c u an tificaci n d e am in o cid os en p lasm a em p lean d o ... n l as am in o acid o p at as so...

Acta Bioquím Clín Latinoam 2009; 43 (4): 647-61

Cuantificación de aminoácidos en plasma empleando CromatografíaLíquida de Alta Eficiencia#

Plasma amino acid quantification using HighPerformance Liquid Chromatography

Luis Fernando Malaver Ortega1*, Carlos Javier Alméciga-Díaz2*, Inés StellaMorales Monsalve1*, Olga Yaneth Echeverri Peña1*, Johana Guevara Morales1*, Estefania Zuluaga Torres3*, Henry Alírio Córdoba Ruiz4**, Luis Alejandro BarreraAvellaneda5*

Bioquímica Clínica

Resumen

Las aminoacidopatías son errores innatos del metabolismo intermediario de losaminoácidos. Su con!rmación diagnóstica y seguimiento se realiza con la cuan-ti!cación de aminoácidos libres en "uidos biológicos por técnicas como la cro-matografía líquida de alta e!ciencia (HPLC), para lo que es necesario compararcon valores de referencia normales. La población colombiana no cuenta conestos valores disponibles y el diagnóstico es realizado por comparación con losde otras poblaciones. En el presente trabajo se obtuvieron valores de referenciade aminoácidos en plasma en una población de niños (n=36) y adultos no afec-tados (n=17), mediante HPLC por derivatización postcolumna con ninhidrina.Los valores de referencia obtenidos fueron ligeramente más elevados que los in-formados para otras poblaciones y permitieron la identi!cación de doce casosde aminoacidopatías, incluyendo fenilcetonuria clásica, hiperfenilalaninemia,hiperglicinemia no cetósica, desórdenes del ciclo de la urea, tirosinemia. La im-plementación de la cuanti!cación de aminoácidos por HPLC y la obtención delos valores de referencia de aminoácidos en plasma permitirán aumentar elconocimiento sobre la incidencia de las aminoacidopatías en el país para ga-rantizar, junto con otros factores, su diagnóstico preciso y oportuno y la imple-mentación de un adecuado seguimiento nutricional.

Palabras clave: valores de referencia * aminoácidos * aminoacidopatías * cro-matografía líquida de alta e!ciencia

Summary

Aminoacidopathies are inborn errors of the amino acid intermediary metabo-lism. The benchmark method used for their diagnosis and monitoring is thequanti!cation of free amino acids in biological "uids using High PerformanceLiquid Chromatography (HPLC), which needs to be compared against normal

1. Bacteriólogo2. Dr. en Ciencias Biológicas3. Nutricionista4. M. Sc. en Ingeniería Química5. Dr. en Bioquímica

* Instituto de Errores Innatos del Metabolismo.Ponti!cia Universidad Javeriana. Carrera 7N° 43-82, Laboratorio 305A Edi!cio 53. Bo-gotá D.C., Colombia.

# Departamento de Química, Facultad de Cien-cias, Ponti!cia Universidad Javeriana. Bo-gotá D.C., Colombia.

Acta Bioquímica Clínica LatinoamericanaIncorporda al Chemical Abstract Service.Código bibliográ!co: ABCLDL.ISSN 0325-2957ISSN 1851-6114 en líneaISSN 1852-396X (CD-ROM)

IntroducciónLas aminoacidopatías son errores innatos en el me-

tabolismo de los aminoácidos, producidos por la altera-ción en la actividad de enzimas o transportadoresubicados antes de la formación del correspondiente tioéster de acil-CoA (1). Hasta el momento se han caracte-rizado cerca de 55 enfermedades distintas con preva-lencias que van desde 1:12000 para el caso de lafenilcetonuria clásica (PKU) hasta desórdenes de losque apenas se han descrito unos pocos casos (2).

El esquema de diagnóstico básico de las aminoaci-dopatías comienza con los exámenes de tamizaje inicialque incluyen las pruebas de dinitrofenilhidrazina, ni-trosonaftol, nitroprusiato de sodio y cloruro férrico,para la identi!cación de cetoácidos, tirosina (en orina),grupos sul!hidrilos (cistina y homocistina) y cetoácidoshidroxilados, respectivamente (3). Posteriormente, lasmuestras son analizadas por cromatografía en capa del-gada de alto desempeño (HPTLC), en donde el diag-nóstico preliminar de aminoacidopatía es realizado porla alteración en el per!l cromatográfìco de las muestrasde los pacientes con respecto a las de controles norma-les y mezclas de estándares de aminoácidos (3). Final-mente, en el diagnóstico y seguimiento de lasaminoacidopatías, la cuanti!cación de aminoácidospermite monitorear la evolución del paciente y realizarlos ajustes necesarios durante su tratamiento, de unamanera más efectiva (2). Aunque el tamizaje por es-pectrometría de masas en tándem ha surgido como unaimportante alternativa para el diagnóstico de algunasaminoacidopatías (4), la cuanti!cación de aminoácidosen "uidos biológicos mediante HPLC continúa siendoel método de referencia para el diagnóstico y segui-miento de los defectos que involucran el metabolismointermediario de los aminoácidos (5).

El análisis de aminoácidos en muestras biológicas

tiene el inconveniente de la presencia de un númeroconsiderable de aminoácidos en un amplio rango deconcentraciones. La separación cromatográ!ca de estoscompuestos permite una alta especi!cidad, sensibilidad,linealidad y reproducibilidad para su cuanti!cación (6).Los métodos usados para la determinación de aminoá-cidos en "uidos biológicos incluyen HPTLC (5), cro-matografía de gases (7), y cromatografía líquida de altae!ciencia (HPLC) (8-13). La determinación directa delos aminoácidos no es posible debido a la ausencia deimportantes grupos cromóforos o "uoróforos, siendonecesaria su derivatización, pre o postcolumna, para suposterior detección por métodos ultravioleta (10)(13),"uorescentes (12)(14) o radiactivos (15).

Los patrones de excreción en orina, así como los va-lores de aminoácidos en plasma se ven afectados tantopor factores nutricionales como por la edad (7)(16-17).Scout et al. (9) informaron que los per!les de aminoá-cidos en plasma para poblaciones comparables de re-cién nacidos variaban en función de la dieta aportada,sin encontrar diferencias basadas en el género y con va-lores mayores durante el primer mes de vida.

