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Fundamentos de Inmunología Básica y ClínicaIván Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Sepúlveda C.,

Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C.Editorial Universidad de Talca, 2002

Capítulo 40

MÉTODOS INMUNOQUÍMICOS

Darwins Castillo A. y Carolina Valenzuela B.

1. Introducción2. Inmunoanálisis2.1.Inmunoanálisis con reactivos no mar-cados2.1.1. Reacción de precipitación2.1.1.1. Reacción de precipitación en medio líquidoa) Precipitación en tubob) Floculaciónc) Turbidimetríad) Nefelometríae) Precipitación de complejos inmu-nes solubles2.1.1.2. Reacción de precipitación en gela) Inmunodifusión dobleb) Inmunodifusión radialc) Inmunoelectroforesisd) Inmunofijacióne) Contrainmunoelectroforesisf) “Rocket” inmunoelectroforesisg) Inmunoelectroforesis cruzada obidimensional de Laurell

2.1.2. Reacción de aglutinacióna) Aglutinación directab) Aglutinación indirecta

c) Aglutinación pasiva2.1.3. Reacción con participación del complementoa) Fijación del complementob) Actividad hemolítica del comple- mento

2.2. Inmunoanálisis con reactivos marcados2.2.1. Inmunoanálisis fluorescentea)Microscopía inmunofluorescenteb) Inmunoanálisis de fluorescenciapolarizadac) Inmunoanálisis de fluorescenciaunida a enzimad)Citometría de flujo2.2.2. Enzimainmunoanálisis (EIA)a) EIA homogéneob) EIA heterogéneoc) Electroinmunotransferencia o“Western blot” o “Immunoblotting”

2.2.3. Radioinmunoanálisis (RIA)a) RIA en fase solubleb)RIA en fase sólidac)Detección inmunorradiométricapara antígeno

2.2.4. Quimiluminiscencia2.2.5. Bioluminiscencia

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RESUMEN

La base de los métodos inmunoquímicos es la unión del antígeno y/o hapteno con el anti-cuerpo, es una reacción específica, de alta afinidad y reversible. Está definida por una constantede equilibrio o de asociación intrínseca (K) que es una medida de fuerza de la interacción de lareacción para formar complejos estables.Los anticuerpos son proteínas relativamente estables, y sus reacciones con haptenos o

antígenos pueden ser estudiados en un amplio rango de condiciones. Las modificaciones en laconstante de asociación inciden en las fuerzas que estabilizan los complejos antígeno-anticuerpo(Ag-Ac). La reacción es dependiente de algunos parámetros como: temperatura, pH y fuerzaiónica del medio que deben considerarse al llevar a cabo un inmunoanálisis.Los inmunoanálisis pueden ser divididos en métodos que requieren de sistemas Ag-Ac no

marcados y marcados. La mayoría de los inmunoanálisis no marcados se basan en reaccionesinmunes secundarias (precipitación). Los inmunoanálisis marcados se basan en reacciones in-munes primarias (inmunoanálisis fluorescentes).En el inmunoanálisis con reactivos no marcados, la interacción de antígenos solubles

macromoleculares y anticuerpos específicos llevan a la formación de complejos, que en unarelación molar equivalente precipitan en solución (precipitación). Existe una reacción anómalallamada floculación, en que la precipitación se observa sólo en un rango muy estrecho de laproporción Ag/Ac. La interacción de antígenos particulados con sus anticuerpos específicos pro-ducen aglutinación. La turbidimetría y nefelometría determina niveles de antígeno o de anti-cuerpo en baja concentración, formando pequeños agregados que producen una turbidez quepuede ser medida por disminución y dispersión de la luz incidente, respectivamente.Los métodos de precipitación en gel detectan la presencia y/o concentración de antígenos

y/o anticuerpos por la formación de bandas, anillos o arcos de precipitado que corresponden acomplejos antígeno-anticuerpo en la zona de equivalencia (inmunodifusión doble,inmunodifusión radial, inmunoelectroforesis, inmunofijación, contrainmunoelectroforesis,“rocket” inmunoelectroforesis e inmunoelectroforesis cruzada).El inmunoanálisis con reactivos marcados se clasifica en homogéneo o heterogéneo y

puede ser de dos tipos competitivo y no competitivo. El inmunoanálisis fluorescente incluye lamicroscopía inmunofluorescente que corresponde a la tradicional inmunofluorescencia (IF)que es una técnica inmunohistoquímica o inmunocitoquímica que permite la localización deantígenos en células ó tejidos, y la detección y titulación de anticuerpos específicos; elinmunoanálisis de fluorescencia polarizada (FPIA) que es homogéneo y competitivo; elinmunoanálisis de fluorescencia unida a enzima (ELFIA) que es heterogéneo y puede sercompetitivo o no competitivo; y la citometría de flujo que permite medir la cantidad de anti-cuerpo monoclonal fluorescente unido en cada célula que atraviesa un láser e identificarla segúnsu tamaño y granularidad de acuerdo a la forma que deflecta o dispersa la luz del láser.El enzimainmunoanálisis (EIA) se basa en dos fenómenos biológicos: reacción

inmunológica (unión Ag-Ac) y la amplificación por reacciones químicas (enzima que actúa so-bre el sustrato). Se dispone de EIA homogéneo representado por el “enzyme-multipliedimmunoassay technique” (EMIT) que además es competitivo y de EIA heterogéneo, como el"enzyme-linked inmunosorbent assay" (ELISA) y el "microparticle enzyme immunoassay"(MEIA) que además son no competitivos. La electroinmunotransferencia combina laelectroforesis en gel SDS-poliacrilaminada y el enzimainmunoanálisis. El radioinmunoanálisis(RIA) utiliza antígeno o anticuerpo, generalmente marcados con isótopos como 125I o, eventual-mente, 131I y este inmunoanálisis puede llevarse a cabo en fase soluble o sólida.Finalmente existe el inmunoanálisis quimiluminiscente que utiliza la emisión de luz pro-

ducida en ciertas reacciones químicas de oxidación, como por ejemplo, la oxidación del luminoly el inmunoanálisis bioluminiscente que se basa en un sistema natural la D-luciferina/luciferasa,en que la luciferasa cataliza la oxidación de la D-luciferina en presencia de ATP y Mg+2 aoxiluciferina, con emisión de luz a 546 nm.

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1. INTRODUCCIÓN

La unión del antígeno (Ag) con el anticuer-po (Ac) es una reacción fundamental en la meto-dología inmunoquímica. En general, la mayoríade los antígenos son macromoléculas, especial-mente proteínas con una estructura completamenteestablecida en que regularmente no conocemos laidentidad, ni la conformación del determinanteantígénico que reacciona con el anticuerpo, ni elnúmero por molécula de Ag. Para comprender lareacción Ag-Ac y evitar reacciones complicadascon Ags macromoculares, en adelante se van aconsiderar reacciones de Acs específicos con mo-léculas de haptenos (Hp) simples.La producción de Acs contra Hp se obtiene

generalmente inmunizando animales con el Hpunido covalentemente a una proteína. La forma-ción de complejos específicos Hp-Ac puede serexaminados en detalle con sistemas relativamen-te simples y los anticuerpos que reaccionan sonfácilmente aislados e identificados.Como se ha señalado, la base de los métodos

inmunoquímicos es la unión del antígeno y/ohapteno con el anticuerpo. Esta reacción se carac-teriza por ser específica, de alta afinidad y rever-sible. Está definida por una constante de equili-brio o de asociación intrínseca (K) que es unamedida de la fuerza de interacción de la reacciónpara formar un complejo estable.

k Hp + Ac [Hp Ac] (1)

k'

k [Hp Ac]K= = (2)

k' [Hp] [Ac]

k : constante de asociaciónk': constante de disociación

K representa la afinidad intrínseca de un sitioactivo representativo del anticuerpo por un haptenoo ligando en término de concentración enequilibrio, que puede calcularse midiendo laconcentración de hapteno o ligando libre.Existen varios métodos para distinguir

hapteno libre (Hp) de hapteno unido (Hp-Ac),

como ultracentrifugación, "quenching" fluores-centes, y otros. Pero, el método que se utilizacorrientemente es el equilibrio de diálisis.En forma práctica, en el laboratorio se calcula

la constante de asociación intrínseca promedio(Ko) obtenida a través de la ecuación de Scatchard,que se define por la concentración de hapteno oligando libre requerida para ocupar la mitad delos sitios activos o de unión de los anticuerpos.De acuerdo a esta premisa, en la ecuación 2:

[Hp Ac] = [Ac], por lo tanto,

1Ko= [Hp]

La unidad de Ko es el recíproco de la concentra-ción, es decir, litro/moles.

Los anticuerpos son proteínas relativamenteestables y sus reacciones con haptenos o antígenospueden ser estudiados en un amplio rango decondiciones. Las modificaciones que se producenen la constante de asociación inciden en las fuerzasque estabilizan los complejos Ag-Ac. Por lo tanto,las características de la reacción es dependientede varios parámetros como: temperatura, pH yfuerza iónica del medio. Por ejemplo, un aumentode la temperatura puede afectar la interacción delanticuerpo con hapteno o antígeno que puededisminuir o no la constante de asociación y, por lotanto, modificar la afinidad. Sin embargo, lapráctica general es incubar la mezcla deanticuerpos y antígenos a 37ºC o a temperaturaambiente (aproximadamente 22º C).La unión del hapteno p-aminobenzoato con

el anticuerpo anti-p-aminobenzoato disminuyetanto con la reducción de pH de 7 a 4, como con elaumento de la concentración de cloruro de sodio(NaC1) desde 0,1 a 1 M. Sin embargo, idénticoscambios no afectan a la unión del hapteno 2,4-dinitroanilina (DNP) a su anticuerpo anti-DNP. Laexplicación se debería probablemente a que elgrupo COO- del benzoato interactúa con un grupocargado positivamente del sitio de combinaciónde los anticuerpos y que en cambio, en el grupoDNP las interacciones iónicas no son importantespara la unión con el sitio de su anticuerpo.

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2. INMUNOANÁLISIS

Los inmunoanálisis son actualmenteherramientas de amplio uso en los laboratoriospara medir diferentes analitos biológicos, debidoa su facilidad de trabajo, como en la obtención deresultados sensibles y específicos.Los inmunoanálisis pueden ser divididos en

métodos que requieren de sistemas Ag-Ac nomarcados y marcados. La mayoría de losinmunoanálisis no marcados se basan enreacciones inmunes secundarias, como porejemplo, precipitación y aglutinación. Se midenpor métodos cuya base es la dispersión de la luz opor recuento de partículas o células Losinmunoanálisis marcados se basan en reaccionesinmunes primarias, como por ejemplo, inmunoa-nálisis fluorescente y enzimainmunoanálisis.

2.1. Inmunoanálisis con reactivos no marcados

La interacción de antígenos solublesmacromoleculares (polivalentes) y anticuerposespecíficos llevan a la formación de complejos

(Ag-Ac) con relación variable de Ag o de Ac, quefrecuentemente llegan a ser insolubles y precipitanen solución. Esta se conoce como reacción deprecipitación que es dependiente de la relaciónmolar Ag y Ac. La formación de complejos dehaptenos o de pequeños antígenos univalente consus anticuerpos son solubles. La interacción deantígenos particulados, como microorganismo océlulas con sus anticuerpos específicos producenla reacción de aglutinación. En la tabla 40-1 semuestran los métodos de inmunoanálisis conreactivos no marcados.

2.1.1. Reacción de precipitación

2.1.1.1. Reacción de precipitación en mediolíquido

a) Precipitación en tubo. La precipitación en tuboes un procedimiento que no se usa corrientementeen el laboratorio, pero que es necesario conocerpara apreciar las características generales de lareacción de anticuerpo con antígeno de alto pesomolecular en medio líquido. En forma práctica se

Tabla 40-1. Inmunoanálisis con reactivos no marcados

Reacción de precipitaciónEn medio líquido

Precipitación en tuboFloculaciónTurbidimetríaNefelometríaPrecipitación de complejos inmunes solubles

En gelInmunodifusión dobleInmunodifusión radialInmunoelectroforesisInmunofijaciónContrainmunoelectroforesis“Rocket” inmunoelectroforesisInmunoelectroforesis cruzada o bidimensional de Laurell

Reacción de aglutinaciónAglutinación directaAglutinación indirectaAglutinación pasiva

Reacción con participación del complementoFijación del complementoActividad hemolítica del complemento

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realiza en una batería de tubos que contienen unvolumen fijo de antisuero (concentración fija deanticuerpo) a los que se les añade diferentesconcentraciones de antígeno, midiendo la proteínatotal del precipitado formado y detectando elexcedente de Ac o de Ag en el sobrenadante.Como se muestra en la figura 40-1, a una

concentración definida de anticuerpos, la cantidadde complejo Ag-Ac precipitado aumenta con lacantidad de antígeno añadido hasta un valormáximo, que sobrepasándolo lleva a unadisminución progresiva de la precipitación. Seproduce precipitación de una cantidad máxima deanticuerpos por una cantidad óptima de antígeno.

Figura 40-1. Curva de precipitación para un complejo específico Ag-Ac.

En la curva de precipitación se encuentra unazona de exceso de anticuerpos, el sobrenadantecontiene anticuerpo libre, una zona de exceso deantígeno, el sobrenadante contiene antígeno librey una zona de equivalencia o punto de equivalen-cia, el sobrenadante está libre de anticuerpo yantígeno libre.Es importante tener presente que en las zo-

nas de exceso de anticuerpos y de antígenos sedetectan complejos inmunes solubles. En la zonade exceso de antígeno los sobrenadantes contienencomplejos solubles de varias composiciones comoAg4 Ac3, Ag3 Ac2 y Ag2 Ac. En el extremo deesta zona los complejos que principalmente seforman son Ag2 Ac que se atribuye a los dos sitiosactivos o a la divalencia de la molécula de anti-cuerpo IgG. Este fenómeno es explicado de

acuerdo a la teoría del enrejado (“lattice theory”)de Heidelberger, Kendall y Marrack. Ellossugirieron que la precipitación puede serconsecuencia del crecimiento del agregadoantígeno-anticuerpo de tal manera que la moléculadel antígeno se une a más de una molécula deanticuerpo y cada molécula de anticuerpo se unea más de una de antígeno en que participanactivamente interacciones Fc-Fc, de manera quecuando el agregado excede un volumen crítico,precipita espontáneamente.El precipitado formado puede disociarse y

volver al equilibrio con adición de Ag fresco. Cuandose produce un exceso suficiente se forman pequeños

complejos solubles y el precipitado se solubiliza.

b) Floculación. La floculación es una reacción deprecipitación anómala, donde la precipitación seobserva solamente en un rango muy estrecho de laproporción Ag/Ac. Los agregados insolubles seforman en una relativa gran cantidad de Ag. Estasreacciones se dan sólo con algunos antisueros, comopor ejemplo, sueros de caballos antitoxina diftérica,antitoxina tetánica y antitoxinas estreptocócicas ysuero humano anti-tiroglobulina. Es posible que losantisueros que floculan contengan algunosanticuerpos no precipitantes de alta afinidad quedeben ser previamente saturados con el antígeno.

c) Turbidimetría. La turbidimetría cuantifica lanubosidad o turbidez de una solución en que

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reacciona el antígeno con el anticuerpo en bajaconcentración. El fotodetector está en línea a laluz incidente y la solución, en ángulo de 0° o 180°y mide una disminución de la señal o reducciónen la intensidad de la luz que ocurre comoresultado de la combinación de la reflexión,absorción o dispersión de la luz incidente.

d) Nefelometría. La nefelometria es una técnicaque permite determinar niveles de antígeno o deanticuerpo en soluciones a muy baja concen-tración. La nubosidad o turbidez que producen lospequeños inmunocomplejos es medida por la luzque se dispersa (“scattered light”), a través de unfotodetector que está en un ángulo diferente a lafuente de luz incidente (30° a 90°). Se puedeobtener una gran sensibilidad usando luzmonocromática de un rayo láser y por adición depolietilenglicol que aumenta el tamaño de losagregados. En el laboratorio clínico se está usandomasivamente por sus ventajas en la cuantificaciónde proteínas, como: rápido, altamente automa-tizado, simple de operar, usa pequeños volúmenesde muestra y reactivo, alta sensibilidad (menor que1 ng/litro) y excelente precisión.

e) Precipitación de complejos inmunes solubles.Existen algunas situaciones que hacen necesarioprecipitar complejos inmunes solubles paraidentificar el antígeno o determinar el contenido deanticuerpos, que se lleva a cabo modificando lasolubilidad del complejo con polietilenglicol al 2%o sulfato de amonio al 50% o por adición de unreactivo anti-inmunoglobulinas (anticuerpos anti-inmunoglobulinas o proteína A de estafilococo).

2.1.1.2. Reacción de precipitación en gel

Los métodos de precipitación en gelpermiten detectar la presencia y/o concentraciónde antígenos y/o anticuerpos presente, por laformación de bandas opacas de precipitado quecorresponden a complejos antígenos-anticuerposen la zona de equivalencia.

a) Inmunodifusión doble. La inmunodifusióndoble fue desarrollada principalmente porOuchterlony en Suecia. Se basa en la difusión delAg y el Ac en un medio semisólido (gel de agar),formando bandas de precipitación donde losreactantes están en proporciones equivalentes.Estos complejos son insolubles y pueden seranalizados visualmente.La técnica se basa en preparar un gel uniforme

de agar en una placa Petri o portaobjeto. En el agarse practica perforaciones de un diámetro y esquemapreviamente establecidos. Las soluciones quecontiene el antígeno y el anticuerpo se colocan enperforaciones adyacentes y se deja difundir hastaformar líneas o bandas de precipitación. Laintensidad, nitidez y posición de estas bandas esdependiente de la concentración del Ag y Ac.La inmunodifusión doble se utiliza para análisis

de antígenos y anticuerpos. Permite determinar larelación inmunoquímica entre dos antígenos a travésde componentes idénticos o de reactividad cruzada.Se distinguen tres patrones de reactividad: reacciónde identidad, de no identidad y de identidad parcialo cruzada (figura 40-2). También, puede utilizarsepara determinar monoespecificidad de un antisueroy para conocer el título de los anticuerpos.

Figura 40-2. Inmunodifusión doble. Reacciones de precipitación en agar que ilustran reacciones de identidad, identidad parcialy no identidad.

