C A R A T U L A

'NOMBRE: Le6n Melgarejo Martha Patricia TELEFONO: 874-1 5-1 2 MATRICULA: 87241458

,/ LICENCIATURA: Ingeniería Bioquímica Industrial

/DlViSlON: Ciencias Biológicas y de la Salud UNIDAD: lztapalapa

HORAS A LA SEMANA: TRIMESTRE : 95-1

20 hi-s.

,/ TITULO DEL PROYECTO: Identificación y sobrevivencia de

en apio (Apium graveolens) Vibrio cholera

, y' ASESOR M en C Carlos Vázquez Salinas

Profesor de tiempo completo Departamento de Diolecnologia

1,UGAR DONDE SE REALlZO EL TRABAJO: Laboratorio de Fisiología de Postcosecha de fmtas y verduras (S-l56), Departamento de Biotecnología

19 de Mayo de 1994 FECHA DE INICIO: -""PECHA DE TERMINACION: 19 de Noviembre de 1994 ,,.'

-I

CLAVE: IBI-015-94

NOMBRE DIEL PROYECTO: "Estudio de la presencia de patóyenos en diferentes hortalizas."

PROYECTO DE SERVICIO SOCIAL

1 1

1 IDENTIFICACIÓN Y SOBREVIVENCLA DE Vibrio cholerue I EN APIO (Apium graveolens)

I

MARTHA PATRICIA LEON MELGAREJO

í N D I C E

' I

PAGINAS

OBJETIVO GENERAL .................................................................... 1

OBJETIVOS PARTICULARES ...................................................... 1

INTRODUCCI~N .............................................................................. 2-5

JUSTIPICACIÓN .................... . ........................................................ 6

MATE:RIAL Y EQUIPO ................................................................... 7

MEDIOS DE CULTIVO ..,,. . ............................................. 7

REACTIVOS .............. . ..................................................... 7

METODOLOGíA ....... . .................................................... 8-12

ACTIVIDADES REALIZADAS .................................... 13,14

OBJElTIVO Y METAS ALCANZADAS ....................... 14

RESULTADOS ................. <,.. ........................................... 15-17

DISCUSIONES ................. u .............................................. 18,19

CONCLUSIONES. ......................................................... 20

RECOMENDACIONES ................................................. 21

BIBLIOGRAFIA ....... ....... . .............................................. 22,23

INTRODUCCION:

En México, las enfermedades gastrciintestinales tienen una gran incidencia entre la población debido al consumo de alimentos contaminados, entre estos se incluyen las hortalizas, las cuales pueden ser un vehículo de transmisión de dichos padecimientos. (23)

El apio pertenece a la familia Apiaceae o Umbellifera; género y especie Apium graveolens, es una variedad dulce. Tambi(in puede clasificarse de acuerdo a sus partes alimenticias cornso una hortaliza de tallo, y morfologicamente se distingue como una hortaliza de peciolos engrosados. (16,19,20)

El apio es una planta bienal que se cultiva como anual, de 40 a 50 cm de altura, con raíces fibrosas, hojas olorosas, divididas provistas de costillas o pencas carnosas y tiernas, achatadas o huecas. Los tallos florales, que aparecen en el segundo año, alcanzan una altura de 80 cm y portan umbelas de pequeñisimas flores de color amarillento. Es una especie originaria de Europa meridiona4. (20)

Se conocen dos tipos de apio, que se distinguen cuando la planta está en completo desarrollo por el color de los peciolos y por el corazón. El tipo amarillo o dorado; el cual tiene follaje verde amarillento, los pecíolos son delgados, un poco delgados de calidad mediana y no son muy aptos para el almacenaje. El tipo verde se distingue por un marcado color verde clam a verde oscuro de la planta, por el grosos notable de los pecíolos en sección transversal, resiste mejor el almacenaje.(4,6 )

El apio requiere de bastante humedad, clima fresco y suelos orgánicos bien drenados. Las temperaturas medias propicias para su desarrollo están entre los 15 'C y 18 "C. Se puede conservar en tránsito o alniacenamiento refrigerado hasta 2 o 3 meses a O "C, con una humedad relativa de 90 a 95 %. Su punto de congelación es de 1.5 OC. El apio puede absorber otros olores por lo que sólo deben almacenarse plantas enteras sin daiio. (4.6).