La relación entre la edad y la concentración de ami-noácidos también fue estudiada por Lepage et al.(16),quienes describieron una dinámica distinta de los ami-noácidos del plasma y los de la orina, con tres per!lesbien de!nidos. En 148 individuos con edades que com-prendían desde el nacimiento hasta los dieciocho años,nueve de los aminoácidos (alanina, arginina, asparagina,metionina, ornitina, fenilalanina, prolina, treonina y ti-rosina) mostraron una disminución gradual hasta el añode vida, seguida de un aumento discreto hasta la adul-tez. Otros nueve (cistina, glutamina, glicina, histidina,isoleucina, leucina, lisina, triptófano y valina) mostraronun aumento gradual durante los primeros dieciochoaños de vida, mientras que cinco (aspartato, citrulina,glutamato, serina, y taurina) mantuvieron niveles cons-

648 Malaver Ortega LF et al.


reference values. However, those amino acid reference values are not available for the Colom-bian population and the diagnosis is usually made using values from American or Europeanpopulations. In this work, plasma amino acid reference values in non-affected children (n=36)and adults (n=17) were established, using an HPLC method with a post-column derivatizationwith ninhidrine. Plasma amino acid reference values in a Colombian population were slightlyhigher compared with those reported for other populations, and enabled the identi!cation oftwelve aminoacidopathies including urea cycle disorders, phenylketonuria, hyperphenylala-ninemia, nonketotichyperglycinemia, hepatorrenaltyrosinemia and maple syrup urine disease.The implementation of amino acid quanti!cation by HPLC and the construction of plasmaamino acid reference values is very useful for a suitable and precise diagnosis of amino aciddisorders, the implementation of proper nutritional treatments, and an increased knowledgeof aminoacidopathy incidence in Colombia

Key words: reference values * amino acids * aminoacidopathies * high performance liquidchromatography

tantes durante este período. Hallazgos similares fuerondescritos por Chuang et al. (18).

En la actualidad no existen informes sobre los valoresde aminoácidos en plasma para la población colombianay no se cuenta con un método de cuanti!cación de ami-noácidos para el diagnóstico de errores innatos del me-tabolismo (EIM), por lo que las muestras debían serenviadas fuera del país para su cuanti!cación, aumen-tando considerablemente el tiempo de diagnóstico e ini-cio de tratamiento, en estas enfermedades que, en su granmayoría, son consideradas urgencias médicas (3) (19-20).Adicionalmente, los valores de referencia de aminoáci-dos en plasma son de gran utilidad para el seguimientode mujeres embarazadas (21), de condiciones como ladesnutrición (22) y la anorexia nerviosa (23), y para el es-tablecimiento de valores de ingesta diaria de proteínas(24). En el presente trabajo se establecieron valores dereferencia de aminoácidos en plasma en una poblacióncolombiana de individuos no afectados que fueron divi-didos en dos grupos etáreos: (1) infantes, entre un día yun año de vida, e (2) individuos mayores de 18 años. Lacuanti!cación de los aminoácidos se realizó medianteHPLC con derivatización postcolumna con ninhidrina ydetección a 440 y 570 nm. Estos valores de referencia per-mitieron con!rmar el diagnóstico en un grupo de indivi-duos con sospecha de aminoacidopatías.

Materiales y Métodos

MUESTRAS

La obtención de los valores de referencia se realizóen dos grupos etáreos. El grupo I estuvo conformadopor 36 individuos (16 niñas y 20 varones), que teníanentre un día y un año de edad (–x = 4,35 meses). Los me-nores estaban bajo custodia legal del Instituto Colom-biano de Bienestar Familiar (ICBF). Se excluyeron delestudio sujetos con antecedentes de enfermedad mus-cular, enfermedad ósea, enfermedad de la piel, enfer-medad ocular, enfermedad infecciosa, quienes hubieranrecibido transfusión sanguínea o tratamiento con anti-bióticos con una semana de anterioridad a la toma de lamuestra, y quienes no tuvieran un desarrollo normal ba-sado en la comparación de la edad cronológica con losparámetros peso y talla. Previa realización de la encuestay de la !rma del consentimiento informado por partedel tutor legal, se extrajeron 5 mL de sangre que se co-locaron en un tubo heparinizado. Por otro lado, elgrupo II estuvo conformado por 17 adultos normales(10 mujeres y 7 hombres), entre 19 y 50 años (–x =31,5años), a los cuales se les extrajeron 5 mL de total sangreque se colocaron en un tubo heparinizado.

Un tercer grupo de individuos estuvo constituido pordoce pacientes remitidos al Instituto de Errores Innatosdel Metabolismo (IEIM) de la Ponti!cia Universidad Ja-

veriana entre el segundo semestre de 2006 y el primerode 2008, con sospecha de aminoacidopatía o acidemiaorgánica. Las muestras de orina de los pacientes fueronsometidas a pruebas de tamizaje con dinitrofenilhidra-zina, nitrosonaftol, nitroprusiato de sodio y cloruro fé-rrico y análisis de ácidos orgánicos en orina porcromatografía de gases acoplada a espectrometría demasas (GC-MS). El análisis de aminoácidos en las mues-tras de plasma fue realizado por HPTLC y HPLC.

PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS DESANGRE

El plasma se separó por centrifugación a 4000 rpmdurante 10 min y se conservó a –80 °C hasta el momentodel análisis. El plasma se desproteinizó por adición deácido 5-sulfosalicílico (50 mg/mL) y se incubó por 1hora a 4 ºC. Finalmente, el plasma desproteinizado secentrifugó a 13200 rpm por 5 min a temperatura am-biente y se !ltró por membrana de 0,22 µm (Alltech As-sociates Inc. Deer!eld, IL, EE.UU.).

ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS POR HPTLC

Se utilizaron placas cromatográ!cas HPTLC de 20 x10 cm de celulosa (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania).La fase móvil consistió en una mezcla de butanol:ácido-acético:agua en proporción 12:3:5, respectivamente. Dosmicrolitros de la muestra de plasma desproteinizado y!ltrado o de la mezcla patrón fueron sembrados en laplaca. La mezcla patrón estaba conformada por cisteína,lisina, histidina, ornitina, arginina, glicina, serina, ácidoglutámico, glutamina, prolina, valina, metionina, trip-tofano, tirosina, alanina, fenilalanina, leucina e isoleu-cina (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE.UU.), cadauna en una concentración de 1 mg/mL en HCl 0,1N.La placa se reveló con ninhidrina al 1%.

CUANTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS POR HPLC

El análisis de aminoácidos por HPLC se realizó en unanalizador de aminoácidos Biochrom 20® (PharmaciaBiotech, Cambridge, Reino Unido) con una columna deintercambio catiónico de alta resolución de 200 mm x4,6 mm (Pharmacia Biotech), siguiendo las instruccio-nes del fabricante (25)(26). De la solución estándar odel plasma filtrado desproteinizado fueron cargados 80µL en la cápsula de inyección (Pharmacia Biotech) ycolocados en el automuestreador mantenido a 4 ºC.Como fase móvil se emplearon las soluciones tampónde citrato de litio contenidas en el Ultra PhysiologicalFluid Chemical Kit (Pharmacia Biotech), a un "ujo de1 mL/min. Las características de cada una de las solu-ciones tampón, así como las condiciones de los gradientesde fuerza iónica y temperatura, se ilustran en la Tabla I. Ladetección se realizó postcolumna a 440 y 570 nm previa

Aminoácidos en plasma por HPLC 649


derivatización con ninhidrina (Ultra Ninhydrin Rea-gent, Pharmacia Biotech) a 135 ºC. Los cromatogramasfueron analizados utilizando el programa EZChromElite® (EZchrom Scienti!c Software, San Ramon, CA,EE.UU.).