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La figura 40-3 muestra la utilidad de lainmunodifusión doble en la detección de antígenosproteicos en orina.

b) Inmunodifusion radial. La inmunodifusiónradial es una técnica de precipitación en gel, enque el agar se ha mezclado con un antisuero mono-específico sobre un portaobjeto o placa de Petri.Se hacen perforaciones cilíndricas que se llenancon volúmenes fijos de soluciones de referenciade antígeno para el cual el antisuero es específicoy con soluciones o muestras problemas. Ladifusión del Ag en el agar permite la formaciónde anillos de precipitación, cuya área esproporcional a la concentración inicial del Ag. Altérmino de 16 a 48 horas de difusión en cámara

Figura 40-3. Inmunodifusión doble de una muestra de orina. Se observa un elevado nivel de albúmina y ausencia de IgG, loque indica un posible daño inicial del glomérulo.

húmeda y temperatura constante, se leen losdiámetros del halo de precipitación. Se construyeun gráfico o se obtiene la ecuación de la recta conlas concentraciones de referencias versus área odiámetro del anillo y se interpola la lectura de lamuestra problema.Este procedimientos ha sido ampliamente

adaptado para medir muchos antígenos, como porejemplo, inmunoglobulinas en diversos líquidosbiológicos y su sensibilidad puede llegar a 0,1 mg/ml y su coeficiente de variación es menor al 20%(figura 40-4).

c) Inmunoelectroforesis. La inmunoelectroforesis(IEF) desarrollada por Grabar y Williams, es unatécnica cualitativa que permite la identificación

Figura 40-4. Cuantificación de IgG humana por Inmunodifusión radial. Curva de referencia IgG (pocillos 1 al 4) y muestrasde suero de pacientes (pocillos 5 al 8).

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de diferentes antígenos en mezclas complejas, quepueden tener semejante movilidad electroforéticay peso molecular, pero diferentes determinantesantigénicos.Esta técnica se realiza en geles de agar o

agarosa y se distinguen dos etapas: (1) la soluciónde proteínas se somete a separación electroforéticay (2) terminada la electroforesis, las proteínas sonanalizadas con antisueros poli o monoespecíficosen el agar en un canal paralelo al eje de migración.Luego de un período de difusión en cámarahúmeda, se observan arcos de precipitación cuyaforma y posición dependen de las característicasinmunoquímicas y de la concentración de cadaantígeno.La IEF es de gran utilidad para el análisis e

identificación de componentes monoclonales quecaracterizan las enfermedades asociadas congammapatías monoclonales (figura 40-5).

d) Inmunofijación. La inmunofijación es unprocedimiento que utiliza, en una primera etapa,la electroforesis de proteína en gel de agarosa yluego, la inmunoprecipitación. Sobre la placa deagarosa en que se han separado las proteínas por

Figura 40-5. Electroforesis e inmunoelectroforesis del suero de un paciente (p) con gammapatía monoclonal IgG, . Suerocontrol (c), suero anti-IgG ( ), suero anti IgA humana ( ), suero anti-IgM humana (µ), suero anti-kappa libre humana ( ) y sueroanti-lambda libre humana ( ).

electroforesis se aplican antisueros monoespe-cíficos y la presencia del antígeno complementarioforma complejos antígeno-anticuerpo queprecipitan. La formación de un precipitado estableantígeno-anticuerpo fija la proteína en el gel(figura 40-6). Se utiliza esencialmente en lacaracterización de inmunoglobulinas mono-clonales.La inmunofijación y la inmunoelectroforesis

son técnicas complementarias en la identificaciónde una gamapatía monoclonal. La inmunofijacióndebiera ser utilizada frente a proteínas anómalasque son difíciles de caracterizar por inmuno-electroforesis.

e) Contrainmunoelectroforesis. La contrain-munoelectroforesis se realiza en gel agar, dondeel pH del tampón de electroforesis permite que elanticuerpo de cargue positivamente y el antígenonegativamente. La sensibilidad del método esaproximadamente 20 veces mayor que la dobledifusión. Actualmente el uso más importante esen el diagnóstico de enfermedades infecciosascuyos antígenos migran hacia el polo positivo enel agar (figura 40-7).

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Figura 40-6. Electroforesis e inmunofijación del suero de un paciente (p) con gammapatía monoclonal IgG, . Suero anti-IgG humana ( ), suero anti-IgA humana ( ), suero anti-IgM humana (µ), suero anti-kappa libre humana ( ) y suero anti-lamddalibre humana ( ).

Figura 40-7. Contrainmunoelectroforesis para la determinación de antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. Pocillosa: Suero de conejo anti-antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. Pocillos b: Sueros humanos positivos y negativos aantígeno de superficie del virus de la hepatitis B.

f) “Rocket” Inmunoelectroforesis. El “rocket”inmunoelectroforesis es la combinación de laelectroforesis y la inmunodifusion radial que hanproporcionado un método rápido para medirconcentración de antígenos. El Ag migra porelectroforesis (aplicado en un pequeño pozo) en unagar que contiene antisuero (anticuerpos en exceso).El tiempo requerido para la precipitación es de

aproximadamente 2 horas. La altura de la zona deprecipitación que tiene la forma de un “rocket” esproporcional a la concentración de antígeno.El antígeno debe migrar hacia el polo positivo

en la electroforesis, por tanto, es conveniente paraalbúmina, transferrina y ceruloplasmina, pero parainmunoglobulina es más conveniente lainmunodifusión radial (figura 40-8).

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g) Inmunoelectroforesis cruzada o bidimensio-nal de Laurell. La inmunoelectroforesis cruzadarequiere inicialmente la separación electroforéticade una mezcla de antígeno en una dirección per-pendicular al fenómeno final de precipitación ode etapa “rocket”. Esta es capaz de resolver mezclade antígenos altamente complejas y cuantificarcada uno de ellos (figura 40-9). Por ejemplo, seha utilizado para estimar el grado de conversiónde tercer componente del complementario (C3) ala forma inactivada C3c.

Figura 40-8. "Rocket" inmunoelectroforesis para la determinación de albúmina humana. Concentraciones de referenciade albúmina (pocillos 1 al 3) y muestras de pacientes (pocillos 4 al 7).

2.1.2. Reacción de aglutinación

Los antígenos particulados, como microorga-nismos y suspensiones celulares son corrientementeaglutinados cuando se mezclan con sus antisueros.Los anticuerpos son dirigidos contra determinantesantigénicos de superficie que permiten un adecuadoentrecruzamiento con el Ag particulado permitiendola reacción de aglutinación. Los principios de laaglutinación son los mismos descritos para lasreacciones con antígenos solubles.Las reacciones de aglutinación se utilizan

preferentemente para identificar bacteria y tipificarglóbulos rojos, es llevada a cabo, generalmenteen solución fisiológica (NaCl 0,15 M; pH 7,0) yes ampliamente utilizada en determinacionessemicuantitativas.En las reacciones de aglutinación se debe

considerar el fenómeno de prozona que consiste enque algunos sueros dan una efectiva reacción deaglutinación solamente cuando están francamentediluidos. Sueros no diluidos o diluidos levemente noreaccionan visiblemente con el Ag. Actualmente seconoce que en la prozona existen anticuerposabsorbidos en la superficie celular y el fenómeno seexplica por el exceso de anticuerpos y a la presenciade anticuerpos conocidos como bloqueadores oincompletos que corresponden a anticuerposunivalentes (Acs con un solo sitio activo).

a) Aglutinación directa. La aglutinación directase utiliza cuando el antígeno particulado posee

Figura 40-9. Inmunoelectroforesis cruzada o bidimensionalde Laurell. Primera dimensión. El pocillo contiene suerohumano. Segunda dimensión: el gel de agar contiene unantisuero oligoespecífico. Los precipitados o "rocket"corresponden a las siguientes proteínas: (1) transferrina, (2)alfa 2-macroglobulina, (3) ceruloplasmina, (4) alfa 1-antitripsina, (5) alfa 1-glicoproteína ácida.

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suficientes determinantes antigénicos en susuperficie permitiendo que el antisuero (Ac)correspondiente produzca espontáneamente elfenómeno de aglutinación. Se usa regularmenteen la serotipificación bacteriana.

b) Aglutinación indirecta. La aglutinaciónindirecta se utiliza para células que tienen unnúmero reducido de determinantes antigénicos oque existe una cantidad insuficiente de anticuerposque dificultan el procedimientos de aglutinación,para lo cual es necesario disponer de otro reactivoque es el anticuerpo anti-inmunoglobulinas. Porejemplo, determinación del antígeno D (Rh) delos glóbulos rojos.

c) Aglutinación pasiva. La aglutinación pasivase utiliza para antígenos solubles que se absorbenen forma covalente a la superficie de las partículas.Se han usado partículas como glóbulos rojos(hemaglutinacion pasiva) o polímeros sintéticostal como el poliestireno o un coloide mineral comola bentonita. La determinación del factorreumatoídeo utiliza partículas de poliestireno deaproximadamente 0.20 a 0.25 µm de diámetrorecubiertas con gammaglobulina humana.La aglutinación es considerada más sensible

que la precipitación para detectar anticuerpos,debido básicamente a que grandes partículascubiertas con Ag sirven para amplificar la reacción.

2.1.3. Reacción con participación del com-plemento

a) Fijación del complemento. La fijación delcomplemento permite detectar anticuerpos por laformación de complejos inmunes que fijancomplemento por la vía clásica y que por unareacción secundaria, lisis de un sistema indicadorglóbulos rojos-anti glóbulos rojos permitedeterminar la cantidad de antígeno o de anticuerpopresente en la reacción.

b) Actividad hemolítica del complemento(CH50). La determinación de la actividadhemolítica del complemento (CH50) permiteconocer la actividad funcional del sistemacomplemento y se basa en determinar la cantidadmínima de suero (complemento) que lisa el 50%de glóbulos rojos indicadores que han sidopreviamente sensibilizados en forma óptima con suanticuerpo (hemolisina). La hemólisis se producepor la activación de la vía clásica del complemento.

2.2. Inmunoanálisis con reactivos marcados

Los inmunoanálisis con reactivos marcadosse clasifican en: homogéneos y heterogéneos yexisten dos tipos básicos: competitivo y nocompetitivo.

El inmunoanálisis homogéneo no requiereseparación física del antígeno unido, del libre.Considera las diferencias fisicoquímicas (tamañoo cambios conformacionales) entre el antígenolibre y el acomplejado al anticuerpo, siendo estehecho el que caracteriza la señal de respuesta. Lasensibilidad puede verse afectada debido a que nohay separación de la muestra del paciente con laseñal de detección final, facilitando interferencias.A veces se recomienda tratamiento previo de lamuestra para eliminar estas interferencias. Suautomatización es fácil y se utiliza preferentementeen la detección de drogas y hormonas.

El inmunoanálisis heterogéneo contempla laseparación del antígeno unido del libre, conside-rando las diferencias físicas, químicas o inmuno-lógicas (tamaño, carga, adsorción a superficiesólida). Permite eliminar la mayoría de las interfe-rencias de la muestra, mejorando la sensibilidadde la determinación. Su automatización es comple-ja y se aplica en la determinación de anticuerposespecíficos, marcadores tumorales y hormonas.

El inmunoanálisis competitivo se basa en lacompetencia entre el antígeno de interés (analito)y una cantidad constante del antígeno similarmarcado por una cantidad fija y limitada deanticuerpo específico. En este caso esta marcadoel analito.

El inmunoanálisis no competitivo usa un excesode anticuerpo específico marcado contra elantígeno o analito de interés. En este caso estámarcado el reactivo.En la tabla 40-2 se muestra los métodos

inmunoquímicos que utilizan reactivos marcados.

2.2.1. Inmunoanálisis fluorescente

a) Microscopía inmunofluorescente. Lamicroscopía inmunofluorescente incorpora elconcepto tradicional de inmunofluorescencia (IF)que básicamente es una técnica inmunohisto-química o inmunocitoquímica que permite lalocalización de antígenos en células y tejidos y la

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Tabla 40-2. Inmunoanálisis con reactivos marcados

Inmunoanálisis fluorescenteMicroscopía inmunofluorescente

Inmunofluorescencia directaInmunofluorescencia indirecta

Inmunoanálisis de fluorescencia polarizada (“FPIA”)Inmunoanálisis de fluorescencia unida a enzima (“ELFIA”)Citometría de flujo

Enzimainmunoanálisis (EIA)EIA homogéneo. “EMIT”EIA heterogéneo. “ELISA”, “MEIA”Electroinmunotransferencia o “Western blot” o “Immunoblotting”

Radioinmunoanálisis (RIA)RIA en fase solubleRIA en fase sólidaDetección inmunorradiométrica para antígeno

Quimiluminiscencia

Bioluminiscencia

detección y titulación de anticuerpos específicos.La fluorescencia es un fenómeno producido

por moléculas excitadas que emiten radiación,energía o luz que cesa inmediatamente despuésque se retira la luz excitante. Las moléculas quetienen esta característica se llaman fluorocromos.Los fluorocromos o fluoróforos son sustanciascoloreadas que absorben radiación y luego sonexcitadas emitiendo máxima energía a unadeterminada longitud de onda.Para obtener un máximo rendimiento de la

IF es necesario conocer los “peak” de excitacióny de emisión del fluorocromo en uso que permitaseleccionar adecuadamente la fuente de luz y lacombinacion de filtros (primarios y barrera) delmicroscopio de fluorescencia. El “peak” deexcitación es la longitud de onda a la que elfluorocromo absorbe radiación con una máximaeficiencia. El “peak” de emisión es la longitud deonda a la que la energía fluorescente resultante esmáxima.Los fluorocromos más utilizados son el

isotiocianato de fluoresceina (FITC), rodamina By ficoeritrina. Los anticuerpos con uno o dosresiduos de fluorocromo por molécula sonintensamente fluorescentes y mantienen suactividad específica. Existen dos procedimientosde inmunofluorescencia que se utilizan

regularmente en el laboratorio: directa e indirecta.

a.1) Inmunofluorescencia directa (IFD) . La IFDutiliza un anticuerpo específico conjugado con elfluorocromo que se aplica directamente sobre elsustrato (tejido, célula, u otro) permitiendoidentificar la estructura responsable de laespecificidad. Se utiliza preferentemente paraidentificar microorganismo y tipificar células (porejemplo: linfocitos).

a.2) Inmunofluorescencia indirecta (IFI). La IFIes una técnica de doble capa, en que un anticuerposno marcado se aplica directamente sobre el sustratoy se visualiza la reactividad con un conjugado anti-inmunoglobulinas-fluorocromo. Se utilizapreferentemente para la detección de autoanti-cuerpos (figura 40-10).En la inmunofluorescencia se puede aumentar

la sensibilidad con el sistema avidina(estreptavidina)-biotina que tiene una alta afinidad,que utiliza primariamente un conjugadoanticuerpo-biotina y luego conjugado avidina-fluorocromo.

b) Inmunoanálisis de fluorescencia polarizada.El inmunoanálisis de fluorescencia polarizada(“fluorescence polarization immunoassay"; FPIA)

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es un inmunoanálisis homogéneo y competitivoque usa un antígeno marcado con un fluoróforo ypolarizado, y su sistema de detección está basadoen la fluorometría. Es fácilmente automatizado yse utiliza para medir pequeñas moléculas comodrogas y hormonas.

c) Inmunoanálisis de fluorescencia unida aenzima. El inmunoanálisis de fluorescencia unidaa enzima (“enzyme-linked fluorescence immu-noassays", ELFIA) es un inmunoanálisisheterogéneo y puede ser de tipo competitivo o nocompetitivo, en que el inmunorreactante marcadocon enzima está en combinación con un sustratofluorogénico que permite la detección porfluorometría. El ELFIA está automatizado y es unode los métodos más sensibles hoy en día en ellaboratorio clínico. Utiliza preferentemente comoenzima marcadora fosfatasa alcalina y comosustrato fluorogénico el 4 metil umbeliferona(4MUP).

d) Citometría de flujo. La citometría de flujopermite medir la cantidad de anticuerpo mono-clonal fluorescente unido a cada célula en formaindividual, facilitando la identificación y tipifica-ción de diferentes subgrupos de poblacionescelulares con una extraordinaria sensibilidad,eficiencia y rapidez.En el citómetro de flujo las células atraviesan

un rayo láser y son analizadas individualmente.Las células deflectan o dispersan la luz de un láserde una forma estrechamente relacionada con sutamaño y granularidad que es registrada en un

Figura 40-10. Detección de anticuerpos antinucleares porinmunofluorescencia indirecta. Se usa células HEp-2. En estecaso se observa un patrón homogéneo.

detector (ver capítulo 43). La molécula defluorocromo unida al anticuerpo monoclonalabsorbe luz del rayo láser y emite luz en otralongitud de onda, en que su intensidad es captadapor otro detector que está en ángulo recto al rayo.Ambos fenómenos facilitan la correctaidentificación de las poblaciones celulares.

2.2.2. Enzimainmunoanálisis

El enzimainmunoanálisis (EIA) ha reempla-zado a muchas técnicas tradicionales en eldiagnóstico clínico e investigación biológica desdeque se introdujo en 1966 por Avrameas y Uriel.Este método se basa en dos fenómenos biológicos:alta especificidad del anticuerpo por un antígeno(reacción inmunológica) y la amplificación porreacciones químicas llevadas a cabo por enzimasque actúan sobre sustratos que originan productoscoloreados (reacción indicadora).La técnica de EIA es utilizada rutinariamente

para localización de antígeno o anticuerpo sobretejidos o células, para la detección de antígeno oanticuerpos inmovilizados en una fase sólida, parala titulación de anticuerpo y para la medición deantígeno. Los antígenos pueden ser medidos porprocedimientos inmunoenzimáticos homogéneoso heterogéneos.Las enzimas que se utilizan corrientemente

para marcar anticuerpo o antígeno son: fosfatasaalcalina, cuyo sustrato es el p-nitrofenil-fosfato yla lectura de absorbancia se lleva a cabo a 405nm; peroxidasa que puede utilizar tres sustratosdiferentes: o-fenilendiamina (oPD)/H

202; 3,3',5,5'-

tetrametilbenzidina (TMB)/H202 y 2,2'-di-azino(3-

etilbenzotiazolina 6-ácido sulfónico (ABTS)/H202

con lecturas de densidad óptica a 492, 450 y 415nm respectivamente y beta-galactosidasa, cuyosustrato es el o-nitrofenil-beta-D-galactopira-nósido (oNPG) y la lectura se realiza 420 nm.En los EIA automatizados se usa corriente-

mente la fosfatasa alcalina como enzima marca-dora y como sustrato el 4-metilumbeliferil fosfato(MUP). El MUP es catalizado a un productofluorescente (metilumbeliferona) que es medidopor fluorometría.El EIA, también puede ser amplificado

utilizando la interaccion avidina (estreptavidina)-biotina. Se utiliza los conjugados anticuerpos-biotina y avidina-enzima.

a) EIA homogéneo. El “enzyme-multiplied im-munoassay technique” (EMIT) es un EIA

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homogéneo y competitivo que usa una enzimamarcadora y el sistema de detección esespectrofotométrico. La enzima marcadora esunida covalentemente al antígeno en una posicióncercana al sitio activo de la enzima. Durante lareacción inmunológica, cuando el antígenomarcado con la enzima se une al anticuerpo, elsitio activo de la enzima es bloqueado físicamentey la enzima es inhibida funcionalmente. En laforma libre del antígeno marcado con la enzima,la enzima permanece activa funcionalmente yactuará sobre el sustrato que se añade generandoun producto coloreado. El cambio de colorresultante es proporcional a la cantidad de antígenomarcado libre disponible y debido a la naturalezacompetitiva del inmunoanálisis, será proporcionala la cantidad de analito (antígeno) presente en lamuestra. El EMIT se ha automatizado fácilmentey es usado principalmente en la detección dedrogas.

b) EIA heterogéneo. Los procedimientos EIAheterogéneos son en general más sensibles que loshomogéneos.El "enzyme-linked inmunosorbent assay"

(ELISA) se realiza sobre una fase sólida (placasde poliestireno u otro similar) y es un EIAheterogéneo, no competitivo y su detecciónpreferentemente es por espectrofotometría (figura40-11). Es ampliamente utilizado en el laboratorioclínico en la detección y medición de autoan-ticuerpos y varias otras proteínas. Existe unavariedad que se realiza sobre papel de nitrocelulosaque se ha llamado inmunofijacion en punto o"immuno blot, "dotimmunobinding" o "dot"(figura 40-12).El "microparticle enzyme immunoassay"

(MEIA) es un método heterogéneo, no competitivoy de tipo “sandwich”. Utiliza una enzimamarcadora y el sistema de detección es porfluorometría o espectrofotometría. Incorporamicropartículas que permiten aumentar el área enla cual ocurre la reacción antígeno-anticuerpofacilitando la cinética de la reacción ydisminuyendo el tiempo de incubación. Ha sidoautomatizado permitiendo cuantificar una grancantidad de moléculas, incluyendo hormonas ymarcadores tumorales.

c) Electroinmunotransferencia ("Western blot"o "Immunoblotting"). La electroinmuno-transferencia combina la electroforesis en gel SDS-poliacrilamida y la alta sensibilidad del enzi-

Figura 40-11. Esquema de enzimainmunoanálisis en fasesólida (ELISA) para detección y cuantificación deanticuerpos específicos. En el esquema el antígeno se ha unidoa un soporte sólido; luego el anticuerpo (Ac primario) a pesquisar(suero del paciente) reconoce el antígeno. Posteriormente elconjugado anticuerpo secundario-enzima se une al Ac primario,evento que es reconocido con la adición del sustrato quecatalizado por la enzima forma productos coloreados cuyadensidad óptica se lee a una determinada longitud de onda.