Desde épocas muy antiguas el apio se ha utilizado tanto como verdura como en forma de planta medicinal, en este último caso, por sus propiedades diuréticas, carminativas y depuradoras de la sangre, derivadas de la presencia de un glucósido llamado apiina y un aceite esencial compuesto principalmente por apio y limoneno. Las hojas de apio se han utilizado en cataplasma para limpiar llagas y úlceras. (10)

El apio es apreciado en la dieta por su alto valor nutritivo, la composición del apio fresco puede observarse en el cuadro No. 1

Del apio se consumen su pecíolos en ensaladas y en aderezos generalmente crudos, sin ningún tratamiento térmico, y además son sometidos a lavados superfíciales, sin la utilización de agentes desinfectantes adecuados como: solución de hipoclorito de sodio, solución de nitrato de plata, iodo, etc., lo cual trae como consecuencia que los microorganismos que se encuentran contenidos en él, disminuyan de forma poco importante. (1 0,20)

SOBREVIVIENCIA DE K cholerae en Apio.

A Temp. 20-25 "C 3 días I

I

A Temp. 30-31" C a Temp. S1O"C fuentes: Barba (1970) I m T 7-lodías I

Prescott y Bhattacharjee (1969)

1

Apio A Temp. 20-25°C reíigerador hojas y 3-5 días 1-2 semamas

tallo

' ! i , ,

I

' !

TABLA No. 1

PI0 COMPOSICIL.. DE LAS PARTES COMESTIBLES DEL (EN 100 g. DE MUESTRA)

PORCION COivíESTlBl AGUA ENERGIA PROTEINAS GRASA CARBOHIDRATOS CALCIO FOSFORO HIERRO SODIO POT AS10 VITAMINA A*

IU Vitamina A = 0.3 nig vitamina A alcohol (10,201

Entre los alimentos que pueden transmitir a Vibrio cholerae, se encuentran las hortalizas, en las cuales el microorganismo sobrevive por periodos importantes, como lo demuestran los estudios realizados en diferentes productos hortlcolas, por Prescott y Batacharjee (1969)yBania(1970).

Las hortalizas pueden contener a. V. cholerae debido a que en algunos paises son regadas, durante su cultivo, con aguas residuales, como es el caso, en algunos lugares de la República Mexicana, a pesar que la ley de ecología lo prohibe, además, generalmente se utilizan como abono, fertilizantes orghnicos de origen animal. (IS)

CARACTERISTICAS DEL MICROORGANISMO.

La especie de Vibrio más importante para la d u d es Vibrio cholerue, el cual es un microorganismo aerobio o anaerobio facultativo, Gram-negativo, oxidasa positivo, de metabolismo oxidativo o fermentativo, móvil por un flagelo polar y sus dimensiones van de 1.4-2.6 pm de largo y 0.5-0.8 pm de diámetro (Baumunn et ai., 1984), es curvo de extremos redondeados. Pertenece a la Emilia Vibrionaceae filogeneticamente cercana a las enterobacterias, es capaz de realimr el metabolismo respiratorio o fementativo, es oxidasa positivo, reduce el NO3 a N02, produce acetoína y/o diacetil, fermenta la sacarosa, el -cetoglutarato y aumentan su crecimiento agregando de 1-2 % de NaCl ai medio. (3,13)

Vibrio cholerae pueden crecer en medios simples, siempre y cuando se le proporcione un hidrato de carbono utilizable (sobre todo glucosa), nitrógeno inorgánico, azufre, fósforo, minerales y un amortiguador adecuado. Crece mejor a pH 7, pero puede tolerar condiciones alcalinas hasta pH 9.5, es extremadametite sensible a la desecación, exposición a la luz solar y cambios extremos de pH, sobre todo a pH ácidos. (12,21)

CLASIFICACION DEL MICROORGANISMO.

V. cholerue se clasifica taxonómicamente en dos scrogrupos el O: 1 y el no O: 1, las cepas de este último no aglutinan con el antisuero "O" del grupo 1. El serognipo O: 1 comprende dos biotipos el Clásico y El Tor, cada uno de los cuales puede ser de los serotipos Ogawa, haba e Hikojima (Organización Panmcricana de la salud, 1987). Cuadro No. 2. En la caracterizaci6n de las cepas del cólera, asi en el diagnóstico, se han utilizado técnicas de biología molecular, ejemplo de ello son los trabajos de Olsvik et ai, 1993, realizados con las toxina producidas por el microorganismo y los de Wachsmuth et id, 1993.

SEROGRUPOS NUEVOS Y SU MPORTANCLA.

Hasta hace poco, el g6nero Vibrio estaba conformado de acuerdo al Manual de Bacteriología Sistemática Bergey con más de 80 serognipos no O: 1, actualmente se han

TABLA No. 2

CLASlFlCAClON TAXQNOMICA DE Vibrio cholerae

Vibrio cholerae

r------I Nü'0:l

(> 1158 SEROTIPOS)

I 0:l

(COLERA ASIATICO)

CLASICO a EL TOR a I

OGAWA, INABA, HlKOJlMA

I

I NOTOXIGENIC0 I

FUENTE: OMSlOPS 1987

I TOXIGENIC0 I

agregado 57 a los ya existentes, para extender el esquema hasta 0:140; adiciones importantes fueron los serogrupos 0:139 y 0:140, este último asignado al serognipo "Hakata", el cual posee el factor C (haba), pero no el B (Ogawa), ni el A, antígeno específico mayor del serogmpo de K choi'erae O: 1 (Shimada et al., 1994). El serognipo O: 139, al cual se le designó "Bengal" (Siddique et al., 1994), es semejante al O: 1 El Tor desde el punto de vista de especificidad í'ágica (Higa et al., 1994).

