De todas las funciones de las protenas, la catlisis es probablemente la ms im-portante. En la ausencia de catalizadores, la mayora de las reacciones en los sis-lemas biolgicos sucederan demasiado lentas como para aportar productosnecesarios a un ritmo adecuado para un organismo en la metablisis. Los catali-zadores que tienen esta funcin en los organismos se llaman enzimas. Con laexcepcin de algunos ARN (ribozimas) (se describen en las secciones 11.7 y12.4), todas las dems enzimas son protenas globulares (seccin 4.3). Las enzi-mas son los caralizadores conocidos ms eficientes; pueden incrementar la rapi-dez de una reaccin dada por un factor hasta de 1020 sobre las reacciones nocatalizadas. A diferencia, los catalizadores no enzimticos estimulan la velocidadde reaccin slo por factores de 102 a 10'1.

Como veremos en los siguientes dos captulos, las enzimas se caracterizanpor ser altamente especficas, aun al grado de ser capaces de distinguir variosestereoismeros de un mismo compuesto, y con base en ello incrementar lavelocidad de una reaccin especfica. En muchos casos, las acciones de las enzi-mas estn finamente sintonizadas por los procesos regulatorios.

Los catalizadores son sustancias que aceleran la velocidad de una reaccinqumica orgnica.Las enzimas son los catalizadores biolgicos que aceleran las reaccionesmetablicas que ocurren en el cuerpo.La mayora de las enzimas son protenas globulares.

La velocidad de reaccin y su preferencia termodinmica son dos cosas diferentes,aunque estn ntimamente relacionadas. Esto es cierto para todas las reacciones, yasea que est o no participando un catalizador. La diferencia entre las energas delos reactivos (el estado inicial) y las energas de los productos (estado final) de unareaccin da un incremento o decremento (incremento negativo) de energa paraesa reaccin, el cual expresamos como el cambio de energa libre estndar, o LlGo.Los cambios de energa pueden ser descritos por diversas cantidades termodinmi-cas relacionadas. Nosotros usaremos los cambios de la energa libre estn dar parafines de nuestra discusin; la cuestin de si una reaccin es favorecida depende delLlGo (ver la seccin l.9 y 15.2). Las enzimas y todos los catalizadores aceleran lareaccin, pero no alteran la constante de equilibrio o el cambio de energa libre.La velocidad de la reaccin depende de la energa libre de activacin o energa deactivacin (D.G':), que es el aporte de energa requerido para iniciar la reaccin.La energa de activacin requerida para una reaccin no catalizada es mayor quela de la catalizada: en otras palabras una reaccin no catalizada requiere ms ener-ga para iniciarse. Por esta razn es ms lenta que la de la catalizada.

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1

Un viaje a travs del paso de una montaaes una analoga usada frecuentementepara describir el avance de una reaccinqumica. Los catalizadores aceleran el pro-ceso,

Si una reaccin es espontnea, isignifica esto queser rpida?

iSi uno eleva la temperatura. aumentar lavelocidad de una reaccin?

La velocidad de una reaccin ise basa siempre enla concentracin de los reactivos?

iPor qu las enzimas se unen a los sustratos?

e iPor qu la quimotripsina y la ATCasa tienendiferentes curvas de velocidad1

iCmo calculamos KM y Vm, de unaID iCul es el significado de KMy

iCmo podemos identificar un inhibidorcompetitivo?

o iCmo podemos identificar un inhibidor nocompetitivo?

144 Captulo 6 El comportamiento de las protenas: las enzimas

Progreso de la reaccin ------.

Progreso de la reaccin ------.

FIGURA 6.1 Perfiles de energalibre. a) La energa libre del perfil deactivacin para una reaccin tpica. Lareaccin mostrada aqu es exergnica(libera energa). Observa la diferenciaentre la energa libre de activacin (ilG't)y la energa libre estndar de la reaccin(ilG'). b) Una comparacin de la energalibre de perfiles de activacin para reaccio-nes catalizadas y sin catalizar. La energaJibre de activacin de la reaccin catalizadaes mucho menos que la de la reaccin sincatalizar.

La reaccin de glucosa con e! oxgeno para producir bixido de carbono yaguaes un ejemplo de una reaccin que requiere cierto nmero de catalizadores enzim-ticos:

Esta reaccin es termodinmicamente favorable (espontnea en e! sentido termodi-nmico) ya que su cambio en energa libre es negativo (!le" = -2880 k] mol-l =-689 kcal mol-l).

Si una reaccin es espontneasignifica esto que ser rpida?Observa que el trmino espontneo no quiere decir "instantneo". La glucosa es esta-ble en el aire con un abasto ilimitado de oxgeno. La energa que debe ser abastecidapara iniciar la reaccin (que a partir de ah procede con liberacin de energa) -laenerga de activacin- es conceptualmente similar al acto de empujar un objetohasta la cima de una colina para que se deslice hacia abajo por el otro lado.

La energa de activacin y su relacin con e! cambio de energa libre de unareaccin puede ser mejor captada grficamente. En la figura 6.1A, e! eje de las x nosmuestra e! avance que la reaccin va teniendo, y e! eje de las y nos indica los cambiosde energa libre para una reaccin idealizada. El perfil de energa de activacin muestralas etapas de una reaccin, o sea aquellas entre los estados inicial y final. Los perfilesde energa de' activacin afectan la velocidad de la reaccin y la presencia de uncatalizador acelera la reaccin al cambiar el mecanismo y de este modo se reduce laenerga de activacin necesaria. La figura 6.1Agrafica las energas para una reaccinexergnica, espontnea, como la de la oxidacin completa de la glucosa. En e! mxi-mo de la curva que conecta los reactivos y los productos aparece el estado de transi-cin con la cantidad necesaria de energa y el arreglo correcto de los tomos paradar los productos. La energa de activacin puede tambin ser vista como la cantidadde energa libre requerida para llevar a los reactivos al estado de transicin.

La analoga de viajar por el sendero de una montaa situada entre dos valles esusada frecuentemente en la discusin de los perfiles de energa de activacin. Elcambio de energa corresponde al cambio de elevacin y el progreso de la reaccincorresponde a la distancia recorrida. El anlogo del estado de transicin es la cimadel sendero. Se ha aplicado un esfuerzo considerable para dilucidar las etapas inter-medias en las reacciones de inters para los qumicos y los bioqumicos, y tambinpara determinar la ruta o mecanismo de reaccin intermedio entre las etapas inicialy final. La dinmica de la reaccin, el estudio de las etapas intermedias de los meca-nismos de reaccin es hoy en da un campo de investigacin muy activo. En e! cap-tulo 7, veremos e! uso de molculas que imitan el estado de transicin, llamadasanlogos de! estado de transicin, las cuales son usadas para estudiar los mecanismosespecficos de la catlisis enzimtica.

El efecto ms importante de un catalizador sobre una reaccin qumica es apa-rente cuando se compara con los perfiles de energa de activacin de la misma reac-cin catalizada y sin catalizar, como se muestra en la figura 6.1B. El cambio deenerga libre estndar para la reaccin, o sea, !le", permanece inalterada cuando seadicionan catalizadores, pero la energa de activacin, !lGot, sin embargo, se reduce.En la analoga de la colina y el valle, e! catalizador es una gua que encuentra la tra-yectoria ms fcil entre los dos valles. Una comparacin similar puede ser hechaentre dos rutas de San Francisco a Los ngeles. El punto ms alto en la interestatal5 es e! paso Tejn (a 4400 pies) yes el anlogo de la ruta sin catalizar. El punto msalto en la carretera federal U.S. 101 est no muy arriba de 1000 pies. Los puntosinicial y final del viaje son los mismos, pero las rutas entre ellos son diferentes, comolo son los mecanismos de las reacciones catalizada y sin catalizar. La presencia de unaenzima disminuye la energa de activacin requerida para que las molculas del sus-trato alcancen el estado de transicin. La concentracin del estado de transicinaumenta marcadamente. Como resultado de ello, la velocidad de la reaccin catali-

,\_---------

6.2 Cintica vs termodinmica 145

zada es mucho mayor que la de la reaccin sin catalizar. Los catalizadores enzimti-cos incrementan la rapidez de reaccin en muchas potencias de la.

La reaccin bioqumica en la cual el perxido de hidrgeno (agua oxigenadaH202) es convertida a agua y oxgeno nos da un ejemplo del efecto de los cataliza-dores en la energa de activacin.

2H202 ~ 2H20 + O2

La energa de activacin de esta reaccin es reducida si a la reaccin se le permiteseguir su curso sobre superficies de platino, pero es an mucho menor si est presen-te la enzima catalasa. La tabla 6.1 resume las energas implicadas.

Energa libre de activacinCondiciones de reaccin Velocidad relativa

75.248.923.0

18.011.75.5

Sin catalizadorEn superficie de platino

Catalasa

12.77 X 104

6.51 X 108

Las velocidades estn dadas en unidades arbitrarias relativas a un valor de 1 para la reaccin sin catalizar a 3rC.

estado expuestos inapropiadamente a esas importantes toxinasagrcolas. De hecho, ms de 20 enzimas son usadas de maneracomn en el diagnstico de enfermedades en 'un laboratorioclnico. Existen indicadores altamente especficos para las enzi-mas activas en el pncreas, los glbulos rojos, e! hgado, elcorazn, e! cerebro y la glndula prosttica y muchas de lasglndulas endocrinas. Debido a que esas enzimas son fciles dedetectar en un laboratorio, aun usando tcnicas automatizadas,son por ello parte del examen "estndar" de sangre que elmdico prefiere requerir a los laboratorios para realizar unbuen diagnstico.

Las enzimas como indicadores de enfermedadAlgunas enzimas se encuentran nicamente en tejidos especfi-cos o en un nmero limitado de algunos tejidos. La enzimalactato deshidrogenasa (LDH) tiene dos tipos diferentes desubunidades: una que se encuentra principalmente en elmsculo del corazn (H) y otra que se encuentra en el mscu-lo esqueltico (M). Las dos enzimas difieren ligeramente en sucomposicin de aminocidos; en consecuencia, pueden serseparadas electrofortia o cromatogrficamente con base ensu carga. Debido a que la LDH es un tetrmero de cuatro subu-nidades y debido a que las subunidades H y M pueden combi-narse en todas las posibilidades, la LDH puede existir en cincoformas diferentes, llamadas isozimas (o isoenzimas), depen-diendo de la fuente. Un incremento en cualquiera de las for-mas de la LDH es un indicador de algn tipo de dao de untejido. Un ataque cardiaco normalmente era diagnosticado porun incremento en la LDH en e! msculo de! corazn. Similar-mente, hay diferentes formas de creatina quin asa (CK), unaenzima que aparece en el cerebro, el corazn y el msculoesqueltico. La aparicin del tipo cerebral puede indicar unaembolia o un tumor cerebral, mientras que el tipo cardiacoindica un ataque al corazn. Despus de uno de estos ataques,la CK aparece ms rpidamente en la sangre que la LDH. Elmonitoreo de la presencia de ambas enzimas aumenta la posi-bilidad de un buen diagnstico, lo cual es til, ya que un ataquecardiaco moderado podra ser difcil de diagnosticar. Un nivelelevado de la' isozima del msculo del corazn en la sangre esuna indicacin definitiva de dao al tejido del corazn.