Figura 40-12. Inmunodifusión en punto o "dotimmunobinding". Enzimainmunoanálisis sobre papel denitrocelulosa para detección de anticuerpos específicos. Lospuntos coloreados indican positividad.

mainmunoanálisis para originar una poderosaherramienta que permite estudiar cualitativa ycuantitativamente las reacciones antígeno-anticuerpo. Los antígenos son separados en gelSDS-poliacrilamida y transferidos a una mem-brana de nitrocelulosa uniéndose inespecífica-mente e identificados con procedimientosinmunoenzimáticos. Debido a que existe unproceso de denaturación de los antígenos por los

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detergentes utilizados se recomienda utilizarantisueros policlonales en el análisis ("blotting")para aumentar la probabilidad de detectar epítoposo determinantes antigénicos que no se han alteradopor la denaturación.La electroinmunotransferencia se utiliza en

el diagnóstico viral (confirmacion de anticuerposanti-HIV), tipificación de bacterias (Neisseriameningitidis), detección de autoanticuerpos(anticuerpos anti-antígenos nucleares extrac-tables), etc.

2.2.3. Radioinmunoanálisis

El radioinmunoanálisis (RIA) utiliza antígenoo anticuerpo generalmente marcados con isótoposcomo, 125I o eventualmente 131I. Este inmunoa-nálisis puede llevarse a cabo en fase soluble osólida.

a) RIA en fase soluble. El RIA en fase solublepermite determinar la capacidad de unión de unanticuerpo, por adición de un moderado excesode antígeno marcado a un antisuero, losanticuerpos forman complejos solubles y seprecipitan por los procedimientos ya indicados.En el precipitado se mide la radiactividad dandouna estimación de la capacidad de unión delanticuerpo específico por su antígeno. Esteinmunoanálisis en fase soluble, también permitedeterminar antígeno (RIA clásico) por adición deun antígeno marcado a una cantidad fija y limitadade anticuerpo, cuya unión puede ser parcialmenteinhibida por la adición de antígeno no marcado.La extensión de esta inhibición puede ser usadacomo una medida del antígeno no marcado. Sedebe realizar la medición de la radiactividad delantígeno radiomarcado libre, que debe estarseparado de los otros constituyentes del sistema.

b) RIA en fase sólida. El RIA en fase sólidapermite medir un anticuerpo a través de sucapacidad de unión al antígeno que ha sidoinsolubilizado por adsorción física a un soporteplástico. La inmunoglobulina unida puede serestimada por la adición de un anticuerpo anti-inmunoglobulinas radiomarcada producida en otraespecie. Este procedimiento se ha utilizado en laprueba RAST ("radioallergosorbent test") para ladeterminación de IgE específica en pacientesalérgicos. En este caso, el alergeno escovalentemente unido a un soporte y que luego esincubado con el suero del paciente. La cantidad

de IgE específica unida al soporte es estimada porla adición de un anticuerpo anti-IgE radiomarcado.

c) Detección inmunorradiométrica paraantígenos. En las pruebas inmunorradiométricasel reactivo marcado es utilizado en exceso. Parala determinación de antígeno, los anticuerpos estánabsorbidos sobre un soporte sólido al que se leagrega la solución de antígeno. Luego el soportees lavado y la cantidad de antígeno unido puedeser estimado por la adición en exceso de unanticuerpo radiomarcado. La prueba muestra unamayor especificidad cuando los anticuerposutilizados reconocen diferentes epítopos delantígeno. La aplicación clásica de esta prueba esel RIST ("radioimmunosorbent test") para ladeterminación de IgE total, donde el anticuerpoanti-IgE se ha unido covalentemente amicrocristales de celulosa y se le adiciona el suerodel paciente y los sueros controles. La IgE totalunida es medida por la adición de un anticuerpoanti-IgE radiomarcado.

2.2.4. Quimiluminiscencia

La quimiluminiscencia es la emisión de luzproducida en ciertas reacciones químicas deoxidación. La mayoria de las reaccionesquimiluminiscente son de oxidación debido a quela producción de luz visible requiere reaccionesaltamente energéticas. La reacción quimilumi-niscente más estudiada ha sido la oxidación delluminol. Los marcadores más populares son losderivados de isoluminol y ésteres de acridina. Paradetectar un marcado quimiluminiscente se usa unaamplia variedad de luminómetros que miden laemisión de luz.En este último tiempo se está usando como

marcador la fosfatasa alcalina que reacciona consustratos basados en el adamantil 1,2-dioxetanoaril fosfato, que los desfoforila para producir unfenóxido intermediario y éste al descomponerseproduce emisión de luz a 470 nm. Actualmente,los inmunoanálisis quimiluminiscentes sonutilizados por varios analizadores automatizados.En ellos se determinan drogas, hormonas,marcadores tumorales y otras proteínas.

2.2.5. Bioluminiscencia

La bioluminiscencia es un fenómeno natural quese encuentra en muchas formas inferiores de vida.Un sistema natural es la D-luciferina/luciferasa,

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en que la luciferasa cataliza la oxidación de la D-luciferina en presencia de ATP y Mg+2 aoxiluciferina, con emisión de luz a 546 nm. Enlos inmunoanálisis bioluminiscentes se estáutilizando conjugado anticuerpo-fosfatasa alcalinao conjugado analito-fosfatasa alcalina quereacciona con la D-luciferina-o-fosfato liberandoD-luciferina. La D-luciferina es oxidada por laluciferasa con emisión de luz. Aún no estádisponible inmunoanálisis bioluminiscente paraaplicación rutinaria en el laboratorio.

LECTURAS SUGERIDAS

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Diamandis, E. and Christopoulos, T., Immunoas-say, Academic Press. U.S.A.,1996.

Eisen, H., Immunology, Harper and Row Pub-lishers, U.S.A., capítulo 16, pp. 297-336, 1980.

Kemeny, D., “Titration of antibodies”, J. ImmunolMeth., 150: 50 76, 1992.

MacCrindle, C., Schwenzer, K. and Jolley, M.,“Particle concentration fluorescence immunoas-say: A new immunoassay technique for quantifi-cation of human immunoglobulins in serum”, Clin.Chem., 31/9:1487-1490, 1985.

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Fundamentos de Inmunología Básica y ClínicaIván Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Sepúlveda C.,

Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C.Editorial Universidad de Talca, 2002

Capítulo 41

MÉTODOS DE ESTUDIO DE LAINMUNIDAD CELULAR

Jorge González C. y Pilar Vega C

1. Introducción2. Preparación y aislamiento de dife-rentes poblaciones celulares2.1.Métodos de purificación tradicio-nales

2.2. Separación inmunomagnética3. Estudio de la respuesta inmune ce-lular específica3.1. Estudio de las subpoblaciones delinfocitos

3.2. Estudio de las funciones de inmu-nidad celular específica

3.3. Estudio de la síntesis de citoqui-nas y sus receptores

3.4. “DNA microarrays”3.5. Pruebas para evaluar reaccionesde hipersensibilidad retardada(RHR)

3.6. Estudios de la especificidad decélulas T

3.7. Detección de células T precursoras

4. Estudio de la inmunidad celularinespecífica4.1. Ensayos funcionales de neutró-filos

4.2. Ensayos funcionales de eosinó-filos

4.3. Ensayos funcionales de monoci-tos y macrófagos

5. Evaluación de laboratorios del pa-ciente infectado con el virus de lainmunodeficiencia humana. Un mo-delo del estudio de las deficienciasen la respuesta celular5.1. Estudio fenotípico de linfocitos5.2. Estudio de la respuesta prolife-rativa

5.3. Estudio de la respuesta citotóxica5.4. Evaluación de los niveles decitoquinas y subpoblaciones delinfocitos T

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RESUMEN

La respuesta inmune celular del hombre debe ser evaluada mediante pruebas de laborato-rio, no sólo frente a la sospecha de estados inmunes alterados, sino también frente a tratamientoscon modificadores biológicos de la respuesta y en eventuales estudios de vacunación. Frente acualquiera de estas situaciones, la respuesta inmune celular puede ser evaluada tanto in vivocomo in vitro. Las respuestas in vivo, se evalúan únicamente mediante pruebas cutáneas, llama-das reacciones de hipersensibilidad.Por otro lado, un vasto arsenal de pruebas in vitro, están disponibles, para evaluar la res-

puesta celular y la factibilidad de su uso dependen tanto del nivel de equipamiento de cadalaboratorio como de la formación de sus recursos humanos. No obstante, de manera generalningún ensayo aislado es suficiente para un adecuado diagnóstico; una visión adecuada delfuncionamiento de la respuesta celular puede obtenerse por la combinación e interpretación devarios métodos y parámetros.Especial cuidado debe tenerse en el análisis, manejo e interpretación de los resultados.

Debe considerarse que los resultados obtenidos podrían variar dependiendo de la metodologíaempleada, del background genético de los diferentes individuos e incluso dentro de un mismoindividuo. Por ello resulta de especial valor que cada laboratorio determine y maneje con propie-dad los parámetros normales para cada prueba, pudiendo así acceder a interpretacioneslaboratoriales más adecuadas.El desarrollo de ensayos sensibles para analizar la respuesta inmune celular tanto en el

hombre como en modelos experimentales ha llevado a importantes descubrimientos tanto eninmunología básica como clínica.En el futuro, el empleo de métodos más sensibles y específicos, sumados a la utilización de

tecnologías emergentes como los “DNA microarrays” y el estudio de proteínas (proteomica),permitirá mejorar el diagnóstico y el pronóstico de las diferentes enfermedades infecciosas y debase inmunólogica

1. INTRODUCCIÓN

La rama celular de la respuesta inmune, con-fiere inmunidad mediante la generación de célu-las efectoras. Aunque en estos mecanismos, pue-den además participar tanto anticuerpos como fac-tores del complemento, éstos juegan un papel se-cundario. Por ello, tanto células específicas comono específicas estimuladas para un mismo antígenocontribuyen a la respuesta inmune mediada porcélulas.Las células específicas, corresponden a las

diferentes subpoblaciones de linfocitos T CD4+ yCD8+, mientras que en las células no específicasse incluye a macrófagos, neutrófilos, eosinófilosy células "natural killer" (NK). No obstante, laactividad de ambos tipos de células depende delas concentraciones locales de citoquinas, que sonmediadores solubles secretados por diferentes

poblaciones celulares. De esta forma, mientras larespuesta humoral, permite controlar y eliminarmicroorganismos extracelulares y neutralizar susproductos, la respuesta celular es responsable delcontrol de microorganismos intracelulares, la des-trucción de células infectadas por virus, célulastumorales y el rechazo a injertos. De esta formase puede afirmar que la respuesta celular está adap-tada para reconocer y eliminar células alteradas,sean éstas infectadas por patógenos intracelulareso que expresen antígenos tumorales.La importancia de la inmunidad mediada por

células, resulta evidente cuando el sistema es de-fectuoso. Por ejemplo, en niños con síndrome deDi George, quienes nacen sin timo y por ende sondeficientes en células T, generalmente controlanpatógenos extracelulares, pero no así losintracelulares (ver capítulo 29). Esta falla funcio-nal en la respuesta inmune mediada por células,

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resulta en infecciones a repetición por diferentespatógenos intracelulares, donde incluso vacunasatenuadas pueden producir estados infecciosos.La evaluación de la respuesta inmune celular

permite, en pacientes, conocer de manera cualitati-va y cuantitativa la funcionalidad de células y me-diadores de esta rama de la respuesta inmune, demanera de determinar en correlación con los ante-cedentes clínicos, el estado inmune del paciente.La detección de estados alterados puede corres-ponder a las llamadas inmunodeficiencias las cua-les pueden ser congénitas o adquiridas (ver capítu-los 29 y 30). Por otro lado, también se consideranestados de inmunidad alterada la reactividad con-tra antígenos propios conocida como autoin-munidad (ver capítulo 23) y la hiperreactividad pro-pia de la alergia (ver capítulo 22).De igual forma, el monitoreo de los niveles

de productos de la función celular como citoquinasy monoquinas, puede ser de utilidad clínica en es-tudios frente a modificadores de la respuesta bio-lógica (MRB). En el ámbito de la investigaciónbiomédica, ya sea en modelos animales, como enpersonas, permite conocer y definir de maneraexperimental las características de la respuestainmune celular posibilitando la identificación deantígenos protectores tanto frente a patógenoscomo frente a tumores, en eventuales estudios devacunación.En este capítulo se describe los principales

métodos diagnósticos que permiten evaluar el es-tado de la rama celular de la respuesta inmune.Muchas de las pruebas que permiten la evalua-ción de la respuesta inmune celular han sido utili-zadas por muchos años. Otras son de incorpora-ción más reciente al arsenal de pruebas de labora-torio. Algunas de ellas son de reciente aplicaciónen el ámbito de la inmunología y aunque no siem-pre podrían ser factibles de aplicar de maneramasiva en los laboratorios, es necesario conocerla existencia de ellas y sus posibles proyecciones.

2. PREPARACIÓN Y AISLAMIENTO DEDIFERENTES POBLACIONES CELU-LARES

El estudio de la respuesta inmune celular re-quiere, en algunos casos, disponer de poblacionescelulares puras o enriquecidas que permitan la eva-luación de diferentes parámetros. Se puede utili-zar métodos de purificación tradicionales y basa-dos en separación inmunomagnética.

2.1. Métodos de purificación tradicionales

Utilizan soluciones de ficoll-hipaque opercoll en diferentes densidades, las que median-te centrifugación permiten la separación de las di-ferentes poblaciones celulares, basándose en susdiferencias de tamaño y densidad.

2.1.1. Separación de linfocitos

Para ello la sangre total es diluida en bufferfosfato salino en proporción 1:1, depositándolasobre ficoll-hipaque a densidad de 1,077. Luegode centrifugar, en la interfase entre el plasma di-luido y la solución de ficoll, se forma un anilloblanco rico en leucocitos, mientras que en el pelletse encuentran los eritrocitos y los polimor-fonucleares (PMN).

2.1.2. Separación de polimorfonucleares ylinfocitos

La sangre heparinizada se mezcla con unasolución de dextrano al 6% y se deja sedimentar atemperatura ambiente. De esta manera, se obtieneun plasma rico en PMN, monocitos y linfocitospero libre de eritrocitos (figura 41-1).

2.1.3. Separación de linfocitos y PMN

Una buena separación de linfocitos y PMNse consigue a partir del plasma obtenido por sedi-mentación con dextrano al 6%. Esta se obtienemediante centrifugación diferencial sobre ficoll-hipaque con densidad 1,077, observándose en lainterfase un anillo blanco que contiene loslinfocitos mientras que el pellet contiene loseritrocitos (figura 41-1).En todos los casos los procedimientos de pu-

rificación deben ser monitoreados mediante frotisy evaluación morfológica de las células recupera-das. La confirmación del tipo celular recuperadose puede realizar mediante inmunofluorescenciautilizando anticuerpos monoclonales contra mar-cadores de superficie. El control de la viabilidadde estas células debe realizarse mediante pruebasde exclusión con azul tripan, o mediante métodosfluorescentes utilizando ésteres de acetoxymetilcalceína (calceína-AM).

2.1.4. Aislamiento de monocitos humanos

Gradientes de ficoll-hipaque han sido

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Figura 41-1. Separación de PMN y linfocitos. Utilizando dextrano 6% se pueden separar los PMN y linfocitos de los glóbulosrojos y a la vez los dos primeros se pueden separar usando ficoll hipaque 1.077 o bien una gradiente doble de ficoll hipaque.

rutinariamente utilizadas para inicialmente aislarcélulas mononucleares, de las cuales entre 10-20%corresponden a monocitos. Para aislar losmonocitos, se usa su capacidad de adherir al plás-tico, luego de incubación por 1 h a 37 °C. El pro-cedimiento de aislamiento se desarrolla en esteri-lidad, a temperatura ambiente, utilizando mediosy material de vidrio o plástico que estén libres deendotoxinas, debido a que endotoxinas bacterianascomo el lipopolisacárido (LPS) son potentesactivadores de monocitos y macrófagos.

2.1.5. Aislamiento de eosinófilos

El bajo número de eosinófilos en sangreperiférica de individuos normales ha hecho relati-vamente difícil obtener preparaciones en númeroy pureza apropiadas para estudios funcionales.Para ello, protocolos basados en la separación deeosinófilos de neutrófilos la principal célula con-taminante, mediante densidad han sido utilizadospor largo tiempo. Estas técnicas resultan en célu-las de alta viabilidad, no obstante posean bajorendimiento y grados de pureza variable. Más aúnla mayoría de los eosinófilos son de alta densidad(1095-1100 g/mL), por lo que presumiblementerepresentarían poblaciones no activadas. Recien-temente, se ha introducido la selección negativa,basada en la remoción de neutrófilos por mediode separación celular magnética usando perlasrecubiertas de anticuerpo monoclonal anti-CD16.Este método aumenta la recuperación y pureza delos eosinófilos con respecto a las técnicas que uti-lizan gradiente de densidad. No obstante, estas pre-paraciones difieren de las obtenidas por gradiente,ya que contienen además los eosinófilos

hipodensos. Debe tenerse en mente que diferen-cias funcionales han sido observadas dependien-tes del método utilizado en la purificación. Apa-rentemente, eosinófilos purificados mediante se-paración celular magnética son menos respon-dedores a lípidos quimiotácticos que las célulasobtenidas por gradiente.