Las cepas de K cholerae no O: 1 se asocian con infw¡ones extraintestinales tales como la colesistitis, meningitis, celulitis, aspiracion pneumónica y otitis media, IBS cuales ocurren en pacientes con enfermedades crónicas, particularmente con cirrosis hepática, diabetes, leucemia, baja acidosis gástrica, entre otras (Dhar et ai., 1989).

La cepa 0:139 fue aislada en un b'rote de gastroenteritis en la India en 1992, se diseminó a otras regiones, encontrandose on Bangladesh en diciembre del mismo a.fio, en Tailandis en abril de 1993 (Jesudason y Johns, 1994; Waldor y Mekaianos, 1994), en el mismo año se encontró en 13 estados de La india (Nair et ai., 1994 y Emeis et al., 1994), y en Bangladesh, donde se ailó la cepa en 11 de 92 muestras de agua superñcial y el 100% de éstas, produjeron la toxina (Islami et ai., 1994).

Esta cepa es capsulada y las porciones de los genes del complejo biosintético del antigen0 O: 1, están alterados o no existen, además muestra resistencia al suero humano normal. La presencia de la ct~psula sugiere el potencial de la cepa para invadir el torrente sanguíneo en huéspedes susceptibles y tiene profundas implicaciones para el posible desarrollo de una vacuna (Johnson et al., 1994). Este seroppo se asocia Con una gastroenteritis adquirida por el consumo die productos de la pesca crudos (Dumler et al, 1989; Dhar et al., 1989).

SOBREVIVENCIA DE K cholerue.

El tiempo' de sobrevivencia de V. cholerae aumenta en condiciones de dinidad intermedia, bajas temperaturas, alto contenido órganico, pH cercano a la neutralidad, protegido de la luz y en ausencia de flora csociada. En estudios realizados en Inglaterra se determinó que la sobrevivencia del microorganismo aumenta en agua clorada cuando ésta contiene 6xndo de fierro (Patel et al, 1994) En el cuadro 3, se presentan datos específicos de la sobrevivencia de este microorganismo en apio a diferentes temperaturas.

SMTOMATOLOGI A.

A mitad del siglo XiX, John Snow fie el primero etl describir la sintomatología del cólera, la enfermedad comienza repentinamente, con dianea acuosa y profusa, sin dolor, vómito ocasional, deshidratación rápida, acidosis y colapso circulatorio, en casos sin tratamiento se produce la muerte dentro de las 24 horn d t su aparicibn. h e d e haber síntomas premonitorios tales como anorexia, malestar abdominal, diarrea líquida, inicialmente de color café, pero rápidamente adquiere un color gris pálido Con olor

discreto, ligeramente a pescado (Gangarwsa et al., 1972), la enfermedad se puede presentar en forma leve o asintomática. Las evacuaciones masivas pueden causar la pbrdida de 10 a 15 % de los líquidos, al persistir éstas, resulta una severa deshidratación.

El pulso periférico puede estar ausente y la presión arterial no detectable, aumenta la viscosidad de la sangre dando como consecuencia UM cianosis, la turgencia de la piel desaparece, los qjos se encuentran hundidos, las manos y los pies se muestran arrugados y hay calambres musculares por la pérdida, de electrolitos a nivel celular (Organización Panamericana de la Salud, 1991).

PATOGEN 1A.

El primer requerimiento para que la infección se presente es la ingestión de vibnones del cólera, la dosis inf'ectiva es generalmente alta, (108 vibnones) pero puede bajar en situaciones de acidosis gástricin e inmunosupresión, llegando en algunas ocasiones a ser de 100 bacterias, el periodo de incubación puede ser de unas cuantas horas a cinco días, pero generalmente es de dos a tres días (Holmgren, 1982).

Las cepas patógenas de V. cholerae O: 1, producen la toxina del cólera. Cuando llegan al intestino delgado, lo colonizan y se multiplican al vencer los mecanismos de defensa (Holmgren, 1980). La toxina es una proteina que consta de dos subunidades, la A y la B (Sima et al., 1991). La subunidad B. es responsables de la fijación de la toxina ai receptor gangliósido GM-1 en la membrana celular del epitelio del intestino delgado del huésped. La subunidad A, activa el complejo enzimático adenilato ciclasa, incrementando los niveles intracelulares de AMP cíclico, que altera el transporte activo de iones a nivel de la membrena celular (Mekalanos, 1885), por lo que se presenta secreción de líquido y electrolitos hacia e:l lumen del intestino con disminución de la absorción (Field et al., 1989), lo que provoca la presencia de moco en las evacuaciones (Harrison et al, 1'986).