Una enzima particularmente til de verificar en laborato-rio es la acetilcolinesterasa (ACE), la cual es importante en elcontrol de ciertos impulsos nerviosos. Muchos pesticidas inter-fieren con esta enzima, de modo que los granjeros frecuente-mente son examinados para estar seguros de que no han

M4 H4Formas homogneas

Vemos aqu las variantes posibles de isozimas dela lactato deshidrogenasa. El smbolo M se refierea la forma de deshidrogenasa que predomina en elmsculo esqueltico y el H se refiere a la que predo-mina en el msculo del corazn (la cardiaca).

146 Captulo 6 El comportamiento de las protenas: las enzimas

"d 100'"-e:~::v"do. 50,~8v.'>::vuHoA.

20 40 60 80Temperatura, De

FIGURA 6.2 El efecto de la tem-pera/ura sobre la actividad enzimtica.Actividad relativa de una reaccin enzi-mtica como funcin de la temperatura.El descenso en actividad arriba de 50e esdebido a desnaturalizacin trmica.

Si uno eleva la temperatura, aumentarla velocidad de una reaccin?La elevacin de la temperatura de una mezcla de reaccin aumenta la energa dispo-nible para que los reactivos alcancen el estado de transicin. En consecuencia, la ra-pidez de una reaccin qumica se incrementa con la temperatura en principio. Unopodra verse tentado a suponer que esto es cierto universalmente para todas las reac-ciones bioqumicas. De hecho el incremento de esta velocidad de reaccin con latemperatura ocurre slo hasta cierto lmite en las reacciones biolgicas. Es til elevarla temperatura al principio, pero en forma eventual se llega al punto en el cual sealcanza la desnaturalizacin de la enzima por calor (seccin 4.4). Arriba de esta tem-peratura, el aadir ms calor desnaturaliza ms la enzima y se ralentiza la reaccin.La figura 6.2 nos muestra una curva tpica del efecto de la temperatura sobre unareaccin catalizada por una enzima. El recuadro anterior de conexiones bioqumicasdescribe otra forma en la cual la especificidad de las enzimas es de gran uso.

- ~ - ~Resumen de la seccin 6.2 La termodinmica de una reaccin bioqumica se refiere a si una reaccin es

espontnea. Una reaccin espontnea es la que tiene energa libre de Gibbsnegativa o ~ G',

La cintica se refiere a cun rpido ocurre una reaccin. Una reaccin puedetener ~eo negativa y an no acontecer rpidamente.

Las enzimas aceleran una reaccin al bajar la energa de activacin requeridapara una r-eaccin. stas ayudan a que el sustrato y la enzima alcancen el estadode transicin, elpunto ms alto del diagrama de energa para la reaccin.

6.3 Ecuaciones de emtica enzimticaLa velocidad de una reaccin qumica por lo general es expresada en trminos de laconcentracin de un reactivo o de un producto con respecto a un intervalo de tiem-po. Se puede usar cualquier mtodo experimental conveniente para monitorear loscambios de concentracin. En una reaccin de la forma A + B -- P, en donde A y Bson los reactivos y P el producto, la velocidad de reaccin puede ser expresada tantoen trminos de la velocidad de desaparicin de uno de los reactivos como en trminosde la velocidad de aparicin del producto. La velocidad de desaparicin de A es- ~ [A]/ ~t, en donde el smbolo ~ significa cambio (incremento o decremento), [A]es la concentracin de A en moles por litro y t es el tiempo. De igual modo, la veloci-dad de desaparicin de B es -~[B]/ ~t Yla velocidad de aparicin de P es ~[P]/ ~t.La velocidad de la reaccin puede ser expresada en trminos de cualquiera de esoscambios debido a que todos estn relacionados por la estequiometra de la reaccin.

. - MAl - MBl MplVelocidad = = = --

~t ~t ~t

Los signos negativos en los cambios de concentracin de los reactivos A y B indicanque ambos estn siendo consumidos en la reaccin, mientras se va produciendo P.

Se tiene establecido que el avance de una reaccin en un tiempo dado es pro-porcional al producto de las concentraciones de los reactivos elevado a las potenciasapropiadas.

Velocidad co [A]f[B]g

O, como una ecuacin,

Velocidad = k[A]f[B]g

donde k es una constante de proporcionalidad llamada-la constante de velocidad dereaccin. Los exponente~ fy g deben ser determinados en forma experimental. stos no nece-sariamente son iguales a los coeficientes de la ecuacin balanceada, pero con frecuen-cia s, Los parntesis rectangulares, como de costumbre, denotan concentracin mo-

6.3 Ecuaciones de cintica enzimtica 147

lar. Cuando los exponentes en la ecuacin de velocidad han sido determinadosexperimentalmente, se puede proponer un mecanismo para la reaccin: una descrip-cin de los pasos detallados a lo largo de la ruta entre los reactivos y los productos.

Los exponentes en la ecuacin de velocidad son por lo comn pequeos nme-ros enteros, como 1 o 2. (Hay casos en que tambin el exponente O aparece.) Losvalores de los exponentes estn relacionados casi siempre con el nmero de molcu-las implicadas en los pasos detallados que constituyen el mecanismo. El orden generalde la reaccin es la suma de todos los exponentes. Si por ejemplo, la velocidad dereaccin A -7 P est dada por la ecuacin

Velocidad = k[A]l (6.1)

en la que k es la constante de velocidad y el exponente para la concentracin de A es 1,entonces la reaccin es de primer orden con respecto a A y de primer orden general.Poniendo un ejemplo paralelo de fsica atmica, tenemos que la velocidad de decli-'nacin radiactiva del fsforo 32 (32p; peso atmico =32) , el cual es ampliamente usa-do como trazador, depende slo de la concentracin de 32p presente. En ste tene-mos un ejemplo de una reaccin de primer orden. Slo los tomos 32p estnimplicados en el mecanismo de declinacin radiactiva, la cual, en forma de ecuacin,toma la forma:

32p -7 Productos de declinacin

Si la velocidad de una reaccin A + B -7 C + D est dada por:

Velocidad = k[A]l[BF (6.2)

donde k e la constante de reaccin, el exponente de la concentracin A y la de B son1, entonces se dice que la reaccin es de primer orden con respecto a A y respecto aB, y de segundo orden general (dado que 1 + 1 = 2). En la reaccin de glucgenon(un polmero de glucosa con n residuos de glucosa) con un fosfato inorgnico Ppara formar glucosa-1-fosfato + glucgenon_l' la velocidad de reaccin depende de lasconcentraciones de ambos reactivos.

Clucgeno., + P -7 Glucosa 1-fosfato + Clucgeno.jVelocidad = k[Glucgeno]l[Pi]l = k[Glucgeno] [Pi]

donde k es la constante de reaccin. Tanto el glucgeno como el fosfato toman parteen el mecanismo de regccin. La reaccin de glucgeno con fosfato es de primerorden con respecto al glucgeno, de primer orden con respecto al fosfato.y de segun-do orden en general.

Muchas reacciones comunes en bioqumica son de primer y segundo orden.Despus que el orden de la reaccin es determinado en forma experimental, se pue-den hacer propuestas acerca del mecanismo de una reaccin.

La velocidad de una reaccin, se basa siempreen la concentracin de los reactivos?Los exponentes en una ecuacin de velocidad pueden llegar a ser igual a cero, conuna velocidad de reaccin A -7 B dada por la ecuacin

Velocidad = k[A]o = k (6.3)

Tal reaccin es llamada de orden cero, y su velocidad que es constante no dependede las concentraciones de los reactivos sino ms bien de otros factores, como la pre-sencia de catalizadores. Las reacciones catalizadas por enzimas pueden exhibir unacintica de orden cero cuando la concentracin de los reactivos es tan alta que laenzima est saturada por completo con molculas reaccionantes. Este punto serdiscutido con ms detalle ms tarde en este captulo, pero, por el momento, pode-mos considerar esta siruacinen forma anloga a un embotellamiento de trfico enel cual seis filas de automviles tratan de cruzar un puente de dos carriles. La veloci-dad a la que los autos cruzan no est afectada por el nmero de carros en espera, sinoslo por el nmero de carriles disponibles en el puente.

148 Captulo 6 El comportamiento de las protenas: las enzimas

- -

Resumen de la seccin 6.3 La velocidad de una reaccin qumica se mide por la velocidad de aparicin de

los productos o la de desaparicin de los sustratos. La velocidad de una reaccin es matemticamente igual a una constante de

velocidad de reaccin, k, multiplicada por la concentracin del(os) sustrato(s)elevado a un exponente.

El orden de una reaccin est descrito por el exponente de la ecuacin respec-tiva. Los rdenes de reaccin O,l Y2 son los ms comunes.

La constante de velocidad de reaccin, k, y los exponentes deben ser medidosen forma experimental para cada reaccin.

6.4 Unin enzima-sustratoEn una reaccin catalizada por una enzima, sta se liga al sustrato (uno de los reacti-vos) para formar un complejo. La formacin del complejo conduce a la formacin deestados de transicin, los cuales son los que forman el producto final. La naturalezade estos estados de transicin en las reacciones enzimticas es en s un gran campode investigacin, pero podemos hacer algunas consideraciones fundamentales sobrela materia. Un sustrato se une normalmente, por interacciones no covalentes, a unapequea porcin de la enzima llamada el sitio activo, con frecuencia ubicado enuna grieta o hendidura de la protena y consiste de ciertos aminocidos que son esen-ciales para la actividad enzimtica (figura 6.3). La reaccin catalizada se lleva a caboen el sitio activo, generalmente en varios pasos.'

Por qu las enzimas se unen a los sustratos?El primer paso es la unin del sustrato a la enzima, lo cual ocurre debido a las inte-racciones altamente especficas entre el sustrato y las cadenas laterales y grupos delesqueleto de aminocidos que constituyen el sitio activo. Se han desarrollado dosimportantes modelos para describir el proceso de unin. El primero, llamado de lla-ve y cerradura, da por hecho un alto grado de similitud entre la forma del sustrato yla geometra del sitio de ligamiento en la enzima (figura 6.3a). El sustrato se une a unsitio cuya forma complementa la propia, como una llave en una cerradura o la piezacorrecta en un rompecabezas tridimensional. Este modelo tiene un atractivo intuitivopero es hoy en da principalmente slo de inters histrico debido a que no toma encuenta una importante propiedad de las protenas que es la flexibilidad de su confor-macin espacial. El segundo modelo toma en cuenta el hecho de que las protenas

Modelo llave-cerradura

Sitio activo

6) En el modelo llave-cerradura, la forma del sustrato y laconformacin del sitio activo son complementarios entre s.

Modelo final inducido

(!) En el modelo de ajuste inducido, la enzima sufre un pequeocambio de conformacin al unirse al sustrato. La forma del sitioactivo se convierte en la complementaria de la forma del sustratoslo despus que ste se enlaza a la enzima.

FIGURA 6.3 Dos modelos para elligamiento de un sustrato a una enzima.

