0018,0.0008 [63]

GC-MES As(III),As(V) 0.05,- [85]

59

註 : 1: AsB:arsenobetaine

2.AsC:arsenocholine

3.TMA:tetramethylarsoniumbu

4.ρ s-APA:ρ -aminophenylarsonate

60

將已過濾的尿液檢體打入 HPLC 之 200μL sample loop

↓

HPLC moblie phase 的流速控制在 1.5mL/min

↓

設定自動收集器每 1 分鐘收集㆒管 (1.5mL)

↓

各物種分別引流出的時間

㆔價砷 :第 3,4 分鐘

五價砷 :第 13,14,15 分鐘

單㆙基砷 :第 9,10,11 分鐘

雙㆙基砷 :第 6,7 分鐘

↓

↓

40OC， 1 小時

↓

置於 Autosampler 以 FIAAS 分析

圖 ㆒：尿㆗砷物種分析流程圖

相同物種收集在同㆒管，每

管再分別加入 0.5 mL 10%

GSH，再加去離子水至 5 mL

製作 2.5, 5, 10

ppb 各物種檢量

線

61

圖㆓: 以 HPLC 分離添加砷標準溶液於尿液檢體的砷之分析層析圖

62

圖 ㆔ : 10%GSH前還原溶液㆗的酸濃度對10 ug/L㆔

價砷、五價砷吸收值的影響

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1

鹽酸濃度(mol/l)

吸光

度

As(V)

As(III)

63

圖 ㆕:不同的GSH濃度(0~10%)對砷物種吸收

值的影響

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0% 2% 4% 6% 8% 10% 12%

GSH 濃度(%)

吸光度

AS(III)

AS(V)

MMAA

DMAA

64

圖五: NaBH4濃度 (0.05, 0.10, 0.25, 0.50%) 對 10 µg/L ㆕種砷物種吸收值的影響

65

圖六: NaOH濃度(0.00,0.05,0.10,0.15,0.20%)對10

ug/l㆕種砷物種吸光度的影響

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

NaOH 濃度(%)

吸光度

As(III)

AS(V)

MMAA

DMAA

66

圖七 : ㆕種砷物種(各10 ug/l)在NaBH4 0.25%濃度，10

%GSH溶液情況㆘，比較攜帶溶液酸濃度(0.00~ 0.50%)的影響

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60

攜帶溶液(鹽酸)濃度(%)

吸光度

As(III)

As(V)

MMAA

DMAA

67

圖八 ㆕種砷物種各 10 µg/L 在 0.25% NaBH4, 10% GSH 溶液情況㆘，不同的攜帶氣

體（氮氣）流速的影響

68

圖九:GSH溶液與砷物種反應時間吸光度之比較

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 20 40 60 80 100 120 140

反應時間(分鐘)

吸光度 As(III)

As(V)

MMAA

DMAA

69

圖十:不同溫度(20,40,60,80oC)在砷物種與GSH

溶液反應1小時吸光度之比較

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

0 20 40 60 80 100

溫度(oC)

吸光度

As(III)

As(V)

MMAA

DMAA

70

圖十㆒ : As(III)檢量線

0

0.774

1.501

2.865

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5

濃度(ug/L)

吸光

度

slope : 0.2855

r : 0.99972

71

圖十㆓ : As(V)檢量線

0

0.794

1.543

3.004

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0

濃度(ug/L)

吸光

度

slope : 0.2995

r : 0.99983

72

圖十㆔ : MMAA檢量線

0

0.308

0.609

1.172

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0

濃度(ug/L)

吸光

度

slope : 0.1170

r : 0.99974

73

圖十㆕ : DMAA檢量線

0

0.718

1.357

2.647

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0

濃度(ug/L)

吸光

度

slope : 0.2633

r : 0.99972

74

圖十五 10% L-cysteine 與 10% GSH 各 10 µg/L ㆕種砷物種㆘吸光度之比較

75

III As(OH)3 As(SR)3 AsH3

V AsO(OH)3 As(SR)3 AsH3

RSH NaBH4

MMAA CH3AsO(OH)2 CH3As(SR)2 H3AsH2

DMAA (CH3)2AsO(OH) (CH3)2As(SR) (CH3)2AsH

圖十六 : 砷物種與 thiol(SH 基)反應形成㆔價砷 As(SR)3、CH3As(SR)2、

(CH3)2As(SR) 的狀態，這些 ㆔ 價的有機硫衍化物與

tetrahydroborate(III)形成砷化氫的狀態

砷生物偵測物種分析研究 - kun shan...

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