Los vibrios del cólera tienen otros, factores de virulencia además de la toxina, entre ellos se cuentan, los pila (Levine et al., 1983), fimbrias, proteasas capaces de activar a la toxina (Booth et al., 1984) y adhesinas (Finkelstein y Hanne, 1982). El gen toxR codifica para la proteína T o a que controla la expresi6n de aproximadamente UM veintena de genes de virulencia (DeRita et d., i991).

En los estudios hechos para determinar el mecanismo responsable de la patogénesis de V. cholerae no O: 1 se detetminó que algunas de estas cepas son capaces de producir actividad de toxina (Moms, 1990), se comparó ésta con la producida por V. cholerae O: 1, mediante las pruebas en asa ligada de conejo, ratón lactante, células de ovario de hamnst.er chino y células de la suprarrenal de rat6n Y-I; la conclusión fue que las toxinas eran semejantes, inclusive en su termoestabilidad (Yamamoto et al.,1983; Hoge et al., 1990; Said, 1994). Es clara In existencia de mecanismos de patogenicidad diferentes de la t,oxina en otros serotipos de Vsholerae, ya que aigunas cepas que no producen toxina son enteropatógenas en el ser humano (Baumiinn et al., 1984).

I '

- I'ANDEMIA PERIODO PRIMERA 18 17-1 823 S E G W A 1826- 183 7* TERCERA 1846-1862* CUARTA 1864- 1875* QUINTA 1887-1896 SEXTA 1902-1923

SEPTIMA 1961- ALA FECHA*

PANDEMI AS

En el siglo XIX, el cólera se diseminó del Ganges de la India al resto del mundo, dando origen a una pandemia, desde entonces, hasta nuestros dias, se han feportado siete pandemias, cuadro 4, de las cuales la segunda, tercera y cuarta afectaron a México. En junio de 1991 se informó el primer caso en la República Mexicana dentro de la séptima pandemia. la cual en este momento estamos viviendo, los paises del Continente Americano involucrados en ésta son Perú, Colombia, Ecuador, Estados Unidos de América, Brasil, Chile, México, Guatemala, El Salvador, Bolivia y Panam& al inicio de esta pandemia, se presentaron brotes en Japón apareciendo la denniedad en el Pacífico Meridional, persistiendo en Africa y Asia, donde los biotipos Clasico y El Tor han estado presentes Se considera que las rutas comerciales pudieron haber sido las vías por las que la enfermedad pasó de 1ii India a Afiica, Europa y América del Norte (Organización Panamericana de la Salud, 1992).

CUADRO No. 4. PANDEMIAS DE COLERA

(Dirección General de Epidemiología, 199 1 ) * Afectaron a México.

MECAMSMOS DE TRANSMISION

Los mecanismos directos e indirectos de transmisión' que operan en otras infecciones entéricas se aplican al cólera, pero en realidad la forma precisa de propagación de esta enfermedad no está definida, excepto en las principales epidemias transmitidas por el agua en el pasado.

La transmisión indirecta de persona a persona a través de alimentos contaminados con excretas, por medio de los dedos o las moscas puede ser un mecanismo de transmisión.

El reservorio natural es el hombre, aunque se han propuesto reservorios en el ambiente y se desconocen animales susceptibles en condiciones naturales (Organización Panamericana de la Salud, 1992).

Existen diversos factores que influyen en la aparición de los brotes de cólera, algunos no pueden ser controlados fácilmente pero, se pueden tomar medidas que en a circunscribir el problema, como las recomendadas por La Organización Panamericana de la Salud, 1991

Cuando se ha confirmado un brote de cólera, los individuos infectados deben ser tratado inmediata y adecuadamente con los antibioticos de elección, lo cual permite interrumpir la ti-ansmisión ya que disnimuye el periodo de excreción de vibrios en materia fecal (Organizalcion Mundial de la Salud, 1991).

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' , JUSTIFIC ACION: , ,

1: , ,

En Mkxico, las enfermedades gastrointestinales ocupan el segundo lugar siendo las de origen bnctenano las de mayor incidencia entre la población; debido al consumo de alimentos que no han sido sometidos H un proceso de higiene, entre estas infecciones se encuentra el cólera, enfermedad causada por Vibrio cholerue microorganismo por el cual se vive la septima pandemia y la epidemia que padecemos y que en los Últimos años ha provocado un gran número de muertes:.

