Bases Moleculares

Efrén Santos

ADN, ARN, proteínas ADN, contiene la información genética ARN, muy similar al ADN. (1) Copia

temporal del ADN (2) Parte funcional y estructural del aparato traductor

Proteinas, la molécula principal relacionada a la estructura y a funciones enzimáticas

Dogma central El ADN es la molécula que

contiene la información específica para determinar la estructura de las proteínas usando el ARN como intermediarioProteína

Cromatina activa

Cromosoma condensado

Estructura del cromosoma

Gen = conjunto de secuencia determinada de nucleótidos, codifica una proteína.

Genotipo = contenido genético de un organismo.

Fenotipo = expresión del genotipo en un determinado ambiente. Las propiedades observables de un organismo.

Estructura del ADN Dos tipos de bases nitrogenadas que

comprende la estructura del ADN Purinas = adenina y guanina Pirimidina = timina y citosina

Estructura del ADN Nucleótidos = los “bloques” del ADN = fosfato +

azúcar + base Nucleósido = azúcar + base Azúcar = 5 carbonos, desoxirribosa Enlaces de fosfodiester unen las moléculas de azúcar

a grupos fosfatos

Estructura del ADN Orientación de los

enlaces = 5’ a 3’ debido a que el fosfato que se une al carbono 5’ de un azúcar, se enlaza al carbono 3’ del siguiente azúcar.

Purinas y pirimidinas están unidas a carbon 1’ del azúcar.

El ADN consiste de dos cadenas polinucleótidas que van de 5’ a 3’ en direcciones opuestas = antiparalelas

Las cadenas de ADN están unidas por puentes de hidrógeno entre las bases.

Adenina (A) con timina (T)

Guanina (G) con citosina (C)

Transcripción Producción de una hebra de ARN que es

complementaria a la secuencia de ADN (ARN mensajero, ARNm)

ARN contiene la base uracil en lugar de la timina y el azúcar ribosa

ARN es sintetizado del ADN molde (template DNA) después de la separación de las hebras en la doble hélice

Expresión génica

Gene

ARN es sintetizado en la dirección 5’ – 3’ Promotor = secuencia de nucleótidos que se

encuentra en la región 5’ al sitio de iniciación de la transcripción (transcription start site, TSS) que es esencial para el la adhesión de la ARN polimerasa y de factores de transcripción de iniciación

Terminador = secuencia de ADN necesaria para terminar la transcripción

Un típico gen contiene un promotor, una región que codifica (codifica los aminoácidos de las proteínas) y un terminador

ARNm lleva la información necesaria para la síntesis de proteínas.

El ARNm determina el orden de los aminoácidos en las proteínas.

Cada grupo de tres bases (triplete) corresponde a un codon.

Código genético es redundante

Traducción

ARN mensajero (ARNm). Contiene el código genético en codones (tripletes de bases) que especifican la secuencia de aminoácidos en las proteínas

ARN de transferencia (ARNt). Están covalentemente adheridos a aminoácidos específicos por aminoacil- ARNt sintetasa y contiene un anti-codón complementario al codón del ARNm

Código genético

-Redundante

Código genético AUG es el codón de iniciación que especifica

la colocación de metionina como primer aminoácido

El código genético es universal = los mismo codones especifican el mismo aminoácidos en todas las especies (pocas excepciones).

Proteínas poseen señales en las secuencias que guían a las proteínas a ciertos compartimentos celulares

Código de una letra de nucleótidos

Reacción en cadena de polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction)

Reacción en cadena de polimerasa

(PCR, Polymerase Chain Reaction) Amplificación de ADN in vitro por medio de la polimerización en cadena de ADN utilizando un termociclador.

El propósito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de ADN.

Se puede amplificar un fragmento específico de ADN con poco material disponible.

Kary Mullis.

Ganó el premio Nóbel de Química en 1993 por su invento.

92-96°C

~60°C

~72°C

Termociclador

Necesario para cambios rápidos de temperatura en ciclos.

Calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo.

Componentes necesarios para PCR Amortiguador (Buffer): 50mM KCl o NaCl, 10mM Tris (pH 8.3 a

temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2. Generalmente viene con la polimerasa.

MgCl2: La polimerasa requiere de magnesio. También contribuye a la especificidad del anillamiento del primer. La concentración optima tiene que ser determinada (1-5 mM).

dNTP’s (Dinucleosidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Requeridos para la sintesis de ADN. Concentración de dNTPS es proporcional al tamaño del fragmento que se

desea amplificar. Generalmente, se usa una concentración de 200 µM de cada uno.

Cebadores = iniciadores = “primers”. Secuencias cortas de nucleótidos 15-30 nucleótidos de

longitud, complementarias a una región del ADN que se quiere amplificar.

Deben anillarse en los flancos del ADN a amplificar. Un mayor % de GC es preferible (>50%, <60%). Primers deben contener GC en la región 3’ No debe ser auto-complementario (Self-complementary) No debe formar dimeros con primers.

