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Caracterización morfoanatómica de semillas de anón ( Annona squamosa L.)
y evaluación de algunos parámetros fisiológicos del proceso de germinación
y latenciaTesis de investigación presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias Agrarias, Área Fisiología de Cultivos
Fabio Ernesto Martínez Maldonado
Director:Ph.D. Diego Miranda Lasprilla
Codirector:Ph.D. Stanislav Magnitskiy
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INTRODUCCIÓN• Árbol semicaducifolio de porte bajo
o arbusto de 3 a 7 m de altura• Globosos-oviformes, acorazonada,
5 a 12 cm diámetro, peso de 200 a800 g
• Semillas negro-lustrosas o café-oscuras, de 1,25 cm de longitud yconstituyen entre el 31% y 41% deltotal del fruto
• Diminuto y poco desarrolladoembrión. Incrustado en unabundante endospermo
(CABALLERO, 1779)
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El anón en Colombia
• Plantas en estado silvestre.
• Cultivos poco desarrollados.
• Desaparición paulatina de la especie.
• Dificultades en procesos de propagaciónsexual.
• 30, 50 y 90 días. PG = 1 - 3,8% en unperíodo de 63 días.Fuente: (Cruz, 2002), (Guerrero y Fisher, 2007).
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• Tolerante a estrés (investigación, patrones).
• Alta demanda en mercado nacional ($4.000/kg).
• Potencial de mercado en el exterior.
• Interés de la Corporación Colombia Internacional yexportadoras.
• Frutos exóticos de origen tropical.
• Subexplotadas en Colombia.
• Ventajas comparativas.
• Desarrollo de Técnicas de producción.
• Mejorar potencial germinativo de la especie.
• Conservación: almacenamiento de semillas a largoplazo.
• Progresiva eliminación de individuos (Guerrero yFisher, 2007).
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OBJETIVOSDescribir las características morfoanatómica de semillas de anón (Annonasquamosa L.) y evaluar algunos parámetros fisiológicos del proceso degerminación y latencia.
Específicos:
• Realizar una descripción anatómica de las semillas de Annona squamosa L.
• Describir los cambios morfoanatómicos y en el contenido de carbohidratos,proteínas y actividad peroxidasa durante la germinación de semillas de anón(Annona squamosa L.).
• Caracterizar el fenómeno de latencia en semillas de anón (Annona squamosaL.) mediante la aplicación de diferentes tratamientos pregerminativos.
• Evaluar el efecto del almacenamiento sobre la germinación, contenido deproteína y carbohidratos solubles en semillas de anón (Annona squamosa L.).
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Anatomía de semillas de Annona squamosa L.
(Annonaceae )
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INTRODUCCIÓN: Semillas de anonáceas
• Sésiles, albuminosas, elipsoides, macizas y su longitudvaría entre 5 y 30 mm.
• “El carácter ruminado de las semillas y sus embrionesdiminutos son caracteres de identificación de la familia”Barroso et al. (1999).
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• Estudios Filogenéticos y ecológicos.
• Pocos estudios germinación de semillas.
• Estudios anatómicos de semillas son muy escasos: Corner(1949).
• Características anatómicas ayudan a comprenderfenómenos de latencia y germinación en anón.– Tegumento resistente e impermeable– Embriones rudimentarios
• Realizar una descripción anatómica de las semillas deAnnona squamosa L.
Fuente: Garwood (1995).
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METODOLOGÍA
• Proyecto del Banco Colombiano deGermoplasma de Anón
• Semillas de A. squamosa L. obtenidasde frutos colectados de las accesionesC2AS224, C2AS225 y C2AS226.
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• Protocolo de Sandoval (2005) adaptado y modificado.
Etanol al 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96% y terbutanolx 24h
Embriones, testas y endospermo fénol 50% x 24h, S. Bouin x 48h
25% de parafina – 75% Ter-butanol, b). 50% de parafina – 50% Ter-butanol, c). 75% de parafina – 25% Ter-butanol y d). 100% parafina.