El apio es una hortaliza de amplio consumo, generalmente en forma cruda; vehiculo de transmisión de Vibrio choierue, por lo que en este trabajo se consideró importante poner en evidencia la presencia de este microorganismo.

En la República Mexicana no existen datos publicados respecto a la sobrevivencia de V. cholerue efl este producto horticola. Lo señalado junto con el hecho de que en los últimos meses se ha presentado w1 númm importante de casos de cólera, lo que justifica el estudio de la sobrevivencia y presencia de V. choierue en apio

I

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! I OBJETIVO GENERAL:

Estudiar la presencia y la sobrevivencia de Vibrio cholerae en muetras de apio, recolectadas en la Central de Abastos del D F.

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I OBJETIVOS PARTICULARES: ' I

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' ! i 1 :

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i /

1 :

a)- Aislar a Vibrio cholerae a partir de miuestras frescas de apio.

,

b)- Determinar el tiempo de recuperaci6ri de Vibrio cholerue O: 1 Inaba no toxigénico d a d o a partir de bivdvos;, inoculado en muestras de apio,

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TECNICA PARA LA DETERMINACION DEL TIEMPO DE SOBREVIVENCIA DE Ubrio cholerae

REALLZACION DE DiLUCIONES 1.10 Y 100 ceüml. A PARTiR DE UNA CEPA PURA DE

Vibrio cholerae O: 1 I

ENJUJAR CADA MUESTRA DE APIO CON lOC0 rnl, DE APA

EL ACUA PEPI'ONADA

CON LAS DILUCIONES DE LA CEPA MFECTAR

I COLOCAR CADA MUESTRA POR DILUCION DIFERENTE I ~ I A LAS SIGUIENTES TEMPERATiJMS 3T'C. 25°C Y -10°C J

I ANTERIORES UN TESTIGO, MANTENENDOLO

I CADA 12 HORAS TOMAR MUESTRAS Y SEMBRAR EN AGAR TCBS.

I INCUBAR A 35°C POR 18 HORAS I

REALIZAR LA MISMA OPERACION HASTA QUE NO SE PRESENTE CRECIMIETNO.

I I !

I

- A 3 COLONIAS CARACTENSTICAS (2-3 mm,, AMARItLAS

CON CENTRO OPACO Y BORDES TRANSLUCIDOS SEMBRAR EN

' ! !

c I

I

INCUBAR A 37 "C DURANTE 24 HRS.

, 'I

TECNICA PARA AISLAR Vibrio cholerae

COLOCAR 100 g DE AGREGAR IO00 ml DE (MA)

íDDILUCiON 10')

1 LAVAR 'Y DEJAR REPOSAR

HACER DILUCIONES 10-2 Y 10" POR DUPLICADO

INCUBAR A 37 "C Y 42 "C I DURANTE24HORAS.

DE CADA DíLUCION TRANSFERIR UNA ASADA I A PLACAS CON AGAR TCBS

I INCUBAR A 37 " C I

Caldo tnptona i'l AGARTlNl T I

HMS MUCOIDE

I J

POLIVALENTE

1 M A = Agua pepionada aid ina TCBS = Tiosulfato, Ciúato, Sales Biliares y Sacarosa TIN1 = Tnptona al 1 %y NaCl al 1 %

TECNICA PAR4 DETERMINAR LA PRESENCIA DE SalmoneUa

T O W 25 mi. DEL LAVADO INlCIAi. DE LA (DILUCION 10-1) Y ADICIONARLOS A FRASCOS

125 ml DE TETRATiONATO Y SELENITO

POLI~ALENTE DE

RESULTADOS Y DISCUSION:

De un total de 100 muestras analizridas, en 41 se identificó Vibrio choleme NO 0:1, no se logró poner en evidencia a V. choferae 01.

La procedencia de la mayoría de las muestras fue el Estado de Puebla, debido a la cercanía con el D.F y el volúmen de prodiiccibn de las sociedades cooperatiw establecidas en este estado.

PROCEDENCIA DE LAS MIJESTRAS DONDE SE IDENTIFfCO V76rio chdaac NO O 1

r No. DE 1 NUMERODE I PORCENTAJE I ORIGEN I MUESTRAS MUESTRAS DE

ANALIZADAS POSlTIvAS POSITIVIDAD 4 16 SIR _ _ _. - -

76 I ATLIXCO 36 I PALMARITOS

9 I 36 I sAN.MARTIN I TOTAL 41

De los resultados obtenidos en la jdentificacibn de Vibr/o cholerue, se puedo observar que este microorganismo se presenta en un 41% del total de las muestras analizadas, porcentaje que se considera elevado; la presencia del microorganismo en estudio puede deberse a ciertas característicm de esta hortaliza, como pueden ser el gran contenido de agua que presenta, ad también por su contenido en sales, y un pH neutro, esto la hace susceptible de que se convierta en un medio adecuado para el desarroilo de vibnones. La especie encontrada de Vibrio cholerue pertenece al serotipo No 0:1, aún cuando no es causante de síndromes diarreicos graves o potencialmente letales como el serotipo 0:l (iZ,Zi), representa un riesgo a la salud pública, por lo que es de importancia considerar un mejor control en la forma de cultivo y cousumo de dicha hortaluq principalmente por que se puede consumir cruda.