Para la determinación de los tiempos de retención yde su coe!ciente de variación, se inyectó por triplicadouna solución que contenía una mezcla de los siguientesaminoácidos: ácido aspártico (Asp, 0,53 mM), treonina(Thr, 0,44 mM), serina (Ser, 0,76 mM), ácido glutámico(Glu, 0,47 mM), asparagina (Asn, 0,49 mM), glutamina(Gln, 0,44 mM), cisteína (Cys, 0,58 mM), prolina (Pro,0,63 mM), glicina (Gly, 0,80 mM), alanina (Ala, 0,56mM), citrulina (Cit, 0,29 mM), valina (Val, 0,66 mM),metionina (Met, 0,35 mM), cistina (0,23 mM), isoleu-cina (I-Leu, 0,44 mM), leucina (Leu, 0,40 mM), tirosina(Tyr, 0,33 mM), fenilalanina (Phe, 0,38 mM), lisina (Lys,0,34 mM), triptofano (Trp, 0,24 mM), histidina (His,0,36 mM) y arginina (Arg, 0,26 mM). Esta mezcla deaminoácidos fue preparada a partir de soluciones de re-serva de 0,2-0,3 mg/mL en HCL 0,1 N de cada uno delos aminoácidos. Para la construcción de las curvas decalibración se realizaron tres diluciones seriadas 1:2, enHCl 0,1 N, de esta mezcla de aminoácidos. Cada uno delos puntos de la curva fue inyectado por triplicado. Lascurvas de calibración de cada aminoácido fueron cons-truidas gra!cando el área bajo la curva del aminoácidocontra su concentración (mM). La precisión del métodose determinó como reproducibilidad interensayo condeterminaciones de una misma muestra en diferentesdías por dos operadores diferentes (n=4).

Los valores de concentración (mM) fueron expresa-dos como media ± desviación estándar (DE), rangos opercentiles 25/50/75 con el objetivo de comparar losresultados obtenidos en este trabajo con los informadospor otros autores. Para el diagnóstico de los pacientescon aminoacidopatías se utilizaron los valores de los per-centiles 2,5 y 97,5.

ANÁLISIS DE ÁCIDOS ORGÁNICOS PORCROMATOGRAFÍA GASEOSA-ESPECTROMETRÍADE MASAS (GC-MS).

El análisis de ácidos orgánicos en los pacientes remi-tidos al IEIM con sospecha de aminoacidopatía fue rea-lizado empleando el método de extracción con acetatode etilo y etil-éter y derivatización con bis-(trimetilsilil)-tri"uoroacetamida (Sigma-Aldrich) previamente des-crito (27). La muestra derivatizada se analizó en uncromatógrafo de gases HP-6890 (Agilent Technologies,Santa Clara, California, EE.UU.) acoplado a un detec-tor de espectrometría de masas selectivo HP-5973 (Agi-lent Technologies). El ensayo se desarrolló por 35 mincon helio ultrapuro como fase móvil a un "ujo constantede 0,6 mL/min sobre una fase sólida de polimetilsilo-xano de 0,2 mm de espesor, en una columna capilar de12,5 m de largo. La mezcla de ácidos orgánicos deriva-tizados se separó con una rampa constante de tempera-tura entre 80 y 220 °C. Los datos obtenidos se analizaroncon el programa ChemStation Data System G1701CA-C.00.00 (Agilent Technologies). El espectro de masasfue comparado con las bases de datos de uso corrienteen el laboratorio para el diagnóstico de errores innatosdel metabolismo.

CONSIDERACIONES ÉTICAS

El proyecto fue aprobado por los comités de ética in-vestigativa de la Facultad de Ciencias de la Ponti!ciaUniversidad Javeriana y del Instituto Colombiano deBienestar Familiar (ICBF), seccional Bogotá. Todos losindividuos aceptaron y !rmaron el consentimiento in-formado donde se especi!caba el tipo de muestra atomar y los procedimientos y resultados esperados deltrabajo.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

El análisis estadístico descriptivo se realizó con el pa-quete SPSS Versión 13.0 para Mac (Chicago, Illinois,EE.UU.).

Resultados

CUANTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS POR HPLC

El método de análisis de aminoácidos por HPLC em-pleado en el presente trabajo permitió la identi!caciónde los 22 aminoácidos listados en la Tabla II, los cualesaportan al diagnóstico diferencial de aminoacidopatías(3)(6). Con excepción de prolina que se monitoreó a440 nm (donde presenta la mayor absorbancia), todoslos aminoácidos fueron monitoreados y cuanti!cados a570 nm (Figura 1a). Bajo las condiciones empleadas nofue posible la resolución de los picos de glutamato y as-



Solución pH Tiempo Temperatura(min) (ºC)

Tampón* 1 0,2 M 2,80 7 34Tampón* 2 0,3 M 3,00 36 34Tampón* 3 0,5 M 3,30 27 42Tampón* 3 0,5 M 3,30 8 70Tampón* 4 0,9 M 3,50 34 64Tampón* 5 1,6 M 3,55 50 80LiOH 0,3 M 6 80

11 80Tampón* 1 0,2 M 2,80 35 36

6 363 34

*Soluciones tampón de citrato de litio.

Tabla I. Soluciones tampón y gradientes de fuerza iónica y tempera-tura utilizados en los análisis de aminoácidos por HPLC.

paragina, y de alanina y citrulina, por lo que estos ami-noácidos fueron informados con base en el área totaldel pico. La separación de glutamato y asparagina fueposible a bajas concentraciones (>0,1 mM), como se ob-servó durante la construcción de la curva de calibración(dato no mostrado).

La Tabla II resume los resultados del análisis de loscoe!cientes de variación (CV) para los tiempos de re-tención. El método mostró CV de los tiempos de reten-ción entre 0,3 y 1,5, y CV interensayo para los tiempos deretención menores a 15 con excepción de serina, gli-cina, cisteína y metionina, quienes mostraron CV de 16,28, 30 y 33, respectivamente. Los curvas de calibraciónde los aminoácidos mostraron coe!cientes de regresiónmayores a 0,90, con excepción de serina, cisteína y pro-lina, quienes mostraron coe!cientes de regresión de0,8501, 0,6560 y 0,8107, respectivamente.

ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS POR HPTLC

Debido a que el análisis de aminoácidos por HPTLCes la técnica regularmente empleada en este laborato-rio para el diagnóstico de aminoacidopatías, las mues-tras de plasma de los individuos del grupo I y II fueronanalizadas por esta técnica cromatográ!ca luego deHPLC. Con excepción de tres individuos del grupo I

que mostraron un leve aumento en la banda de valina-metionina-triptofano, no se observó una diferencia apre-ciable entre los per!les obtenidos para los diferentesindividuos, independientemente de la edad de éstos(dato no mostrado).

ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS EN PLASMA PORHPLC EN POBLACIÓN ADULTA

La Tabla III resume los datos obtenidos en poblaciónadulta expresados como media, desviación estándar yrango, con el objetivo de comparar los resultados delpresente estudio con los informados por otros autores.Las medias calculadas corresponden a los valores en-contrados en el total de los individuos. Algunos amino-ácidos como aspartato, treonina y serina no fueronidenti!cados de manera constante en los cromatogra-mas. Tales casos fueron incluidos en la estadística des-criptiva con un valor de concentración de cero. LaFigura 1b muestra un cromatograma típico de aminoá-cidos en plasma de un individuo no afectado.

Todos los aminoácidos mostraron una distribuciónnormal (Shapiro-Wilk, p>0,05) y fueron identificadosen el 80-100% de los individuos con excepción del as-partato (6/17) y treonina (8/17). En todos los casos lacisteína fue detectable pero no cuantificable, con una



Figura 1. (a) Cromatograma por HPLC de una mezcla de aminoácidos puros. (b) Cromatograma típico de una muestra de plasma de un in-dividuo no afectado. La mezcla de estándares o de plasma desproteinizado y !ltrado (80 µL), fue inyectada en el HPLC y separada en unacolumna de intercambio iónico. Los aminoácidos fueron derivatizados postcolumna con nihindrina y monitoreados a 440 nm y 570 nm.

Minutos

Minutos



Orden Amino TR Ventana de elusión CV CV Linealidadde elusión ácido (min) (min) Intraensayo Interensayo (R2)

para el TR (precisión)

1 Asp 30,5 2,0 3,3 4 0,94632 Thr 33,9 2,0 1,4 6 0,98533 Ser 34,9 2,1 1,4 16 0,85014 Glu+Asn 36,9 2,5 2,0 13 0,90705 Gln 39,1 2,5 2,0 4 0,91986 Cys 43,2 4,2 2,1 2 0,65607 Pro 48,2 2,5 1,6 4 0,81078 Gly 51,6 3,4 1,4 28 0,95979 Ala-Cit 53,9 3,5 1,4 4 0,9222

10 Val 62,0 1,0 0,8 6 0,933211 Cistina 63,2 4,4 0,8 30 0,956512 Met 69,7 2,0 1,0 22 0,932313 ILeu 74,8 4,6 0,7 5 0,932914 Leu 77,2 4,6 0,7 5 0,915815 Tyr 86,1 4,8 0,5 6 0,913016 Phe 90,9 5,3 0,5 8 0,920617 Lys 128,2 5,6 0,2 8 0,938718 Trp 130,7 7,3 0,4 7 0,902719 His 133,0 8,0 0,3 6 0,901220 Arg 151,5 7,6 0,3 4 0,9391

Tabla II. Tiempos de retención (TR) y sus coe!cientes de variación (CV), según el orden de elusión de los aminoácidos puros.La ventana de elusión fue ajustada con respecto al CV para la máxima resolución de los picos.

Amino-Estudio actual Chuang (2002) Perry y Hansen (1969)

ácido n=46 n=20

n Media ± DE Media ± DE

Asp 6/17 0,160±0,345 0,008±0,003 NDThr 8/17 0,075±0,087 0,119±0,050 0,138±0,031Ser 13/17 0,247±0,251 0,114±0,044 0,099±0,019Glu+Asn 12/17 0,125±0,086 NDGln 13/17 0,327±0,344 0,382±0,167 0,640±0,058Cys 17/17 DT NDPro 13/17 0,209±0,138 0,146±0,078 0,185±0,048Gly 17/17 0,334±0,163 0,256±0,099 0,234±0,044Ala+Cit 15/17 0,295±0,147 NDVal 15/17 0,279±0,144 0,221±0,086 0,225±0,040Cistina 15/17 0,071±0,053 0,03±0,013 0,049±0,009Met 1317 0,039±0,024 0,028±0,01 0,021±0,004Ile 17/17 0,095±0,018 0,061±0,028 0,060±0,02Leu 17/17 0,233±0,061 0,127±0,045 0,115±0,023Tyr 17/17 0,083±0,018 0,067±0,026 0,054±0,011Phe 17/17 0,090±0,011 0,064±0,016 0,048±0,007Lys 16/17 0,203±0,091 0,06±0,047 0,186±0,036Trp 16/17 0,065±0,021 0,181±0,064 0,031±0,0006His 17/17 0,166±0,032 0,061±0,021 0,088±0,016Arg 16/17 0,118±0,054 0,054±0,027 0,058±0,014

ND= no detectableDT= detectableNI= no informado

Tabla III. Valores de aminoácidos en plasma para población adulta comparados con los informados en la literatura. Los valores son expresados como mM.

altura de pico entre tres y diez veces el ruido de fondo.La mayor dispersión se encontró en los valores de glu-tamina, valina y metionina. Cuando los valores obteni-dos se expresaron como rangos (Tabla III), los valoresmínimos fueron iguales a cero para aspartato, treo-nina, serina, prolina, cisteína, metionina, lisina, tripto-fano y arginina.

ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS POR HPLC ENPOBLACIÓN MENOR A UN AÑO DE EDAD

La Tabla IV resume los resultados del análisis de ami-noácidos para la población menor de un año, con los va-lores expresados como media, desviación estándar,rango y percentiles (25/50/75), con el objetivo de com-parar los resultados del presente estudio con los infor-mados por otros autores. Todos los aminoácidos fueronencontrados en la totalidad de los muestras analizadas,con excepción de aspartato (22/27), treonina (26/27)y serina (25/27), y mostraron una distribución normal(Shapiro-Wilk, p>0,05) Los per!les cromatográ!cos fue-ron similares a los observados en adultos (Figura 1b).Los valores de glutamina, valina, tirosina y lisina mos-traron los mayores valores de dispersión. A diferenciade lo observado en el grupo de adultos, en el límite mí-nimo no se detectó aspartato, treonina, serina ni glicina(valores tomados como cero).

ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS EN PACIENTES CONAMINOACIDOPATÍAS

Una vez realizada la validación parcial del método decuantificación de aminoácidos por HPLC y establecidoslos valores de referencia, doce individuos remitidos alIEIM bajo sospecha de aminoacidopatía o acidemia or-gánica fueron seleccionados, con base en su historia clí-nica y resultados de pruebas tamizaje y/o ácidosorgánicos por GC-MS, para la cuantificación de aminoá-cidos en plasma por HPLC. Con el objetivo de evitar unelevado número de falsos positivos, los valores de refe-

rencia fueron establecidos como los percentiles 2,5 y 97,5(Tabla V). Los valores de aminoácidos encontrados, asícomo los principales hallazgos clínicos sugestivos de unerror innato del metabolismo, se resumen en la Tabla VI.