Componentes necesarios para PCR

Componentes necesarios para PCR

ADN molde: Contiene el ADN a amplificar. Puede ser ADNc (cDNA aislado a partir de RN). 10-500 ng ADN.

Puede ser ssDNA o dsDNA (simple o doble cadena)

ADN circular y cerrado es levemente menos efectivo que el ADN lineal

Se puede amplificar a partir de una sola molécula de ADN molde, pero las condiciones deben estar muy optimizadas

ADN polimerasaPolimerasa. Generalmente se usa 0.05-2 unidades por reacción. Resistente a altas temperaturas. Con bajo ratio de errores. De acuerdo a la longitud del fragmento de ADN a amplificar. Algunas polimerasas crean fragmentos con 3’ A Estabilidad – Taq: 9 min a 97°C, Pwo >2 hr a 100°C Fidelidad – Taq: baja, Pfu: alta Algunas presentan actividad transferasa terminal en el extremo 3´, ej.

Taq agrega una A al exremo 3´, especialmente si en el extremo hay una C. Pwo y Tli generan extremos romos

Cantidad usada = 5 x 1012 moleculas (1.5 unidades) La mas comunmente usada = Taq ADN polimerasa Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu Pyrococcus furiosus, Tli

Thermococcus littoralis

Ciclos de PCR Desnaturalización: 94-95°C por 20-45 segundos Temperatura de hibridización o anillamiento (Annealing) – debe

ser calculada o determinada empíricamente para cada par de primers

demasiado alta = poco o nada de producto demasiado baja = anillamiento no específico = productos

incorrectos Extensión A la temperatura óptima de la ADN polimerasa utilizada ej.: 72°C para Taq

1 min/kb de longitud, dado que la Taq polimeriza 2000 pb/min

solo a partir del 3er ciclo son producidos ADN duplex de la longitud deseada, los cuales a partir de allí se tornan en el producto principal

•Polimerasa mas comúnmente usada: Thermus aquaticus conocida como Taq pol.•Taq es resistente a altas temperaturas (~45 min @ 94°C).

Polimerasa

Condiciones de los ciclos del PCR Desnaturalización ( 92°C-95°C).

Del ADN.

Anillamiento (-4°C Tm de los primers) Tm es la temperatura en donde el 50% de los

oligonucleotidos (primers) se encuentra en duplex con sus correspondientes complementos.

Concentración de los primers va de 0.1 a 0.5 µM. Síntesis de ADN o elongación.

Depende de la longitud del fragmento a amplificar (1 min 750-1000 bp).

Numero de ciclos (30-40).

Análisis del PCR La detección del producto de

la PCR (amplicon) se realiza normalmente mediante corrido electroforético.

Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución se utiliza diferentes medios (agarosa,

Análisis de la Muestra• La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio (lámpara de luz UV), tinción de plata, fluorescencia, radioactividad

Ladder: pesos conocidos

1: Fragmento a 1857 pb

2 y 4: Fragmento a 800 pb

3: No hay producto

5: Multiples bandas (primers inespecíficos se pegan a varios sitios)

“Ladder”

HOT start Taq polymerase Reduce la amplificación de

productos no específicos y formación de dímeros de primers en cada ciclo del PCR

Las bajas temperaturas durante la preparación y antes del primer paso de denaturalización, permite que los primers se anillen al ADN molde en lugares no específicos y permitiendo también la formación de dímeros de primers.

HOT start Taq polymerase HOT start Taq solo comienza a amplificar después de

la denaturalización inicial previniendo la formación de amplicones no específicos.

HOT start Taq está en estado inactivo y solamente se activa después de 10-15 minutos a 95ºC.

Inactivación de la polimerasa puede ser por métodos químicos (adición de grupos de bloqueo sensibles al calor en los residuos de los aminoácidos de la polimerasa), barreras de cera o anticuerpos.

Multiplex PCR Uso de múltiples pares de primers para

amplificar diferentes secuencias (amplificación de varios productos en una reacción).

Requiere de mucha optimización por la formación de dímeros de primers y amplificación específica (buffer PCR y concentración de los primers).

• Síntesis por DNA polimerasa

• • -A T G C A T G C A T G C * *

A C G-T

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

Cortos primers de DNA específicos hibridizan con la cadena que tiene que ser copiada

5’ 3’

• Síntesis por DNA polimerasa

• • -A T G C A T G C A T G C * *

A C G T-T

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

5’ 3’

• Síntesis por DNA polimerasa

• • -A T G C A T G C A T G C * *

A C G T-T A5’ 3’

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

• Síntesis por DNA polimerasa

• • -A T G C A T G C A T G C * *

A C G T-T A C

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

5’ 3’

PCR PCR es una técnica muy sensible. Por lo tanto

cualquier contaminación con ADN que contenga secuencias complementarias a los primers puede resultar en obtener un producto del PCR (amplicón).