El análisis estadístico de los resultados obtenidos del tiempo de recuperación de Vibrio cholerue en apio a diferentes temperaturas se presentan en la cuadro No. 6.

Cuando se midio el tiempo de sobrevivencia en función de la concentración celular y la temperatura de incubación, para una concentnci6n celular de 100,OOO cel/d. No se encontraron diferencias signiñcathis (P< 0.005) a las temperaturas de 25 OC y 37 "C. También en esta concentración celular, se pnssntdon los valores promedios de sobrevivencia más altos, según la prueba de Duncan.

-. ! j

' . I .

8.1 1 f 0.7 6.33 f 0.6 3.38 f 0.6 C.d

1 O0 O00 10 O00 1 O00

, , : ' / 8 1

1: , ' 8.72 f 0.9 '

4.72 f 0.8 3.00 f 0.5

1 i ,

TABLA No. 3

PRUEBADUNCAN EN FUNCION DE LA CONCENTRACION DE INOCULO

Y LA TEMPERATURA DE INCUBACION

1 .- Los valores son la media f DE de 9 réplicas.

a.- Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes a P < 0.05

' , !

1 :

' 1

I !

En general el tiempo de recuperación de Vibrio cholerue, con respecto a las diluciones realizadas disminuyó conforme la muestra se diluía y disminuía la temperatura. De esta manera se observa en la cuadro No. 4, que la sobrevivencia disminuía en un 65.23 % cuando se pasaba de una dilución de lO(E,OOO a 10,000 ceüd. en el tratamiento sometido a una temperatura de 10 "C, en este mismal tratamiento la sobrevivencia disminuía en un 43.06 % de una concentración de 10,OOO a 1000 ceüml.. Cuando se analizó la sobrevivencia de este microorganismo a una temperatura de 25'C, se observó que la sobreviviencia dismmuia en un 77.68%, para las dos primeras diluciones en cuanto la relación enire la segunda y tercera el valor fue del 43%. Aunque a una temperatura más elcvada, en este caso a 37T, la sobrevivencia disminuyó en aproximadamente 54.12 % entre la dilución de 100,OOO cellml y 10,OOO Cevml, mientras que el valor entre las diluciones 10,OOO ceümi y lo00 dml fue de 63.55 %, en donde se observa una dismjuiución mucho más drástica que en los otros casos. De esta manera se puedo observar una relación de la dilución y la temperatura a la que se sometió la muestra.

En el cuadro No. 4 6e muestran los resultados estadísticos de la determinación del tiempo de sobrevivencia de Vibrio cholerue 0:l Inaba no tdgh ico , aislado a partir de bivalvos, el cual fue inoculado a muestras ftescas de apio.

CONCLUSIONES: : J , ,

1. - El análisis microbiológico de la hortaliza estudiada dio a conocer la presencia de Vibrio cholerue no O: 1.

2.- Aún cuando la especie identificada de Vibrio cholerue no es causante de cuadros clínicos tan graves como la especie 0:1, por su gran incidencia en apio este debe ser considerado como un riesgo para la salud, sobre todo por que dicha hortaliza es consumida por lo general en forma cruda sin ningún otro tratamiento adecuado para poder eliminar a dicho microorganismo.

I , , ' ; ' '

I

, 8

1 ; . ,

3 - El tiempo de sobrevivencia de Vibrio cholerue O 1 aumenta conforme incrementa el número de células a temperaturas sobre 103 25 "C, lo mismo ocurre a temperaturas bajas, , I

I aunque en menor proporción

3' j ' ,

Es preciso monitorear más coniinuamente esta hortaliza ya que si fue posible identificar Vibrio choferae no O: 1, no se descarta la posibilidad de que pueda estar contaminado por Vibrio cholerae O: 1 el cual es causante del cólera clásko enfermedad que se caracteriza por presentar cuadros cínicos más severos en el hombre, como es el comienzo brusco de vómitos y diarrea, la rápida pérdida de iiquidos que van de 15 a 20 litros por día y en casos no tratados rápida y adecuadamente pueden causar la muerte. (12)

Además los estudios realizados en cuanto a la recuperación de Vibrio cholerae en apio mostraron que aún cuando la cantidad de células presentes en una muestra sea pequeña, el tiempo se sobrevivencia aumenta más rápidamente, sobre todo manto la hortaliza se mantiene a una temperatura de 25 OC. El tiempo de sobmvivencia disminuye cuando la hortaliza es refrigerada pero esto no puede ser un factor de seguridad ya que si el número de células por muestra es superior a 10,OOO ceümi. puede Uagar a alcanzar casi los mismos niveles de sobrevivencia que en el caso de temperatmu superiores.