6.4 Unin enzima-sustrato 149

tienen algo de flexibilidad tridimensional. De acuerdo con este modelo de ajuste in-ducido, la unin del sustrato induce un cambio en la conformacin espacial de laenzima que da por resultado una adaptacin complementaria despus que el sustratoha sido ligado (figura 6.3b). El sitio de unin tiene en principio una forma tridimen-sional diferente antes que el sustrato se ligue. El modelo de ajuste inducido es tam-bin ms atractivo cuando consideramos la naturaleza del estado de transicin y lareducida energa de activacin que se requiere en una reaccin catalizada por enzi-mas. La enzima y el sustrato deben unirse para formar el complejo ES antes quecualquier otra cosa suceda. Qu sucedera si este ligamiento fuera demasiado per-fecto? La figura 6.4 nos muestra lo que pasa cuando se unen E y S. Debe haber unaatraccin entre E y S para que stos se liguen. Esta atraccin origina que el complejoES est a un nivel inferior en el diagrama de energa que el E+Sal inicio. Entonces elcomplejo ES unido debe lograr la conformacin del estado de transicin EXt. Si launin de E y S para formar ES encajara perfectamente, el ES estara a tan baja ener-ga que la diferencia entre ESy EXt sera muy grande. Esto reducira la velocidad dereaccin. Muchos estudios han demostrado que las enzimas aumentan la velocidadde reaccin bajando la energa del estado de transicin, EXt, mientras que elevan elnivel de energa del complejo EX. El modelo de ajuste inducido ciertamente soportaesta consideracin mejor que el modelo de " llave-cerradura"; de hecho, el modelode ajuste inducido imita el estado de transicin.

Despus que el sustrato ha sido ligado y el estado de transicin es subsecuente-mente formado, la catlisis puede ocurrir. Esto significa que los enlaces deben serrearreglados. En el estado de transicin, el sustrato se une cerca de los tomos conlos cuales va a reaccionar. Ms all, el sustrato se ubica en la orientacin correctacon respecto a esos tomos. Ambos efectos, la proximidad y la orientacin, son losque aceleran la reaccin. Conforme los enlaces se rompen y se forman nuevos, elsustrato se transforma en producto. En ese momento el producto se desprende de laenzima, la cual puede entonces catalizar de nuevo la reaccin con ms sustrato paraformar ms producto (figura 6.5). Cada enzima tiene su propio modo nico de cat-

-"

IO)....D:.:::

'"'5}...c:~

Sentido del progreso de la reaccin - FIGURA 6.4 La energa libre delperfil de activacin de una reaccin con unligamiento fuerte del sustrato a la enzimapara formar un complejo enzima-sustrato.E+S :::;"",,;:::====='~ ES ::;"",,;::==~'~EXi --------+. E+P

Producto

+~

Producto

FIGURA 6.5 Formacin del producto a partir del sustrato (ligamiento a la enzima)seguido de la liberacin del producto.

150 Captulo 6 El comportamiento de las protenas: las enzimas

lisis, lo cual no es sorprendente dada la gran especificidad de cada enzima. Aun aS,existen algunos modos generales de catlisis dentro de las reacciones enzimticas.Dos enzimas, la quimotripsina y la aspartato transcarbamoilasa, son buenos ejemplosde estos principios generales.

-- -. - -Resumen de la seccin 6.4

Antes que una reaccin pueda 'ser catalizada, la enzima y el sus trato debenunirse.

El sus trato se enlaza a la enzima en un bolsillo especial llamado el sitio activo. El enlace al sitio activo es reversible y ocurre a travs de interacciones no cova-

lentes. Hay dos modelos que son usados frecuentemente para describir la unin: el de

llave-cerradura y el de ajuste inducido. El modelo de ajuste inducido es la descripcin ms precisa de la formacin del

complejo ES, ya que explica cmo el enlace de E + S lleva al establecimientodel estado de transicin.

6.5 Ejemplos de reacciones catalizadas por enzimasLa quimotripsina es una enzima que cataliza la hidrlisis de los enlaces peptdicos,con especificidad para residuos que contengan cadenas laterales aromticas. La qui-motripsina tambin escinde enlaces peptdicos en otros sitios, como la leucina, lahistidina y la glutamina, pero con menor frecuencia que en los residuos aromticos.Tambin cataliza la hidrlisis de enlaces estricos.

Reacciones catalizadas por la quimotripsina

OO

1111/C /R2 + H20 C + H;N -R2R1 N R: ""0-

. 1H

Pptido cido Amina

OO

1111/C /R2 + H20 C + HO-R2 + H+R O R: ""0-

ster cido Alcohol

Condiciones alcalinas

N02

p-Nitrofenilacetato

N02p-Nitrofenolato (amarillo)

6.5 Ejemplos de reacciones catalizadas por enzimas 151

Aunque la hidrlisis de steres no es importante en lo que toca a la funcinfisiolgica de la quimotripsina en la digestin de las protenas, es sin embargo, unsistema modelo conveniente para investigar la catlisis enzimtica de las reaccionesde hidrlisis. El procedimiento usual de laboratorio es usar los steres de p-nitrofe-nilo como sustrato y monitorear el progreso de la reaccin por la aparicin de uncolor amarillo en la mezcla de reaccin causado por la produccin del in p-nitrofe-nilato.

En una reaccin tpica en la cual un ster de p-nitrofenilo es hidrolizado porquimotripsina, la velocidad experimental de la reaccin depende de la concentra-cin del sustrato: en este caso, el ster de p-nitrofenilo. A bajas concentraciones delsustrato, la velocidad de reaccin aumenta conforme se aade ms sustrato. En con-centraciones mayores de sustrato, la velocidad de reaccin cambia muy poco conms adicin hasta que se alcanza un mximo. Cuando estos resultados se presentanen una grfica, la curva se vuelve hiperblica (figura 6.6).I Otra reaccin catalizada por enzimas es la catalizada por la aspartato transcarba-moilasa (ATCasa). Esta reaccin es el primer paso en la ruta que conduce a la for-macin del trifosfato de citidina (CTP) y deltrifosfato de uridina (UTP), los cualesson en ltima instancia requeridos para la biosntesis del ARN y el ADN. En estareaccin, el carbamoil fosfato, reacciona con el aspartato para producir carbamoilaspartato e in fosfato.

Carbamoil fosfato + aspartato ~ carbamoil aspartato + HPO~-Reaccin catalizada por la aspartato transcarbamoilasa

La velocidad de esta reaccin tambin depende de la concentracin del sustrato: eneste caso, del aspartato (la concentracin del carbamoil fosfato se conserva constan-te). Los resultados experimentales muestran una vez ms que la velocidad de reac-cin depende de la concentracin de sustrato a bajas ymoderadas concentraciones y,tambin, que se alcanza un mximo asinttico de velocidad ya en las altas concentra-ciones del mismo.

Existe, sin embargo, una diferencia importante. Para esta reaccin la grfica quenos muestra la dependencia de la velocidad de reaccin con la concentracin desustrato tiene una forma sigmoidal ms que hiperblica (figura 6.7).

Por qu la quimotripsina y la ATCasatienen diferentes curvas de velocidad?Los resultados de los experimentos sobre la cintica de reaccin de la quimotripsinay de la aspartato transcarbamoilasa son representativos de los resultados experimen-tales obtenidos con muchas otras enzimas. El comportamiento cintico general demuchas enzimas es muy parecido al de la quimotripsina, mientras que otras enzimasse comportan en forma similar a la aspartato transcarbamoilasa. Podemos usar estainformacin para llegar a algunas conclusiones generales acerca del comportamien-to de las enzimas. La comparacin entre los comportamientos cinticos de la quimo-tripsina y la ATCasenos recuerda la relacin entre los comportamientos de la uninde oxgeno por la mioglobina y la hemoglobina, discutidos en el captulo 4. LaATCa-sa y la hemoglobina son protenas alostricas; la quimotripsina y la mioglobina no.(Recordemos de la seccin 4.5 que las protenas alostricas son aquellas en que cam-bios sutiles en un sitio de la protena afectan la estructura y funcin en otro sitio re-lativamente alejado. Los efectos cooperativos, como el hecho de que la unin de laprimera molcula de oxgeno a la hemoglobina facilita que se unan otras molculas,son los que dan un sello caracterstico a las protenas alostricas.) Las diferencias decomportamiento entre las protenas alostricas y las no alostricas pueden entender-se en trminos de modelos basados en las diferencias estructurales entre los dos tiposde protena. Cuando en los captulos siguientes encontremos mecanismos de las mu-chas reacciones catalizadas por enzimas, necesitaremos un modelo que explique elcomportamiento hiperblico de los datos cinticos para las enzimas no alostricas yotro que explique la forma sigmoidal para las alostricas. El modelo Michaelis-Men-ten es ampliamente usado para enzimas no alostricas y para las alostricas se usanvarios modelos.

Concentracin [S] de ---p- ni trofenilacetato

FIGURA 6.6 Dependencia dela velocidad de reaccin, V, de la concen-tracin de P.nitrofenilacetato [S], en unareaccin catalizada por quimotripsina. Laforma de la curva es hiperblica.

rc:'o'ou

'"~

152 Captulo 6 El comportamiento de las protenas: las enzimas

Resumen de la seccin 6.5 La quimotripsina es una enzima que escinde los pptidos cerca de los amino-

cidos con cadenas laterales aromticas. Puede ser estudiada usando un sus tratoanlogo que contenga p-nitrofenilacetato.

Cuando la velocidad de la quimotripsina es graficada vs la concentracin de susustrato, la curva es una hiprbola.

La aspartato transcarbamoilasa es una enzima que est involucrada en la snte-sis de los nucletidos.

Cuando la velocidad de la aspartato transcarbamoilasa es graficada vs la con-centracin de aspartato, la curva es sigmoidal.

La diferencia entre las curvas de velocidad para la quimotripsina y la aspartatotranscarbamoilasa nos muestra la diferencia entre el comportamiento de unaenzima alostrica y una no alostrica.

6.6 El enfoque de Michaelis-Menten en la cinticaenzimtica

Un modelo particularmente til para la cintica de las reacciones catalizadas porenzimas fue descubierto en 1913 por Leonor Michaelis y Maud Menten. An es elmodelo bsico para enzimas no alostricas y es ampliamente usado, aun cuando hasufrido muchas modificaciones.

Una reaccin tpica podra ser la conversin de algn sustrato, S, a un productoP. La ecuacin estequiomtrica para esta reaccin sera

S--7P

El mecanismo para una reaccin catalizada por enzimas puede ser resumida en laforma

(6.4)

Observemos que el producto no es re convertido a sus trato en ningn grado aprecia-ble. En esta ecuacin, k1es la constante de velocidad de formacin del complejo en-zima-sustrato, ES, a partir de la enzima E y el sustrato S; k1 es la constante de veloci-dad para la reaccin inversa, o sea la disociacin del complejo ES a enzima libre ysustrato; y Iv es la constante de velocidad para la conversin del complejo ES a pro-ducto P con la subsecuente liberacin de producto de la enzima. La enzima apareceexplcitamente en el mecanismo as como las concentraciones tanto de la enzima li-bre, E, as como el complejo enzima-sustrato, ES, y por tanto aparecen en las ecuacio-nes de velocidad. Los catalizadores, tpicamente son regenerados al final de sus reac-ciones, lo cual es cierto tambin para las enzimas.

Cuando medimos la rapidez (tambin llamada la velocidad) de una reaccinenzimtica a diversas concentraciones de sustrato, vemos que esta velocidad depen-de de la concentracin del sus trato [S]. Lo que debemos medir es la velocidad ini-cial de la reaccin (la velocidad medida inmediatamente despus que la enzima y elsustrato han sido mezclados) de modo que podamos estar seguros de que el produc-to no ha sido convertido a sus trato en ningn grado apreciable. Esta velocidad esalgunas veces escrita como Vinic o VD,pero es importante recordar que todos los clcu-los implicados en la cintica enzimtica consideran que la velocidad que se mide esla velocidad inicial. Podemos graficar nuestros resultados como se ve en la figura 6.8.En la regin baja de la curva (a bajos niveles de sustrato), la reaccin es de primerorden (seccin 6.3), implicando que la velocidad, V, depende totalmente de la con-centracin de sustrato [S]. En la parte superior de la curva (a ms altos niveles desustrato) la reaccin es de orden O, o sea que la velocidad ya es independiente de laconcentracin. Esto es porque todos los sitios activos de todas las molculas de enzi-ma ya estn saturados. En concentraciones infinitas de sus trato, la reaccin procede-ra a su mxima velocidad, la cual se expresa como Vrnx'

6.6 El enfoque de Michaelis-Menten en la cintica enzimtica 153

La concentracin del sustrato a la cual la reaccin llega a la mitad de su mximavelocidad tiene un significado especial. Est dada por el smbolo KM, el cual puedeser considerado como la medida inversa de la afinidad de la enzima por el sus trato.Entre ms baja es la KM, mayor es la afinidad.