La Figura 2 muestra el cromatograma típico obtenidopara un paciente con hiperfenilalaninemia. En el pri-mer caso de hiperfenilalaninemia, los valores de fenila-lanina en sangre fueron 7,4 veces más elevados que losobservados en individuos no afectados, similar a lo in-formado en la literatura para el diagnóstico de hiperfe-nilalaninemias(3)(28). Este valor se comparó con lacuanti!cación "uorométrica de fenilalanina, obtenién-dose una elevación de 8,6 veces con respecto a los valo-res normales (dato no mostrado), similar a la informadapor HPLC. Para el segundo y tercer caso los valores defenilalanina se encontraban alrededor de seis veces porencima de los valores de referencia (Tabla VI).

En el paciente con tirosinemia, el análisis de ácidosorgánicos demostró la elevación en orina del ácido 4-hi-droxi-fenil láctico, ácido 4-hidroxi-fenil acético, ácido 4-hidroxi-fenilpirúvico, n-acetil tirosina y succinilacetona,este último compuesto patognomónico de tirosinemiahepatorrenal (3) (Figura 3a). La con!rmación del diag-nóstico se realizó por cuanti!cación de aminoácidos porHPLC encontrando niveles de tirosina y fenilalanina 5,1y 1,9 veces por encima de los valores de referencia (Fi-gura 3b).

Para el caso del paciente con orina con olor a jarabede arce (EOJA), la sospecha clínica apoyada en los re-sultados de ácidos orgánicos que mostraron una marcadaexcreción de 2-hidroxivalerato, 2-hidroxi metilvalerato,2-metil 3-hidroxivalerato, ácido 2-ceto-isocaproico, d-iso-leucina y d-alloisoleucina (Figura 4a), fue con!rmadapor el análisis por HPLC (Figura 4b). Aunque se ob-servaron valores normales de valina, la leucina y la iso-leucina se encontraban elevadas 7,4 y 1,2 veces porencima de los valores de referencia. Adicionalmente, elcromatograma presentó una señal de alloisoleucina quese encuentra en sujetos afectados y es altamente suges-tiva de EOJA (29)(30).



Figura 2. Cromatograma de aminoácidos en plasma por HPLC (570 nm) de un individuo con hiperfenilalaninemia. Los valores de tirosinay fenilalanina fueron 0,092 mM (0,046/0,514 mM) y 0,740 mM (0,050/0,120), respectivamente. Los aminoácidos restantes se encon-traban dentro de rangos normales.

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Tabla V. Valores de referencia de aminoácidos en plasma para población menor de 1 año y adulta, empleados para el diagnóstico de aminoacidopatías.

Figura 3. (a) Cromatograma de ácidos orgánicos en orina por GC-MS de un individuo con tirosinemia tipo I. (1) ácido láctico, (2) estándarinterno, (3) fenilláctico, (4) 4-hidroxifenil piruvato, (5) succinilacetona, (6) N-acetiltirosina, (7) 4-hidroxifenil láctico, (8) 4-hidroxifenilpirúvico, (9) N-acetiltirosina y (10) N-acetiltirosina. (b) Cromatograma de aminoácidos en plasma por HPLC (570 nm). Los valores de con-centración de tirosina y fenilalanina fueron 0,665 mM (0,046/0,514) y 0,229 mM (0,050/0,120), respectivamente. Los aminoácidosrestantes se encontraban dentro de rangos normales.

Minutos

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Cuatro casos de desórdenes del ciclo de la urea soninformados en el presente trabajo. En todos los casos lahiperamonemia fue un hallazgo constante, así como laelevación de glutamina, alanina-citrulina y lisina en losanálisis por HPLC (Figura 5a), de acuerdo con lo infor-mado en la literatura (20)(31). Estos casos ejempli!canlas limitaciones de la técnica de HPTLC, pues los ami-noácidos histidina, lisina y ornitina presentan una dis-tancia de migración muy similar a la de arginina,impidiendo una interpretación acertada del patrón cro-matográ!co. Adicionalmente las bandas de aumento deaspartato, glutamina, glicina, alanina-citrulina y metio-nina no fueron detectadas como elevadas por HPTLC(dato no mostrado). En el tercer caso se encontró, ade-más, la elevación de ornitina, identi!cada de acuerdo altiempo de retención informado en la literatura (32), ha-llazgo compatible con una de!ciencia de ornitina trans-carbamilasa (OTC) (20)(31).

Con respecto a los valores encontrados en el diag-nóstico de la hiperglicinemia no cetósica (Figura 5b),en tres de los casos el aumento de glicina en plasma y lí-

quido cefalorraquídeo (LCR) estuvo entre tres y cincoveces por sobre el valor de referencia, con una relaciónplasma/LCR para la glicina superior a 0,8 que con-cuerda con lo descrito para la variante neonatal de laenfermedad (33)(34). A pesar de que en el último casolos valores de glicina en plasma y LCR se encontrabandentro del rango de normalidad, la relación plasma/LCR estuvo elevada (0,33).

Discusión

Las aminoacidopatías constituyen un grupo impor-tante de EIM, en el que el oportuno y correcto diag-nóstico permite la instauración de tratamientosnutricionales que evitan la aparición de daños irrever-sibles o fatales (3)(20). En el presente trabajo se cons-truyeron valores de referencia de aminoácidos enplasma para una población colombiana, para ser em-pleados en el diagnóstico de pacientes con sospecha deaminoacidopatías.



Figura 4. (a) Cromatograma de ácidos orgánicos en orina por GC-MS en un individuo afectado por la enfermedad de la orina con olor a jarabede arce (EOJA). (1) ácido láctico, (2) 3-hidroxicaproico, (3) 3-hidroxi-butirato, (4) 2-hidroxi-isovalérico, (5) acetoacetato, (6) 3-hidroxi-valérico, (7) acetoacetato, (8) 2-hidroxi-isocaproico, (9) 2-ceto-isocaproico, (10) 4-hidroxi-isovalérico, (11) 3-ceto-2-metil-valérico, (12)estándar interno y (13) d-aloisoleucina. (b) Cromatograma de aminoácidos en plasma por HPLC (570 nm) del mismo paciente. Los valoresde valina, isoleucina y leucina fueron 0,244 mM (0,041/0,322), 0,132 mM (0,050/0,110) y 1,943 mM (0,062/0,260). La elevación enlos valores de glutamina y metionina es producida por el daño hepático asociado con la enfermedad. Los aminoácidos restantes se encon-traban dentro de rangos normales.

