capitulo 13coloracion de frotis de sangre periferica
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ELABORACIÓN DE FROTIS SANGUÍNEO
CAPÍTULO
COLORACIÓN DE FROTIS SANGUÍNEOS:
Las tinciones hematológicas se pueden clasificar según diferentes criterios:
1- Atendiendo al grado de vitalidad de las células a colorear:
-Coloraciones vitales o supravitales: Se realiza sobre células vivas. Son
colorantes vitales, el azul de metileno, el naranja de acridina, y el verde jano.
- Coloraciones no vitales: Se realiza sobre células muertas por lo cual es
necesario un proceso de fijación previo.
2- Atendiendo a la utilización de un solo colorante (monocromía), o al uso de
varios colorantes (policromasia). En este tipo de coloraciones se encuentran las
coloraciones tipo Romanowsky.
Para la coloración de extendidos de sangre periférica y de la médula ósea se
utilizan los colorantes tipo ROMANOWSKY. Estos consisten en una mezcla de
eosinato de azur de metileno, eosinato de azul y de violeta de metileno.
El azur de metileno es un derivado por oxidación de azul de metileno, se forma
en las mezclas de eosina y azul de metileno así como también
espontáneamente en las sales viejas de azul de metileno. El azul de metileno
colorea selectivamente la cromatina y las sustancias azurófilas.
El violeta de metileno es también un derivado del azul de metileno y se obtiene
igual que el azur, a este se debe la coloración metacromática de granulaciones
basófilas.
Los colorantes de tipo ROMANOWSKY son inactivos cuando están disueltos
en alcohol metílico actuando previamente como un fijador.
Si agregamos agua de la dilución, precipitan y al pasar del estado de solución
al de precipitación es cuando actúan con la particularidad de volverse otra vez
inactivos cuando han precipitado totalmente.
Como las propiedades de coloración dependen de una disociación balanceada
del complejo neutro, el pH del alcohol metílico y del agua son de gran
importancia. El alcohol metílico absoluto no debe contener trazas de acetona ni
de ácido acético y el agua debe ser neutra o usarse un amortiguador neutro
ligeramente ácido.
ELABORACIÓN DE FROTIS SANGUÍNEO
A las coloraciones de tipo ROMANOWSKY pertenecen Giemsa, Wright,
Leishman y la coloración de Peppenheim, que es una asociación de dos
colorantes.
COLORACIÓN DE WRIGHT.
El colorante de Wright, se encuentra en el comercio bajo dos formas: en
polvo para que la solución colorante sea preparada en el laboratorio o la
solución ya preparada.
Preparación de la solución colorante:
a) Colocar 1g. de colorante de Wright en un mortero limpio y seco.
b) Medir 600cc de alcohol metílico libre de acetona y vaya añadiendo
pequeñas cantidades de éste en el mortero triturando el polvo,
transfiriendo el sobrenadante a un frasco ámbar limpio y seco,
añada más alcohol metílico y repita la operación hasta que todo el
polvo se haya disuelto completamente en los 600cc de alcohol
metílico.
c) Se deja madurar durante 15 días por lo menos.
d) De esta solución filtre pequeñas porciones en frascos gotero para el
uso diario. Mantenga los frascos bien tapados para evitar la
evaporación de alcohol o la entrada de vapor de agua.
Preparación de la solución amortiguadora:
Buffer de Fosfatos a pH 6,4:
Fosfato Monobásico de Potasio anhidro (K H2 PO4 )....................6.63 g.
Fosfato dibásico de sodio anhidro (Na2 HPO4 )............................2.56 g
Agua destilada............................................................................ 1000 cc.
Buffer de Fosfato a pH 6,7
Fosfato monobásico de potasio anhidro (KH2 PO4 ).....................5.13 g.
Fosfato dibásico de sodio anhidro (Na2 HPO4).............................. 12 g.
Agua destilada..............................................................................1000 cc.
