CARACTERÍSTICAS DE LOS CULTIVOS (CRECIMIENTO).

Uno de los principales distintivos de las bacterias es el aspecto resultante del crecimiento

en diversos medios (características de crecimiento), y caracteristicas como el Color

(cromogénesis), la abundancia del crecimiento, y aun el olor del cultivo, proporcionan

todos ellos indicios para la identificación de un cultivo desconocido.

Para determinar las características de crecimiento de un cultivo puro es costumbre

observar los siguientes tipos de cultivo.

Los aspectos del crecimiento que se pueden observar en cada uno de los medios son los

siguientes:

1) Colonia en placa de agar: (cultivos en placa).

Tamaño. El tamaño de las colonias alcaza desde el sumamente pequeño, que solo mide una

fracción de mm, hasta las grandes colonias de 5 a 10 mm de diámetro.

Margen o borde. La periferia de las colonias bacterianas presenta formas muy diferentes,

según las especies. Puede ser circular lisa, o presentar irregularidades como lóbulos

redondos, muestras irregulares, proyecciones filamentosas o rizoides.

Elevación. Las colonias pueden ser muy planas (aplastadas) o espesas (elevadas). Las

colonias elevadas ofrecen varios grados de convexidad superficial.

Cromogénesis o pigmentación. Pueden ser coloreadas (pigmentadas) o no pigmentadas.

Los diversos tintes rojo, amarillo, pardo y violeta, caracterizan ciertas especies.

Caracteres ópticos. Opacas, translúcidas, u opalescentes.

Colonias en agar nutritivo

Forma:

Elevación:

Borde:

2) Crecimiento en estrías sobre agar (Inclinado).

Cantidad. Escasa, moderada, o abundante,

Margen o borde de crecimiento. Uniforme o liso, o presentando irregularidades

semejantes a las de las colonias en placas de agar.

Consistencia o coherencia del crecimiento. Butirosa o mantecosa, que se retira

fácilmente con el alambre; viscosa o fibrosa; seca y quebradiza.

Cromogénesis o pigmentación. Semejante a la descrita en colonias en placas de agar.

Crecimiento en agar inclinado.

3) Crecimiento en caldo nutritivo.

Valor del crecimiento. Escaso, moderado o abundante.

Distribución del crecimiento en el caldo. Uniformemente distribuido (igualmente turbio); limitado a la superficie del caldo, cómo velo o película; acumulado en sedimento, granuloso o viscoso.

Olor. Pútrido; de frutas o aromático; o imperceptible.

Crecimiento en caldo.

4) Crecimiento de picado en gelatina.

Crecimiento (sin licuefacción) a lo largo de la línea de picadura. El crecimiento

puede estar limitado a la línea de inoculación, o puede presentar varios grados de

propagación de esta línea.

Licuefacción de la gelatina. Puede avanzar por igual desde la superficie, o presentar

diversos aspectos infundibuliformes de licuefacción del medio.

Crecimiento de picado en gelatina.

Línea de picadura Licuefacción

Una de las características más llamativas en los cultivos es la cromogénesis o pigmentación.

No todas las bacterias presentan este distintivo. En algunas de las bacterias cromógeneas, el

pigmento queda retenido dentro de la célula y se colorea sólo la masa de células bacterianas,

mientras que en otros el pigmento se segrega al exterior y aparece coloreado el medio

La intensidad de la pigmentación depende de la composición del medio de cultivo y las

condiciones de incubación,

Algunas especies bacterianas comunes que produce y retienen intracelularmente los

pigmentos son las siguientes:

Serratia marcescens Chromobacterium violáceum Staphylococcus aureus Sarcina lútea Micrococcus flavus Micrococcus niger

Rojo

Violeta

Amarillo oro

amarillo limón

amarillo

Pardo o negro

Entre las especies bacterianas comunes que producen pigmento y lo segregan al medio

se encuentran:

Pseudomonas chlororaphis. verdoso a amarillo

Pseudomonas fluorescens verdoso a pardo oliva

Pseudomonas aureaginosa verde, azul a pardo oscuro.

Una vez que la observación, del aspecto de los cultivos bacterianos (características de crecimiento) sugieren que puede ser un solo tipo de microorganismo, se deben efectuar

pruebas complementarias (bioquímicas) para confirmar esta suposición, así: como identificar el microorganismo especificado; pero las características del cultivo han dado una pista en cuanto al tipo de microorganismo de que se trata.