Bloques, diamantadoácido clorhídrico al 50%
7 µm en el micrótomobaño de flotación a 50°CDesparafinado 60°C durante 24 horas
safranina 24 horas, OH pícrico, amoniacal, etanol al 96%, FastGreen 10 seg, clavo, isopropanol, xilol
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RESULTADOS
1
4
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RESULTADOS
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Cubierta seminal
� Mesotesta: dos capas.� Pericalaza� hipodermis
Ex exotesta; Mt mesotesta; Etendotesta; Hyp hipodermis; Epepidermis; Fl fibras longitudinales; Ftfibras transversales; Ei epidermisinterna. Pc pericalaza; Tv tejidovascular.
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� Endotesta y Tegmen: Ruminación.
Rm ruminación, Et endotesta, Mt mesotesta, Ext exotesta F fibras, Ft fibras transversales, Endendospermo, Hyp hipodermis, Tgtegmen
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Tg
Et
Et
En
Id
20 µm 50 µm
20 µm
A B
C
Tg
Tg
� Tegmen colapsado� Idioblastos
Tg tegmen, Et endotesta, En endospermo, Id idioblasto.
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Edt
Et
Aer
Edt
Pm
Lf
300 µm
200 µm
300 µm
50 µm
A B
C D
Pm
Cn
Cn capa nucelar, Edt endostoma, Et endotesta, Lf línea de fractura, Aer aerénquima, Pm plugmicropilar.
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Endospermo
Em endospermo micropilar,Rm ruminaciones, Id
idioblastos, Nu nucela, Os
oleosoma.
� Ruminado
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Embrión
Rd radicula, Hc hipocotilo, Ep epicotilo, Ct cotiledones, Pc procambium, Mac meristemo apical caulinar.
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CONCLUSIONES• Las características anatómicas de la cubierta seminal, el endospermo y el
embrión corroboran los datos reportados en la literatura para la familiaAnnonaceae.
• Integumento externo: exotesta, mesotesta (dos capas ) y endotesta.
• Pericalaza: asociación de células parenquimatosas y vasculares.
• Plug micropilár: tejido endotestal menos empaquetado, línea de fractura
• Endotesta: mayor participación en la formación y constitución de losórganos de la semilla, apariencia ruminada del endospermo.
• Endospermo ruminado, células de diferentes formas y contenidos,voluminosas e isoradiométricas, idioblastos.
• Embrión subdesarrollado.
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Cambios morfoanatómicos y en el contenido de carbohidratos,
proteínas y actividad peroxidasadurante la germinación de semillas
de anón ( Annona squamosa L.) (Annonaceae )
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INTRODUCCIÓN• Inexistencia de información sobre aspectos fisiológicos y
bioquímicos del proceso de germinación de A. squamosa L.
– Germinación en 1 o 2 etapas.
– Recursos emplea para germinar (metabolismo de azucares)
– Cambios morfológicos.
• Entender el rol de azucares y proteínas en las etapas degerminación. Metabolismo de la semillas de anón.
• Describir los cambios morfoanatómicos y en elcontenido de carbohidratos, proteínas durante lagerminación de semillas de anón (Annona squamosaL.).
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Preparación del material
Análisis morfológico y determinación de sacarosa, glucosa, fructosa, proteína y actividad enzimática peroxidasa
1. 4.
2. 5.
3. 6.
Azúcares solubles totales: dos diferentes estados de crecimiento de radícula: longitud > 3 mm, y > 10 mm
Germinación
� turba rubia sin nutrientes
� profundidad doble de su longitud
� fitotrón 30 días a una temperatura de 35 °C,
� ausencia total de luz (Ferreira et al., 1997).
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Métodos empleados
• Análisis anatómico : Sandoval (2005) modificado. Laboratorio deMicrobiologia, Facultad de Agronomía. UNAL.
• Laboratorio de Fisiología y Bioquímica, Departamento de Biología.UNAL.– Carbohidratos solubles totales: Colorimetría. Método fenol-
sulfúrico (Dubois et al. 1956).
– Sacarosa, glucosa y fructosa: Análisis por HPLC. HPLC WATERScolumna Phenomenex Ca++ Monosacharide de 30cm X 8mm,autosampler, horno y detector de índice de refracción. fase móvil fueagua tipo I.
– Proteína: Método de Bradford (1976) y Zor y Selinger (1996).
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A – D = 3 mm; E- F= 4 mm; G= 2 mm; H=7 mm.
10 y 15 días de incubación
15 y 20 de incubación
Arabidopsis thaliana L., Lepidium sp., Chenopodium sp., Nicotiana y Petunia, Trollius sp.