Técnica de coloración:
ELABORACIÓN DE FROTIS SANGUÍNEO
a) Coloque las laminillas o láminas con el frotis hacia arriba en una
bandeja de coloración.
b) Cubra el frotis bien seco con la solución de WRIGHT.
c) Se deja actuar durante dos minutos. En esta etapa se fija el frotis a
la laminilla por desnaturalización de las proteínas con el alcohol
metílico.
d) Sin derramar el colorante se agrega igual número de gotas de agua
neutra o de buffer, que las añadidas anteriormente. Este segundo
tiempo varía de 3 - 5 minutos y es la etapa de coloración.
e) Se sopla para que se mezcle bien el agua y la solución colorante.
Cuando se ha mezclado bien se observa en la superficie un brillo
metálico.
f) Se lava con agua destilada hasta que no queden restos de colorante
y se deja secar bien al aire.
g) Una vez seco los frotis, se debe eliminar la tinción de la parte
posterior de la preparación pasando con cuidado una gasa
impregnada con alcohol.
NOTA: Puede suceder que cuando se utilice un nuevo lote de
colorante varían los tiempos de fijación y coloración, así como también las
cantidades relativas de colorante y de buffer.
Resultados de la coloración de Wright:
En una buena tinción, la preparación debe presentar un color rosado a
simple vista.
Microscópicamente se observa:
a) Los hematíes de color rosa.
b) Los núcleos de los leucocitos azul púrpura.
c) El citoplasma de los leucocitos neutrófilos maduros, de color rosado
pálido.
d) En otras células el color del citoplasma puede variar desde los tonos
azules muy oscuros de las células plasmáticas y de los eritroblastos
basófilos, hasta el tono azul celeste de los linfocitos.
e) El citoplasma de los monocitos se colorea de azul gris.
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f) Las granulaciones se definen muy bien:
Neutrófilas se ven de color lila.
Eosinófilas, rojo anaranjada.
Basófilas, azul-negro o violeta.
Azurófilas, púrpura-rojiza.
Defectos de coloración:
a) Coloraciones excesivamente azules:
- Resultan del lavado insuficiente,
- Extendidos muy gruesos,
- Tiempo de coloración excesivo
- Alcalinidad muy alta del amortiguador, del agua o del colorante.
- Colorante muy concentrado,
- Tiempo de secado insuficiente
Para mejorar el color puede emplearse menos colorante o más diluyente, o
bien reducir el tiempo de tinción y aumentar el tiempo del lavado.
b) Coloraciones excesivamente rojas:
- Resultan de acidez excesiva del colorante, del amortiguador o del agua.
- Extensión muy fina,
- Colorante diluido,
- Tiempo insuficiente de tinción,
- Excesivo tiempo de lavado
- Agua de lavado con cloro
c) Coloraciones pálidas:
- Resultan del lavado excesivo o falta de tinción adecuada.
Desventajas de la coloración de Wright:
a) Una de las dificultades que plantea el empleo del colorante de
Wright es que trata de una solución alcalina donde la concentración
del colorante se modifica en forma continúa por oxidación
progresiva del álcali.
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b) Otra desventaja son las alteraciones en la concentración del
disolvente (alcohol metílico) por evaporación del colorante cuando
se agrega agua durante la tinción.
Elementos que pueden inducir a error:
Presencia de precipitados de colorante:
- La acción prolongada del colorante deja restos
- Falta de filtración del colorante.
- Utilización de portaobjetos sucios o engrasados
Presencia de artefactos en la muestra:
- Una acción prolongada del anticoagulante, puede entre otras cosas
ocasionar:
a- Vacuolas en el citoplasma de los monocitos.
b- Segmentación nuclear
c- Agregación de plaquetas alrededor de los leucocitos.
d- Espiculación de hematíes.
e- Células fragmentadas
- Utilizar portaobjetos sucios, puede ocasionar:
a- Micro burbujas
b- Partículas que se confunden con plaquetas
c- Precipitados de células microbianas que pueden dar imágenes falsas.
COLORACIÓN DE GIEMSA:
Preparación del colorante:
Azur II Eosina ……………………………… 3 g
Azur II …………………………………….. .. 0.8 g
Glicerina purísima ..................................... 125cc
Alcohol metílico puro ................................. 375cc
El alcohol metílico es el disolvente, la glicerina permite aumentar la
concentración del colorante, evitando así los inconvenientes que podrían
provenir de la extrema volatilidad del alcohol metílico.