2.1.6. Aislamiento de basófilos

Los basófilos son los leucocitos de menorabundancia en sangre humana y por ende su puri-ficación es relativamente difícil. Los procedimien-tos basados en centrifugación por gradiente per-miten enriquecer las preparaciones de basófiloshasta en un 50%, pero contienen una significativacontaminación con otros tipos celulares especial-mente linfocitos. Durante cualquier procedimien-to de enriquecimiento deberá tenerse presente enprevenir su estimulación y degranulación.

2.2. Separación celular inmunomagnética

Recientemente han sido utilizadas técnicasbasadas en la separación inmunomagnética deneutrófilos, usando perlas magnéticas recubiertasde anticuerpo monoclonal anti-CD16. Aunque elmarcador CD16 no es exclusivamente expresadopor neutrófilos (también está presente en algunoseosinófilos y en algunas células mieloides precur-soras), el aislamiento inmunomagnético a partirde sangre periférica permite obtener preparacio-nes enriquecidas de neutrófilos con más de 99%de pureza (figura 41-2). De igual manera, usandoperlas sensibilizadas con anticuerpos anti-CD14es posible separar monocitos humanos, mientras

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que perlas magnéticas con anticuerpos CD4 y CD8permiten separar estas poblaciones linfocitarias.

3. ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNECELULAR ESPECÍFICA

La evaluación de la respuesta inmune celu-lar específica, requiere conocer tanto el númerode células como su capacidad funcional. De igualmanera, hoy es necesario conocer su capacidad

Figura 41-2. Separación inmunomagnética de neutrófilos,utilizando anticuerpo monoclonal CD16 unido a partículasmagnéticas.

para secretar algunos mediadores biológicos comoson las citoquinas. Entonces, es necesario cono-cer los niveles de linfocitos T (LT), tanto CD4+como CD8+ y sus propiedades funcionales eva-luando las principales citoquinas secretadas poréstos. De igual manera es importante ensayar tan-to la especificidad de estos linfocitos, basándoseen aspectos estructurales, como también detectarcélulas T precursoras en poblaciones que prolife-ran en respuesta a un antígeno. En todos los ca-sos, la hipótesis diagnóstica permite orientar la in-vestigación de laboratorio, así como los resulta-dos del laboratorio deben ser interpretados a laluz de los hallazgos clínicos.

3.1. Estudio de las subpoblaciones de linfocitos

El estudio de la competencia celular debe co-menzar por determinar los niveles de las célulasque participan en esta respuesta. Por ello, el nú-mero y capacidad funcional de los leucocitos cir-culantes en sangre periférica refleja el estado ge-neral de competencia inmune de un determinadoindividuo. De esta manera en una variedad de si-tuaciones clínicas, la evaluación del número y fun-ción de linfocitos, granulocitos y monocitos hancomenzado a ser rutinarias tanto en el diagnósticode diferentes patologías como en el monitoreo detratamientos con inmunosupresores o inmuno-rrestauradores.Inicialmente, la determinación en el labora-

torio de linfocitos T y B, se realizó, mediante lautilización de eritrocitos de cordero y la forma-ción de rosetas. Los linfocitos T poseen la capaci-dad de unirse a los eritrocitos de cordero, forman-do un complejo en el que estas células están ro-deadas de eritrocitos, de manera semejante a unaflor, denominada roseta E (eritrocito). La evalua-ción de rosetas se realiza mediante lectura micros-cópica. De igual manera, linfocitos B, polimor-fonucleares y macrófagos poseen receptores desuperficie para fragmentos Fc de IgG y para com-plemento. Por ello, en presencia de anticuerpos yel factor C3b del complemento, forman las rosetasEAC (eritrocito, anticuerpo-complemento), lascuales son también evaluadas mediante micros-copía óptica (figura 41-3).

3.1.1. Determinación del fenotipo inmunológicomediante citometría de flujo

En los últimos años, el uso de las pruebas decitometría de flujo (ver capítulo 42) en la deter-

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Figura 41-3. Determinación de linfocitos por formación de Rosetas E y Rosetas EAC. La roseta E se produce por unión delglóbulo rojo al receptor CD2 del LT. La roseta EAC se produce por interconexión entre el receptor para C3b del LB y la unión deC3B al fragmento Fc de IgG. También pueden haber uniones de Fc al receptor que tiene LB humano.

minación de las diferentes subpoblaciones delinfocitos, se ha transformado en un importantemétodo tanto en el diagnóstico como en el pro-nóstico de varias entidades clínicas, incluyendola evaluación de las inmunodeficiencias y los des-órdenes inmunológicos.La citometría de flujo, permite la enumera-

ción de diferentes tipos de linfocitos, los cualesdifieren en sus propiedades funcionales, su linajey su estado de maduración. Entonces mediante estatécnica es posible determinar los diferentes tiposde linfocitos mediante el uso de anticuerposmonoclonales marcados con substanciasfluorescentes, que reconocen sus marcadores desuperficie (figura 41-4). Desde la invención delos anticuerpos monoclonales, miles de ellos hansido generados contra determinantes de superfi-cie de células hematopoyéticas. Inicialmente, gru-pos de estos anticuerpos que demostraron pro-piedades semejantes en cuanto a su ligación y dis-tribución tisular fueron designados como "clustersdifferentiation" o antígenos CD (ver capítulo 45).La identificación de estos CD en la superfi-

cie celular de los linfocitos, mediante anticuerposmonoclonales, ha sido esencial en delinear loscomponentes del sistema inmune. Estosanticuerpos son ahora rutinariamente usados enla identificación, recuento y separación de dife-rentes subpoblaciones de leucocitos y en la clasi-ficación de afecciones malignas de estosleucocitos.Los anticuerpos monoclonales usados para

reconocer LT totales están dirigidos contra los

antígenos CD45 y CD3, mientras que lassubpoblaciones de LT “helper” son reconocidospor los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD4. Lassubpoblaciones de LT citotóxicos y supresores sedefinen con los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD8,mientras que los linfocitos B presentan el marca-dor CD19. Por otro lado, las células NK, se defi-nen por el fenotipo CD3-, CD16+ o CD56+. Noes posible identificar células NK mediante un úni-co antígeno, no obstante, el fenotipo CD3-/CD56+,incluye la mayoría de las células NK. Por ello serequiere marcación con dos fluorocromos, siendoque existe un porcentaje de LT que son CD3+/CD56+. En esta perspectiva, el uso de anti-CD3marcado con fluoresceína y anti-CD16 y anti-CD56 marcados con otro fluorocromo (ficoeritrinao texas red) es recomendable para determinar endefinitiva el fenotipo de las células NK.

3.1.2. Determinación de subpoblaciones delinfocitos mediante inmunofluorescencia

La determinación de subpoblacioneslinfocitarias, es también posible mediantemicroscopía de fluorescencia utilizandoanticuerpos anti-CD, marcados con compuestosfluorescentes. Para ello, luego de purificar loslinfocitos, se confecciona un frotis con las célulasfijadas, las que se incuban con los respectivosanticuerpos. Al microscopio, se cuentan a lo me-nos 250 células, determinando su fenotipo, me-diante la marcación del anticuerpo. Este métodopermite calcular el porcentaje de un determinado

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fenotipo. Mediante un procedimiento un tanto mássofisticado, como es la microscopía confocal, estambién posible utilizar dos o tres diferentesanticuerpos marcados con diferentes fluoro-cromos.

3.2. Estudio de las funciones de inmunidad ce-lular específica

Es aceptado que las características fenotípicasde las células del sistema inmune no proveen in-formación sobre su actividad. Por ello, aunque elanálisis funcional es algo más complejo por re-querir experiencia y adecuados controles de cali-

dad para así lograr una apropiada interpretaciónde los resultados, resulta importante evaluar estosparámetros funcionales. La importancia del aná-lisis funcional resalta porque cada vez son másfrecuentes sus aplicaciones en el diagnóstico ymonitoreo de pacientes con síndrome deinmunodeficiencia adquirida (SIDA), cáncer, en-fermedades autoinmunes y en casos de pacientesque requieren trasplantes de órganos. De igualmanera, el uso de inmunomoduladores y MRBsen estudios clínicos precisa de un monitoreoconfiable del sistema inmune por parte del labora-torio clínico. Entonces, hoy es posible medir unamplio espectro de parámetros funcionales que in-

Figura 41-4. Identificación de células “natural killer” mediante citometría de flujo. Para la identificación, separación y recuento deestas células se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra sus antígenos marcadores de superficie CD16 y CD56. Uno de estosanticuerpos está marcado con fluoresceína y el otro con rodamina por lo que emiten fluorescencia en diferentes longitudes de onda.

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cluyen desde la activación, proliferación y produc-tos de síntesis hasta la función de células efectoras.Más aún, considerable progreso se ha obtenido enla separación y aislamiento de varias subpobla-ciones de células del sistema inmune. Sin embar-go, no sólo los ensayos funcionales pueden ser deutilidad sino que también los estudios estructuralesy la detección de células T precursoras.Así, con un arsenal considerable de ensayos

de laboratorio y opciones de evaluar diferentes fun-ciones, la elección de las pruebas más apropiadaspermitirá al inmunólogo clínico disponer de lainformación que permita conocer el estado de larespuesta inmune celular del paciente.

3.2.1. Activación de Linfocitos T

La activación de linfocitos T es un procesocaracterizado por una compleja cascada de even-tos bioquímicos y moleculares, cuyo resultado fi-nal es la producción de citoquinas, la expresiónde receptores, la proliferación y en algunas célu-las la expresión de citotoxicidad. En condicionesfisiológicas, este fenómeno se inicia con la pre-sentación antigénica en el contexto de moléculasdel Complejo Principal de Histocompatibilidad(MHC) clase I o II e involucra complejos meca-nismos de señalización con participación dequinasas, fosfatasas y segundos mensajeros (vercapítulo 10).

Indicaciones clínicas. La activación de células T,debe evaluarse frente a la sospecha de desórdenesinmunológicos congénitos o adquiridos. Dentro deéstos se incluyen la inmunodeficiencia combinadasevera (falla en el desarrollo de células B y T), elsíndrome de Di George (falla en el desarrollo deltimo), síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome deChediak-Higashi (inmunodeficiencia por ataxiatelangiectasia con albinismo parcial), inmuno-deficiencias variables comunes y frente a infeccio-nes recurrentes por virus, parásitos y hongos.Las disfunciones de células T, predisponen a

infecciones virales por Herpes simplex, Varicella-zoster y Cytomegalovirus. De igual manera lacandidiasis mucocutánea recurrente es frecuente-mente asociada con disfunción de células T. Den-tro de las infecciones por protozoos, Pneumocystiscarinii y Toxoplasma gondii a menudo complicanel curso de pacientes con SIDA, en los cuales lasubpoblación de linfocitos CD4+ es deficiente.La activación de células T, también puede

monitorearse, para evaluar el tratamiento mediante

terapias inmunomoduladoras y para detectar lamemoria inmunológica frente a diferentesantígenos como: derivado de proteína purificada(PPD), streptoquinasa, Candida, tetanus y difte-ria.Ciertos desórdenes inmunológicos como

Lupus eritematoso sistémico se manifiestan conmúltiples disfunciones de células T. Por ello, cuan-tificar la activación de células T es también útilpara monitorear el efecto de las terapiasinmunomoduladoras.

Interpretación de los datos. La capacidad delinfocitos para proliferar, in vitro, en respuesta alectinas mitogénicas como fitohemaglutinina(FHA) y concanavalina A (Con A), es el métodomás común para evaluar la inmunidad mediadapor células. La proliferación celular es ensayada72 horas después, evaluando la incorporación de3H timidina en el DNA recientemente sintetizadopor la célula T. Métodos de más reciente aplica-ción permiten evaluar eventos tempranos del pro-ceso de activación, tales como la elevación de cal-cio intracelular, la activación de proteína quinasaC (PKC) o eventos que ocurren en las primeras24 h, tales como la síntesis de IL-2 y la expresiónde su receptor IL-2R. Estos últimos son losabordajes más directos y presentan varias venta-jas técnicas, como el hecho de requerir un peque-ño número de células mononucleares de sangreperiférica (CMSP), no necesitan enriquecer loslinfocitos T de CMSP, su ejecución requiere me-nos tiempo y realizada en serie resulta de más bajocosto. Desde este punto de vista resulta apropiadoevaluar la síntesis de IL-2 y su receptor, IL-2R, yaque la síntesis de éstos muestra además que lasvías en que participa fosfoinositol/Ca++ y PKC,están intactas.La IL-2 es evaluada en sobrenadantes de cul-

tivo de CMSP, luego de la estimulación conmitógenos por 24 h. La cantidad de IL-2 produci-da por CMSP normales en cultivo, depende delestímulo, las condiciones de cultivo y del métodoempleado en su cuantificación. La activación decélulas T puede ser inducida utilizando diferentesagonistas tales como lectinas, anticuerpos anti-re-ceptor, ionóforos y forbol ésteres. Lectinas comoFHA y Con A pueden adicionarse directamente alos cultivos de CMSP. En presencia de monocitosque secretan IL-1, las células T producirán IL-2 ydesarrollarán una enérgica respuesta proliferativacon "peak" a las 72 h. Las ventajas de usarmitógenos son su estabilidad, bajo costo y fácil

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uso. Agonistas específicos como anticuerposmonoclonales contra el receptor CD3 pueden usar-se para activar células T y permiten evaluar la ca-pacidad del receptor para iniciar la traducción deseñales por la vía fosfoinositol/Ca++/PKC.Una disminución en la producción de IL-2

es asociada con una disminución en la expresiónde IL-2R. La disminución en la síntesis de IL-2 yen la expresión de IL-2R sugiere un defecto en lavía fosfatidilinositol/Ca2+/PKC. Entonces para de-terminar si esta vía de señalización no es funcio-nal, la medición de Ca2+ y de la actividad de PKCpueden ser de utilidad. La determinación de Ca2+

en células T puede realizarse usando algunosindicadores fluorescentes como Fura 2 o Quin 2.Por otro lado los ensayos para PKC son sensiblesy específicos, no obstante requieren poblacionesenriquecidas en células T. En este tipo de ensayolas células T deben ser activadas por un agonista,para luego preparar un extracto celular en el cualse evalúa la incorporación de P32ATP en unsubstrato peptídico sintético o en histonas. Es cla-ro que ambos ensayos requieren personal entre-nado y algunas condiciones del laboratorio por loque no se realizan de manera rutinaria.

3.2.2. Estudio de proliferación de linfocitos

El reconocimiento entre receptores de super-ficie de linfocitos y determinados ligandos, iniciauna cascada de señales intracelulares que inclu-

Figura 41-5. Estudio de la proliferación de linfocitos T, mediante la incorporación de 3H-timidina al ADN. Se miden lascuentas por minuto (cpm) incorporadas al DNA de los linfocitos T que proliferan luego del estímulo mitogénico.

yen interacciones de membrana con citoesqueleto,influjos de Ca2+, activación de fosfolipasa C, libe-ración de Ca2+ inducida por inositol-trifosfato yactivación de genes (ver capítulo 10). Las señalesde transmembrana causan cambios significativosen el linfocito como ser la redistribución de recep-tores, secreción de citoquinas y anticuerpos, movi-lidad celular, reconocimiento entre células o ini-ciación de la proliferación celular. Entonces, la ca-pacidad de un linfocito para responder a un ligan-do, es utilizada tanto en investigación básica comoclínica, evaluando la proliferación. Como ya sedescribió, diferentes lectinas, anticuerpos y com-puestos químicos pueden estimular la proliferaciónde linfocitos. La respuesta proliferativa puede en-tonces ser evaluada en cultivos de sangre total, oen células mononucleares aisladas y en diferentessubpoblaciones de linfocitos. No obstante, debeconsiderarse que en muchos casos se requiere másde un tipo celular para responder a un determinadoligando. Frecuentemente, además de las células T,se requiere la participación de células accesoriasque expresen asociadas a su membrana moléculasMHC clase II, como monocitos y macrófagos.De manera sucinta, un ensayo de prolifera-

ción debería medir el número de células sobrevi-vientes y aquellas generadas como consecuenciadel estímulo. Esto comúnmente se evalúa de ma-nera indirecta por medio de la incorporación deun nucleótido radiactivo (3H-timidina) en el DNAsintetizado (figura 41-5).

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Indicaciones clínicas. Parece claro que los ensa-yos de proliferación o blastogénesis poseen am-plias aplicaciones clínicas. El ensayo es utilizadopara estudiar alteraciones derivadas deinmunodeficiencias congénitas, así como tambiénaquellas secundarias derivadas de enfermedadesinfecciosas, cáncer, desnutrición, cirugías y enfer-medades autoinmunes. Dentro de las inmuno-deficiencias congénitas se incluye la inmunode-ficiencia combinada severa, caracterizada por unamarcada deficiencia en las funciones de células By T (ver capítulo 29). Entonces la utilidad clínicade este ensayo radica en proveer información dela capacidad funcional de linfocitos de sangreperiférica. Esta información es de valor para co-nocer el estado del sistema inmune del paciente ycomo indicador del progreso de una terapia.La aparición del SIDA, atrajo nuevamente la

atención a la investigación clínica de lasinmunodeficiencias y reafirmó la importancia delas determinaciones in vitro de las funciones dela inmunidad celular. Por ejemplo, una disminu-ción en la respuesta proliferativa a Phytolaccaamericana (una lectina que actúa comoestimulador de células B y T) o frente a algunosantígenos de memoria tales como Cándidaalbicans o toxoide tetánico, tiene valor pronósti-co, por ser la capacidad de proliferar un indicadorprecoz del deterioro de la función inmune en per-sonas infectadas con el virus de lainmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1), en pe-ríodos de la infección en que los niveles de CD4+están aún dentro de límites normales.De igual manera, el ensayo de proliferación

puede ser utilizado para definir otras inmunode-ficiencias adquiridas, como el síndrome de fatigacrónica (SFC), que frecuentemente se acompañacon reactivación frente a virus de alta prevalenciacomo Epstein-Barr o virus Herpes. Por ejemplo,la respuesta proliferativa a PWM estuvo bajo lamedia de los controles normales en el 95% de pa-cientes con SFC. De igual manera, la habilidad delinfocitos estimulados con mitógenos a producirIFN, generalmente se puede correlacionar con res-puesta proliferativa.Los antígenos de potencial uso en clínica son

numerosos y deben ser escogidos con cuidado deacuerdo al problema a investigar. Para evaluar res-puesta frente a antígenos en los cuales altos por-centajes de la población están expuestos, (marca-dores generales de inmunocompetencia celular),Cándida albicans y toxoide tetánico deberían uti-lizarse.