Examinemos las relaciones matemticas entre las cantidades [E], [S], Vmx YKM. Elmecanismo general de la reaccin catalizada por una enzima comprende la unin dela enzima E al sustrato S para formar un complejo ES, el cual entonces genera el pro-ducto. La rapidez o velocidad de formacin del complejo enzima-sustrato ES, es

. ., MES]Velocidad de formacin = -- = k[E][S]

I1t(6.5)

donde MES]! M representa el cambio en la concentracin del complejo MES] enun tiempo I1t, y k es la constante de velocidad de formacin del complejo.

El complejo ES se descompone en dos reacciones, regenerando la enzima y els{strato o dando lugar al producto y liberando la enzima. La velocidad de desapari-cin del complejo es la suma de las velocidades de las dos reacciones.

Velocidad de descomposicin = -111~S] = k_[ES] +~[ES] (6.6)

El signo negativo del trmino 11[ES] / I1t significa que la concentracin del complejodisminuye conforme el complejo se descompone. El trmino k. es la constante develocidad para la disociacin del complejo y que as regenera la enzima y el sustrato,y k2 es la constante de velocidad de la reaccin del complejo para generar el produc-to y la enzima. .,

Las enzimas son capaces de procesar el sustrato muy eficientemente, y un estadoestacionario es rpidamente logrado, en el cual la velocidad de formacin del comple-jo enzima-sustrato iguala la velocidad de su descomposicin. Hay muy poco complejopresente y se transforma rpidamente, pero su concentracin permanece constante atravs del tiempo. De acuerdo con la teora del estado estacionario, la velocidad de forma-cin del complejo enzima-sus trato iguala la velocidad de su descomposicin.

I1[ES]

I1t-11[ES]

I1t(6.7)

y

, k[E][S] = L[ES] + ~[ES] (6.8)Para conocer la concentracin del complejo ES con esta ecuacin, es necesario

conocer la concentracin de los otros componentes implicados en la reaccin. Laconcentracin inicial del sustrato es una condicin experimental conocida y no cam-bia significativamente durante las etapas iniciales de la reaccin. La concentracindel sustrato es mucho mayor que la de la enzima. La concentracin total de la enzi-ma [Eh, es tambin conocida, pero una gran proporcin de sta podra estar impli-cada en el complejo. La concentracin de la enzima libre [E], es la diferencia entre[E} y [ES], lo cual puede ser escrito como una ecuacin:

[E] = [Eh - [ES] (6.9)

Sustituyendo la concentracin de la enzima libre [E],en la ecuacin 6.8,

kl ([Eh - [ES]) [S] = k_1 [ES] + ~ [ES] (6.10)

y reuniendo todas las constantes de velocidad para las reacciones individuales, ten-dramos

(6.11)

en donde ~ es llamada la constante de Michaelis. Ahora es posible resolver la ecua-cin 6.11 para la concentracin del complejo enzima-sustrato:

r

~' ~"'"

154 Captulo 6 El comportamiento de las protenas: las enzimas

([Eh - [ES]) [S]--'-"-----=-=----[=-E-=---S]::--=-----=----.:c= KM

[EMs] - [ES][S] = KM [ES]

[EMs] = [ES] (KM + [S])

o

[][EMs]ES =---"----=-=-=-~

Kw + [S] (6.12)

En las etapas iniciales de la reaccin hay tan poco producto presente que no haynecesidad de considerar ninguna reaccin en reversa de producto a complejo. Y deeste modo, la velocidad inicial de las reacciones enzimticas depende de la velocidadde rompimiento del complejo enzima-sustrato para dar producto y enzima. En elmodelo de Michaelis-Menten, la velocidad inicial V de formacin de producto,depende slo de la velocidad de rompimiento del complejo ES

(6.13)

y sustituyendo la expresin [ES] de la ecuacin 6.12,

(6.14)

Si la concentracin del sus trato es tan alta que la enzima est saturada por completocon sus trato ([ES] = [Eh), la reaccin procede a su mxima velocidad posible (VmxJ.Sustituyendo [Eh por [ES] en la ecuacin 6.13,

(6.15)

La concentracin total de la enzima es una constante lo cual quiere decir matemti-camente

V;nx = constante

Esta expresin para la Vmx se parece a la de una reaccin de orden cero como la quetenamos en 6.3:

Velocidad = k[A]o = k

Observemos que la concentracin de sustrato [A], aparece en la ecuacin 6.3 en vezde la concentracin de la enzima [E], como en la ecuacin 6.15. Cuando la enzimaest saturada con sus trato, observamos una cintica de orden cero con respecto alsustrato.

El substituir la expresin para Vrnx en la ecuacin 6.14 nos permite relacionar lavelocidad observada a cualquier concentracin de sustrato con la velocidad mximade una reaccin enzimtica:

(6.16)

La figura 6.8 nos muestra el efecto del aumento de la concentracin de sustratoen la velocidad observada. En tal experimento, la reaccin es realizada a varias con-centraciones de sustrato, y la velocidad se determina midiendo la desaparicin delreactivo, o la aparicin de producto por cualquier medio conveniente. A bajas con-centraciones de sustrato, observamos una cintica de primer orden. Ya mayoresconcentraciones (ms all de 10 X Krvi), cuando la enzima est saturada, se observala velocidad de reaccin constante caracterstica de una cintica de orden cero.

Esta velocidad constante, cuando la enzima est saturada con el sustrato, es la Vrnxpara la enzima, un valor que puede ser estimado en forma aproximada, de la grfica.El valor de K,vr puede tambin ser estimado de la grfica. De la ecuacin 6.16,

6.6 El enfoque de Michaelis-Menten en la cintica enzimtica 155

Cuando las condiciones experimentales son ajustadas de tal modo que [S] = AM.

Vrnx [S]V=[S] + [S]

y

VmxV=-2

En otras palabras, cuando la velocidad de la reaccin est a la mitad de su valor mxi-mo, la concentracin del sustrato es igual a la constante de Michaelis (figura 6.9).Este detalle es la base para la determinacin grfica de AM.

Observemos que la reaccin usada para generar la ecuacin de Michaelis-Men-ten era la ecuacin enzimtica ms simple posible, o sea aquella con un nico sustra-to convirtindose en un nico producto. La mayor parte de las enzimas catalizanreacciones con dos o ms sustratos. Esto, sin embargo, no invalida nuestras ecuacio-nes. Para enzimas con mltiples sustratos puede usarse la misma ecuacin, peroestudiando slo un sustrato por vez. Si por ejemplo, tuviramos la reaccin catalizadapor una enzima

an podramos usar el enfoque de Michaelis-Menten. Simantenemos A en niveles desaturacin y luego variamos la cantidad de B sobre un amplio intervalo, la curvade velocidad vs [B] an ser una hiprbola, y an podemos calcular el AM para B.Inversamente, podemos mantener el nivel de B a niveles de saturacin y variar lacantidad de A para determinar el AM para A. Existen enzimas que tienen dos sustratosdonde, si graficamos V vs [sustrato A], vemos la hiprbola de Michaelis-Menten, pero,si graficamos V vs [sustrato B], vemos la curva sigmoidal mostrada para laaspartatotranscarbamoilasa en la figura 6.7. Tcnicamente, el trmino ~[es apropiado slopara enzimas que exhiben la curva hiperblica de velocidad vs [sustrato].

Cmo calculamos KM y Vmx de una grfica?La curva que describe la velocidad de una reaccin enzimtica no alostricaes hiper-blica. Es muy difcil estimar la Vrnx debido a que es una asntota, y el valor nunca esalcanzado con ninguna concentracin finita de sustrato que pudiramos usar en ellaboratorio. Esto, a su vez, hace difcil determinar la AM de la enzima. Es considera-blemente ms fcil trabajar con una lnea recta que con una curva. Uno puede trans-formar la ecuacin para una hiprbola (ecuacin 6.16) en una ecuacin para unalnea recta tomando los recprocos de ambos lados y transformarla algebraicamenteen forma secuenciada:

1 ~ + [S]V V:nx[S]1 KM [S]- = --- + ---"--':--:-V Vrnx [S] Vrnx [S]1 ~ 1 1-=-- x-+--V Vrnx [S] Vrnx

(6.17)

La ltima ecuacin, ahora tiene la forma de una lnea recta y = mx + b, donde l/Vtoma el lugar de la coordenada y, y l/[S] la de la coordenada x. La pendiente de lalnea, m,es R-dVrnx, y la interseccin sobre el eje de las y's, b,es l/V mx. La figura 6.10presenta esta informacin grficamente como un diagrama de doble recproco deLineweaver-Burk. Comnmente es ms fcil dibujar la mejor lnea recta a travs deun conjunto de puntos que estimar el mejor ajuste de puntos a una curva. Existenmtodos de computadora convenientes para dibujar la mejor lnea recta a travs deuna serie de puntos experimentales. Tal lnea puede ser extrapolada a altos valoresde [S], que no podran ser alcanzables debido a los lmites de solubilidad o el costodel sustrato. La lnea extrapolada puede ser usada para obtener Vrnx.

Concentracin del sustrato [5]-

FIGURA 6.9 Determinacingrfica de Vrnx y ~ de un grfico de lavelocidad de reaccin V contra la concen-tracin de sustrato [S]. Vrnx es la velocidadconstante alcanzada cuando la enzima estcompletamente saturada con sustrato, unvalor que con frecuencia debe ser estimadode un grfico como ste.

156 Captulo 6 El comportamiento de las protenas: las enzimas

1

V

~ .. 1GPendiente = ~

VmxInterseccin -1

c\on el eje. x= ~

..................

~ Interseccin 1con el eje y =--Vmx

o 1[S]r-

CENGAGENOW.: FIGURA ACTIVA 6.10 Grfica de doble-recproco de Lineweaver-Burk de cinticaenzimtica. El recproco de la velocidad de reaccin l/Vha sido graficado contra el recproco dela concentracin del sustrato 1/ [S]. La pendiente de la lnea es KM/Vmx y la interseccin con eleje de las y, es l/Vmx. La interseccin con el eje de las x, es -1/ KM. Inscrbete en www.cengage.com/login para consultaruna versin animada de esta figura. .