Otro punto a sugerir es darle un mejor tratamiento higiénico antes de ser consumida, sobre todo si se va a preparar cruda.

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,

APÉNDICE A- I

PREPARACI61'4 DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

AGUA PEPTONADA ALCALINA (APA.).

Fórmula. Peptona 1 0 8 cloruro de sodio 10 g

Disolver los componentes dentro de un matraz Erlenmeyer con tapón de rosca en un litro de agua destilada, ajustando el pH a 8.9, esteriüzar a 121 'C por 15 minutos. (2,151

AGAR TIOSUL.FAT0, CITRATO, SALES BJLIARES Y SACAROSA (TCBS).

Especificaciones: Este medio es empleado para el aislamiento y cultivo selectivo de Vibrio cholerae y otros vibrios enteropatógenos.

Fórmula: Ingredientes por litro Extracto de levadura Peptona proteosa No.3 de Difco Citrato de sodio Tiosulfato de sodio Oxgall Sacarosa Cloruro de sodio Citrato fémco Azul de bromotimol

pH final 8.6 0.2 a 25 "C

Método de preparación: Suspender 89 g en un litro de agua destilada o desionizada (se recomienda que el recipiente en donde se prepare sea tres veces mayor ai volumen deseado), Calentar a ebullición hasta disolver completamente. NO ESTERILIZAR. Distribuir en cajas petri estériles o desechables. (2,15)

AGAR TRIPTONA AL 1 % Y NaCl AL 1 % (TlNl)

Fórmula: Ingredientes por litro Tnptona 10 8

NaCl 10 8 Agar 15 8

Método de preparación: Hacer la relaci6n de los ingredientes sepún el volumen deseado, disolver con agua destilada, ajustar el pH a 7.0 0.2 a 25 "C, calentar a ebullición hasta completa disolución, esterilkat a 121 "C durante 15 minutos. Distribuir en cajas petri estériles o desechables. (2,1:5)

CALDO TRIF'TONA SIN CLORURO DE SODIO (CT).

Méíodo de preparación: Disolver 10 g de tnptona en un litro de agua destilada, ajustar el pH a '7.0 0.2. Distribuir en tubos con tapón de rosca, esterilizar a 121 "C por 15 minutos. (1 5 )

APENDICE A-2

FUNDAMENTOS DE LAS PRUEBAS BIOQU~MICAS EMPLEADAS

PRUEBA DE LA OXIDASA:

Esta prueba está basada en la producción bacteriana de una enzima oxidasa. Esta reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa (encontrado por io general en los microlorganismos aeróbicos o anaerobios facultativos) que activa la oxidación del citocromo reducido por el oxígeno molecular, el que a su vez actúa como aceptor de electrones en la etapa terminal del sistema de transferencia. El oxígeno molec:ular oxida un sustrato con la intervención del sistema de transporte de electrones. El oxígeno es el aceptor de hidrógeno &ai, produciendo a partir del hidrógeno, agua o peróxido de hidrógeno, según la especie bacteriana y sus sistema enzimático.

Esta prueba es útil para diferenciar colonias sospechosas de Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio y Campylobacter, entre otros microorganismos oxidasa positivos de Enterobacterias (oxidasa negativos).

La prueba de oxidasa utiliza ciertos reactivos colorantes como el Diclorhidrato de N-N-dimetil-p-fenilendiamina (CSH12N:2.2HCI) que actúa como aceptor artificial de electrones sustituyendo al oxígeno. La p-düeniidiamina es incolora en un estado reducido, pero en presencia del citocromooxidasa y oxígeno atmosf&¡co, oxida el reactivo formando un compuesto coloreado, el indofenol. Si el reactivo oxidasa se prepara con -naftol, se forma ani1 de indofenol; sin embargo, el - d o l no es necesario para que tenga lugar la reacción. (17)

PRUEBA DE HLO MüCOíDE:

Esta prueba se basa en la formai:ión de un hilo o pequeña cuerda al mezclar y agitar células con una gota de Desoxicolato de sodio al 0.5%, Pot la capacidad que tiene el DNA del V. cholerae y otros microorganismos de desdoblarse al contacto con dicho reactivo.

La prueba debe realizarse en el transcurso de 30 segundos y no más para evitar resultados falsos.