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Durante la validación del método se observó quetodos los aminoácidos fueron identi!cados, salvo gluta-mato-asparagina y alanina-citrulina, los cuales no pu-dieron serlo resueltos bajo las condiciones empleadasen el método. A pesar que la cuanti!cación especí!cade la citrulina es importante en el diagnóstico y segui-miento de los desórdenes del ciclo de la urea, el diag-nóstico diferencial puede establecerse con laidenti!cación y cuanti!cación de otros aminoácidos quese encuentran alterados en estos pacientes, como la glu-tamina o el ácido aspártico (29). Por otro lado, la ala-nina no se encuentra elevada ordinariamente enaminoacidopatías, motivo por el cual un incremento enel área del pico de alanina-citrulina seguramente co-rresponderá a un aumento en la concentración de ci-trulina. Por lo tanto, el diagnóstico y seguimiento depacientes con alteraciones en el metabolismo de citru-lina, puede ser realizado mediante la determinación delárea bajo la curva del pico de alanina-citrulina. Para elcaso del pico de glutamato-asparagina, debido a que suresolución fue posible en concentraciones inferiores a0,1 mM, se recomienda que en aquellos pacientes conelevación en este pico se realice dilución de la muestra,con el objetivo de separar estos aminoácidos y determi-nar cuál es el responsable del aumento de la señal.

Los coe!cientes de variación para el tiempo de re-tención (Tabla II) fueron similares a los informados por

Turnerll y Cooper (10) y Georgi, et al.(35) para la cuan-ti!cación de aminoácidos en muestras biológicas, peroligeramente más altos que los logrados por Biggs y Gen-tilcore (36) y Qu, et al. (11). Los coe!cientes de variacióninterensayo variaron entre 4 y 30%, valores inferiores alos informados por Turnerll, et al. (10) y Biggs y Gentil-core(36), con excepción de los aminoácidos con grupossul!hidrilos (cistina, metionina) y la glicina. A pesar deque para la mayoría de los aminoácidos los valores de li-nealidad no cumplen los criterios establecidos para sucuanti!cación en otras aplicaciones biológicas (37),cuando se presenta un paciente con aminoacidopatía laelevación en la concentración del aminoácido es tanmarcada (cerca de 6 veces por encima de los valores nor-males), que el diagnóstico puede ser realizado fácil-mente y de una manera precisa (2). De los valores de R2

se destaca el de cisteína (0,6560), pues en principio nopermitiría su cuanti!cación en muestras de pacientes.Sin embargo, como se discutirá más adelante, este ami-noácido fue detectable pero no cuanti!cable (entre tresy diez veces el ruido de fondo) en las muestras de los in-dividuos del grupo control.

En conjunto, estos resultados muestran que el mé-todo de cuanti!cación de aminoácidos por HPLC esta-blecido en este laboratorio, puede ser usado para laconstrucción de valores de referencia de aminoácidosen plasma y para el diagnóstico de aminoacidopatías.



Figura 5. (a) Cromatograma de aminoácidos en plasma por HPLC (570 nm) de un paciente con desorden del ciclo de la urea. Los valoresde glutamina, alanina-citrulina y lisina fueron 1,545 mM (0,021/0,988), 0,614 mM (0,050/0,546) y 0,888 mM (0,000/0,358), respec-tivamente. Los picos de amonio y ornitina fueron identi!cados de acuerdo a los tiempos de retención informados en la literatura. (b) Cro-matograma de aminoácidos por HPLC (570 nm) en plasma y líquido cefalorraquídeo (LCR) de un paciente con hiperglicinemia no cetósica.Los valores de glicina en plasma y LCR fueron 1,087 mM (0,351±0,097 mM) y 0,218 mM (0.071±0.01mM). En los dos casos los aminoá-cidos restantes se encontraban dentro de rangos normales.

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La cuantificación de aminoácidos en adultos noafectados mostró una distribución normal y fueronidentificados en más del 80% de los individuos, con ex-cepción de aspartato y treonina (Tabla III). Estas dife-rencias no se observaron cuando las muestras fueronanalizadas por HPTLC, mostrando la limitación de estatécnica y la importancia del análisis de aminoácidospor HPLC.

Entre los valores de concentración de aminoácidosen adultos (media ± DE), se destaca el de ácido aspár-tico, que se encuentra elevado veinte veces con respectoa lo informado por Chuang, et al (18) para una pobla-ción china y 40 veces lo reportado por Perry y Hansen(17). No fue posible establecer la causa de este marcadoincremento, aunque diferencias nutricionales y factoresasociados con la toma y manejo de la muestra puedenjugar un papel importante en este hallazgo (17); dichasposibilidades están siendo evaluadas en la actualidad.Para los demás aminoácidos los valores hallados (media± DE) fueron entre 0,2 y dos veces más altos que los in-formados por otros autores (17)(18) (38), con excep-ción de lisina, que presentó valores similares a lospublicados por Perry y Hansen (17), pero 3 veces porencima de los informados por Chuang, et al. (18). Paralos casos de valina, metionina y tirosina la media de laconcentración fue similar a lo informado por otros au-tores (17)(18). Los valores de glutamina fueron simila-res a los informados por Chuang, et al. (18) pero másbajos que los indicados por Perry y Hansen (17). Los va-lores de prolina, lisina y triptofano fueron similares a losinformados por Perry y Hansen (17).

En el caso de la población menor de un año, similara lo observado en la población adulta, los valores de as-partato (media ± DE) fueron 10, 20 y 50 veces más ele-vados que los informados por Chuang, et al. (18),Brodehl y Gellissen (39) y Soupart (40), respectiva-mente, sugiriendo un posible efecto de la metodologíasobre la cuanti!cación de este aminoácido. Los valoresde glutamina (media ± DE) fueron más bajos que los ha-llados por Shapira, et al. (38) y Soupart (40). Para losdemás aminoácidos, los valores (media ± DE) fueronentre 0,2 y 2 veces más elevados que los hallados por Le-page, et al. (16). Cuando los valores fueron expresadoscomo rangos, los límites máximos fueron mayores quelos informados por otros autores.

El análisis de aminoácidos en plasma y orina porHPTLC constituye una herramienta importante para eltamizaje de individuos con sospecha de aminoacidopatías(3)(20). Sin embargo, este método no permite una ade-cuada separación y cuanti!cación de los aminoácidos, di-!cultando la identi!cación precisa de una disminución oaumento en la concentración de un determinado ami-noácido, lo que produce un elevado número de falsos po-sitivos y falsos negativos (5). La disminución en laconcentración de algunos aminoácidos es determinantepara el diagnóstico de los desórdenes del ciclo de la

urea, en los que la cuanti!cación de arginina y citrulinapermite diferenciar entre una u otra enfermedad(2)(31). Al comparar los hallazgos de HPTLC para lostres individuos del grupo I en los que se observó un au-mento en la banda valina-metionina-triptofano, con losresultados obtenidos por HPLC para cada uno de estosaminoácidos, se observó que los valores se encontrabandentro de los rangos normales. Adicionalmente, las va-riaciones observadas en las concentraciones de los dife-rentes aminoácidos (Tablas III y IV), no se observan porHPTLC. Estos resultados muestran la importancia decon!rmar cualquier hallazgo encontrado en HPTLCmediante cuanti!cación de aminoácidos por HPLC,pues la información obtenida por el primer métodopuede verse alterada por diversos factores externos e in-ternos, que limitan el correcto diagnóstico de la enfer-medad (3).