RESULTADOS: ETAPAS DE GERMINACIÓN DE LAS SEMILLAS DE A. squamosa L.
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Sección longitudinal de embrión, endospermo micropilar y p lug micropilar enel proceso de germinación.
Semilla madura y primera etapa de germinación.
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Formación de raíces laterales en semillas con protrusión deradícula.
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Cambios morfológicos en el endospermo
Cambio en forma y volumen en imbibición y ruptura de la testa, endospermo pronunciado.
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Cambios en la concentración (ug/mg de materia fresca) deazúcares solubles en embrión y endospermo de A. squamosa L.
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Cambios en la concentración (ug/mg materia fresca) de sacarosa (A), Glucosa (B) y Fructosa (C) en embrión y endospermo
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0
2
4
6
8
10
12
14
No germinada Sem. imbibida Rup. de testa Protr. de radicula
Pro
tein
a (
mg
/g m
ate
ria
fre
sca)
Cambios en los contenidos (ug/mg materia fresca)de proteína en semillas de A. squamosa L.
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Durante el proceso de germinación se observa que:
Semillas sin germinar Imbibición Ruptura de testa Ruptura de endospermo
Disminuye concentraciónIncrementa concentración
Estable
Embrión
Endospermo
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CONCLUSIONES• La semilla de anón presenta germinación en dos etapas
consecutivas: rompimiento de testas y protrusión de la radícula.
• El marcado uso de azúcares solubles, sacarosa y proteína indicansu rol clave en el crecimiento del embrión. El endospermo mantieneniveles estables azc totales.
• Crecimiento post germinativo no se presenta mayor variación en losniveles de azúcares solubles totales en el embrión ni en elendospermo.
• En la post-germinación se presenta la formación e inducción deraíces laterales. Estas se producen en la raíz primaria de formaendógena a partir del periciclo.
• El cambio visual en forma, se inicia en la ruptura de la testa y en elcomienzo de la segunda etapa de germinación.
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Caracterización del fenómeno de latencia en semillas de anón
(Annona squamosa L.) (Annonaceae ) mediante la
aplicación de diferentes tratamientos pregerminativos
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INTRODUCCIÓN• Latencia morfológica.
• Latencia física.
• Tegumento resistente e impermeable.
• Efecto positivo de GA.
• Latencia no se debe a la impermeabilidad alagua.
• Escarificación con lija aumenta el porcentajede germinación (75%) y la velocidad deemergencia en semillas.
Fuente: Colauto et al. (2003), Lobo et al., (2007), Sousa et al.,(2008),
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Tratamientos pregerminativos• Promoción química: GA, Citoquininas, Etileno,
auxinas, etileno, H2O2, KNO3,
• Estratificación
– Cálida (22 a 30 °C)
– Fría (0 a 10 °C)
• Escarificación: Mecánica, química, agua.
• Preimbibición
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• Germinación pobre, impredecible y altamente variable.
• Largos periodos de germinación.
• Exhiben algún tipo de latencia.
• Estudio realizados en otras latitudes.
• Limitaciones para establecimiento de cultivo de la especievía sexual.
• Caracterizar el fenómeno de latencia en semillas deanón (Annona squamosa L.) mediante la aplicaciónde diferentes tratamientos pregerminativos.
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METODOLOGIA
• Proyecto: “Establecimiento del banco de germoplasmaColombiano de Anón (Annona squamosa L.)” MADR.
• Material vegetal:– Apulo, Cundinamarca: 670 msnm, 25°C, HR 85%– Castilla, Coyaima, Tolima: 341 msnm, 29°C, HR 70%
• Extracción y desinfección de semillas
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T° amb.:media: 18,7; máxima: 22,9; mínima: 17,3
Tratamientos
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Análisis de datosT° de germinación y efecto de tratamientos
ni = número de semillas germinadas en la iésima toma de datosti = tiempo (en días) de la iésima toma de datosK = Tiempo (en días) de duración de la prueba de germinaciónN = número de semillas germinadasNs = número de semillas totalesfi = frecuencia relativa de germinación
� Supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas SAS®� Función arcosen √(PG/100), (Wagner et al., 2006). � ANAVA y Tukey (P<0,05).
Modelo logístico:� �
�
�������
K máximo valor que alcanza la variable, A productoentre el valor inicial “a” por el máximo “K”, B es unparámetro de escala sobre el tiempo t que influenciala tasa de crecimiento.