41.667

27.77818.86816.66715.625

El siguiente grupo de datos describe una reaccin catalizada por enzimas. Grafi-que estos resultados usando el mtodo de Lineweaver-Burk,y determine los valo-res para la ~ y la Vmx' (La concentracin de la enzima es la misma en todos losexperimentos. )

Concentracin del sustrato(mM)

2.55.0

10.015.0

20.0

Velocidad(mMseg-1)

0.0240.0360.0530.060

0.061

SolucinEl recproco de la concentracin y de la velocidad da los siguientes resultados:

1/[5] (mM'l)

0.400

0.2000.1000.0670.050

6.6 El enfoque de Michaelis-Menten en la cintica enzimtica 157

-0.20 -0.15 -0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40Sustrato

La grfica de los resultados nos da una lnea recta. Visualmente de la grfica,el valor de la interseccin con el eje y nos da 12 yel de la interseccin con el ejex es -0.155. El recproco del primero y es Y;nx, cuyo valor es de 0.083 mMseg-1.El recproco del segundo x de signo contrario es = K,\1 = 6.45 mM. Podemostambin usar las ecuaciones precisas para que la lnea recta se ajuste lo mejorposible a los puntos experimentales, lo cual nos da 1/ V = 75.46 (1/ [S]) + ll.8.Usando esta ecuacin se obtienen los siguientes valores: K,\1 = 6.39 mM y Vrnx=0.0847 mMseg-1.

r r

Ya hemos visto que cuando la velocidad de una reaccin. \': es igual a la mitad de lamxima velocidad posible, F = \;,lx/2 entonces K\ = [S]. Lna interpretacin dela constante de l\Iichaelis. K\f es que es igual a la concentracin de sustrato a la cualel 50% de los sitios activos de la enzima estn ocupados por ste. La constante deMichaelis tiene unidades de concentracin.

Otra interpretacin de la K\ est basada en las consideraciones del modelo ori-ginal de Xlichaelis-Xlenten sobre la cintica enzimtica. Recordemos la ecuacin 6.4:

", k,E+S:;;:::ES-?E+P,,-,Como antes. k] es la constante de velocidad para la formacin del complejo enzima-sustrato, ES. a partir de la enzima v el sustrato; k] es la constante de velocidad para lareaccin inversa. o sea la disociacin del complejo ES a enzima libre y sustrato; y k2 esla constante de velocidad para la formacin del producto P y la consiguiente disocia-cin del producto \ de la enzima. Tambin recordemos de la ecuacin 6.11 que

., + 112K\I = --'--~. k

Consideremos ahora el caso en el cual la reaccin E + S-7 ES tiene lugar ms frecuen-temente que ES -7 E + P. En trminos cinticos, esto significa que la constante dedisociacin 11.1 es mucho mayor que la de formacin de producto, k2. Si k] es muchoms grande que h2 (k, k2), que es como fue originalmente considerada por Mi-chaelis-Menten entonces aproximadamente

fLx; = --;;

158 Captulo 6 El comportamiento de las protenas: las enzimas

Es interesante e informativo comparar la expresin de la constante de Michaelis conla expresin de la constante de equilibrio para la disociacin del complejo ES,

k-,ES;;:: E + S

k,

Los valores de k son las constantes de velocidad como antes. La expresin de la cons-tante de equilibrio es

Esta expresin es la misma que para la ~ y nos seala que, cuando la consideracinde que k 10.es vlida, entonces ~ es simplemente la constante de disociacinpara el complejo ES. ~ es una medida de cuan aferradamente est ligado el sustratoa la enzima. Entre ms grande es el valor de ~, menos fuertemente est adherido elsus trato a la enzima. Advirtamos que en el enfoque de estado estacionario, no se asu-me que 10.sea pequeo comparado con k; por tanto, ~ no es tcnicamente hablan-do de una constante de disociacin, aun cuando con frecuencia es usada para estimarla afinidad de la enzima por el sus trato.

Vmx est relacionada con el nmero de recambio (tumover number) de una enzi-ma, el cual es igual a la constante cataltica 10..Esta constante tambin es nombradacomo kcat o '1>:

v= nmero de recambio = k.:at[ETl

El nmero de recambio es el nmero de moles de sus trato que reaccionan para for-mar producto por mal de enzima por unidad de tiempo. Esta aseveracin implicaque la enzima est saturada por completo con el sus trato y de este modo la reaccinprocede a su mxima velocidad. La tabla 6.2 enlista algunos nmeros de recambiopara enzimas tpicas en donde las unidades son por segundo.

Los nmeros de recambio son una ilustracin particularmente dramtica de laeficiencia de la catlisis enzimtica. La catalasa es un ejemplo de una enzima par-ticularmente eficiente. En la seccin 6.1 vimos a la catalasa en su funcin de conver-tir perxido de hidrgeno a agua y oxgeno. Como la tabla 6.2 lo indica, puedetransformar 40 millones de moles de sus trato a producto cada segundo. El recuadrosiguiente de Conexiones bioqumicas describe alguna informacin prctica disponi-ble a partir de los parmetros que hemos discutido en esta seccin.

Tabla 6.2

Enzima Funcin N de recambio = kcatCatalasa Conversin de H202 en

H20 y O2Hidratacin del CO2Regenera la acetilcolina,(una importante sustanciaen la transmisin de losimpulsos nerviosos) a partirde un acetato y la colinaEnzima proteoltica

Degrada la pared celular depolisacridos de las bacterias

25

Anhidrasa carbnica

Acetil colinesterasa

129.5 X 10-2

QuimotripsinaLisozima

1.9 X 102

0.5

6.6 X 10-1

6 X 10-3

'La definicin de nmero de recambio es: El nmero de moles de sustrato convertidas a producto por mal de la enzimapor segundo. Las unidades son seq ",

"Las unidades de KMson milimolares.

/~/~ I / .}j """""f:~JI ;: :-...-(lo{t>!r.JlIl ii'; ;-W~~ /~~~,~~ ,~~~,~~~::~~-

11 Michaelis y Menten desarrollaron una serie de relaciones matemticas paraexplicar el comportamiento de muchas enzimas alostricas.La ecuacin de Michaelis-Menten describe varios parmetros, incluyendo lavelocidad mxima V;nx, Yla constante de Michaelis ~.V;:nx describe la velocidad de una reaccin catalizada por una enzima cuandohay un nivel de saturacin del sustrato. V;nx puede ser usada para determinarla constante de velocidad, ~, la cual describe la descomposicin de! complejoES hacia E + P.

11 La constante de Michaelis, K,'1' es matemticamente igual a la concentracindel sustrato en la cual la velocidad es la mitad de Vmx'Un diagrama de Lineweaver-Burk es e! grfico inverso de l/V vs 1/ [S],Ypuedeser usado para determinar Kr-1 YVm,x'

llJ~'

l-ibici n de as enzimasUn inhibidor, como su nombre lo indica, es una sustancia que interfiere con la ac-cin de una enzima y reduce la velocidad de una reaccin. Hay gran cantidad de in-formacin acerca de reacciones enzimticas que pueden ser obtenidas por la meraobservacin de los cambios en la reaccin causados por la presencia de inhibidores.Los inhibidores pueden afectar una reaccin enzimtica de dos formas. Un inhibidorenzimtico reversible se puede unir a la enzima para luego ser liberado posterior-mente, dejando a la enzima en su condicin original. uno irreversible reacciona conla enzima para producir una protena que no es enzimticamente activa y de la cual laenzima original no puede ser regenerada.

Se pueden distinguir dos clases principales de inhibidores reversibles sobre labase de los sitios de la enzima sobre los cuales se enlazan. Lna clase consiste de com-puestos de estructura muy similar al sustrato. En este caso, el inhibidor puede unirseal sitio activo y bloquear el acceso del sustrato. Este modo de accin es llamado inhi-bicin competitiva debido a que el inhibidor compite con el sustrato por el sitioactivo de la enzima. Otra clase importante de inhibidores reversibles incluye cual-quier inhibidor que se une a la enzima en un sitio diferente del sitio activo y, quecomo resultado de esta unin, causa un cambio en la estructura de la enzima, espe-cialmente alrededor del sitio activo. El sustrato an es capaz de ligarse al sitio activo,pero la enzima no puede catalizar la reaccin con el inhibidor unido a ella. Estemodo de accin es llamado inhibicin no competitiva (figura 6.11).

Las dos clases de inhibicin pueden ser distinguidas una de otra en e!laborato-rio. La reaccin se lleva a cabo en la presencia del inhibidor a diferentes concentra-ciones de sustraio \ las velocidades obtenidas son comparadas con las de la reaccinsin inhibir. Las diferencias entre las grficas Lineweaver-Burk para las reaccionesinhibidas v sin inhibir aportan la base para la comparacin,

. "' I , .. " "

' J JI l J Ji 1",

En presencia de un inhibidor competitivo, la pendiente del grfico Lineweaver-Burkcambia, pero la interseccin con eje)' no, (La interseccin x tambin cambia). 1~nxpermanece inalterada, pero Kr-.j aumenta. Se requiere ms sustrato para lograr unavelocidad dada en la presencia del inhibidor que en su ausencia. Este punto especfi-camente se aplica al valor Vrnxl2 (recordemos que a V;nx/2, la concentracin delsustrato [S], iguala a KM) (figura 6.12). La inhibicin competitiva puede ser contra-rrestada por una concentracin de sustrato suficientemente alta.

6.7 Inhibicin de las enzimas 159

Inhibidorcompetitivo

IrInhibidor nocompetitivo

't FIGURA 6.11 Modos de accinde los inhibidores. La diferencia entre losinhibidores competitivos y los no competi-tivos es que el primero evita elligamientodel sus trato a la enzima, mientras queuno no competitivo no. 1) Un complejoenzima-sus trato en ausencia de inhibidor.2) Un inhibidor competitivo se une al sitioactivo; el sustrato no puede ligarse. 3) Uninhibidor no competitivo se une en un sitiodiferente del sitio activo; el sustrato an sepuede ligar, pero la enzima no puede cata-lizar la reaccin debido a la presencia delinhibidor unido a ella.

160 Captulo 6 El comportamiento de las protenas: las enzimas

c;J

6.7 Inhibicin de las enzimas 161

donde El es el complejo inhibidor enzima. La constante de disociacin para estecomplejo puede ser escrita

El ~ E + I

[E][I]K = [El]

Puede demostrarse algebraicamente (aunque no lo haremos aqu) que, en presenciade un inhibidor, el valor de la f

162 Captulo 6 El comportamiento de las protenas: las enzimas

1/ Vmx, que es el trmino ben la ecuacin de una lnea recta, no ha cambiado desdela ecuacin anterior, pero la pendiente KM/Vmx en la ecuacin 6.17 se ha incremen-tado por el factor (1+[1]/K). La pendiente, que es el trmino m en dicha ecuacin,es ahora

lo cual da cuenta de los cambios en la pendiente de la grfica Lineweaver-Burk.Obser-vemos que la interseccin en el eje y no cambia. Este manejo algebraico de la inhibi-cin competitiva est de acuerdo con los resultados experimentales, lo cual valida elmodelo, as como los resultados experimentales validan el modelo de Michaelis-Men-ten subyacente para la accin enzimtica. Es importante recordar que la caractersticams distintiva de un inhibidor competitivo es que el sustrato o el inhibidor puedenunirse a la enzima, pero no ambos. Debido a que ambos compiten por el mismo sitio,si hay suficiente cantidad de sustrato, ste desplazar al inhibidor. sta es la razn porla que Vmx no cambia: es una medida de la velocidad a un nivel infinito de sustrato.

Cmo podemos identificar un inhibidor no competitivo?Los resultados cinticos de la inhibicin no competitiva difieren de los de la compe-titiva. Las grficas de Lineweaver-Burk para una reaccin en presencia y en ausenciade inhibidor no competitivo nos muestran el cambio tanto de la pendiente como delvalor de interseccin en el eje y para la reaccin inhibida (figura 6.13), sin cambiarel valor de la interseccin en el eje x. El valor de Vmx disminuye pero el de KM perma-nece constante; el inhibidor no interfiere con elligamiento del sustrato al sitio activo.El aumento en.la concentracin de sustrato no previene la inhibicin no competitivadebido a que el inhibidor y el sustrato no estn compitiendo por el mismo sitio.