En el momento de usarla se debe diluir esta solución en agua neutra o
soluciones buffer de pH. 6,4 a 6,8.
ELABORACIÓN DE FROTIS SANGUÍNEO
Preparación de la solución Buffer:
Fosfato disódico (Na2 HPO4)................................... 0.6 g
Fosfato monopotásico (KH2 PO4).............................. 0.4 g
Agua destilada........................................................... 100 cc.
Para preparar la solución de trabajo, se diluyen 10 cc de la solución stock y
se llevan a 500 cc con H2O destilada.
En caso de no tener solución buffer puede usarse agua neutra, para
obtenerla se mezclan partes iguales de agua destilada ( ácida) y de
agua de chorro (alcalina). Para comprobar que quedó neutra se le
agrega 1 gota de solución alcohólica de rojo neutro al 1% a cada
litro de agua, la presencia de un pH neutro se pone de manifiesto por la
aparición de una coloración anaranjada. Si se observa un color rosado
el agua está ácida y se podrá neutralizar con unas gotas de solución
diluida de Carbonato de Sodio. Si por el contrario el indicador revela
una coloración amarilla, el agua está alcalina y podrá agregársele
unas gotas de ácido acético diluido hasta neutralizarla.
Técnica de la coloración:
a) La solución de trabajo de Giemsa se prepara a partir de la
solución madre así: Coloque en una copa graduada 2 cc de
buffer o de agua neutra y agregue por cada cc de buffer
medido una gota de la solución madre de Giemsa (también
puede agregarse 2 gotas por cada cc de buffer dejando actuar el
colorante la mitad de tiempo).
b) Se procede a fijar el frotis agregándole unas gotas de metanol
suficiente para cubrir las láminas. Déjelo actuar por 3 minutos.
También puede usarse alcohol absoluto dejándolo actuar 5
minutos.
c) Terminada la fijación se bota el alcohol sobrante o se deja que
se evapore.
d) Se cubre la lámina con la solución Giemsa diluida y se deja
actuar por 30 minutos. Si se agregó 2 gotas de Giemsa por
cada cc de buffer se deja actuar por 15 minutos.
ELABORACIÓN DE FROTIS SANGUÍNEO
e) Lave la lámina y déjela secar colocándola sobre papel
absorbente.
Resultados:
La solución de Giemsa colorea muy bien la cromatina y las granulaciones
acidofilas y basófilas.
COLORACIÓN DE WRIGHT–GIEMSA:
Se han obtenido muy buenos resultados combinado estas dos coloraciones
teniendo la ventaja de que los frotis se conservan coloreados por mucho
mas tiempo.
Técnica:
a) Coloración de Wright.
b) Después de lavar la lámina se le agrega Giemsa diluido dejándolo
actuar por 20 minutos.
c) Lavar.
MONTAJE DE LA PREPARACIÓN:
Una vez que los frotis sanguíneos han sido coloreados y están secos se
procede a montarlos para la observación microscópica:
Si los frotis se han realizado en cubreobjetos se colocan éstos
sobre un portaobjeto y entre ambos se coloca aceite de inmersión.
Si los frotis se han realizado en portaobjetos se coloca un
cubreobjetos sobre la preparación y entre ambos una gota de
aceite de inmersión.
En cualquiera de los dos casos anteriores debe utilizarse suficiente aceite
y extenderlos completamente entre el portaobjeto y cubreobjetos a fin de
evitar burbujas de aire.
Cuando se va a realizar la observación microscópica con objetivo de
inmersión (100 X), se coloca una gota de aceite de inmersión encima del
cubreobjetos.
ELABORACIÓN DE FROTIS SANGUÍNEO
EXAMEN MICROSCÓPICO DEL EXTENDIDO DE SANGRE
Uno de los exámenes más importante en el estudio de la sangre lo constituye
la observación microscópica detallada del extendido de sangre ya que permite
hacer un estudio cualitativo de los diferentes elementos celulares.