A diferencia de lo reportado por Lepage, et al.(16)y Chuang, et al (18), para poblaciones canadienses ychino-taiwanesas, respectivamente, en el presente es-tudio no se observó una diferencia significativa entrelos valores de aminoácidos en plasma de adultos yniños menores de un año (Tablas III y IV). Estos resul-tados, así como las variaciones en las concentracionesde los aminoácidos con respecto a otros informes, pue-den ser debidos a la variabilidad ocasionada por los mé-todos analíticos y equipos empleados en uno u otrocaso, así como al número de individuos presentes encada grupo. Es importante destacar que el tamaño delos grupos en el presente trabajo es similar al infor-mado por otros autores (Para adultos: Perry y Hansen(17) n= 20, Chuang, et al. (18) n=46; para menores deun año: Brodehl y Gellissen (39) n=12, Soupart (40)n=20, Lepage, et al. (16) n=34, Chuang, et al. (18)n=34). Sin embargo, es necesario ampliar el númerode sujetos de los dos grupos, incluyendo niños mayoresde un año y adolescentes.

Finalmente, en los 12 individuos con sospecha deaminoacidopatía fue posible realizar la confirmacióndel diagnóstico, mostrando la validez de los valores dereferencia construidos en el presente trabajo. Se iden-tificaron tres hiperfenilalaninemias (elevación de fe-nilalanina), una tirosinemia (elevación de tirosina),una enfermedad de Orina con Olor a Jarabe de Arce(elevación de aminoácidos ramificados: valina, leucinae isoleucina), tres desórdenes del ciclo de la urea (ele-vación de glutamina, alanina-citrulina y lisina) y tres hi-perglicinemias no cetósicas(elevación de la relaciónglicina plasma/líquido cefalorraquídeo 2,6-11 veces).

Entre los casos con sospecha de aminoacidopatía sedestaca el cuarto paciente del grupo de hiperglicinemiasno cetósicas, el cual, como se observa en la Tabla VI, pre-sentó una relación del aminoácido en LCR/plasma porencima de los valores de referencia pero con valores nor-males de glicina en plasma. Análisis posteriores mostra-ron que el paciente presentaba excreción elevada de



cuerpos cetónicos en orina, descartándose la hiperglici-nemia no cetósica y llevando hacia la búsqueda de unnuevo diagnóstico. De esta manera, en el diagnóstico dela hiperglicemia no cetósica es conveniente tener encuenta no sólo la elevación de la relación de glicina enLCR y plasma, sino también la elevación simultánea delaminoácido en los dos "uidos, la presencia de cuerposcetónicos, las alteraciones en los per!les de ácidos or-gánicos en orina y las anormalidades (tipo estallido-su-presión) en el electroencefalograma.

ConclusionesSe construyeron valores de referencia de aminoáci-

dos en plasma para niños menores de 1 año y poblaciónadulta, los cuales mostraron diferencias con los infor-mados para otras poblaciones, destacando la importan-cia del establecimiento de valores de referencia propiosde cada población, especialmente para países en los quela carga genética y las costumbres alimenticias varíanconsiderablemente con respecto a otras poblaciones conlas que generalmente son construidos estos valores dereferencia. La comparación entre lo resultados obteni-dos por HPTLC y HPLC mostró la importancia de con-!rmar cualquier hallazgo encontrado en HPTLCmediante cuanti!cación de aminoácidos por HPLC, des-tacando la importancia de la implementación de estametodología y de la construcción de los valores de refe-rencia. Aunque es necesario ampliar el número de in-dividuos para el cálculo de los valores de referencia, laimplementación de esta técnica permitirá mejorar el co-nocimiento sobre este grupo de enfermedades, hasta elmomento subdiagnosticadas entre la población colom-biana y latinoamericana.

AGRADECIMIENTOS El presente trabajo fue !nanciado por la Ponti!cia UniversidadJaveriana (ID PPTA 00000322, ID PRY 000335). Los autores ex-presan sus agradecimiento al Dr. James Bonham del Shef!eldChildren’s Hospital, UK, por la donación del analizador de ami-noácidos; a la Dra. María Angélica Bruges y al Dr. Orlando Scop-petta Díaz Granados del ICBF, por su colaboración en elreclutamiento de los niños y a María Alejandra Burbano por suasistencia. LFMO recibió una beca de Joven Investigador del De-partamento de Administrativo de Ciencia, Tecnología e Investi-gación (COLCIENCIAS).

CORRESPONDENCIADR. LUIS ALEJANDRO BARRERAInstituto de Errores Innatos del MetabolismoPonti!cia Universidad JaverianaCarrera 7 No. 43-82, Laboratorio 305A Edi!cio 53Tel: +57-1-3208320 Ext:4099BOGOTÁ D.C., Colombia. E-mail: [email protected]

Referencias bibliográ!cas1. Hoffman G, Nyhan W, Zschocke J, Kahler S, Mayatepek

E. Enfermedades Metabólicas Hereditarias. Aravaca:McGraw Hill; 2004.

2. Bremer H, Duran M, Kamlerlig J, Przyrembel H, Wad-man S. Disturbances of Amino Acid Metabolism: Clini-cal Chemistry and Diagnosis. Baltimore: Urban &Schwarzenberg; 1981.

3. Barrera L, Saenz H, Cuellar Y, Ospina S, Garzón K, Ca-brera M, et al. Manual de Enfermedades Metabólicas.Bogotá D.C.: Panamericana; 2004.

4. Fingerhut R, Olgemöller B. Newborn screening for in-born errors of metabolism and endocrinopathies: an up-date. Anal Bioanal Chem 2009; 393 (5): 1481-97.

5. Yahya N. High Performance Liquid Chromatography(HPLC) method for con!rming thin layer chromatogra-phy (TLC) !ndings in inborn errors of metabolism chil-dren in Malaysia. Southeast Asian J Trop Med PublicHealth 1995; 26 (Suppl 1): 130-3.

6. Woontner M, Goodman S. Chromatographic analysisof amino and organic acids in physiological "uids to de-tect inborn errors of metabolism. Curr Protoc Hum Genet2006; Chapter 17 (Suppl 51): 17.2.1-17.2.14.