Curvas de imbibición, temperatura y aplicación de ácido giberélico
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RESULTADOS: Temperatura de germinación
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Efecto de testa y temperatura sobre absorción de agua
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Efecto de la escarificación mecánica
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Efecto del GA3 sobre los patrones de germinación
GA3 0 mg/kg �70,348
1 − 14,05e�−0,14X� R2=0,99272 GA3 200 mg/kg �
87.6346
1 − 2.273e�−0.21X� R2=0.9756
GA3 50 mg/kg �78.7976
1 − 7.220e�−0.25X� R2=0,97243 GA3 400 mg/kg �
100.423
1 − 1.412e�−0.10X� R2=0.99292
GA3 100 mg/kg �103.45
1 − 1.508e�−0.09X� R2=0.98739 GA3 600 mg/kg �
95.138
1 − 2.389e�−0.25X� R2=0.98012
GA3 800 mg/kg �88.4138
1 − 1.202e�−0.15X� R2=0.97761
PG Max= 95% a los 24 díasPG (5dias) = 57%
PG Max= 59,3% % a los 30 díasPG (5dias) = 9,6%%
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Efecto del GA3
B
D
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Efecto de la estratificación caliente
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CONCLUSIONES• Las semillas dependientes de la temperatura para su
germinación. 35°C puede considerarse temperatura optima.
• Las testas de A. squamosa L. no presentan un impedimento ala absorción de agua.
• La eliminación completa de testa incrementó el potencial degerminación.
• GA3 exógeno, efectivo para el rompimiento de latencia de lassemillas de A. squamosa L.
• Las semillas de A. squamosa L. presentan latencia detipo endógena (fisiológico y morfológica) y exógena(mecánica).
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Efecto del almacenamiento sobre la germinación, contenido de proteína
y carbohidratos solubles en semillas de anón ( Annona squamosa L.)
(Annonaceae )
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INTRODUCCIÓN• Comportamiento ortodoxo.
• Respuestas positivas al almacenamiento a temperaturaambiente.
• No influencia del almacenamiento sobre la germinación.
• Latencia inducida por la inmadurez embrionaria puede sersuperada con el almacenamiento.
Fuente: Pulécio (2012), Pinto et al. (2005).Dornelles et al. (2002).
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• Desconocimiento del efecto de la condición dealmacenamiento sobre calidad fisiológica e las semillas.
• Inexistentes recomendaciones o pautas paraalmacenamiento comercial o establecimiento de bancosde germoplasma.
• Importante determinar las condiciones óptimas.
• Evaluar el efecto del almacenamiento sobre lagerminación, contenido de proteína ycarbohidratos solubles en semillas de anón .
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METODOLOGIA• Extracción y desinfección de semillas.
• Apulo, Cundinamarca: humedad inicial 10 -12%.
• Castilla, Tolima: humedad inicial 12 -14%
• 30, 60 y 120 días en bolsas de papel craft:– Cuarto frio (CF) a 4°C y HR= 79 - 90%– Refrigerador (R) a 10 °C y HR= 79 - 90%– Condición ambiental (CA) a 18,7°C y HR= 59,5 %
• PG, VMG y TMG.
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Determinaciones Bioquímicas
– Sacarosa, glucosa y fructosa:• Solo en semillas del Tolima, (0 y 120
días).
– Proteína: En cada periodo y condición dealmacenamiento.
• Método de Bradford (1976) y Zor ySelinger (1996).
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RESULTADOS: Humedad de las semillas durante el almacenamiento
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Germinación y contenido de proteína durante el almacenamiento de las semillas
A B
C D
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Cambios en el contenido de azúcares (ug/mg materia fresca)durante el almacenamiento de las semillas
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CONCLUSIONES
• El almacenamiento a condiciones ambientales durante 60 y120 DIAS mejora la respuesta de germinación y presentalas mayores concentraciones de sacarosa y fructosa.
• Durante almacenamiento en condición ambiental sepresentó una superación de forma natural de la latenciapresente.
• El almacenamiento en CF y en R no afecta, no hay efecto elpotencial germinativo de las semillas. Limita la superaciónde la latencia presente.
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CONCLUSIONES GENERALES
• Annona squamosa L. presenta semillas con latenciaexógena y endógena, la cual puede ser superada conla eliminación de testas, GA exógeno y con elalmacenamiento a corto plazo en condiciónambiental.