TÉCNICAS DE TINCIÓN.

Una de las herramientas principales para el estudio de las células es la tinción diferencial.

Una tinción es diferencial cuando 2 o mas reactivos se aplican para impartir color a la célula o sus partes especificas, mientras que una tinción simple implica la adición de un solo reactivo.

La acumulación gradual de gran número de pruebas citoquímicas ha hecho posible la identificación de los constituyentes de la célula. También se sabe desde hace tiempo que los aminoácidos y proteínas celulares reaccionan como bases y ácidos débiles con una gran variedad de materiales.

En otras palabras, las proteínas son sustancias anfotéricas; se pueden ionizar ya sea como

ácido o base.

La ionización es el proceso por el cual los átomos y moléculas adquieren carga eléctrica. La magnitud de la carga se indica con el signo + y -, que indican el tipo de carga.

La ionización es el resultado de la pérdida o ganancia de electrones, los cuales alteran la neutralidad eléctrica de la partícula, y un ión se define como un átomo o molécula con carga eléctrica.

Como las proteínas constituyen la mayor parte de los sólidos en la célula, ellas participan en la mayor parte de las reacciones de tinción. Para poder reaccionar exitosamente con una proteína, una tinción biológica debe ser capaz de ionizarse como ácido o base, además de producir coloración.

Generalmente estas sustancias se llaman colorantes básicos cuando muestran fuerte afinidad por las porciones acidas de la célula y colorante ácidos cuando presentan fuerte afinidad por las partes básicas dé la célula.

Muchas veces resulta conveniente usar una mezcla dé dos colorantes, uno ácido y uno básico, que tiñan de diferentes colores. Al tratar una célula con esta mezcla, los componentes ácidos aparecen de color diferente que las partes alcalinas de la célula.

Existen ciertas técnicas y procedimientos comunes para todos los estudios citológicos. Una de

estas técnicas trata de la preparación celular para ser observada.

Al hacer una preparación al microscopio, debe depositarse en el portaobjetos una capa de células lo suficientemente delgada para penetrar el paso de la luz a través de ella. En el caso de los microorganismos generalmente basta con un frotis de células microbianas para luego teñirlas. Puesto que las células son tan pequeñas, el objetivo se logra simplemente preparando una suspensión de células en agua y otro líquido; una gota de esta suspensión se extiende; sobre una área del portaobjetos y se deja secar, obteniendo así una delgada capa de células sin necesidad de usar aparatos especializados.

Cuando se desea hacer un frotis de un caldo de cultivo de microorganismos, el caldo se aplica directamente al portaobjetos sin dilución previa. .

Al prepara un frotis de un medio solidó, el problema a evitar es la presencia de demasiadas células. Para esto se toma del medio solidó una minúscula cantidad de material bacteriano el cual sé emulsifica en una gota de agua de la llave sobre la superficie del portaobjetos. Una vez seco el frotis., debe aparecer ligeramente blanquecino.

Una vez hecho el frotis hay que fijarlo, para asegurarse que las células no se desprenderán durante los repetidos lavados a que se somete el portaobjetos para teñir la preparación.

Durante la técnica de fijado, se intenta detener toda actividad enzimátíca en la célula antes de observarla al microscopio. Muchas si no todas las células poseen proteínas enzimáticas capaces de destruir gran parte de las estructuras intracelulares después de la muerte de las células, por lo que si la célula no ha sido fijada adecuadamente antes de teñirse la acción destructora de estas enzimas impedirá la apreciación de todo detalle.

El calor además de inactivar las enzimas, ayuda a adherir las células al portaobjetos, minimizando así la pérdida de células durante el proceso de tinción.

La técnica de gota pendiente se utiliza con frecuencia cuando se desea determinar la capacidad de un microorganismo para desplazarse con locomoción propia. Aquí se observa el organismo en su estado natural, vivo y se puede ver si presenta algún tipo de locomoción propia.

De ordinario, las bacterias son tan pequeñas que debido a los choque con las moléculas en movimiento del agua circundante, y otras moléculas en solución, las células bacterianas rebotan ligeramente en función de la suma de los impactos recibidos.

Puesto que hay miles de millones de moléculas que chocan simultáneamente con la célula

bacteriana, está parece vibrar al azar. La bacteria no da la impresión de llevar dirección

definida, simplemente parece bailar dentro de un territorio dado. Por esto se dice que las

bacterias presentan movimiento Browniano.