La ruta de la reaccin se ha vuelto considerablemente..ms complicada y variosequilibrios deben ser considerados.

+SE:;;::=:ES-->E+P

+lJ~ 1~+IEl:"::;:ESI

+SEn presencia de un inhibidor no competitivo, 1, la mxima velocidad de la reaccinVImxs tiene la forma (no haremos la derivacin aqu)

1 Vmx~x = ---:"7--1 + [IJ/ K.

K, 1V

+1

. Kivr ( [1] )Pendiente = -- 1+-Vmx K

-1

"

"ES ES1

o 1[S]

~CENGAGENOW.: FIGURA ACTIVA 6.13 Una grfica de Lineweaver-Burk de cintica enzimtica paraun inhibidor no competitivo. Inscrbete en www.cengage.com/login para consultar una versin animadade esta figura.

6.7 Inhibicin de las enzimas 163

donde K1 es de nuevo la constante de disociacin para el complejo enzima-inhibidor,El. Recordemos que la mxima velocidad Vrnx, aparece en las expresiones tanto parala pendiente como para la interseccin con los ejes coordenados en la ecuacin parael grfico de Lineweaver-Burk (ecuacin 6.17):

1 K"w 1 1-=--x-+--V Vmx [SJ Vmx

y=mXx+b

En la inhibicin no competitiva, reemplazamos el trmino Vrnx, con la expresin deV~x' para obtener:

1 ~ ( [IJ) 1 1 ( [1])-=-- 1+- X-+-- 1+-V Vmx K [SJ Vmx K

(6.19)

y= m x x + bInhibicin no competitiva

Las expresiones, tanto para la pendiente como para la interseccin en la ecuacinpara el grfico Lineweaver-Burk de una reaccin no inhibida, han sido sustituidas porexpresiones ms complicadas en la ecuacin que describe esta inhibicin no compe-titiva. Esta interpretacin es confirmada por los resultados observados experimental-mente. Con un inhibidor no competitivo, elligamiento del sustrato no afecta al delinhibidor, y viceversa. Debido a que la ~ es una medida de la afinidad de la enzimapor el sustrato, y debido a que el inhibidor no afecta la unin entonces la ~ no cam-bia con la inhibicin no competitiva.

Los dos tipos de inhibicin presentados aqu son los dos casos extremos.Hay muchos otros tipos de inhibicin. La inhibicin incompetitiva (o acompetitiva)aparece cuando un inhibidor puede ligarse al complejo ES pero no a la enzima Elibre. La grfica de Lineweaver-Burk de un inhibidor incompetitivo produce lneasparalelas. El Vmx, disminuye y la ~l aparente disminuy tambin. La inhibicin nocompetitiva es realmente un caso lmite de un tipo de inhibicin ms general llama-do inhibicin mixta. Con un inhibidor de tipo mixto, podemos ver el mismo diagra-ma de ligamiento como en las anteriores ecuaciones de equilibrio, pero en estecaso, la unin del inhibidor s afecta el ligamiento del sus trato y viceversa. La repre-sentacin de Lineweaver-Burk de una enzima con un inhibidor mixto, producelneas que intersectan el cuadrante izquierdo de la grfica. La K,VI, aumenta y la Vmx'disminuye.

La sacarosa (azcar comn de mesa) es hidrolizada a glucosa y fructosa (seccin16.3) a travs de un experimento clsico en cintica. La reaccin es catalizada porla enzima invertasa. Usando los siguientes datos experimentales, determine por elmtodo Lineweaver-Burk, si la inhibicin de esta reaccin con urea 2M es compe-titiva o no competitiva.

Concentracinde sacarosa(mol L -1)

0.02920.05840.08760.1170.175

V, sin inhibidor(unidadesarbitrarias )

0.1820.2650.3110.3300.372

V, Inhibidor presente(mismas unidades

arbitarias )

0.0830.1190.1540.1670.192

164 Captulo 6 El comportamiento de las protenas: las enzimas

SolucinGraficar el conjunto de datos con el recproco de la concentracin de sacarosaen el eje de las x y los recprocos de las dos velocidades de reaccin sobre el ejey. Observe que los dos trazos tienen diferentes pendientes, los cuales son tpicosde una inhibicin no competitiva. Note que existe el mismo lugar para la inter-seccin sobre el eje negativo de las x, el cual da -1/ Km.

1312111098

;::.7;::;-6

5",,'4"

"" 3

.-

6.7 Inhibicin de las enzimas 165

La inhibicin enzimtica en el tratamiento del SIDAUna estrategia clave en el tratamiento del sndrome de inmu-no deficiencia adquirida (SIDA) ha sido el desarrollo de inhibi-dores especficos que selectivamente bloquean las acciones deenzimas especficas y nicas al virus del SrDA (HIV por sus si-glas en ingls "human immunodeficiency virus", o VIH en espa-ol). Muchos laboratorios estn trabajando en el enfoque deldesarrollo de agentes teraputicos. Existen tres enzimas queson los blancos actuales para la terapia del SIDA: la transcripta-sa inversa, la integrasa y la proteasa.

A partir de que la clula es infectada con HIV, hay tres enzimasclave implicadas en la replicacin del virus: la transcriptasa inversa,la integrasa y la proteasa. Reimpreso bajo permiso de Science 311, 943(2006).

!OH

Estructura del apreuavir (VX-478), un inhibidor de la proteasadesarrollado por Vertex Pharmaceuticals, Inc.

Una de las enzimas "objetivo" ms importantes de la HIVproteasa, una enzima esencial para la produccin de nue-vas partculas del virus en la clula infectada. Esta proteasa esnica del virus. Cataliza el procesamiento de las protenas vira-les en una clula infectada. Sin esas protenas, las partculasvirales portadoras no pueden ser liberadas para causar infec-cin subsecuente. La estructura de la HIV proteasa, incluyendosu sitio activo, fue conocida a partir de los resultados de crista-lografa con rayos X. Con esta estructura en mente, los cientfi-cos han diseado y sintetizado compuestos que se unan al sitioactivo. Se lograron mejoras en el diseo de la droga obtenien-do estructuras de una serie de inhibidores ligados al sitio activode la HIV proteasa. Estas estructuras fueron tambin dilucida-das por medio de cristalografa con rayos X. Este proceso even-tualmente condujo a diversos compuestos comercializados pordiferentes compaas farmacuticas. Estos inhibidores de laproteasa HIV incluyen el "saquinavir" de Hoffman-LaRoche,"ritonavir" de Abbot laboratories, "indinavir" de Merck, "Vira-cept" de Pfizer, y "amprenavir"de Vertex Pharmaceuticals.(Estas compaas mantienen pginas en la "WWW, altamenteinformativas. )

El "blanco" buscado ms recientemente es la enzima viralllamada integrasa, la cual es necesaria para que el virus se copiea s mismo dentro de la clula hospedera. Una droga recienteelaborada por Merck, llamada la MK-0518, inhibe la enzimaintegrasa. El tratamiento del SrDA es ptimo cuando se usa unacombinacin de terapias a base de compuestos y los inhibido-res de la HIV proteasa, de la integrasa y de la transcriptasainversa juegan una funcin muy importante. El uso de inhibi-dores mltiples de las enzimas virales clave permite que losniveles de cada una de ellas permanezca debajo de los nivelestxicos para la clula.

Sitio activo del VX-478 formando complejo con la proteasaHIV-l.

El comportamiento delas protenas: enzimas,mecanismos y control7.1 El comportamiento de las enzimas alostricasEl modelo de Michaelis-Menten puede describir el comportamiento de muchasenzimas bien conocidas, pero las enzimas alostricas se comportan en forma muydiferente. En el ltimo captulo, vimos similitudes entre la cintica de la reaccinde una enzima como la quimotripsina, la cual no tiene comportamiento alostri-co y elligamiento del oxgeno por la hemoglobina, el cual tambin es un ejem-plo de comportamiento no alostrico. La analoga se extiende hasta mostrar lasimilitud en el comportamiento cintico de una enzima alostrica como la aspar-tato transcarbamoilasa (ATCasa) y elligamiento del oxgeno por la hemoglobi-na. Ambos son protenas alostricas; sus comportamientos exhiben efectos co-operativos causados por sutiles cambios en la estructura cuaternaria. (Recordemosque la estructura cuaternaria es el arreglo en el espacio que resulta de la interac-cin de las subunidades a travs de fuerzas no covalentes, y que la cooperatividadpositiva se refiere al hecho de que elligamiento de bajos niveles de sustrato faci-lita la accin de la protena a mayores niveles de ste, ya sea que la accin sea ea-taltica o de algn otro de tipo de ligamiento.) Adems de mostrar cintica coo-perativa, las enzimas alostricas tienen una respuesta diferente a la presencia deinhibidores en comparacin con las enzimas no alostricas.

Cmo son controladas las enzimas alostricas?La ATCasa cataliza el primer paso en una serie de reacciones en las cuales elproducto final es trifosfato de citidina (CTP, por sus siglas en ingls, cytidine tri-phosphate), el cual es un nuclesido trifosfato necesario para construir el ARNYel ADN (captulo 9). Desde el punto de vista energtico, las rutas que producennucletidos son costosas e implican muchos pasos. La reaccin catalizada por laATCasa es un buen ejemplo de cmo tal ruta es controlada para evitar la sobre-produccin de tales compuestos. Para la sntesis del ADN y el ARN, los niveles devarios nucletido trifosfatos se mantienen bajo control. El CTP es un inhibidorde la ATCasa, la enzima que cataliza la primera reaccin en esta ruta. Este com-portamiento es un ejemplo de inhibicin por retroalimentacin (tambin llama-da inhibicin por produro final), en la cual el producto final de la secuencia dereacciones inhibe la primera reaccin de la serie (figura 7.1). La inhibicinpor retroalimentacin es un mecanismo de control eficiente debido a que la se-rie completa de reacciones puede ser inhibida cuando hay un exceso de produc-to final, evitando as la acumulacin de intermediarios en la ruta. La inhibicinpor retroalimentacin es una caracterstica general del metabolismo y no estreservada exclusivamente para las enzimas alostricas. Sin embargo, la cinticaobservada para la reaccin de la ATCasa, incluyendo su modo de inhibicin, estpica de las enzimas alostricas.

Cuando la ATCasa cataliza la condensacin del aspartato y del carbamoilfosfato para formar el carbamoil aspartato, la representacin grfica de la velo-cidad como una funcin del incremento en la concentracin de sustrato (aspar-tato) es una curva sigmoidal en vez de la hiprbola obtenida con las enzimas noalostricas (figura 7.2a). Esta curva sigmoidal indica el comportamiento coope-rativo de las enzimas alostricas. En esta reaccin de dos sustratos, el aspartatoes aquel cuya concentracin vara, mientras que la concentracin del carbamoilfosfato se conserva constante a niveles altos.

~CENGAGENOW.::Inscrbete en www.cengage.com/login para autoevaluarte sobre estos conceptos.

Las seales de trnsito regulan el flujo deltrfico de automviles de una manera muyparecida a los mecanismos de control delas reacciones bioqumicas.

Sinopsis7.1 Elcomportamiento de las enzimas

alostricas Cmo son controladas las enzimas alostricas?