7. Kamoun P, Parvy P. Analysis for free amino acids in pre-breakfast urine samples. Clin Chem 1981; 27 (5):783-95.

8. Boucher J, Charret C, Coudray-Lucas C, Giboudeau J,Cynober L. Aminoacid determination in biological "uidsby automated ion-exchange chromatography: perform-ance of Hitachi L-8500A. Clin Chem 1997; 43 (8):1421-8.

9. Scott P, Sandham S, Balmer S, Wharton B. Diet-RelatedReference Values for Plasma Amino Acids in NewbornsMeasured by Reversed-Phase HPLC. Clin Chem 1990;36 (11): 1922-7.

10. Turnell D, Cooper D. Rapid assay for amino acids inserum or urine by pre-colum derivazation and reversed-phase liquid chromatography. Clin Chem 1982; 28 (3):527-31.

11. Qu Y, Slocum R, Fu J, Rasmussen WE, Rector HD, MillerJB, et al. Quantitative amino acid analysis using a Beck-man system gold HPLC 126AA analyzer. Clin Chim Acta2001; 312 (1-2): 153-62.

12. Gatti R, Gioia MG. Liquid chromatographic "uorescencedetermination of amino acids in plasma and urine afterderivatization with phanquinone. Biomed Chromatogr2008; 22 (2): 207-13.

13. Bartolomeo MP, Maisano F. Validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative amino acid analy-sis. J Biomol Tech 2006; 17 (2): 131-7.

14. Frank MP, Powers RW. Simple and rapid quantitativehigh-performance liquid chromatographic analysis ofplasma amino acids. J Chromatogr B Analyt Technol Bio-med Life Sci 2007; 852 (1-2): 646-9.

15. Drnevich D, Vary T. Analysis of physiological amino acidsusing dabsyl derivatization and reversed-phase liquidchromatography. J Chromatogr 1993; 613 (1): 137-44.



16. Lepage N, McDonald N, Dallaire L, Lambert M. Age-spe-ci!c distribution of plasma amino acid concentrationsin healthy pediatric population. Clin Chem 1997; 43(12): 2397-402.

17. Perry T, Hansen S. Technical pitfalls leading to errors inthe quantitation of plasma amino acids. Clin Chim Acta1969; 25 (1): 53-8.

18. Chuang C, Lin S, Lee S, Wang T. Plasma free aminoacids in Taiwan Chinese. Clin Chem Lab Med 2002; 40(4): 378-82.

19. Burlina A, Bonafé L, Zacchello F. Clinical and biochem-ical approach to the neonate with a suspected inbornerror of amino acid and organic acid metabolism. SeminPerinatol 1999; 23 (2): 162-73.

20. Cornejo E, Raimann E. Errores Innatos del Metabolismode los Aminoácidos. En: Colombo M, Cornejo V, RaimannE eds. Errores Innatos del Metabolismo del Niño. San-tiago de Chile: Mediterráneo; 1999. pp 59-106.

21. Ortega P, Castejón H, Argotte M, Gómez G, Bohorquez L,Urrieta J. Per!l de aminoácidos plasmáticos en adoles-centes saludables embarazadas de Maracaibo, Vene-zuela. ALAN 2003; 53 (2): 157-64.

22. Cravioto J, Gómez F, Ramos R, Frenk S, Montaño E, Gar-cia N. Metabolismo proteico en la desnutrición avan-zada: Concentración de aminoácidos libres en el plasmasanguíneo. Bol Of San Panam 1969383-91.

23. Moyano D, Vilaseca M, Artuch R, Lambruschini N.Plasma amino acids in anorexia nervosa. Eur J Clin Nut1998; 52 (9): 684-9.

24. Millward J, Jackson A. Protein/energy ratios of currentdiets in developed and developing countries comparedwith a safe protein/energy ratio: implications for recom-mended protein and amino acid intakes. Public HealthNutr 2003; 7 (3): 387-405.

25. Davies M. Amino acid method 45. Cambridge: BiochromUK; 1995.

26. Samyn W. Amino acid method 60. Cambridge: BiochromUK; 1998.

27. Barrera L, Echeverri O, Almeciga-Diaz C, Malaver L. Fun-damentos De Las Acidemias Orgánicas y Desórdenes DelCiclo De La Urea: Diagnóstico y Tratamiento - Parte II.Temas Pediátr 2006; 24 (1): 5-23.

28. Giovannini M, Verduci E, Salvatici E, Fiori L, E. R.Phenylketonuria: dietary and therapeutic challenges. JInherit Metab Dis 2007; 30 (2): 145-52.

29. Holmes D, Strauss K, Robinson D, Pufenberger E, Kel-ley R. Diagnosis and treatment of Maple Syrup Disease:A Study of 36 Patients. Pediatrics 2002; 109 (6): 999-1008.

30. Sanchez A, Serra J, Garcia A, Cabello M, Martinez P. Pro-tocolo de diagnóstico de la enfermedad de orina con olora jarabe de arce. Ann Esp Pediatr 1997; 47 (1): 9-13.

31. Blom W, Huijmans G. Differential diagnosis of inheretedamino acid metabolism or transport disorders. AminoAcids 1992; 2 (1-2): 25-67.

32. Davies M. Amino acid method 48. Cambribge: BiochromUK; 1995.

33. Applegarth D, Toone J. Nonketotic hyperglycinemia(glycine encephalopathy): Laboratory diagnosis. Mol GenMetab 2001; 74 (1-2): 139-46.

34. Applegarth D, Toone J. Workshop Report Glycine en-cephalopathy (nonketotic hyperglycinaemia): Review andupdate. J Inherit Metab Dis 2004; 27 (3): 417-22.

35. Georgi G, Pietsch C SG. High-performance liquid chro-matographic determination of amino acids in protein hy-drolysates and in plasma using automated pre-columnderivatization with o-phthaldialdehyde/2-mercapto-ethanol. J Chromatogr 1993; 613 (1): 35-42.

36. Biggs H, Gentilcore L. Liquid-Chromatographic Meas-urement of amino acids in biological samples formationof phenylthiohydantoin derivatives. Clin Chem 1984; 30(6): 851-5.

37. Reason A. Validation of Amino Acid Analysis Methods.En: Smith BJ (ed). Protein Sequencing Protocols.Clifton: Humana Press; 2003. pp 181-94.

38. Shapira E, Blitzer M, Miller J, Africk D. Biochemical Ge-netics: Laboratory Manual. New York: Oxford UniversityPress; 1989.

39. Brodehl J, Gellissen K. Endogenus renal transport of freeamino acids in infancy and childhood. Pediatrics 1968;42 (3): 395-404.

40. Soupart P. Free amino acids of blood and urine in thehuman. Amino Acids Pools. Amsterdam: Jt. Holden;1962.

Aceptado para su publicación 29 de diciembre de 2009



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