Aunque hay que hacer notar que los organismos móviles, son los que presentan movimiento

propio, además del movimiento browniano). Muchos microorganismos cuentan con órganos de

locomoción que los capacita para moverse con dirección y sentido en un medio líquido. Es

posible observar como estos organismos giran y se tuercen y a menudo se desplazan

rápidamente por distancias relativamente grandes en el campo microscópico. Este tipo de

desplazamiento es la motilidad real.

Otro método para determinar la motilidad de un microorganismo es la siembra por picadura en un

medio semisólido (SIM). En éste las bacterias no móviles crecen solamente siguiendo la línea de

inoculación, en tanto que las móviles crecen rápidamente y se difunden por todo el medio.

El medio SIM tiene la ventaja de permitir la movilidad bacteriana por medio de la

producción de ácido sulfhídrico a lo largo de la línea de crecimiento y la formación de

indol (coloración rojo-purpúrea) después de cualquier período de incubación, en la

superficie del reactivo de Kovacs'.

La movilidad en este medio se observa por un crecimiento difuso ó turbidez lejos de la

línea de inoculación. Si el microorganismo es móvil, y produce H2S se notará un color negro

(turbidez), por el contrario, si el microorganismo no es móvil, la turbidez color negro, se

encontrará en la línea de inoculación.

La tinción bacteriana mas conocida es la de Gram, de carácter diferencial, llamada así en

honor a su inventor Dr. Christian Gram. Se emplea para distinguir entre un grupo de

microorganismos y otros. Usando esta técnica es posible clasificar todas las células en por lo

menos dos categorías. (Gram + y Gram -).

La tinción de Gram constituye el punto inicial del procedimiento de identificación de

microorganismos y se compone de 4 reactivos:

1) Cristal violeta, es generalmente el primer colorante primario de la serie gram, su

propósito es impartir color a todos los microorganismos en el frotis y puede ser sustituido

por Violeta de Genciana.

2) Yodo lugol o Yodo Gram, es el segundo reactivo y actúa como mordente (sustancia que

aumenta o refuerza la unión entre un colorante y un sustrato).

3) Acetona-Alcohol, esta solución se conoce como decolorante porque disuelve y arrastra

fuera de las células el colorante primario. Es una mezcla de acetona-alcohol 95%, en

proporción 30y 70% respectivamente. Muchos microorganismos retienen el cristal violeta

con gran tenacidad a pesar del decolorante. A estos se les llama Gram +.

4) Safranina, el cuarto reactivo dé la serie es un colorante rojo, el cual se aplica como

cotratinción. Aquellos microorganismos que se destiñeron con el decolorante, se han

tornado invisibles (incoloros) por eso es que para tornarlos visibles se emplea una

contratinción de diferente color qué el colorante primario. De manera .que se designa como

Gram -, a cualquier organismo que tome la coloración roja de la safranina. Este puede ser

sustituido por Fucsina básica. .

Gram + son los organismos que retienen el colorante primario a lo largo de todo el proceso,

y no toman el color de la safranina, simplemente porque ya han reaccionado completamente

con el cristal violeta. .

La edad del cultivo usado también determina los resultados finales de la tinción Gram. Es

sumamente importante mencionar que la tinción Gram da resultados válidos cuando se aplica a

cultivos nuevos, de 24 horas o menos. Una vez que el cultivo se incuba por mas de 24 horas,

muchas células gram positivas empiezan a perder su habilidad para retener el colorante primario.

Al envejecer, las células tienden a volverse gram negativas incluso las que eran gram positivas originalmente.

Para teñir los flagelos se usa un procedimiento diferente. El colorante se aplica junto con el

ácido tánico como mordente, el cual se adhiere a la célula y a los flagelos en capas sucesivas

hasta que la bacteria y los flagelos aumentan sus dimensiones. Esta tinción presenta muchos

inconvenientes, una de las cosas que hay que evitar es la presencia de materia orgánica ajena

a las células a teñir en el portaobjetos. El mordente tiene tremenda afinidad por cualquier

tipo de materia orgánica y por eso, teñirá intensamente cualquier rastro de desecho orgánico

presente en el portaobjetos, por lo cual es importante asegurarse de que este se encuentre

escrupulosamente limpio.