La reacción mixta de linfocitos (RML) esuna respuesta proliferativa a dos poblaciones decélulas T alogénicas cultivadas en conjunto. Enotras palabras, se usa para conocer la reactividadde la población de linfocitos de un paciente frentea las células de otro individuo. El principal estí-mulo en este tipo de reacciones son los antígenosdel MHC, presentados en la membrana de loslinfocitos T. Esta es sin duda la técnica de másamplio uso para estudiar la respuestainmunológica de los linfocitos. En esta reacciónse verifican tres eventos principales: síntesis demacromoléculas, transformación blástica y pro-liferación. Las células respondedoras en RML sonprincipalmente linfocitos CD4+. Éstas recono-cen moléculas de MHC clase II por lo queantígenos de Clase II son sus principalesestimuladores. Además de poder determinar losniveles de la respuesta de linfocitos, esta reac-ción sirve para demostrar la compatibilidad deMHC. Se conoce dos tipos de RML, launidireccional y la bidireccional. En launidireccional, una población celular sirve comoantígeno (también conocidas como célulasestimuladoras) y es usada sólo después de lainhibición de su propia proliferación. Entoncessólo se determina la respuesta proliferativa de lasegunda población celular (también llamadas cé-lulas respondedoras). En la RML bidireccionalla respuesta proliferativa de ambas poblacionescelulares es evaluada ya que ninguna poblacióncelular es inhibida en su división. Si existe reco-nocimiento o reactividad de los linfocitos habráproliferación e incorporación de 3H-timidina (fi-gura 41-6).Esta reacción ha sido usada para evaluar los

defectos de la respuesta inmune. No obstante, suaplicación más importante es en el área detipificación de tejidos y trasplante de órganos ycélulas.

Interpretación, rangos normales y control decalidad. La utilidad clínica del ensayo de proli-feración depende de la habilidad del inmunólogoclínico para interpretar de manera adecuada losresultados. Esto requiere conocer de maneraexacta la respuesta a esperar en individuosinmunocompetentes, para poseer los adecuadoscontroles. Esto implica, además, que cada labo-ratorio debiera poseer sus propios rangos de va-lores normales para la respuesta a cadainmunógeno, tomando en consideración aspec-tos como edad, sexo y grupo étnico.

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3.2.3. Estudio de la citotoxicidad celular

La citotoxicidad celular es una de las funcio-nes más importantes de esta rama de la respuestainmune. La citotoxicidad se entiende como la ca-pacidad de una célula de atacar o ser tóxica paraotra célula blanco. Esta propiedad la poseen losLT citotóxicos (LTc), las células NK y aquellostipos celulares que participan de fenómenos decitotoxicidad dependientes de anticuerpos(ADCC) (ver capítulo 19).De manera general las células citolíticas

efectoras se pueden dividir en dos grupos: aquellasque requieren sensibilización previa con un antígenoy reconocen en el contexto de moléculas de HLA yaquellas que no requieren sensibilización previa,ya que poseen reactividad espontánea, su respuestano está restringida a HLA y son activadas porcitoquinas. La mayor parte de las células T CD8- yCD4-, no actúan restringidas a HLA, pero lassubpoblaciones (tanto CD4+ como CD8+) puedenser restringidas a HLA. De igual manera las célu-las T L/B (células TCR2+) pueden mediar ambostipos de citotoxicidad, donde la expresión de lamolécula CD56 permite separar ambassubpoblaciones. La restricción de HLA parece sermás bien relativa que una propiedad constante delos linfocitos T citolíticos. Esto podría depender dela naturaleza y presentación del antígeno, implican-do que una célula efectora tiene potencial para ex-

presar diferentes tipos de estructuras de reconoci-miento y mediar más de un tipo de citotoxicidad.Las células citolíticas efectoras humanas com-

prenden diferentes tipos celulares los cuales depen-diendo de su microambiente difieren en número,estado de activación y en el mecanismo utilizadoen reconocimiento y muerte de la célula blanco.Luego del reconocimiento y el contacto de superfi-cie, la célula citolítica efectora activa una cascadade señales, desencadenando una acción irreversi-ble y letal hacia la célula blanco. La célula efectora,generalmente puede asociarse a nuevas células blan-co en dos o tres ocasiones sin necesitar de reactivarsu cascada de señales. En el capítulo 19 se descri-ben los diferentes mecanismos de citotoxicidad quepresenta los LTc y células NK.

Significancia clínica e interpretación de los re-sultados. La evaluación de las funciones citolíticasprovee una medida eficaz para evaluar la eficien-cia de las diferentes subpoblaciones celulares enestados de salud y de pérdida de ella.Estos ensayos constituyen una parte sustan-

cial de la evaluación clínica de pacientesinmunocompetentes. Las células citolíticasefectoras parecen jugar un importante papel en unavariedad de enfermedades del hombre. Por un lado,una función citotóxica ausente o disminuida, alanálisis in vitro de células citolíticas, se observaen pacientes con inmunodeficiencias como SIDA,

Figura 41-6. Cultivo mixto de linfocitos. Las células no respondedoras (irradiadas) presentan sus antígenos de superficie a lascélulas respondedoras, que como respuesta entran a división celular e incorporan 3H-timidina en el DNA.

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en pacientes con cáncer, en infecciones crónicaspor virus y hongos y en ciertas enfermedadesautoinmunes. Por otro lado, la activación de lafunción citolítica se observa en pacientesinmunodeficientes que reciben una terapia exitosa,en pacientes que se recuperan de infeccionesvirales y en personas con cáncer que responden ala terapia. Las células citolíticas participan en elrechazo a trasplantes (entre ellos los de médulaósea), eliminación de células anormales y en nu-merosos procesos patológicos.

Ensayos en sangre humana. Los estudios clíni-cos a menudo requieren monitorear la actividad decélulas NK. Sin embargo, en algunos pacientes in-cluyendo niños la cantidad de sangre disponible esescasa. Por ello, ha sido necesario desarrollar pro-tocolos sensibles que usen pequeños volúmenes desangre total evitando procesos de purificación. Es-tos protocolos han proporcionado resultados com-parables con los procedimientos tradicionales.

3.2.4. Linfocitos T citolíticos

Las células T LB+ (TCR2+), que incluyenaquellas células que participan en la respuestacitolítica restringida por HLA, son la principalpoblación circulante de células T. Una poblaciónsignificativamente menor, aunque importante, co-rresponde a los linfocitos T g/d+, los cuales puedenmediar reacciones citolíticas no restringidas porHLA, o semejantes a NK, después de cultivarse enpresencia de IL-2, pero podrían también mostrarlisis por antígenos que son restringidos por molé-culas de HLA clase semejante a I. Las células LBTCR2+, de linfocitos citotóxicos reconocen seg-mentos relativamente cortos, de 10-20 aminoácidos,que asociados a moléculas de HLA se exponen enla superficie de la célula. Por ello la susceptibilidadde una determinada célula blanco al ataque de unadeterminada célula citotóxica, depende primaria-mente del tipo de vía de procesamiento del antígenoen la célula blanco. Así, antígenos que sonendógenamente procesados y asociados en la su-perficie celular con moléculas de clase I, son reco-nocidos por LTc, CD8+. Por otro lado, antígenosprocesados por medio de proteasas endosomales seasocian con moléculas de HLA clase II y son reco-nocidos por LTc, CD4+. Es claro que bajo ciertascircunstancias, ambos procesamientos pueden ocu-rrir en la misma célula blanco.Los LTc, son importantes en la inmunidad del

huésped a infecciones por virus y otros patógenos

intracelulares, en trasplante de órganos y en el con-trol de neoplasias. La actividad antiviral puede serdetectada directamente en CMSP, sólo en períodosrelativamente cortos en la infección aguda. Esta res-puesta de LTc, se desarrolla dentro de pocas sema-nas luego de la infección viral. Después de la resolu-ción de la infección aguda, la respuesta de LTc sólopuede detectarse por estimulación in vitro de CMSP,cultivando estas células durante varios días en pre-sencia del antígeno viral específico. La CMSP dedadores normales generalmente contienen cantida-des suficientes de células presentadoras de antígeno(monocitos) y células ayudadoras (linfocitos TCD4+) para estimular esta respuesta de LTc de me-moria. No obstante citoquinas exógenas como IL-2y IL-6, pueden adicionarse al cultivo para aumentarla diferenciación de LTc precursoras en células killerfuncionales. Una excepción la constituyen los pa-cientes con SIDA quienes parecen mantener nivelesdetectables de células circulantes maduras confenotipo CD8+ específico para HIV.Todas las otras respuestas por LTc pueden ser

evaluadas por medio de una estimulación in vitrode las células T de memoria mediante incubaciónde CMSP con antígenos relevantes, para así indu-cir una activación in vitro y una expansión clonalde las células T reactivas al antígeno. Por ello unafalla en la respuesta para generar respuesta porLTc in vitro, podría ser indicativo de: a) ausenciade célula T de memoria; b) falla en las células Tde memoria para activarse, proliferar o diferen-ciarse en respuesta al antígeno; c) fallas en la pre-sentación del antígeno por parte de las células pre-sentadoras de antígeno; d) incapacidad para indu-cir la muerte de la célula blanco.Los nuevos abordajes terapéuticos como tras-

plante de médula ósea, transferencia pasiva decélulas y terapia con citoquinas, están tornandocada vez más importante identificar la causa de ladeficiencia de la respuesta por LTc de manera tanprecisa como sea posible. Debe quedar claro queuna célula citolítica puede ser capaz de reconocery matar a una célula blanco por más de un meca-nismo. Entonces la activación in vitro de LTc pue-de ser capaz de matar tanto de manera específicay restricta a HLA como de manera no restricta aHLA y semejante a como matan las células NK.Por ello la interpretación de los ensayos de LTc esa menudo difícil y requiere una cuidadosa consi-deración de la historia clínica del paciente, su es-tado clínico actual y la interpretación de losparámetros de laboratorio en el contexto de losvalores normales establecidos por el laboratorio.

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Los métodos que evalúan citotoxicidad soncomunes a todas las células involucradas en estetipo de reacciones y se basan en la marcación pre-via de las células blanco con 51C. Las células blan-co marcadas son incubadas con las célulasefectoras citolíticas y el 51Cr, liberado por las cé-lulas y presente en el sobrenadante, es un índicede la actividad citolítica (figura 41-7).

está significativamente asociada con el desarrollode metástasis a distancia. Las células NK respon-den rápidamente a MRB, aumentando lacitotoxicidad, por lo que esta propiedad puede serutilizada como un sensible indicador en estudiosin vitro destinados a evaluar la capacidad de lascélulas del paciente en responder frente a la acti-vación de un determinado agente terapéutico. De

Figura 41-7. Medición de la citotoxicidad mediada por células. Células blanco marcadas con 51 Cr, son incubadas con célulasefectoras (LT, células NK) HLA idénticas; luego la lisis de las células blanco se detecta cuantificando el 51Cr liberado.

3.2.5. Células NK

Las células NK circulantes, representan en-tre el 10-15% de las CMSP y son capaces de indu-cir la lisis espontánea de células blanco neoplásicaso infectadas por patógenos intracelulares, sin unanecesaria sensibilización y sin restricción de HLA.Evidencias recientes muestran que células NKpueden ser activadas para producir citoquinas ta-les como TNF , e IFN , factor estimulador decolonias de granulocitos y macrófagos, IL-3 y pro-bablemente otros factores necesarios para el de-sarrollo células hematopoyéticas. Las células NKparecen ser importantes y activos componentes devarios procesos patológicos en el ser humano. Porello la medición de la actividad de células NK cir-culantes o en tejidos parece necesaria para defi-nir la contribución de estas células al proceso pa-tológico. Por ejemplo en cáncer, una baja activi-dad de células NK tiene un valor predictivo en elprogreso del tumor, la respuesta pobre al tratamien-to y la disminución en el tiempo de sobrevida sinmetástasis. Una baja en la actividad NK tambiénpuede significar un factor de riesgo en la instala-ción de procesos malignos. De igual manera, unabaja actividad de NK en la sangre de pacientes

igual manera el monitoreo seriado de la actividadde células NK puede ser usado para demostrarcambios en el estado de activación de células in-munes circulantes durante la terapia con MRB.El papel de células NK como primera línea

de defensa frente a las infecciones es conocido.Por ende en pacientes inmunocomprometidos, hayuna estrecha correlación entre actividad NK y lapresencia de infecciones severas. En el trasplantede médula ósea, células NK parecen ser las pri-meras en re-colonizar la médula, por lo que estascélulas pueden ser importantes para su instalaciónexitosa y control de las infecciones viralespostrasplante. Anormalidades en la respuesta NKpueden encontrarse también en enfermedadesautoinmunes. Por todo lo anterior, la evaluaciónseriada de la actividad NK es necesaria para co-nocer el estado de la respuesta inmune frente avarias enfermedades.

3.2.6. La reacción de citotoxicidad celular de-pendiente de anticuerpos

Los ensayos de ADCC pueden ser clínica-mente útiles para valorar la inmunocompetenciade subpoblaciones de células efectoras caracteri-

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Figura 41-8. Reacción de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos. Células blanco incubadas en presen-cia de anticuerpos IgG, son reconocidas por células efectoras NK que expresan receptores del tipo Fc RII y Fc RIII. Comoresultado final, la célula recubierta de anticuerpos es lisada.

zadas por la presencia del receptor Fc RII yFc RIII. En el hombre, las células NK CD3-CD56+ CD16+ y una pequeña fracción de célulasT CD3+ CD16+ participan en ADCC. Así, enpacientes con varias enfermedades y especialmen-te en pacientes con cáncer que han sido tratadoscon MRB, estas pequeñas subpoblaciones puedenexpandirse in vivo y ser responsables por una fuer-te respuesta antitumoral y antiviral. Siendo quelas actividades NK y ADCC parecen ser media-das por diferentes subpoblaciones de CMSP (CD3-CD56+CD16- versus CD3- CD56+CD16+ yCD3+CD56+CD16+, respectivamente), podría sernecesario monitorear todas ellas en estados de en-fermedad. De igual manera, se sabe que estos dostipos de citotoxicidad parecen participar en mo-mentos diferentes de una determinada enferme-dad. Las células NK son la primera línea de de-fensa mientras que las reacciones de ADCC asu-men un papel importante una vez que las IgG di-rigidas contra un patógeno o célula blanco han sidosintetizadas y se encuentran en la circulación (fi-gura 41-8).Otra de las principales aplicaciones de

ADCC es la evaluación de la reactividad deanticuerpos contra aloantígenos, célulastumorales y virus. La ADCC puede utilizarse paraestudiar el suero de pacientes que recibirán uninjerto o están desarrollando un rechazo a injer-to, en pacientes con cáncer que están siendo tra-tados con anticuerpos monoclonales dirigidoscontra el tumor y en pacientes con infeccionesvirales. Entonces ADCC entrega importante in-formación acerca de la función de lacitotoxicidad mediada por células en dichos pa-cientes durante la enfermedad.

3.2.7. Células “killer” activadas por linfoquinas

El ensayo de células “killer” activadas porlinfoquinas (LAK) es frecuentemente usado paramonitorear la respuesta a la terapia en pacientestratados con citoquinas u otros MRBs. Célulasefectoras activadas in vivo pueden ser capaces dematar células blanco resistentes a NK. Así, CMSPno son capaces de matar tales células en ensayosde 4 h que miden liberación de 51Cr, mientras quealgunos linfocitos residentes en tejidos puedentener una actividad LAK espontánea. Entonces,la evaluación de la actividad LAK en CMSP fres-cas es una medida de la activación in vivo de cé-lulas efectoras. Por ello el ensayo de la actividadde células LAK, realizado antes y después de laactivación in vitro de CMSP con IL-2 u otracitoquina es una medida de la capacidad de célu-las NK y T para activarse y expresar sus funcio-nes efectoras.

3.2.8. Citotoxicidad por macrófagos

En el ensayo para evaluar la competencia demonocitos para destruir células blanco, el tipo decélula blanco puede indicar el tipo de mecanismoinvolucrado en la destrucción in vitro. Alteracio-nes de la función de monocitos se presentan enalgunas inmunodeficiencias o pueden ser secun-darias a episodios infecciosos, así como tambiénen procesos malignos y enfermedades autoin-munes y pueden en general acompañarse deinmunosupresión. Generalmente otros ensayos sonmás comunes para evaluar la capacidad funcionalde monocitos, no obstante la evaluación de lacitotoxicidad es una función especializada que

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podría ser importante en pacientes con cáncer yen aquellos que padecen de enfermedades infec-ciosas. El ensayo de la citotoxicidad de monocitosdebe ser usado en conjunto con otras pruebas fun-cionales, para evaluar la regulación positiva o ne-gativa de la función de monocitos luego del trata-miento in vivo o in vitro con MRBs.

3.2.9. Nuevos métodos de evaluación de la ac-tividad citotóxica

a) Ensayos de fragmentación de DNA. Diferen-tes observaciones muestran que las células suje-tas a ataque de linfocitos citotóxicos presentancambios morfológicos semejantes a los observa-dos en células que desarrollan muerte celular pro-gramada, también llamada apoptosis. Este proce-so es acompañado por pérdida de la integridad dela membrana celular, lo cual la hace más simplede cuantificar.Los mecanismos de esa muerte celular están

basados en la inducción de fragmentación del DNAde la célula blanco, hecho que ocurre pocos mi-nutos luego del contacto con la célula citotóxica.El grado de solubilización del DNA depende de lanaturaleza de la célula blanco. Esta afirmación sebasa en la observación de que las célulascitotóxicas inducen el mismo tipo de daño en elenvoltorio nuclear de todas las células, sin embar-go estos daños llevan a la desintegración celularsólo en algunas células. No obstante, evidenciasposteriores no mostraron que el envoltorio nuclearresulte dañado por los LTc en células que no desa-rrollan desintegración celular.La verificación de la fragmentación del DNA,

requiere de electroforesis en geles de agarosa parademostrar el clásico patrón en escala. Para cuanti-ficar la fragmentación del DNA, es necesario eva-luar la fracción soluble. El principio de esta técni-ca se basa en que el DNA de doble hebra que hasufrido un extensivo daño se mantiene soluble,mientras que el DNA intacto permanece insolu-ble. Recientemente el uso de 3H-timidina en vezde 125I-UdR ha sido propuesto por poseer ventajascomo ser menos tóxica para el propio DNA.

b) Cuantificación de apoptosis usando coloran-tes fluorescentes. El uso de compuestosfluorescentes que se asocian a DNA es una técni-ca simple que nos permite determinar el porcen-taje de células que están en proceso apoptótico.La combinación de bromuro de etidio y naranjade acridina es ampliamente utilizada. Naranja de

acridina tiñe de verde el DNA y de naranja elRNA, ya que este colorante no intercala RNA. Lascélulas muertas son teñidas con bromuro de etidioy se ven naranjas, mientras que las células vivasexcluyen este colorante.

c) Cuantificación de la fragmentación del DNA.Estas técnicas se basan en el hecho que DNA frag-mentado no sedimenta junto con el cromosomaíntegro cuando es centrifugado. Siendo que estatécnica es complicada sin ventajas comparativassobre las otras técnicas ya descritas, se recomien-da sólo para evaluar poblaciones celulares que nopuedan ser fácilmente marcadas en su DNA, comopor ejemplo los linfocitos en reposo.

d) Ensayo de pérdida de adhesión de célulasblanco. Esta técnica tiene por objetivo evaluar lasconsecuencias funcionales resultantes de lainteracción tumor-células T. Por ello la mediciónde la pérdida de la adhesión de las célulastumorales permite evaluar además la actividadlítica de esas células T.

e) Aislamiento de gránulos citoplasmáticos. Elestudio de gránulos citoplasmáticos aislados ypurificados entrega conocimientos más profundosacerca de los mecanismos de citotoxicidad celu-lar, más allá de la simple observación in vitro dela actividad citotóxica.

f) Ensayo de esterasa. Las serino esterasas estándentro de las numerosas moléculas biológicas queparticipan en los mecanismos de toxicidad celu-lar. El ensayo es simple y confiable y se basa en lamedición de las esterasas liberadas durante lasreacciones de citotoxicidad en que participan LTc.Los linfocitos citotóxicos pueden ser activados pordiferentes mecanismos como anticuerposmonoclonales que semejan el efecto de célulasblanco portadoras de antígeno, por combinaciónde ionóforos de calcio y proteíno quinasa C (oforbol éster) o de manera tradicional incubándo-los con células blanco.