1.2 los modelos concertado y secuencialpara las enzimas alostricas

Cul es el modelo concertado para elcomportamiento alostrico?

Cul el modelo secuencial para el comportamientoalostrico?

7.3 Control de la actividad enzimticapor medio de la fosforilacin

La fosforilacin siempre incrementa la actividadenzimtica?

1.4 los zimgenos7.5 la naturaleza del sitio activo Cmo determinamos los residuos de aminocidos

crticos? Cmo afecta a la catlisis la arquitectura de un

sitio activo? Cmo catalizan los aminocidos crticos

la reaccin de la quirnotripsina?7.6 Reacciones qumicas que intervienen

en los mecanismos enzimticos Cules son los tipos de reacciones ms comunes?

7.7 Elsitio activo y los estados de transicin Cmo determinamos la naturaleza del estado

de transicin?7.8 las coonzimas

172 Captulo 7 El comportamiento de las protenas: enzimas, mecanismos y control

FIGURA 7.1 Representacinesquemtica de una ruta que muestra lainhibicin por retroalimentacin.

IIIIIIIIIIIIII

Inhibicin por retroalimentacin ///

_/

/-///IIIIIII

O O O11 11 11

-O- P-0- P-0- P-0-CH21 1 1

0- 0- 0-

Carbamoil fosfato

+NH+

1 3

-OOC - CH - CH2COO-

Aspartato

La reaccin catalizada por la ATCasaeventualmente lleva a la produccin de CTP

Carbamoil aspartato

ATCase

O11C-NH1 2

NH1

-OOC -CH - CH2- COO-

tt Serie de reaccionest

o~JO

Citidn trifosfato (CTP)Inhibidor alostrico de la ATCasa OH OH

Representacin esquemtica de una rutaque muestra la inhibicin por retroalimentacin

Inhibicin porretroalimentacin:el producto final

bloquea una reaccintemprana y cancela la

serie completa

Precursor(es) original(es)

(-- - -r,:im'enzima 2

2

! enzima 33

! enzima 44

! enzima 55

! enzima 6I 6I ! enzima 7I\\ 7-,

Producto final

La serie de reaccionescatalizadas por enzimasconstituye una ruta

7.1 El comportamiento de las enzimas alostricas 173

rVelocidaddereaccin(V)

6) Grfica de la velocidad VS. laconcentracin de sustrato(aspartato) para la aspartatotranscarbamoilasa (ATCasa).

[Sj--

rVelocidaddereaccin(V)

FIGURA 7.2

(l) El efecto de losinhibido res y activadoressobre una enzimaalostrica.

[Sj--

La figura 7.2b compara la velocidad de la reaccin de la ATCasa sin inhibir conla misma, pero en presencia de CTP. En este ltimo caso, una curva sigrnoidal andescribe el comportamiento de velocidad de la enzima, pero la curva se desplaza amayores niveles de sustrato; se necesita una concentracin ms alta de aspartato paraque la enzima alcance su misma rapidez de reaccin. A concentraciones altas desustrato, se observa la misma velocidad mxima, Vrnx'ya sea en presencia o en ausen-cia de un inhibidor. (Recuerde esto de la seccin 6.7.) Debido a que el esquema deMichaelis-Menten cambia cuando una reaccin tiene lugar en presencia de un inhi-bidor no competitivo, la inhibicin no competitiva no aplica en este caso. El mismomodelo de Michaelis-Menten asocia este tipo de comportamiento con la inhibicincompetitiva, pero esa parte del modelo an no nos aporta un cuadro razonable. Losinhibidores competitivos s~unen al mismo sitio que el sustrato debido a que son muysimilares en estructura. La molcula de CTP es muy diferente del sustrato, aspartato,en estructura, y ste se une en un sitio diferente en la molcula de ATCasa.LaATCasaest formada por dos tipos diferentes de subunidades. Una de ellas es la subunidadcataltica, que consiste de seis subunidades de protenas organizadas en dos trmeros.La otra es una subunidad regulatoria, la cual consiste tambin de seis subunidadesde protena organizadas en tres dmeros (figura 7.3). Las subunidades catalticaspueden ser separadas de las subunidades regulatorias tratndolas con p-hidroximer-curiobenzoato, el cual reacciona con las cistenas de la protena. Cuando se haceesto, la ATCasa an cataliza la reaccin, pero pierde su control alostrico por el CTPy la curva se vuelve hiperblica.

La situacin se vuelve cada vezms rara cuando la reaccin ATCasa tiene lugar,no en presencia del CTP, un nuclesido trifosfato de pirimidina, sino en presenciade adenosn trifosfato (ATP), un nuclesido trifosfato de purina. Las similitudesestructurales entre CTP y ATP son aparentes, pero el ltimo no es un productoincluido en la ruta de la reaccin de la ATCasa y esa produce CTP. Ambos, ATP YCTP, son necesarios para la sntesis del ARNy del ADN. Las proporciones relativasde ATP y CTP son determinadas por las necesidades del organismo. Si no hay sufi-ciente CTP en relacin a la cantidad de ATP, la enzima requiere una seal paraproducir ms. En presencia de ATP, la velocidad de la reaccin enzimtica se incre-menta a bajos niveles de aspartato, y la forma de la curva de velocidad se vuelve

174 Captulo 7 El comportamiento de las protenas: enzimas, mecanismos y control

FIGURA 7.3 Organizacin espa-cial de la aspartato transcarbamoilasa(ATCasa), mostrando los dos trmeroscatalticos (verde central en dos planos) lostres dmeros regulatorios (color mostaza enprmer plano).

___________ Dmeros regulatorios

menos sigmoidal y ms hiperblica (figura 7.2b). En otras palabras, hay menoscooperatividad en la reaccin. El sitio de unin para e!ATP en la molcula de la enzi-ma es e! mismo que para e! CTP (lo cual no es de sorprender en vista de su similitudestructural), pen? el ATP es un activador ms que un inhibidor como lo es el CTP.Cuando e! CTP escasea en un organismo, la reaccin de la ATCasa no se inhibe, y launin del ATP incrementa la velocidad de la enzima an ms.

o oo11 11 11

~-P-O-P-O-P-O-C~1 1 1

0- 0- 0-

o

OH OH

Adenosn trifosfato (ATP),un nuc!etido derivadode la purna; activador

de laATCasa

Aun cuando es tentador considerar la inhibicin de las enzimas alostricas delmismo modo que las no alostricas, gran parte de la terminologa no es apropiada.La inhilricin competitiva y la no competitiva son trminos reservados para las enzimasque se comportan en lnea con la cintica de Michaelis-Menten. Con las enzi-mas alostricas, la situacin es ms compleja. En general, existen dos tipos de sis-temas enzimticos llamados sistemas K y sistemas V. Un sistema K es una enzimapara la cual la concentracin de! sustrato que produce la mitad de la Vrnx se ve alte-rada por la presencia de inhibidores o activadores, La ATCasa es un ejemplo de un

7.2 Los modelos concertado y secuencial para las enzimas alostricas 175

sistema K.Debido a que no estamos tratando con una enzima de tipo Michaelis-Men-ten, el trmino ~ aqu no es aplicable. Para una enzima alostrica, el nivel de sus-trato a la velocidad media de la Vmx se le da el nombre de ~.5' En un sistema V, elefecto de los inhibidores y activadores hace que cambie la Vmx pero no la Ko.5'

La clave del comportamiento alostrico, incluida la cooperatividad y las modifi-caciones de sta, es la existencia de mltiples formas para las estructuras cuaternariasde las protenas alostricas. La palabra alostrica es derivada de ala, "otra", y estros"forma", refirindose al hecho de que las posibles conformaciones afectan el com-portamiento de la protena. El ligamiento de sustratos, inhibidores y activadorescambia la estructura cuaternaria de las protenas alostricas, y los cambios en estruc-tura se ven reflejados en el comportamiento de esas protenas. Una sustancia quemodifica la estructura cuaternaria, y de este modo el comportamiento de una prote-na alostrica por medio de la unin con sta, es llamada un efector alostrico. Eltrmino efector puede aplicarse a los sustratos, a inhibidores o a activadores. Se hanpropuesto varios modelos para el comportamiento de las enzimas alostricas y valela pena compararlos.

Primero definamos dos trminos. Efectos homotrpicos son interacciones alos-tricas que ocurren cuando varias molculas idnticas se ligan a una protena. Launin de molculas de sustrato a diferentes sitios de una enzima, tales como el liga-miento del aspartato a la ATCasa, es un ejemplo de efecto horno trpico. Los efectosheterotrpicos son interacciones alostricas que acontecen cuando diferentes sus-tancias (tales como un inhibidor y un sustrato) se ligan a la protena. En la reaccinde la ATCasa, la inhibicin por CTP y la activacin por ATP son ambos efectos hete-rotrpicos.

Resumen de la seccin 7.1 Las enzimas alostricas exhiben diferentes comportamientos comparados

con las enzimas no alostricas y las ecuaciones de Michaelis-Menten no sonaplicables.

Un trazo de la velocidad vs. [S] para una enzima alostrica tiene una formasigmoida!.

Un tipo de control visto frecuentemente con las enzimas alostricas es la llama-da inhibicin por retroalimentacin.

Los inhibidores y activadores pueden controlar la actividad de una enzimaalostrica.

7.2 Losmodelos concertado y secuencialpara las enzimas alostricas

Los dos modelos principales para el comportamiento de las enzimas alostricas sonel modelo concertado y el secuencia!' Fueron propuestos en 1965 y 1966, respectiva-mente y actualmente ambos se usan como una base para interpretar resultados expe-rimentales. El modelo concertado tiene la ventaja de simplicidad comparativa, y des-cribe muy bien el comportamiento de algunos sistemas de enzimas.

El modelo secuencial sacrifica una cierta cantidad de simplicidad por un cuadroms realista de la estructura y comportamiento de las protenas: tambin maneja muybien el comportamiento de algunos sistemas de enzimas.

Cul es el modelo concertado para el comportamientoalostrico?En 1965,]acques Monod,]effries Wyman y]ean-Pierre Changeux propusieron el mo-delo concertado para el comportamiento de las protenas alostricas en una publica-cin que se ha vuelto un clsico de la literatura bioqumica. (Es citado en la bibliogra-fa al final de este captulo.) En este cuadro, la protena tiene dos conformaciones, laactiva R (de relajada) que liga al sustrato fuertemente y la inactiva T (tensa, tambin

176 Captulo 7 El comportamiento de las protenas: enzimas, mecanismos y control

llamada tirante), misma que une el sustrato con menor afinidad. La caractersticadistintiva de este modelo es que las conformaciones de todas las subunidades cambiansimultneamente. La figura 7.4a muestra un protena hipottica con dos subunida-des. Ambas cambian de la conformacin inactiva T a la activaR al mismo tiempo: estoes, ocurre un cambio concertado de conformacin. La relacin de equilibrio de lasformas T/R es llamada L y se asume que es alta -esto es, hay ms enzima presenteen la forma no ligada T que en la forma no ligada R-. Elligamiento del sustrato acualquiera de las dos formas puede ser descrito por la constante de disociacin de laenzima y del sustrato, K, con mayor afinidad hacia el sustrato de forma R que haciala forma T. De este modo ~ < < KT. La relacin de KR/ KT es llamada c. La figura 7.4bnos muestra un caso lmite en el cual KT es infinitamente mayor que ~ (c = O).Enotras palabras: el sustrato no se ligar a la forma T en absoluto. El efecto alostrico seexplica por este modelo basado en la perturbacin del equilibrio entre las formas TyR.Aunque inicialmente la cantidad de enzima en la forma R es pequea, cuando elsustrato se liga a la forma R, remueve la forma R libre. Esto da lugar a la produccinde ms forma R para restablecer el equilibrio, lo cual hace ms posible elligamien-to del sustrato. Este desplazamiento del equilibrio causa los efectos alostricos obser-vados. El modelo Monod-Wyman-Changeux ha sido demostrado matemticamentepara explicar los efectos sigmoidales observados con las enzimas alostricas. La formade la curva estar basada en los valores de L y c.Conforme L se incrementa (forma li-bre T mayormente favorecida), la curva se vuelve ms sigmoidal (figura 7.5). Confor-me el valor de e declina (mayor afinidad entre el sustrato y la forma R), la curvatambin se vuelve ms sigmoidal.