FUNDAMENTO DE Li4S PRUEBAS SEROLOGICAS.

IDENTIFICACIÓN SEROLOGICA PARA Vibrio choferae.

El grupo antigénico O grupo 1 de Vibrio cholerae tiene tres serotipos, cada uno contiene un factor antigénico, cuadro A-2.

CUADRO A-2. FACTORES AJ'4TIGEMCOS DE LOS SEROTIPOS DE Vibrio cholerae

SEROTIPO FACTOR ANTIGENIC0

haba AC Ogawa AB

Para la identificación de cada sierotipo se emplean antisueros que contienen anticuerpos específicos para cada uno de los factores anteriores y la prueba se basa en una simple aglutinación.

Una aglutinación positiva usando un antisuero polivderite constituye una identificación pmsuntiva de Vibrio cholerae, en presencia de resultados tipicos de pruebas bioquúnicas.

Los cultivos que presenten aglutinación positiva con antisuero polivalente, pueden ser usados para la prueba con antheros monovdentes especfficos como: Ogawa e haba.

INTERPRET ACION:

a) Cuando la aglutinación ocurra debe ser inmediata y completa. b) Aglutinación en el control d i o indica que el cultivo es insatisfactorio

Casa abierta al tiempo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA CAI-UD SERVICIO SOCIAL

ES.Cbs 781.95

LIC. JULIO DE LARA ISASSI COORDINADOR DE SISTEMAS ESCOLARES PRESENTE.

Por medio de la presente se hace constar clue el alumno cuyos datos se describen a continuación, concluyó su Servicio Social:

NOMBRE: LEÓN MELGAREJO MARTHA PATRICIA

MATRbJLA: a m m a LICENCIATURA: INGENlERiA BlOQU¡MiCA INDUSTRIAL

PROYECTO: IDENTIFICACIÓN Y SOBREVIVENCIA DE VIBRIO CHOLERA EN APIO (APIUM GRAVEOLENS)

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, a los quince días del mes de Diciembre de mil novecientos noventa y cinco.

Atentamente, "Casa Abierta al Tiempo"

M. kN C. ROSAURA GRETñER(doNZÁLE;Z DIRECTORA

*LPO

UNIDAD IZTAPALAPA Av. Michoacán y La Purísima lztapalapa 09340 Mexico, D.F. A.P. 55-535 Fax: (5) 612-80-83 Teis. 724-46-81 y 85

.< , .<I ..-_.I, .. . .. ..

Casa abierta al tiempo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD SECRETARIA ACADEMICA

SS.cbs.826.96

A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio d e l a presente s e hace constar que el ( l a )

d e l Departamento de BIOTECNOLOGIA de l a División d e Ciencias Biológicas y de l a Salud, asesoró e i siguiente Servicio social:

M. EN C. CARLOS VAZQUEZ SALINAS

TITULO: IDENTIFICACION Y SOBREVIVENCIA DE VIBRIO CHOLERA A P I O (APIUM GRAVEOLENS)

ALUMNO ( S ) : LEON MELGAREJO MARTHA PATRICIA

LICENCIATURA: INGENIERIA BIOQUIMICA INDUSTRIAL

PERIODO: MAYO 19, 1994-OCTUBRE 9 , 1995

Se extiende l a presente para l o s fines que a l inte- resado convengan, en l a Ciudad de México, D.F., a - l o s días d e l mes d e d e mil novecien - tos noventa y seis.

A t e n t a m e n t e

"CASA ABIERTA AL TIEMPíl"

enero

Rodriquez A. Div. CBC

*LPC UNIDAD IZTAPALAPA

Av. Michoocán y La Purisinia Irtapalapa 09340. Mrixico. D. F. A.P. 55-535 Fax: l5)6i2-üo-ü3 Tels. 724-4581 y 85 , < , ,.- .."* -..v.,, .l,.. (,,.. ".,_*,

México D.F a 9 de octubre de 1995.

M en C. ROSAURA GRETHER GONZALEZ DIRECTORA DE LA DlVlSldN DE CIENCIAS BI0LC)GICAS Y DE LA SALUD DE LE\ UAM-I PRESENTE

Por medio de la presente, hago constar que la alumna Martha Patricia León Melgarejo con número de matricula 87241458 en la E#aqwlmica Indumal, conciuyo scrti$factorlamente BU pmyW0 expWmtM titulado " Identiftcacibn y Sob-vlvehda de W f o C ~ W T ~ ~ ~ I Y @putti grweofens)", el cual estuvo a mi cargo.

Así mismo manifiesto mi conformidad con et contenido del informe presentado al término de dicho proyecto,

Sin más por el momento me despido de usted y agradezco la atención prestada a la interesada.

ATENTAME$E: ,

M en C. Carlos Vázquez Salinas