3.3. Estudio de la síntesis de citoquinas y susreceptores

Las citoquinas son glicoproteínas solublesque desempeñan funciones reguladoras. Son sin-tetizadas y secretadas por diferentes células, sien-do capaces de estimular células del sistemainmunológico para inducir cambios en su función,

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activación y expresión génica (ver capítulo 11).Las citoquinas son producidas como resultado dela activación celular y se caracterizan porque susíntesis y secreción es breve y autolimitada. Porello, la evaluación de ellas en muestras biológi-cas puede ser utilizada para monitorear tanto larespuesta inmunológica como inflamatoria,correlacionándose con el estado de activación dela respuesta inmune celular.De igual manera, es conocido que los

linfocitos T helper, pueden subdividirse en dossubpoblaciones, llamadas Th1 y Th2, las que sepueden caracterizar por el patrón de secreción decitoquinas. El predominio de una determinadasubpoblación de LT en el hombre, ha sido asocia-da a la patogénesis en algunos desórdenes comoel asma, las enfermedades alérgicas, enfermeda-des autoinmunes como el lupus eritematoso y ar-tritis reactiva, así como también en la resistenciaa enfermedades infecciosas y parasitarias. Por ellola determinación de los patrones de citoquinassecretadas por linfocitos humanos es cada vez demayor relevancia.Aunque las citoquinas pueden ser directa-

mente evaluadas por medio de ensayos biológi-cos (evaluando su función biológica sobre célulasblanco) o por medio de enzima inmunoanálisis(ELISA) (ver capítulo 39), estos métodos poseenalgunas limitaciones. La primera, se refiere al tipode muestra disponible. El ensayo de actividad decitoquinas es apropiado para muestras líquidas,tales sobrenadantes de cultivo o fluidos biológi-cos, pero no es factible de realizarse en muestrasde tejido sólido. El segundo aspecto a considerares que la cantidad de citoquina en un determinadofluido representa un remanente de la cantidad decitoquina producida con respecto a la utilizada odegradada. Así, los valores de citoquinas comoIL-2 e IL-4 en sobrenadantes de cultivo contenien-do anticuerpos anti-IL-2R o IL-4R que bloqueansu utilización, son considerablemente más altosque en mediciones realizadas en cultivos en au-sencia de estos anticuerpos, sugiriendo que lasconcentraciones de citoquinas producidas son ge-neralmente mucho más altas que lo que las medi-ciones tradicionales suelen indicar. Entonces, bajoestas circunstancias la medición en sobrenadanteso en fluidos biológicos, no siempre podría entre-gar resultados representativos de los reales nive-les de síntesis de una determinada citoquina cuan-do métodos basados en la captura y posterior iden-tificación mediante ensayos tipo ELISA son utili-zados.

Aunque los métodos que cuantifican elmRNA específico para cada citoquina, resultanalgo más complejos y demandan más trabajo, sehan empleado para evitar los problemas deriva-dos de los métodos basados en la evaluación de laproteína o de su actividad. La ventaja de este tipode ensayos radica en que permiten el análisis dela expresión de una citoquina particular o un gru-po de citoquinas en un tejido definido, órgano ogrupo de células en un período de tiempo deter-minado. Más aún, la alta sensibilidad de estas téc-nicas permiten estudiar la expresión de citoquinasen un pequeño número de células, lo que resultaimposible si se utilizan otros ensayos. Varios mé-todos han sido propuestos para cuantificar mRNAde citoquinas. Dentro de los más usados están el“Northern blotting”, ensayo de protección pararibonucleasa y la reacción de polimerasa en cade-na- transcriptasa reversa (RT-PCR). Estos méto-dos, requieren como primer paso del aislamientodel RNA, previo a evaluar la expresión génica delas citoquinas o su receptor. Por ello, errores eneste procedimiento de aislamiento llevan a menu-do a errores en los resultados y en lareproductibilidad del método. Se debe considerarde manera especial que el RNA aislado es inesta-ble y sensible a la degradación por ribonucleasaspresentes tanto en la muestra original como en elmaterial donde se realiza la extracción. Por ello,para obtener una buena preparación de ARN sedebe minimizar la actividad de ribonucleasas du-rante la lisis de células o tejidos, evitando intro-ducir trazas de ribonucleasas en soluciones o ma-terial de vidrio. Para evitar en parte este proble-ma, el material debe ser autoclavado, se deben usarguantes durante todas las fases de la extracción yagua tratada con dietilpirocarbonato, que es unasubstancia inhibidora de ribonucleasa. De igualmanera, el uso exclusivo de material para la ex-tracción de RNA es fuertemente recomendado. Los procedimientos de extracción de RNA,

utilizan la mezcla de isotiocianato de guanidina ycloroformo más agentes reductores como 2-mercaptoetanol, los cuales desintegran las estruc-turas celulares, disocian las nucleoproteínas y almismo tiempo inactivan las ribonucleasasendógenas.De esta manera, a partir del RNA aislado, se

puede purificar el mRNA mediante cromatografíade afinidad en columna de oligo(dT) celulosa, parainvestigar la expresión de un determinado recep-tor. No obstante, la mayoría de los métodos utili-zados para este propósito, los cuales se describen

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a continuación, no requieren de este paso de puri-ficación.

3.3.1. Reacción de polimerasa en cadena-transcriptasa reversa (RT-PCR)

Luego de la descripción original de esta técni-ca orientada a amplificar pequeñas cantidades deDNA, el método fue adaptado para la detección deRNA, incluyendo un paso inicial que utilizatranscriptasa reversa en el cual el cDNA es sintetiza-do para ser usado como molde en la amplificaciónposterior (ver capítulo 44). La PCR usa partidoresespecíficos, ya definidos para la mayoría de lascitoquinas tanto humanas como murinas (tabla 41-1).

Tabla 41-1. Secuencias de partidores para la detección de algunas citoquinas humanas mediantereacción de polimerasa en cadena

Citoquina Partidores

IL-1B S5’-TACGAATCTCCGACCACCACTACAG-3’A5’-TGGAGGTGGAGAGCTTTCAGTTCATATG-3’

IL-2 S5’-ACTCACCAGGATGCTCACAT-3A5’-AGGTAATCCATCTGTTCAGA-3’

IL-4 S5’-CCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCC-3’A5’-CCAACGTACTCTGGTTGGCTTCCTTCA-3’

IL-6 S5’-AGCTCAGCTATGAACTCCTTCTC-3’A5’-GTCTCCTCATTGAATCCAGATTGG-3’

IL-10 S5’-ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA-3’A5’-TCTCAAGGGGCTGGGTCAGCTATCCCA-3’

IL-12p40 S5’-CCAAGAACTTGCAGCTGAAG-3’A5’-TGGGTCTATTCCGTTGTGTC-3’

IL-13 S5’-TATGCATCCGCTCCTCAATCCTC-3’A5’-CGAAGTTTCAGTTGAACCGTCC-3’

TNF S5’-CGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAG-3’A5’-CACCAGCTGGTTATCTCTCAGCTC-3’

IFN S5’-AGTTATATCTTGGCTTTTCA-3’A5’-ACCGAATAATTAGTCAGCTT-3’

-actina S5’-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3’A5’-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3’P5’-CAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCA-3’

Estos partidores específicos para cada citoquina, per-miten su amplificación a partir de pequeñas cantida-des del cDNA generado. Los productos de la PCRpueden ser fácilmente detectados por medio de va-rias técnicas como la electroforesis en geles deagarosa, los cuales son teñidos con bromuro de etidio,el “Southern blotting” seguido de hibridización consondas marcadas con 32P o mediante técnicascolorimétricas que usan sondas marcadas con subs-tancias fluorescentes. La sensibilidad de estasmetodologías de RT-PCR hacen de ellas métodos deelección para la detección de RNA específico, espe-cialmente cuando se trabaja con pocas cantidades decélulas o con RNA, que normalmente son expresa-dos en pequeñas cantidades.

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3.3.2. Ensayo de protección de ribonucleasa(EPR)

Es una técnica sensible y específica para ladetección y cuantificación de mRNA. Se basa enla hibridización en fase líquida, de una sondaradiactiva de RNA antisenso con el mRNA,seguida de la exposición a RNAasas que degradanla sonda remanente así como también cualquierRNA no hibridizado. El material remanente"protegido" es separado mediante electroforesis,visualizado y cuantificado mediante autorradio-grarfía, densitometría o aparatos y "softwares" quepermiten evaluar fosfoimágenes. Entonces laintensidad de las bandas es comparada con lascantidades del RNA blanco, originalmente presentesen la muestra. En los últimos años, "kits" comercialespara esta metodología están disponibles, los cualespermiten el análisis simultáneo de múltiplescitoquinas en una misma muestra.

3.3.3. Tinción intracelular de citoquinas

Una eventual limitación de los métodosmoleculares radica en la imposibilidad de poderseleccionar una determinada célula para su estudioy la imposibilidad de obtener información acercade la identidad y frecuencia de células productorasde una citoquina particular dentro de una poblacióncelular. Entonces, en ausencia de preparacionescelulares puras, estas técnicas no pueden serutilizadas para estudiar la producción de citoquinaspor subpoblaciones definidas de células como esel caso de las subpoblaciones Th1 y Th2 de célulasT CD4+. Más aun considerable evidencia muestraque cambios en la frecuencia de diferentessubpoblaciones celulares puede ocurrir endiferentes enfermedades por lo que la capacidadpara detectar la producción de citoquinas porcélulas individuales y fenotípicamente definidasresulta hoy de particular importancia.Inicialmente, métodos de dilución limitante y

ELISPOT se utilizaron para determinar lafrecuencia de células productoras de unadeterminada citoquina. Estos métodos sonlaboriosos y consumen mucho tiempo. Por ello,técnicas de reciente introducción basadas en latinción intracelular de citoquinas han simplificadoel estudio de la producción de citoquinas en célulasindividuales. Aparte de ser técnicas de gransensibilidad y especificidad, no son afectadas porfactores como son la presencia de receptoressolubles y de membrana para la citoquina en estudio.

Estas técnicas se basan en la detecciónintracelular, previa permeabilización de la célula,de una determinada citoquina mediante el uso deanticuerpos anti-citoquina marcados concompuestos fluorescentes, seguida de un cortoperíodo de activación de las células en presenciade un estimulador conocido de la síntesis y enpresencia de bloqueadores del transporte deproteínas como Brefeldina A o Monesina. Estosinhibidores impiden la secreción induciendo laacumulación citoplasmática de la citoquina. Lascélulas son también teñidas con anticuerposdirigidos contra marcadores de membrana (CD3,CD4, CD8, etc.) en atención a definir la poblacióncelular productora de una determinada citoquina.Anticuerpos marcados con diferentes fluorocro-mos están disponibles comercialmente. No obs-tante dependerá de la población celular a estudiary de las citoquinas a investigar el tipo de anticuerpoanti-marcador celular y anti-citoquina a serutilizado.

3.3.4. Evaluación del interferón

Aunque esta molécula fue identificada a finesde la década del cincuenta, como una proteína an-tiviral, sus vastos efectos biológicos la sitúan comouna molécula inmunorreguladora capaz de alteraruna amplia variedad de procesos tales comocrecimiento celular, diferenciación, transcripcióngénica y traducción. Los interferones sonproducidos por una variedad de células enrespuesta a la infección, y son por ello sintetizadoscomo producto de la activación de la respuestainmune (ver capítulo 11). Existen tres tiposconocidos de IFN , y , por lo que tanto el tipocelular como el agente que actúa como inductorde su síntesis son importantes en determinar el tipode IFN producido. De esta manera IFN esproducido por linfocitos T y B, macrófagos, célulasNK y linfocitos granulares grandes, en respuestaa variados estímulos como virus, productosbacterianos, polinucleótidos, células tumorales ycélulas alogénicas. Estos mismos inductorespodrían gatillar la síntesis de IFN , al tomarcontacto con fibroblastos, células epiteliales y enmenor medida con linfocitos. Por otro lado, el IFNes producido por linfocitos T CD4+ y CD8+, paracuya síntesis requieren de la cooperación demonocitos y macrófagos. Esta citoquina esproducida de manera específica cuando células Tsensibilizadas actúan frente a un antígeno ocomplejos antígeno anticuerpo. De igual manera,

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su síntesis es inducida de forma inespecífica pormitógenos, anticuerpos anti-linfocito o citoquinascomo IL-2.Todos los IFNs pueden aumentar o disminuir

en una amplia variedad de reacciones inmunes.Los tipos celulares y las funciones que pueden sermodificadas por los IFNs son variados. Los IFNsmodifican la reactividad inmune actuando sobrecélulas B, T, NK, macrófagos, basófilos o célulasgerminales de médula ósea. La alteraciónresultante de tales estímulos se traduce en laproducción de anticuerpos, la citotoxicidad decélulas T, reacciones de injerto versus huésped,blastogénesis mediada por mitógenos y antígenos,alteración de varias funciones de los macrófagos,hipersensibilidad retardada, citotoxicidad porcélulas NK, liberación de histamina mediada porIgE y maduración de células germinales de lamédula ósea. Estos estados de inmunidad alteradapueden ser importantes en la fisiopatología de laautoinmunidad, inmunodeficiencia, procesoslinfoides malignos y en infecciones virales.La sobreproducción, la subproducción o la

producción selectivamente localizada de IFNpuede ser un importante factor en autoinmunidady en las inmunodeficiencias.Los tres IFNs son proteínas diferentes desde

el punto de vista antigénico, por lo que anticuerpospueden utilizarse para su identificación yevaluación mediante métodos de RIA y ELISA(ver capítulo 39).

Indicaciones clínicas. Se debe evaluar losniveles circulantes de IFNs, en pacientes con unavariedad de desórdenes, así como la detección invitro de la producción de IFN podría ser unmarcador de la función de células T. De igualmanera, IFNs pueden ser evaluados en lacirculación de pacientes con desórdenesautoinmunes sistémicos como el lupuseritematoso. En estos pacientes la presencia deIFN se correlaciona con enfermedad clínicaactiva. Además, las determinaciones de IFNs sonesenciales en el monitoreo de pacientes queparticipan en estudios clínicos. Ensayos biológicosdeberían usarse para asegurar la actividadbiológica de IFNs que serán administrados a lospacientes. También, es importante monitorear losniveles séricos de IFN de pacientes que estánrecibiendo terapia con IFN. La síntesis deanticuerpos anti-IFN, puede ser detectada en elsuero de pacientes en respuesta a terapias con IFN.En estos casos, los sueros deberían ser evaluados

mediante algún bioensayo o mediante ELISA.La producción in vitro de IFN por células

mononucleares de sangre periférica, seguida de laestimulación con mitógenos o antígenosespecíficos es una manera efectiva de evaluar lafunción de células T (en lo que respecta a laproducción de citoquinas) y la interacciónmonocito-célula T. Un defecto en la producciónde IFN u otras citoquinas puede ser sugestivo deque el problema de fondo es una aberración enlas señales regulatorias. La depresión en laproducción de IFN , en respuesta a mitógenos,antígenos específicos o a IL-2 puede indicar undefecto en el número y función de células T y undefecto en la habilidad de monocitos parainteractuar con células T. La alteracion in vitro delos linfocitos para secretar IFN frente a unestímulo, se asocia con enfermedades de baseinmune como autoinmunidad, inmunodeficiencia,procesos linfoides malignos e infecciones conciertos virus incluyendo VIH.

a) Ensayos biológicos

Los ensayos biológicos para IFNs, permitenevaluar la extensión en que esta molécula inhibeuna o varias manifestaciones del crecimiento viralcomo son, la inhibición de la producción departículas virales, la inhibición del efecto citopático,la inhibición de la formación de placas, la inhibiciónde la formación de antígenos virales o de la síntesisde DNA viral. Estos ensayos requieren la incubaciónde células con IFN, la remoción del IFN, la infecciónde las células con virus y la evaluación de lareducción del crecimiento viral. La actividad anti-viral observada es cuantificada en unidades (U),donde 1U de IFN corresponde al recíproco de lamás alta dilución de IFN que inhibe una magnitudespecífica del crecimiento o de la actividad viral(generalmente el 50%), comparado con un controlno tratado con IFN.

b) Inmunoensayos para IFN

Todos los tipos de IFNs, pueden serdeterminados mediante ensayos inmunoenzi-máticos e inmunorradiométricos. La principalventaja de estos ensayos es la rapidez y laposibilidad de tamizar muchas muestras. No ob-stante, los inmunoensayos no siempre reemplazana los ensayos biológicos, especialmente cuandose requiere identificar una molécula biológica-mente activa, como es el caso de la evaluación de

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diferentes partidas de IFNs para uso en inmunote-rapia.

Interpretación. Los ensayos para IFN en suerode pacientes con HIV, evalúan la respuesta decélulas linfoides frente a HIV y agentesoportunistas así como alteraciones en los aspectosinmunorregulatorios. La replicación de HIV puedeser responsable de la presencia de IFN , y ,mientras que la respuesta T a proteínas de HIV,puede ser responsable de los niveles de IFN . Noobstante, debe quedar claro que en la infecciónaguda por diferentes patógenos oportunistas sepodría observar síntesis de IFNs. Elevados nivelesde IFN, se asocian con anormalidades en la funcióninmune tales como hipergamaglobulinemia odepresión de algunas respuestas celulares. Sinembargo la producción de IFNs puede asociarsecon síntesis de otros factores no relacionadoscomo son producción de neopterina, aumento dela expresión de moléculas de HLA clases I y II,expresión de 2 microglobulina y producción de2-5 oligoadenilato sintetasa.Niveles séricos de IFNs son detectados en

personas infectadas con HIV y se observan demanera precoz en el desarrollo del síndrome deinmunodeficiencia adquirida. De hecho los nivelesséricos de neopterina y 2 microglobulina, lascuales son inducidas por IFNs, se elevan

precozmente en pacientes que desarrollan SIDAy por ello poseen elevado valor pronóstico.