Lo primero que debe hacerse es observar la preparación con objetivo seco de
menor aumento así podemos tener una visión panorámica del extendido y
comprobar si el frotis es satisfactorio en cuanto a distribución de los elementos
y en cuanto a coloración. Una vez juzgado el frotis como satisfactorio se elige
una de las mejores áreas para hacer un examen mas detallado primero a
mediano aumento y luego con lente de inmersión.
Se examina sistemáticamente los glóbulos rojos, los glóbulos blancos y las
plaquetas anotando cualquier alteración cualitativa que se observe así como
también la posible presencia de células extrañas a la sangre o de parásitos
intra o extracelulares.
1) Glóbulos rojos:
a) Tamaño (microcitosis, macrocitosis. normocitosis) y variación de este
(ANISOCITOSIS), los eritrocitos normales tienen aproximadamente 7
micras de diámetro.
b) Forma (esferocitos, ovalocitos, células en diana, etc.) y variaciones de
ésta (POIQUILOCITOSIS)
c) Intensidad del color de los glóbulos, que nos da una idea de su
contenido en hemoglobina ya que ésta es el principal componente
coloreable de los eritrocitos.
d) Variaciones del color (basofilia difusa, policromatofilia). Presencia de
estructuras coloreables intraeritrocitarias (anillos de Cabot, corpúsculos
de Howell-Jolly) así como la presencia de glóbulos rojos inmaduros
nucleados (normoblastos ó eritoblastos) los cuales NO deben
confundirse con los glóbulos blancos.
2) Glóbulos blancos:
Para la identificación de los distintos tipos de leucocitos es necesario
examinar
cuidadosamente cada célula, observando las siguientes características :
ELABORACIÓN DE FROTIS SANGUÍNEO
a) Tamaño de la célula en comparación con el de otra célula observadas
en el mismo frotis.
b) Examinar el núcleo, observando:
Su posición dentro de la célula: central o excéntrico
Su forma: redondo, arriñonado, en cayado, si es o no segmentado y
número de segmentos.
Su color.
Estructura de la cromatina: malla fina, laxa, medianamente gruesa o
gruesa
Si presenta nucléolos ó no.
c) Examinar al citoplasma, observando:
Cantidad relativa en comparación al tamaño celular y al tamaño del
núcleo: escaso, moderado, abundante .
Coloración: azul, rosa , etc.
Si se observa zona clara perinuclear o no.
Si presenta o no granulaciones, su número aproximado, su color y
su distribución.
3) Plaquetas:
a) Lo primero que debe comprobarse es su presencia o ausencia en el
extendido y hacer una apreciación aproximada de su número.
b) Luego se observa su morfología y su tamaño. Normalmente son
corpúsculos de 2 a 3 micras de diámetro con una parte granular central
de color púrpura y un citoplasma hialino rosa en la periferia. En algunos
casos, pueden observarse variaciones muy marcadas en el tamaño de
las plaquetas (ANISOCITOSIS plaquetaria) y en otros casos plaquetas
muy grandes (MACROTROMBOCITOS).
Ocasionalmente, se pueden observar en sangre periférica
fragmentos de megacariocitos.
ELABORACIÓN DE FROTIS SANGUÍNEO
BIBLIOGRAFÍA
1.- Balcells, A. La Clínica y el Laboratorio. 11ª. Edición. 1.978
2.- Casas, A. Laboratorio Clínico. Hematología. Interamericana. Mc.Graw-
Hill. 1994.
3.- McKenzie, Shirlyn B., Hematología Clínica. 2da Edición. Editorial Manual
Moderno. Capítulo 27. 2.000
4.- Sonnenwirth - Jarett. Métodos y Diagnósticos de Laboratorio. Editorial
Médica Panamericana. Tomo 1. 1983.
5.- Serrano, Josefa M. (2.005). Fundamentos y Técnicas de Análisis
Hematológicos y citológicos. Editorial Masson S.A
6.- Vives Joan LL. (2.001). Manual de técnicas de Laboratorio en
Hematología. Editorial Masson S.A