• La germinación se presenta en dos etapas en lascuales sacarosa, glucosa, fructosa y proteína sonrequeridas para el crecimiento del embrión.
• Las semillas presentan embriones subdesarrollados,testas en tres capas permeables al agua yendospermo ruminado.
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AGRADECIMIENTOS• A mi familia: Por llenarme de momentos felices, por apoyar cada uno de mis
movimientos e ideas. • A mi director de tesis, Diego Miranda Lasprilla por todo su apoyo, paciencia y
dedicación y por contribuir en mi formación profesional.• A la profesora Luz Marina Melgarejo, por su apoyo y confianza.• Al profeso Stanislav Magnitskiy, por su orientación.• A María Fernanda Díaz y hermana y amiga, por su amistad y apoyo incondicional en
este trabajo• A Miguel Romero, hermano y amigo eterno, por su abnegada amistad y apoyo
incondicional en este trabajo.• A Jennifer Blanco, por sus aportes a mi vida. Por compartir su vida conmigo.• A Diana Obregón, Liliana Castañeda, Julián Cárdenas, Carlos Carranza, Enrique
Balaguera, Natalia Moreno, Lina Pulécio, Mafe Patiño, Edward Martínez, Sandra crespo por su amistad, confianza y apoyo.
• A los profesionales y amigos del laboratorio de Fisiología y Bioquímica, Biología.• A mi Alma Mater, la Universidad Nacional, sus trabajadores, docentes y estudiantes
por haberme dado la oportunidad de construirme, por su maternalismo y por enseñarme a ser quien debo ser.
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Gracias!
Las ciencias naturales son una de las armas del
hombre en la lucha por su libertad.
Mao Tse Tung
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METODOLOGIA (Anexo 1)
Etanol al 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96% y terbutanolx 24h
Embriones, testas y endospermo fénol 50% x 24h, S. Bouin x 48h
25% de parafina – 75% Ter-butanol, b). 50% de parafina – 50% Ter-butanol, c). 75% de parafina – 25% Ter-butanol y d). 100% parafina.
Bloques, diamantadoácido clorhídrico al 50%
7 µm en el micrótomobaño de flotación a 50°CDesparafinado 60°C durante 24 horas
safranina 24 horas, OH pícrico, amoniacal, etanol al 96%, FastGreen 10 seg, clavo, isopropanol, xilol
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Semillas de anonáceas (Anexo 2)
• Ovulo anátropo• Pericálaza• Nucela ruminada transversalmente
(pliegues de los integumentos), lasruminaciones son en su mayoríatransversales
• Micrópilo formado por el endostoma.• Endospermo ruminado (Corner, 1949;
Garwood, 1995; Judd et al. 1999)
• Testa es fibrosa y consiste de fibrasoblicuas y longitudinales
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RESULTADOS: Determinación de viabilidad
A B
C
D
A
B C
nv
Figura 3-2. Cortes evaluados en la prueba deviabilidad de semillas de anón. A, semilla sin cubiertaseminal. B, corte transversal. C, corte longitudinalventral. D, corte longitudinal dorsal.
Figura 3-3. Patrones de tinción delembrión en la prueba de viabilidad desemillas de anón. A, embriones viables.B, tinción incompleta, embrión viable. C,comparación embrión viable y noviable. nv no viable.
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RESULTADOS: Curva de secado
Figura 3-4. Curva de secado de semillas de anón, para las localidades de Apulo, Cundinamarca y Castilla, Tolima
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0,00000
0,01000
0,02000
0,03000
0,04000
0,05000
0,06000
No germinada Sem. imbibida Rup. de testa Protr. de radicula
UA
E P
OD
(Δ
A4
60
/Δm
in*m
g p
rot)
Figura 2-9. Cambios en la actividad enzimática peroxidasa (Δ A460/Δmin*mg prot.) en semillas de A. squamosa L. en: semillas sin germinar (No germinada); imbibición por 72 horas (sem. Imbibida); Etapa I de germinación: ruptura de testa (Rup. de testa); Etapa II de germinación: protrusión de radícula (Protr. de radicula). Imbibición en agua por 72 horas y posterior incubación para germinación a 35°C y HR de 60% en turba húmeda. Barras verticales indican error estándar (±); n=4.