3.4. “DNA microarrays”

Este tipo de análisis, denominados genómicos,se han desarrollado en los últimos cinco años ypermiten evaluar en forma simultánea la expresiónde miles de genes. Los genes de un determinado tipocelular son dispuestos de manera ordenada sobre unsoporte sólido. Estos genes están representados yasea por oligonucleótidos o por fragmentos de cDNA.El mRNA de las células en que se desea estudiar laexpresión génica es utilizado para generar las sondasde cDNA total para hibridizar con el “microarray”.Estas sondas están marcadas con compuestosfluorescentes, por lo que su eventual hibridizacióncon genes del “microarray” es cuantificada mediantefluorescencia, cuya intensidad refleja la abundanciade un determinado mRNA dentro de la célula enestudio. La medición de la expresión génica medianteesta técnica ha mostrado estar en estrecha correlacióncon los resultados obtenidos con otras metodologíasconvencionales como “northern blot” y PCRcuantitativa. Entonces, es posible mediante estemétodo estudiar a gran escala la expresión génicadurante la activación de células T, durante la respuestainmune a diferentes agentes infecciosos o durante laterapia con inmunomoduladores (figura 41-9).

Figura 41-9. DNA microarrays. Representación esquemática de la preparación del material genético, hibridación, captura yanálisis de imágenes.

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3.5. Pruebas para evaluar reacciones dehipersensibilidad retardada (RHR)

La inyección intradérmica de antígenos,como tuberculina (PPD), estreptoquinasa y Can-dida entre otros, puede inducir una o más de loscuatro tipos de reacciones cutáneas: (a) unareacción circular y enrojecida que alcanza sumáxima induración 15-20 minutos después de lainoculación y es debida a la presencia de IgEespecífica en la piel, (b) una reacción de fase tardíamediada por IgE con una máxima induración en-tre 12-24 h posteriores a la inyección, (c) unareacción caracterizada por una vasculitis local,denominada reacción de Arthur, que toma lugarentre 12-24 h luego de la inoculación y es mediadapor anticuerpos fijadores de complementopresentes en el sitio de la inoculación y (d) unareacción de hipersensibilidad retardada depen-diente de macrófagos y linfocitos, caracterizadapor eritema e induración en el sitio de lainoculación que se produce en 24-48 h posterioresal contacto con el antígeno. De esta manera lasRHR representan un fenómeno de memoriainmunológica, para uno o más grupos de antígenosfrente a los cuales el individuo se ha sensibilizado.Esto significa que una exposición previa causó lasensibilización a un determinado antígeno y lanueva presencia de ese antígeno recuerda y alertaal sistema inmunológico. Ello desencadena unarespuesta inflamatoria específica al antígeno,donde el diámetro de la reacción es un índice dela hipersensibilidad cutánea. Así, las pruebas dehipersensibilidad retardada usando inyecciónintradérmica son aún un método válido, de costorazonable para detectar hipersensibilidad y evaluarinmunidad celular en el hombre (única pruebafuncional in vivo). Respuestas dérmicas positivasgeneralmente se correlacionan con los ensayos invitro para hipersensibilidad retardada, incluyendola proliferación de linfocitos y la medición de lasíntesis de citoquinas.

Indicaciones clínicas de la RHR. Es útil en laevaluación de pacientes con síndromes deinmunodeficiencias primarias o adquiridas. Si unpaciente no presenta reacción después de lainoculación intradérmica de cualquier antígeno,se dice que es anérgico o presenta un estado deanergia. Esta condición debe necesariamente sercomprobada utilizando concentraciones más altasde antígeno.Las RHR, también han sido utilizadas para

moniotorear los resultados de inmunoterapia enalgunas enfermedades malignas o en inmunodefi-ciencias, para monitorear el curso de enfermedadescomo coccidiomicosis y para el diagnóstico dealgunas enfermedades infecciosas.

Interpretación. Debe considerarse que algunosindividuos podrían no responder a un determinadoantígeno, por no haber tenido contacto previo conél. No obstante, ciertos antígenos son ubicuos ypor ello la gran mayoría de las personas respondenfrente a ellos por haber sido sensibilizados un algúnmomento de sus vidas. Una revisión de la literaturaextranjera, acerca de la respuesta de personas sanasa diferentes antígenos, evaluada mediante RHRmostró que: 75,5% responde a paperas; 53,3% aCándida albicans; 43,5% a Trichophyton; 38,3%a toxoide tetánico; 37,6% a tuberculina (PPD) y20,4% a coccidina. En base a estos estudios, losreferidos antígenos podrían ser utilizados en lospaneles de evaluación, o al menos ser utilizadospara validar la realidad nacional. En orden aobtener resultados reproducibles, deberá existirconsenso en lo referente a los antígenos a serutilizados y establecer criterios uniformes encuanto a su preparación, vía y forma deadministración del antígeno así como tambiénrespecto a los criterios a ser utilizados en laevaluación de la respuesta dérmica.

3.6. Estudios de la especificidad de células T

3.6.1. Tetrámeros. Las células T reconocenpequeños péptidos, los que son presentados en elcontexto de moléculas de MHC, en asociación conel receptor para células T (TCR). Entonces, esposible utilizar complejos MHC-péptido,marcados con colorantes fluorescentes, los que alasociarse con el TCR permitan visualizar estaligación y a la vez evaluar la especificidad de esascélulas T por un determinado antígeno. No ob-stante, debe considerarse que la asociación entreTCR y el complejo péptido-MHC es bastante débilcomo para producir un complejo estable. Esto,puede ser compensado mediante el uso demultímeros fluorescentes del complejo péptido-MHC, lo cual aumenta su avidez por la célula T.Así, dímeros y aún mejor, tetrámeros de complejospéptido-MHC clase I, han sido usados en ensayosde citometría de flujo, para enumerar, caracterizary purificar células CD8+, específicas para undeterminado péptido. En este tipo de ensayos, tantola cadena ligera como la pesada de MHC, son

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producidas en Escherichia coli, para luego serensambladas in vitro, en presencia del péptidoantigénico. Los complejos así formados sonpurificados mediante filtración en gel. Entonces,una molécula de biotina es adicionada en elcarboxilo terminal de la cadena pesada de MHC.Esto permite su incubación con fluoresceínamarcada con streptoavidina, permitiendo que estostetrámeros puedan ser utilizados en ensayos deligación.

Relevancia clínica. La frecuencia de células Tevaluadas mediante el ensayo de tetrámeros esgeneralmente 10 veces más alta de lo que revelanlas mediciones realizadas con métodosconvencionales. Considerando que la ligación delcomplejo MHC-tetrámero, requiere la expresióndel TCR apropiado, este ensayo no proveeevidencia acerca de la funcionalidad de la célulaT ya que el ensayo está restringido a epitopos decélulas T previamente identificados. No obstantela característica más interesante del ensayo detetrámeros es su capacidad para visualizar todaslas células T específicas sean éstas precursoras,efectoras, funcionales o anérgicas.

3.6.2. Inmunoscopía. La diversidad delrepertorio de células T, es creada mediante unproceso de rearreglo del DNA somáticodenominado recombinación V(D)J. La terceraregión hipervariable (CDR3) tanto de las cadenas como de TCR, son producto de estarecombinación. Entonces, mediante PCRutilizando partidores específicos para V y C, lasdiferentes regiones de CDR3 pueden seramplificadas y su distribución de tamaños puedeser analizada mediante electroforesis en geles deagarosa. Varias docenas de segmentos de genesBV y 4 ó 5 de BJ que codifican para la cadena son conocidos en el ratón y el hombre. Por ello,las posibilidades de combinación de lossegmentos V y J con los posibles CDR3representan más de 2.000, las que pueden seranalizadas en una única muestra. Después de lainmunización, unos pocos clones de células T sonamplificados. Todas las células pertenecientes aun mismo clon presentarán el mismo CDR3. Esteabordaje, ha sido utilizado para visualizar ycuantificar la expansión clonal tanto en el hombrecomo el ratón. Utilizando la tecnología del PCR,el método inmunoscópico es altamente sensibley una única célula T específica puede serdetectada en 2 x 105 células.

Relevancia clínica. La inmunoscopía proveeinformación acerca del repertorio de células T queha sido seleccionado durante la respuesta inmune.En combinación con la técnica de tetrámeros esposible evaluar la diversidad de clones de célulasT específicos para un epitopo, expandidas luegode la inmunización. De igual manera, el usosimultáneo de ambas técnicas permite el análisisdetallado del repertorio de células T sin necesidadde que estas poblaciones celulares seanamplificadas in vitro.

3.7. Detección de células T precursoras

Las células T precursoras no tienen ningunafunción efectora. Sin embargo pueden proliferaral enfrentarse al estímulo antigénico. Estaproliferación ha sido ensayada mediante variadosmétodos que utilizan la incorporación de precur-sores radiactivos o compuestos fluorescentes. Sinembargo, ninguno de estos métodos permitepurificar y caracterizar las células precursoras queproliferan frente a un antígeno. La capacidad deuna célula precursora para proliferar, permite laamplificación de una población específica paraun antígeno, así como también determinar lafrecuencia de estas células precursoras. Esto esposible mediante técnicas de dilución limitantey citometría de flujo. Esta última, utilizacolorantes fluorescentes para teñir la membranade la célula por lo que es más sensible y de mayorutilidad. Entonces, las células son teñidas concolorantes fluorescentes como carboxifluores-ceína o PKH26. Después de cada división celular,las células acaban siendo dos veces menosfluorescentes, producto de la partición delcolorante fluorescente en las dos células hijasresultantes de cada ciclo. Esto permite deducirel número de ciclos celulares a partir de laintensidad de la fluorescencia. De igual manera,la frecuencia inicial de células T precursoraspuede ser calculada a partir de la fluorescenciaobservada al final del experimento (generalmenteentre 4 y 15 días).

Relevancia clínica. El ensayo de la respuestaproliferativa de células precursoras mediantecitometría de flujo es un método que presentaventajas sobre aquellos que utilizan la incorpora-ción de precursores radiactivos, más aún si seconsidera que se puede utilizar la misma muestrapara determinar en paralelo la asociación detetrámeros.

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4. ESTUDIO DE LA INMUNIDAD CELULARINESPECÍFICA

El estudio de este tipo de inmunidad, involu-cra evaluar las células y mediadores que participanen esta vía de la respuesta inmunitaria. Dentro deellos debemos considerar los neutrófilos(leucocitos polimorfonucleares, PMN), monocitos,eosinófilos y basófilos.Los defectos en la fagocitosis y muerte celular

llevan a un aumento en la susceptibilidad ainfecciones y pueden asociarse a alteración de estascélulas o bien a deficiencias en factoresquimiotácticos como C3a y C5a. Éstos tambiénpueden deberse a fallas en la opsonización sea estapor déficit de anticuerpos opsonizantes o de factoresopsonizantes del complemento como C3b y C4b.

4.1. Ensayos funcionales de neutrófilos

Los neutrófilos o leucocitos PMN constituyen elmás abundante tipo de leucocito en sangreperiférica normal, donde sus concentracionesvarían entre 2000 y 5000 células/µl (ver capítulo3). Estas células participan en la fase efectora dela respuesta inmune jugando además un importantepapel en la inflamación y en la patogénesis demuchas enfermedades. Su función en el controlde microorganismos es potenciada por actuar eninterdependencia con algunos factores del sistemade complemento y anticuerpos opsonizantes. Losdefectos intrínsecos de los neutrófilos que alteransu funcionamiento son, generalmente, de basegenética, como es el caso de la enfermedadgranulomatosa crónica (ver capítulo 29). En esteproceso se observa una ingestión normal, pero elproceso de destrucción intracelular no ocurre. Estoes debido a la inactivación de la enzima NADPHoxidasa, responsable de la síntesis de interme-diarios reactivos del oxígeno. Por otro lado, ladeficiencia genética de mieloperoxidasa y glucosa6 fosfato deshidrogenasa, es responsable por losdefectos en la capacidad de PMN en inducir lamuerte celular de los microorganismos.Los neutrófilos en su calidad de células

fagocíticas, son la principal población celularinvolucrada en la respuesta inflamatoria aguda.Estas células pueden ser aisladas en gran númeroy pureza de la sangre del hombre y animales.

a) Medición de la actividad fagocítica. Laactividad fagocítica de neutrófilos puede medirseutilizando una variedad de microorganismos tales

como bacterias (Staphylococcus aureus) ylevaduras (Cándida albicans). Los microorga-nismos fagocitados pueden ser detectadosmediante la tinción con colorantes y lecturamicroscópica así como también mediante el usode células microbianas marcadas con substanciasfluorescentes (citometría de flujo; ver capítulo 42)o precursores radiactivos para luego evaluar lafluorescencia o radiactividad asociada a los PMN.

b) Ensayo de actividad microbicida. Para evaluarla actividad microbicida de PMN, célulaspurificadas son incubadas con microorganismos(S. aureus, C. albicans), en una proporción célula:microorganismo igual a 1:5, en presencia deanticuerpos del paciente y de C3b más controlesapropiados. Los tubos se incuban durante 3 h,tomándose alícuotas cada 30 minutos. En cadacaso, las alícuotas son centrifugadas, las célulaslisadas y la suspensión resultante es sembrada enmedios de cultivo apropiados para mediante eldesarrollo bacteriano, evaluar la cantidad debacterias fagocitadas que permanecen viables.

c) Prueba de reducción del azul de nitrotetra-soliun. La habilidad de neutrófilos para reducir elazul de nitrotetrasolium (NTB) es una medida desu actividad de NADPH oxidasa y su capacidadpara generar productos reactivos intermediarios deoxígeno. El O

2- y otros productos del estallido

respiratorio tienen la capacidad de reducir el NTBa formazán, un precipitado negro azulado que sedetermina espectrofotométricamente. Alternativa-mente, los neutrófilos se pueden fijar y examinaral microscopio, después de la incubación con NTB,permitiendo de esta manera determinar elporcentaje de células que contienen el colorantereducido (formazan).

d) Generación de anión superóxido. Lageneración de anión superóxido (O

2-) puede ser

evaluada utilizando tanto en células estimuladascomo no estimuladas, mediante la medición de lainhibición de la reducción de ferricitocromo c porsuperóxido dismutasa.

e) Formación de peróxido de hidrógeno. Lageneración de peróxido de hidrógeno (H

2O2) por

neutrófilos se produce como consecuencia delestímulo de membrana y puede medirse mediante elmétodo basado en la oxidación del ácidohomovainillínico. Esta reacción es catalizada porperoxidasa (HPR) y depende del H

2O2 generado por

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la célula. Métodos fluorescentes de recienteintroducción, permiten medir la producción de H

2O2

usando el 10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazima, el cualen presencia de HPR, reacciona con H

2O2, generando

resorufina, compuesto que es altamente fluorescentecon emisión máxima a 563 nm. La lectura se realizaen microplaca usando un espectrofluorómetro.

4.2. Ensayos funcionales de eosinófilos

Los eosinófilos son granulocitos derivadosde la médula ósea y cuyos gránulos contienenproteínas básicas que se tiñen con colorantesácidos como la eosina. En personas sanas noalérgicas, estas células corresponden al 2-5% delos leucocitos sanguíneos (ver capítulo 3). Aunqueson capaces de fagocitar, su función está dadafrente a ciertos agentes infecciosos incluyendo loshelmintos. Además estas células juegan un papelsignificativo en la inflamación y la injuria celularseguida a las reacciones de hipersensibilidadretardada. La producción y activación deeosinófilos está bajo el control de células T CD4+pertenecientes a la subpoblación Th2, responsablespor la producción de IL-5, que es el principal fac-tor activador de eosinófilos. Después de suactivación, los eosinófilos aumentan de tamaño ydisminuyen su densidad. Eosinófilos activados sonpotentes efectores de reacciones de ADCC yproducen una variedad de mediadores inflamato-rios incluyendo leucotrienio C4 (LTC4) y O

2-.

a) Generación de LTC4. El leucotrienio C4 esun mediador derivado de ácido araquidónico quees producido por mastocitos, basófilos yeosinófilos. LTC4 y sus metabolitos derivados,LTD4 y LTE4, son poderosos mediadores devasocontricción, jugando un papel central en lapatogénesis del asma. La producción de LTC4por eosinófilos después de estimulación con variosagentes (IL-5,GM-CSC, Zynosan, ionóforoA23187) puede medirse utilizando diferentes kitscomerciales basados en el radioinmunoanálisis.

b) Ensayo de anión superóxido. Al igual queneutrófilos, los eosinófilos luego de su activaciónpueden generar O

2-. Éste puede medirse inhibiendo

la reducción de ferricitocromo c por superóxidodismutasa.

c) Ensayo de adhesión de peroxidasa deeosinófilos. La adhesión de eosinófilos al colágenoo a células de endotelio vascular humano, es

medida en placas de 96 orificios, detectando loseosinófilos asociados a célula por medio de lamedición de la actividad de peroxidasa propia delos eosinófilos.

4.3. Ensayos funcionales de monocitos ymacrófagos

Desde los trabajos pioneros de EllieMetchnikoff, los macrófagos han sido conside-rados como las células responsables de laregulación de la respuesta inmune. Los macrófagosparticipan en procesos de recambio celular,incluyendo el remodelamiento tisular duranteembriogénesis, destrucción tisular y reparación delos tejidos con posterioridad a injurias einfecciones y renovación tisular que permite laeliminación de células senescentes o malignas. Losmacrófagos son células de central importancia enla respuesta inmune. Una de sus característicasdistintivas que avala su papel central en lainmunidad es su presencia en la mayoría de lostejidos de nuestro cuerpo. Entonces su principalfunción es monitorear y regular los fluidoscirculantes y reaccionar frente a los cambios. Losmacrófagos participan tanto de las vías aferentescomo eferentes de la respuesta inmune. Susfunciones son variadas e involucran pinocitosis,degradación de material ingerido, quimiotaxis,actividad antimicrobiana, secreción demonoquinas y otros factores, procesamiento ypresentación de antígenos, cooperación con célulasT y B y actividad citolítica.Los monocitos y los macrófagos son células

que se originan en la médula y son programadaspara madurar y diferenciar de la célulahematopoyética germinal hasta ser liberada paracircular en la sangre periférica. La diferenciaciónde monocitos a macrófagos ocurre en diferentestejidos, dependiendo de la localización tisular ydel microambiente al que los monocitos sonexpuestos.Los monocitos circulantes y los macrófagos

tisulares desempeñan importantes funciones en ladefensa del huésped contra microorganismosinvasores y células tumorales. Por otro lado, lafagocitosis, degradación y muerte de microorga-nismos permite a monocitos y macrófagosparticipar en la presentación de antígenos, primery esencial paso en el montaje de la respuestainmune. De igual manera estas células pueden re-sponder a un determinado antígeno secretandocitoquinas (monoquinas) solubles, que permiten

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activar y reclutar diferentes tipos de célulasefectoras. La primera monoquina secretada frentea un estímulo antigénico es interleucina 1 (IL-1),que inicia la respuesta inmune actuando sobrecélulas T CD4+ y CD8+, permitiendo la secreciónde IL-2 y la expresión de receptores para IL-2,que permite la proliferación de estas células. Otramonoquina es IL-6, que posee capacidad paraactivar células NK, timocitos y linfocitos T.Monocitos activados también producen el

factor estimulador del crecimiento de granulocitosy macrófagos, el cual induce la maduración demonocitos y neutrófilos de la médula ósea y laactivación funcional de los monocitos circulantes.Monocitos estimulados por antígenos tambiénproducen IL-8. El TNF sintetizado por monocitosactivados posee propiedades antitumorales peroademás es capaz de activar monocitos, granulo-citos y eosinófilos. No obstante monocitos ymacrófagos no sólo producen monoquinas capacesde estimular la respuesta inmune sino que ademáspueden producir factores inmunosupresores comoprostaglandina E

2. Entonces el aislamiento de

monocitos de sangre periférica permite evaluar laactividad microbicida y antitumoral de estascélulas así como su funcionalidad en producirmonoquinas y prostaglandinas.