Precauciones en el PCR Usar critalería/plástico limpio y autoclavado. Tener cuidado mientras se manipulan los reactivos. Usar guantes. Incluir control negativo (no contiene el ADN molde). Usar agua tratada con UV o agua ultra pura. Preparar las reacciones de PCR en un área designada

en el lab. Usar una “campana” designada para el trabajo de

PCR (no se lo utiliza para añadir el ADN molde para evitar contaminación del área).

RT-PCR Donde el molde inicial es ARN y se requiere de

una transcriptasa inversa (reversa) para realizar la conversión del ARN a un tipo de ADN llamado ADNc (ADN complementario).

A partir del ARN se sintetiza un ADNc (cDNA).

El cDNA es usado como molde en una reacción de PCR.

RT-PCR es frecuentemente usada para amplificar genes específicos que se expresan.

Requiere de un primer antisentido (antisense) (oligo dT, aleatorios, específicos) y de una Reverso Transcriptasa

RT-PCR: PCR con transcriptasa reversa

RT-PCR

AAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’

Transcripción reversa

PCR usando GSP+GSP1

AAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’

mRNAoligo(dT)15-18

cDNA

GSP1

GSP

Requiere el conocimiento de la secuencia para diseñar los primers GSP and GSP1

PharmaGenomics 2003

La combinación de oligo d (T) y cebadores aleatorios darán los mejores rendimientos

RT-PCR Control para determinar ausencia de

ADN en muestras de ARN.

cDNA from

cDNA from

PCR en tiempo real La PCR cuantitativa, PCR en tiempo real o qPCR (del

inglés quatitative polimerase chain reaction) es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la cual se cuantifica de forma absoluta o relativa el producto de la amplificación de ADN (o lo que es lo mismo, el amplicón).

A la mezcla para PCR se le adiciona una sustancia marcada con un fluorocromo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia, permite medir la tasa de generación de uno o más productos específicos.

En muchos casos el molde que se emplea para la PCR cuantitativa no es desde el principio ADN, sino que puede ser ADN complementario (ADNc) obtenido por transcripción reversa de ARN; de este modo, lo que se está efectuando es una RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR).

PCR en tiempo realReal time PCR (Quantitative-PCR, qPCR)

Grommen 2006

PCR en tiempo real El PCR standard no es cuantitativo debido a la fase “plateau”:

Pocos primers y mucho del producto (amplicón) causa anillamiento de hebras de ADN complementarias en vez de los primers en el ADN molde, dando como resultado que las altas o bajas concentraciones del ADN al inicio de la reacción den el mismo rendimiento.

PCR en tiempo real Medición continua de la formación del producto de

PCR (amplicón). Se puede utilizar SYBR Green, que se une específicamente a ADN de doble cadena: en cada ciclo existen más amplicones de doble cadena

qPCR Los métodos actuales de detección se basan

en cambios en la fluorescencia, que son proporcionales al aumento copias de ADN amplificado. Se puede seguir el crecimiento de la fluorescencia durante cada ciclo de PCR que es proporcional a la amplificación, permitiendo al usuario seguir la reacción en tiempo real.

Podevin et al 2006

qPCR

Grommen 2006

Cuantificación

EtBr (baja sensitividad)

SYBR Green

Grommen 2006

Consideraciones usando SYBR Green Evitar la formación de dimeros de primers y productos no específicos Al seleccionar amplicones entre 100 y 150 pb un alto nivel de

fluorescencia se puede obtener sin comprometer la eficiencia de PCR. Primers:

Tamaño: 18-30 bases Contenido GC: idealmente 40-60%. ΔTm entre primers no mayor a 4°C Evitar falta de complementaridad de los primers con la region a amplificar, espcialmente

en la region 3’. Evitar 3 o más nucleótidos seguidos, especialmete Gs o Cs en la región 3’ Evitar T en el final 3’ (permite falta de complemetaridad). Evitar complementaridad dentro de cada “primer” para evitar estructuras “Hairpin” Evitar complementaridad entre primers para evitar dimeros, especialmente de 2 o más

bases en al región 3’ Diseñar primers en exones

Cuantificación

Grommen 2006

qPCR, una herramienta esencial

qPCR realiza una cuantificación precisa, sensible y rápida de secuencias de ácidos nucléicos.

Cualquier persona que domina la habilidad de pipeteo puede generar hermosas curvas de amplificación sigmoidal.

Sin embargo, muchos investigadores no se dan cuenta del control de calidad,que es esencial en todo el flujo de trabajo qPCR (de las células vivas, extracción de ácidos nucleícos, almacenamiento, pasos enzimáticos como el tratamiento de DNasa, la transcripción reversa y amplificación, y finalmente de análisis de datos) a fin de extraer significado conclusiones con significado biológico

En la actualidad más de 10 años después de la concepción de la qPCR todavía no hay consenso sobre buenas prácticas de laboratorio en general, y el nivel de control de calidad, diseño de experimentación y de la estrategia de análisis de datos en particular.