R T

~~"Si=tio=d,~=nio='n ='>DR~ . del sus trato Efector o

1sitio de unin

ITJ Sus trato alostrico

Unin delR sustrato

FIGURA 7.4 Modelo Monod-Wyman-Changeux (MWC) para las transiciones alostricas,(llamado tambin modelo concertado).

el Por el principio de Le Chatelier, elligamiento de unsus trato desplaza el equilibrio en favor del estado relajado(R) por medio de la eliminacin de R no ligado. Laconstante de disociacin para el complejo enzima-sustrato esKR, para la forma relajada y KT, para la forma tensa. KR < KT,de modo que el sus trato se liga mejor a la forma relajada. Ala relacin de ~/ KT, se le da la designacin c. Esta figuramuestra un caso lmite en el cual la forma tensa no ligasustrato en absoluto, en cuyo caso KT se vuelve infinitoy e= O.

L= ..:!:.. R

L es grande. (T> > R)

6) Una protena dimrica puede existir en cualquiera de dosestados de conformacin en el equilibrio, la forma T(tensa) o la forma R (relajada). L es la relacin de laforma T a la forma R. En la mayor parte de los sistemasalostricos, L es grande, de modo que hay ms enzimapresente en la forma T que en la R.

7.2 Los modelos concertado y secuencial para las enzimas alostricas 177

Conforme L (larelacin de la formaT/R) aumenta, laforma de la curva seva volviendo mssigmoidal.

r-'CENGAGENOW.: FIGURA ANIMADA 7.5 El modelo Monod-Wyman-Changeaux (o concertado).(Adaptado de Monod,j, Wyman,j, y Changeux,j P., 1965. Sobre la naturaleza de las transiciones alostri-cas: Un modelo plausible. Journal of Molecular Biology 12:92.) Inscrbete en www.cengage.com/loginpara explorar una versin interactiva de esta figura.

En el modelo concertado, los efectos de los inhil:idoresy los activadores puedentambin ser considerados en trminos de desplazamiento del equilibrio entre lasformas T y R de la enzima. La unin de los inhibido res a las enzimas alostricas escooperativa; los inhibidores alostricos se unen y estabilizan la forma T de la enzima.La unin de los activadores a enzimas alostricas tambin es cooperativa; los activa-dores alostricos se unen a, y estabilizan la forma R de la enzima. Cuando un acti-vador A, est presente, la unin cooperativa de A desplaza el equilibrio entre lasformas T y R, con la forma R vindose favorecida (figura 7.6). Como resultado deello, hay menos necesidad de sustrato S para desplazar el equilibrio en favor de laforma R y se nota menos cooperatividad en la unin de S.

Cuando un inhibidor, 1, est presente, el enlace cooperativo de 1 tambin des-plaza el equilibrio entre las formas T y R, pero esta vez la forma T se ve favorecida(figura 7.6). Se requiere ms sustrato para desplazar el equilibrio de T a R. Se obser-va un mayor grado de cooperatividad en la unin de S.

Cul es el modelo secuencial para el comportamientoalostrico?El nombre de Daniel Koshland est asociado con el modelo secuencial directo decomportamiento alostrico. La caracterstica distintiva de este modelo es que la unindel sustrato induce el cambio de conformacin de la forma T a la R -lo cual es eltipo de comportamiento postulado por la teora del ajuste inducido delligamientodel sustrato-. (El artculo original con la descripcin de este modelo es citado en labibliografa al final del captulo.) Un cambio de conformacin de T a R en una subu-nidad hace que sea ms fcil el cambio conformativo en otra subunidad, y sta es laforma en que la unin cooperativa es expresada en este modelo (figura 7.7a).

En el modelo secuencial, la unin de activadores e inhibidores tambin tienelugar por medio del mecanismo de ajuste inducido. El cambio conformacional quese inicia con la unin del inhibidor o del activador a una subunidad afecta las con-formaciones de otras subunidades. El resultado neto es que se favorece el estado Rcuando hay activador presente y se favorece la forma T cuando el inhibidor, 1 estpresente (figura 7.7b). La unin de 1 a una subunidad, produce un cambio en laconformacin de tal modo que aun es menos probable que la forma T se ligue al

El nivel de cooperatividadtambin est basado en laafinidad de los sustratos porla forma T o la R. CuandoKT es infinita (Oafinidad),la cooperatividad es alta, talcomo podemos ver en la lneaazul, en la que c= O (e= ~/ KTConforme caumenta, ladiferencia en la unin entrelas formas T y R disminuyey las curvas se vuelven menossigmoidales.

178 Captulo 7 El comportamiento de las protenas: enzimas, mecanismos y control

Una protena dimrica que puede existiren cualquiera de dos estados: Ro oTo.Esta protena puede unir tres ligandos.

1) Sustrato (S) 'ifLf/: Un efector homotrpicopositivo que se unesolamente a R en el sitio S

2) Activador (A) L: Un efector heterotrpicopositivo que se unesolamente a R en el sitio F

3) Inhibidor (1) ::y: Un efector heterotrpiconegativo que se unesolamente a T en el sitio F

1.0

Ys 0.5

NoAol

--- ';/-------------~-I .... II II I

: Ko.5- ::/ :

O ~~::'~~_=~~~~'~==~O 1.0

[S]2.0

,Sustrato LActivador

~

LActivador

Rl(S) ~ ~ Rl(A)

IiltSustrato

Rl(A,S)

Efectos de A:A+Ro-Rl(A)El aumento en el nmerode confrmeros R cambia Ro ~ Toal de To-Ro

1) Se forman ms sitiosdisponibles para S.

2) Disminucin en la cooperatividadde la curva de saturacin del sustrato.El efector A reduce el valor aparente de L.

Efectos de 1:I+To-Tl(l)Aumento en el nmero de confrmeros T(disminucin de Ro conforme R - Topara reestablecer el equilibrio)

De este modo, I inhibe la asociacin de S yA con R bajando el nivel de Ro I incrementala cooperatividad de la curva de saturacindel sus trato. I eleva el valor aparente de L.

r-CENGAGENOW.: FIGURA ACTIVA 7.6 Efectos delligamiento de los activadores e inhibidores con elmodelo concertado. Un activador es una molcula que estabiliza la forma R. Un inhibidor estabilizala forma T. Inscrbete en www.cengage.com/login para explorar una versin interactiva de esta figura.

sustrato igual que antes. Este cambio conformacional se trasmite a todas las de-ms subunidades, haciendo que sean ms vidas para unirse al inhibidor y menosvidas para ligar sustrato. ste es un ejemplo del comportamiento cooperativo queconduce a una mayor inhibicin de la enzima. De igual modo, la unin de un acti-vador origina un cambio conformacional que favorece el ligamiento de sustrato, yeste efecto es transmitido de una subunidad a otra.

El modelo secuencial para unir efectores de todo tipo, incluyendo la unin delos sustratos a las enzimas aJostricas tiene una caracterstica nica no vista en elmodelo concertado. Los cambios conformacionales inducidos de este modo puedenhacer a la enzima menos vida para unir ms molculas del mismo tipo. Este fen-meno, llamado cooperatividad negativa, ha sido observado en pocas enzimas. Unade ellas es la tirosil ARNt sintetasa, la cual juega una funcin importante en la snte-sis de protenas. En la reaccin catalizada por esta enzima, el aminocido tirosinaforma un enlace covalente con una molcula de ARNde transferencia(ARNt). En lospasos subsecuentes, la tirosina es transferida hasta ocupar su lugar en la secuencia dela protena en crecimiento. La tirosil ARNt sintetasa consiste de dos subunidades. Launin de la primera molcula de sustrato a una de estas subunidades inhibe el liga-miento de una segunda molcula a la otra subunidad.

El modelo secuencial ha explicado exitosamente la cooperatividad negativaobservada en el comportamiento de la tirosil ARNt sintetasa. El modelo concertadono da ninguna explicacin a esta cooperatividad negativa.

7.3 Control de la actividad enzimtica por medio de la fosforilacin 179

e Mtodo secuencial de la unincooperativa S a una enzima alostrica.Cuando se liga el sustrato a unasubunidad, induce que la otra subunidadadopte el estado R, el cual tiene unamayor afinidad por el sustrato.

Sustrato

Cambio conforma-cional alrededordel sitio de unin

T

Cambio conforma-cional en la subunidaden la cual se ligel sustrato

Cambio conforma-cional en otrasubunidad

(!) Modelo secuencial de la unin cooperativa delinhibidor 1a una enzima alostrica. Al unirseel inhibidor a una subunidad, induce uncambio en la otra subunidad hacia una formaque tiene menor afinidad por el sustrato.

Inhibidor

Cambio conforma-cional alrededordel sitio de unin

R

Cambio conforma-cional en unasubunidad dondese uni el inhibidor

Cambio conforma-cional en otrasubunidad

FIGURA7.7

Resumen de la seccin 7.2 Los dos principales modelos para el comportamiento de una enzima alostrica

son llamados modelo concertado y modelo secuencia!. En el modelo concertado, se piensa que la enzima est en una forma "tirante

o tensa" T, o bien en una forma "relajada" R. Todas las subunidades se encuen-tran en una u otra forma, y se llega a un equilibrio entre las dos formas, la T yla R.

El sustrato se liga ms fcilmente a la forma R que a la forma T, los inhibidoresestabilizan la forma T y los activadores estabilizan la forma R.

En el modelo secuencial, las subunidades de la enzima pueden cambiar se-cuencialmente de la ~rma T a la forma R y a la inversa.

La unin de una molcula de sustrato a una subunidad estimula la transicinde la subunidad a la forma R, la cual entonces estimula a otra subunidad a quecambie a la forma R.

La unin de un inhibidor a una subunidad induce un cambio en las otrassubunidades a una forma con menos afinidad por el sustrato. La unin de unactivador a una subunidad induce un cambio en las otras subunidades paraformar la que tiene ms alta afinidad por el sustrato.

7.3 Control de la actividad enzimticapor medio de la fosforilacin

Uno de los mecanismos ms comunes de control de las enzimas es por fosforilacin.La cadena lateral de grupos hidroxilo de la serina, treonina y de la tirosina puedenformar steres fosfato. El transporte a travs de membranas nos presenta un impor-tante ejemplo, tal como la bomba de in sodio-potasio, la cual mueve al potasio haciadentro y al sodio hacia afuera de la clula (seccin 8.6). La fuente del grupo fosfatopara el componente protenico de la bomba de iones sodio-potasio y para muchas

Menor afinidadpor el sustrato

180 Captulo 7 El comportamiento de las protenas: enzimas, mecanismos y control

FIGURA 7.8 La fosforilacin dela bomba