Indicaciones clínicas. La evaluación in vitro dela función de monocitos se recomienda enpacientes en los cuales se sospecha deficienciasen la inmunidad mediada por células. Deficienciaen la función de monocitos se puede manifestarclínicamente como aumento en la frecuencia deinfecciones las que podrían ser debidas a fallasen la capacidad de matar gérmenes, en deficienciasen el procesamiento y la presentación de antígenoso en la producción de monoquinas. En estos casos,el primer y más simple ensayo consiste en evaluarla capacidad antimicrobiana seguida de laevaluación de la capacidad de secretar monoquinascomo TNF. En pacientes con cáncer, la evaluaciónde la capacidad tumoricida puede entregar valiosainformación acerca de las capacidades funcionalesin vivo de estas células. Por otro lado la mediciónde la producción de PGE

2 por monocitos permite

conocer el nivel de actividad supresora de losmonocitos. Ciertas enfermedades crónicas comocirrosis, tuberculosis, sarcoidosis, actinomicosisy enfermedad de Crohn, pueden asociarse condisfunción de monocitos por lo que el monitoreode la función de estas células puede ser informativoacerca del estado de la enfermedad.

a) Producción de intermediarios del meta-bolismo oxidativo. Durante la fagocitosis y laactividad citotóxica, los macrófagos son capacesde producir varios intermediarios del metabolismodel oxígeno. Durante las fases iniciales de lafagocitocis, los macrófagos muestran un aumentoen el consumo de oxígeno, cortocircuito de laactividad de hexosa monofosfato y producción deintermediarios de oxígeno, en un proceso conocidocomo estallido respiratorio. La generación deradicales superóxido es catalizada por una NADPHoxidasa localizada en la membrana, siendo generadopor una apropiada estimulación de membrana. Estaoxidasa transfiere electrones de NADPH citosólicaal oxígeno extracelular, produciendo H

2O2, el que

es necesario para la muerte de los microorganismosinvasores, pero al mismo tiempo causa inflamacióny daño tisular. El estallido respiratorio nonecesariamente depende de la fagocitosis peropermite caracterizar la actividad fagocítica. Laproducción de O

2-, es el paso inicial de la conversión

de oxígeno a peróxido de hidrógeno y radicaleshidroxilo, los cuales son potentes metabolitosmicrobicidas. Por ello la evaluación del nivel deproducción de O

2-, es un importante indicador del

potencial microbicida de los macrófagos. En esteaspecto, el método más apropiado para la mediciónde O

2- es evaluar la inhibición de la reducción de

citocromo c Fe3+ a Fe2+, la que es dependiente desuperóxido dismutasa.

b)Estudio de la fagocitosis. Bajo el término defagocitosis se describe la capacidad de células detomar partículas sólidas, tales como eritrocitos,diferentes microorganismos, materiales orgánicose inorgánicos. Diferentes eventos celulares han sidoasociados con la internalización y subsecuenteprocesamiento del material ingerido. Cada fase dela fagocitosis es un proceso celular complejo, concaracterísticas funcionales propias y diferentesrequerimientos metabólicos donde participanfactores intra y extracelulares. Por ello, la fagocitosisrepresenta uno de los parámetros funcionales usadospara caracterizar la función de los macrófagos.Para obtener una evaluación más objetiva de

este proceso biológico, es importante escoger demanera cuidadosa la partícula a ser fagocitada.Además de eritrocitos y varias cepas de bacterias,existen partículas comúnmente clasificadas comoinertes que son empleadas como reactivos para lacuantificación de la actividad fagocítica. Ellas sonsílica, metales carboxilados, microcristales ypartículas de látex. No obstante, la fagocitosis de

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bacterias es una de las técnicas tradicionalmenteusadas por más de una centuria. Prácticamente todaslas bacterias pueden ser utilizadas. Entonces cultivosde monocitos se ponen en contacto con losmicroorganismos por un período de tiempo. Luego,los cultivos son lavados y se evalúa tanto el númerode bacterias intracelulares por cada 100 monocitos,como el porcentaje de monocitos que contienenbacterias intracelulares. El índice fagocítico quemuestra la relación entre el porcentaje demacrófagos con a lo menos una bacteria y la mediadel número de bacterias por macrófagos positivos,puede también ser considerado. Tradicionalmente,esta evaluación se ha realizado mediantemicroscopía óptica, aunque protocolos másrecientes y algunos reactivos comercialesdisponibles utilizan bacterias (Escherichia coli K12)marcadas con fluoresceína, lo que permite evaluarla fagocitosis por microscopía de fluorescencia,citometría de flujo y espectrofluorometría. Resultainteresante destacar, que las metodologíasfluorescentes permiten diferenciar entremicroorganismos localizados extracelularmente ylos microrganismos intracelulares. Estos protocolosse basan en la observación de la viabilidad delmicroorganismo al ser teñido con naranja deacridina y luego observado en el rango ultravioletao con excitación azul. El microorganismo semostrará de color verde si estuviese viable o decolor rojo si estuviese muerto.Otro posible abordaje, se basa en el uso de

microesferas fluorescentes y efectos de bloqueo,que permite la fácil diferenciación entre laspartículas asociadas y aquellas interiorizadas. Latécnica se basa en la propiedad de algunoscolorantes como el cristal violeta o el azul tripande apagar la fluorescencia de partículas fluores-centes libres o asociadas al monocito, mientras queaquellas interiorizadas permanecen fluorescentes.El fenómeno responsable por este bloqueo se llamatransferencia de energía de excitación. Latransferencia ocurre cuando el espectro deabsorción del agente bloqueador se sobrepone alespectro de emisión del marcador fluorescente.

c) Evaluación de la actividad microbicida. Laactividad microbicida y la fagocitosis puedeevaluarse incubando cultivos de monocitos conlevaduras, como C. albicans, a diferentesrelaciones levadura : monocito (1:3; 1:10; 1:30).Luego de incubación a 37°C por 18 h, las levadurasson marcadas metabólicamente con 14C-glucosa,adicionando el isótopo en agua, lo que permite la

lisis de los monocitos. Por ello sólo incorporaránel isótopo aquellas levaduras que permanecenviables, por lo que la radiactividad incorporada secompara con un control en que se cultivó idénticoinóculo inicial pero en ausencia de monocitos.También es posible evaluar la actividadmicrobicida mediante recuento microscópico delnúmero de células infectadas y el número delevaduras por cada 100 células infectadas.

d) Evaluación de la actividad citostática frentea tumores. La habilidad de monocitos paracontrolar el crecimiento tumoral, puede evaluarsemediante la incorporación de 3H- timidina encélulas tumorales que sobreviven luego de laincubación con monocitos y que son comparadascon la incorporación de células tumorales quefueron incubadas en ausencia de macrófagos.

e) Evaluación de la actividad tumoricida. Laevaluación de la actividad tumoricida es semejantea la evaluación de la actividad citostática, con ladiferencia de que las células tumorales sonmarcadas antes de la incubación con losmacrófagos.

f) Estudios de inducción de monoquinas. Demanera general, cultivos de monocitos purificadosson incubados por 24-48 h con algunos inductoresde la producción de monoquinas como el LPS deEscherichia coli. Luego los sobrenadantes soncolectados mediante centrifugación y sometidosa evaluación o congelados inmediatamente. TantoELISA como RIA pueden ser usados para ladetección de monoquinas. La principal desventajade estos métodos es que también detectanmonoquinas biológicamente inactivas. Por ello, losmétodos moleculares, principalmente aquellosbasados en PCR, presentan grandes ventajas tantoen sensibilidad como en especificidad (ver punto3.3.1 y capítulo 44).

• Ensayo de IL-1. Para el ensayo de laactividad biológica de IL-1, sobrenadantesde monocitos estimulados son usados paraestimular la proliferación dependiente de IL-1 de una línea de células T (clon de células Tmurinas). El ensayo utiliza IL-1 comocontrol de la proliferación de las células T.La presencia de esta monoquina puede

ser identificada mediante ensayos de ELISAutilizando preparados comerciales, los cualestienen sensibilidad en el rango de 20-50 pg/

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mL, sin reacciones cruzadas con otrasmonoquinas y citoquinas.

• Ensayo de IL-6. Los ensayos biológicosmiden la habilidad de sobrenadantes decultivo de monocitos estimulados en inducirla proliferación dependiente de IL-6 en unalínea celular de plasmocitoma (por ejemploT1165 o B9). Diluciones seriadas de IL-6recombinante son incluidas como control. Deigual manera, "kits" comerciales pueden serutilizados para evaluar los niveles de IL-6.La sensibilidad de estos es de 3.5 pg/mL, deproteína por ml, no presentando reaccionescruzadas con otras citoquinas. Estos ensayosson a lo menos tan sensibles como los ensayosbiológicos con la ventaja de ser más rápidosy la desventaja de su relativo alto costo.

• Ensayo para GM-CSF. Los ensayosbiológicos de la actividad de factorestimulador de colonias granulocito-monocito(GM-CSF), miden la habilidad de sobrena-dantes de cultivo de monocitos estimuladosen inducir la proliferación dependiente deGM-CSF en una línea celular de leucemiahumana (con frecuencia se usan los clonesMo7e o TALL-101). Diluciones seriadas deGM-CSF recombinante humano sonutilizados como control. En este caso debeconsiderarse que las líneas tumoralesutilizadas son respondedoras tanto a GM-CSFcomo a IL-3 por lo que una caracterizacióndefinitiva de la actividad de GM-CSF, serealiza incubando los sobrenadantes demonocitos esimulados con anticuerpos anti-GM-CSF y anti-IL-3, antes de evaluar laactividad de GM-CSF. De igual manera "kits"comerciales de ELISA pueden ser utilizados.

• Ensayo de TNF. Para el ensayo biológico de laactividad de TNF, se evalúa la capacidad desobrenadantes de cultivo de monocitosestimulados, en lisar una línea celular defibrosarcoma murino, caracterizado por seraltamente sensible a TNF (por ejemplo WEHI164-JD). En este caso las células delfibrosarcoma son marcadas con 51Cr y luegoincubadas con diluciones seriadas delsobrenadante de cultivo de monocitos. Controlesse realizan con células incubadas en ausenciade sobrenadantes. Diluciones seriadas de TNFrecombinante son incluidas como control y las

unidades de TNF son calculadas en base a unacurva estándar. Considerando que tanto TNFcomo TNF (también llamada linfotoxina) sondetectados en este ensayo, la neutralización conanticuerpos contra cada uno de éstos, esnecesaria para conocer cuál monoquina estásiendo detectada. No obstante sólo TNF essintetizado por monocitos, por lo que ladetección de TNF sugiere que la preparaciónpudiese estar contaminada con linfocitos. Si nofuese posible o pertinente marcar las células con51Cr, el ensayo podría realizarse tiñendo lascélulas al final de la incubación con azul tripanpara así evaluar la viabilidad celular o teñir concristal violeta que tiñe las células tumoralesresiduales. Esta técnica es particularmenteapropiada cuando se usan como célula blancolos fibroblastos murinos L929.

g) Ensayo de prostaglandina E2. La prosta-

glandina E2 es detectada por RIA. El sobrenadante

de monocitos estimulados es ajustado a pH 12,5con NaOH y luego es hervido, neutralizado yevaluado. Las concentraciones de PGE

2 son

calculadas en base a una curva de referencia.

5. EVALUACIÓN DE LABORATORIO DELPACIENTE INFECTADO CON EL VIRUSDE LA INMUNODEFICIENCIA HUMA-NA: UN MODELO DE ESTUDIO DE LASDEFICIENCIAS EN LA RESPUESTACELULAR

Frente a la sospecha inicial de encontrarsefrente a un paciente infectado por HIV, eldiagnóstico de laboratorio se realiza mediante labúsqueda de anticuerpos, utilizando ELISA. Laspruebas de “Western blot” y PCR se usan comoconfirmatorias. Por ello, la evaluación de larespuesta inmune celular en estos pacientes, es decentral importancia ya que permite monitorear elcurso de la infección, evaluar el tratamiento y susresultados poseen valor pronóstico (ver capítulo30).

5.1 Estudio fenotípico de linfocitos

En base a lo anterior, el estudio inicial dellaboratorio debería incluir el análisis fenotípicomediante citometría de flujo, de las diferentessubpoblaciones de linfocitos T, evaluandoparticularmente los marcadores CD3+, CD4+ y

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CD8+. Este examen se orienta particularmente aconocer el porcentaje y recuento absoluto de LTCD4+, ya que éstos poseen una relación estrictacon el estado de la infección. De acuerdo a laclasificación del Centro de Control de lasEnfermedades Infecciosas de los Estados Unidos(CDC), en relación a los niveles de células TCD4+, se pueden clasificar a los pacientes en trescategorías: a) Recuentos mayores 500 células/µL,b) Recuentos entre 200-499 células/µL, c)Recuentos menores a 200 células/µL.No obstante, el avance en las técnicas de

citometría de flujo, ha permitido proponer nuevosmarcadores con valor predictivo. Entre éstos seincluye evaluar la prevalencia e intensidad delmarcador CD38 de células T CD8+, el porcentajede células CD4+ que muestran pérdida demarcadores CD26 y CD28 y el porcentaje decélulas CD4+ que expresan el marcador CD95.La intensidad del marcador CD38 en linfocitosCD3/CD8+ se ha podido correlacionar de maneraestrecha a la progresión futura de la enfermedad,de manera más absoluta que el recuento único delinfocitos CD4+. Pruebas adicionales podrían serrealizadas en estudios clínicos orientados a evaluarefectos terapéuticos de una determinada droga oel efecto protector de una eventual vacuna. Enestos casos podría ser interesante un estudiofenotípico extensivo a otras poblaciones celulares,incluyendo marcadores para monocitos, célulasNK, células B y marcadores de la activación decélulas T, tales como HLA-DR o el monitoreo dela expresión de receptor para IL-2.

5.2. Estudio de la respuesta proliferativa

Una de las alteraciones más tempranas delpaciente infectado con HIV, es una marcadareducción en la habilidad de los linfocitos T paraproliferar in vitro, en respuesta a mitógenos,antígenos solubles y aloantígenos. Es por elloimportante la evaluación de la respuestaproliferativa de los linfocitos de pacientesinfectados con HIV. De esta manera, el estudio dela respuesta proliferativa de células T a mitógenos,antígenos solubles y aloantígenos puede ser degran valor.

5.3. Estudio de la respuesta citotóxica

Varias evidencias sugieren que LTc podríanser importantes en la defensa frente a HIV. Éstasse basan en la observación que una fuerte

respuesta por LTc se manifiesta en períodostempranos de la infección, en personas en que apesar de estar infectadas por más de una décadano presentan signos de enfermedad, o entrabajadoras sexuales y recién nacidos de padresinfectados que no contrajeron la infección Aunqueen pacientes infectados con HIV los niveles deCD8+ son cercanos a los niveles normales, lahabilidad para generar respuesta LTc, la cualrequiere IL-2, está disminuida, ya que se observauna reducción en los niveles de IL-2. Por ello,estudios recientes sugieren la evaluación de larespuesta citotóxica de células T de pacientesinfectados, frente a células blanco infectadas conHIV o que expresan proteínas virales. En estoscasos se sugiere colectar CMSP y someterlas invitro a estimulación previa con diferentesantígenos de HIV tales como nef, gag, po1, vif yenv. Esta estimulación previa parece serindispensable, ya que permite la estimulaciónespecífica y la amplificación de pequeñaspoblaciones precursoras de células T citotóxicas,que pudieran encontrarse en la sangre periféricaen el momento de la recolección de la muestra.Por encontrarse en bajo número, de no mediar unaestimulación previa, la actividad citotóxica de estascélulas no sería detectada en ensayos decitotoxicidad convencionales.De igual manera pueden ser importantes, la

evaluación del efecto citotóxico de células NK.Aunque el porcentaje de NK en pacientesinfectados con HIV puede permanecer normal, elnúmero absoluto de algunas subpoblaciones de NKpueden estar disminuidas, por lo que la funciónNK se deteriora según progresa la infección.Entonces, la actividad NK puede ser detectada enCMSP, mediante métodos que miden la liberaciónde 51Cr por parte de células blanco.Las reacciones de ADCC, específicas para

HIV, pueden también ser evaluadas, ya que laactividad ADCC, mediada por células NK, declinaconforme progresa la enfermedad. Dos tipos deADCC pueden utilizarse en la evaluación depacientes infectados con HIV. La primera, esdenominada ADCC clásica o indirecta, en la cualse usa suero de pacientes infectados y linfocitos dedadores normales. La lisis de las células infectadases evaluada de mediante la liberación de 51Cr. Porotro lado, la ADCC directa, usa células NK frescas,aisladas de pacientes infectados, las que soncultivadas con anticuerpos citofílicos anti HIV yluego incubadas con células blanco infectadas conHIV o recubiertas con antígenos del virus.

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5.4. Evaluación de los niveles de citoquinas ysubpoblaciones de linfocitos T

Varias observaciones sugieren, que en lainfección por HIV, ocurre una alteración en elbalance de la expresión de citoquinas y susreceptores, lo que podría contribuir a lapatogénesis de la infección. Elevados niveles deIL-1, IL-6, GM-CSF, TNF y TNF se hanreportado en suero y líquido cefalorraquídeo enpacientes con HIV. De igual manera, segúnprogresa el síndrome, se observa una disminuciónen los niveles de IL-2 y IFN , a la vez queaumentan IL-4 e IL-10. Esta observación sugiereque durante el transcurso de la enfermedad, laactividad de la subpoblación Th1 disminuyemientras que la subpoblación Th2 aumenta. Siendoque Th1 están asociados a las RHR y a lasreacciones de citotoxicidad mientras que Th2 seasocia a la producción de anticuerpos, este cambioen el predominio de una determinada subpoblaciónpodría contribuir a la progresión de la enfermedad.La disminución en la subpoblación Th1 se puedeasociar al hecho que en pacientes con SIDA, seobserva una significativa reducción en lareactividad de las pruebas de sensibilidad cutánea("skin-test"). De esta manera, la determinación decitoquinas y sus receptores mediante métodosmoleculares parece ser de central importancia enla evaluación de la progresión del síndrome.Los procedimientos de laboratorio propues-

tos en la evaluación de pacientes con HIV seresumen en la figura 41-10.

LECTURAS SUGERIDAS

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Figura 41-10. Flujograma de la evaluación inmunológica del paciente infectado con HIV.

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